Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры с использованием поли- и моноклональных антител

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры с использованием поли- и моноклональных антител"

На правах рукописи

ФЕДОРОВА Валентина Анатольевна

ТЕОРЕТИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ ИЗУЧЕНИЯ БЕЛКОВЫХ И УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИХ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЧУМЫ И ХОЛЕРЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.00.07. - микробиология 14.00.36. - аллергология и иммунология

Авт ореферат на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Саратов, 2004

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Девдариани Зураб Леванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Храпова Наталия Петровна

доктор биологических наук Мещерякова Ирина Сергеевна

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Щуковская Татьяна Николаевна

Ведущая организация:

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт

Защита диссертации состоится 2 марта 2004 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д.208.078.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб".

Автореферат разослан 28 января 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Корнеев Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Крупные вспышки чумы, регистрируемые в течение последних лет в Танзании (1991 г.), Заире (1993 г.) и Индии (1994), появление нового, эпидемически опасного штамма Vibrio cholerae 0139 серовара, вызывающего массовую заболеваемость с высокой летальностью (Hall et al, 1993; Levisalles et al, 1993; Preston, 1993; Shimada et al, 1993; Albert et al, 1993, 1997; Kaper et ai, 1995; Fa-ruque et al, 1998; Basu et al, 2000; Steinberg et al, 2001; Смирнова, 2002), диктуют актуальность проведения научных исследований по совершенствованию диагностических и профилактических препаратов, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию этих инфекций.

В свою очередь конструирование высокочувствительных диагностических тест-систем и разработка эффективных химических вакцин невозможны без новых современных знаний об антигенах Yersinia pestis и V. cholerae 0139, имеющих ряд сходных признаков по структурной организации клетки (наличие капсулы и R-форма ли-пополисахаридов (ЛПС)) (Schutze, 1932; Burrows, 1963; Бахрах с соавт., 1967-1972, 1977; Вейнблат, 1972; Тараненко с соавт., 1972, 1973, 1977, 1988, 1990; Brubaker, 1972,2000; Waldor et al, 1994; Weintraub et al, 1994; Ломов с соавт., 1995; Kaper et al, 1995; Knirel et al, 1995, 1997, 2003; Nandy et al, 1995, 1999; Favre et al, 1996; Дома-радский, 1996, 1998; Skurnik et al, 1996; 1999-2002; Perry, Fetherston, 1997; Attridge et al, 2001; Смирнова, 2002; Gremyakova et al, 2002; Hoist, 2002; Prior et al, 2002; Vinogradov et al, 2002; Bruneteau, Minka, 2003; Oyston et al. 2003 и др.).

Несмотря на огромные достижения отечественных и зарубежных ученых в молекулярной микробиологии и биохимии чумного микроба и холерного вибриона, имму-нохимические свойства многих известных антигенов изучались в малочувствительных по современным представлениям серологических реакциях и опосредованно с помощью рекомбинантных штаммов, что позволяет лишь косвенно судить о биологических функциях полипептидов или полисахаридов в естественных природных условиях, поскольку наличие того или иного гена не всегда коррелирует с проявлением экспрессируемого им признака in vivo.

С появлением гибридомной технологии и новых эффективных методов иммуно-химического анализа стало возможным изучение структурных особенностей антиге-

нов полипептидной и углеводной природы на молекулярном уровне (Douglas et al, 1988; Ezzell et al, 1990; Алексеева с соавт, 1991, 1993, 1998,2001, 2002; Храпова с со-авт., 1991, 1994, 1996; Бичуль, 1993; Garg et al, 1994; Helmerhorst et al, 1998; Susskind et al, 1998; Rivera-Betancourt, 2000; Prior, Titball, 2002; Heagy et al, 2003; Mitov et al, 2003; Monreal et al, 2003; Ogawa et al, 2003; Someya et al, 2003 и др.). В первую очередь это касается такого сложноорганизованного антигена, как капсульный антиген (К-антиген) чумного микроба (Ф1). В частности, остаются не до конца выяснены вопросы о связи его серологической активности с конкретными антигенными компонентами, особенности фолдинга белка Ф1 у штаммов Y. pestis с Fra± фенотипом, причины кросс-реактивности полученных к нему сывороток.

Другим, имеющим диагностическую значимость, видоспецифическим антигеном чумного микроба является фибринолизин (активатор плазминогена), синтез которого детерминируется уникальной для возбудителя чумы плазмидой пестициногенности (Вейнблат с соавт., 1984, 1988-1991; Титенко, 1985; McDonough, Falkow, 1989; Булгакова с соавт., 1991; Попов с соавт., 1991; Lahteenmaki et al, 2001). Проявление чумным микробом фибринолитической активности, как правило, коррелирует со способностью Y. pestis к коагуляции плазмы (Квашнина, 1941, 1959; Домарадский с соавт., 1960, 1963, 1996, 1998; Яромюк, 1964; Brubaker et al, 1965; Beesley et al, 1967 и др.), -а участвующие в реализации данного процесса антигены - фибринолизин и коагулаза охарактеризованы как полипептиды с м.м. 37 и 35 кД, соответственно (Cavanough, 1971; McDonough, Falkow, 1989; Straley, Brubaker, 1982; Sodeinde et al, 1988, 1989; Булгакова, 1991; Лупикова с соавт., 1992; Домарадский, 1996, 1998; Perry, Fetherston, 1997; Brubaker, 2000; Lahteenmaki et al, 2001; Goguen, 2002). Однако несмотря на значительное количество научных разработок, до сих пор не установлено, один или оба белка определяют фибринолитическую и коагулазную активности возбудителя чумы.

Широко используемая в лабораторной диагностике серологическая дифференциация бактерий по химической структуре ЛПС (Davies, 1960; Luderitz et al, 1966, 1968; Jann, Westphal, 1975; Овчинников, 1979; Захарова, 1980; Яровая, Алешкин, 1991; Книрель, Кочетков, 1993; Whvtfield et al, 1995, 1997; Hoist et al, 1996, 1998, 1999, 2002; Rietschel et al, 1996; Raetz, Whitfield, 2002 и др.), а также данные о способности моноклональных антител (МКА) к ЛПС Y. pestis выявлять все штаммы чумного микроба независимо от наличия или отсутствия собственных плазмид и температуры

культивирования (Дсвдариани, 1993) предопределяют актуальность, теоретическую и практическую значимость исследований по определению с помощью современных информативных методов иммунохимического анализа родо- и видоспецифических антигенных детерминантов ЛПС, а также изучению антигенной структуры входящего в его состав липида А и другого полисахаридсодержащего препарата чумного микроба - основного соматического антигена (ОСА) (Дальвадянц, 1968; Бахрах с соавт., 1969, 1970, 1972, 1973, 1977; Боровикова, 1972; Вейнблат с соавт., 1972, 1989, 1991 и

др.).

Как известно, ведущую роль в проявлении чумным микробом вирулентных свойств большинство исследователей связывает с наличием в его геноме плазмиды Са2+-зависимости (pCad), детерминирующей синтез ряда продуктов, в частности, белков наружной мембраны (БНМ) или Yops (Brubaker et al, 1979, 1991, 2000; Straley, Bowmer, 1986; Bolin, Wolf-Watz, 1988; Cornells et al, 1989, 1997, 1998,2002; Bliska et al, 1990; Видяева, 1992; Кутырев, 1992; Микеров, Кутырев, 1997 и др.), часть из которых обладает протективными свойствами (Burrows, 1963; Brubaker, 1991; Kutyrev et al, 1994; Leary et al, 1995, 1997, 2001; Nakajima et al, 1995; Williamson et al, 1995, 1997, 1999, 2001; Anderson et al, 1996; Health et al, 1996; Andrews et al, 1999; Titball et al., 1999, 2000,2002; Jones et al., 2002 и др.). Несмотря на огромный интерес исследователей к ним, сравнительное изучение иммуногенных свойств отдельных антигенов проводилось косвенно на моделях других бактерий с клонированными генами pCad Y. pestis в связи с трудностями выделения антигенов в чистом виде (Brubaker et al, 1987; Sample, Brubaker, 1987; Sodeinde et al, 1988; Заренков с соавт., 1991; Шмелев с соавт., 1991; Leary et al, 1997; Titball et al, 1997,1999,2001,2002 и др.). К тому же, даже при щадящих методах экстракции, изолированные из цельного микроорганизма антигены могут полностью или частично утрачивать свои нативные свойства.

Для преодоления этих препятствий в настоящее время весьма перспективно применение антиидиотипических антител (АИТ), сохраняющих функциональную, серологическую и иммунобиологическую активности исходного антигена и позволяющих проводить изучение его свойств в условиях, максимально приближенных к естественному состоянию in vivo (Amit et al, 1986; Bona, 1988; Anders et al, 1989; Araga, 1993; Field et al, 1993; Fernandez et al, 1994, 2001; Koliakos et al, 2002). He менее актуальна разработка на их основе экспериментальных антиидиотипических вакцин

(Bona, Moran, 1985; Chanh et al, 1990; Raychaudhuri et al, 1990; Beatty, 1992; Sutherland et al, 1993; Herlyn et al, 1995; Spertini et al, 1999; Basak et al, 2000; Le Poole et al, 2002; Magliani et al, 2003 и др.).

Поскольку капсульныс антигены (К-антигены) большинства грамотрицательных бактерий обладают выраженными протективными свойствами и высокой специфичностью, представляет несомненный интерес выделить К-антиген из V. cholerae 0139 серовара и изучить его иммунохимические и иммунобиологические свойства- Сведения о неэффективности существующих холерных вакцин против V.cholerae 0139 (Chongra-nguan et al, 1993; Levisalles, 1993; Ramamurthy et al, 1993; Kaper et al, 1995; Favre et al, 1996; Faruque et al., 1998) придают особую важность исследованиям в. этом направлении.

Не менее актуальными являются исследования по изучению структурной организации ЛПС V. cholerae 0139, выявлению различий в иммунореактивности этого антигена у исходных и диссоциированных вариантов вибрионов со сниженной вирулентностью, а также попытки экспериментально обоснованного получения моноспецифических неадсорбированных антител, пригодных для разработки экспресс-методов индикации возбудителя холеры 0139.

ЦЕЛЬЮ ИССЛЕДОВАНИЯ является получение новых сведений об антигенной структуре возбудителей чумы и холеры с помощью современных методов иммунохи-мического анализа с применением поликлональных, моноклональных и антиидиоти-пических антител, а также экспериментальное обоснование возможности их практического применения.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Получить панель МКА для изучения антигенной структуры возбудителя чумы и разработки на их основе экспериментальных диагностических тест-систем нового поколения.

2. Изучить природу антигенных детерминантов, определяющих серологическую активность Ф1 чумного микроба, особенности фолдинга белкового компонента капсулы у штаммов Y.pestis с Fra± фенотипом с использованием современных методов иммунохимического анализа и разработать методические подходы для их выявления.

3. Определить общие и специфические эпитопы углеводсодержащих антигенов возбудителя чумы (ЛПС и ОСА) с использованием набора поли- и моноклональных антител.

4. С помощью панели МКА изучить иммунохимические особенности фибриноли-зина У.реяНя и возможности использования моноклональных иммуноглобулинов в иммунофлуоресцентном и иммуноферментном анализах для детекции штаммов чумного микроба, содержащих рРв!.

5. Определить спектр полипептидов, детерминируемых рСаё У. ре5Н5, у возбудителя чумы, выращенного в условиях их максимальной экспрессии. Получить панель поли- и моноклональных антител к белкам, кодируемым рСаё чумного микроба, провести сравнительное изучение иммуногенных свойств и диагностической значимости отдельных антигенов с помощью методов иммунохимического анализа.

6. Получить АИТ к отдельным антигенам чумного микроба и экспериментально -обосновать перспективу их применения для разработки профилактических и диагностических медицинских иммунобиологических препаратов.

1. Определить видо-, биоваро- и серовароспецифические полипептиды путем сравнения электрофоретических профилей клеточных лизатов V. еко1егае 01 и не 01 се-рогрупп (в частности, V. еко1егае 0139), по наличию или отсутствию которых возможно проведение дифференциации штаммов холерных вибрионов на этапах идентификации выделенных культур.

8. Изучить иммунохимические свойства ЛПС, экстрагированных из холерного вибриона 0139 серовара различными методами, и получить моноспецифические не-адсорбированные поликлональные антитела, пригодные для его обнаружения в им-муноферментном анализе.

9. Разработать на основе антикапсульных антител к V. еко1егае 0139 методический подход, позволяющий дифференцировать вирулентные и слабовирулентные штаммы этого возбудителя. Изучить протективные свойства К-антигена и обосновать принципиальную возможность его использования в качестве потенциального компонента химической холерной вакцины.

10. Разработать принципы гибкой технологии изготовления как моно-, так и поли-клональных иммуноглобулиновых диагностических препаратов и тест-систем с ис-

пользованием в качестве продуцентов специфического сырья линейных мышей БЛЬБ/е.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Впервые с использованием гибридомной технологии и оригинальных методов скрининга антите-лопродуцирующих гибридом получена уникальная панель моноклональных антител для изучения антигенов возбудителя чумы, кодируемых как хромосомными, так и плазмидными генами.

С помощью антител различной специфичности и современных методов иммуно-химического анализа установлены гликопептидная природа и конформационная зависимость антигенного детерминанта, определяющего серологическую активность Ф1 чумного микроба. Новыми являются сведения о способности углеводного компонента этого антигена возбудителя чумы вызывать продукцию антител у лабораторных животных.

Представлены экспериментальные доказательства исключительной роли СаПМ в доставке Сай на клеточную поверхность У. ре5Н5, но не в процессе фолдинга мономеров Ф1.

Новыми являются установленные с помощью высокочувствительных вариантов иммуноферментного анализа и иммуноблота, основанных на использовании поли- и моноклональных антител, сведения о наличии у полисахарида кора ЛПС чумного микроба как специфических для коровой части антигенных детерминантов, так и общих с липидом А и ОСА эпитопов.

Впервые обнаружены и изучены иммунобиологические свойства у ряда ранее не описанных белков, детерминируемых рСаё чумного микроба, при культивировании в условиях их максимальной экспрессии. Получена панель гибридом-продуцентов МКА с различной специфической активностью, направленных к отдельным антигенным детерминантам белков, кодируемым указанной плазмидой У. pestis. С их помощью подтверждена устойчивость V антигена к протеолитической деградации под влиянием фибринолизина, а также наличие у белков с м.м. 25±2,54±2, 72±2 и 87±2 кД кросс-реактивных эпитопов. Доказано существование УорЕ в виде сложноорганизо-ванного антигена, состоящего из нескольких субъединиц белковой природы со сходными свойствами, наиболее важными из которых являются высокая иммуногенность и отсутствие деградации под действием фибринолизина.

Впервые с использованием сложной оригинальной системы скрининга гибридом, основанной на функциональных и антигенных свойствах фибринолизина чумного микроба, получена панель МКА различной специфичности. С помощью МКА показана иммунохимическая идентичность фибринолизина и коагулазы Y. pestis. Доказано существование этих субстанций у возбудителя чумы в виде бифункционального белка с двумя ферментативными активностями, проявление которых индуцируется температурой культивирования чумного микроба.

Экспериментально на модели возбудителя чумы подтверждена теория идиотипи-ческих сетей N. Jeme (1974). Впервые получены и охарактеризованы по иммунохими-ческому, иммунологическому и функциональному критериям АИТ к отдельным антигенам чумного микроба. Установлено, что АИТ к ЛПС Y. pestis имеют выраженный адъювантный эффект без токсических проявлений у иммунизированных животных, характерных для исходного препарата, а АИТ к белкам, кодируемым pCad, с м.м.

кД и YopE обладают высокой специфической иммуногенностью, сопоставимой с уровнем протективной активности соответствующих полипептидов. Показана перспективность использования АИТ не только в роли эффективного инструмента изучения антигенной структуры бактерий, но и в качестве основных специфических компонентов для разработки экспериментальных диагностических и профилактических иммунобиологических препаратов.

Впервые для выделения К-антигена из капсулообразующего нового эпидемически значимого 0139 серовара холерного вибриона использован метод, эффективный при экстракции. капсульной субстанции из культуральной жидкости биомассы чумного микроба (Вейнблат с соавт., 1980), который позволил получить приоритетные данные о присутствии в капсульном веществе V. cholerae 0139 наряду с углеводным компонентом двух иммунореактивных полипептидов с м.м. 38±2 И 61±2 кД. При этом установлено, что протективные свойства К-антигена не связаны с его белковым компонентом, а обусловлены капсульным полисахаридом. Иммуногенность последнего по отношению к гомологичному серовару избирательна в отличие от ЛПС, выделенного из биомассы клеток V. cholerae 0139, обладающего одинаковой протективной активностью как при заражении возбудителем холеры Эльтор, так и V. cholerae 0139.

Впервые научно обоснована и экспериментально подтверждена эффективность разработанного нами методического подхода по получению препаративного количе-

ства мышиных моноспецифических поликлональных антител к ЛПС V. cholerae OI39, не нуждающихся в дополнительной адсорбции близкородственными по антигенной структуре гетерологичными микроорганизмами. Благодаря использованию оригинального способа экстракции получены новые данные о выраженных антигенных свойствах липида А V. cholerae 0139 и изучена специфичность полученных к нему антител. Впервые идентифицированы видо-, биоваро- и серовароспецифические полипептиды холерного вибриона при сравнительном изучении электрофоретических профилей различных представителей рода Vibrio.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Получен оригинальный набор линий лимфоид-ных гибридных клеток, продуцирующих МКА к белковым и углеводсодержащим антигенам Y. pest is. Эти антитела могут быть использованы для конструирования диагностических тест-систем, а также изучения иммуно- и патогенеза чумной инфекции.

Предложено несколько методических подходов для индикации и идентификации штаммов чумного микроба с Frat-фенотипом, не требующих разработки специальных диагностических препаратов для обнаружения так называемой "атипичной" капсулы ("атипичного" К-антигена): 1. Разрушение идентифицируемых клеток Y.pestis лизи-рующим буфером с последующим определением Ф1 соответствующими коммерческими диагностическими препаратами; 2. Использование для индикации иммунофер-ментных тест-систем, основой которых являются МКА к другому видоспецифиче-скому антигену - фибринолизину/плазмокоагулазе; 3. Применение для обнаружения таких штаммов моноклональных флуоресцирующих иммуноглобулинов к ЛПС чумного микроба или аналогичной иммуноферментной тест-системы.

Подтверждена более высокая серологическая активность и специфичность К-антигена чумного микроба, выделенного из культуральной жидкости методами В.И. Вейнблата с соавт. (1980) и Л.Н. Сердобинцева с соавт. (1983) в сравнении с традиционным способом его экстракции из клеточной биомассы Y. pestis по Е. Baker et at. (1952), который по настоящее время используется в технологии получения соответствующих чумных гипериммунных сывороток.

Впервые на основе МКА к видоспецифическому антигену фибринолизи-ну/коагулазе чумного микроба разработаны и успешно испытаны в лабораторных условиях экспериментальные диагностические флуоресцирующие иммуноглобулины и иммуноферментная тест-система, способные выявлять штаммы Y. pestis, содержащие

плазмиду пестициногенности, независимо от температуры культивирования бактерий и не дающие положительных реакций с гетерологичными микроорганизмами, в том числе другими патогенными иерсиниями.

С использованием моноклональных иммуноглобулинов к антигенным детерминантам ЛПС кодируемого хромосомными генами (Девдариани, 1993), сконструирован сэндвич-вариант иммуноферментного анализа для обнаружения типичных и атипичных штаммов возбудителя чумы независимо от отсутствия или наличия в них собственных плазмид. Апробация указанного варианта твердофазного иммунофер-ментного анализа (ТИФА) на большом наборе природных и генно-инженерных штаммов возбудителя чумы свидетельствует о высокой практической значимости ан-тилипополисахаридных МКА, как универсальных диагностических реагентов с широким диапазоном действия, несмотря на перекрестную реактивность только с отдельными представителями вида Y.pseudotuberculosis.

Обнаружен ряд новых полипептидов, кодируемых рСаё чумного микроба, обладающих не только антигенными, но и достаточно выраженными защитными свойствами, которые, в дополнение к протективному белку УорЕ, могут быть использованы при создании чумных химических вакцин.

Разработана стратегия иммунизации лабораторных животных для индукции АИТ к антигенам чумного микроба. Доказана принципиальная возможность применения АИТ для создания противочумных вакцин нового поколения, не содержащих материала патогена и обладающих выраженными превентивными свойствами. Экспериментально обосновано новое перспективное научно-практическое направление в конструировании медицинских иммунобиологических препаратов с использованием АИТ как аналогов диагностически значимых антигенов.

Установлена достоверно более высокая протективная активность К-антигена в сравнении с ЛПС V. еко1егае 0139 при заражении аутбредных мышей гомологичным серовариантом. Полученные результаты позволяют рекомендовать первый из названных антигенов для создания химической вакцины против заболеваний, вызываемых У.ско1егае 0139.

Предложен способ дифференциации вирулентных и слабовирулентных штаммов V. еко1егае 0139, основанный на разной степени активности меченных пероксидазой антикапсульных антител при постановке иммуноферментного анализа с капсулиро-

ванными (мутные колонии) и лишенными капсулы (прозрачные колонии) штаммами V. cholerae0139.

С помощью иммунохимических методов анализа доказана серологическая идентичность энтеротоксинов (XT) холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп. Эти данные имеют практическое значение при разработке универсальной химической вакцины против холеры, обязательным компонентом которой является специфический анатоксин.

Впервые в мировой практике получены с использованием биохимически очищенных антигенов и линейных мышей BALB/c неадсорбированные поликлональные антитела к ЛПС и К-антигену холерного вибриона 0139 серовара, не дающие перекрестных серологических реакций с гетерологичными микроорганизмами и вибрионами других серогрупп в сэндвич-варианте иммуноферментного анализа.

Разработаны принципы гибкой технологии изготовления иммуноглобулиновых диагностических препаратов и тест-систем с использованием в качестве продуцентов специфического сырья линейных мышей BALB/c.

По результатам проведенных исследований разработаны и утверждены:

- Программа комиссионного испытания иммуноглобулинов диагностических чумных флуоресцирующих к липополисахариду чумного микроба (Утверждена директором ВНИПЧИ "Микроб" 22.05.90 г.);

- Регламент производства "Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие чумные антикапсульные моноклональные сухие" № 11-86(90);

- Инструкция по изготовлению и контролю иммуноглобулинов диагностических мо-ноклональных флуоресцирующих сухих к липополисахариду чумного микроба (Утверждена директором ВНИПЧИ "Микроб", протокол № 21 от 2.11.90 г.);

- Инструкция по применению иммуноглобулинов диагностических моноклональных флуоресцирующих сухих к липополисахариду чумного микроба (Утверждена директором ВНИПЧИ "Микроб", протокол № 21 от 2.11.90 г.);

- Методические рекомендации по обнаружению типичных и атипичных штаммов, чумного микроба в иммуноферментном анализе (Утверждены директором РосНИП-ЧИ "Микроб", протокол № 3 от 4.03.94 г.);

- Методические рекомендации по определению в дот-иммуноанализе содержания капсульного антигена и липополисахарида Vibrio cholerae OI 39 серовара на этапах

экспериментального производства химической холерной вакцины (Утверждены директором РосНИПЧИ "Микроб", протокол № 5 от 20.06.97 г.);

- Методические рекомендации по обнаружению штаммов Vibrio cholerae 0139 серо-вара в иммуноферментном анализе (Утверждены директором РосНИПЧИ "Микроб", протокол № 6 от 10.10.97 г.);

- Штамм гибридных клеток Yp.LPS.A6.Sp, продуцирующих моноклональные антитела к ЛПС Y. pestis, депонирован в Российской коллекции клеточных культур в институте цитологии РАМН (г. Санкт-Петербург) 04.12.89 г. под номером ВСКК(П) 426Д;

- Усовершенствованные методические приемы по гибридомной технологии включены в соответствующий раздел методического пособия для врачей и биологов "Методические приемы при работе с возбудителями инфекционных болезней бактериальной природы I—II групп патогенности", которое утверждено пленумом Межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ 31.10.2001г.

- Теоретические и практические результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, используются при чтении лекций по иммунологии чумы и холеры и лабораторной диагностике инфекционных заболеваний на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей по бактериологии, иммунологии и эпидемиологии при РосНИПЧИ "Микроб" с 1989 г. по настоящее время.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Антигенные детерминанты, определяющие серологическую активность (специфичность) капсульного антигена чумного микроба, имеют гликопептидную природу.

2. CaflM Y. pestis играет исключительную роль в транспортировке мономера Ф1 из периплазматического пространства на поверхность микробной клетки, но не в процессе фолдинга мономеров капсулы на клеточной стенке чумного микроба. Идентификацию возбудителя чумы с Fra±-фенотипом можно проводить коммерческими чумными антикапсульными диагностическими иммуноглобулиновыми препаратами после разрушения клеток лизирующим буфером или с использованием диагностических тест-систем на основе МКА к фибринолизину или ЛПС чумного микроба.

3. Полисахарид кора чумного микроба имеет как специфические антигенные детерминанты, так и общие для коровой части, липида А и ОСА эпитопы. Эксперимен-

тальная иммуноферментная тест-система на основе МКА к ЛПС У. резИз является эффективным диагностическим реагентом для обнаружения и идентификации возбудителя чумы независимо от наличия и присутствия собственных плазмид.

