Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование фенольных соединений в культуре тканей и клеток верблюжьей колючки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Образование фенольных соединений в культуре тканей и клеток верблюжьей колючки"

РГ6 од

НАЦИОНАЛЬНАЯ*"АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И БИОХИМИИ ИМ. М. А. АЙТХОЖИНА

На правах рукописи

УДК 581.19; 581. 192; 581. 143. 6

С АПК О ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

ОБРАЗОВАНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ ТКАНЕЙ И КЛЕТОК ВЕРБЛЮЖЬЕЙ КОЛЮЧКИ

03. 00. 04 — Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алма-Ата. 1993

Работа выполнена в лаборатории энзимологии обмена природных соединений Института молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина Национальной АН Республики Казахстан.

Научные руководители:

доктор биологических

наук, профессор Р. М. КУНАЕВА

кандидат биологических

наук Б. Г. МУХАМЕДЖАНОВ

Официальные оппоненты: доктор химических

наук, профессор П. П. ГЛАДЫШЕВ

кандидат биологических

наук А. У. АХАНОВ

Ведущая организация:

Главный ботанический сад Национальной АН Республики Казахстан, Алма-Ата.

Защита состоится « 1993 г.

в 5 час, на заседании специализированного совета

К 008. 22.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Институте молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина Национальной АН РК по адресу: 480012, г. Алма-Ата, ул. Мичурина, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке АН РК (г. Алма-Ата, ул. Шевченко, 28).

Автореферат разослан » <2-_1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, '■

специализированного совета, /у

кандидат биологических иаук^^ЛЭ—Н. С. ПОЛИМБЕТОВА

Актуальность проблемы. Характерной особенностью выслих раоте-'ний является их способность к образовании больного числа Школьных соединений (СС). В настоящее время-имеется достатйчко данных, поз-

воляющих утверждать, что' природные"СС является необхсдимкмн-и-актиг-------

ныш метаболитами клеточного обмена. Интерес к зтсй весьма числепной группе природных веществ определяется как теи, что ОС благодаря иирскому спектру биодогическогодействия нагл;? практическое применение в медицине, так и тем, что иксгие из ни:-: вь^слняет различные фигиолого-бксхимическпе функции в 'рагтнтель.ч:./ срганигуе.

Несмотря на больше успехи, достигнутые в игуче;.;:.;: К, ш-::гне вопросы требует дальнейшие исследований. Далеко не достаточно выяснены вопросы регуляции образования 1С, их po^ii а. с'Саг« цгггбсдпг^й растений и механизмы биологического действие. Изучение укагаязьс: вопросов, выявление новых аспектов биологического действия К, поиск и изучение растительных источников биологически активных земств, представляют теоретический и практически интерес. Б последние годы для решения теоретических и прикладных задач' пирско используются культуры изолированных клеток и-тканей растений. Это обусловлено как болызшк возможностями самого метода культпзпрова-ния клеток in vitro ( опт легация и стандартизации услов::й выралг:-Еания, возможность использования различных зффектор-ов), так и потребностям:-: получения данных физиологически активных весеств бз:отех-нологическим способов

Дикорастущее растение верблхкьей колечки i Alha^i k:r-s!".iscrur, Schrenk. , семейство Legmr.inc-ssa) характеризуется высоким содержанием различных классов 02, проявляющие биологическую актганоеть (Бугаева и др. % 1976,1577,1960 ; Srailav, 1330). Сведения о куль-туре клеток верблюжьей ко лечи: а литературе -oxcyscsaycrv ■

• gga' г. задачи вадагомазд^ Баетсягзйработы било полу-

чение куль ткгируе tea; клеток и ткааей азрСсаскьей калзечки и изучение особенностей образования а инхСС, нх и адь-п^^кь^;

вкяс-'екие воэшянсстеа регугяа?» Саосадгега 2С а выхманке С;:;л:т:!-даекей активности $екольньк верста, ciSKesispyausar a уггевгах in vitro. N

S связи с зткм были поставлены егедухг?» задали 1. ГЬлучить каддуснь» н суспешсгаа» к/гмгуры К»?*«»-

sorusi.

2. Выделить и идентифицировать ОС, синтезируемые в клеточных й|

ткглевых культурах., •3. Изучить возможности регуляции образования ФС путем измене-:' ния химических и физических условий культивирования (гормональные эффекторы, свет, влияние грибных элиситоров). ( 4. Отработать систему клонирования и получить серию индивиду-;-• альных клонов с различным уровнем -биосинтеза ®С при испольу зовании разных систем отбора ( спонтанных, кндуцирозаннь± " ШВЛ, а также резистентных к 1ША, спонтанных и'дадуцирован-ных). ; '

6. Изучить ' биологическую активность ОС, синтезируемых культурами клеток верблюжьей 'колючки. : : ; Научная новизна. Получены тканевые и клеточные культуры верб-лшьей колючки, способные к длительному пассированию на агаризован-ной и в жидкой питательных средах. В результате проведенных иссщ-дований получены данные о закономерностях образования. разлитых классов фенольных веществ при культивирований клеток в условиях in vitro. Впервые исследован химический состав СС культивируемых клеток верблюжьей колючки. Показана возможность направленной регуляции образования СС прй воздействии стрессовых факторов ( элиситоров, 'изменение гормонального состава, дефицита сахарозы в питательной среде). Отработана система клонирования при обработке мутагенам'и полнены клеточные линии, отличающиеся повышенным уровнем- биосинтеза и измененным по сравнению с исходными культурами составом ОС. Показано ингибирутвдэе влияние суммарных, препаратов и отдельных фС на биосинтез белка. Выявлено умеренное ' цитотоксическое действие ЕС культивируемых клеток на рост различных опухолевых штаммов m vitro.

