Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химические свойства пероксидазы каллусных культур полыней и верблюжьей колючки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические свойства пероксидазы каллусных культур полыней и верблюжьей колючки"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им. М. А. АЙТХОЖИНА

На правах рукописи

АСКАРОВА Маулкен Акишовна

УДК 581.19; 581.192; 581.198

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЕРОКСИДАЗЫ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР ПОЛЫНЕЙ И ВЕРБЛЮЖЬЕЙ КОЛЮЧКИ

(03.00.04 — «Биологическая химия»)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алма-Ата, 1992

Работа выполнена в лаборатории энзимологни обмена природных соединений Института молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхо-жина Академии наук Республики Казахстан.

Научный руководитель — доктор биологических наук Р. М. КУНАЕВА

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук О. В. ФУРСОВ Доктор биологических наук К. Н. САРСЕНБАЕВ

Ведущая организация — Институт физиологии растений АН России, г. Москва.

Защита состоится 3 апреля 1992 г. в 15 часов на заседании специали-зироканного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук К 008.22.01 при Институте молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина АН Республики Казахстан по адресу: 480012, Алма-Ата, ул. Мичурина, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке АН РК.

Артореферат разослан « «я, МСОрГГ? СО ит т.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Н. С. ПОЛИМБЕТОВА

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Пероксидаэа (.К$ I.II.1.7) относится к классу оксидоредуктаз. Она широко распространена в растениях и выполняет самке разнообразные физиологические и биохимические функции.■Полифункциональность фермента сзязана с его участием в общем метаболизме клетки, катализируя сксхигл-^еглт.е реакции лежащих в основе, важнейших физиологических процессов - фотосинтез, дыхание, развитие, рост и т.д. Поэтому необходимость изучения пероксидазы в научном плаке привлекает многочисленных исследователей, судя по ежегодным публикациям, посвященным этому ферменту. Но несмотря на большое количество- работ, до сих пор остается невыясненной роль фермент-, в жизнедеятельности растений, его поли-фушсционалкзм и роль отдельных- молекулярных форм з важнейших реакциях растительной клетки.

Именно полифункцконализм фзрлента определил чрезвычайно широкий интерес к нему и в практическом плане. Это и использование для аналитических ц&лей в медицине, в пищевой промышленности, в контроле окружающей среды. Наряду с шрокиы применением фермента при спектрофотометрпческях методах анализа все более интенсивными становятся хеыолюминисцентккэ метода, в которых пероксидаза такав проявляет высокие каталитические качества. В настоящее время для изучения научных проблем в области.энзимологки,. а также при практическом прикзнешш ферментов широко используется метод цультуры клеток, который дает возыозность изучить' фермент в контролируемых условиях.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выделение и сравнительное изучение физико-химических свойств мо-леггуляркых фора пероксидазы из каллусных культур полыней a.annua L., A. dracunculus И верблшьей КОЛЮЧКИ, А» kirgisotum с оптимизацией условий их культивирования, для практического применения н качестве источников отдельных форм фермента.

В соответствии с поставленной целью решались следующие за. дачи:

I. Получить каллуснке культуры полыней a. annua ь., а.

. ' dracunculus.

.2. Разработать схему выделения и4очистки пероксидазы из

_ 4 -

. культур полыней и верблюжьей колючки.

3. Изучить физико-химические свойства выделенных форм фермента.

Научная новизна. Получены каллусные культуры полыней л annua Ъ a. drao., которые имели разные индексы роста для стеблевой и корневой каллусных культур. Показано, что-культуры полыней различаются и по характеру изменения активности пероксидазы от времени культивирования в течение одного цикла. Установлено, что культивируемые клетки полыней содержат высокоактивную пероксидазу по сравнению с ферментом нативного растения и имеют более упрощенный изоферментный состав. Разработан способ выделения и очистки фермента. Изучены физико-химические свойства рН-оптимум, термостабильность, субстратная специфичность, определены молекулярные массы, ИЭТ, кинетические константы..