4. Фибринолизин и плазмокоагулаза чумного микроба являются иммунохимически идентичными субстанциями, существующими у возбудителя чумы в виде бифункционального сложного белка с двумя независимыми ферментативными активностями.

5. При культивировании чумного микроба в условиях максимальной экспрессии белков, кодируемых pCad, синтезируются по крайней мере 35 полипептидов, в том числе антигены с м.м. 25±2, 54±2, 72±2 и 87±2 кД, иммунизация которыми защищает от экспериментальной чумы 37-60% белых мышей. YopE - сложноорганизованный антиген, состоящий из нескольких субъединиц белковой природы, имеющих сходные иммунобиологические свойства.

6. Полученные АИТ к ЛПС и некоторым белкам, детерминируемым pCad У. резИз, могут служить эффективным. инструментом при изучении. антигенной структуры чумных бактерий и разработке профилактических и диагностических иммуноглобу-линовых препаратов.

7. К-антиген V. еко1егае 0139, выделенный с использованием биохимического метода экстракции капсульного вещества, помимо ЛПС, содержит два полипептида с м.м. Протективная активность К-антигена избирательна, а ЛПС, полученный из клеточной массы, защищает животных в равной степени как от заражения гомологичным сероваром, так и V. еко1егае Эльтор.

8. Поликлональные антитела, выделенные из асцитической жидкости линейных мышей BALB/c, иммунизированных биохимически очищенными препаратами ЛПС и К-антигена V. еко1егае 0139, не нуждаются в дополнительной адсорбции гетероло-гичными микроорганизмами и специфически реагируют в иммуноферментном анализе только с холерными вибрионами 0139 серовара.

9. Технология изготовления иммуноглобулиновых диагностических тест-систем с использованием в качестве биологического сырья линейных мышей - перспективное направление в производстве медицинских иммунобиологических препаратов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.' Материалы диссертации были представлены на: Всесоюзной научно-практической конференции "Иерсиниозы: Микробиол., эпидемиол., клиника, патогенез, лаб. диагностика", Владивосток, 1989; Рабочем совещании "Со-

стояние проблемы и перспективы развития диагн. бактер. инф.", Оболенск, 1990; Международной конференции "Лабораторные животные для медико-биологических исследований", Москва, 1990; I съезде иммунологов России, Новосибирск, 1992; Российской научной конференции "Иммунол. и специф. профилакт. особо опасн. инф.", Саратов, 1993; Межгосударственной научной конференции "Профилактика и меры борьбы с чумой", посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы, Алма-Ата, 1994; Межгосударственной научно-практической конференции "Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний", Ставрополь, 1994; Научной конференции "Актуальные вопросы особо опасных инфекций", Новороссийск, 1994; Научно-практической конференции, посвященной 60-летию противочумной службы на Кавказе, Ставрополь, 1995; Научной конференции "Актуальные вопросы современной медицины", Бишкек, 1996; Международной конференции Академии Естествознания "Гомеостаз и инфекционный процесс", Саратов, 1996; Научной конференции "Эколого-эпидемиологический надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии", Астрахань, 1996; Научной конференции "Эпидемиология и клинико-иммунологические аспекты профилактики важнейших инфекционных заболеваний", Астрахань, 1996; VII съезде всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 1997; II съезде биохимического общества Российской академии наук, Москва, 1997; 4-ой Международной конференции молодых ученых и студентов, Бишкек, 1997; Научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России, Саратов, 1997; Международной конференции Академии Естествознания "Гомеостаз и инфекционный процесс", Саратов, 1998; 7 Интернациональном конгрессе по иерсиниям, Нидерланды, 1998; 8-м Интернациональном симпозиуме по иерсиниям, Финляндия, 2002.

ПУБЛИКАЦИИ. Материалы диссертации изложены в 78 опубликованных научных работах, из них 31 статья (22 - в отечественной печати и 9 - за рубежом) и 47 тезисов докладов.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация изложена на 338 страницах и состоит из введения, собственных исследований (7 глав), заключения, выводов и списка литературы, включающего 695 источников, из них зарубежных - 402. Диссертация иллюстрирована 42 рисунками и 45 таблицами.

Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично автором настоящей работы, под его руководством и в соавторстве с сотрудниками лабораторий гибридом, патогистологии, прикладной генетики, патогенных вибрионов, биомоделей, отделов профилактических препаратов, биохимии и биофизики, диагностических препаратов, ГКПБ РосНИПЧИ "Микроб".

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали 345 штаммов бактерий, включая патогенные иерсинии, холерные вибрионы 01 и не 01 серогрупп и другие микробы, в том числе природные и генетически модифицированные варианты. В качестве биомоделей для получения антисывороток, поликлональных, моноспецифических, моноклональных и антиидиоти-пических антител, а также изучения протективной активности антигенов, служили более 4000 мышей инбредных и аутбредных линий, 12 морских свинок, 15 кроликов породы шиншилла и 4 белых крысы, полученных из питомников РосНИПЧИ "Микроб" и "Светлые горы" НИЛЭБЛ АМН РФ, Москва. Иммунохимические и иммунобиологические свойства антигенов У.pestis и V. cholerae 0139 изучали с применением препаратов ЛПС, К- и О-антигенов, изолированных методами О. Westphal et al. (1952), С. Galanos et al. (1969), E. Baker et al. (1952), В.И. Вейнблата с соавт. (1980), Л.Н. Сердобинцева с соавт. (1983), A. Boivin et al (1933), М.Н. Джапаридзе с соавт. (1984); для экспериментов по изучению структурно-функциональной организации фибринолизина чумного микроба использовали препарат, экстрагированный из куль-туральной жидкости E.coli рЕК4 (любезно предоставлен проф. В.И. Вейнблатом и к.м.н. Н.И. Лупиковой), Са2+-зависимых белков - препараты, полученные из биомассы вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных, КМ-217 и КМ-218 (любезно предоставлены проф. И.А. Дятловым). Гибридизацию соматических клеток проводили по методу G. Galfree et al. (1977). Скрининг культуральной или асцитической жидкостей гибридом вели в непрямом ТИФА; непрямом методе флуоресцирующих антител (НМФА), а также реакции торможения фибринолиза (РТФ). Эпитопную специфичность и иммунореактивность МКА, поликлональных, моноспецифических и антиидиотипических антител, локализацию и серологические свойства отдельных эпитопов кора, липида А и ОСА Y. pestis анализировали в раз-

личных модификациях ТИФА, включая дот-вариант (ДИА). Электрофоретические профили цельно-клеточных лизатов У. cholerae 01 и не 01 серогрупп, углеводных компонентов чумных бактерий или вибрионов 0139 и 022, депротеинизированных методом P. Hitchcock and Т. Brown (1983), Ф1, фибринолизина, ЛПС, препаратов водорастворимых белков возбудителя чумы, ЛПС и 0-антигенов V. cholerae 0139 исследовали в 10-12,5% ПААГ-SDS согласно рекомендациям U. Laemmli (1970) с окраской гелей Coomassi Brilliant Blue R-2S0 или ионами серебра по С. Tsai and С. Frasch (1982). Специфическую активность поли- и моноклональных антител оценивали в иммуноблоттинге по Н. Towbin et al. (1984). Для приготовления экспериментальных иммуноферментных тест-систем поли- или моноклональные иммуноглобулины конъюгировали с пероксидазой (rz>3,5) по методу P. Nakane and A. Kawaoi (1974). Статистическую обработку материалов проводили по И.П. Ашмарину и А.А. Воробьеву (1962).

2. ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАПСУЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ Y.pestis И V. cholerae O139

Согласно литературным данным, капсульное вещество грамотрицательных бактерий представляет собой гетерогенную субстанцию, состоящую, в основном, из белков и углеводов, количественное соотношение которых, как правило, варьирует у разных видов микроорганизмов. В настоящее время доказана ведущая роль капсул в защите бактериальных клеток от иммунной системы организма хозяина и ряд других, присущих им иммунобиологических функций, включая участие ассоциированных с ними К-антигенов в обеспечении серологической специфичности микроорганизмов. Вместе с тем, остается не до конца выясненным вклад непосредственно белковых или углеводных компонентов в иммунореактивность К-антигенов ряда капсулообразующих микроорганизмов равно как и особенности молекулярной организации отдельных эпитопов, непосредственно вовлеченных во взаимодействие с антителами.

В настоящем разделе работы представлены результаты изучения К-антигенов Y. pestis и V. cholerae 0139 с помощью панели антител различной специфичности.

На первом этапе исследований на модели чумного микроба сравнивали антигенные свойства препаратов К-антигена (Ф1), выделенных по методам Е. Baker et al. (1952), В.И. Вейнблата с соавт. (1980) и Л.Н. Сердобинцева с соавт. (1983), по способности индуцировать выработку антител у мышей BALB/c. В результате было ус-

тановлено, что сывороточные антитела к каждому из препаратов, а также МКА Y.p.FI.DjBî-Sp. (Анисимов с соавт., 1983; Девдариани, 1993), реагировали в ТИФА со всеми использованными антигенами независимо от метода экстракции и количественного присутствия в Ф1 углеводов, в том числе изолированным из Ф1 путем проте-олитической обработки по методу P. Hitchcock and T. Brown (1983) углеводным компонентом. Показано, что иммунизация последним также приводила к выработке у мышей BALB/c антител, способных взаимодействовать в ТИФА с препаратами Ф1 в одинаковом титре. При совместном инкубировании углеводного компонента с анти-капсульной сывороткой в конкурентном ТИФА зарегистрировано снижение титра специфических антител к Ф1 почти в 39 раз по сравнению с непрямым вариантом анализа, что указывает на непосредственное участие субстанций белковой и углеводной природы в обеспечении иммунореактивности Ф1 Y. pestis. В ДИА зафиксирована положительная реакция ЛПС и ОСА чумного микроба только с антителами к Ф1, выделенной методом Е. Baker et al. (1952), что согласуется с данными других исследователей о присутствии в указанном антигене неспецифических субстанций, в том числе, ассоциированных с клеточной стенкой* бактерий, обеспечивающих кросс-реактивность (Glosnicka, Gruszkiewicz, 1980; Косее с соавт., 1992, 1993, 1997, 1999 и др.) и, следовательно, на иммунохимическую неидентичность углеводного компонента капсулы и ЛПС возбудителя чумы.

При исследовании взаимосвязи серологически активного эпитопа Ф1, комплементарного МКА, с глико- или фосфолипидами по различной способности вступать в реакцию с перийодатом или гидроксидом натрия (Берзофски, Берковер, 1989) установлена его фосфолипидная природа. Показано сохранение антигенной активности данного эпитопа в ДИА с МКА в случае мягкой обработки Ф1 проназой и снижение ре-акционоспособности МКА вплоть до полного ингибирования с образцами Ф1 после тепловой обработки или в присутствии ß-меркаптоэтанола и SDS.

На следующем этапе для прояснения вопроса особенностей биогенеза капсульной субстанции у чумных бактерий с Fra± фенотипом (Burrows, 1963) в ряде экспериментов исследовали вакцинный штамм Y. pestis EV НИИЭГ, 6 природных штаммов чумного микроба с указанной выше характеристикой, 2 рекомбинантных варианта возбудителя чумы с дефектом по гену, а также иммунохимические свойства изолированных из них соответствующим методом антигенов Ф1 (любезно предоставлены

д.м.н. А.П. Анисимовым). При определении в сэндвич-ТИФА содержания Cafl внутри, на поверхности клеток и культуральной жидкости штаммов чумного микроба с Fra+ и Fra± фенотипами в клеточных лизатах бактерий без дефектов в пределах caf-оперона (У. pestis EV) обнаружено в 2,1 раза больше Cafl, чем на клеточной стенке, а также превышение количества секретируемого продукта в среде культивирования в 4,2 раза по сравнению с наружной мембраной бактерий. На поверхности бактерий и в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов или вариантов микробов с Fra± фенотипом Ф1 не выявлена. Однако зарегистрировано увеличение внутриклеточного количества Ф1 в 7,9-32,6 раза относительно штамма Y. pestis EV как интрацеллюляр-но, так на наружной клеточной стенке и в среде культивирования. Полученные в ТИФА данные подтверждены результатами электрофоретического разделения указанных штаммов в ПААГ-SDS - в клеточных лизатах всех cafl* бактерий чумы, кроме Y. pestis PKR-133, не имеющего в геноме соответствующей нуклеотидной последовательности (Гончаров, 1995), обнаружен белок, соответствующий по м.м. мономеру Ф1. Серологическая идентичность этого компонента Cafl установлена в иммуноблоте клеточных лизатов указанных бактерий с МКА к Ф1. Ни у одного из штаммов чумного микроба, кроме контрольного EV НИИЭГ, капсула не выявлена при окраске микроорганизмов по Бурри при культивировании бактерий при температуре 37°С в течение четырех суток. При тестировании в ТИФА изучаемых бактерий с МКА к ЛПС возбудителя чумы во всех случаях зафиксирована положительная реакция в высоких титрах на сходном уровне (1:1380±153,3 — 1:3072±505,1). Полученные данные согласуются с результатами экспериментального моделирования вторичной структуры CaflM (Zav'yalov et ai, 1995; Chapman et ai, 1997), что позволило нам предложить несколько возможных вариантов детекции штаммов Y. pestis с фенотипом: 1. Применение в реакциях ТИФА с коммерческими МКА к Ф1 лизатов чумных бактерий, а не взвесей цельных клеток; 2. Использование в НМФА и ТИФА МКА к ЛПС, реагирующих как с типичными, так и с атипичными штаммами микроба независимо от плазмидного состава или наличия дефектов в сaf-oпероне; 3. С помощью МКА к фибринолизину, как это будет показано далее.

В результате изучения иммунохимических свойств К-антигена, выделенного из штамма Р16064 V. cholerae 0139 по методу В.И. Вейнблата с соавт. (1980), установлено следующее: препарат оказался гетерогенным и содержал углеводный и белко-

вый компоненты, которые визуализировались в 12,5% ПААГ-8Б8 и иммуноблоте с гомологичной мышиной антисывороткой и были представлены быстромигрирующим, несколькими умеренно- и медленномигрирующими фрагментами и двумя белками с м.м. 38±2 и 61±2 кД. Электрофоретическая подвижность последних совпадала с м.м. мажорных полипептидов цельно-клеточных лизатов штаммов V. ско1вгав 0139. Установлена серологическая неидентичность в ТИФА К-антигена и ЛПС вибрионов указанной серогруппы, а также способность антикапсульных иммуноглобулинов взаимодействовать только со штаммами Р16064 и МО45 гомологичного серовара, причем с существенно большей активностью с вибрионами мутных (чувствительность около 1,0-10? м.кл./мл), а не прозрачных (1,5-3,0-10 м.кл./мл) колоний V. ско1вгав 0139. Реакция с другими гетерологичными микроорганизмами, включая вибрионы 01 и 022 серогрупп, отсутствовала.

При оценке протективных свойств К-антигена в сравнительных экспериментах с препаратом ЛПС V. ско1вгав 0139 Р16064 обнаружено, что первый из них обеспечивал более высокий - в 1,5 раза - уровень защиты аутбредных мышей от заражения гомологичным штаммом < независимо от присутствия в препарате белка, но не защищал, в отличие от ЛПС, животных, обработанных вирулентным штаммом 230 холерного вибриона Эльтор (табл. 1).

ТаблицаI

Сравнение протективных свойств К-антигена и ЛПС V. ско1вгав 0139

Антигены, использованные для иммунизации Заражение V. ско1егае 0139 Заражение V. ско1егае 01 Р

Кол-во -• зараженных мышей Из них выжило - Кол-во зараженных мышей Из них выжило

Абс. (М±т) Абс. (М±т)

Нативный К-антиген- 37 28 75,7±7,1 28 12 42,8±9,4 <0,05

Капсульный полисахарид 34 28 77,8±7,1 34 8 23,517,3 <0,01

ЛПС 35 17 49,5*8,5 28 14 50,0±9,5 >0,1

Неиммунизи-рованные мыши (контроль) 10 0 0 10 0 0

Увеличение дозы антигенов привело к статистически достоверному (Р<0,05) выживанию большинства (83,4±0,5 — 93,8±0,3) особей, зараженных штаммом V. ско1вгав 0139, причем при определенных дозировках (50-100 мкг/мышь) именно за счет белка капсулы. Серологическая идентичность ХТ вибрионов 01 и 0139 серогрупп была ус-

тановлена в ТИФА с гомологичными МКА Vch.Get.6Gg.Sp. в совместных экспериментах с к.м.н. Т.В. Аленкиной, т.к. к началу нашей работы в литературе отсутствовали сведения об иммунореактивности экзотоксина у V. cholerae 0139. 3. ОСОБЕННОСТИ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ УГЛЕВОДНЫХ КОМПОНЕНТОВ ЧУМНОГО МИКРОБА И ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА 0139 СЕРОВА-РИАНТА

В данной главе представлены данные по изучению ЛПС Y. pestis и V. cholerae 0139 с применением поли- и моноклональных антител.

Для характеристики ЛПС возбудителя чумы первоначально использовали гомологичные поликлональные антитела и разноэпитопные МКА шести стабильных гибридных линий, обладающих различной специфической активностью. При постановке ТИФА с клетками 100 штаммов Y. pestis и 61 штамма Y. pseudotuberculosis обнаружено, что МКА B1 и А6 взаимодействовали со 100% чумных и 22,9-24,6% псевдотуберкулезных бактерий, МКА А5, А, и С3 - с 15,0-70,0% и 8,2-9,8% соответствующих микробов, а МКА Ац выявляли только штаммы возбудителя чумы, но узнаваемый ими детерминант экспрессировался у 92,0% из них. Показана различная реакционо-способность МКА в ТИФА с бактериями чумы, отличающимися по плазмидному составу (табл. 2), что свидетельствует об отсутствии полной гомологии углеводных компонентов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis и, вероятно, неполной идентичности R-гликолипидов отдельных штаммов возбудителя чумы. С поликлональными антителами также зарегистрировано различное количество позитивных реакций при тестировании бактерий Y. pestis.

При определении локализации на молекуле ЛПС эпитопов, узнаваемых МКА, в различных модификациях ТИФА, ДИА и иммунохроматографии установлено, что все МКА узнают эпитопы полисахарида кора, по крайней мере два из которых являются серологически идентичными антигенным детерминантам липида А и шесть - ОСА. Данные этого этапа исследований были подтверждены при проведении конкурентного ТИФА. Совместное инкубирование ОСА и МКА полностью ингибировало взаимодействие последних с ЛПС, что указывает на комплементарность паратопов антител и эпитопов изучаемого антигена и, следовательно, на идентичность эпитопов ОСА и ЛПС. Причем аналогичное явление наблюдалось и при постановке конкурентного ТИФА с МКА и гомологичной к ОСА сывороткой. Таким образом, с помощью пане-

ли МКА впервые установлено наличие у R-ЛПС чумного микроба специфических детерминантов, а также общих для коровой части, липида А и ОСА эпитопов.

Таблица 2

Особенности экспрессии узнаваемых МКА углеводных детерминантов у штаммов чумного микроба с различным плазмидным составом в ТИФА

Плазмидный профиль штаммов Y. pestis Кол-во штаммов % позитивных реакций с антителами

моноклональными поликло-нальными

А, A« а7 Ап в, с, к ЛПС

pPst*pCad+pFra* 53 20,7 100,0 1U 43,3 96Д 60,3 94,3

PPst'pCad+pFra+ 20 25,0 100,0 20,0 35,0 100,0 100,0 90,0

pPst'pCad'pFra* 6 33,3 100,0 33,3 50,0 100,0 66,6- 100,0

pPst'pCacfpFra" 2 100,0 100,0 50,0 50,0 > 100,0 100,0 50,0

pPst+pCad+pFra" 3 0 100,0 0 66,6 100,0 333 66,6^

pPst+pCad"pFra' 2 100,0 100,0 0 50,0 100,0 100,0 50,0

pPst'pCadpFra" 4 25,0 100,0 25,0 25,0 100,0 50,0 100,0-

pPst+pCad"pFra+ 4 50,0 100,0 0 50,0 100,0 50,0 75,0

При изучении специфичности МКА в иммуноблоте и иммунохроматографии выявлены конкретные моносахариды ЛПС У. ргяйя, участвующие в формировании комплементарных антигенных детерминантов и определено их количество (табл. 3).

Таблица 3

Количество специфических эпитопов на моносахаридах кора ЛПС чумного микроба,

обнаруженных разными методами иммунохимического анализа.

Метод детекции Кол-во эпитопов на моносахаридах ЛПС Y. pestis

N-глюко замин гал геп глю фук ман риб кси кдо

RAM-HRP1 2 2 0 3 1 3 1 3 2

Белок A-Aui 2 2 0 4 3 3 2 3 2

ТИФА 2 1 0 4 3 3 2 3 2

ПААГ-SDS3 2 1 0 4 3 3 2 3 2

• иммунохроматография с использованием для проявления нитроцеллюлозных реплик после обработки МКА антивидового пероксидазного конъюгата; 2 - иммунохроматография с применением конъюгата белок А-коллоидное золото;3 - иммуноблот ЛПС и клеточных лиза-тов У. pestis после электрофоретического разделения.

При исследовании ЛПС холерного вибриона 0139 серовара применяли полученные нами поликлональные мышиные и кроличьи антитела к препаратам антигенов, выделенным из штамма Р16064 V. еко1егае 0139 по методу A. Boivin &а1. (1933) или культуральной жидкости (Джапаридзе с соавт., 1991).

Установлено, что оба препарата не реагировали в непрямом ТИФА с коммерческими лошадиными диагностическими холерными сыворотками Инаба, Огава, О и R0, а иммуноглобулины, выделенные из асцитических жидкостей мышей BALB/c или сывороток кроликов, иммунизированных ЛПС, взаимодействовали в сэндвич-ТИФА только со штаммами гомологичного серовара и не связывались с клетками 54 штаммов V. еко1егае 01 и не 01 серогрупп, а также 28 штаммов других бактерий. В аналогичном варианте иммуноферментного анализа антитела к цельным клеткам холерных вибрионов 0139 в 100% случаев реагировали со штаммами V. еко1егае 0139 и 01 серогрупп, отдельными представителями V. еко1егае не 01 (23% позитивных сигналов) и Е.еоИ (40% кросс-реакций), но не с вибрионами 022 серовара.

При сравнительном изучении препаратов ЛПС, депротеинизированных клеточных лизатов и термостабильных 0-антигенов (Shimada et а1., 1994) штаммов V. еко1егае 01, 0139 и 022 серогрупп обнаружены отличительные особенности в электрофоре-тических профилях углеводных компонентов, заключающиеся в отсутствии у представителей двех последних серогрупп зеброобразных полос в средней и верхней частях геля, характерных для холерных вибрионов 01, что согласуется с данными ^^ Nandy et а1. (1995). В иммуноблоте с антителами к ЛПС 0139 серогруппы специфические реплики обнаружены на уровне низкомолекулярных фрагментов О-антигенов и ЛПС указанного серовара.

При анализе в 12,5% ПААГ-SDS цельно-клеточных лизатов V. еко1егае 01 биова-ров классического и Эльтор, а также вибрионов 0139, 022 и других представителей не 01 серогрупп, выявлен ряд полипептидов, присутствующих в профилях всех изучаемых микробов или отдельных серотипов, био- или сероваров. 4. ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ БЕЛКОВ, КОДИРУЕМЫХ pCad ЧУМНОГО МИКРОБА

В главе изложены сведения, полученные при изучении Са2*-зависимых белков возбудителя чумы с панелью моноспецифических и моноклональных антител.

К началу наших исследований было известно до 25 Yops (Cornells et al., 1998). Однако при сравнительном исследовании в 12,5% ПААГ-SDS двух антигенных препаратов, полученных из моноплазмидного (pCad*) штамма Y. pestis KM-217 и бесплазмид-ного варианта возбудителя чумы, КМ-218, выращенных в условиях максимального синтеза pCad-зависимых белков (Дятлов, Филиппов, 1993), в первом из них было обнаружено 35 белков, отсутствующих в препарате КМ-218. Следовательно, нами было выявлено по крайней мере 10 новых антигенов, что согласуется с результатами исследований R. Perry et al. (1998), продемонстрировавших наличие 60 открытых рамок считывания в pLCR (pCDl) Y. pestis KIM5, в том числе и для потенциально новых членов LCR. Детерминированность указанных антигенов pCad была подтверждена в иммуноблоте с кроличьей адсорбированной анти-рСаd-сывороткой в совместных экспериментах с к.б.н. Н.А. Видяевой, что позволило идентифицировать некоторые известные БНМ - БНМ1 (соответствовал белку №1 нашего исследования), БНМ2 (белок № 12 или 13), БНМ4 (белок № 15/16), БНМ5 или Yop5/YopE (белок №19), V антиген (белок № 14) и др., а также реакции иммунодиффузии и нескольких вариантах ТИФА. Во всех случаях мышиные моноспецифические сыворотки к отдельным белкам, полученные по методу X. Амброзиус (1987), формировали одну линию преципитации только с pCad+ штаммом Y. pestis и положительно реагировали в ТИФА в титрах от 1:4000 до 1:128000 с несущими указанную плазмиду чумными бактериями.