' Теоретическая я практическая значимость.работы. Культуры ' кл|-ток и тканей верблкшьей колючки -могут быть использованы !в качестве источника получеши биологически активных веществ фенольной природы. Полученные в работе, данные позволяют направленно регулировать процесс образования ©С. Показана эффективность использования ШШ и . ПСКЕА в качестве селективного фактора для получения клеточных штаммов с повышенным уровнем биосинтеза биологически активных веществ фенольной природы.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты'докладывались на IV конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана

С Аихабад, 1935), на 1 Всесоюзной научно-практической конференция "'применение достижений биотехнологии в народном хозяйстве" ( Уфа , -1987) -на-5-ой- международной.конференции "Биология _ культивируемых

клеток к биотехнология" (Новосибирск,1988), на 6 симпозиуме Е5йС по " органической хплкп ( йгосдания,1939 ), на V конференции биохимиков Средней Агни и Казахстана (Тазкект, 1991).'

Публикации. По материала;.: диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литература, экспериментальной части, заключения и выводов. Рабата содержит 9 таблиц, 21 рисунок и список цитируемой литературы, включающий 214 наименований.

ОБЪЕКТЫ К МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили культуры тканей и клеток верблюжьей колючки, полученные в лаборатории энзимологии обмена природных соединений КМБиБ АН Республики Казахстан в 1985 г.

Получение каллуской культуры. Каллусные. культуры получали из

кончиков ткани корня, сегментов листа или стебля двухнедельных стерильных проростков. Ткань культивировали в стандартных условиях при температуре 26 ± 1 С, -в темноте пли в условиях 16-ти часового фотопериода (1000 лккс), относительной влажности 70%, на модкфкцкрсвач-исй среде Курасиге-Скуга ( ШгазГиее, Бкоог , 1952) с витаминам по Уайту (Зутенко,19б4), с добавлением '30 г/л сахарозы, 7 г/л агара :: различных сочетаний гормонов. ?Н ср^ды 5,7. Продолжительность цикла вцращквайил составила 4 недели. Ростовые гормоны ЕУК, 2, &-Д, кине-тик и ЕАП испытывали в концентрациях (мг/л): 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 1,0; 2,С; 3,0; 4,0; 5,0; ЙУК - 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 7.0; 10,0.

Суспензионную культуру получали из каллуской ткани ласта путгм ее переноса в жидкую питательную среду содержащую ЕАП и ЕУК (1 мт/ л). г 'опенэию культивировали в стандартных условиях ка круговой качалке со скоростью 90 об / -мин. Цикл выращивания составил 3 надели при исходной плотности 0,5-1,0x10 *'кл/кл.

Клонирование суспензионных клеток, аадаидугльные адонн получали по методу Бергмана ( Вег^г,апп,1950 ).

Обработка суспензионных ¡слеток К-нитрозо-К-шпгдггочезизой (.У-

: •■ .. . - 6 -HLG.Í ). С целью обогащения исходной популяции измененными клетками, .2-не дельную культуру обработали мутагеном N-ffi"' в концентрации 4 мм/час пс общепринятой методике ( . Пймина, .1984 ). ,

Активность Ь-фенклалакинаммиак-лказы (ДАЛ) определяли по1 образованию коричной кислоты при 290 нм согласно методике (ZuckerJ1S65).

Активность' пероксидаэы : определяли по начальной скорости,'окис-- ¡ ления о-дианизидина при 460 км при комнатной температуре ¡ (.ребедева j и др.,1977). ■• . i '■-

Белок' определяли по микробиуретЬвсму методу (Кочетов, 1971). Патогенный гриб Helmintixsporium sativum выращивали на : синтетической среде Чапека (Кирай и др., 1974) в термостате при температуре 24 С.. Грибной злиситор получали автоклавированием 1 г сырого ,! мицелия гриба в 100 мл воды в течение 30 минут (Zucker, 1965).

Л1\. 1 !

Для определения включения С СЗ-фенилаланина в ®С клеток в кол- \ бу со 100 мл суспензии (плотностью 2,0-2,5хЮ5кл/мл) добавлял! 10 ■ мкл [ СЗ -фенилаланина (430000 dpnrmin) и 8 мг фенилаланина. Клетки"» отфильтровывали, растворимые ' <ЕС извлекали этанолом и измеряли ин- ; тенсивность импульсов в обдам спиртовом экстракте или в растворах ! отдельных соединений на приборе "i/ark" фирмы "Bekman" (Имения)1, - i Содержание SC г зтанольных экстрактах определяли спектрофато- ¡ метрически с реактивом Фрлина-Дениса ( Запрометов,1974 ) по' погло- ' щенка при 725 нм. Для построения калибровочной кривой использовали ! пирогаллол. ./ ~ / ' ' i

Анализ ДС. Хроматографию на бумаге выполняли восходящим спосо- ¡. бом с применением бумаги FN-lü ("Filtrak",Германия) в системах' раст-i ■ ворителей бутанол-1уксусная кислота - вода (ЕУВ, 4:1:2) и ук- •' . сусная кислота. £С обнаруиивали по специфической флуоресценции при просматривают хроматограмм в УФ-свете до и после обработки аммиаком и по'качественным реакциям со специфическими реагентами (Mark- | ham, Mabry, 1375; Кльшев и др.',1978) Лонкослойную хроматографию про~ водили на пластинках Silyfol UV-254 (Чехо-Словакия) в системе растворителей хлороформ - этанол, 95: б.7 Высокоэффективную жидкостную . хроматографию (ВЭЮО/ проводили яа октадецилсилильных сорбентах при 'элюировании смесями Этанол/вода. :,.• .'" . • . ! „

* Для выделения индивидуальных СС использовали метод колоночной хроматографиинасйликагелэ (Chemapol L 40/100), на полиамиде ( Wo-elm, Германия ) и метод ВЭЖХ на' октадецилсилильных сорбентах ( Хос-

Гетман, 1988).