Обнаружена устойчивость к действию высоких температур пероксидазы из культуры полыни a. amiu\;, L. по сравнении с ферментом из нативного растения. Впервые'показана возможность использования кислых форм пероксидазы из культивируемых клеток полыней в качестве метчика для иммунодиагностики. Установлено, что молекулярная форма пероксидазы из эмбриогенной линии культуры A.kircisorum может использоваться в качестве маркера эмбриогенеза этой культуры,

Практическая значимость работы заключается в том, что разработан простой способ выделения и очистки пероксидазы из вышеперечисленных культур. Показана возможность использования кислых форм ' фермента из каллусных культур полыней в качестве метчиков для иммуно диагностики. Каллусные культуры полыней предложены как новые источники высокоактивной пероксидазы.

Апробация работы. Материалы диссертации бьши представлены на 1У конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана (Ашхабад,1986), на П Всесоюзной конференции молодых ученых (Уфа, 1987), на'5-ой международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988), на УП интернациональном конгрессе в Амстердаме (1990). . ..

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем"работы. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 30 рисункоа и 13 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методик исследования, изложения4результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы (142 наименования, из них 42 на русском языке).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве материалов были использованы каллусные культуры полыней л. annua, л. drac; а также эмбриогенные и неэмбриогенкъте линии каллусной культуры верблюжьей колючки.

Лолучение каллусных культур Польшей. Каллусные культуры получали из сегментов стерильных проростков полыней. Разработана схема стерилизации семян, где были использованы растворы хг.п04 ( 10% хлорамина, 15% HgOg, 70 % этилового спирта и стерильная дистиллированная вода. Обработанные таким образом семена полыней пересаживали на агаризованнуго питательную среду Гельригеля. Сегменты пророста на II—12, дни высанквали на питательную среду Мурасиге-Скуга ( i'uras-ohise, Skooce , 1962). После серии экспериментов были подоб-

рзны концентрации и сочетания фитогорм'оноз. Для полыни однолетней

A. annua l. _ НУК (нафтилуксусная кислота) в концентра-

ции 2 кг/л в сочетании с кинетином в концентрации I мг/л, для полыни эстрагон НУК - I мг/л с БАП (бензоаминопурии) - I мгл/л. Полученные культуры полыней отличались продолжительностью цикла культивирования, т.е. культура a. annua L. - быстрошвуцая (4 нед.), культура л. drac. - !.;эдлэнко;я:зуцая (8 нед.).

Каллусные культуры верблюжьей колючки для работы были предоставлены О.А.Сапко.

Активность пероксилазы. определяли по начальной скорости окисления о-дианизидина при комнаткой температуре при 460 .нм -(Лебедева и др.) 1577). Скорость реакции определяли по тангенсу угла наклона начальных участков кинетических прямых изменения оптической плотности во времени.

Для получения яекзткчзсеих параметров v ■ '»fc , , ic по

шэХ CI

2 2 13 о-ДОанизидицр измеряли зависимость начальной скорости v ■ количества одного пз субстратов при наскщающэй концентрации другого субстрата.

Наличэственнов опрэделенкз белка. Концентрацию белка определяли биурзтовш кзтодом для макроопределений по Д.Бзйли. А также соектрофотоизтрнчзснш методом оценки содержания белка по разности, длине волн при 230 НМ И 260 КМ (Kalb, Bernlohr , 1977).

Электрофорез белков в ПААГ проводили по методу Дэвиса (1964) при pH 8,3 (7,5 акриламида) и при pH 4,3 (15% акриламид).

Препаративное изоэлектрофокусирование проводили в колонке 40 х 1,5 см с водяной рубашкой (Гильманов, Фурсов, 1981). Градиент

рН создавали 1% раствором амфолинов в интервале рН 3,5-10. Градиент плотности создавали растворами сахарозы от 5 до 40$.

Для изоэлектрофокусирования на пластинах использовали прибор "Мультифор" ЛКБ ('Швеция) (5% акриламид) в диапазоне рН 3,5-10.

Термоинактивацию проводили -инкубированием фермента при 60°G от 5 до 120 мин.

Реакцию усиленной хемилюминисценции измеряли на лшинометро модели 1250 фирмы Я® "./allac" (Финляндия).