При изучении иммуногенности установлено, что наибольшей способностью защищать аутбредных мышей от заражения экспериментальной чумой обладали белки № 2 (м.м. 72±2 кД) и 19 (м.м. 25±2 кД) - 50 и 57% выживших животных, соответственно, а также белки № 8 (м.м. 54±2 кД) и 21 (м.м. 87±2 кД) - 3 6,4% особей.

С помощью гибридомной технологии к указанным антигенам, а также к ряду других продуктов плазмиды Са2+-зависимости, в том числе, V антигену, были получены МКА, продуцируемые соответствующими стабильными гибридными линиями, специфическая и пролиферативная активности которых in vivo были оценены в НМФА на протяжении не менее 9 пассажей. Методом аффинной хроматографии с применением в качестве лиганда МКА к белку № 19, обладающему наибольшей иммуноген-ностью, был изолирован полипептид, состоящий из нескольких субъединиц, соответствующих в 10% ПААГ-SDS по м.м. белкам № 19, № 8, № 21, и еще двух антигенов с м.м. 2212 И 125±2 кД. Показаны термоиндуцибельный характер синтеза указанных

белков, детерминированность pCad и наличие общих эпитопов у каждого из перечисленных антигенов аналогично белку Y.pestis с м.м. 22±2 кД (^а1у^пас et а1, 1988). При определении типа связи, стабилизирующей молекулу, было установлено, что только два белка с м.м. 87±2 и 125±2 кД соединены между собой дисульфидными мостиками, а в поддержании общей структуры белковой молекулы, вероятно, заметную роль играют гидрофобные взаимодействия. У субъединиц дополнительно обнаружен ряд интересных иммунобиологических свойств, в том числе, адгезивные, лек-тинные и адъювантные активности, что предполагает укладку полипептидных цепей зрелой белковой молекулы в виде р-спирали. Последнее обеспечивает способность антигена к белок-белковым взаимодействиям, в том числе, специфическое взаимодействие белка и шаперона (^аШаи et а1., 1996). Установленные в настоящем исследовании вышеперечсленные свойства белка № 19 (УорЕ) согласуются с сообщениями о наличии у этого полипептида специфического шаперона SycE (^аШаи et а1.у 1993) или УсгА (Ргй^^М&еп et а1, 1995).

5. ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФИБРИНОЛИЗИНА У\pestis С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Настоящий раздел работы посвящен получению и применению МКА для изучения фибринолизина чумного микроба.

Для отбора позитивных клонов одновременно использовали два методических подхода: скрининг антителопродукции в ТИФА и НМФА с клетками рРй+ и рРзГ штаммов возбудителя чумы и способность МКА ингибировать фибринолитическую активность У. ре5^ в РТФ. В результате после клонирования и реклонирования методом лимитирующих разведений было отобрано 27 РТФ+ МКА различной специфичности, условно разделенных на четыре группы - А, В, С и D. При тестировании на клетках 92 штаммов Ypestis, 28 штаммов Y.pseudotuberculosis и 19 штаммов других бактерий показано специфическое взаимодействие в НМФА МКА группы А (15 клонов) со 100% рРв1+ штаммов чумного микроба независимо от комбинации других плазмидных репликонов. С МКА групп В и С (10 клонов) зарегистрировано 33,384,0% позитивных реакций. Ни одно из МКА не связывалось с бесплазмидными вариантами Y.pestis и другими близкородственными в серологическом отношении представителями семейства Enterobacteriaceae. С МКА группы D (3 клона) положительных реакций с клетками бактерий не зафиксировано.

При последующем изучении функциональных и иммунохимических свойств установлена способность всех РТФ+ МКА ингибировать плазмокоагулирующую активность возбудителя чумы, окрашивать в НМФА и ДИА рРв^ штаммы чумных бактерий, выращенных как при температуре 280С, так и при 37°С, и визуализировать в им-муноблоте с клеточными лизатами Y. pestis ЕУ независимо от температуры культивирования микроба и препаратами фибринолизина две мажорные линии с м.м. 37±2 и 35±2 кД, т.е. соответствующие электрофоретической подвижности фибринолизина и коагулазы ^гаку, ВгиЬакег, 1982; McDonough, Еа1кош, 1989; Булгакова, 1991 и др.).

Показана невозможность разделения препарата фибринолизина и коагулазы на две отдельные антигенные субстанции методом высоко эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

При тестировании специфической активности в НМФА на клетках 100 природных штаммов возбудителя чумы с различным набором плазмид обнаружена способность МКА группы А окрашивать как капсулированные, так и бескапсульные варианты Y. pestis, несущие плазмиду пестициногенности. При сравнительном анализе диагностической значимости МКА к фибринолизину и Ф1 в НМФА и дот-иммуноанализе (ДИА) установлены преимущества и перспективы применения первых из них как основы иммуноглобулиновых реагентов, направленных на идентификацию чумных бактерий независимо от температуры их культивирования и наличия капсулы с одновременной дифференциацией последних от других патогенных иерсиний. 6. ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИКЛАДНОЕ ЗНАЧЕНИЕ АНТИИДИОТИПИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ

В данной главе представлены теоретические и практические аспекты получения и применения АИТ для изучения ЛПС Y. pestis и белков № 2, 8, 19 и 21, кодируемых рСа<±

Выработку АИТ индуцировали иммунизацией кроликов или мышей ВАЬВ/с соответствующими МКА. Присутствие гомологичных антител к каждому из иммунизирующих агентов в сыворотках и асцитических жидкостях биомоделей было подтверждено в реакции иммунодиффузии и нескольких вариантах ТИФА. Комплементар-ность анти-МКА-антител Е(аЬ)-фрагментам моноклональных иммуноглобулинов и принадлежность их к виду АТ2Р была установлена по иммунохимическому, иммунологическому и функциональному критериям.

Показано наличие у АИТ к ЛПС выраженного адьювантного эффекта на основании способности почти в 16 раз усиливать выработку антител к Ф1 У.рвяНя при совместном введении мышам линии С57/В1. Установлены адгезивные и лектинные свойства АИТ к Са2' -зависимым белкам, а также, в ряде случаев, высокая иммуно-генность некоторых из них - обработка аутбредных мышей АИТ к белкам № 19 и 21 защищала 60,0-77,8% животных от заражения вирулентным штаммом У. рв5Ш 231.

Изучена возможность применения АИТ к ЛПС возбудителя чумы как аналога гомологичного антигена, наряду с исходным антигеном и Ф1, для определения противочумных антител в сыворотках гипериммунных животных (8 образцов) и привитых живой чумной вакциной сотрудников РосНИПЧИ "Микроб" (140 человек). Выявлено сходное количество позитивных реакций ко всем использованным антигенам, а у прививавшихся в течение 10 и более лет людей зарегистрировано в 1,5-2,0 раза больше положительных сигналов к ЛПС и соответствующим ему АИТ по сравнению с Ф1. 7. ПЕРСПЕКТИВА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЫШИНЫХ ПОЛИ- И МОНОКЛО-НАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ: РАЗРАБОТКИ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ

Завершающим этапом работы явилось изучение диагностической значимости полученных нами моно- и поликлональных антител к различным антигенам возбудителей чумы и холеры.

Как известно, большинство тест-систем для лабораторной диагностики чумы направлено на обнаружение Ф1 или антикапсульных антител. Однако наличие капсулы не является постоянным признаком возбудителя, а термоиндуцибельный характер синтеза Ф1 ограничивает область применения гомологичных поли- и моноклональных антител. По нашим данным, результаты сравнительного анализа специфической активности МКА к Ф1 и фибринолизину/коагулазе убедительно свидетельствовали в пользу последних при выявлении и характеристике штаммов У. рв5Ш (табл. 4). Ком-плементарность полученных нами МКА общему для фибринолизина и коагулазы эпитопу обеспечивает выявление чумных бактерий независимо от температуры их культивирования и исключает кросс-реакции с гетерологичными микроорганизмами, включая другие патогенные иерсинии, которые нередко регистрируются в реакциях с МКА к Ф1 (Басова с соавт., 1982; Анисимов с соавт., 1983; Бичуль с соавт., 1989; Косее с соавт., 1992, 1993 и др.).

Установлена высокая диагностическая значимость МКА к ЛПС. Продемонстрированы перспективы применения МКА к ЛПС при тестировании штаммов чумного микроба независимо от композиции плазм ид и температуры выращивания бактерий.

Таблица 4

Реакционоспособность МКА разных гибридных линий в ТИФА с бактериями У. ргяйя

с различным плазмидным профилем

Изогенные варианты У. резйз ЕУ и их плазмидный состав Температура куль-тиви-рова-ния,°С Гибрвдомы-продуценты и антигены, эпитопы которых узнают МКА

ИэВ2 (ФО Группа А (фибрино-лизин/ко-агулаза) 2АТ205 (V антиген) 2А7208Е5 (белок № 19) Аб,Вь Ап (ЛПС)

ЕУ рРга^рРз^рСасГ 28 - + - - +

37 + + + + +

КМ-215 рРга'дЛ^рСаЛ* 28 - + - - +

37 - + + + +

КМ-216 рРга";рР$1+;рСаеГ 28 - + - - +

37 - + - - +

КМ-217 рРга'грРвСдСаа* 28 - - - - +

37 - - + + +

КМ-218 рРга'.-рРгГфСасГ 28 - - - - +

37 - - - - +

КМ-225 рРга+,-рРй";рСа<Г 28 - - - - +

37 + - - - +

КМ-226 рРга+фРй+;рСа<Г 28 - + - - +

37 + + + + +

КМ-227 рРга^рРв^.-рСасГ 28 - + - - +

37 + + - - +

Представлены экспериментальные данные об особенностях практического использования панели МКА к некоторым белкам, кодируемым pCad, общей для патогенных иерсиний. Установлены потенциальные возможности изучения тонкой антигенной структуры и молекулярной организации отдельных продуктов pCad с помощью гомологичных МКА, а также использования последних для эпизоотологического мониторинга в природных очагах чумы.

Показаны преимущества использования иммуноасцитических жидкостей мышей ВАЬВ/с, иммунизированных некоторыми антигенами Y. pestis (Ф1, ОСА, липидом А, белками, кодируемыми рСаё) и V. cholerae 0139 (ЛПС, К-антигеном, липидом А) для получения препаративного количества гомологичных антител. Представлено теоретическое обоснование возможности применения мышей указанной линии в качестве биопродуцентов для приготовления экспериментальных серий иммуноглобулиновых препаратов, перспективных для практического здравоохранения или проведения фундаментальных научных исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем разделе обобщены и проанализированы основные данные, полученные при изучении антигенов чумного микроба и холерного вибриона 0139 с помощью современных методов молекулярной иммунологии и иммунохимии на моделях типичных и атипичных штаммов Y. pestis, включая варианты чумного микроба, дефектные по гену саАМ, а также природных штаммов холерных вибрионов 0139 серо-вара.

Представлено теоретико-экспериментальное обоснование возможности практического применения соответствующих гомологичных антиидиотипических, поли- и мо-ноклональных антител для дальнейшего совершенствования диагностических и профилактических иммуноглобулиновых препаратов, а также проведения фундаментальных исследований структурно-функциональной и молекулярной организации антигенов патогенных бактерий на уровне индивидуального антигенного детерминанта.

Показаны преимущества применения сочетания разработанных в настоящей работе оригинальных методических подходов с основными положениями фундаментальной и молекулярной иммунологии, иммунохимии и гибридомной биотехнологии при изучении иммунохимических и иммунобиологических свойств синтезируемых микроорганизмами известных биомолекул и ассоциированных с ними отдельных эпито-пов или выявлении и характеристике новых антигенных субстанций.

Отмечено, что новые сведения об антигенной структуре возбудителей чумы и холеры являются существенным вкладом в понимание роли конкретных антигенов в иммуно- и патогенезе указанных инфекций и определяют ряд перспективных направлений молекулярной иммунологии биомолекул белковой и углеводной природы патогенных бактерий.

30

выводы

1. Разработаны новые методические подходы для изучения антигенной структуры возбудителей чумы и холеры с использованием гибридомной биотехнологии и экспериментально обоснована перспектива их применения для создания диагностических и профилактических препаратов.

2. С помощью современных методов иммунохимического анализа (различных вариантов ТИФА и иммуноблоттинга) установлены гликопептидная природа и конфор-мационная зависимость антигенного детерминанта, определяющего серологическую активность капсульного антигена чумного микроба. Показана способность углеводного компонента Ф1 индуцировать выработку антител у лабораторных животных.

3. Экспериментально доказана внутриклеточная локализация капсульного антигена у штаммов чумного микроба с Fra± фенотипом, подтверждающая исключительную роль CaflM Y.pestis в транспортировке мономера Ф1 из периплазматического пространства на поверхность микробной клетки. Предложено несколько методических приемов для обнаружения и идентификации указанных штаммов, не требующих создания специальных диагностических препаратов для выявления так называемой "атипичной" капсулы: 1. Разрушение идентифицируемых клеток Y.pestis лизирующим буфером с последующим определением Ф1 соответствующими коммерческими диагностическими препаратами; 2. Использование для индикации иммунофермент-ных тест-систем, основой которых являются МКА к другому видоспецифическому антигену возбудителя чумы - фибринолизину/плазмокоагулазе; 3. Применение для обнаружения таких штаммов моноклональных флуоресцирующих иммуноглобулинов к ЛПС чумного микроба или аналогичной иммуноферментной тест-системы.

4. У R-гликолипида чумного микроба при использовании панели разноэпитопных МКА обнаружено не менее шести различных серологически активных антигенных детерминантов. Установлено, что галактоза, фукоза и манноза содержат родоспеци-фические эпитопы, N-глюкозамин, глюкоза, рибоза, ксилоза и КДО - общие для Y.pestis и Y.pseudotuberculosis антигенные детерминанты, а N-глюкозамин, глюкоза, манноза, ксилоза и КДО - специфические эпитопы для возбудителя чумы. На основе гомологичных антител сконструированы экспериментальные диагностические тест-системы, способные выявлять штаммы Y. pestis независимо от состава собственных

плазмид, в том числе бесплазмидные варианты. Впервые получены данные о присутствии общих эпитопов у коровой части ЛПС, липида А и ОСА.

5. С помощью панели МКА установлена иммунохимическая идентичность фибри-нолизина и коагулазы Y. pestis, существующих в виде бифункционального белка с двумя видами ферментативной активности. Разработаны видоспецифичные экспериментальные флуоресцирующие моноклональные иммуноглобулины и моноклональ-ные иммуноферментные конъюгаты для обнаружения бактерий Y. pestis, несущих pPst, независимо от температуры их культивирования и наличия или отсутствия других собственных плазмид.

6. Впервые выявлены и изучены специфические и протективные свойства 35 белков, кодируемых pCad чумного микроба, включая ранее не описанные новые полипептиды. Получена панель моноклональных антител к отдельным антигенным детерминантам этих субстанций, в том числе, V антигену и белкам с м.м. 25±2, 27±2, 54±2,

благодаря использованию которых представлены данные об их возможной структурной организации. Доказано существование YopE в виде сложноор-ганизованного антигена, состоящего из нескольких белковых субъединиц с идентичными свойствами, наиболее важными из которых являются высокая иммуногенность и отсутствие деградации под действием фибринолизина. Установлена способность белков с м.м. 25±2 и 72±2 кД защищать от экспериментальной чумы 50-60% иммунизированных аутбредных мышей.

7. Впервые получены и охарактеризованы по иммунохимическому, иммунологическому и функциональному критериям АИТ к ЛПС и белкам с м.м. 25±2, 54±2, 72±2 и 87±2 кД, кодируемых pCad Y. pestis. Установлена выраженная адьювантная активность чумных АИТ к ЛПС, заключающаяся в 16-кратном увеличении титра антикап-сульных антител у аутбредных мышей при совместном введении с Ф1, отсутствие токсического эффекта при иммунизации лабораторных животных, а также возможность применения наряду с ЛПС и Ф1 для обнаружения в ТИФА противочумных антител в сыворотках иммунизированных животных и привитых живой чумной вакциной людей. Выявлено наличие у АИТ к указанным белкам адгезивных, лектинных и специфических серологических свойств, присущих исходным антигенам, а также способности АИТ к белкам с м.м. 25±2 И 87±2 кД защищать от экспериментальной чумы 60-78% иммунизированных мышей линии С57/В1. Показана перспективность исполь-

зования полученных АИТ для изучения антигенной структуры бактерий и разработки профилактических и диагностических препаратов.

8. В К-антигене, экстрагированном из V. cholerae 0139 серовара по методу выделения капсульных субстанций, помимо полисахаридсодержащего компонента обнаружены белки с м.м. 38±2 и 61±2 кД. Установлены более выраженные протективные свойства изолированной субстанции по сравнению с традиционно используемым О-антигеном. Получены специфические антикапсульные неадсорбированные поликло-нальные антитела, эффективные для обнаружения в иммуноферментном анализе вибрионов указанного серовара и их дифференциации по степени вирулентности.

9. При сравнении в ПААГ-SDS цельно-клеточных лизатов холерных вибрионов 01 и не 01 серогрупп обнаружены антигены белковой природы, общие для рода Vibrio

а также белки, присутствующие в элек-трофоретических профилях представителей только классического (м.м. 28±2 и 80±2 кД) или Эльтор (м.м. 30±2 и 44±2 кД) биоваров, серотипов Инаба (м.м. 49±2, 50±2, 83±2,93±2 и 98±2 кД) или Огава (м.м. 38±2 кД), 0139 (43±2 и 78±2 кД) или 022 сероваров, соответственно.

10. Экспериментально обоснованы и сформулированы перспективные научные направления, имеющие важное прикладное значение для иммунодиагностики и профилактики чумы, холеры и других инфекций:

- создание антиидиотипических вакцин, лишенных материала патогена, обладающих иммунопротективными или адъювантными свойствами, не уступающих по эффективности соответствующим специфическим антигенам или антигенным комплексам;

- конструирование антигенных диагностических антиидиотипических препаратов, имеющих существенные преимущества в технологии изготовления и качестве конечной продукции перед аналогичными антигенными диагностикумами, основу которых составляют очищенные в той или иной степени антигены;

- создание диагностических иммуноглобулиновых препаратов с использованием моноспецифических поликлональных антител, не требующих дополнительной адсорбции гетерогенными микроорганизмами, полученных от иммунных мышей конкретной инбредной линии;

- примен+ение экономически малозатратного гибкого биотехнологического метода получения стандартных мышиных моноспецифических поликлональных или (при необходимости переориентации производства) моноклональных иммуноглобулинов за счет сочетанного использования в качестве биопродуцентов ин-бредных мышей и миелом сингенных линий с содержанием в асцитической жидкости специфических антител, сопоставимых по концентрации и объему с кроличьими гипериммунными сыворотками.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Девдариани З.Л., Веренков М.С., Федорова В.А., Вейнблат В.И. Получение и диагностическая значимость моноклональных антител к возбудителям чумы и псевдотуберкулеза // Иерсиниозы: Микробиол., эпидемиол., клиника, патогенез, лаб. диагностика: Тез. Всесоюзн. науч.-практ. конф. (12-13 сент. 1989 г.). - Владивосток, 1989.-4.2.-С. 88-89.

2. Девдариани З.Л., Веренков М.С., Федорова ВА., Митина Е.В. Применение моноклональных антител для обнаружения чумы и псевдотуберкулеза непрямым им-мунофлуоресцентным методом // Состояние проблемы и перспективы развития диагн. бактер. инф.: Матер, рабочего совещ. (1-2 нояб. 1989 г.). - Оболенск, 1990. - С. 60.

3. Девдариани 3JL, Федорова В.А., Чижиньков А.И., Веренков М.С., Кочетов А.Х. Особенности использования лабораторных мышей при изготовлении коммерческих чумных моноклональных люминесцирующих иммуноглобулинов // Тез. конф. "Лабораторные животные для медико-биологических исследований" (20-22 нояб. 1990 г.). - Москва, 1990. - С. 96.

4. Девдариани З.Л., Федорова В.А. Прижизненное неоднократное получение ас-цитической жидкости у зараженных гибридомами мышей // Лаб. дело. - 1991. - № 6. -С. 79.

5. Девдариани З.Л., Федорова В.А., Аленкина Т.В. Протективная активность мо-ноклональных антител к капсульному антигену и липополисахариду чумного микроба // Тез. докл. I съезда иммунологов России (23-25 июня 1992 г.). - Новосибирск, 1992.-С. 130-131.

6. Devdariani Z.L., Verenkov M.S., Feodorova V.A., Solodovnikov N.S., Belov L.G. Identification of Yersinia pestis with varied plasmid composition using monoclonal and

put. ... ■

polyclonal fluorescent immunoglobuhns // FEMS Immunol, and Med. Microbiol. - 1993. -№6.-P. 31-36.

7. Федорова В.А., Девдариани З.Л., Сумарока М.В., Дятлов И.А., Аленкина Т.В. Экспрессия плазмидой Са2+-зависимости Y. pestis протективных антигенов // Имму-нол. и специф. профилакт. особо опасн. инф.: Матер. Российск. науч. конф. (21-23 сент. 1993). - Саратов, 1993. - С. 76-77.

8. Федорова В.А., Девдариани З.Л., Тараненко Т.М., Аленкина Т.В. Антиидиоти-пические антитела к липополисахариду Y. pestis //Там же. - С. 77-78.

9. Федорова В.А., Девдариани ЗЛ., Тараненко Т.М., Шульгина И.В. Иммуно-ферментная тест-система с использованием моно- и поликлональных антител для детекции возбудителей чумы и псевдотуберкулеза// Там же. - С. 240-241.

10. Веренков М.С., Степанов В.М., Солодовников Н.С., Девдариани ЗЛ., Федорова В А., Шанина Л.Н., Радченко ГА., Королев Б.В., Аленкина Т.В., Мальянова О.А. Сравнительная оценка эффективности прямого и непрямого вариантов метода флуоресцирующих антител при обнаружении и идентификации бактерий чумы // Матер, межгосуд. науч. конф. "Профил. и меры борьбы с чумой", поев. 100-летию открытия возб. чумы (6-7 сент. 1994 г.). - Алма-Ата, 1994. - С. 80-81.

11. Федорова В.А., Девдариани ЗЛ., Дятлов И.А. Получение и характеристика моноклональных антител к белкам, экспрессируемым плазмидой Са2+- зависимости Y. pestis //Там же. - С. 82.

12. Федорова В.А., Девдариани ЗЛ., Тараненко Т.М. Изучение иммуномодули-рующих свойств антиидиотипических антител к липополисахариду чумного микроба на модели В-клеточных гибридом in vitro //Там же. - С. 84

13. Федорова В.А., Девдариани ЗЛ. Специфические свойства антиидиотипических антител к липополисахариду чумного микроба// Там же. - С. 150-151.

14. Девдариани ЗЛ., Федорова В.А., Сумарока М.В., Аленкина Т.В., Дятлов И.А. Характеристика моноклональных антител к белку с м.м. 30 kDa, кодируемому плазмидой Са2+-зависимости чумного микроба // Там же. - С. 25.

15. Девдариани ЗЛ., Федорова В.А., Тараненко Т.М. Определение антител к ли-пополисахариду чумного микроба в гипериммунных сыворотках животных // Актуал. вопр. профил. чумы и др. инф. заб.: Матер, межгос. науч.-практич. конф. - Ставрополь, 1994. - С. 25-26.

16. Федорова В.А., Девдариани З.Л., Кузнецова Н.А., Тараненко Т.М., Солодовников Н.С., Шульгина И.В. Специфическая активность моноклональных антител к липополисахариду чумного микроба, продуцируемых разными клонами гибридом // Там же. - С. 94-95.

17. Федорова В.А., Девдариани ЗЛ., Кузнецова Н.А., Веренков М.С., Ермакова Г.В., Солодовников Н.С., Тараненко Т.М., Андреева И.П., Шульгина И.В. Специфическая активность поликлональных иммуноглобулинов к липополисахариду чумного микроба в иммуноферментном анализе // Там же. - С. 95-96.

18. Федорова В.А., Девдариани З.Л., Назарова Л.С., Тараненко Т.М. Характеристика антиидиотипических антител к липополисахариду чумного микроба // Там же. -С. 96-97.

19. Федорова В.А., Девдариани З.Л., Тараненко Т.М., Андреева И.П., Кузнецова Н.А. Идентификация антигенных детерминант у липополисахарида чумного микроба с помощью моноклональных антител // Там же. - С. 97.

20. Федорова В.А., Ермакова Г.В., Тараненко Т.М., Девдариани З.Л., Андреева И.П. Изучение электрофоретических профилей липополисахаридов чумного и псевдотуберкулезного микробов // Там же. - С. 98—99.

21. Девдариани ЗЛ., Федорова В.А. Значение серологических методов исследования на основе поли- и моноклональных антител в лабораторной диагностике чумы // Проблемы особо опасных инф. - Саратов, 1995.- № 1. - С. 77-90.

22.' Федорова В.А., Девдариани ЗЛ., Тараненко Т.М. Влияние величины рН сливающего агента на образование антителопродуцирующих гибридом к липополисаха-риду чумного микроба // Матер, науч.-практич. конф., посвящ. 60-летию противочумной службы на Кавказе. - Ставрополь, 1995. - С. 317-318.

