Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Термостабильный токсин Yersisnia pseudotuberculosis и разработка на его основе видоспецифических диагностических препаратов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Термостабильный токсин Yersisnia pseudotuberculosis и разработка на его основе видоспецифических диагностических препаратов"

РГ6 од

. . — 1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФВД2РАЦЯИ ПО НАРОДНОМУ ОБРАЗОВАНИЮ МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЗДЕРАЩИ ВЛАДИВОСТОКСКИЙ ГОСГ/ДЛРСТВЕМЙ 1ВДФШСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

БЕСВДЮВ АЛЕКСАНДР ЛБВСВЯЧ

ТЕРМОСТАШДЫШЙ токаш ГЕЕБПШ. РЗЕШЮТиВЕЯСЦЬ0313 И РАЗРАБОТКА НА. ЕГО ОСНОВЕ БИДОСБИЛФИЧЕСЛЖ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

(03.00.07 - микробиология)

Автореферат дассертацшх на соискакиз ученой стеши кацтрутата биологических наук

Глгдагос-ок - 12ЭЗ

Диссертация выполнена в НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РЖ! г. Владивостока.

Науччыо г ководители; Тимченко Н.Ф. - доктор медицинских наук, лауреат Государственной преши; Борти ев Ю.Б. - доктор химических наук.

Официальные оппоненты: Дзадзиоьа М.Ф. - доктор биологических наук, профессор, лауреат Государственной премии; Яньхова Б.И. -кандидат биологических наук.

Водущео учрешгащб. даодеэ внешний отзыв о научно-практической дойности работы - Российская Медицинская Академия им. Й.М.Се-ченова.

Защита диссертация состоится " фЛ 199 ^ г.

на заседании Специализированного Совета К.084.24.01 при Владивостокском Государственном медицинском институте по адресу: 690600 ГСП, г. Еладавосток, цр. Острякова, 2.

С диссертацией ысано озяакошться в библиотеке Владивостокского Государственного медицинского института.

Автореферат разослан " ^ " 199^. г.

Ученый секретарь Специализированного "овета, кандадат иедацшЕмшх наук, доцзцт

Диго Р.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность пройдет.

К настоящему времени значительно возрос уровень знаний о природе патогошгости мирооргшсгзмов - возбудителей заболевании человека и яивотных. Одним из признаков патогенности бактерий является их способность продуцировать токсшш. Г редко характер заболевания зависит не столько от вида микроорганизма, участвующего в инфекционном процессе, сколько от типа токсина, которой он продуцирует (Верткев Ю.В., 1987). Способностью продуцировать токсические вещества типа экзотоксинов обладают многие грамотрздатслышо бактерии, в том числе и иерсинии. Однако Еопрос о спектре продуцируемых и.\ш токсинов, об условиях их выработки бактериями л роли этих веществ в патогенезе заболеваний, вызываемых ими, изучен слабо. Не является исключением в этом отношении и Т. рБеийо1;иЪегси1сз1з .' 3 то ;;;о время, все проблемы, связанные с псевдотуберкулезной инфззщяей, весьма актуальны, так как эта нозоформа тлеет значительна удельный вес в патологии человека. В ряде р'егиояов ношей страны, в том числе и на Дальнем Востоке, эта инфекционная болезнь даот вспшки различной интенсивности, сопровождающиеся длительной потерей трудоспособности заболевших, тяяелыми рецидивами л осло;?лишямя. Как известно, в клинике пс евдо ту б ер "'.улез а ярко в нравен токсический кошонент (Борисова М.А., 1991). Однако, данные литературы о выделении, очистке токсинов псевдотуберкулезного микроба и изучении свойств этих веществ, весьма немногочисленны и разноречивы. К настоящему времени очищены и частично охарактеризованы только три токсические субстанции возбудителя псевдотуберкулеза - торг,^лабильный экзотоксин (Пашин А.Ю, и соавт.., 1384), термостабклышй токсин (Тимченко Н.Ф. и соавт., 1985) и Р?-ранний фактор, ■наруш.-шцаЯ проницаемость сосудов коки животных (Бисага Л.В., Недашсвская Е.Ш ( 1992).

Новый высокоочвденннй токсин псевдотубэркулезного микроба -термостабилышй токсин (ТсТ), внзшшадЯ гибель мышей при Енутри-брюшинном введении, был впервые получен р 1983 году й НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (Тшченко Н.Ф. и соачт., 1385). По данным авторов, этот токсин продуцируют более 8С$ изученных стам-мо'йт. рзеи<1о1;иЬегси1ов1а , выращенных при те:л1ературо+6-йЗ°С, независимо от серовара микроба. На основании этгас данных бшго сысва-зано предположение-о вадоспецпфичности ТсТ. Н.ф. Тимченко и соавт. (1981, 1983) показали, что возбудителе псевдотуберкулеза продуцирует несколько токсинов, однако их рать, в том числе, роль ТсТ, в

патогенезо болезни и формировании иммунитета к ней, изучена недостаточно. Неизвестно, вырабатывают ли иероинш этот токсин в организме человека и животных. Скудны данные о продукции ТоТ in vitro , о значении плазкид иерсшшй, в частности, идазадда вирулентности с молекулярной кассой 45 МД, в токсинообразовании. Отсутствуют сведения о наличии антител к ТсТ в крови больных псевдотуберкулезом людей. Кроме того, изучение свойств токсина, ц презде всего, убедительные доказательства чго вцдоспевдфичности, исследование влияния условий выращивания микроорганизмов на уровень продукции токсина, позволил!" бы получить сведения, дгтацяе оонование рассттривать токсин в качестве инструмента для создания видоспецифаческих препаратов для иммунодиагностики псевдотуберкулеза. Необходимость введения в практику таких препаратов (эритроцитарного антигенного диагностику!,а и иммунной диагностической сыворотки) обусловлена потребностью в ускорении и улучшении дифференциальной диагностики псевдотуберкулеза. Эти препараты позволят быстро и экономично отобрать большое число серонегативных образцов без нацраоного расхода юно-специфических диагностикумов и сывороток. Б нашей стране выпускается только один псевдотуберкулезный коммерческий эритровдтарный ди-агностикум, в котором в качестве сенсииша использован.модифицированный антиген Буавена псевдотуберкулезного микроба (Королюк А.И., 1983). Однако, этот препарат является моноспеццфическим, то есть он дает возможность выявлять антитела к иерсиниям псевдотуберкулеза, относящимся только к I серологическому варианту. Это приводит к тому, что многие случаи заболевания, вызванные иерсинияма III, 1У и других оероваров, не могут быть выявлены. Диагностические псевдотуберкулезные сыворотки, выпускаемые в России к настоящему времени, являются ыоно- и поливалентными (Дайтер А.Б. и соавт., 1991), и их использование такие не может обеспечить выявления бактерий псевдотуберкулеза всех сероваров.