Молекулярную массу белков определяли методом электрофореза в ПААГе в присутствии ДДС натрия ( Laesmli , 1970) с использованием белков маркеров.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ВЬЩЕЯЕНИЕ, 0ЧИСТК4 И СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ШЗИКО-ХШИЧЕСЖХ-СВОЙСТВ ШРОКСМДАЗЫ ИЗ КШУСНЫХ КУЛЬТУР ПОЛЫНЕЙ И БЕРБЛШЬЕЙ КОЛЮЧКИ.

I. Зависимость активности гороксидазы от времени культивирования полыней

Нами были получена каллуснкз культуры полыней с различккш индексами роста ^ ыа ~ гао^ . У культуры полыни A. annua L. для стеблевого каллусе? индекс роста составил 18, корневого - 24, тогда как у культуры л- ¿гас. 15 и 30 соответственно. Эти культуры полинай отличались и по характеру изменения активности пзро-ксидазы, у культуры А- annua ь. наблюдали два пика активности, • в начала цикла культивирования "адаптационной" и в конца гркла (рпсД).

Подобную зависимость набяйдаля в каллуеной ткани гкпокотиля, корнях фасоли (Нокизерко, Орэшкина» 1988) п связызали с адаптаци- . ей культивируемых клеток к сведен питательной средэ и с началом некроза ¡слеток в конца цикла культивирования (рис.2), аналогичный характер изменения активности был выявлен для суспензионной культуры арахиса ( Kossatz, Kuystee . » IS76).

Различна характер'зависшоста.актнзности фермента от врзюнгг культивирования у культур д. оплиа ъ. а» drac рогхохно обусловлз-нн и тем, что они отличаются циклом роста : культура A. annua ъ, - бустрозивущая (4 изд.), а едльтура д. ¿гас. - иэдлзнноаиву-

щая (8 шд.).

3 1

-S-1 .1 1 >-5-1-1-Г

п 2a 23 27 3a 33 35 39 иг a5

Время культивирования, су т. Ркс.Х. Изменения пзроксидазной активности в коркзвой (I) и стеблз-вой (2) культура полыни a. annua х,. от врзмзни культивирования.

<600-

<аоо

-о

§

§

5

2

еоо

с

gj

сз

<3

3

I

400

т

г

—Г"

к

-Г"

5

-т-

{О

Время культивирования,неделя

Рис.2. Изменения пероксидазной активности в корневой (I) и стебле' вой (2) культурах полыни эстрагон от времени культивирования.

2. Внеклеточная пероксидаза

Пероксидаза является одним из ферментов, активно секретируе-мых в питательную среду при культивировании клеток растений.

Установлено, что в исследуемых культурах полыни л. annua L. и á» drcc наблюдали одинаковую зависимость выделения внеклеточной пероксидазы в питательную среду, которая происходит параллельно сырому весу клеток, в период экспоненциальной фазы роста. Показано, что активность внеклеточной пероксидазы в 32-дневной культуре annua L. увеличивается в 100 раз, культура л. drac. - б 73 раза. ,

Аналогичные данные были получены для культуры моркови, перца, картофеля С Bredeaeijer , IS85; Shetty et al., 1990; Kellon IS86). Эти авторы предлагали использовась внеклеточную гороксцдаэу в качестве индикаторов роста кул ь т к в ;:ру е :,rjx клеток.

Таким образом, питательную среду каллусных культур полыней, наряду с самой культурой полдаи, моако использовать в качестве дополнительного источника пероксидазы.

3. Выделение к очистка пероксидазы из каллусных культур полыней '

Для получения гомогенного ферментного препарата была раэра-: ботана схема очистки пероксидазы из культур полыней. Как известно, высокое содержание фенольных соединений в полыни значительно затрудняет процесс выделения ферментов. Но так как было установлено, что культуры клеток полыней обеднены фенолькыыи соединениями (Сапно, I9S7), то наа метод очистки более упрощен и ке требует присутствия в буфере выделения различного рода вегцвств защитного действия.