Идентификация SC. Установление структуры соединений проводили с помощью спектральных, методов, хроматсграфического поведения, качественных реакций и реакций деструкции ( Казицкна, Куплетская, 1958; Mabry et al. , 1970 ; Kiarkham, Mabry, 1975, 1982 ; Еандюкова , 1983; Marborn, Williams, Wilson, 1985; Porter, 1971,1385).

Электронные спектры поглощения записывали на спектрофотометре "Hitachi 330". ИК-спектры получали на приборе UR-2Q (Германия),таблетки KBr. Масс-спектры ползали на приборе Varian-MAT 44(США) при энергии ионизирующих электронов 70 эЕ. Спектры ИМ?.регистрировали в СД30Д или ДЬБО-d б на приборе Bruker С Германа ) с рабочей частотой 90 (ssmgCTza 1,3,5) или 5С0 1£гц (вещзства, ¿,5,7).- - Приведены сдвиги в 1ькале & (м. д. ).

РЕЗУЛЬТАТЫ Ï1 ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.. Влияние гормональных регуляторов на рост и накопление ffiC в каллусной культуре верблюжьей колючки. . •

Гормональные регуляторы могут и блокировать,' и стимулировать ; биссякт.?з 60, при этом их действие зависит от специфики и концентрации горшноподобного зффектора (Bote, 1981; Zaprosötov.lSSS).

Эксплантаты получали из различных частей проростков вэрблшьеп колючки и исследовали влияние на их каллусогенез и накопление ïïC экзогенных гормонов в различных сочетаниях к концентрациях яз исследованных более 40 вариантов сред для кзлдого типа эксплантата ке было установлено существенных различий л поведении тканей разного происхождения. Рост тканевых культур, морфологические характеристики и количество'®; в большей мэре зависели от концентрации гормональных регуляторов, их комбинаций, чем" от нроиехоядвния ткани.

йспользозание комбинаций ВАЛ и ПУК было оптимальным и привело к интенсивному каллусогенээу и образованна хорош растущих культур. Шздучшй рост отмечен у каллусных культур листа и стебля, культуры корня харак: -ризовадись меньшей интенсивностью роста.

Интенсивный прирост биомассы наблюдали не среда::, содержащих 2,4-Д.к.юшегш. Отличительной: чэртой культур, рфорадроарашхся на этих средах являете отсутствие У ннх оргзиогонзза п длительный гдаи ззырзцдаанкя (8-10 недель).

Использование сред, содержащих КУК или комбинации КУК и кинетика, а также комбинации БУК и кинетика не позволили получить жизнеспособные длительно пассируемые тканевые культуры. ■

Анализ СС показал, что использованные гормональные эффекторы влияли ка содержание в тканях обшэй суммы растворимых ФС и относи-, тельное содержание отдельных компонентов. 'Содержание суммы растворимых ОС колебалось от 2,3 до 0,3 ка сухой вес. Большее содержа-: кие СС наблюдалось, как правило, в текноокравгенных с болыаи^ количеством некротических участков тканях, не способных к стабиль-кому росту. Качественный состав СС оставался неизменным во всех испытанных вариантах.

2. влияние света ка рост и метаболизм СС каллуской культуры верблюжьей колючки. I

Для многих клеточных культур свет является аффективным индук+ тором биосинтеза коричных кислот, лигнина, флавонов, антоцианоз и других фэнольных веществ (НаПИзгоок ей а1. ,1930; Запрометоз,1988)., Для изучения влияния света использовали однородный хоросс расг тущий (рис.1) на среде с 2,4-Д и кинетином (1мг/л) желто-зеленого цвета каллус, характеризующийся средним уровнем биосинтеза СС'. Культуры выращивали при 16-часовом освещении или в темноте. Уже через 2-3 пассирования у темновой ткани наблюдались морфологические изменения. Ткань приобрела светло-желтый цвет, более рыхлую консистенцию. Однако, прирост биомассы, накопление СС в обоих случаях отличались незначительно ( рис.1 и 2 ). Качественный состав СС не зависел от условий освещения. Накопление суммы растворимых СС менялось по мере роста культуры и в цикле выращивания обоих вариантов имело 2 максимума. Один из них приходился на начало экспоненциальной фазы, другой - ка стадию замедления роста.- Параллельно анализировали изменения активности САЛ - ключевого фермента биосинтеза фенилпро-паяоидов . Характер изменения активности ФАЛ в цикле выращивания световой культуры заметно'отличался от темновой на стад;;;: лаг-фа^ы ( 1-2-я недели, рис.2 ). Этот период сопровождался увеличением активности фермента в культивируемых ка свету тканях и уменьшением -в темповых. Уровень максимальной активности фермента и характер изменения активности при дальнейшем культивировании в обоих случаях были практически одинаковы. Индуцирующего- влиянии на активность САЛ

Возраст кэглиури, нелеп«

Рис. 1. Динамика "роста Кадлусных культур верблюжьей колючки, выращиваемых при 16-часовом фотопериоде (1) и в темноте (2)

Возраст культуры, недели

'ис. 2. • Накопление сушы растворимых фэнольных соединений (1.1') к изменение активности ФАЛ (2,2/) в культурах тканой , выращиваемых ..ри 18-часовом освещении (сплошные,линии) .или в темноте (пунктир)

исшшспаннйй белый свет (флуоресцентные лампы) не оказывал, i

Отсутствие индуцирующего влияния света в к~лем случае связано, вероятней всего, с малой.его интенсивностью или неэффективность*;

использованного спектрального участка. 1

' ! ■ i

' 3. йаакческий состав фенольных соединений культивируемых фгеток и тканей верблюжьей колючки • . i

Исследования СС методом ВЭЖХ проведены в Институте Ьиооргани-ческоГ; химии им. М. iL Иэмякина РАН .