В Связи с этим, для идентификации возбудителя псевдотуберкулеза известных сероваров, выявления антигенов этого микроорганизма и антител к нему, наиболее целесообразным является создание и ас-пользование видоспедафнческого псевдотуберкулезного эритроцитарно-го даагностикума и видоспевдфической псевдотуберкулезной агглютинирующей-сыворотки. Получение таких препаратов открывает перспективы для быстрой и аффективной диагностики заболевания, а также для решения многих вопросов патогенеза псевдотуберкулеза и иммунитета к этой инфекции.

Цадыо настоящей работы явилось ввделение и очистка термостабильного токсина Y. peeudotubsrouloзis , изучение некоторых его свойств, а также использование его при конструировании впдоспеци-фических диагностических препаратов дал выявления псевдотуберкулеза.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать in vitro влияние условий культивирования бактерий псевдотуберкулеза на данашку продукции имя термостабилыго-го токсина.

2. Ввделить И очистить ТсТ Т.pseudotuberculosis , изучить некоторые его физико-химические и биологические свойства.

3. Разработать влдоспецифяческпй псевдотуберхулезнын эрлтро-цитарный диагностикум.

4. Изучить зависимость чувствительности РИГА от степс"'л очистки препаратов токсина, используемых для приготовления эрнтроцл-тарного диагностикуыа.

5. Изучить кидоспевдфичность и чувствительность дпагностаку-ма в РНГА с сыворотками больных псевдотуборкулезом людей, с гипер-шшушшма сыворотками кроликов, полученгшш иммунизацией ливотшх иерсиниями псевдотуберкулеза разных сероваров, и с коммерческими сыворотка?,га против разных пред^-"атталей семейства Enturobacteri-асеае • .

6. Получить антиоыЕороткп против препаратов ТсТ разной степени очистки. Изучить возможность использования антитоксической сыворотки для идентификации культур возбудителя псевдотуберкулеза в реакции агглютинации.

7. Изучить видоспецпфичность антитоксической сыворотки и термостабильного токсина в РТНГА с лкз'аташ 1. pseudotuberculosis

I - У111 сероваров. •

8. Оценить возможность выявления в сыворотках больных псевдотуберкулезом лщей антител к ТсТ при помощи радаокммунного анализа (РИА).

Научная новизна и теоретическая значимость работ».

Осношше положения работы, характеризующие ее новизну, сводится к следующему:.

I. Впервые изучена динамика продукции ТсТ псевдотуберкулоз-ю-го микроба при культивировании бактерий в яидксЯ среде. Псг'.гз то, что бактерии псевдотуберкулеза, несущие плазмвду Еируле;ггноз?и с молекулярной массой 45 ЦД и гзогьнныо шг аымы, у тратит ал о пг-с-

дуцируют термостабильннй токсин при низкой £Ю°С) и высокой (+37°С) температурах. При температуре *Ю°С титр токсина в среде культивирования и в клетках бактерий в конце экспоненциальной фазы роста иерсиний достоверно превышает таковой при температуре+37°С.

2. 3 целью увеличения выхода Еысокоочищенного ТсТ модифицирована схема его выделегшя и очистки. Получены препараты токсина разной степени очистки - высокоочищенный токсин и "0,1 М фракция", содержащая ТсТ. Исследованы некоторые физико-химические и биологические свойства ТсТ.

3. Ич бактерий псевдотуберкулеза получен принципиально новый геыосонситин и на его основе сконструирован ввдоспецифичвский антигенный эритроцитаршй диагностику«, позволяющий определять антитела в сыворотках крови людей и нивотных, заболевание у которых вызвано иерсшшяыи разных сероваров, и антигены 1. раеийо-ЬиЪегси-1ос1а всех восьми сероваров.

4. Впервые показано, что видоспецифическая антитоксическая сыворотка, полученная иммунизацией животных термостабилышм токсином, является агглютинирующей, вследствие чего она шхет быть использована для идентификации бактерий псевдотуберкулеза всех сероваров.

5. Впервые с помсчыо РИА с использованием высокоочищенного ТсТ и иммунной сыворотки к нему выявлены антитела к термостабильно-ыу токсину в сыворотках больных .псевдотуберкулезом ладей.

Полученные данные вносят вклад в изучение теоретических проблем медицинской ьсядгабиологии, и црезде всего, в исследование механизмов продукции и функционирования факторов патогенности возбудителей сапронозов.

Практическая значимость работы.

Практическая значимость работы заключается в разработке новых видоспецифических препаратов дая' иммунодиагностики псевдотуберкулеза. Показана возможность диагностики поевдотуберкулеза с помощью видоспецифического псевдотуберкулезного эратроцитарного диагностика/а и вадоспецифической псевдотуберкулезной агглютинирующей сыворотки. Оригинальность способа получения нового гемосеноитина и ди-агностикума защищена авторским свидетельством & 1596528 от 1.06.90 на "Способ получения эритроцитарного антигенного псевдотуберкулезного диагностикута". Оформлена нормативно-техническая документация на препарат "Днагностикум эритроцитаршй псевдотуберкулезный видо-

специфпческий антигенный сухой для РИГА". Проведена первичная апробация НТД в Российском ШСК им. Л.Л. Тарасовича (г. Москва).

Оснорнке положения, внносимнв на защиту:

1. Бактерии псевдотуберкулеза, несущие шгазмиду вирулентности с молекулярной кассой 45 Щ и изогвнныэ атахш, утратившие ее, продуцируют тормостабилышй токсин при выраздоашти их в дидкой среде при низкой (>Ю°С) и высокой $37°С) температурах. Токсин обпаруяи-вается как в среде культивирования иерсиний, так и в бактериальных клетках. Титр ТсТ значительно выше при выращивании бактерий в условиях Ш13К0Й температуры.