Частично очищенный фермент получали следующими путем: экстракция навески в I н водном растворе хлорида натрия - фракционное осаждение сульфатом навески аммония от 30 до 60%, диализ 14-16 часов, гельфильтрация на Toyppoarl - 50 . . Полученный Ферментный препарат имел rz от 0,8 до 1,3 со степенью очистки 7-8.

Для получения гомогенного препарата пероксидазы предложена следующая схема: '-• -

Оушрната Сотбраешзали)

- 9 _

Гомогенизация в в Н^О, содержащей I м НаС1 - экстракция 1,5-2 часа.

Последовательное осаядениэ сульфатом амнония до 30%, затем 80% наскщзкиз.

Осадок пэрерастворяли в 0,05 Н

Трис-нс1 буфере рН 7,2, диализ против этого буфера 15-16 часов.

Суммарный препарат пзроксидазы

ИСК на ДМЕ-цедлюлозэ, элшрорчняо 0,005 М Трис-ГО1 буфером рЬ 7,2, содорзёщим ИаС1

бравдт» пззядержавшнеся на ДОЕ-и/злтегоза (0 фракция)

йОХ на 1Ш-щ?лл., о®:фодан1!з в лянайтиш грп.гргэитэ. коляриости 0„005 и 0,25 М'йдэтатесго буфера рН 4,4

2-ой ©яявйгеиай при иониой сила 'О,"14-0,15* Н цесх

Голь$!ЛьраЦ!Н1 на Тоуореаг1 -50

Гомогенный препарат -

По даннки пооэлактрофокуетфовання и электрофореза в ПМГ, полупзтткэ прэтзрзты пэрокскдззн были гомогенны (рис 3). При ото« достигалась бояеэ 100-кратная степень ¿чистки.

задзркшгаошз .

на ДЕАВ-цэлжяоза 8 испольоуэм дал вьщзлзггая кясгкх форм

Магоаптевнпэ фракцпа отбраснзали

I

i 0.290-

; 0.090-

2

0.49a-

O.D9aJ

0.3IQ

б0 80 wo <20

I

Рис.3. Денситограша препарата пзрокспдазы культура полыни

л. drac. Ч)- Электрофореграмма препарата пзрокевдази культуры полыни аплца (2).

Перокевдезу выделяли из окбрлогенной линии Еерблаиьай колючки. Навеску биомассы гомогенизировали» экстрагировали в дистиллированной воде, содержащей I М itaCl , затем последовательно осаждали при 20 и 80% насыщении сульфатом ашония. После диализа ферментный про парат подвергали гельхроматографии на Toyopeari - 50 » Фракции высокой пероксидаэной активность© хроыатографкроваяи на КМ_цэллю-лозе. Элюцию осуществляли линейным градзюнтоы полярности от 0,005 до 0,25 М ацетатного буфера pH 4,4.

Ферментный препарат из неэибриогенной линии вльировался с КМ. целлюлозы 2.фракциями, тогда как препарат из эмбриогенной линии З-кя фракциями. Удельная активность в 3-ей фракции была на порядо выше двух других фракций и отсутствовала в неэмбриогенной линии. Это позволило заключить, что эта фракция характерна только для эмбриогенной линии культуры верблюжьей колючки. Результаты очисти

4. Выделение и очистка пзроксидаэа из каллусной культуры верблакьей колючки

представлены в таблица 2.

Таблица I.

Очистка пероксидазы из каллусной культуры верблюжьей очистки

| { ¡Уд,активность | ' |

Стадии !hi »рЛЬ MKH'!SSfm «Степень ! w

очч&рки tобъем балок ¡на иг »акткв~!очистки !

оч"схкл ¡(мл) | Cur) j jq3 , jHocTb ¡0ЧИС-1КИ вихо;

__ i j !_ : ! 103 i . !

Исход.экстраг. 50 210 0,8 420 •ШГ 100

Посла 80£ 15 20 9 351 II 83,6

ф 50 20 12 16,6 199,2" 20,5 47,4

ц/ИМ-целл. 25 5 26 130 30,3 31

Как видно ка таблицы, пзроксидаза очищена в 30 раз с выходом 31$. .