3.1. Особенности образования.ЙС. i i

При культивировании клеток в условиях in vitro происходит; сни-»йкке содержания .растворимых ®С по сравнению с надземной частью исходного растения в 7-12 раз (до 0,8-1,4% - в каллусных и d,5r0;8% -в суспензионных культурах). При этом в культивируемых клетках ; зна--«¡теяьно изменяется качественный , состав SC. ■ ' j

Наиболее стабильным, сохраняющиеся в каллусных и суспензионных клетках культуры, является • биосинтез, изофлавоноидоз.; В

.■»s й я-

VI

' -о.

-- jg

30 Й , iO

вреаа !, чин.'.

. Хроматографа зтилацэтатного экстракта надземной' чрсти кел какого растения (а) и каллусных клеток (б) вербяакьей

колючки, полученные методом В32Х % - неудержвазше на колонке лиофилькыа фенолышэ соединения, 2 ~ 7-окси-4'-метоксиизофдавон (формококетин). 3 - 7,3-дкокси-'4'-шюксиизофлаЕон ( каликозкн ), 4 -7-окси-8,4'-дамзтоксиизофлзвок (матилретузин), 5 - 7,8-диокси-4'-мэтоксиизофлавои (рэтузин)

| Г - и - , С

■культивируемых клетках биосинтез изофлзвоноидов не только сохраня-ется^ ко и усиливается до 25-30 % ( вещества 2-5 на рис. 3) от обкэй суммы растворимых форм- при - заметном -. ослаблении ~ накопления- - других классов СС.

Длительно сохраняется в тканевых и клеточных, культурах синтез

веществ, предварительно отнесенных к коньвгатам фенолкарбоновых кислот (рис.4). Синтез других классов СС менее .стабилен. Уаке в тканям культуры первых пассажей (1-3-й) наблюдается заметное ослабление накопления таких классов СО, как флавонолы и их гликозиды,биосинтез

1 - изорамнетин, 2 - квер-цетин, 3-5, 16-19, 23, 24 -неидентифицированные соединения, даювде реакции на полифенолы, 6-12 - коньюгаты фенолкарбоновых кислот, 1315,25 - изофлавокы, 20-21 -флавонол-гликоэ иды, 22- рам-ноглюкозид изорамнеткна.

15* ндс

Рис. 4. Схема двумерной хроматограммы на бумаге этанольного экстракта каллусной культуры верблюжьей колючки

которых полностью утрачивался через 7-10 пассажей. Биосинтез таких классов ТС как катехины, проантоцианидины и их полимерных форм, ик-гибирован полностью уже на начальных этапах культивирования, г

3.2. Разделение и идентификация фенольных соединений.

С испо. .зованием хроматографических и спектральных методов из чаллусных и суспензионных клеток выделено и идентифицировано 7 фла-зоноидных соединений, изофлавоны ( веп^ства 4-7)-для данного расте-зия, исходного и в . ..ловиях in vitro, описаны впервые.

Взвдство 1, состава С151Ц00? , т.пл. 310-312°С (хлороформ-мата-

нолц),Лвах . НИ (этанол): 25$,2695Ь, ЗООэЬ, .370 ; ИК-спектр ( КВт, см" ): 3400 (ОН), 1655 (С*0), 1615, 1560, 1525 (С=С аром.). Данные ПМР-спектра вещества 1 и последующих приведены в табл.1. Вещество 1 идентифицировали как 3,5,7,3',4' -пентаоксифлавон (кверцетин).

Еещество 2, состава С^ф^у, т. пл. 204-306° С (хлороформ-этаЧ нол); Л шаос «нм (этанол): 254, 2§8зЬ, 306 зЬ, 371; ИК-спектр:( КВт,! см" ): 2900 (ОН), 1600 (СМ)), 1610, 1570, 1510 ( С=С аром. ); мацс-спектр, т/2 (7.): Ы+316 (1СЮ), 301 (37), 287 ( 56), 273(42), 257(15), 145(47), 151(63). Вещэство 2 идентифицировали как 3,5,7,4'-тетраок-

■;.; Таблица 1

ШР-спектры флавоноидов культуры клеток Alhagi kirghisomn

> : .1

--Н-

Химические сдвиги протонов, м. д. . i • ; ..

Соединена

Н-2 Н-5 »-б Н-8 Н-2' Н-3' Н-5' Н-6' \ -0СН3

1(R'=R"=H)

2(R'=H,R"=C%)

3(R'=Glc-Riia,

•R"=CH3) 4( R'=0H,R"«=H) 8.

5(R'=0CHj, 8.

R"=H) 8(R"«=H,R"«=0H) 8.

S.18d 6.52d 7.64d

J=2 . J=2 j«=2

6.31d 6.59d 7.85d

J=3 J=3 J=3

■ 6.29d 6.39d 7.93d

J=3 J=3 J=3

6.79d 7.72dd i J=9 ! J=9h2 i 7.05d 7.79ddj 3.86s J=9 - J=9k3' 6.91. .7.62dd ¿.94s J=9 J=9n3

35s 7.97d 6.97d . J=9 J=9 28S 7.79d 6.99d J=9 J=9

7.5ld 6.99d 8.99d 7.51d 3.77s

J =9 J=9 J=91 J=9

7.45d 6.97d 6.97d • 7.45d, ¿94s,

J=9 J =9 J=9: ! J=9 3.88s j

.28s 7.95d __7.05-6.85(ш,5H),H-6,8,2',5'j6'_3.80si

J=»9 | ■ . . f

7(R' =R"=H) 8. 43s 8.07Й 7.18dd 7.25d 7.54d 7. Old 7. Old 7.54d . 3.79s-

J=10 >9иЗ J«=3 J=10 J=9 J=9 J-iO ! '

Химические сдвиги приведены в шкале S , внутренний стандарт-ТШ, константы спин-спинового взаимодействия (J) в Гц! Спектры' сняты в CD30D (вешрства 1-3,5) или 8 DbS0-d6(вещества 4,6,7).