23. Федорова В.А., Девдариани ЗЛ., Тараненко Т.М. Перевиваемость ин виво разных клонов гибридом - продуцентов моноклональных антител к липополисахари-ду чумного микроба // Там же. - С. 319-320.

24. Девдариани З.Л., Федорова ВА, Громова О.В., Тараненко Т.М., Андреева И.П., Герасимова К.И. Обнаружение специфических антител к чуме в сыворотках привитых людей // Там же. - С. 265-266.

25. Джапаридзе М.Н., Наумов А.В., Громова О.В., Адамов А.К., Елисеев Ю.Ю., Космоенко О.М., Копырзов В.Н., Заворотных В.И., Девдариани ЗЛ., Федорова В А,

Алснкина Т.В., Чеховская Г.В. Изучение штамма возбудителя холеры 0139 серовара для получения иммуногенов холерных вакцин // Там же. - С. 266-267.

26. Федорова В.А., Аленкина Т.В., Громова О.В., Девдариани З.Л., Джапаридзе М.Н., Космоенко О.М. Сравнительное изучение особенностей синтеза и специфичности энтеротоксина Vibrio cholerae 0139 серовара с помощью моноклональных антител // Молекул, генетика, микробиология и вирусол. - 1996. - № 3. - С. 3-6.

27. Федорова В.А., Девдариани З.Л. Повышение эффективности метода получения антителопродуцирующих гибридом // Биотехнология. - 1996. -№ 4. - С. 10-13.

28. Федорова В.А., Уткин Д.В., Анисимов А.П., Маркова В.Ю., Киреев М.Н., Дроздов И.Г., Девдариани ЗЛ. Изучение иммунореактивности капсульного антигена штаммов Yersiniapestis, дефектных по гену caf1M, с помощью иммуноферментного анализа // Тез. докл. к международ, конф. Академии Естествознания Томеостаз и инф. процесс". - Саратов, 1996. - С. 264.

29. Федорова В.А., Девдариани З.Л., Лупикова Н.И., Киреев М.Н., Солодовников Н.С. Получение и характеристика моноклональных антител к фибринолизину - ви-доспецифическому антигену Yersinia pestis II Сб. научн. трудов науч. конф. "Эколого-эпидемиологический надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном При-каспии". - Астрахань, 1996.-С. 118-119.

30. Федорова В.А., Громова О.В., Девдариани ЗЛ., Джапаридзе М.Н. Иммуно-химическая характеристика липополисахарида Vibrio cholerae 0139 серовара и диагностическая значимость полученных к нему антител // Биотехнология. - 1996. -№11.-С. 33-37.

31. Аленкина Т.В., Федорова В.А., Громова О.В., Девдариани З.Л., Киреев М.Н. Гиперпродукция энтеротоксина штаммами Vibrio cholerae 0139 серовара // Матер, конф. "Эпидемиол. и клинико-иммунол. аспекты профилакт. важнейш. инф. заболев.". -Астрахань, 1996.-С. 135-136.

32. Терешкина Н.Е., Федорова В.А., Громова О.В., Девдариани ЗЛ. Кинетика образования антител к капсульному антигену Vibrio cholerae 0139 серовара // ДЕП. в ВИНИТИ 04.11.96 г. № 3209-В96.

33. Федорова В.А., Девдариани ЗЛ., Дятлов И.А., Солодовников Н.С. Изучение спектра pCad-зависимых полипептидов у возбудителей иерсиниозов // Матер.УН

съезда вссроссийск. общества эпидемиол., микробиол. и паразитол. (28-31 янв. 1997 г.). - Москва, 1997. - Т. 1. - С. 249-250.

34. Джапаридзе М.Н., Наумов А.В., Громова О.В., Елисеев Ю.Ю., Палагин А.Ю., Федорова В.А., Аленкина Т.В. Новый штамм Vibrio cholerae 0139 серовара - продуцент оральной химической вакцины и специфической антисыворотки // Там же. -С. 291-292.

35. Федорова В.А., Терешкина Н.Е., Громова О.В., Девдариани ЗЛ. Иммуноре-активность капсульного антигена Vibrio cholerae 0139 серовара // Там же. — С. 312— 313.

36. Федорова В.А., Громова О.В., Девдариани ЗЛ., Аленкина Т.В., Терешкина Н.Е. Специфическая активность антител к капсульному антигену Vibrio cholerae 0139 серовара // Там же. - С. 313-314.

37. Федорова В.А., Громова О.В., Девдариани З.Л., Аленкина Т.В., Грачева И.В., Ливанова Л.Ф. Иммунохимические свойства и протективная активность капсульного антигена Vibrio cholerae 0139 серовара // Там же. - С. 314-315.

38. Федорова В А., Девдариани 3JL Повышение эффективности образования асцита у мышей, зараженных антителопродуцирующими гибридными клетками // Деп. в ВИНИТИ 23.05.97 г. № 1701-В97.

39. Федорова ВЛ., Девдариани ЗЛ. Структурно-функциональная характеристика липополисахарида чумного микроба//Деп. в ВИНИТИ 23.05.97 г. № 1702-В97.

40. Девдариани ЗЛ., Федорова ВЛ., Солодовников Н.С., Плотников О.П., Шульгина И.В. Иммуноферментная тест-система для идентификации типичных и атипичных штаммов чумного микроба // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. — 1997. -№1.-С. 31-35.

41. Федорова В.А., Девдариани ЗЛ., Громова О.В., Ливанова Л.Ф. Некоторые иммунохимические и иммунобиологические свойства капсульного антигена Vibrio cholerae 0139 серовара // Молекул, генетика, микробиология и вирусол. - 1997. -№3.-С. 18-20.

42. Девдариани ЗЛ., Федорова В.А., Громова О.В., Тараненко Т.М. Сравнительная эффективность обнаружения специфических антител к капсульному антигену и липополисахариду Yersinia pestis у привитых чумной вакциной людей // Клинич. лаб. диагностика. - 1997. - № 4. - С. 39-41.

43. Киресв М.Н., Федорова В.А., Девдариани З.Л., Солодовников Н.С., Лупикова Н.И. Бифункциональные свойства моноклональных антител к фибринолизину-коагулазе Yersinia pestis II Матер. II съезда биохим. общества Рос. акад. наук (1923 мая 1997 г., Москва). - Пущино, 1997. - ч. II. - С. 364-365.

44. Федорова В.А., Громова О.В., Девдариани З.Л., Аленкина Т.В., Грачева И.В. Антигенные свойства липида A Vibrio cholerae 0139 серовара // Там же. - С. 365-366.

45. Федорова В.А., Терешкина Н.Е., Громова О.В., Девдариани ЗЛ., Джапаридзе М.Н., Киреев М.Н., Солодовников Н.С., Аленкина Т.В. Эпитопный анализ липида А Vibrio cholerae 0139 серовара // Деп. в ВИНИТИ 23.05.97 г. № 1700-В97.

46. Федорова В.А., Терешкина Н.Е., Громова О.В., Девдариани ЗЛ., Белякова Н.И., Доброва Г.В., Елисеев Ю.Ю., Джапаридзе М.Н., Киреев М.Н. Применение дот-иммуноанализа для контроля синтеза основных иммуногенов Vibrio cholerae 0139 се-ровара при его глубинном культивировании // Деп. в ВИНИТИ 24.11.97 г. № 3446-В97.

47. Девдариани ЗЛ., Федорова В .А., Солодовников Н.С. Иммунохимическая и иммунобиологическая характеристика pCad-зависимого протективного антигена Yersinia pestis II Материалы науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию образования про-тивочумн. службы России (16-18 сент. 1997 г.). - Саратов, 1997. - Т. 1. - С. 205.

48. Тараненко Т.М.; Гусева Н.П., Ермакова Г.В., Киреев М.Н., Кравцов АЛ., Наумов А.В., Девдариани ЗЛ., Федорова В.А., Брандзишевский Ю.В., Коннов Н.П. Изучение структуры и функции углеводсодержащих антигенов чумного микроба с помощью различных модификаций // Там же. - С. 246-247.

49. Девдариани ЗЛ., Федорова В А, Терешкина Н.Е., Тараненко Т.М., Киреев М.Н. К характеристике соматических полисахаридсодержащих антигенов чумного микроба // Там же. - Т. 2. - С. 32.

50. Федорова В.А., Девдариани ЗЛ., Солодовников Н.С, Лупикова Н.И., Киреев М.Н. Иммунохимическая идентичность фибринолизина и плазмокоагулазы чумного микроба // Там же. - С. 139.

51. Девдариани З.Л., Аленкина Т.В., Федорова В.А. Экспресс-идентификация токсигенных штаммов возбудителя холеры // Там же. - С. 171-172.

52. Федорова В.А., Громова О.В., Девдариани З.Л., Терсшкина Н.Е., Солодовников Н.С., Джапаридзе М.Н. Детекция штаммов Vibrio cholerae 0139 в иммунофер-ментном и дот-иммуноанализе // Там же. - С. 228-229.

53. Федорова В.А., Девдариани З.Л. В идо-, биоваро- и серовароспецифические полипептиды Vibrio choleraeIIТам же. - С. 229-230.

54. Федорова В.А., Терешкина Н.Е., Громова О.В., Девдариани ЗЛ. Анти-липид А-антитела как дополнительный критерий дифференциации Vibrio cholerae 01 и не 01 серогрупп // Там же. - С. 231.

55. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. Some serological properties ofFI Yersinia pestis galactolipid // Abstracts of the 7th International Congress on Yersinia, Nijmegen, June 1416,1998, S 19 (P-17). (Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiologie, supplement II volume 6 June 1998).

56. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. Immunochemical identity of Yersinia pestis plasminogen activator/coagulase has been determined with the help of monoclonal antibodies // Ibid. - S. 22 (P-28).

57. Devdariani Z.L., Feodorova V.A. Protective antigen encoded by the LCR-plasmid of Yersinia pestis: isolation and characterization using monoclonal antibodies // Ibid. — S. 22

(P-31).

58. Джапаридзе М.Н., Палагин А.Ю., Громова О.В., Елисеев Ю.Ю., Белякова Н.И., Юшкова О.Д., Федорова В А. Культивирование штамма Vibrio cholerae 0139 се-ровара как продуцента для конструирования оральной холерной химической вакцины // Деп. в ВИНИТИ 26.10.98 № 3096-В98.

59. Федорова В.А., Девдариани ЗЛ., Терешкина Н.Е., Ермаков Н.М. Перспективы создания антиидиотипических вакцин против чумы // Матер, российско-французск. конф. памяти Луи Пастера. - Санкт-Петербург, 1998. - С. 53-54.

60. Федорова В .А., Девдариани ЗЛ. Изучение антигенных детерминантов липо-полисахарида Yersinia pestis с помощью моноклональных антител // Молекул, генетика, микробиология и вирусол. - 1998. - № 3. - С. 22-26.

61. Федорова В А., Громова. О.В., Девдариани ЗЛ. Иммуноферментная тест-система для детекции Vibrio cholerae 0139 серовара // Журн. микробиол. - 1998. -№5. -С. 77-80.

62. Дсвдариани З.Л., Федорова В.А., Ермаков Н.М., Терешкина Н.Е., Сырова НА., Грашкин В.А. Перспектива использования линейных мышей для производства диагностических иммуноглобулиновых препаратов // Матер, юбилейн. научн. конф., поев. 70-летию НИИ микробиологии МО РФ "Диагн., лечение и профилакт. опасных инф. заболеваний. Биотехнология. Ветеринария." - Киров, 1998. — С. 81-82.

63. Джапаридзе М.Н., Палагин А.Ю., Громова О.В., Елисеев Ю.Ю., Белякова Н.И., Клокова О.Д., Федорова В.А. Глубинное культивирование штамма Vibrio chol-erae 0139 серовара для включения его в состав оральной холерной химической вакцины // Там же. - С. 297-298.

64. Федорова В.А., Терешкина Н.Е., Громова О.В., Сырова Н.А., Девдариани» ЗЛ., Ермаков Н.М., Белякова Н.И., Доброва Г.В., Елисеев Ю.Ю., Джапаридзе М.Н. Новые методы контроля синтеза иммуногенов при производстве химической вакцины против холеры, вызванной Vibrio cholerae 0139 // Биотехнология. - 1999. - № 2. -С. 82-88.

65. Feodorova V.A., Devdariani Z.L., Nazarova L.S. Adjuvant properties of the anti-idiotypic antibodies against Yersiniapestis lipopolysaccharide // Journal of Medical Microbiology. - 1999. - Vol. 48. - № 8. - P. 751-756.

66. Федорова В.А., Девдариани ЗЛ. Характеристика фибринолизина чумного микроба с помощью моноклональных антител // Молекул, генетика, микробиология и вирусол. - 1999. - № 3. - С. 21-26.

67. Девдариани 3 Л., Аленкина Т.В., Федорова В.А. Экспресс-диагностика токси-генных штаммов Vibrio cholerae в дот-иммуноанализе с помощью моноклональных антител // Клинич. лаб. диагностика. -1999. - № 8. - С. 24-32.

68. Федорова В.А., Девдариани ЗЛ. Моноклональные антитела к V антигену Yersinia pestis II Chinese journal of control of endemic diseases. - 1999. - Vol. 14. -P. 182-183.

69. Федорова В.А., Бобров А.Г., Девдариани ЗЛ., Солодовников Н.С., Исляева М.Н. Капсульный антиген (фракция 1) чумного микроба у дефектных по гену caflM штаммов локализован внутриклеточно // Ibid. - Р. 180-181.

70. Наумов А.В., Джапаридзе М.Н., Громова О.В., Захарова Т.Л., Кузьмиченко И.А., Киреев М.Н., Полунина Т.А., Дятлов ИА., Девдариани ЗЛ., Федорова В.А., Смирнова Н.И., Ливанова Л.Ф., Космоенко О.М. Биохимическое и иммунохимиче-

ское изучение антигенов и факторов патогенности возбудителей чумы и холеры как основа конструирования современных профилактических и диагностических препаратов // Холера и патогенные для человека вибрионы. - Ростов н/Дону, 2000. -Vol. 13.-Р. 107-108.

71. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. Development, characterisation and diagnostic application of monoclonal antibodies against Yersinia pestis fibrinolysin and coagulase // Journal of Medical Microbiology. - 2000. - Vol. 49. - № 3. - P. 261-269.

72. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. Immunogeneity and structural organisation of some pLCR-coded proteins of Yersinia pestis II Ibid. - 2001. - Vol. 50. - № 1. - P. 13-22.

73. Feodorova V.A., Gromova O.V., Devdariani Z.L., Dzhaparidze M.N., Teryoshkina N.Y. Immunochemical characterisation of Vibrio cholerae 0139 О antigens and production of a diagnostic antiserum without absorption // Ibid. - № 6. - P. 499-508.

74. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. New genes involved in Yersinia pestis fraction I biosynthesis // Ibid. - № 11. - P. 969-978.

75. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. Expression of acid-stable proteins and modified lipopolysaccharide of Yersinia pestis in acidic growth medium // Ibid. - P. 979-985.

76. Федорова В.А., Девдариани ЗЛ. Изучение продуктов белковой и углеводной; природы, синтезируемых Yersinia pestis в условиях, имитирующих внутреннюю среду фаголизосом млекопитающих // Молекул, генетика, микробиология и вирусология. -2001.-№4.-С. 22-27.

77. Федорова В Л., Девдариани ЗЛ. Иммунохимическая характеристика Фракции I штаммов Yersinia pestis, дефектных по гену caflMII Там же. - 2002. - № 1. -С.11-17.

78. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. Characterization of Yersinia pestis lipopolysac-charide using monoclonal antibodies // Abstract in 8* International Symposium on Yersinia, September, 4-8,2002, Turku, Finland. - P-43.

Сдано в набор 16.10.03 г. Подписано к печати 16.10.03 г. Формат 84 х 108 1/16. Печать лазерная. Объем 2,0 усл. п. л. Тираж 100 экз.

Отпечатано на полиграфическом оборудовании РосНИПЧИ "Микроб" Минздрава РФ 410000S, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

€'2958

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Федорова, Валентина Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 1. Материалы и методы.

1.1. Штаммы микроорганизмов.

1.2. Антигены.

1.3. Клеточные линии.

1.4. Культуральные среды.

1.5. Реактивы и буферные растворы.

1.6. Оборудование и приборы.

1.7. Методы иммуноанализа.

1.8. Лабораторные животные.

1.9. Статистические методы.

Глава 2. Иммунохимическая характеристика капсульных антигенов

Y.peslis и V.cholerae 0139.

2.1. Изучение природы антигенных детерминантов, определяющих серологическую активность

Ф1 чумного микроба.

2.2. Иммунореактивность капсульного антигена штаммов

Y.peslis, дефектных по гену cqflM.

2.3. Иммунобиологические свойства капсульного антигена

V.cholerae 0139 серовара.

2.4. Обсуждение результатов.

Глава 3. Особенности антигенной структуры углеводных компонентов чумного микроба и холерного вибриона 0139 сероварианта.

3.1. Изучение особенностей экспрессии антигенных детерминантов ЛПС у штаммов Y.peslis с разным плазмидным профилем.

3.2. Выявление антигенных детерминантов ЛПС, липида А и ОСА чумного микроба с помощью полии моноклональных антител.

3.3. Иммунохимическая характеристика ЛПС V.cholerae 0139 и диагностическая значимость полученных к нему антител.

3.4. Обсуждение результатов.

Глава 4. Изучение иммуногенности и специфичности белков, кодируемых pCad чумного микроба.

4.1. Определение спектра полипептидов, детерминируемых pCad возбудителя чумы, в условиях их максимальной экспрессии.

4.2. Сравнительное изучение иммуногенных свойств отдельных антигенов белковой природы, кодируемых pCad Y.pestis.

4.3. Получение и характеристика моноклональных антител к белкам, экспрессируемым pCad чумного микроба.

4.4. Аффинная очистка и иммунохимическая характеристика некоторых белков, кодируемых pCad Y.pestis.

4.5.' Обсуждение результатов.

Глава 5. Иммунохимическая характеристика фибринолизина Y.pestis с помощью панели моноклональных антител.

5.1. Получение и характеристика антителопродуцирующих гибридом.

5.2. Функциональные и иммунохимические свойства МКА, направленных к различным антигенным детерминантам фибринолизина Y.pestis.

5.3. Конструирование экспериментальных диагностических тест-систем (ТИФА и МФА) для выявления и дифференциации штаммов чумного микроба независимо от температуры их культивирования.

5.4. Обсуждение результатов.

Глава 6. Получение и прикладное значение антиидиотипических антител к антигенам возбудителя чумы.

6.1. Стратегия иммунизации и выбор лабораторных животных для индукции антиидиотипических антител против антигенов чумного микроба.

6.2. Критерии установления вида антиидиотипических антител.

6.2.1. Иммунохимический критерий.

6.2.2. Иммунологический критерий.

6.2.3. Функциональный критерий.

6.3. Экспериментальное обоснование возможности применения антиидиотипических антител для разработки противочумных вакцин нового поколения.

6.4. Экспериментальные иммуноглобулиновые тест-системы на основе антиидиотипических антител как аналоги антигенных диагностических препаратов.

6.5. Обсуждение результатов.

Глава 7. Перспектива использования мышиных поли- и моноклональных антител для разработки диагностических тест-систем.

7.1. Панель моноклональных антител для лабораторной диагностики чумы и определения полипептидов, кодируемых плазмидами чумного микроба.

7.2. Оптимизация условий получения поликлональных моноспецифических иммуноглобулинов к антигенам возбудителей чумы и холеры.

7.3. Обсуждение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры с использованием поли- и моноклональных антител"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Крупные вспышки чумы, регистрируемые в течение последних лет в Танзании (1991 г.), Заире (1993 г.) и Индии (1994), появление нового, эпидемически опасного штамма Vibrio cholerae 0139 серовара, вызывающего массовую заболеваемость с высокой летальностью (180, 295-297, 317, 371-374, 402-404, 438, 447, 457-459, 462, 475, 476, 502, 516, 517, 569, 574, 610, 611, 642), диктуют актуальность проведения научных исследований по совершенствованию диагностических и профилактических препаратов, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию этих инфекций.

В свою очередь конструирование высокочувствительных диагностических тест-систем и разработка эффективных химических вакцин невозможны без новых современных знаний об антигенах Yersinia peslis и V. cholerae 0139, имеющих ряд сходных признаков по структурной организации клетки (наличие капсулы и R-форма ЛПС) (19, 97, 180, 230, 281, 474, 476, 555 и др.).

Несмотря на огромные достижения отечественных и зарубежных ученых в молекулярной микробиологии и биохимии чумного микроба и холерного вибриона, иммунохимические свойства многих известных антигенов изучались в малочувствительных по современным представлениям серологических реакциях и опосредованно с помощью рекомбинантных штаммов, что позволяет лишь косвенно судить о биологических функциях полипептидов или полисахаридов в естественных природных условиях, поскольку наличие того или иного гена не всегда коррелирует с проявлением экспрессируемого им признака in vivo.

С появлением гибридомной технологии и новых эффективных методов им-мунохимического анализа стало возможным изучение структурных особенностей антигенов полипептидной и углеводной природы на молекулярном уровне (1, 6, 9, 14, 86, 137, 138, 141, 166, 198, 199, 208, 211, 219, 220, 276, 392, 399, 420, 425, 581). В первую очередь это касается такого сложноорганизованного антигена, как Ф1. В частности, остаются не до конца выяснены вопросы о связи его серологической активности с конкретными антигенными компонентами, особенности фолдинга белка Ф1 у штаммов Y.peslis с Fra± фенотипом, причины кроссреактивности.полученных к нему сывороток.

Другим, имеющим диагностическую значимость, видоспецифическим антигеном чумного микроба является фибринолизин (активатор плазминогена, Fib), синтез которого детерминируется уникальной для возбудителя чумы плазмидой пестициногенности. Проявление чумным микробом фибринолитической активности, как правило, коррелирует со способностью Y.peslis к коагуляции плазмы (73, 99, 100, 130, 135, 136, 163, 187, 205, 255, 280, 293, 311, 343, 390, 514, 522, 624, 625, 632, 647), а участвующие в реализации данного процесса антигены - Fib и коагулаза (Coag) охарактеризованны как полипептиды с м.м. 37 и 35 кД, соответственно (43, 44, 182, 205, 255, 278, 356, 522, 632). Однако несмотря на значительное количество научных разработок, до сих пор не установлено, один или оба белка определяют фибринолитическую и коагулазную активности возбудителя чумы (43, 163, 182, 187, 205, 255, 278, 280, 293, 311, 390, 591, 592, 624, 626).

Широко используемая в лабораторной диагностике серологическая дифференциация бактерий по антигенной структуре ЛПС (122, 143-145, 200, 292, 388, 449, 450-452, 466, 510-514, 575, 576 и др.), а также данные о способности моно-клональных антител (МКА) к липополисахариду (ЛПС) Y.peslis выявлять все штаммы чумного микроба независимо от наличия или отсутствия собственных плазмид и температуры культивирования (69, 86) предопределяют актуальность, теоретическую и практическую значимость исследований по определению с помощью современных информативных методов иммунохимического анализа ро-до- и видоспецифических антигенных детерминантов ЛПС, а также изучению антигенной структуры входящего в его состав липида А и другого полисахарид-содержащего препарата чумного микроба - ОСА.

Как известно, ведущую роль в проявлении чумным микробом вирулентных свойств большинство исследователей связывает с наличием в его геноме плаз-миды Са2+-зависимости, детерминирующей синтез ряда продуктов, в частности, белков наружной мембраны (70, 121, 152, 153, 165, 167, 168, 193, 306, 312, 322, 326-329, 338, 340, 341, 346, 350, 351, 355, 365, 380-382, 405-411, 413, 432, 444, 460, 498, 533, 544, 555, 557, 562, 617, 630, 632, 638, 681, 682 и др.), часть из которых обладает протективными свойствами (108, 193, 299, 342, 348, 350, 443, 488, 501, 537, 539, 640, 660 и др.). Несмотря на огромный интерес исследователей к ним, сравнительное изучение иммуногенных свойств отдельных антигенов проводилось косвенно на модели псевдотуберкулезного микроба с клонированными генами в связи с трудностями выделения антигенов в чистом виде (121, 193, 285, 345, 346, 591, 592, 626, 627). К тому же, даже при щадящих методах экстракции, изолированные из цельного микроорганизма антигены могут полностью или частично утрачивать свои нативные свойства.

Для преодоления этих препятствий в настоящее время весьма перспективно применение антиидиотипических антител (АИТ), сохраняющих функциональную, серологическую и иммунобиологическую активности исходного антигена и позволяющих проводить изучение его свойств в условиях, максимально приближенных к естественному состоянию in vivo (188, 208, 219, 298, 303, 319, 330, 331, 337, 347, 358, 361, 379, 384, 397, 400, 407, 436, 463, 468, 469, 485, 559, 567). Не менее актуальна разработка на их основе экспериментальных антиидиотипических вакцин (361, 362, 383, 406, 437, 478, 580, 588, 597, 643, 673).