5, Свободные и связанные формат пэроксидазы полыни

Пороксидаза, как и другие белки, находится в клетке в определенной сгязн с щуашя компонентами. Сила этой свяан определяет их экеграгируэшсть, отрааает-локализацию и функции. Вдарвда йэдером i Mäder et al., 1975; 1980; Hessel, Kädor- ~ 1977) бти вкскаеаш предположения о различии свойств и функций свобод-' шее и сзязаиннх фора пвроисидаз табака. Защюгзтсв 11982} на чайной растении показан, что при введении чайного растения в культуру клзток происходи!? пзрзрасщ-здэяегаз связанных и свободных форм фзрмэнта.

Наш были изучены растзоршжз ,• ионносвязаннкэ и пррчносвязан-нез форма пероксадагы в интаятном растении - стерильных проростках я каллусной культуш полыни. Для выделения нонносвязанных белков навеску экстрагировали I И раствором KeCl в 8'~>татком буфере pH 5,2. Прочноевязанные экстрагировала ацртат.бу^роы, содержавши 1% тритон X-IQQ. Затеи бъ-лки осаждали сульфатом аммония до 80 % насыщения, осадки перерастворяли в 0,05 М ацетатном буфере pH 5,2 и диалнзовали против этого ке буфера Т&асов.

- 12 - Таблица .2

Объекты i j Органы j «ракц.КЯ)} $ракц.2 (J6) j Фракц.З (.%

Интактн. листья 9 90 I

оастение корни 3 92,5 4,5

Стерильные листья 8,3 91 о,?

проростки корни 8 34,5 57,5

Каллусы листья 18 65 17

корни 28 64 8 ■

Как видно из таблицы 2,при введении полыни в культуру происхо дат перераспределение активности свободных и связанных форм фермента. Увеличивается активность растворимой и прочносвязанной перокси-дази в каллусной культуре и соответственно уменьшается активность ионносвязгкной формы. Считают, что перераспределение активностей различных форм при введении растений в культуру клзток связано с нарушением дифференциации и локализации фермента в культуре клеток, которая ведет к нарушению лигнификации. Лигнин образуется не только з клеточных стенках, но u з цитоплазме, что влачзт за собой увеличение активности растворимой дароксидазы в культура меток (Запро-ызтов, 1982). '

6. Физико-химические свойства пэроксидаеы из каллусных культур полыней

Известно, что изучение физико-химических свойств ферментов имеет важное значение для понимания их физиологических, биохимических функций. Поэтому были изучены рН^птимум, термостабильность, субстратная специфичность. Определены.молекулярные массы форм рр-мента, их изоэлектрические точки, кинетические характеристики.

Оптимальные значения рН были определены для щелочной и кислой молекулярных форм цолыни annua 1. и-кислой молекулярной формы A. drac. с субстратами о-дианизидин, гваякол, фенолантипирин с использованием следующих буферов: ацетатного (рН 3,6-5,8), фосфатного СрН 6,8-8,0), трис-хлоридного (рН 7,2-9). Установлено, что вс£ молекулярные формы фермента из обovx. видов полыней имели одинаковы! значения оптимума рН с о-дианизи,цино,и' (5,2; 5,2; 5,2), гваяколом • (4,4; 4,4; 5,8). С фенол&нтипирином кислые формы пероксидазы имели рН-ептимум при 3,6, а щелочная форма A. amma L. - 7,71. СледО

вателыю, оптимальные значения рН зависят как от субстрата фермента, так и его молекулярных форы.

Субстратную специфичность изучали на этих же- субстратах, а тагске с лшинолоы э раакции хемилюыинесценции. Наиболее высокую специфичность проявили молекулярные форш шроксидаз к о-дионизидн-ну, низкую - к гваяколу. Кислые форш. обог-пс видоз полинея имели более низкую активность пероксидааы по сравнению с щелочной формой. Причем кислая пероксидаэа из л» оппиа Ь. гораздо активнее, чем из а. ¿гас. (таблица 3).