2. Термостабильный токсин является видоапецпфячзским антигеном пседдотуберкулезного микроба. В организме больного псевдотубэр-кулезом человека вырабатываются антитела к этому токсину.

3. Псевдотуберкулезный эритроцитарный антигенный диагностикум, разработанный на основа термостабильногс токсина, является видоспе-цифическим. Зтот препарат высокоспзци^ичен, чувствителен и позволяет выявлять антитела в крови большее псевдотуберкулезом людей.

4. Видоспецкфзческая антитоксическая сыворотка является агглютинирующей для у. рдеийо^Ъегси1оз1а I - УП1 сероваров, вследствие чего она моает быть использована дон идентификации этих микроорганизмов.

Апробация дкссерташи.

Результаты работы ежегодно докладывались на заседаниях Ученого Совета ШИЭМ СО РАМН. Основные полоаения диссертации обсузда-лись на: ' ;

- Всесоюзной научно-практической конференции "Иерсиниозы", Владивосток, 1989;

- 2-й Всесоюзной конференции "Бактериальные токсины", Юрмала, 1989;

- Научной конференции "Актуальные вопросы медицинской биотехнологии", посвященной 65-ло'Шо Томского ордена Трудового Красного Знамена НЙИВС НПО "Вирион", Томск, 1991;

- Конференции молодых ученых ШШЭМ игл. Г.Н. Габричевского "Акгусль-ные проблемы эпидемиологии, диагностики и клиники ;лфек;;иоя:тх заболевший", Москва, 13Э1;

- Конференции молодых ученых 1ШЗМ СО РАМН, Еладшгосток, 1ЭЭГ-;

- Научно-практической конференции "Здсровье и болезни чолод^гл ¡»л Дальнем Еостокс", ЕлзднЕоеток, 1ЭЭЗ.

Объем к структура работа. •

Диссертация состоит из введения, 2 глав обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, приложения. Диссертация изложена на 1ЪЪ страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами, 8 рисункаш и 2 схемами. Указатель датируемой литературы включает 137 отечественных и 63 иностранных источника. '

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Б работе использовали штаммы бактерий рода Yersinia - Y. pse-udotuborculosis » Y. enterocolitica » Y. frederik3enii , Y. kri-ßtunbenii к Y. intermedia из ко&яевдш НИИ эпвдешолоиш и микробиологии СО РАШ, типовые штаммы Y. pceudotuberculosis из коллекция института шенн Пастора (Франция) и из Японии; штамм х, реа-tib ev . получен из санэпидлаборатории Тихоокеанского флота; штаммы бактерий родов Salmonella » Shigella . Escherichia i Proteus » Enterobacter , Klebsiella , Providencia из коллекции российского ' ГЛСК ir,л. Л.А. Тарасевича (г. Москва).

Использовали сыворотки крови людей, больных псевдотуберкулезом и заболеваниями непсевдотуберкулвзной этиологии (получены из инфекционного госпиталя СЭО Тихоокеанского флота и Городской клинической больницы скорой медицинской помощи, г. Владивосток); сыворотки крови здоровых доноров (получены из Городской станции переливания крови, г. Владивосток); сыворотки кроликов, иммунизированных кивали бактериями псевдотуберкулеза I - У1 серовариантов; сыворотки кроликов, иммунизированных препаратами из pseudotu-bercuiosis , содержащими термостабильный токоин различной степени очистки. В качестве продуцента термостабильного токсина использовали в работе штамм 512 y. pseudotuberculosis < ввделенный от больного псевдотуберкулезом. Кролики и неинбредные мыши, использованные в работе, были получены из вивария НИИЭМ СО РАМН.

Микробиологические методы. Иерсинии культивировали на питательном агаре и в бульоне Хоттингера цри температурах+Ю°С и+37°С. Другие бактерии семейства Enterobacteriaceae выращивали на питательном агаре при температуре+37°С. В цроцессе роста при температуре +Ю°С микроорганизмы пересевали через каждые 48-72 часа, цри температуре »37°С - через 12-16 часов. Бактериологическую диагностику псевдотуберкулеза проводили в лаборатории молекулярных основ пато-

-генности бактерий НИЙЭМ СО РАШ.

Препаративные методы. Для изучения условий продукции ТсТ иер-синиями псевдотуберкулеза в жидкой среде, микроорганизмы культивировали в бульоне Хоттингера при температурах <-Ю°С ц +37°С з ™оченле 144 часов и 93 часов, соответствешю, при пориодаческом перемешивании. Через определешше промежутки времени аликвоты отбирали и центрифугировали при 15000об/мин в течение I часа при температуре +2+3°С. Супернатанты фильтровали через бактериальные фильтры, проверяли фильтрат на стерильность и использовали в дальнейшей работо (далее по тексту - "супернатантн"). Осадок бактерий обрабатывали литической смесью (Cheville If.Р. , Hinler H.B., 1989) îi использовали лизаты бактерий в последующих исследованиях (далее по тексту - "лизаты").

Для получения препаратов ТсТ разной степени очистки, .гассу бактерий псевдотуберкулеза обезвоживали ацетоном, охлажлен:.им до -20°С, с последующим ее высушиванием, .и далее получали нее токсин согласно последовательности операций, представленных в схеме I.

Диагностикум псевдотуберкулезный эрнтроцитарный Евдоспзцнфи-ческий антигенный сухой готовили по разработанному вами методу (Недашковская Е.П. л соавт., 1990), используя в качестве гемосенсг-тина фракции термостаботьного .^оксина'псевдотуберкулезного гглкро-ба разной степени очистки, которыми сенсибилизировали фор.-.плшшзи-роваяные эритроциты барана (далее по тексту - "0,1 M фракция" и "внеокоочищешгай токсин"). Формалинизированные эритроциты барана готовили ПО методу, описанному J.C. Feeley et al. (1958). Для ли-офильного высутванпя препаратов эритроцитарного диагностику;^ использовали среду лиофилизации, содержавшую сахарозу, бычий сывороточный альбумин и пептон. Адъютант для получения иммунной сийорот-ки готовили по методу, описанному O.E. Вязовш-i (1Э64).