Поскольку капсульные антигены (К-антигены) большинства грамотрицатель-ных бактерий обладают выраженными протективными свойствами и высокой специфичностью (14, 113-115, 129, 273, 399, 465, 474, 510, 615), представляет несомненный интерес выделить К-антиген из V.cholerae 0139 серовара и изучить его иммунохимические и иммунобиологические свойства. Сведения о неэффективности существующих холерных вакцин против V.cholerae 0139 (371-374, 403, 404, 438, 447, 457, 458, 462, 475, 476, 502, 541, 569, 574, 604, 662) придают особую важность исследованиям в этом направлении.

Не менее актуальными являются исследования по изучению структурной организации Л ПС V.cholerae 0139, выявлению различий в иммунореактивности этого антигена у исходных и диссоциированных вариантов вибрионов со сниженной вирулентностью, а также попытки экспериментально обоснованного получения моноспецифических неадсорбированных антител, пригодных для разработки экспресс-методов индикации возбудителя холеры 0139.

ЦЕЛЬЮ ИССЛЕДОВАНИЯ является получение новых сведений об антигенной структуре возбудителей чумы и холеры с помощью современных методов иммунохимического анализа с применением поликлональных, монокло-нальных и антиидиотипических антител, а также экспериментальное обоснование возможности их практического применения.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Получить панель МКА для изучения антигенной структуры возбудителя чумы и разработки на их основе экспериментальных диагностических тест-систем нового поколения.

2. Изучить природу антигенных детерминантов, определяющих серологическую активность Ф1 чумного микроба, особенности фолдинга белкового компонента капсулы у штаммов Y.peslis с Fra± фенотипом с использованием современных методов иммунохимического анализа и разработать методические подходы для их выявления.

3. Определить общие и специфические эпитопы углеводсодержащих антигенов возбудителя чумы (ЛПС и ОСА) с использованием набора поли- и монокло-нальньгх антител.

4. С помощью панели МКА изучить иммунохимические особенности фибри-нолизина Y.pestis и возможности использования моноклональных иммуноглобулинов в иммунофлуоресцентном и иммуноферментном анализах для детекции штаммов чумного микроба, содержащих pPst.

5. Определить спектр полипептидов, детерминируемых pCad Y.pestis, у возбудителя чумы, выращенного в условиях их максимальной экспрессии. Получить панель поли- и моноклональных антител к белкам, кодируемым pCad чумного микроба, провести сравнительное изучение иммуногенных свойств и диагностической значимости отдельных антигенов с помощью методов иммунохимического анализа.

6. Получить антиидиотипические антитела к отдельным антигенам чумного микроба и экспериментально обосновать перспективу их применения для разработки профилактических и диагностических медицинских иммунобиологических препаратов.

7. Определить видо-, биоваро- и серовароспецифические полипептиды путем сравнения электрофоретических профилей клеточных лизатов V.cholerae 01 и не 01 серогрупп (в частности, V.cholerae 0139), по наличию или отсутствию которых возможно проведение дифференциации штаммов холерных вибрионов на этапах идентификации выделенных культур.

8. Изучить иммунохимические свойства липополисахаридов, экстрагированных из холерного вибриона 0139 серовара различными методами, и получить моноспецифические неадсорбированные поликлональные антитела, пригодные для его обнаружения в иммуноферментном анализе.

9. Разработать на основе антикапсульных антител к V.cholerae 0139 методический подход, позволяющий дифференцировать вирулентные и слабовирулентные штаммы этого возбудителя. Изучить протективные свойства К-антигена и обосновать принципиальную возможность его использования в качестве потенциального компонента холерной вакцины.

10. Разработать принципы гибкой технологии изготовления как моно-, так и поликлональных иммуноглобулиновых диагностических препаратов и тест-систем с использованием в качестве продуцентов специфического сырья линейных мышей BALB/c.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Впервые с использованием гибридомной технологии и оригинальных методов скрининга антителопродуцирующих гибридом получена уникальная панель моноклональных антител для изучения антигенов возбудителя чумы, кодируемых как хромосомными, так и плазмидными генами.

С помощью антител различной специфичности и современных методов им-мунохимического анализа установлены гликопептидная природа и конформаци-онная зависимость антигенного детерминанта, определяющего серологическую активность капсульного антигена чумного микроба. Новыми являются сведения о способности углеводного компонента Ф1 чумного микроба вызывать продукцию антител у лабораторных животных.

Представлены экспериментальные доказательства роли CaflM в доставке Cafl на клеточную поверхность Y.pestis, но не в процессе фолдинга мономеров Ф1.

Новыми являются установленные с помощью высокочувствительных вариантов иммуноферментного анализа и иммуноблота, основанных на использовании поли-и моноклональных антител, сведения о наличии у полисахарида кора ЛПС чумного микроба как специфических для коровой части антигенных детерминантов, так и общих с липидом А и ОСА эпитопов.

Впервые обнаружены и изучены иммунобиологические свойства у ряда ранее не описанных белков, кодируемых pCad, чумного микроба при культивировании в условиях их максимальной экспрессии. Получена панель гибридом-продуцентов МКА с различной специфической активностью, направленных к отдельным антигенным детерминантам белков, детерминируемых указанной плазмидой Y.pestis. С их помощью подтверждена устойчивость V антигена к протеолитической деградации под влиянием фибринолизина, а также наличие у белков с м.м. 25±2, 54+2, 72±2 и 87±2 кД кросс-реактивных эпитопов. Доказано существование YopE в виде сложноорганизованного антигена, состоящего из нескольких суб"единиц белковой природы со сходными иммунобиологическими свойствами свойствами.

Впервые с использованием сложной оригинальной системы скрининга гибридом, основанной на функциональных и антигенных свойствах фибринолизина чумного микроба, получена панель МКА различной специфичности, с помощью которых доказана иммунохимическая идентичность фибринолизина и коагулазы Y.pestis.

Экспериментально на модели возбудителя чумы подтверждена теория идиотипических сетей N. Jerne (1974). Впервые получены и охарактеризованы по им иммунохимическому, иммунологическому и функциональному критериям антиидиотипические антитела к отдельным антигенам чумного микроба. Установлено, что АИТ к ЛПС Y.pestis имеют выраженный ад"ювантный эффект без токсических проявлений у иммунизированных животных, характерных для исходного препарата, а АИТ к белкам, кодируемым pCad, с м.м. 25±2, 87+2 кД и YopE обладают высокой специфической иммуногенностью, сопоставимой с уровнем протективной активности соответствующих полипептидов. Показана перспективность использования АИТ не только в роли эффективного инструмента изучения антигенной структуры бактерий, но и в качестве основных специфических компонентов для разработки экспериментальных диагностических и профилактических иммунобиологических препаратов.

Впервые для выделения К-антигена из капсулообразующего нового эпидемически значимого 0139 серовара холерного вибриона использован метод, эффективный при экстракции капсульной субстанции из культуральной жидкости биомассы чумного микроба (Вейнблат с соавт., 1980), который позволил обнаружить в капсульном веществе V.cholerae 0139 наряду с ЛПС два иммунореактивных полипептида с м.м. 38+2 и 61+2 кД. При этом установлено, что протективные свойства К-антигена не связаны с его белковым компонентом, а обусловлены капсульным липополисахаридом. Иммуногенность последнего по отношению к гомологичному серовару избирательна в отличие от ЛПС, выделенного из биомассы клеток V.cholerae 0139, обладающего одинаковой протективной активностью как при заражении возбудителем холеры Эльтор, так и V.cholerae 0139.

Научно обоснована и экспериментально подтверждена эффективность разработанного нами методического подхода по получению препаративного количества мышиных моноспецифических поликлональных антител к ЛПС V.cholerae 0139, не нуждающихся в дополнительной адсорбции близкородственными по антигенной структуре гетерологичными микроорганизмами. Благодаря использованию оригинального способа экстракции получены новые данные о выраженных антигенных свойствах липида A V.cholerae 0139 и изучена специфичность полученных к нему антител. Впервые идентифицированы видо-, биоваро- и серовароспецифические полипептиды холерного вибриона при сравнительном изучении электрофоретических профилей различных представителей рода Vibrio.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Получен оригинальный набор линий лим-фоидных гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к белковым и углеводсодержащим антигенам Y.peslis. Эти антитела могут быть использованы для конструирования диагностических тест-систем, а также изучения иммуно- и патогенеза чумной инфекции.

Предложено несколько методических подходов для индикации и идентификации штаммов чумного микроба с Fra± фенотипом, не требующих разработки специальных диагностических препаратов для обнаружения так называемой «атипичной» капсулы («атипичного» капсульного антигена): 1. Разрушение идентифицируемых клеток Y.peslis лизирующим буфером с последующим определением Ф1 соответствующими коммерческими диагностическими препаратами; 2. Использование для индикации иммуноферментных тест-систем, основой которых являются МКА к другому видоспецифическому антигену - фибриноли-зину/плазмокоагулазе; 3. Применение для обнаружения таких штаммов моно-клональных флуоресцирующих иммуноглобулинов к ЛПС чумного микроба или аналогичной иммуноферментной тест-системы.

Подтверждена более высокая серологическая активность и специфичность капсульного антигена чумного микроба, выделенного из культуральной жидкости методами В.И. Вейнблата с соавт. (1980) и Л.Н. Сердобинцева с соавт. (1983) в сравнении с традиционным способом его экстракции из клеточной биомассы Y.peslis по Е. Baker et al. (1952), который по настоящее время используется в технологии получения соответствующих чумньгх гипериммунных сывороток.

Впервые на основе моноклональных антител к видоспецифическому антигену фибринолизину/коагулазе чумного микроба разработаны и успешно испытаны в лабораторных условиях экспериментальные диагностические флуоресцирующие иммуноглобулины и иммуноферментная тест-система, способные выявлять штаммы Y.peslis, содержащие плазмиду пестициногенности, независимо от температуры культивирования бактерий и не дающие положительных реакций с ге-терологичными микроорганизмами, в том числе другими патогенными иерси-ниями.

С использованием моноклональных иммуноглобулинов к антигенным детерминантам ЛПС Y.pestis, кодируемого хромосомными генами (Девдариани, 1993), сконструирован сэндвич-вариант иммуноферментного анализа для обнаружения типичных и атипичных штаммов возбудителя чумы независимо от отсутствия или наличия в них собственных плазмид. Апробация указанного варианта ТИФА на большом наборе природных и генноинженерных штаммов возбудителя чумы свидетельствует о высокой практической значимости антилипополисахаридных МКА, как универсальных диагностических реагентов с широким диапазоном действия, несмотря на перекрестную реактивность только с отдельными представителями вида Y.pseudotuberculosis.

Обнаружен ряд новых полипептидов, кодируемых pCad чумного микроба, обладающих не только антигенными, но и достаточно выраженными защитными свойствами, которые, в дополнение к протективному белку YopE, могут быть использованы при создании чумных химических вакцин.

Разработана стратегия иммунизации лабораторных животных для индукции антиидиотипических антител к антигенам чумного микроба. Доказана принципиальная возможность применения антиидиотипических антител для создания противочумных вакцин нового поколения, не содержащих материала патогена и обладающих выраженными превентивными свойствами. Экспериментально обосновано новое перспективное научно-практическое направление в конструировании медицинских иммунобиологических препаратов с использованием антиидиотипических антител как аналогов диагностически значимых антигенов.

Установлена достоверно более высокая протективная активность К-антигена в сравнении с ЛПС V.cholerae 0139 при заражении аутбредных мышей гомологичным серовариантом. Полученные результаты позволяют рекомендовать первый из названных антигенов для создания химической вакцины против заболеваний, вызываемых V.cholerae 0139.

Предложен способ дифференциации вирулентных и слабовирулентных штаммов V.cholerae 0139, основанный на разной степени активности меченных пероксидазой антикапсульных антител при постановке иммуноферментного анализа с капсулированными (мутные колонии) и лишенными капсулы (прозрачные колонии) штаммами V.cholerae 0139.

С помощью иммунохимических методов анализа доказана серологическая идентичность энтеротоксинов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп. Эти данные имеют практическое значение при разработке универсальной химической вакцины против холеры, обязательным компонентом которой является специфический анатоксин.

Впервые в практике создания диагностических сывоторок получены с использованием биохимически очищенных антигенов и линейных мышей BALB/c неадсорбированные поликлональные антитела к ЛПС и К-антигену холерного вибриона 0139 серовара, не дающие перекрестных серологических реакций с гетерологичными микроорганизмами и вибрионами других серогрупп в сэндвич-варианте иммуноферментного анализа.

Разработаны принципы гибкой технологии изготовления иммуноглобулиновых диагностических препаратов и тест-систем с использованием в качестве продуцентов специфического сырья линейных мышей BALB/c.

По результатам проведенных исследований разработаны и утверждены:

- Программа комиссионного испытания иммуноглобулинов диагностических чумных флуоресцирующих к липополисахариду чумного микроба (Утверждена директором ВНИПЧИ "Микроб" 22.05.90 г.;

- Регламент производства "Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие чумные антикапсульные моноклональные сухие" № 11-86(90);

- Инструкция по изготовлению и контролю иммуноглобулинов диагностических моноклональных флуоресцирующих сухих к липополисахариду чумного микроба (Утверждена директором ВНИПЧИ "Микроб", протокол № 21 от 2.11.90 г.);

- Инструкция по применению иммуноглобулинов диагностических моноклональных флуоресцирующих сухих к липополисахариду чумного микроба (Утверждена директором ВНИПЧИ «Микроб», протокол № 21 от 2.11.90 г.);

- Методические рекомендации по обнаружению типичных и атипичных штаммов чумного микроба в иммуноферментном анализе (Утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб», протокол № 3 от 4.03.94 г.);

- Методические рекомендации по определению в дот-иммуноанализе содержания капсульного антигена и липополисахарида Vibrio cholerae 0139 серовара на этапах экспериментального производства химической холерной вакцины (Утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб», протокол № 5 от 20.06.97 г.); -Методические рекомендации по обнаружению штаммов Vibrio cholerae 0139 серовара в иммуноферментном анализе (Утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб», протокол № 6 от 10.10.97 г.);

- Штамм гибридных клеток Yp.LPS.A6.Sp, продуцирующих моноклональные антитела к ЛПС Y.pestis, депонирован в Российской коллекции клеточных культур в институте цитологии РАМН (г. Санкт-Петербург) 04.12.89 г. под номером ВСКК(П) 426Д;

- Усовершенствованные методические приемы по гибридомной технологии включены в соответствующий раздел методического пособия для врачей и биологов «Методические приемы при работе с возбудителями инфекционных болезней бактериальной природы I-I1 групп патогенности», которое утверждено пленумом Межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ 31.10.2001 г;

- Теоретические и практические результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, используются при чтении лекций по иммунологии чумы и холеры и лабораторной диагностике инфекционных заболеваний на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей по бактериологии, иммунологии и эпидемиологии при РосНИПЧИ «Микроб» с 1989 г. по настоящее время.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Антигенные детерминанты, определяющие серологическую активность (специфичность) капсульного антигена чумного микроба, имеют гликопептидную природу.

2. Идентификацию возбудителя чумы с Fra± фенотипом можно проводить коммерческими чумными антикапсульными диагностическими иммуноглобулиновыми препаратами после разрушения клеток лизирующим буфером или с использованием диагностических тест-систем на основе МКА к фибринолизину или ЛПС чумного микроба.

3. Полисахарид кора чумного микроба имеет как специфические антигенные детерминанты, так и общие для коровой части, липида А и ОСА эпитопы. Экспериментальная иммуноферментная тест-система на основе МКА к ЛПС Y.pestis является эффективным диагностическим реагентом для обнаружения и идентификации возбудителя чумы независимо от наличия и присутствия собственных плазмид.

4. Фибринолизин и плазмокоагулаза чумного микроба являются иммунохимически идентичными белковыми субстанциями с двумя независимыми ферментативными активностями.

5. При культивировании чумного микроба в условиях максимальной экспрессии белков, кодируемых pCad, синтезируются более 30 полипептидов, в том числе антигены с м.м. 25±2, 54+2, 72±2 и 87+2 кД, иммунизация которыми защищает от экспериментальной чумы 37-60% белых мышей. YopE - сложноорганизованный антиген, состоящий из нескольких суб"единиц белковой природы, имеющих сходные иммунобиологические свойства.

6. Полученные антиидиотипические антитела к ЛПС и некоторым белкам, детерминируемым pCad Y.pestis, могут служить эффективным инструментом при изучении антигенной структуры чумных бактерий и разработке профилактических и диагностических иммуноглобулиновых препаратов.

7. Капсульный антиген V.cholerae 0139, выделенный с использованием биохимического метода экстракции капсульного вещества, помимо липополисаха-рида, содержит два полипептида с м.м. 38±2 и 61+2 кД. Протективная активность К-антигена избирательна, а ЛПС, полученный из клеточной массы, защищает животных в равной степени как от заражения гомологичным сероваром, так и от V.cholerae Эльтор.

8. Поликлональные антитела, выделенные из асцитической жидкости линейных мышей BALB/c, иммунизированных биохимически очищенными препаратами ЛПС и К-антигена V.cholerae 0139, не нуждаются в дополнительной адсорбции гетерологичными микроорганизмами и специфически реагируют в им-муноферментном анализе только с холерными вибрионами 0139 серовара.

9. Технология изготовления иммуноглобулиновых диагностических тест-систем с использованием в качестве биологического сырья линейных мышей -перспективное направление в производстве медицинских иммунобиологических препаратов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены на:

- Всесоюзной научно-практической конференции «Иерсиниозы: (Микробиол.,эпидемиол., клиника, патогенез, лаб. диагностика)», Владивосток, 1989;

- Рабочем совещании «Состояние проблемы и перспективы развития диагн. бак-тер. инф.», Оболенск, 1990;

- Международной конференции «Лабораторные животные для медикобиологических исследований», Москва, 1990; -1 съезде иммунологов России, Новосибирск, 1992;

- Российской научной конференции «Иммунол. и специф профилакт. особо опасн. инф.», Саратов, 1993;

- Межгосударственной научной конференции «Профилактика и меры борьбы с чумой», посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы, Алма-Ата, 1994;

- Межгосударственной научно-практической конференции "Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний", Ставрополь, 1994;

- Научной конференции "Актуальные вопросы особо опасных инфекций", Новороссийск, 1994;

- Научно-практической конференции, посвященной 60-летию противочумной службы на Кавказе, Ставрополь, 1995;

- Научной конференции "Актуальные вопросы современной медицины", Бишкек, 1996;

- Международной конференции Академии Естествознания "Гомеостаз и инфекционный процесс", Саратов, 1996;

- Научной конференции "Эколого-эпидемиологический надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии", Астрахань, 1996;

- Научной конференции "Эпидемиология и клинико-иммунологические аспекты профилактики важнейших инфекционных заболеваний", Астрахань, 1996;

- VII с"езде всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 1997;

- II с"езде биохимического общества Российской академии наук, Москва, 1997;

- 4-ой Международной конференции молодых ученых и студентов, Бишкек, Кыргызстан, 1997;

- Научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования Противочумной службы России, Саратов, 1997;

- Международной конференции Академии Естествознания "Гомеостаз и инфекционный процесс", Саратов, 1998;

- 7 Интернациональном конгрессе по Иерсиниям, Нидерланды, 1998.

- 8 Интернацинальном симпозиуме по Иерсиниям, Финляндия, 2002. ПУБЛИКАЦИИ. Материалы диссертации изложены в 78 опубликованных научных работах, из них 31 статья (22 - в отечественной печати и 9 - за рубежом) и 47 тезисов докладов.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация изложена на 338 страницах и состоит из введения, собственных исследований (7 глав), заключения, выводов и списка литературы, включающего 695 источников, из них зарубежных -402. Диссертация иллюстрирована 42 рисунками и 45 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Федорова, Валентина Анатольевна

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые методические подходы для изучения антигенной структуры возбудителей чумы и холеры с использованием гибридомной биотехнологии и экспериментально обоснована перспектива их применения для создания диагностических и профилактических препаратов.

2. С помощью современных методов иммунохимического анализа (различных вариантов ТИФА и иммуноблоттинга) установлены гликопептидная природа и конформационная зависимость антигенного детерминанта, определяющего серологическую активность капсульного антигена чумного микроба. Показана способность углеводного компонента Ф1 индуцировать выработку антител у лабораторных животных.

3. Экспериментально доказана внутриклеточная локализация капсульного антигена у штаммов чумного микроба с Fra± фенотипом, подтверждающая исключительную роль CaflM Y.pestis в транспортировке мономера Ф1 из периплазма-тического пространства на поверхность микробной клетки. Предложено несколько методических приемов для обнаружения и идентификации указанных штаммов, не требующих создания специальных диагностических препаратов для выявления так называемой "атипичной" капсулы: 1. Разрушение идентифицируемых клеток Y.pestis лизирующим буфером с последующим определением Ф1 соответствующими коммерческими диагностическими препаратами; 2. Использование для индикации иммуноферментных тест-систем, основой которых являются МКА к другому видоспецифическому антигену возбудителя чумы - фиб-ринолизину/плазмокоагулазе; 3. Применение для обнаружения таких штаммов моноклональных флуоресцирующих иммуноглобулинов к ЛПС чумного микроба или аналогичной иммуноферментной тест-системы.

4. У R-гликолипида чумного микроба при использовании панели разноэпи-топных МКА обнаружено не менее шести различных серологически активных антигенных детерминантов. Установлено, что галактоза, фукоза и манноза содержат родоспецифические эпитопы, N-глюкозамин, глюкоза, рибоза, ксилоза и К ДО — общие для Y.pestis и Y.pseudotuberculosis антигенные детерминанты, a N-глюкозамин, глюкоза, манноза, ксилоза и КДО - специфические эпитопы для возбудителя чумы. На основе гомологичных антител сконструированы экспериментальные диагностические тест-системы, способные выявлять штаммы Y.pestis независимо от состава собственных плазмид, в том числе бесплазмидные варианты. Впервые получены данные о присутствии общих эпитопов у коровой части ЛПС, липида А и основного соматического антигена.

5. С помощью панели МКА установлена иммунохимическая идентичность фибринолизина и коагулазы Y.pestis. Разработаны видоспецифичные экспериментальные флуоресцирующие моноклональные иммуноглобулины и моноклональные иммуноферментные коъюгаты для обнаружения бактерий Y.pestis, несущих pPst, независимо от температуры их культивирования и наличия или отсутствия других собственных плазмид.

6. Изучены специфические и протективные свойства 35 белков, кодируемых pCad чумного микроба, включая ранее не описанные новые полипептиды. Получена панель моноклональных антител к отдельным антигенным детерминантам этих субстанций, в том числе, V антигену и белкам с м.м. 25±2, 27+2, 54+2, 72+2 и 87+2 кД, благодаря использованию которых представлены данные об их возможной структурной организации. Доказано существование YopE в виде сложноорганизованного антигена, состоящего из нескольких белковых суб"единиц с идентичными свойствами, наиболее важными из которых являются высокая иммуногенность и отсутствие деградации под действием фибринолизина. Установлена способность белков с м.м. 25+2 и 72+2 кД защищать от экспериментальной чумы 50-60% иммунизированных белых мышей.

7. Впервые получены и охарактеризованы по иммунохимическому, иммунологическому и функциональному критериям антиидиотипические антитела к липополисахариду и белкам с м.м. 25+2, 54+2, 72±2 и 87+2 кД, кодируемых pCad Y.pestis. Установлена выраженная ад"ювантная активность чумных АИТ к ЛПС, заключающаяся в 16-кратном увеличении титра антикапсульных антител у белых мышей при совместном введении с Ф1, отсутствие токсического эффекта при иммунизации лабораторных животных, а также возможность применения наряду с ЛПС и Ф1 для обнаружения в ТИФА противочумных антител в сыворотках иммунизированных животных и привитых живой чумной вакциной людей. Выявлено наличие у АИТ к указанным белкам адгезивных, лектинных и специфических серологических свойств, присущих исходным антигенам, а также способности АИТ к белкам с м.м. 25+2 и 87+2 кД защищать от экспериментальной чумы 60-78% иммунизированных мышей линии С57/В1. Показана перспективность использования полученных АИТ для изучения антигенной структуры бактерий и разработки профилактических и диагностических препаратов.

8. В К-антигене, экстрагированном из V.cholerae 0139 серовара по методу выделения капсульных субстанций помимо полисахаридсодержащего компонента обнаружены белки с м.м. 38+2 и 61+2 кД. Установлены более выраженные протективные свойства изолированной субстанции по сравнению с традиционно используемым О-антигеном. Получены специфические антикапсульные неад-сорбированные поликлональные антитела, эффективные для обнаружения в им-муноферментом анализе вибрионов указанного серовара и их дифференциации по степени вирулентности.

9. При сравнении в ПААГ-SDS цельно-клеточных лизатов холерных вибрионов 01 и не 01 серогрупп обнаружены антигены белковой природы, общие для рода Vibrio (м.м. 36+2, 45±2, 56+2, 62±2, 68+2 и 76+2 кД), а также белки, присутствующие в электрофоретических профилях представителей только классического (м.м. 28+2 и 80+2 кД) или Эльтор (м.м. 30+2 и 44±2 кД) биоваров, сероти-пов Инаба (м.м. 49+2, 50±2, 83+2, 93+2 и 98+2 кД) или Огава (м.м. 38+2 кД), 0139 (43+2 и 78+2 кД) или 022 (м.м. 15+2 и 20-23+2 кД) сероваров, соответственно.