Обозначения: d-дублет, dd-дублет дублетов, игмультиплет.

' - 13 -

си-3' -метоксифлавон (изорамнетин).

Ееиество 3, состава Сг^з^'*» т. пл. 172 - 174° С ( этанол ); ^ шах" • ни"(этанол)'Т 256,' 26431-1, '307зЬ,~ 359; Ж-спёкгрКВг,см1 ): '3300-3500 (ОН),1660 (С=0), 1605,1570,1510 (С=С аром.); масс-спектр, т/г (%):}/316(100), 346(10), 301(57),287(62), 245(58), 217(45), 151 (41). ПЫР-спектр представлен на ряс. 5. При кислотном гидролизе вещества образуется глюкоза, рашоза и агликон (М+316) идентифицированный как изорамнетин. Вещество 3 не подвергается щелочному гидролизу, что характерно для гликозидоз с 1,2-порядком связи между са-харами (Литвиненко, Шкаров, 1969)„ Шлученные данные позволили идентифицировать Бвдегенясэ со единая!» кгк 3^0-веогасаеридоззд-5,7,4'-триокси-3' -метоксифлавона (3-0-неогееперидозид изорамяетина).

8 7 С 5.4 3 2 } О

8 , а.д.

Рис. 5. ПМР-спектр З-О-неогесперидозида изорамнетина

о

Зэщэстзо 4, С16Н12О5, т.пл.243-250 С (!.ё ОН), аах,нм(этанол): 258, 299; масс-спектр, п/2(%): 284(100) ,268(21) ,151(35) ,134( 43).

Еэщэство 5, СЦ7И,405, т.пл.217-221°С(МаОН), ЛШах,ш(этанол): 254, 302зЬ, 340 ЗЬ; 1^298(100), 283(18), 268(20), 255(12), 137(42),. 128(35). ;' -

Зэщеетзо 6, т.пл.226-230 С®(2£зОН), Л иах<г»;Сэтанол):

210зЬ, 245,2563)1,285; М£СС-СПеетр, а/г (%): Н+284 ( 70),269(30), 25& (12), 137(52).

Вещество 7, й(бЕ|204, т.ях257-259°С (МэОН), Л аах,нм(этанол): 252,280зЬ,302з11; масс-сяёктр, И/г (X):. Ь5+268( 100),253(17), 251(20),

- 14 -

241(10) ,197(7), 168(10) ,151(20) ,121(45).

• Вещество 8, С^Н,^ ,Хшах ,нм ( этанол ) 254, 298 sh; масс-спектр, m/z (%):ií298(100), 283(41), 268(35), 255(35), 237(68), 191 (53), 138(30).

Вепрство 9, С15Н,0Об,Л шах,нм (этанол) 233, 254, 205sh; масс-спектр, ш/г(%): М+ 286 (100), 271(80), 259 ( 65), 241 (70), 227(45), 151(53), 137(52).

Ка основании полученных данных и сравнением их -с литературными (Hayashi, Thomson, 1974; Vong,1975; Kaneko et al. ,1988) вещества 4 -7 были идентифицированы кг.:; 7,8-днокси-4"-метоксиизофлавон(ретузин) (4), 7-окси-3,4'-диметоксиизофлавон (8-метилретузин) (5), 7,3' -диок-си-4'-метоксиизофлавон (каликозин) (6) и 7-окси-4'-метокснизофлавон (формононетин) (7). j-

Для веществ 8,9 на основании данных масс- и УО - спектроскопии предварительно предложены структуры 7,4'-диметокси-8-оксииэофлавойа (8) и 3', 4*, 7,8( или 5) -техраоксиигофлавона (9). ¡

Наряду с описанными флавоноидами, в каллусных и суспензионных клетках верблюжьей колючки стабильно сохраняется биосинтез вещает^, отнесенных к коньюгатам фенолкарбоновых кислот. Эти соединения (■€-12 на рис. 4) имеют голубую флуоресценцию в УО-свете, гидролизуются минеральными кислотами с образованием оксикоричной кислоты ( кофеЛ-ной или п-кумаровой) и соответственно углевода ( глюкозы, рамнозы) или хинной кислоты. УФ-спектры этих соединений имеют максимумы поглощения в области 320-330 и 240-245 иди 300-315 и 230-235 нм. Излученных данные позволили предварительно отнести эти вещества-к эфирам кофейной ( или п-кумаровой) кислот соответственно с углеводами ( рамнозой и глюкозой) или хинной кислотой ( Драник, Шуберт, 1S70; Еандюкова, 19S3).

4. Влияние грибного элиситора Helminthosporium sativum" на метаболизм -ОС суспензионных клеток' верблюжьей колючки.

Исследовали ус -вия, позволяющие индуцировать синтез различных ■-.лассов <ЕС. Одной из. задач явилось, изучение ответных реакций суспензионных клеток колючки на обработ^^ элиситором, а также -1 оценка ро^Рэкзогенного.фенилаланкна в интенсивности ответа!

•..Обработка б-8-сутог ">й суспензии элиситором привела к угнетена роста культур:о( на!3-18Х), снижению жизнеспособности клеток.

5000

я

Г!

а

5

о ет о

о а.

I

0

1

ш »

а

•е

о

»

д I

Рис. В.

I I I I-!-—Т-1-Г—1-Г

3 6 12 13 24 ад

час

Изменение активности ФАЛ и пероксидазы в клетках суспензии посла добавления элиситора .