Аналитические методы. Белок определяли по методу, описанному О.Н. Lowry et al. (1951); использовали метод диск-электрофореза в полиакриламидном геле в система додецилсульфата натрия (ПААГ-ДСН) в присутствии белков-стандартов молекулярных масс (ЯэЪег к., Сл-Ъот м., 1969); определение химического состава об"азцов 0,1 м <Тра-КЦИИ проводил:: л лаборатории органического микроанализа Тихоокеанского института биоорганзческой химии ДВО РАН (г. Владивосток).

Иммунологические методы. Антзтсксгческуи сыпоротку получали путем многократной иммунизации кроликов весом 3,0-3,5 гт 0,1 M кцией jaгзата бактерий псэЕдотубэркулеза, содержаЕгей ТсТ. Ск.чо:.>-

тка к высокоочшценному токсину была любезно предоставлена для выполнения данной работы к.б.н. Е.П. Недашковской. Реакции агглютинации бактерий на стекле (РА) и непрямой гемагглхшшации (РИГА) проводили по рекомендациям К.И. Матвеева и М.И. Соколова (1964); реакцию тормонения непрямой геыагглютишщни (РТ11ГА) проводили согласно описанию, представленному в работе В.В. Колесниковой (1981). Реакцию гель-диффузии проводили по методу, описанному о. ОцсМег-Хопу (1969). Радиошлмунный анализ белков осуществляли согласно инструкции фарш " Ею-Най " (США) по применению оборудования для воспроизведеши метода. Иммунодиагностику псевдотуберкулеза проводили в лаборатории молекулярных основ патогенности бактерий НИИЭМ СО РАМН.

Биологические методл. Биологическую активность препаратов ТсТ определяли при их внутрибршшшом введении неинбредным мшшш массой 16-20 Г.

Статистические методы. Статистическую обработку материала проводили методами вариационной статистики (Ашарин И.П., Воробьев А.А.* 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЗШШЕ.

Результаты, полученные в экспериментальной части настоящей работы, свидетельствуют о том, что бактерии псевдотуберкулеза, несущие плазшду вирулентности с молекулярной массой 45 ЫД и изогешше штаммы, утратившие ее, продуцируют термостабильный токсин при температурах +Ю°С и+37°С (рис. I и 2). В этих условиях титр токсина в среде выращивания и в лизатах микробных клеток достигает максимальных значений в конце экспоненциальной фазы роста микроорганизмов. В этот период роста иерсиний титр ТсТ в среде культивирования и в лизатах клоток бактерий, выращенных при температуре+Ю°С , значительно превышает таковой при температуре+37°С.

Анализ показателей оптической плотности суспензии бактерий в бульоне при температурах+Ю°С и+37°С позволил выявить заметное повышение значений экстинкции при температуре +37°С уне через 18 часов после внесения бактерий в среду. Цри низкой температуре значительное повышенае величин оптической плотности суспензии бактерий наблюдалось через 48-72 часа. Это совпадает по времени с повышением титра ТсТ в среде культивирования иерсиний и в клетках бактерий.

Показано, что величины рН среды, независимо от температуры культивирования, в период г/кспоненцпальной фазы роста бактерий сни-

Tiitd PTilTA

1:8192 ..

1:2048 ..

1:512 1:128

1:32

18 48' 72

Время наблюдения, час.

1:8

0

tr

J)

-496

3 13 48

Время наблмдзшш, час.

Рео.,1. Продукция ТсТ. - T. pseudotuberculosis pY7+ ■ гр_а выраьпЕа-roni бактерий в бульоне лоттингсра при температурах : I.-+JC°C, 2 -+370,J (PTilTA). . а) Титр ТсТ в бульоне поело культивлрог-лтв'л в нам бад-терцк;

б) Титр ТсТ з маж йерспл:^.

?ио. 2. Иродуэдш ТсТ У. pseudotuberculosis pYV" при иираирига-нпи бактгрпй в бульоне Хоттзшгера при тешера^урах: I -*Ю°С; .2 -4870С СТЯГА). .

а) Тигр ТсТ с бульона после культивирования в нсы бак-тзрнй;

б) Тктр ТоТ к лазатсх иорошт»;.

-ij-

кались до 6,6, а при переходе к стационарной фаае - повышались до 6,95 И0°С) и 8,0 е37°С).

. При сравнении показателей содзрканзя токсина (по титрам РГНГА) в исоледованных супернатантах и жзатах бактерий пседдотуберк^леза, 1сультивированннх при температуре +Ю°С, показано, что на заключительных этапах экспоненциальной фазы роста бактерий титры ТсТ в лпза-тах и супернатантах достигали близких значений, отличавшихся не болев, чем на одно разведение. Исходя из полученных данных, ля пришла к выводу о целесообразности выделения и очистки токсина для дальнейшей работы из клеток бактерий псевдотуберкулвза, выращенных в течение 48-72 часов при температуре+Ю°С.

Для конструирования диагностических препаратов из т. paeudo-■fcuberculosis получены фракции, содержавшие ТсТ разной степени очистки - 0,1 M фракция и высокоочшценный токсин (схема I). Показатели химического состава 0,1 M фракции представлены в табл.1.

Таблица I.

Некоторые -эказатали химического состава фракции псевдотуберкулез-нога микроба, содержащей термостабилытй токсин (0,1 M фракция).

">ч^50казатели 1 M ■ >-4. | образцов ^-v. î белки, % !моносахара, î | %1 нуклеиновые î 1 Ю2СЛОТЫ, % ! ! î ! ! ВДО, %

.1 ' 26,61 21,74 2,39 5,19

II 19,23 23,22 2,71 6,00

III 32,50 23 »62 2,83 4,31

О высокой степени очистки токсина свидетельствуют результаты " диск-электрофореза в системе ПААГ-ДСН и данные имцунохиклческого анализа с антитоксической сывороткой в реакции галь-даффузии. Показано, что антисыворотка с препаратами очищенного токсина давала одну линию преципитаций. Определенно молекулярной массы высокоочл-. щенного токсина показачо, что ее величина равна 45 КД.