Таблица 3

Окисления субстратов молзаулярижн формами пероксидаз --г

Л. annua j А» annua

Субстраты щэлочн Форма I кислая форма

| МКМОЛЬ"МИН/ИГ } МКМОЛЬ'ШШ/МГ

A. drr.c кислая форма

мкмоль'мин/»"'

" 0-дианизидин 244<з' 1688 4737

Гваякол 3 44 60 2,-35

Фенолантипирин 5 06 3 33 2,69

"Наиболее интересным является изучение окисления люминола молекулярными формами пероксидаз.

Таблица 4

Окисление люминола различными формами пероксидаз

Объекты ,\'Вольты

At drae. кислая форма 630

A. ¿тсс. щэлочн.форма 29,86

A. annua 1. кислая форма 492

а. anr.ua ь. . . щэлочн.форма 72,86

Пероксидаэа хрена, кислая форма 2,45

Установлено (табл.4), что кислые форш периксидаз полыней проявили высокую специфичность к люыинолу. Активность их на порядок выше, чем у щелочных форы и на два порядка выше, чем у перокеидазы хрена. Это вызвало интерес для дальнейшего изучения кислых форм фермента с целью их применения в качества метчиков в иммунофермент-ном анализе.

Тарыостабильность изучали при постоянном времени инкубации (5) в зависимости от темперasypa и от времени нагревания Сот 5 до 120) при постоянной температура.

Показано, что щелочная и кислая форш'пероксидазы из культуры a. annua L. оказались более устойчивыми к действию высоких температур, чем кислая форма пероксидазы A. drac. , т.к. при 90°С сохраняли 45-50$ активности. А шроксидаза из Д. drac. при 90°С сохраняла лишь 10$ активности (рис.4).

А% юо

90-

70

.50

3D -

ш-

Г"

40

~i-1-1-г

30 5D

j , 0 70 90 1

Рис.4. Зависимость активности пароксидазы от температуры: : I ~ щелочная форыа алии а X. ; 2 - «шслая форма

A. annua L» ; 3 - кислая форма a. drac.

Установлено, что при 60°С ккслкз формы фэргента' из обоих ■ культур полыней кнактивируотся sa 60 шн. на тогда как щелочная форма пероксидазы из культуры a. annua L. в отих да условиях сохраняет 40% активности.

Изоферментный состав. изученный изоэлектрофокусированивм на пластинах в ГШГе у пероксидазы культуры полыни A .ennui Ь. ; представлен 5 изоформами: три изоформы лекали в кислой и слабо

кислой области (4,2; 4,4 и 4,8) и две изоформы в щелочной области (7,2 и 9,4). У пероксидазы культуры д. ¿гас. обнаружено 6

изоф"рм, которда были распределены несколько иначе - одна форма вал* в кислой области и имела р1 4,5, две в нейтральной области 5,2 и Ь,7 и три в щелочной - 8,0; 9,2; 9,4.

1 - 1 г I -

шш ш \4-je

гг^Ы еГ'1 чш ът <777 и ■ 1 тт:

Ьт-* IV - н иг

гш У гттг.

1 ' ^- ь и ¿мм

I 2 ■

Рис.5. Спектр пероксидаз полыней, однолетней (I) и э-трягон (2>

Рис.6. Спектр пероксидаз каллусной.культуры верблюжьей колючки неэмбриогенной С1) и эмбриогенной (2) линий.

Следовательно, порокеидээы из иульгур полыней отличаются и спектром изоформ, если и культуре л. штил ь. преобладают кислые бормы, то в культуро A. drcc. щелочные формы (рис.5).

Молекулярная к.„сса , опродолонная sua -электрофорезом, оказалась одинаковой для всох молекулярных форм фермента и составила около 46 кД.

Кинетические характеристик» молекулярных Форм гороксндпз из культур Польшей.

Определение кинетических констант ( \!1Х% kfcat К щ ) позволили при рН 5,2 в 0,05 м ацотатиом будара, при' 25°С, и двух вариантах:

1) при постоянной концентрации порокевдазы и о-диашкшдино, меняя концентрации ^О^;

2) при постоянной концентрации пэроксидазы и HgOg, шняя концентрации о-дианизидшга.