б 12 24 '¿С '48 Время, час

Рис.7. Изменение' содержания ®С в интактных (1,2) ;; обрабогаг.иыч элиситором (3,4) клетках сусдензии с добавление» (2,4) или без добавления фекилаланина (1,3) *

При атом в клетках увеличилось содержание суши растворимых ФС , воаросла активность ферментов их обмена - ФАЛ и пероксидазы ( рис.6 и 7 ).

Добавление злиситора вызвало изменение количественного и качественного состава ФС. Наиболее интенсивно накапливающиеся в обработанных злиситором клетках вещества (их содержание возросло в 3-8 раз) были идентифицированы как изофлавоноида, в том числе калико-зин,формононетин, ретузин и 8-метилретузин. Наряду с этим синтезируются вещества, не обнаруженные.в интактных клетках ( фитоалекси-ны), отнесенные к классу глтоксилированных оксибензойных кислот.

Индуцированные злиситором изменения биосинтеза ФС в клетках верблюжьей колючки наблюдали в опытах с меченным фенилаланином (рис. 7). Наблюдаемое превыдонние суммы отдельных эффектов при их совместном воздействии демонстрирует тот факт, что интенсивность ответных реакций может лимитироваться наличием в клетках пула свободного фенилаланина. I

Усиление биосинтеза ФС (в 1,4-1-,8 раз) и индукцию ФАЛ ( 8-10j-кратное увеличение активности, фермента в течение 12-24 часов )|в клетках суспензии верблюжьей колючки наблюдали при воздействии дрзр-пвс стрессоьых факторов: при изменении состава гормональных эффекторов в среде - культивирования или 10-кратном (до О.ЗХ) снижении концентрации .сахарозы. V

Шлученные данные показывает, что скоординированные изменения активности ФАЛ и накопления ФС в культивируемых клетках верблюжьей колючки происходят в ответ на различные стрессовые факторы. Отличаясь по времени проявления, эти изменения носят сходный характер и выражаются в относительно быстром ( 6-24 часов) обратимом увеличении количества ФС и активности ФАЛ и являются неспецифическим ответом клеток на неблагоприятные условия культивирования. ~ - - v

5. Действие N-нитрозо-М-метилмочевины • на изменчивость кленовых

популяций ве^лшьей галочки in vitro. Работа выполнена в Ин-те физиологии растений РАН в лаборатории ■ генетики культивируемых клзток сод руководством д. б. н. Шминой 8. Ei ОднимОз подходов к получение клеточных штаммов/ способных К ' активному0 метаболизму и биосинтезу искомых продуктов является ис4 пользование генеп§юской вариабельности культивируемых клеток и

/волт'ление их спонтанной изменчивости обработкой мутагеннкж факторам.

---------исходным_маугриалом слухпл:-; стабильно растущая

^алегкук^ся ьь гой-й'":.сгз неспособность о - не - протяжек;::: -

о, >:..от;.-л гтеток. Эфдектавяость ¿¿рассхи;:;..:

к::,:?.;:-:. ¿-го:.; ссорила 0,£-С.

Дя? рь'дедакяя клеточных лииш с урс£н-з.',: .

клеток ^д ор..-д..г - пар:-".-

г.^ужпъ та^тистешпм фактором в накоплении флавонопдоз

и другие

рслст"'?"1-:'-^ юш^пСишо, чер«* (

ка, Вгйнярв, 1357). Поэтому получение мутантов уеа'0«ч1мс«,1.; "СГЛ делает всоьяшкм выделение клоков с повышенны:-.; содержанием фенсль-кых веществ.

С целью определения оптимальных условий, при которых еле;:, .-с вести селекции, проверили чувствительность культуры к селективному фактору. Для селекции была выбрана доза О.БмМ 1ЕКГА. В этих уел вкях ?'К'-?к-гпзкость образования колоний составила 1,5x10-4", что в 50 рад

:•':.:<,'-;£!.. кг, оскохшсй "о есть, гкделпть резистентные ::

>:а.:: гг-;^;1, ^арактерис^^-оя зысск::м мутацпоккк)..

СС,ра~-о:\-:о :слетск мутггексм заметно изменила осот 1-:с*ле:-:::: ло. Тчзолхс :-г-лог:;.й по сравнен::» с исходной г:о::;г-:л:и:г'\ •:;•:.:•.-

•¿¿•л::* частоту сбрг.ге?£гк;:я спонтанных к гадуц;:рс2а;;::ы:: 2''.:: тектных к ПОЗА колоний показало, что в обработанной ¡¿уха: ¿ко,-,-. г»ул.чци;: '¿сь,зс?аг? в раза деля клгтс", способных к длительной

Г.р'—'-^. "¡.ЦЛ/! ю ^. ^ I »С У1' ОТ Ь < Ь а ехп 31Л0 с. ф*3 л I- * Л л«Л ^ п л 1К ( х сЮ Л. / , 'и _ ."

зыггет ка увеличение НШ мутационного эффекта.

Таким образом, были получены 4 группы индивидуальных клокоз, тпоятаптах, :«ндуцкроаанных НШ, а такмэ резистентных к ПОЗА (спон-

•.'гкйУХ :: ::кдуц:;ро2г;;кых). Лсл^нкь» рггличншг: сг.осос^:: дрались г»и йН1«кс;аности рсста, цвету, хскскстй:::;;::;, к;;.'.::'-:.--; у.-,..' и составу о; и их ополргпческсй актпзксст::. по

урсьиа бпоспягеза 28ргкгор:£ЗС2ал${Сь клскьг с пндурЦ'роЕанло::

■ - 18 - ••

тенткостьв к 1ША. В этой группе выявлены клоны, содержанке ОС в которых не отличается от контрольных.;(40%), ■ с повышенный (33%) или пониженным (27%) уровнем биосинтеза. Содержание ФС в двух наиболее

Таблица 2

Эффективность образования клонов при разных условиях селекции

Варианты*

Исходная

плотность

засева

Эффективность

образования

колоний

Эффективность .образования клонов

К

1ПП/

' П®А .