10. Экспериментально обоснованы и сформулированы перспективные научные направления, имеющие важное прикладное значение для иммунодиагностики и профилактики чумы, холеры и других инфекций: создание антиидиотипических вакцин, лишенных материала патогена, обладающих иммунопротективными или адъювантными свойствами, не уступающими по эффективности соответствующим специфическим антигенам или антигенным комплексам; конструирование антигенных диагностических антиидиотипических препаратов, имеющих существенные преимущества в технологии изготовления и качестве конечной продукции перед аналогичными антигенными диагностикумами, основу которых составляют очищенные в той или иной степени антигены; создание диагностических иммуноглобулиновых препаратов с использованием моноспецифических поликлональных антител, не требующих дополнительной адсорбции гетерогенными микроорганизмами, полученных от иммунных мышей конкретной инбредной линии; применение экономически малозатратного гибкого биотехнологического метода получения стандартных мышиных моноспецифических поликлональных или (при необходимости переориентации производства) моноклональных иммуноглобулинов за счет сочетанного использования в качестве биопродуцентов инбредных мышей и миелом сингенных линий с содержанием в асцитической жидкости специфических антител, сопоставимых по концентрации и объему с кроличьими гипериммунными сыворотками.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Инфекционная иммунология переживает в настоящее время бурное развитие, в частности, благодаря успехам иммунохимии, а также появлению качественно новых методов и подходов к решению теоретических и практических проблем в этой области науки (115, 207, 465).

Гибридомная биотехнология, основанная на методах клеточной инженерии, обеспечила ученых уникальным тонким инструментом изучения антигенов микроорганизмов и даже их отдельных антигенных детерминантов на молекулярном уровне. Свидетельством тому являются результаты проведенных нами исследований, представленные в настоящей работе. Применение моноклональных антител для характеристики основных известных в настоящее время антигенов чумного микроба - Ф1, ЛПС, ОСА, Fib и V антигена позволило получить новые сведения об их иммунобиологических свойствах. Так, именно с помощью МКА удалось доказать гликопептидную природу детерминанта, ответственного за серологическую активность Ф1 Y.pestis, а также установить иммунохимическую гомогенность Fib и Coag и их существование в виде бифункционального белка, проявляющего два четко различающихся вида активности подобно некоторым другим белковым субстанциям грамотрицательных бактерий. Кроме того, применение панели МКА различной специфичности показало присутствие углеводного фрагмента в препарате Fib в виде примеси компонентов клеточной стенки, но не как полисахаридной субъединицы антигена. Использование набора разно-эпитопных МКА к ЛПС в современных иммунологических реакциях позволило впервые установить наличие у кора как специфических детерминантов, так и общих эпитопов с липидом А и основным соматическим антигеном. Тестирование природных штаммов Y.pestis с различным плазмидным составом в ТИФА с применением МКА позволило предположить отсутствие у них полной идентичности R-гликолипидов и продемонстрировало способность чумного микроба синтезировать по крайней мере два наиболее консервативных детерминанта, которые встречаются практически у всех использованных в работе штаммов Y.pestis.

Еще более интересные сведения были получены при изучении с помощью соответствующих МКА некоторых продуктов pCad возбудителя чумы. Так, подтвердились устойчивость V антигена к протеолитической деградации под влиянием Fib, а также наличие у отдельных белков, кодируемых pCad, эпитопов, способных к кросс-реакциям. Более того, применение МКА, секретируемых одним из гибридных клонов к белку № 19 (YopE) с выраженными протективными свойствами, в качестве лиганда при проведении его аффинной очистки показало существование этой субстанции у Y.pestis в виде сложноорганизованного антигена, состоящего из нескольких суб"единиц белковой природы со сходными свойствами.

Не менее важные результаты были получены при использовании поликлональных антител. Как известно, поликлональная сыворотка может содержать до 10 тыс молекул иммуноглобулинов разной специфичности (147). Однако, исходя из основополагающих принципов фундаментальной иммунологии, можно целенаправленно манипулировать иммунным ответом у лабораторных животных за счет применения различных доз антигенов и схем иммунизации, подбора биологической модели с закрепленным инбридингом генотипом, использованием ксеногенных или сингенных сывороток, обеспечивая в результате индукцию антител нужной специфичности. Особенно наглядно это было продемонстрировано в экспериментах по получению АИТ, выступающих не только в роли тонкого инструмента изучения антигенной структуры бактерий, но и как перспективные компоненты при конструировании диагностических тест-систем и профилактических препаратов. Получение и использование моноспецифических поликлональных антител позволило не только выявить антигенные свойства у целого спектра белков, кодируемых pCad Y.pestis, без предварительной очистки и выделения из сложного антигенного комплекса отдельно каждого из них, но и провести сравнительный анализ их специфической активности и иммуногенности.

Направленный иммунный ответ при получении специфических антисывороток в сочетании с современными методами иммунохимического анализа способствовали обнаружению ряда особенностей антигенной структуры другого эпидемически значимого микроорганизма - вибрионов 0139 серовара. Какизвестно, принадлежащие к указанной серогруппе микроорганизмы принципиально отличаются от V.cholerae 01 группы способностью к капсулообразованию аналогично другим вибрионам не 01 группы (474), которая обеспечивает высокую вирулентность штаммов 0139 серовара, а также свойство к диссимиляции в различные органы и ткани зараженных экспериментальных животных (180) вплоть до септицемии (71, 231, 281, 476). Указанные явления - способность формировать капсулу и бактеремия - характерны для чумного микроба. Кроме того, V.cholerae 0139 также, как и Y.pestis, синтезирует R-ЛПС, с которым, подобно ЛПС чумного микроба, ассоциированы детерминанты специфичности.

Следует отметить, что во многом полученные результаты зависят от метода извлечения антигенов и техники его исполнения. Выбор наиболее щадящих, "деликатных" подходов позволяет избежать частичной деградации или денатурирующего воздействия температуры, химических агентов, сохранить природную конформацию субстанции, что имеет принципиальное значение для получения об"ективных сведений о роли того или иного антигена в микробной клетке. Так, сравнительное изучение иммунохимических свойств К-антигена Ф1, изолированного из бактерий чумы классическим методом Е.Е. Baker et al. (307) и более совершенными способами В.И. Вейнблата с соавт. (57) и Л.Н. Сердобинцева (226) убедительно продемонстрировали преимущества последних. Если в первом случае антиген содержал примеси ЛПС клеточной стенки микроорганизма, что обеспечивало неспецифические свойства гомологичных антител и т.д. и, следовательно, затрудняло изучение свойств непосредственно вещества капсулы, то оба способа выделения Ф1 из культуральной жидкости позволили изолировать непосредственно капсульную субстанцию и получить новые данные о структуре и серологической активности этого антигена. Указанный подход оказался успешным для экстракции и изучения К-антигена из V.cholerae 0139. Причем изолированный по методу В.И. Вейнблата с соавт. (57) препарат оказался в меньшей степени "загрязнен" компонентами клеточной стенки вибриона по сравнению с ранее использованным антигеном, содержащим капсульное вещество, выделенным A. Weintraub et al. (671). Более того, использованный в настоящей работе препарат превосходил по способности защищать лабораторных животных от экспериментальной инфекции К-антигены, экстрагированные другими исследователями (404, 457, 462, 604) и содержал специфические для V.cholerae 0139 субстанции, в том числе белок. Непосредственная связь последнего с К-антигеном холерных вибрионов 0139 серовара была подтверждена различными иммунохимическими методами, хотя в рамках настоящего исследования не удалось полностью выявить все связанные с этим компонентом свойства.

Применение биохимических методов экстракции ЛПС из V.cholerae0139 серовара также оказалось более успешным по сравнению с традиционными методическими приемами приготовления О-антигенов, поскольку в первом случае сохранялись серовароспецифические эпитопы, индуцирующие образование гомологичных специфических антител без дополнительной адсорбции.

Сочетанное применение оптимальных условий культивирования бактерий и метода очистки позволило экстрагировать из штаммов Y.peslis, несущих pCad и лишенных ее, значительно большее количество антигенов по сравнению с известным в настоящее время (381), в том числе, с выраженными протективными свойствами.

Таким образом, оптимизация условий очистки антигенов и выбор наиболее подходящего метода экстракции в каждом конкретном случае наряду с общепринятыми методиками выступают в качестве ключевых моментов, влияющих на объективную характеристику иммунобиологических свойств отдельных антигенных субстанций.

Полученные в настоящей работе сведения об особенностях структурно-функциональной организации антигенов чумного микроба и холерного вибриона позволили предложить несколько экспериментальных тест-систем для лабораторной диагностики чумы и холеры, вызванной вибрионами 0139 серовара. Так, уникальные свойства МКА к Fib/Coag, способных выявлять 100 % штаммов возбудителя чумы, обладающих pPst, независимо от температуры культивирования бактерий и наличия или отсутствия капсулы, были продемонстрированы при их лабораторных испытаниях в НМФА и ДИА для детекции штаммов Y.pestis и их дифференциации с другими патогенными иерсиниями. Применение иммуноглобулиновых иммуноферментных или флуоресцентных тест-систем с использованием МКА к V антигену, которому отводится ведущая роль в реализации Y.pestis вирулентных свойств и устойчивого к посттрансляционной деградации Fib, является перспективным для оценки и прогнозирования эпидемического потенциала штаммов чумного микроба, выделенных в природных очагах. Особую значимость приобретает внедрение в практику здравоохранения диагностического препарата на основе МКА к ЛПС Y.pestis, позволяющего выявлять штаммы чумного микроба независимо от их плазмидного состава, в том числе «атипичные» варианты, имеющие Fra± фенотип (348), у которых репрессирован выход антигена Ф1 на поверхность клетки (213) или имеется дефект по гену caflM (12, 16). Поскольку указанные штаммы возбудителя чумы практически не определяются коммерческими диагностическими препаратами, направленными на обнаружение Ф1, возможность их детекции в МФА или ТИФА моноклональны-ми антителами к ЛПС позволит значительно улучшить качество серологической диагностики чумы. Кроме того, в настоящем исследовании был разработан альтернативный подход обнаружения таких штаммов Y.pestis с применением коммерческих антикапсульных антител - определение содержания Ф1 непосредственно внутри клеток чумного микроба. Причем эффективность использования такого методического подхода, характеризующегося экспрессностью и простотой технического исполнения, продемонстрированная на моделях рекомбинант-ных и природных вариантов чумного микроба с Fra± фенотипом, не вызывает сомнений, поскольку подтверждена при внутриклеточном определении XT у штаммов V.cholerae, в том числе, 0139 серовара.

Полученные при сравнительной характеристике иммунобиологических свойств О-антигенов и ЛПС, изолированных различными способами из холерных вибрионов 0139 серовара, сведения позволили не только разработать новые методические приемы по выделению серовароспецифических антигенов, но и сконструировать и провести лабораторные испытания сэндвич-ТИФА для детекции штаммов указанного серовара. Причем применение в аналогичных вариантах анализа антикапсульных антител к К-антигену, экстрагированному из вибрионов 0139 серовара по оригинальной методике изолирования капсульных субстанций (57) перспективно не только для идентификации микробных клеток

V.cholerae 0139 независимо от морфологии образуемых ими колоний, но и одновременной дифференциации штаммов на вирулентные (капсулосодержащие) или со сниженной вирулентностью (лишенные капсулы), что позволит оценивать эпидемическую опасность для человека выделяемых культур.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Федорова, Валентина Анатольевна, Саратов

1. Адамов А.К. Иммунология холеры. Саратов: Изд-во СГУ, 1981.

2. Адамов А.К, Воронежская Л.Г., Гальцева Г.В., Мединский Г.М., Смоликова Л.М., Сомова А.Г., Усов Г.А., Щуркина И.И. Методические указания по серологическому типированию вибрионов, не агглютинирующихся О-холерной сывороткой. Саратов, 1980.

3. Адамов А.К., Щуркина И.И., Александрова Н.М. Серотипирование НАГ-вибрионов группы Саказаки, выделенных в разных странах // Проблемы ООИ. -Саратов, 1974. Вып. 3(37). - С. 76-78.

4. Адамов А.К., Щуркина И.И., Гончарова Н.С., Карасева З.Н. Изучение антигенов холерных, НАГ и нехолерных вибрионов // Проблемы ООИ. Саратов, 1973. - Вып. 2(30). - С. 148-156.

5. Алексеева Л.П. Моноклональные антитела к липополисахариду в иммунологии и диагностике холеры: Автореф. дис. . докт. биол. наук. Ростов-н/Дону,1993.

6. Амброзиус X. Получение сывороток от различных животных. В кн.: Иммунологические методы. Под ред. Г. Фримеля. М.: Медицина, 1987. - С. 9-20.

7. Анисимов А.П., Ежов И.Н., Захарова Н.М., Карлышев А.В., Кравченко

8. Анисимов А.П., Захарова Н.М. Серовариация капсульного антигена возбудителя чумы // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1992. - № 9-10.1. C. 26-29.

9. Анисимов П.И., Сердобинцев Л.Н., Иванов Ю.В., Тараненко Т.М., Наумов А.В. Некоторые физико-химические особенности капсульного белка чумного микроба // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1987. -№ 2. - С. 24-27.

10. Анисимов А.П., Фомченков В.М., Фурсова Н.К., Ковалев Ю.Н. Электрокинетический потенциал клеток Yersinia pestis и Escherichia coli с интакгным или дефектным геном усаЛ (caflM) fra-оперона возбудителя чумы // Генетика.1994. Т. 30. - № 9. - С. 1160-1165.

11. Антонов А.С., Леванова Г.Ф., Попов Л.С. Об уточнении систематического положения некоторых морских бактерий методом гибридизации ДНК-ДНК // ЖМЭИ.- 1975.-№ 1.-С. 94-96.

12. Апарин Т.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы. Иркутск, 1989. -С. 28.

13. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962.

14. Балахонов С.В. Результаты скрининга плазмид штаммов Yersinia pestis из разных очагов центрально-азиатской зоны природной очаговости чумы // Молекул. генетика, микробиол. и вирусол. 1989. -№ 4. - С. 39-42.

15. Бароян О.В. Холера эльтор. М.: Медицина, 1971.

16. Бахрах Е.Э. О структуре соматических антигенов чумного микроба // Вестник Акад. мед. наук СССР. М.: Медицина, 1973.-№ 11. - С. 71-76.

17. Бахрах Е.Э. Соматические антигена чумных бактерий и применение выделенных препаратов для выявления иммуноаллергической перестройки организма при чуме: Автореф. дис. . докт. мед. наук. Саратов, 1973.

18. Бахрах Е.Э., Боровикова Т.П., Вейнблат В.И., Дальвадянц С.М., Тараненко Т.М. К характеристике соматических антигенов чумного микроба // ЖМЭИ. -1972.-№9.-С. 101-105.

19. Бахрах Е.Э., Вейнблат В.И. Иммунохимическая идентификация двух соматических полисахаридосодержащих антигенов чумного микроба // Проблемы ООИ. Саратов, 1969. - Вып.6. - С.82-87.

20. Бахрах Е.Э., Вейнблат В.И. Выделение из типичных штаммов чумного микроба методом Буавена основного соматического антигена // Проблемы ООИ. Саратов, 1970. - Вып. 1. - С. 109-115.

21. Бахрах Е.Э., Вейнблат В.И. Соматические полисахаридсодержащие антигены чумного микроба // ЖМЭИ. 1972. -№ 3. - С. 12-16.

22. Бахрах Е.Э., Дроздовская Ф.К. Выделение полисахаридсодержащей фракции из умного микроба // Известия Иркутского противочумн. ин-та Сибири и Дальн. Вост. 1958.-Т. 18.-С. 135-138.

23. Бахрах Е.Э., Коробкова Е.И., Шалаева А.Ф. О химической природе и серологических свойствах специфической полисахаридсодержащей фракции чумного микроба // Там же. С. 127-133.

24. Бахрах Е.Э., Тараненко Т.М., Гольдфарб JI.M., Земцова И.Н., Классовский JI.H., Кондрашин Ю.И., Малинина З.Е., Степанов В.М., Андреева И.П. Особенности строения соматических антигенов чумных бактерий // Проблемы ООН. -Саратов, 1977. Вып. 4. - С.70-71.

25. Бахрах Е.Э., Тараненко Т.М., Егорова В.Д. Сравнительная характеристика полисахаридосодержащих фракций, выделенных из чумного микроба разными методами // Генетика, биохим. и иммунохим. ООН. Саратов, 1967. - Вып. 1. -С. 324-331.

26. Беленков Я.И. Серологический метод быстрой идентификации бактерий чумы: Автореф. дис. канд. мед. наук. Киров, 1946.

27. Берзофски Д.А., Берковер А.Дж. Взаимодействие антиген-антитело // В кн.: Иммунология. Под ред. У. Пола. 1989. - Т. 3. - С. 5-88.

28. Бойд У. Основы иммунологии. М., 1969.

29. Боровикова Т.П. Характеристика специфических полисахаридсодержащих комплексов субкультур штамма ЕВ чумного микроба: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1972.

30. Браун Дж., Линг Н.Р. Моноклональные антитела мыши // В кн.: Антитела. Методы. Под ред. Д. Кетти. М.: Мир, 1991. - Т. 1. - С. 116-152.

31. Брокхаус М. Обнаружение гликолипидных антигенов с помощью моноклональных антител //В кн.: Иммунологические методы исследования. Под ред. Г. Фримеля. М.: Мир, 1988. - С. 159-172.

32. Булгакова Е.Г. Функциональное картирование плазмиды пестициногенно-сти чумного микроба: Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1991.

33. Булгакова Е.Г., Кириллина О.А., Попов Ю.А. Экспрессия плазмиды пес-тициногенности и ее Tn-производных в миниклетках кишечной палочки и в системе бесклеточного синтеза // Микробиол., иммунол. и биохим. особо опасных инфекций. Саратов, 1987. - С. 35-41.

34. Васильева Г.И., Пустовалов В.Л. Фагоцитарная активность макрофагов морских свинок, иммунизированных антигенами FIA, FIB, водно-солевым экстрактом и живой чумной вакциной ЕВ // Проблемы ООН. 1977. - Вып. 6(58). -С. 34-37.

35. Васильева Г.И., Пустовалов B.J1., Таранова В.Н. Оценка «латентной» вирулентности вакцинных штаммов чумного микроба по степени завершенности фагоцитоза // Проблемы ООН. Саратов, 1979. - Вып. 5(69). - С. 52-55.

36. Васюренко З.П., Падченко А.Г., Рубан Н.М., Алексеенко В.В., Доброштан Е.В., Гурлева Г.Г., Опанасенко И.С. Состав клеточных жирных кислот бактерий семейства Vibrionaceae IIЖМЭИ. 1995.- № 1. - С. 10-15.

37. Вейнблат В.И. Влияние условий культивирования на синтез чумным микробом некоторых антигенов: Автореферат дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1968.

38. Вейнблат В.И. Антигены Yersinia pestis (биохимические и иммунологические аспекты): Автореф. дис. . докт. мед. наук. Саратов, 1972.

39. Вейнблат В.И., Белобородов Р.А., Боровикова Т.П., УзенцовС.А., Васенин А.С. Характеристика фрагментов капсульного антигена, растворимых в трихло-руксусной кислоте // Проблемы ООН. Саратов, 1974. - Вып. 4(38). - С. 22-27.

40. Вейнблат В.И., Вельская Н.А., Митина Г.С. К вопросу о четвертичной структуре капсульного антигена чумного микроба // Проблемы ООН. Саратов, 1973.-Вып. 2(30).-С. 92-96.

41. Вейнблат В.А., Веренков М.С., Васенин А.С. Получение капсульного антигена из живых чумных микробов // Тезисы Всесоюзн. конф. «Иммунология и иммунопрофилактика чумы и холеры» . Саратов, 1980. - С. 36-39.

42. Вейнблат В.И., Веренков М.С., Дальвадянц С.М., Титенко М.М., Киреев М.Н. К вопросу разработки и стандартизации препаративных методов полученияочищенных антигенов возбудителя чумы // Биохим., патофизиол. и микробиол. ООИ. Саратов, 1983. - С. 38-43.

43. Вейнблат В.И., Гусева Н.П., Ананьев В.В., Самыгин В.М. Липид препаратов капсульного антигена чумного микроба // Микробиол., лабораторная диагностика и специф. профилактика карантинных инфекций. Саратов, 1989. - С. 9092.

44. Вейнблат В.И., Лупикова Н.И., Ерохин Е.П., Лукин Ю.В. Латексный чумной антигенный фибринолизиновый диагностикум // Актуал. проблемы и задачи биохимии, диагностики и иммунопрофилакт. особо опасных инф. Саратов, 1991.-С. 33-37.

45. Вейнблат В.И., Палагин А.Ю., Булгакова Е.Г., Попов Ю.А. Выделение и очистка фибринолизина возбудителя чумы // Микробиол., биохим. и специф. профилакт. карантинных инф. Саратов, 1990. - С. 44-48.

46. Вейнблат В.И., Палагин А.Ю., Веренков М.С. Иммунобиологические свойства препаратов фибринолизина чумных микробов // Биотехнол., иммунол. и биохим. особо опасных инф. Саратов, 1989. - С. 14-18.

47. Вейнблат В.И., Палагин А.Ю., Кронгауз И.В., Лопаткин О.Н. Выделение и физикохимическая характеристика препаратов фибринолизина возбудителя чумы // Микробиол. и биохим. особо опасных инф. Саратов, 1988. - С. 37-42.

48. Вейнблат В.И., Тараненко Т.М., Наумов А.В. Антигены возбудителя чумы: функция, выделение, структура // Актуал. пробл. и задачи биохимии, диагн. и иммунопрофилакт. особо опасных инф. Саратов, 1991. - С. 11-13.

49. Вейнблат В.И., Титенко М.М. Выделение и очистка капсульного белка возбудителя чумы // Тезисы матер. 6 Всесоюзн. симпозиума по химии белков и пептидов (Рига, 21-25 ноября 1983). Рига, 1983. - С. 18-19.

50. Вейнблат В.И., Титенко М.М., Веренков М.С., Щербаков А.А., Киреев М.Н. Видоспецифический поверхностно-соматический антиген возбудителя чумы // Молекул, биол., генет. и иммунол. возбудит, особо опасных инфекций. -Ростов-н/Д, 1984. С. 94-96.

51. Видяева Н.А. Изучение экспрессии белков внешней мембраны, кодируемых плазмидой кальцийзависимости Yersinia pesfis: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1992.

52. Воронежская Л.Г. Холерные вибрионы не 01 группы (биологическая характеристика): Автореф. дис. . докт. мед. наук. Саратов, 1994.

53. Гальцева Г.В. Неагглютинирующиеся вибрионы и некоторые аспекты их дифференциации: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ростов н/Д, 1972.

54. Гольдфарб Л.М., Шанина Л.Н. О связи между пестициногенностью, фиб-ринолитической активностью и плазмокоагулирующей способностью // Генетика, биохим. и иммунохим. особо опасных инфекций. Ростов-н/Д, 1967. - Вып. 1.-С. 10-12.

55. Гончаров А.Ю. Структурно-функциональная организация участка ДНК pYT плазмиды, ответственного за синтез фракции 1 чумного микроба: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1995.

56. Гремякова Т.А., Анисимов А.П. Серологическая активность антигена «Фракция I» Yersinia peslis определяется его белковым компонентом // Тезисы конф. «Гомеостаз и инфекционный процесс» . Саратов, 1996. - Ч. II. - С. 319.

57. Гремякова Т.А., Анисимов А.П., Захарова Н.М. Взаимосвязь способности к экспрессии различных серовариантов капсульного антигена Yersinia pestis состепенью редуцированности липополисахарида бактериальных клеток // ЖМЭИ. 1995.-№ 1.-С. 3-6.

58. Гремякова Т.А., Анисимов А.П., Степаншина В.Н., Говорунов И.Г. Экспрессия капсульного антигена чумного микроба в микроорганизмах с S- и R-формами липополисахаридов // Тезисы докл. к Межведомств, науч. конф. 26-28 марта 1991)-Киров, 1991.-С. 198-199.

59. Далин М.В., Леви М.И., Накаряков В.А. Материалы к характеристике низкомолекулярных фрагментов капсульного антигена чумного микроба // Проблемы ООИ. 1972. - Вып. 5(27). - С. 147-152.

60. Далин М.В., Накаряков В.А., Леви М.И. Материалы к характеристике капсульного антигена чумного микроба, выделенного методом ступенчатой гелевой фильтрации // Проблемы ООИ. Саратов, 1972. - Вып. 4(26). - С. 29-35.

61. Дальвадянц С.М. Характеристика соматических антигенов чумного микроба, изолированных по методу Буавена и Вестфаля-Людерица: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1968.

62. Дальвадянц С.М. Характеристика соматического антигена чумного микроба, изолированного из авирулентного, бескапсульного, атоксичного варианта методом Буавена//Проблемы ООИ. Саратов, 1968.-№2.-С. 134-138.

63. Дальвадянц С.Н., Белобородое Р.А. Изучение токсических свойств антигена, изолированного из чумного микроба по методу Вестфаля-Людерица // Проблемы ООИ. Саратов, 1969. -№ 2. - С. 138-142.

64. Девдариани 3.J1. Научно-методические основы конструирования чумных моноклональных иммуноглобулиновых реагентов с использованием гибридом-ной технологии: Автореф. дис. . докт. мед. наук. Саратов, 1993.