-икейпость кривых зависимостей скорости реакции от концэнтра-ции субстрата в координатах Лайнуивера-Берка сввдотольствует о том; что фермент-субстратные взаимодействия осуществляются по игхенизму Михаэлиса-Мантен^

\ Таблица 5

Кинетические константы реакции окисления пгроксидао \ о-дианизидинок

Объекта } с т { 10 мс ! с к'< 1 | Ю5 сек-Х | до-5«

, A. annua кисл.ф. 6,7 1,0 1,4

A. annua ¡цзл.ф. 7,4 . 1,0 1.5

A. draco кисл.ф. 14,3, 1,8 4,2

Исходя из данных таблицы 5, видно, что имеется различия »гэкду ыолекуляркьпл! формами пероксидазы в отношении величины Кщ . То есть, более высокое сродство к о-дианкзиднну проявляют &арг.ги форманта ИЗ культуры A. annua Ъ. , ПО СрСВНОНИЮ С формой ШрОКСй-дазы из культуры toao. Величина Ки фзрвднта из нетканого растения полыни a. annua L. насколько нике и составила 4,5'10 И (Мухьмедаанов, 1985). Вероятно, увеличение величины кд у пороксп-дазы из культуры полыни связано, наряду с другими причинами, п введением растения в культуру клеток.

Пероксидаза из каллусной культуры зерблюаьей колючки

Активность фермента. Для исследования были взяты две линии каллусных культур верблюжьей колючки -1* ;-1гб- эмбриогенная и не-эмбриогенная. Если до очистки активность пероксидазы из омбрноген-ной линин была в два раза выше, чем у фермента из нззмбриогеккой, то после очистки эта разница стала почти з Ю раз.

ИзоФзрментный состав изучен с понощьэ изоэлактрофокусиров^-ния на пластинах в ПААГе. Остановленог что эмбриогенная и незмб-риогенная линии культуры верблтаьзй колючки различается по ИоОфер--пентког-^у составу. Пэроксидаза из нээмбриогзнной линия состоит из семи .молекулярных форм, из которых два находятся в кислой ронс С р! 4,2 и 4,5), а остальные пять - з цэлочной, т.о. нкзет ¿1 7,9; 8,0; 8,4; 8,7; 9,3. ¿зркентннй препарат из эмбриогенкой линии состоит из 9 молвкуляр!гых форм,, т.е. появляются два дополнительные изоформы пероксидазы,. хезж&е з нейтральной области с р1 5,3 и 5,7 (рис.6;.,ртр.15).

Молекулярная масса пзроксидаз с ЙЗТ 8,7 2! 4,_2 ид зыбриогэн-ной и нзэмбриогенной линкй- была разка соотзетстгшшо 58 д 4'В гД.

рН-оптимум для всех молекулярных фору фермента по о-дканлзи-Д1шу з качестве субстрата был 'одинаков п равнялся 5,8,

Субстратную специфичность определяли цо отношению к о-диани-зидшгу, гваяколу фзнолантипирщу'. Наибольщуэ аатиьность проявил препарат пероксидазы к о-дпак..аидику». шкыцугз - с фзколантиг^ииом, Гваякол окислялся лишь молекулярной формой, характерной для омбрп-огенной линии.. ••

При изучении теряост&бизькости установяэно, что форм, фзризн-та, присущую элбриогенноЗ линия, иояно откеетл к терьястабзяьнш, так, при 80°С ока. с^.сракпла 70$ активности, тогда как моле'тляр-ные форма фэркеата общие для обеих линий 50.и 35$. (рис.7).

Обобщая данные по очистке и изучению физико-хпхгичзск"/ свойств молекулярных форм пзроксидаз из культур полыней и веро-люзьей колючки, можно заключить» что они икзэт ряд различий по сравнению с гароясидазой нативкого растения.' йзрмент пз культуры аолыней обладает высоким уровнен активности, иг* '"зрменткый состаа упрощен, различаются по молекулярной массе, терьостабильнос л,*' каталитическим свойствам. Исходя из•этого, можно рекомендовать халлусвуа культуру полыней в качестве нового источника высокоактивной пероксидазы. \ ,

о о

Й «о

Е

t ь

. '5S сэ

eg

О

d is

80

50-

30-

—гШ

• • Г > I ,,о\

30 50 70 90 <00 (t ) Рис.7. Зависимость активности различных препаратов пароксидазы культуры д. kire. от температуры из 1-энбриогекной линии (I пик), 2-неэмбриогонной линии (I пик), З-эмбрио-геннС линии Ш пик).