Как известно из данных литературы, возбудитель псевдотуберкулеза обладает высокой инвазивностью и уже в порвые 5-10 ?.таг/т после заражения проникает с поверхности эпителия внутрь макрооргана-зма и обнаруживается в крови и органах подопытных кквотных (Тгл-ченко Н.Ф., 1989), Очевидно, что ухе в этот период тсг.сж при помощи "носителя" - бактерий псевдотуборкулеза - дос^ггаат "«.татИ"

С X Е М А I

выделения и очистки термостабильного токсина бактерий псевдотуберкулеза (ТсТ)

Ацотоновнй попошок бактерий

Осадок отбрасывали

Супернатант отбрасывали

- Обработка литической смесью при темпе-ратуре+20+22°С в течение 4 часов на мешалке.

Центрифугирование взвеси при 15000 об/ /шне течение 60 мин.

~ Супернатант

Диализ против дистиллированной воды для удаления компонентов литической смеси.

- Ссавдение белков сульфатом ашония до 50% насыщения.

- Центрифугирование взвеси при 7000 об/мин в течение 20 мин.

"Осадок

Диализ осадка.

Внесение фракции, содержащей ТсТ, в ДЭАЭ-цедлюлозу.

- Отмывка ДЭАЭ-целлюдозы 0,01 М трио-Н01 буфером от белков, не связавшихся с сорбентом.

- Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-цел-лшозе.

- Концентрирование токсической фракции (0.1 М йоакшд) обдуванием холодным воздухом при температуре -»8+Ю°С,

'Концентрат

- Диализ концентрата.

- Гадь-фильтрации через сефадеко а -200.

- Концентрирование токсической фракции обдуванием холодным воздухом цри температуре +8+Ю°С.

концентрат

Диализ кощентрата

бысокоочшэ'дшё. токсаз

в инфицированном организма. Следовательно, не исключено, что действие ТсТ может проявляться уне на начальник этапах развития инфекционного процесса. В связи с этим, особую актуальность приобретает конструирование диагностических препаратов именно на основе ТсТ, который, к тому же, обнаруживается у есох известных сероваряантов псевдотуберкулезного микроба. Поскольку ТсТ содержится в бояызпют-вв шташов иерешшй псегдотуберкулэза и является видоскоциаичоским белком, ш разработали на го основе новый ьздоспецнфичоскп" эрит-роцитарный диагностикум (Авт. азид. У: 1593528 от 1.00.90).

В качестве сенситина использовали 0,1 II фрагсдо лизата бактерий псевдотуберкулеза. Выбор именно этого сенситина был обусловлен тем, что, во-первых, применение высокоочвдешого токсина позволяло повысить титр РИГА не более, чзм на одно раз в еде; где (табл. 2). Во-вторых, выход сухого препарата 0,1 М фракции составляет 0,3/*5, а высокоочшценного.ТсТ - только 0,07%. В-третьих, использовэжга 0,1 М фракции значительно упрощает и удешевляет способ получения гемосенситина для приготовления диагностикума. -Необходимо отд:е-тить, что шлокительшш качеством токсиноодорглщях препаратов яз-ляется то, что процесс сенсибилизации эрктроцптоэ эии антигеном на требует дополнительных манипуляций с шил (обработка щелочью или другими вещества:,и) или о эритроцита!,и (ташдзацая, обработка глу-таровым альдегидом и т.д.). Оптимальная рабочая доза гыл>сенсплша составила 10 мкг белка на I мл 5#-ной взвеси эритроцитов барана. Для приготовления сухого диагностику!,а была подобрана среда высушивания на основе сахарозы и пептона, пои использовании которой титр РИГА для препаратов даагностикуда. до и после шеушвашя отличался на более чем на одно разведение, Хранение образцов даагно-отикума различных серий в течение 3,5 лет (срок наблюдения) не оказало существенного влияния на их специфическую активность в РИГА. В разведенном виде диагностику« сохранял активность до 6-7 оуток.

' Диагностикум обладает высокой специфичностью. При постановке РИГА с коьвлерческими неадсорбированныш сыворотками против разных представителей семейства Ег^егоЪас-ЬегАасеао (иерсиний, сальмонелл, шигелл, эшэрихий) положительные результаты (шссе диагаости-чеокого титра) были получены только с сыворотками против з. ъу-рМтигЛиа и у. резИз (1:100 и 1:40, соответственно). Ни в одной из сывороток 96 доноров, 15 больных салышноллеэом и 22 больных гепатитом на были обнаружены антитела к Т.р8еийо1гаЪегс111ог1е .

Таблвда 2.

■Показатели РИГА с эритроцитарным диагностикушм о использова- . нзеы в качестве гзкосеноитана препаратов термозтабильного токсина у. рзеийо1дЛегси1озха разной степени очистки.

$ серии дкагностикуаза I------------------ ; ! Сенситин 1 ; 1 ; Результат РИГА с гипоришуп-, ной псевдотуберг-^лезыой сы-1 вороткой кролика к иерсиниям ; псевдотубер^леза I серова-5 рианта.

I 0,1 М фракции 1:12800

2 1:6400.

3 . 1:25600

■ 4 -//- 1:6400

5 1:12800

6 -//- 1:6400

7 1;6400

0 1:6400

9 1:25600

10 1:6400

II . 1:51200

12 1:25600

13 1:25600

14 . 1:6400

15 очищенный токсин 1:25600

16 1:25600

17 -//- 1:51200

1« 0,1 М фракция 1:25600

19 очищенный токсин 1:51200

20 -//- 1:25600

21 0,1 М фракция . 1:25600

22 1:25600

D процессе выполнения работы при помощи эритроцятарпого дааг-ностакума были исследованы в РИГА 237 сывороток от 158 больных псевдотуберкулезом, диагноз у которых был подтвержден бактериологически (выделением культур Y. pseudotuberculosis I, III я 1У серова-риантов) и серологачески (выявлением антител к псовдотуберкулозно-ыу микробу в крови больных). Результаты этих исследований представлены в табл. 3, Таблица 3. Частота выявления антител к термостабильному токсину т, paeudotu-Ъегси1оз1э в крови больных псевдотуберкулезом с помощью PIITA.