шы+ПОДА

5,0x10 1,0x10^ 2,0x10' .5,0x10

А

7,9x10 1,6X10 1,6X10 2,7x10

=5 -3

4,5x1 СГ* 1,2x10""' 0,9x1 б"5 3,7хЮ""5

Обозначение вариантов: .•'.-■' • !

К - линии контрольных' клеток, растущие , на основной среде; НЫЦ -■ линии клеток,' обработанных ЕШ, растущие на основной среде;; 1ИХ2А-линии исходных ¡слеток, культивируемые на среде, содержащей ШФА; ЕУМ+ПОЗА. линии клеток, индуцированные НШ, культивируемые на селективной среде. |

продуктивных- линиях было в 3,5 к 4,1 раза вышэ контрольных клеток.-Индуцированные ШН клоны по интенсивности биосинтеза не отличались от контрольных. Клопы со "спонтанной резистентностью к 1ША характеризовались интенсивностью биосизтеаа на уровне контроля-или в З-4 раза кижэ последнего.

6. Влияние СО культуры кдэтоя верблюжьей гадючка и поденных а результате спокташгаго пшдуцярованкого иутагенеза поточных клоков на бкосштеэ белка.

Влияние ФС на биосинтез белка испшызали в даЗораторш белками нуклеиновых кислот йЫВиЕ. .'

Изучал влияние щздивидуальню ЕС к су1шрных; препаратов различных к&точных и ткан^ьсс культур на биосинтез белка. Оценку прз-• паратов. провод1шг0на основе ингибируащэго действия на процессы бко-

синтеза, лолипептидов з Оесклетрчной системе из ретикулоцетов крепка ( Smailcv et al. ,1990")7'ёио~п"о^"^7что_найСольп5^"актганость""" в условиях опыта проявляет сумма SC общей этилацетатной фракции. . Эти вегззэтва а концентрации 0,1 мг/мл на 80% подавляли активность фактора инициации eIF-2. Активную суммарную фракцию СС разделяли на индивидуальные компоненты и- также тестировали в выбранной системе. Индивидуальные ЕС оказывали меньшее ингибирудвде действие. Наибольшей активностью обладал а-метилретузин (45% подавления активности), несколько меньшей -. каликозин (35%) и ретузин (251).

- Ш, основе влияния суммарных фракций ФС на биосинтез белка з выбранной тест-системе провели оценку биологической активности 50 клеточных клонов, полученных различными способами. Выло выявлено 11 клеточных клонов, продуцирующих активные в выбранной тест-с-стеме ■вторичные метаболиты. Суммарные спиртовые ' фракции ФС. отобранных клонов на 40-99* подавляли процессы биосинтеза белка. ,

Противоопухолевая активность.

Исследовали влияние суммарных препаратов <£С на рост опухолевых клеток различных тест-культур: культивируемых в конослоэ опухолевых клеток линии CaOv карциномы яичника человека ( НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ЕОНЦ АМЦ СССР);на рост суспензионных культур карциномы Зрлиха, аффинитентного штамма карцйносарко-мк Уокера и клеточного штамма миеломы мышей Y-53 (KaaHJQi онкологии и радиологии), а такай в тест-системе с Tetratvnena puriformis (Кн-т биоструктуры, Варшава, Шлыпа) согласно разработанному методу ( Re-Ьаг,del et al., 1Э81; Gierczak, Rebands1, 1984).

Экстрактивные вещества обадэй этилацетатной фракции, обнаружив--еэй максимальную цитотоксическую активность на рост перечисленных выше опухолевых культур, разделяли на отдельные составляйте методом ВЗЖХ. Для полученных фракций в'лаборатории кадико-биалогич^ких моделей и генетики опухолей (Алма-Ата, Ин-т онкологии и радиологии) был проведен прэскрининг. Результаты проведенных исследований показали, что различные фракции фенольных вэа&стз культивируемых клеток екгаквают умеренное циготоисаедское действие :л тормозят.. Я'т опухолевых клеток в небольшом проценте случаев. Процент торможэния росс та опухолевых ¡слеток различит штаммов наиболее активними фракциями <ЕС составил 49-37Х. - V.: X ^" ' ' '

- 20 -НЫ50ДЫ

1. Впервые получены длительно пассируемые каллусные и суспен-sконные культуры клеток верблюжьей колючки, сохраняющие способность к синтезу различных классов СС, свойственных исходному растении.

2. Изучен химический состав СС культивируемых in vitro клеток нерблгчсьей колючки. С использованием физико-химических методов анализа (ЯМ?-, У0-, I1K- и касс-спектроскопии) идентифицированы флаво-кола ( 3,5,7,3',4'-пек-аоксифлавок, 3,5,7,4'-тетраокси- З'-метокси-флавон, З-О-глюкораинозид 3,5,7,4'-тетраояся-3'-метоксифлавона ) и кзофлавоны ( 7,3-диокси-4' -метоксиизофлавон, 7-окси-8,4' -диметокси-изофлавон, 7,3' -диокси-4' -метоксиизофлавон, 7-окси-4' -мэтоксииао-флагон ).

Показано, что в культивируемых клетках и тканях стабильно сохраняется биосинтез иг - флавонов и коньюгатов фенолкарбоновых кислот.. Синтез других классов СС частично (Флееоколы) или полностью (кате-хины, прсактоцианидины и их полимерные формы) ингибирован уже на ранних стадиях культивирования каллусных тканей.