ВЫВОДЫ

X.'Из стерильных цроростков полыней A. annua ъ., л. draa. получены быстрсрастущкз каллусккз {¡ультуры, содержащие высокоактии-| иуэ пероксидаау.

Разработан простой метод выделения.и очистки пероксиде.-.ы, .поеволязпщй получить частично очкцзкныз и гокогенньз фзрментныз прзпа^чты. Процесс очистки включает гомогенизация, экстракцию в I водним pdCTE0p2 NaOl , фракционное взваливание сульфатом аш-юнг.-Г ионнообмекную хроматографию на КМ, ДЕАЕ-цзллголозэ и гельфильтрациа| ьа оТ0?0Рааг1 - - г■'

3. Изучение флзико-хккическ' свойств показало, что пэрокси-даза из г^льхур -полыней имеет отличия от фзрызнта из нативного рас тения, Фермент из каллускых 'льтур полыней обладает высоким уровнем йти"ности (385 ООО ыкмоль мин/мг), упрощенным изоферментным спектром, различается го молекулярной массе (46 гД), термостабиль-J ности.

4. Вцврвые обнаружена способность кислых форм пероксидаз из культуп полыней окислять люмкнол и выявлена' пригодность этих форм!

—г~

до

—г

<00

_ 19 -

з качестве маркеров в иммунофермзнтном анализе.

5. Предлагается использовать яаллускда культуры полыней насяду

с питательной средой в качестве нового источника высокоактивной

пзроксидазы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. A.C. XX0SI02 (СССР). Способ получения пзроксидазы. Мухамеджанов В.Г., Садвакасоаа Г.Г., Кунаева P.A., Балтабаева Г.Р.,Аскарова

' М.Л. Опубл.в Б.и., 1984, J? 30.

2. Мухамздаанов В.Г.,Аькарова М.А., Сапко O.A. Изучение фенольных. ссодкизний и фзриснтов в культура клеток растений.ЕГ конференция биохимиков Срздкзй Азк:: и Казахстана, Ашхабад, 1986.

3. Аскароза М.А, "Сравнительное изучение даоз^ёственных молекулярных форм ■ пзроксидазы э интактном растении и каллусной культуре полыни д. snn.ua Есзсоэзяая П конфэрзнция молодых ученых,

. Уфд, Î987. • - • :

4. Лскарова М.А., Кунаева P.M. "Изучение молекулярных форм пзрокс i-дазз з растеши в культу рз по жни д.шшиЗ. 5 Мездун ароднач кон§ "Биология вультизкруошк клеток и бйотохйологяя"»Новосибврса, ÎS8-

э. Аскароза М.А., %ха«йдзаноэ В.Г., Кувазва- P.M. "Пзрошщазная ахтагкость в каллуснсй культура ' полкни д. esaûS. Извзсткл АН КсзСС?, сзр.бг'.ол., I? X, стр.22, ZS83.

3. Уухскздашов Б.Г., Аскароза Ü.A., Кунаева P.M. "Видэлок'.гз к ста-С7ка пзроЕСОДаза пошта" - Сб.Кзтода иояэадзафной биологии, бйо-» замш и бкотеянйлогил рзсгвний, Наука, • 1989, стр.95.

?. H.H.Kitaao-va, B.G.Kuochsraedshaaoir, H.Ä.Ackarova. enaysos

of ic-nolio compounds aynthoais ia cell c-lturcq nod' pleat tissues. ÏÏI International Congress en Plant ïiccuc o..d Cell Culture, Anstetdaa, 2-W9 June, 1990.

cM"

Тип. ЦОТ «Кимтотраи*». 3<к. Ткр.Л?. , IS32 г.ЛЗ.СХ.