65. Девдариани З.Л., Федорова В.А. Прижизненное неоднократное получение асцитической жидкости у зараженных гибридомами мышей // Лаб. дело. 1991. - № 6. - С. 79.

66. Денесюк А.И., Завьялова Г.А. Абрамов В.М., Завьялов В.П. Компьютерный анализ структуры и иммунобиологической активности Ф1-антигена чумного микроба // Тезисы докл. к Межведомств, науч. конф. 26-28 марта 1991) Киров, 1991.-С. 175-176.

67. Денисова Е.П., Егорова В.Д. Химическая характеристика термостабильных антигенов чумного микроба // Особо опасн. и природноочаг. инф. Саратов, 1962.-С. 185-188.

68. Дертева И.И., Кондрашкина К.И., Веренков М.С. Возможность обнаружения капсулообразующих и бескапсульных вариантов чумного микроба в инфицированных блохах иммунофлуоресцентным методом // Проблемы ООИ. Саратов, 1970. - Вып. 3 (13). - С. 143-147.

69. Детерман Г. Гель-хроматография. -М.: Мир, 1970.

70. Джапаридзе М.Н., Наумов А.В., Никитина Г.П., Мелещенко М.В., Доброва Г.В., Заворотных В.И., Грачева В.П., Захарова T.JI. Оральная химическая вакцина из гипертоксигенных штаммов КМ-76 Инаба и КМ-68 Огава возбудителя холеры//ЖМЭИ,- 1991,- №. 4.-С. 31-33.

71. Джапаридзе М.Н., Тараненко Т.М., Наумов А.В., Адамов А.К., Андреева И.Н. Биологическая природа О-специфичности полисхаридов ЛПС оральной холерной химической бивалентной вакцины // Тез. стенд, сообщ. Всесоюзн. био-хим. съезда. М., 1986. - Е. 3. - С. 9.

72. Домарадский И.В. Чума: современное состояние, гипотезы, проблемы. -Саратов, 1996.

73. Домарадский И.В., Либинзон А.Е., Сомова А.Г. К проблеме таксономии вибрионов // ЖМЭИ. 1973. - № 11. - С. 45-50.

74. Домарадский И.В., Яромюк Г.А. Лизис фибрина крови человека и животных чумным микробом // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1960. - № 7. - С. 51-54.

75. Домарадский И.В., Яромюк Г.А., Васюхина Л.В., Коротаева А.В. О коагуляции плазмы чумным и псевдотуберкулезным микробами // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1963. -№ 7. - С. 79-82.

76. Домарадский И.В., Яромюк Г.А., Колмыкова И.П. Новый метод получения токсических, иммуногенных и фибринолитически активных фракций чумного микроба // Докл. Иркутс. противочумн. ин-та. Чита, 1961. - Вып. 2. - С. 4344.

77. Дробков В.И, Абдуллин Т.Г., Дармов И.В. Использование иммунофер-ментного анализа при лабораторной диагностике чумы // ЖМЭИ. 1991. - № 10. - С. 40-42.

78. Дрожжевкина М.С., Зайденов A.M., Мединский Г.М., Титенко М.Т., Ше-лохович А.И. Материалы к изучению вибрионов, обнаруживаемых в кишечнике человека (отчет). Ростов н/Дону, 1973.

79. Дубичев А.Г., Воронцов Е.Д., Сердобинцев JT.H. Некоторые особенности белок-белковых взаимодействий в молекулах капсульного антигена чумного микроба // Микробиол., иммунол. и биохимия особо опасных инфекций. Саратов, 1987.-С. 41-54.

80. Дубичев А.Г., Сердобинцев JI.H., Воронцов Е.Д., Тарасов Л.Ф., Некрасов

81. A.В., Тараненко Т.М., Наумов А.В. Исследование процессов диссоциации-ассоциации капсульного антигена чумного микроба // Иммунол. и специф. профилакт. особо опасных инф. Саратов, 1986. - С. 99-105.

82. Дунаев Г.С., Зыкин Л.Ф., Черченко И.И., Классовский Л.Н., Прозоровский С.В., Метлин В.Н., Рыбкин B.C., Курилов В.Я., Костюковский В.М., Сая-мов С.Р., Кулаков М.Я., Жукова С.И., Волосивец С.И., Соколов П.Н., Бурделов

83. B.А., Валькова Е.Р., Мелехина А.Ф. Выделение L-форм чумного микроба от диких грызунов в природном очаге // ЖМЭИ. 1982. - № 8. - С. 50-54.

84. Дятлов И.А., Филиппов А.Ф., Бондаренко Л.Н., Шульгина И.В., Космаенко О.М. Получение основных антигенов чумного микроба при многоциклических процессах культивирования // Актуал. вопросы профилакт. инфекц. заболеваний. Киров, 1991.-С. 156-157.

85. Дятлов И.А., Филиппов А.Ф., Тараненко Т.М., Космаенко О.М. Иммуно-химические свойства полисахаридного антигена чумного микроба Р-3 // Матер. Российск. научн. конфер. «Иммунол. и специф. профилакт. ООИ» (21-23 сент. 1993). Саратов, 1993. - С. 25-26.

86. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. М.: Наука, 1977.

87. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. М.: Медицина, 1985.

88. Езепчук Ю.В. Стратегия возбудителя в организме хозяина. Л., 1987.

89. Блинов Н.П. Химическая микробиология. М.: Высшая школа, 1989.

90. Ермольева З.В., Сомова А.Г., Воронежская Л.Г. Серологическое изучение неагглютинирующихся вибрионов // ЖМЭИ. 1974. -№ 6. - С. 12-15.

91. Жуков-Вережников Н.Н. Иммунология чумы (Основы специфической терапии и профилактики бубонной и легочной чумы). М.-Л.: Медгиз, 1940. - С. 109-113.

92. Жуков-Вережников Н.Н., Мусабаев И.К., Завьялова Н.К. Клиника, лечение и профилактика холеры. Ташкент, 1966.

93. Заренков М.И., Гончаров Е.К. Влияние 6 Md плазмиды Yersinia pestis EV76 на состав внешне мембранных белков Yersinia pseudotuberculosis YPIII // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1991. -№3. - С. 16-19.

94. Захарова И.Я. Эндотоксины О-антигены кишечной палочки. - Киев, 1980.

95. Захарова И.Я., Косенко J1.B. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев, 1982.

96. Зыкин Л.Ф., Яковлев А.Т. Очерки по лабораторной диагностике опасных инфекций. Саратов, 1993.

97. Иванов К.К. О-соматические и поверхностные антигены сальмонелл // Вестник АМН СССР, 1973.-№ 11. - С. 64-71.

98. Иванов К.К. Разработка вакцин нового поколения против токсинов коклюша, холеры, ботулизма, столбняка, дифтерии // Молекул, генетика, микро-биол. и вирусол. 1993. - № 2. - С. 3-9.

99. Иванова B.C., Лебедева С.А., Гончарова Н.А., Гурлева Г.Г. Скрининг плазмиду музейных штаммов чумного микроба, выделенных из разных природных очагов//Там же. 1990. -№3. - С. 16-18.

100. Иванюшина В.А., Мериин А.Б., Киселев О.И. Молекулярные шапероны: новые белки новые функции // Молекул, биология. - 1991. - Т. 25. - Вып. 4. -С. 869-881.

101. Кагава Я. Биомембраны. М.: Высшая школа, 1985.

102. Казакова Е. Исследование антигенов энтеропатогенных вибрионов 067, 068, 070, 071 и 072 сероваров и усовершенствование методики их серологической идентификации: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1990.

103. Канатов Ю.В. Системы серологических реакций при чуме. 1. Принципы конструирования систем. Диагностика заболеваний у животных // В кн.: Материалы 6-й Научной конф. противочумн. Учреждений Средней Азии и Казахстана. Алма-Ата, 1969. - Вып. 1. - С. 28.

104. Карлышев А.В., Галев Э.Е., Черновская Т.В., Долгих Д.А., Смирнов О.Ю. Для эффективной экспрессии антигена Ф1 чумного микроба необходим ген caflM II Тезисы докл. к Межведомств, науч. конф. (26-28 марта 1991) Киров, 1991.-С. 174-175.

105. Квашнина А.С. Фибринолизины бактерий. Фибринолитические свойства чумной палочки. Сообщение I. // Труды Ростовского-н/Д. противочумн. ин-та. -1941.-Т. 2.-С. 70-77.

106. Квашнина А.С. Фибринолизины микроорганизмов: Автореф. дис. . докт. мед. наук. Ростов-н/Д, 1959.

107. Келлер Дж. Методы получения гибридом // В кн: Иммунология. Методы исследований. Под ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. М.: Мир, 1983. - С. 313328.

108. Кеннет Р.Г., Мак-Керн Т.Дж., Бехтол К.Б. Моноклональные антитела. -М., 1983.

109. Кетти Д., Райкундалия Ч. Получение поликлональных антител и контроль их качества // В кн.: Антитела. Методы. Под ред. Д. Кетти. М.: Мир, 1991.-Т. 1.-С. 33-115.

110. Кириллина О.А. Физическое картирование ДНК плазмиды pFra чумного микроба, клонирование области, ответственной за синтез капсульного антигена: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1992.

111. Кирней Д.Ф. Гибридомы и моноклональные антитела // В кн: Иммунология. Под ред. У. Пола. М.: Мир, 1989. - Т. 3. - С. 248-274.

112. Классовский Л.Н. Современное состояние бактериологического метода выявления чумного микроба в живых объектах // В кн.: Серологические методы диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы. -Саратов, 1975.-С. 18-30.

113. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамоотри-цательных бактерий. 1. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А (Обзор) // Биохимия. 1993. - Т. 58, вып. 2. - С. 166-181.

114. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамоотри-цательных бактерий. II. Структура кора (Обзор) // Там же. С. 182-201.

115. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. 111. Структура О-специфических полисахаридов (Обзор) // Там же. 1994. - Т. 59, вып. 12.-С. 1784-1851.

116. Кокушкин A.M. Социальные и биологические аспекты эпидемиологии чумы: Автореф. дис. . докт. мед. наук. Саратов, 1995.

117. Коллинз У.П. Новые методы иммуноанализа. М.: Мир, 1991.

118. Коробкова Е.И. Живая противочумная вакцина. М., 1956.

119. Коробкова Е.И. Микробиология и эпидемиология холеры. М., 1959.

120. Коробкова Е.И., Котельников Г.Ф., Урода JI.A., Быстренин А.И. О полном антигене чумного и псевдотуберкулезного микробов // ЖМЭИ. 1944. -№ 12. - С. 22-28.

121. Коробкова Е.И., Кузнецова В.И., Бахрах Е.Э., Шалаева А.Ф. О полисаха-ридном комплексе чумного микроба // Труды института «Микроб» . Саратов, 1951. - Вып. 1. - С. 99-103.

122. Коробов В.И. Получение очищенных препаратов V и W антигенов чумного микроба и их характеристика: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Ленинград, 1986.

123. Коробова О.В. Изучение влияния условий культивирования на биосинтез V- и W- антигенов у штамма EV НИИЭГ чумного микроба // Проблемы специфической профилакт. чумы и холеры. Саратов, 1985. - С. 10-14.

124. Коссе Л.В. Характеристика препаратов капсульных антигенов чумного микроба, выделенных из генетически различающихся штаммов-продуцентов: Автореф. дис. канд. биол. наук. Саратов, 1992.

125. Коссе Л.В., Лебедева С.А., Кузнецова Л.С., Чернявская А.С., Заренков М.И. Новые данные, относящиеся к специфичности и генетическому контролю капсульного антигена (Fl) Yersiniapeslis II ЖМЭИ. 1997. - № 2. - С. 29-33.

126. Коссе Л.В., Лебедева С.А., Шикуля Н.А., Чернявская А.Н. FI-антигенная детерминанта капсульного антигена чумного микроба не является видовой //

127. Матер. Российск. науч. конф. «Иммунол. и специфич. профилакт. особо опасных инф.» (21-23 сент. 1993, Саратов). Саратов, 1993. - С. 39-40.

128. Коссе Л.В., Некляев В.Н., Лебедева С.А., Заренков М.И. Генетический контроль FI-специфических компонентов капсульного антигена Yersinia pestis Н ЖМЭИ. 1999. - № 5. - С. 81-85.

129. Кудинова Т.П. О свойствах атипичных штаммов чумного микроба, выделенных в Балхашском районе осенью 1963 г. Сообщение 5. // Там же. С. 217218.

130. Кудинова Т.П., Козаченко А.И. О свойствах атипичных штаммов чумного микроба, выделенных в Балхашском районе осенью 1963 г. Сообщение 6. // Там же.-С. 219-220.

131. Кузьмиченко И.А., Дроздовская Ф.К. Фосфолипазная активность чумного микроба // Проблемы ООИ. Саратов, 1977. - Вып. 6(58). - С. 21-24.

132. Куклева Л.М. Фагоцитоз перитонеальными и альвеолярными макрофагами штаммов возбудителя чумы, отличающихся по вирулентности и антигенному составу: Автореф. дис. канд. биол. наук. Саратов, 1989.

133. Куклева Л.М., Кутырев В.В., Проценко О.А. Молекулярно-генетические аспекты инвазивных и антифагоцитарных свойств патогенных иерсиний // Молекул. генетика, микробиол. и вирусол. 1996. - № 1. - С. 11-16.

134. Кулевацкий Д.П. Липополисахаридобелковые комплексы внешней мембраны возбудителя турялемии: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1994.

135. Кутырев В.В. Генетический анализ факторов вирулентности возбудителя чумы: Автореф. дис. докт. мед. наук. Саратов, 1992.

136. Кутырев В.В., Филиппов А.А., Куклева Л.М., Проценко О.А. Значение плазмидных и хромосомных генов возбудителя чумы для вирулентности // Бактериальные плазмиды (Тезисы докл.). Нальчик, 1990. - С. 9-10.

137. Леви М.И. Обнаружение капсульного вантигена возбудителя чумы в диализате // ЖМЭИ. 1963. -№ 3. - С. 65-69.

138. Леви М.И. Общие закономерности и классификация серологических реакций //ЖМЭИ. 1967. -№ 7. - С. 104-109.

139. Леви М.И., Далин М.В., Накоряков В.А., Лившиц М.М., Сакаян Н.Н. Влияние молекулярного веса растворимого антигена на иммуногенность // ЖМЭИ. 1973,-№ 12.-С. 77-83.

140. Леви М.И., Момот А.Г. Выход и характеристика водорастворимых фракций различных штаммов бактерий чумы // Сборник научн. трудов Элистинской противочумн. станции. Элиста, 1961. - В. 2. - С. 111.

141. Леви М.И., Момот А.Г. Серологические исследования при чуме. Сообщение 7. Реакция нейтрализации антител // Там же. С. 207.

142. Леви М.И., Улуханов И.Б., Кузнецова К.А. Обнаружение чумного микроба в организме блох с применением иммуноферментного анализа и монокло-нальных антител // Мед. паразитол. и паразитарные болезни. 1989. -№ 1. - С. 57.

143. Леви М.И., Шимко Т.А., Темралиева Г.А. Испытания в полевой практике иммуноферментного метода с применением бета-лактамазы в качестве маркера моноклональных антител к капсульному антигену чумного микроба // ЖМЭИ. -1987.-№3,-С. 43-49.

144. Либинзон А.Е., Бичуль К.Г., Попова Г.О., Сомова А.Г., Гальцева Г.В. К вопросу о неагглютинирующихся вибрионах // Матер. 15 Всесоюзн. съезда эпи-демиол., микробиол. и инф. М., 1970. - Ч. 1. - С. 199-200.

145. Лобанов В.Н., Федоров В.Н. К вопросу о патогенезе экспериментальной чумы у полуденной песчанки (Pallasiomys meridiamis) II Вест, микробиол., эпи-демиол. и паразитол. 1939. - Т. 17, вып. 1-2. - С. 57-71.

146. Лобачев B.C., Канатов Ю.В., Левн М.И., Яхьяев А.Д. Обнаружение специфического антигена возбудителя чумы в субфоссильных костях млекопитающих //ЖМЭИ. 1972. -№ 7. -С. 21-27.

147. Ломов Ю.М., Мазрухо Б.Л., Мишанькин Б.Н., Авроров В.П., Власов В.П., Кудрякова Т.А., Кондратенко Т.А., Швагер М.И. Случай завоза на территорию России холеры, вызванной новым сероваром // ЖМЭИ. 1994 (Приложение). -С. 97-101.

148. Лукьянова О.И. Идентификация новых сероваров энтеропатогенных вибрионов: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1988.

149. Лупикова Н.И., Ермакова Г.В., Вейнблат В.И., Попов Ю.А. Гетерогенность препаратов фибринолизина чумного микроба по данным физико-химического анализа//Деп. в ВИНИТИ 02.06.92. № 1819-В92.

150. Мазрухо А.Б. Изучение продукции и свойств энтеротоксина холерных вибрионов 0139 серовара: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1997.

151. Мареева Т.Ю. Антиидиотипические моноклональные антитела к N-ацетилглюкозаминил-(3( 1 -4)-Ы-ацетилмурамоил-аланил-0-изоглутамину: получение и характеристика // Дисс. . канд. химич. наук. Москва, 1995.

152. Метлин В.Н. Характеристика вирулентности и токсичности чумного микроба, утратившего способность к синтезу фракции I Бейкера // Проблемы ООИ. Саратов, 1968. - Вып. 3. - С. 39-43.

153. Мецлер Д. Биохимия. М.: Мир, 1980.

154. Микеров А.Н., Кутырев В.В. Белки внешней мембраны иерсиний, кодируемые плазмидой вирулентности // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -1997. -№3,- С. 3-10.

155. Мишанькин М.Б. Структурно-функциональная характеристика «мышиного» токсина чумного микроба: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1997.

156. Монахова Е.В., Власов В.П., Вуцан В.Н. Видоспецифический ДНК зонд для идентификации V.cholerae II Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -1993.-№4.-С. 8-11.

157. Наумов А.В., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г. Иммунология чумы. Саратов, 1992.

158. Наумов А.В., Самойлова Л.В. Руководство по профилактике чумы. Саратов, 1992.-С. 219-221.

159. Новохатский А.С. Моноклональные антитела в микробиологии // Итоги науки и техники, серия микробиология. М., 1983. - Т. 12. - С.117- 189.

160. Новохатский А.С. Моноклональные антитела к антигенным детерминантам возбудителей инфекционных заболеваний // Там же. Т. 17. - С. 5- 113.

161. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М., 1989.

162. Оганян Е.Ф., Сучков Ю.Г., Филимонова Ю.А., Попов В.А. Перспективы использования эритроцитарных диагностикумов в целях обнаружения в пробе протеолитических ферментов // Актуал. вопр. иммунодиагн. ООИ. Ставрополь, 1986.-Ч. 2.-С. 17-18.

163. Оленичева Л.С. Химический и антигенный состав мочевинного экстракта чумных микробов штамма 1253 // Генет., биохим. и иммунохим. особо опасных инф. Ростов-н/Д, 1967. - Вып. 1. - С. 317-328.

164. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981.

165. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.

166. Палагин А.Ю. Фибринолизин чумного микроба: биохимические и имму-нохимические аспекты: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1993.

167. Петровская В.Г. Генетические основы вирулентности шигелл Флекснера // Вестник Акад. мед. наук СССР. М.: Медицина, 1973. - С. 6-15.

168. Плейфер Дж. Наглядная иммунология. М.: ГЭОТАР Мед., 1998.

169. Пол У. Иммунология. М.: Мир, 1989.

170. Попов А.А. Распределение различных по специфичности антител в белковых фракциях иммунных сывороток (сибиреязвенная, противочумная): Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1967.

171. Попов А.А., Акимович В.В. Распределение различных по специфичности антител в белковых фракциях противочумной агглютинирующей сыворотки □/ Произв-во бактерийных препаратов для профил. и диагн. ООИ. Саратов, 1966. -С. 130-140.

172. Прохватилова Е.В. Моноклональные сапные и мелиоидозные антитела как диагностические реагенты: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1997.

173. Проценко О.А., Анисимов П.И., Можаров О.Т., Попов Ю.А., Кокушкин A.M., Коннов Н.П. Внехромосомная наследственность чумного микроба // Эпи-демиол. и профилакт. природноочаговых инфекций. Саратов, 1981. - С. 131140.

174. Проценко О.А., Филиппов А.А., Кутырев В.В. Гетерогенность популяций штаммов возбудителя чумы по плазмидному составу // Молекул, генетика, мик-робиол. и вирусол. 1992. - № 3-4. - С. 20-24.

175. Пунский Е.Е., Левина А.А., Андреева В.Ф., Адаменко В.И., Адаменко Н.И., Трауб Л.А., Кобылкова Л.Е. Характеристика атипичных штаммов чумного микроба, выделенных на территории Туркмении // Проблемы ООИ. Саратов, 1977.-Вып. 4(56).-С. 68-69.

176. Резников Ю.Б. Исследование антигенного строения новых сероваров эн-теропатогенных вибрионов: Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1985.

177. Ройт А. Основы иммунологии. М.: Мир, 1991.

178. Рыбальский Н.Г., Серова М.А., Игнатьева Г.А., Старчеус А.П. Монокло-нальные антитела и гибридомы. М., 1989.

179. Сагимбеков У.А., Рахимов К.Р., Красникова JI.B. О бесфракционных штаммах чумного микроба, выделенных в Мойынкумах, и механизме их выделения // Там же. С. 262-264.

180. Свеннерфольм А.-М., Готефорс Л., Сак Д.А. // Бюлл. ВОЗ.- 1984. № 7,-С. 92-96.

181. Сердобинцев Л.Н. Полиморфизм капсульного антигена чумного микроба: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1984.

182. Сердобинцев Л.Н., Тараненко Т.М., Веренков М.С., Наумов А.В. Получение капсульного антигена методом одноэтапной гелевой фильтрации // Вопр. профилакт. природноочаговых инф. Саратов, 1983. - С. 37-41.

183. Синичкина Н.А. Фосфолипаза Д чумного микроба и ее действие на биологические мембраны восприимчивых к чуме животных: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1993.

184. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985.

185. Смирнова Н.И., Ерошенко Г.А., Щелканова Е.Ю., Ливанова Л.Ф., Коннов Н.П. Умеренный фаг Vibrio cholerae 0139: характеристика и роль в изменении экспрессии хромосомных генов вирулентности // Молекул, генетика, микро-биол. и вирусол,- 1999.- № 1. С. 3-9.

186. Смирнова Н.И., Чеховская Г.В., Давыдова Н.И., Ливанова Л.Ф., Ерошен-ко Г.А., Остроумова Н.М. Фенотипический анализ двух морфологически разных типов колоний Vibrio cholerae 0139 // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1995.-№3.-С. 30-34.

187. Соколова Н.М. Спонтанный переход отдельных клеток вакцинного штамма ЕВ в вид псевдотуберкулезного микроба // Матер, конф., поев. 50-летию ин-та «Микроб». Саратов, 1968. - С. 84-85.

188. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова Н.Н. Псевдотуберкулез. М.: Мед., 1990.

189. Сомова Г.А. Антигенные свойства и серотипирование новых штаммов неаглютинирующихся вибрионов: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1998.

190. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. -М.: Высшая школа, 1996.

191. Степанов В.М., Захаров А.И., Алманиязова К.К. Свойства штаммов возбудителя чумы, выделенных в Урало-Эмбенском автономном очаге в 1981-1984 гг. // Микробиол., лаб. диагн. и специфич. профилакт. карантинных инфекций. -Саратов, 1989.-С. 105-110.

192. Степаншина В.Н., Коробова О.В., Анисимов А.П., Фурсова Н.К., Аниси-мова В.А. Изучение препаратов капсульного антигена, выделенных из иммуно-химически атипичных штаммов возбудителя чумы // Проблемы ООИ. Саратов, 1995.-№5.-С. 94-96.

193. Степаншина В.Н., Коробова О.В., Степаншин Ю.Г., Светоч Э.А., Гусев В.В. Иммунохимические свойства белка капсулы Pasteurella mnltocida и его роль в процессе диссоциации микроба // Биотехнология. 1996. - № 11. - С. 16-21.

194. Сучков Ю.Г. Вирулентный штамм чумного микроба, лишенный фракции I // Тезисы докл. научн. конфер. по природной очаговости и профилакт. чумы и туляремии (30 октября-2 ноября). Ростов-н/Дону, 1962. - С. 75-77.

195. Сыворотка диагностическая холерная 0139 адсорбированная жидкая для реакции агглютинации на стекле // Здоровье населения и среда обитания. 1994. - № 4. - С. 22.

196. Тараненко Т.М. Углеводсодержащие антигены чумного и псевдотуберкулезного микробов. Теоретические и прикладные аспекты // Дисс. . докт. биол. наук. Саратов, 1988.

197. Тараненко Т.М., Бахрах Е.Э., Гольдфарб Л.М., Андреева И.П. К характеристике липополисахаридов, изолированных из культур, выделенных на Холмо-горье Бадхыз // Проблемы ООИ. 1977. - вып. 6(58). - С. 17-20.

198. Тараненко Т.М., Бахрах Е.Э., Малинина З.Е., Андреева И.П. Особенности строения соматических антигенов, изолированных из вакцинных штаммов ЕВ и

199. К-1 и их ахромогенных вариантов // Проблемы ООИ. Саратов, 1977. - вып. 3. -С. 64-68.