Надели | Количество | В том шоле полсаштелыых сывороток болезни ; исследованных ; (татр I:I€ü-I:2n0 и выше;

» сывороток }___

' ! ! V -(- „ л

!. ! абс. ,

Всего: 237 197 83,1 - 2,7

I 85 71 83,5± 4,4

2 68 52 „ . 76,5i 5,9

3 53 45 84,Э± 5,4

4-5 31 29 93,5 £4,7

Было установлено, что с помощью вадоспециЗстоского даагноети-кума в РИГА маяно выявлять антитола в гипергсммунгшх сыворотках кролика против возбудителя псевдотуберкулсза I - 1У есровариадт'ов, тогда как при помощи коммерческого препарата - только против I се-ровара (табл. 4)." Таблица 4.

Показатели РИГА гипериммуплнх: псовдотуберкулозных сывороток кроликов о эритроцитарныш диагиостикумамп.

Сероварианты i Титр РИГА с даагностнкумаш сывороток j......—......,-р

экспериментальным J коммерчески,!

I 1:12800 1:3200-1:6400

II 1:6400 отр, .

III. 1:800 1:100

1У 1:400 . отр.

Таким образом, сконструированный наш новый диагностический препарат - зрптроцнтарный псевдотубаркулезный ввдоспешфическай антигенный диагностикум - обладает значительной эффективности при шлмунодпагностике псевдотуберкулеза. Высокий выход сухого сеясктнна

е о'люслтельз-ая простота ого получения дают основание считать,.что будуцее производство даагностикума на его основе будет рентабельным. Необ^одалость'конструирования вадоспецифического препарата обусловлена задачами улучшения дифференциальной диагностики псзвдоту-беркулеза. Кроме тсго, разработипый диагностакум позволяет быстро и окожмдчко обобрать большое число сзронегативных образцов без напрасного расхода мокоспеццфичесгасс диаиюстикумов. Енсо1сая активность н достаточный уровень специфичности даагностикума делают его' перспективным не только для диагностики инфекции в клинике, но и. для массового поиска иммунологических или антигенных следов циркуляции возбудителя псевдотуберкулеза, или при проведении систематического иммунологического надзора за псевдотуберкулезш в тех регионах, где его удотыши вес в патология человека значителен.

Быстрая и эффективная идентификация псевдотуберкулезного мик- ' роба, а ?акно индикация.его антигенов в различных объектах (матери-пк от больных людей, органы и ткани зивотнкх, почва, пищевые про- . ; дукты, вола и т.д.) является актуальной задачей для здравоохранения., Для опраделеняя возмаккости применения в этих целях вцдоопецифиче-ской шсдунной сызоротки против ТсТ иерсиний псевдотуберкулеза, проводили сравнительное изучение вцдоспецифпчности и агглютинирующей способности двух сывороток. - против 0,1 № фракции и высокоочищенно-го токсина. Установлено, что обе антитоксические сыворотки являются гтглютчнируэдиш. О высокой их специфичности и агглютинирующей спо- ■ собности свидетельствуют результаты РА с различными шкроорганизма-:,я. Показано, что антитоксические сыворотки в разведении 1:50 вызывали егглптднацшэ всех испытанных штаммов любого серовара I. рзои- . Ло^иЪегси1оз1а- Наиболее быстрая и четкая реакция наблюдалась с культурами I и ЗУ ссровариантов (от 5-10 секунд до 2 ищут'с момента ■ внесения бактерий)тогда как агодаишация культур других серова-ров зро-гекела несколько медленнее (от 3-4 до 5-10 шнут). Результаты, иолученныэ с использованием типовых сывороток против исеодоту-беркулезкого микроба I -ТУ сероваров, были аналогичными. При иссле-догагаи агглютинирующей активности антитоксических сивэроток в от-кеагнпи других микроорганизмов из семейства Еа1;сгоЬас^ег1асеае было показано, что по завершении 10-шнутной экспозиции в сыЕоро-ках ко обнаруживалась агкптшздя выпеуказанных бектерий, Полученные результаты свидетельствуют о видоспецифичности антитоксических, гавзрогок, а следовательно, и антигена, против которого они были по-дучски - гаршстабагьаого токсина. Необходимо озтетлть, что получе-

ние иммунной сыворотки к '■частично очищенному ТсТ (0,1 <",' фракции) является актуальной'задачей, так как оа использование б работе позволяет экономить значительные колгчества сыворотки к вксокоочп-ценноцу токсину, процесс получения которого является весьма трудоемким п продолжительным.

Изучение видоспецифичкости высокоочкщенного ТсТ и сыворотки к ному проводили такяе :ри помощи РТНГА (табл.5). В качество антигена использовали лизаты б^тернй псевдотуборкулеза I - УШ серо-варов. По результатам "шахматного" титрования сыворотки и антшгода за рабочее разведение сыворотки бьиха принята величина 1:12500.

'Таблица 5.

Показатели РТНГА с сывороткой к Еысокоочищенному ТсТ ряеийо-ьи-Ъегои1о818 и лизатамн бактерий псевдотуберкулеза I - УШ соро-варнантов.

сероварианта | 1 |......:;............ 1 Ь итам!,а 1 1 Результат РТНГА с снеопстко;! к ; ТсТ в разведете! 1:12800.

I 853 1:32

II 16 1:32

III 2517 1:64

1У 007 1:64

У 810 1:32

л 1553 1:64

УН 521 1:64

УШ 151 1:64

Как видно из табл. 5, в лизатах всех восьми сероваров возбудителя псевдотуберкулеза наблюдалось наличие положительной реакции, свидетельствующей о присутствии ТсТ в пробах. Поскольку в работе использовали сыворотку к высокоочищенному ТсТ, эти результаты могут слувнть еще одним доказательством видоспецифичностл термостабильного токсина псевдотуберкулезного микроба.