3. Культивирование каллусных тканей на питательных средах с различными ■ сочетания:,и и концентрациями гормональных эффекторов значительно влияет ка интенсивность роста культур, изменяет содержание в них ЕС п не оказывает влияния на качественный состав поли-Фенолоз. Не установлено существенного влияния светового режима культивирования ка накопление СС.

4. Показано стимулирузкцее влияние на биосинтез СС в условиях in vitro стрессовых факторов ( дефицита сахарозы, изменения гормонального состава, обработки злкситором ). Увеличение содержания СЮ сопровождается скоординированным повышением активности ключевого Фермента их биосинтеза - САЛ.

5. Использовакке мутагена и ПОЗА в качестве селективного фактора пс^олили получить клеточные клоны с уровнем биосинтеза СО в 3,5 к 4,а раза превызаюяим исходные линии, а также отличающиеся с? последних иорфо-физиологичэскими характеристиками, составом СО х биологической активностью.

с 6. Вьсшдоко ичгибпрущзг действие суммарных препаратов и икди-г-а/уагшес о^гдянзый кухьтазкртэик клеток на процессы биосинтеза

?. сг-нарууэвс узренное щготоксическое действие СС (до'49Х) ка

; п v.lic различных опухолевых стаммов.

8. Культивируемые клетки верблюжьей колючки могут быть использованы в качестве биотехнологического источника получения биологически - активных - вевдэств фенольной природы.__________

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Сапко О. А., ыухамедианов Б. Г., Кунаева P. U. Образование фе-нольньгх соединений в культуре ткани Alhagi. rirgisorum // тезисы докладов I Всвсо'оз. научно-пра1стической конференции "Применение Достижений в народном хозяйстве". Уфа.. 1987. С. 64-66.

2. Сапко 0. А., 1£г2змзд?йков Б. Г., Кунаева Р. М. Образование фе-рольных соединений в культуре ткани вероложьей колючки ( Alhagi Kirgisorum ) //■ Тезисы докладов международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология". Новосибирск. 1988. С. 73.

3. Kunaeva R. М , Mukhamedzftanov В. Q., Bolganbaev D. A. ,Sapko 0. Д. Regulation of biologically active compounds synthesis in plar* Cells culture // 16th international Symposium on the Chem. of Natural Products. LUPAC 88. Kyoto, Japan. 1988. P. A 34.

4. }>*ухашщаноз В, Г., Волганбаев Д. Д., Сапко О. А., Кунаева Р. Л _ Индукция, очистка и иммобилизация фэнилалакин-аммиак-лиазы суспензионной культуры верблюжьей колачкя Alhagi klrghisorum //Прикладная биохимия и микробиология. 1989. Т. XXV. В. 6. С. 752-758.

5. Кунаева Р. Н., Мзнадилова А. Н., Салка 0. А. Фэнольйыэ соединения растений Казахстана // Тезисы докладов 8 симлоз. ESCC по органической химии. Югославия. 1SS9. С. 233.

6. Сапко 0. А., Ьфха&аджавов а Г., Кунаева Р. м, Биотрангформация кверцетина и кофейной кислоты суспензией клеток Alhagi kirgfttsormi// "SsscTisr АН КаэССР, сер.биод. 1930. N. 12. С. 27-31.

. 7. Ууяамэджаков Б.Г., Сапко 0.Д., Кзшмчук И.С. »Акаева ?.!£<5э--вольные соединения -каляуша а с$гейенэшшых культур верблюжьей кг-дзчки и их биологическая активность // Тезисы докладов V конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана Ташкент, 19S1. С. 373. " " ■ ••

8. Smailov S. К., Los Д.. V., Shairhift 3. '/., Iskakov В.Ы., biukfca-.isdziianov В, О., Згрко О, А., Kunaeva R.U. The rola of phenolic cos-pounds at tha level of gene expression in' plant cells // -Abstract sf 3 th International Protoplast Sympogiup, Uppsala, Sweden. June

16-20. 1931. P. А 33; \

9. Smailov 5. К., Lee A.V., Shaikhin 5.M., Iskakov В. K., Sapko O.A., Mikhamedzhanov B. Q., Kunasva R. К PPA - a nover specific inhibitor of protein biosyntesis initiation // Plenary lecture at International conference 'Trotem biosynthesis". Pushchino. USSR. August 26-September 3, 1991. P. 30 of Abstracts. ■

10. 'Салко O.A., Мухамедканов Б. Г., Кунаева P.M. Образование фе-нэльнкх соединений г. культуре тканей верблюжьей колючки // Физиология растений. 1992. Т. 39. Б. 5. С. 172-178.

, 11. Сапко О. А., Мухамедзканов В. Г., Кунаева Р. М., Кяимчук К С. Способ получения каллусной ткани растения Alhagi kirghisorum. Положительное решение по заявке N 500 6593/13 - 057763 от 9.05.1992: г.

12. Сапко О. А,, Мухашдеканов Е Г., Кунаева Р. 11, Ахматулина Н. Б., Мустафин К, Г. ' 2зособ получения средства; обладающего! активно стью против вируса чумы птиц // Положительное редоние по- заявке N 4835774/14 ( 093456 -) от 30.03.1992 Г. ' j ; |

13. Сапко O.A., ¡Намина 3.Б., Кунаева.Р. 11 Действие М-нитрозо-К-мегилмочевины - ка вариабельность клоновых .популяций Alhagi kirg-hisorum in vitro // Физиология растений. 1993. Т. 40. N. 1. C.il-5.

14. Климчук И. С., .Сапко 0. А., Уухамэдканов Е. Г., Кунаева Р. * 11 Влияние грибного элиситора Hslminthosporium sativum на фенольный метаболизм культуры клеток Alhagi kirghisorum // Прикладная биохимия и микробиология. 1993. N.4-5 (в печати).

Г«». ЦОТ <Kut потопе, 3««. /// , 'uf. /йо W) г. 39 СХ