, До наших исследований в литературе отсутствовала данные об обнаруаении в 1фови больных псевдотуберкулезом ладей антител я токсинам У. рзеийо^ЪегоиХоз1о . Изучение ае состояния антитоксичо-ского имму1штета позволит усовершенствовать диагностику болезни и метода патогенетической терапии. О целью обнаружения специфического взаимодействия антигена (ТсТ) и антител к негду, наш бил приманен высокочувствительный метод радиоиммунного анализа. Необходимо

ота.охпть, что при использовании для выявления антител к ТсТ в 1фо-ел больных ладей Еидоспецпфлческого эритх унарного диагностикума, приготовленного на основе 0,1 М фракции лизата псевдотуберкулезно-■го г.-исроба, сопслтин - антиген - вступает во взаимодействие с антитолами но только к ТсТ, содержащемуся в этой фракции, но и, возможно, к другим антигенам, входгпсш в ее состав. Применение яе в исследованиях высокоочищзнного Тс'«' и антисыворотки к нему позволило получить более точное доказательство наличия антител к этому ток-сипу в.сыворотках больных лвдей. Использование в научных исследо-вагс'лх и практической работе сывороток против препаратов ТсТ разной степени очистки (0,1 Н йршщии и высокоочищенного токсина) дает £оз:ло::;аость охватить весь спектр иммунологических реакций, от слссных (Р11Л, ПФЛ и т.д.) до простых и широко используемых в практических лаборатор:шх (РА, РИГА, РТНГА).

Тогам образом, г-и впервые установили, что ь сыворотках больных 'псевдотуборкулезом людей содер:?лтся антитела к теркостабнльному токсину I. ргоийоЪиЪсгси1оз1и . Это Свидетельствует о том, что бактерии псевдотуберкулеза вырабатывают ТсТ в организме человека, и токсин, являясь антигеном, вызывает выработку в организме специфических антител. До настоящего времени роль ТсТ возбудителя псевдотуберкулеза в патогенезе инфекции не изучена. Полученные нами материалы открывают перспективы для исследования роли ТсТ в развитии инфекционного процесса, а также механизмов действия этого токсина. Создание и использование в практической работе видоспецифяческой тейт-спстем! (эритроцктарннй диагностикум - иммунная сыворотка), обладателей еысокой диагностической значимостью, позволит осуществлять диагностику инфекции значительно быстрее и точнее, чем до.настоящего времени. Применение такой тест-системы доступно любой диагностической лаборатории. Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что кроме практического значения, создание псевдоту-беркулэзноЕ видоспецпфической тест-системы открывает возможность для работы в направлении изучения роли одного из токсинов псевдотуберкулезного ют.роба в патогенезе, псевдотуберкулеза, а такхсе в формировании шл.глштета к этой болезни.

0Б№ ВЫВОДЫ.

1. Бактерии псевдотуберкулеза, несущяа нлазшду вирулентности с молекулярной массой 45 л пзогешшэ цтаммы, утратавипа ез, при выращивании их в жидкой среде, продуцируют термостабплышй токсин при низкой (Ю°С) и высоко!! (3?°С) температурах. При то-дюратура Ю°С титр токсина в среде культивирования и а клетках бактерий я конце экспоненциальной фазы роста иерсшшй достоверно превышает таковой при температуре 37°С.

2. Из бактерий псевдотуберкулеза выделен и очыцон тормостабгш,-ный токсин, являющийся белком с молекулярной массой 45 КД. Т01.0П.1 вн-доспецифичен, его продуцируют церснпин псевдотуберкулеза всех изх,ост-ных серовариантов (X - У111).

3. Сконструирован впдоспевдфическил псевдотуберкулсз:п:Я оригро-цигарный диагностику!! для иммунодиагностики пссвдэтубсркудоза, геко-сенситином в котором является термостабллышй тонешь

4. При изучении ввдоспецифичности и чувскатоЕыюстя диетное; гн-куш в РИГА с снвороткаии большее псевдотуберкулозом ладой, с ,г;:пор--иммунными сыворотками кроликов, получешшш иммунизацией цнеотнмх иерсшшями псевдотуберкулеза разных сероЕаров, и с коммерческий сыворотками против разных представителей семейства энтеробакторий, показано, что РИГА с использованием диагностику^ является специфичной, чувствительной и тлеет высокую диагностическую ценность при ¿няЕЛс:ти псевдотуб еркулеза.

5. С помощью радиоикмунного анализа показало, что при развитии инфекционного процесса у лвдей, больных псевдотубериулезом, в оргаш-

■ змэ вырабатываются антитела к термостабильному токсину псевдотуборку-лезного микроба,

6. Получена псевдотуберкулезная видоспецифическая антпсыворотка к препарату, содержащему термостабильный токсин. Показано, что сыворотки к препаратам токсина разной степени очистки являются агглютинирующими; они могут быть использованы для идентификации бактерий псевдотуберкулеза.

СГКСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТИЛЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Токсшш Yersinia pseudotuberculosis // Иерсиниозы (микробиология, эпидемиология, клиника, патогенез, лабораторная диагностика). - Тез. Боесошн. научно-практ. конф. - Владивосток, 1989. -С. 52-61 (сов;.:, с U.S. Тимченко, Б.П. Недашковской, B.C. Бенедиктовым, М.В. Машевым, JI.B. Симчук).

2. Использование термостабильного токсина Yersinia pseudotuberculosis для диагностики псевдотуберкулеза // Бактериальные токсшш. - Тез. 2-й Всесоязп. коню. - Юрмала, 1989. - С. 91 (совм. с Е.П. Нодашковской, II.5). Тимченко, B.C. Бенедиктовым, U.B. Махневым).

3. Способ получения эритроцитарного антигешюго псевдотуборку-лезного диагностику!,n // Медицинская наука - практике. - Новосибирск, 1991. - С. II4-II5 (совм. с Е.П. Недашковской, Н.Ф. Тимченко, B.C. Бенедиктовым, Ю.В. Вертиезым, Ю.В. Езепчуком).

4. Быдвле:ше псевдотуберкулеза с использованием вздоспецифиче-ского зрзтроцитарного дзагностикума // Актуальные вопросы медицинской биотехнологии. - Мат-лы научной конф. поев. 85-лети» Томского ордена Тр. Ко. Зн. НИИВС НПО "Вирион". - Томск, 1991. - Ч. I. - С. I50-I5I (сов:л. с Е.П. Недаиковской, B.C. Бенедиктовым).

5. Ввдоспецифичоский псевдотуберкулезный зритроцитарный диаг-ностихум: некоторые свойства и перспективы применения // Актуальные .проблемы эпэдешолопш, диагностики и клиники инфекционных заболеваний. - Шт-лы конф. шлодых ученых ШЕШ им. Г.Н. Габричевского. - Москва, X93I. - 382 С. - Доп. в НПО "Союзмединформ" 02.07.91 •'S 2I50I (совм. с B.C. Бенедиктовым).

6. Разработка способа получения препаратов термостабильного летального токсина Yersinia pseudotuberculosis с различной степе-iibso очистки // В сб. науч. работ молодых ученых НИИЭМ СО РАШ. -Новосибирск, 1992. - С. 3-8.

7. Новое в серологической диагностике псевдотуберкулеза // В сб. науч. работ молодых ученых НИШ СО РАМН. - Новосибирск, 1992. -

С. 8-15 (совм. с B.C. Бенедиктовым, Е.П. Недашковской).

8.'Идентификация y, pseudotuberculosis с использованием сыворотки к тормостабильному токсину //'Здоровье к болезни человека па Дальнем Востоке. - Тез. докл. научно-цракт. конф. - Владивосток, 1993. - С. 74 (совм. с B.C. Бенедиктовым).

9. Выявление антител к термозтабильному токсину Т. pseudotuberculosis б сыворотках больных псевдотуберкулезом // Здоровье и

болезни человека па Дальнем Востоке. - Тез. докл. научно-цракт. конф. - Владивосток, 1993. - С. 74 (совм. с B.C. Веиедиктовшл).

'10. Toslna of Yersinia // Eussian Academy of Medical Sciences Siberian Branch. - Medical research In 1992 (abstracts). - Novosibirsk, 1993. - P. 95 (together with E.P. Iledashkovskaya, E.Yu. Ar-tamonova, II.P. Ilmchenko).

ИЗОБРЕТЕНИЯ И РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИЕ ПРЕГОШЕМЯ.

II. Способ получения эритроцитарного антигенного псевдотуберкулезного диагностикума // Авт. свид. J"' 1596528 от 1.08.90 (совм. с В.П. Недашковской, II.Ф. Тимченко, B.C. Венедиктовш, Ю.В. Вертп-евым, Ю.В. Езепчуком).

• 12. Изготовление и использование модофшцтрованного резервуара для елюента в колоночной хроматографии // Удостоверите БРИЗ IH"I5".i СО РАШ .4 3/89 от 6.07.89 (совм. с Е.П. Нсдашсовской).

Направления, методы и объем исследований..

Приложение I. Таблица 6.

Направления [ пя! исследования ! Метода исследования | Объем ! работы

I ! 2 ! 3 ! ' .4

I.

2.

Изучение дана- I. мики продукции тершстабияь-ного токсина ? бактерий паев- • дотуберкулеза.

3.

Получение цре- 4. паратов, со-деркаццх токсин (для всех с разделов работы).

Реакция тормояения непрямой гем-аггл^тинащш (Колесникова В.В.,

Определение значений рН проб, согласно инструкции по применению иономера рН-150.

Определение оптической плотности проб, согласно инструкции по применению спектрофотометра СФ-46.

Способ получения токсина (Тимченко Н,Ф. и ооавт., 1987) в нашей шяификацш:.

Определение белка в препаратах (Ьогсгу О.Н. оЪ ей., 1951'*

6. Дыск-злектрофорез в системе ПААГ-ДСН в присутствии белков-стандар-

1969). 8. Биопробы па мышах

3. Приготовление 9. Приготовление форшлинизированных Еидоспецнфиче- эштроцитов барана (Гее1су ¿".с. ского зритро- Л а1., 1953).

ях"1о- йгжий"

IX. Лиофшизация дкагностикума согласно инструкции по применению • лиофнлнзационной установки КС-30.

4. Изучение 12. Реакция непрямой гемагглатянацип сг-о::ств (по К.П. Матвееву и 1.1.11. Соколову, диагнозтикума, 1561).

с сыЕороткаг.я больны:: цсевдогу-бегку.тззо;.! (15с чел.) с сыго'сотгл:я здог.свгт: дсногоз (95 чел.) ' *

192 реакции

96 определений

96 оцреде-лений

28 серий

274 определения

26 серий

40 определений

308 проб

3

серии

22 . серии

10 ■серий

всего

4978 реакций, из них:

237 реакций

96 реакций

I !

- с сыворотками больных лихородоч- I9D5 нымл заболеваниями непсевдотубер- реакций кулезной этиологии (1482 чел.).

- определение сроков хранения диаг- . 202 ностшсума, выбор сенсптина и от- реакции работка его дозы.

- с иммунными сыворотками к иереи-, £0 ниям псевдотуберкулез а 1-13 се- реакций роваров.

- о сыворотками против различных пред- 90 ставит елей сем. Sntcrobacteriaceae реакции

- контрольные исследования с исполь- 2318

5. Получение иммунной сыворотки к токсину.

6. Изучение специфичности сыворотки к токсину.

зовашем коммерческого псевдотуберкулезного эритроцитарного ди-агностикума,

13. Оригинальный способ, разработанный нами. Использовано в работе

Приготовлено серий сыворотки

14. Реакция агглютинации бактерий на • . стекле (по К.И. Матвееву и

М.И. Соколову, 1964). Исследовано в РА

Y. paeuàofcuïerculoaio роваров

I - УШ се-eaterocolitica II—ти сероваров Т. intermodla teistenaenii

7. Изучение вндо-специфичности сыворотки и токсина. .

8. Выявление антител к токсину в сыворотках больных.

9. Статистическая обработка материала.

- ï.

- X. frederikaenil

- Y. pestis EV

- прочих энтеробактерий (17 видов) Поставлено всего

Реакция торможения непрямой гешг-глютинацяи о яизаташ иерсикий псе-вдотуборкулоза I - УШ сероваров.

реакций

16

кроликов cepini

всого: 165 шта'.глов, из них:

78 шта.тлов

33 штаммов

14 штатов

II штаммов 8

штаммов I

ИТШ.ЗЛ

17

штаммов

566 решодий

48 реакций

15, Радаоиммунный анализ, согласно инструкции фирмы "Bio-Rad'(США) по применению оборудования для вое-произведения метода. Исследовано 6 сывороток

поставлено 4 реакции

16. Методы вариационной статистики цифровые ^Ашм^рин И.П., Воробьев A.A., данные