200. Тараненко Т.М., Бахрах Е.Э., Степанов В.М. К характеристике специфических полисахаридов вирулентного штамма Y.pestis и его ауксотрофных мутантов // Тез. докл. VI Всесоюзн.конф. по химии и биохим. углеводов. М., 1977. -С. 90-91.

201. Тараненко Т.М., Гольдфарб J1.M., Наумов А.В., Андреева И.П. Ускоренный метод выявления структурных особенностей липополисахарида по наличию альдогептозы у бактерий чумы и псевдотуберкулеза // Лаб. дело. 1982. - № 12. - С. 46-47.

202. Тараненко Т.М., Дальвадянц С.М., Бахрах Е.Э., Дернова B.C., Ковалев И.Ф. Изучение химического состава и некоторых биологических свойств соматического антигена чумного микроба // Проблемы ООИ. Саратов, 1972. - Вып. 3. - С. 93-98.

203. Титенко М.М. Исследование антигенов, специфичных для возбудителя чумы, с целью совершенствования методов диагностики: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1985.

204. Титенко М.М., Вейнблат В.И., Веренков М.С., Васенин А.С. Препаративный метод выделения и очистки капсульного антигена возбудителя чумы припомощи изоэлектрической преципитации // Диагн. и профилакт. ООИ. Саратов, 1983.-С. 34-39.

205. Титенко М.М., Кормилицын А.В., Можаров О.Т. К дальнейшей характеристике препаратов Ф1, выделенных из живых чумных микробов // Профилакт. природноочаговых инф. Ставрополь, 1983. - С. 325-326.

206. Титенко М.М., Сидорова И.В., Новохатский А.С., Коссе Л.В., Киселева А.К., Сивкова О.В. Некоторые свойства компонентов оболочечного вещества чумного микроба // Там же. С. 48-50.

207. Томашек В. Гель-хроматография // В кн.: Лабор. руковод. по хромато-графическим и смежным методам. М., 1982. - С. 339-390.

208. Тугамбаев Т.Н. Получение высокоактивных иммунных сывороток к антигенам чумного микроба // Там же. С. 143-144.

209. Турова Т.П., Антонов А.С. Сходство полинуклеотидных последовательностей ДНК холерных и так называемых неагглютинирующихся вибрионов // ЖМЭИ. 1977. - № 7. - С. 47-50.

210. Тюлембаев М.А. Иммунная реакция организма белых мышей на капсульный антиген чумного микроба // Матер, межгосударств, науч.-практич. конф. «Организация эпиднадзора при чуме и меры ее профилакт.». Алма-Ата. - 1992.-Т. 1.-С. 148-149.

211. Тюлембаев М.А. Влияние температуры роста на синтез капсульного антигена чумного микроба // Там же. С. 145-146.

212. Тюлембаев М.А. Циркуляция в организме белых мышей Фракции 1 // Там же.-С. 147-148.

213. Тюлембаев М.А., Апсатарова Р.А., Ионина М.П. Аминокислотный состав капсульного антигена // Там же. С. 174-176.

214. Тюлембаев М.А., Атчабаров Б.Б., Соорбеков О.С., Бегалина Г.Х. Влияние аминокислот, витаминов, урацила и некоторых солей на синтез фракции I чумного микроба// Патологич. физиол., иммунол. и аллергология особо опасных инф. Саратов, 1984. - С. 27-30.

215. Уильяме Д.ЭХ., Джентри М.К., Брэден К.А., Лейстер Р.Х., Йолкен Р.Х. Использование реакции энзиммеченных антител для количественного определения антигенемии при острой чуме // Бюл. ВОЗ. 1984. - Т.62. -№ 3. - С. 69-72.

216. Фадеева Т.Д. К вопросу об антигенной структуре чумного микроба: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1943.

217. Федорова В.А. Получение и научно-прикладное значение моноклональных антител к липополисахариду Yersinia peslis: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1994.

218. Финдлей Дж., Эванз У. Биологические мембраны. Методы. М.: Мир, 1990.

219. Фомичева О.А. Разработка иммуноферментного анализа для лабораторной диагностики псевдотуберкулеза: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1996.

220. Фролов А.Ф., Рубан Н.М., Васюренко З.П. Жирно-кислотный состав липополисахаридов штаммов различных видов иерсиний // Журн. гигиены, эпиде-миол., микробиол. и иммунол. Прага, 1989. - Т. 33. -№ 1. - С. 55-61.

221. Цоу Ч.-Л. Роль гибкости активного центра в ферментативном катализе // Биохимия. 1998. - Т. 63, вып. 3. - С. 300-307.

222. Черепанов П.А., Михайлова Т.Г., Каримова Г.А. Молекулярно-генетическая организация pla гена чумного микроба // Тез. докл. к Межведомств, науч. конф. 26-28 марта 1991) Киров, 1991. - С. 205-206.

223. Черепанов П.А., Михайлова Т.Г., Каримова Г.А., Захарова Н.В. Анализ рекомбинантных клонов, детерминирующих синтез капсульного антигена чумного микроба // Тез. докл. к Межведомств, науч. конф. 26-28 марта 1991) Киров, 1991.-С. 201-202.

224. Черкасова К.И. Фибринолизины чумного микроба и их значение в иммунологии и патогенезе чумы: Автореф. дис.канд. мед. наук. Саратов, 1947.

225. Чеховская Г.В. Генетический анализ хромосомной области Vibrio cholerae 0139, содержащей гены О-антигена: Автореф. дис. . канд. мед. наук. -Саратов, 1997.

226. Чумаченко В.Д. Биологическая активность антигенов, изолированных по способу Уокера// Проблемы ООН. 1969. - Вып. 6(10). - С. 98-103.

227. Шеремет О.В., Бошнаков Р.Б., Харабаджахян Г.Д., Миланова А.Н., Кар-ташева Л.Д., Томов А.Ц., Косовский В.К. Жирнокислотный состав Yersinia pestis при выращивании на различных питательных средах в условиях 28°С и 37°С // ЖМЭИ.- 1994.-С. 16-18.

228. Шеремет О.В., Милютин В.Н., Терентьев А.Н., Морозова Л.Н. Иммуно-генность чумного микроба, выращенного на некоторых питательных средах при 28°С и 37°С // ЖМЭИ. 1987. - С. 63-68.

229. Шроенлоер Р., Беннет Дж.К. Дисульфидные связи // В кн.: Практическая химия белка. М.: Мир, 1989. - С. 165-179.

230. Щуркина И.И. Усовершенствование серологической идентификации эн-теропатогенных вибрионов: Автореф. дис. докт. мед. наук. Саратов, 1981.

231. Щуркина И.И., Адамов А.К. Серологическая идентификация патогенных НАГ-вибрионов // Проблемы ООИ. Саратов, 1973. - Вып. 5(33). - С. 89.

232. Щуркина И.И., Адамов А.К. Серологическая идентификация НАГ-вибрионов // Проблемы ООИ. Саратов, 1974. - Вып. 2(36). - С. 70-76.

233. Щуркина И.И., Адамов А.К., Лукьянова О.И., Казакова Е.С. Антигенная структура холерного вибриона не 01 группы М045 0139 серовара // Деп. в ВИНИТИ 19.07.95 г. №2220. В95., 1995.

234. Щуркина И.И., Курочкин Н.Я., Адамов А.К. Антигенные взаимоотношения холерных и НАГ-вибрионов // Проблемы ООИ. Саратов, 1978. - Вып. 3(61).-С. 38-41.

235. Яровая Л.М., Алешкин В.А. Новые данные о химической структуре ли-пополисахаридов и практические перспективы // ЖМЭИ. 1991. - № 3. - С. 7378.

236. Яромюк Г.А. Фибринолитические свойства чумного микроба и природа его фибринолитической субстанции: Автореф. дис. канд. мед. наук. Иркутск, 1964.

237. Albert М. Vibrio cholerae 0139 Bengal // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P. 2345-2349.

238. Albert M. Epidemiology and molecular biology of Vibrio cholerae 0139 Bengal // Indian J. Med. Res. 1996. - Vol. 104. - P. 14027.

239. Albert M.J., Ansaruzammen M., Bahdhan P.K., Rarique A.S.G. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // Lancet. 1993. - Vol. 42. - P. 38-40.

240. Albert M.J., Siddique A.K., Islam M.S., Faruque A.S.G., Ansaruzzaman M., Faruque S.M., Sack R.B. A large outbreak of clinical cholera due to Vibrio cholerae non 01 in Bangladesh // Lancet. 1993. - Vol. 341. - P. 704.

241. Anders E.M., Kapaklis-Delianis G.P., White D.O. Induction of immune response to influenza virus with anti-idiotypic antibodies // J. Virol. 1989. - Vol.63. -P. 2758-2767.

242. Anderson R.S., Ordal E.T., Deoxyribonucleic acid relatonship among marine Vibrios II J. Bacteriol. 1972. - Vol. 109. - P. 696-706.

243. Anthony A.C., Noellene B.E. Immunological adjuvants'. Desirable properties and sideeffects // Mol. Immunol. 1991. - Vol. 28. - P. 279-284.

244. Araga S. Prevention of experimental autoimmune myasthenia gravis by manipulation of the immune nerwork with a complementary peptide for the acetylcholine receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. - P. 8747-8751.

245. Archer J.R., Rowley D. A quantitatire comparison of the antigenic structure of a virulent and an avirulent strain of SalImoneUa typhimurium II Immunol. 1969. -Vol. 17.-P. 551.

246. Atkins S.A. // Physiol. Rev. 1960. - Vol. 40. - P. 580.

247. Bacon G.A., Burrows T.W., Yates M. // Brit. J. exp. Med. 1951. - Vol. 32. -P. 85.

248. Baker E.E., Sommer H., Foster L.E., Meyer E., Meyer K.F. Studies on immunisation against plague. 1. The isolation and characterisation of the soluble antigen of the Pas lei i re I la peslis II J. Immunol. 1952. - Vol. 68. - P. 131-145.

249. Baker E., Soininer H., Foster L., Meyer E., Meyer K. Antigenic structure of Pasteurella pestis and the isolation of a cristalline antigen // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1947. - Vol. 64.-P. 139-141.

250. Baldwin C.L., Winter A.J. Blastogenic response of bovine lymphocytes to Brucella abortus lipopolysaccharide // Infect. Immun. -1985. Vol. 47. - P. 570-572.

251. Baumann P., Fumiss A.L., Lee J.V. Vibrio // В кн: Bergey's manual of systematic bacteriology (Ed. Kreig N.R., Holt J.G.). The williams@Wilkins Co., Baltimore, Md. - 1984.-Vol. 1.-P. 518-538.

252. Beesley E.D., Brubaker R.R., Janssen W.A., Surgalla M.J. Pesticins. III. Expression of Coagulase and Mechanism of Fibrinolysis // J. Bact. 1967. - Vol. 94. -P. 19-26.

253. Ben-Gurion R., Shafferman A. Essential virulence determinants of different Yersinia species are earned on a common plasmid // Plasmid. 1981. - Vol. 5. - P. 183-187.

254. Bennet L.G., Tornabene T.G. Characterization of the Antigenic subunits of the Envelope Protein of Yersinia pestis И J. Bacteriol. 1974. - Vol. 117. - № 1. - P. 4854.

255. Berche P., Poyart C., Abachin E., Lelievre H., Vandepitte J., Dodin A., Foumier J.-M. The novel epidemic strain 0139 is closely related to the pandemic strain 01 of Vibrio cholerae II J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 170. - P. 701-704.

256. Bergey's Manual of determinative Bacteriology. 8-th ed. - Baltimore, 1974. - 1268 p.

257. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 9-th ed. - Baltimore, London, 1984.-Vol. 1,- 1270 p.

258. Bik E.M., Bunschoten A.E., Gouw R.D., Mool F.R. Genesis of the novel epidemic Vibrio cholerae 0139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide synthesis // The EMBO Journal. 1995. - Vol. 14. - P. 209-216.

259. Bik E.M., Gouw R.D., Mooi F.R. DNA fingerprinting of Vibrio cholerae strains with a novel insertion sequence element: a tool to identify epidemic strains // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34. - P. 1453-1461.

260. Biletta R., HoIIingdale M.R., Zanetti M. Immunogenicity of an angineering internal image antibody // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol. 88. - P. 47134717.

261. Bliska J.В., Black D.S. Inhibition of the Fc receptor-medoated oxidative burst in macrophages by the Yersinia pseudotuberculosis Tyrosine phosphatase // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - P. 681-685.

262. Bliska J.В., Copass M.C., Falkow S. The Yersinia pseudotuberculosis adhesin YadA mediates intimate bacterial attachment to and entry into HEp-2 cells // Infect. Immun. 1993. - Vol. 61. - P. 3914-3921.

263. Bochkareva E.S., Lissin N.M., Girshovich A.S. Transient association of newly synthesis unfolded proteins with the heat-shock GroEL protein // Nature. -1988.-Vol. 336.-P. 254-258.

264. Boivin A., Mesrobeanu J., Mesrobeanu L. Technique pour la preparation des polyosides microbiens specifiques // Сотр. Rend. Soc. Biol. 1933. - Vol. 113. - P. 490-492.

265. Boivin A., Mesrobeanu J., Mesrobeanu L. Extraction d'uncomplexe toxique et antigenique a paitir du bacille d'aertrycke // Ibid. Vol. 114. - P. 307-310.

266. Bolin I., Forsberg A., Norlander L. Identification and mapping of the tempera-ture-inducible, plasmid-encoded proteins of Yersinia spp. // Infect. Immun. 1988. -Vol. 56.-P. 343-348.

267. Bolin I., Norlander L., Wolf-Wotz H. Temperature-inducible outer membrane protein of Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica is associated with the virulence plasmid // Infect. Immun. 1982. - Vol. 37. - P. 506-512.

268. Bolin I., Poitnoy D.A., Wolf-Watz H. Expression of the temperature-inducible outer membrane proteins of Yersinia H Infect. Immun. 1985. - Vol. 48. - P. 234-240.

269. Bolin I., Wolf-Watz H. Molecular cloning of the temperature-inducible outer membrane protein 1 of Yersinia pseudotubercullosis II Infect. Immun. 1984. - Vol. 43.-P. 72-78.

270. Bona C.A. Functional heterogeheity of anti-idiotype antibodies. In: Antiidiotype, receptors and molecular mimicry (Eds. Linthicum D.S., Farid N.R.). New York: Springer Verlag, 1988. - P. 7-14.

271. Brade L., Brandenburg K., Kuhn H.M., Kusumoto S., Macher I., Rietschel E., Brade H. The immunogenicity and antigenicity of lipid A are influence by physiochemical state and enviroment // Infect. Immun. 1987. - Vol. 55. - № 11. - P. 26362644.

272. Brade L., Rietschel E.T., Kusumoto S., Shiba Т., Brade H. Immunogenicity and Antigenicity of synthetic Escherichia coli lipid A // Infect. Immun. 1986. - Vol. 51.-№ l.-P. 110-114.

273. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Bio-chem. 1976. - Vol. 72. - P. 248-254.

274. Brenner M., Ames B.N. Histidine regulation in Salmonella typhimnrium. IX. Histidine transfer ribonucleic acid of the regulatory mutants // J. Biol. Chem. 1972. -Vol. 247.-P. 1080-1088.

275. Brenner D.J., Davis B.R., Kudon Y. Serological comparison of two collections of Vibrio cholerae non 01 // J. Clin. Microbiol. 1982. - Vol. 8. - P. 319-323.

276. Brubaker R.R. Growth of Pasteurella pseudotuberculosis in simulated intracellular and extracellular environments // J. Infect. Dis. 1968. - Vol. 117. - P. 293302.

277. Brubaker R.R. The genus Yersinia: biochemistry and genetics of virulence // Curr. Top. Micribiol. Immunol. 1972. - Vol. 57. - P. 111-158.

278. Brubaker R.R. Expression of virulence in Yersinia II In: Microbiology 1979. D. Schlessinger (ed.). - American Society for Microbiology. Washington, D.C., 1979. -P. 168-171.

279. Brubaker R.R. Factors promoting acute and chronic diseases caused by Yersinia I I Clin. Microbiol. Rev. 1991. - Vol. 4. - P. 309-324.

280. Brubaker R.R. The V antigen of yersiniae: an overview // Contrib. Microbiol. Immunol. 1991. - Vol. 12. - P. 127-133.

281. Brubaker R.R., Beesley E.D., Surgalla M.J. Pasteurella peslis: Role of pes-ticin I and Ipon in Experimental Plague 11 Science. 1965. - Vol. 149. - P. 422-424.

282. Brubaker R.R. Mutation rate to nonpigmentation in Pasteurella pestis II J. Bacterid. 1969. - Vol. 98. - P. 1404-1406.

283. Brubaker R.R., Sample A.K., Yu D.-Z. Proteolysis of V antigen from Yersinia pestis II Microb. Pathogen. 1987. - Vol. 2. - P. 49-62.

284. Brubaker R.R., Surgalla M.J. The effect of Ca2+ and Mg2+ on lysis, growth and production of virulence antigen Pasteurella pestis II J. Infect. Dis. 1964. - Vol. 144. -P. 13-25.

285. Burrows T.W. Virulence of Pasteurella pestis and immunity to plague // Er-geb. Microbiol. Immun. Exp. Ther. 1963. - Vol. 37. - P. 59-113.

286. Burrows T.W. Genetics of virulence in bacteria {P.pestis) // Brit. Med. Bui. -1962. Vol. 18.-P. 69-73.

287. Burrows T.W., Bacon G.A. The basis of virulence in Pasteurella pestis: an antigen determining virulence // Brit. J. Exp. Pathol. 1956. - Vol. 37. - P. 481-493.

288. Burrows T.W., Bacon G.A. V- and W-antigens in strains of Pasteurella pseudotuberculosis // Brit. J. Exp. Pathol. 1960. - Vol. 41. - P. 38-44.

289. Burrows W., Mather A., McHann V.A. Studies of immunity to asiatic cholera. The J and H-antigenic structure of the cholera and related vibrios // J. Inf. Dis. 1946. -Vol. 2.-P. 168-197.

290. Butler T. Plague and other Yersinia infections. New York: Plenum Medical Book Co., 1983.

291. Calia K.E., Muratagh M., Ferraro M.J., Calderwood S.B. Comparison of Vibrio cholerae 0139 with V.cholerae 01 classical and El Tor biotypes // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62. - P. 1504-1506.

292. Carter P.B., Zachorchak R.J., Brubaker R.R. Plague virulence antigens from Yersinia enterocolitica II Infect. Immun. 1980. - Vol. 28. - P. 638-640.

293. Cavanaugh D.C. Specific effect of temperature transmission of the plague bacillus by the oriental rat flea, Xenopsylla cheopis II Am. J. Trop. Med. Hyg. 1971. -Vol. 20. - P. 264-272.

294. Cavanaugh D.C., Williams J.E. Plague: some ecological interrelationships // In: Fleas Proceeding of the International Conference on Fleas. A.A. Balkema, Rotterdam. R. Traub and H. Starcke (ed.). The Netherlands, 1980. - P. 245-256.

295. Cazenave P.-A. Idiotypic-anti-idiotypic regulation of antibody synthesis in rabbits // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74. - P. 5122-5125.

296. Chaicumpa W., Srimanote P., Sakolvaree Y., Kalampaheti Т., Chongsa-Nguan M., Tapchaisri P., Eampokalap В., Moolasart P., Nair G.B. Rapid diagnosis of cholera caused by Vibrio cholerae 0139 // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36. - P. 3595-3600.

297. Chanli T.C., Hewetson J.F. Polyclonal anti-idiotypes induce antibody responses protective against ricin cytotoxicity // Immunology. 1993. - Vol. 79. - P. 681-684.

298. Chanh T.C., Rappocciolo G., Hewetson J.F. Monoclonal anti-iditype induces protection against the cytotoxicity of the trichothecene mycotoxin T-2 // J. Immunol. -1990. Vol. 144. - P. 4721-4728.

299. Chametzky W., Brubaker R.R. RNA synthesis in Yersinia pestis during restriction in calcium-deficient medium // J. Bacteriol. 1982. - Vol. 149. - P. 10891095.

300. Charmetzky W.T., Shuford W.W. Survival and growth of Yersinia pestis within macrophages and an effect of the loss of the 47-megadalton plasmid on growth in macrophages // Infect. Immun. 1985. - Vol. 47. - P. 234-241.

301. Chen Т.Н. The antigenic structure of Pasteurellapestis and the relationship to virulence and immunity // Acta Trop. 1965. - Vol. 22. - № 2. - P. 97-117.

302. Chen Т.Н., Meyer K.F. An evaluation of Pasteurella peslis fraction- 1-specific antibody for the confirmation of plague infections // Bull. W.H. O. 1966. - Vol. 34. -P. 911-918.

303. Chen Т.Н., Quan S.F., Meyer K.P. Studies on immunization against plague. II. The complement fixation test // J. Immunol. 1952. - Vol. 68. - P. 147-152.

304. Cherepanov P.A., Mikhailova T.G., Farimova G.A., Zakharova N.M., Ershov Y.V., Volkovoi K.I. Cloning and detailed mapping of the Fra-Ymt region of the Yersinia peslis plasmid pFra // Mol. Genet. Microbiol. Virusol. 1991. - № 12. - P. 19-26.

305. Cholera in 1993 Part 1 // Wkly Epidem. Rec. - 1994. - Vol. 9. - P. 205-212.

306. Cholera in 1993 Part 11 // Wkly Epidem. Rec. - 1994. - Vol. 9. - P. 213-216.

307. Cholera Working Group, International Centre for Diarrhoeal Diseases Research, Bangladesh // Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // Lancet. 1993. - Vol. 342. - P. 387-390.

308. Chongra-nguan M., Chaicumpa W., Moolasart P., Kandhasingha P., Shimada Т., Kurazono H., Takeda Y. Vibrio cholerae 0139 Bengal in Bangkok // Lancet. -1993.-Vol. 342.-P. 430-431.

309. Coleman D.L., Culver K.E., Ryan J.L. Effect of lipopolysaccharide on the stimulation of macrophage Fc-dependent phagocytosis by splenic В lymphocytes // Cell. Immunol. -1985. Vol. 2 91. - P. 520.

310. Collier D., Bankaitis V., Weiss J., Bassford P. The antifolding activity of SecB promotes the export of the E.coli maltose-binding protein // Cell. 1988. - Vol. 53. - P. 273-283.

311. Colwell R.R., Hug M.A., Chowdhury R., Brayton P.R., Xu B. Serogroup conversion of Vibrio cholerae // Can. J. Microbiol. 1995. - Vol. 41. - P. 946-950.

312. Comstock L.E., Maneval D., Panigrahi P. The capsule and O-antigen in Vibrio cholerae 0139 Bengal are associated with a genetic region not present in Vibrio cholerae 01 // Inf. and Immun. 1995. - Vol. 63. - P. 317-323.

313. Conrath M. Anti-idiotypic antibodies as a tool for cytochemical identification of substance P receptors in the central nervous system // J. Histochem. Cytochem. -1988.-Vol. 36.-P. 1397-1401.

314. Comelis G.R., Biot Т., Lambert de Rouvroit C., Michiels Т., Mulder В., Sluit-ers C., Sory M.-P., Van Bouchaute M., Vanooteghem J.-C. The Yersiniayop regulon // Mol. Microbiol. 1989. - Vol. 3. - P. 1455-1459.

315. Comelis G.R., Boland A., Boyd A.P., Geuijen C., Iriarte M., Neyt C., Sory M.-P., Stainier I. The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome // Microbiol, and mol. Biol. Rev. 1998. - Vol. 62. - P. 1315-1352.

316. Comelis G.R., Wolf-Watz H. The Yersinia Yop virulon: a bacterial system for subverting eucaryotic cells // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 23. - P. 861-867.

317. Costagliola S., Ruf J., Durandgorde M.J., Carayon P. Monoclonal antiidiotype antibodies interact with the 93 kilodalton thyrotropin receptor and exhibit heterogeneous biological activities // Endocrinology. 1991. - Vol. 128. - P. 1555-1562.

318. Crooke E., Wickner W. Trigger factor: a soluble protein that folds pro-OmpA into a membrane-assembly-component form // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. -Vol. 84.-P. 5216-5220.

319. Dalsgaard A., Skov M.N., Serichantalergs O., Echeverria P. Comparison of pulsed-field gel electrophoresis and ribotyping for subtyping of Vibrio cholerae 0139 isolated in Thailand // Epidemiol. Infect. 1996. - Vol. 117. - P. 51-58.

320. Davies D.A.L. A specific polysaccharide of Pasteurellapestis II Biochem. J. -1956.-Vol. 63.-P. 105-116.

321. Davies D.A.L. Polysaccharides of gram-negative bacteria // Advan. Carbohydrate Chem. 1960. - Vol. 15. - P. 271-340.

322. Dodin A., Brygoo E.R. Analise immunoelectrophoretigue du bacille pesteux. VI. Identification de la fraction F I // Ann. Inst. Pasteur. 1965. - V. 108. - № 5. - P. 632-639.

323. Domaradskii I.V., Yarmyuk G.A., Vastukhina L.V., Korotayeva A.V. Coagulation of blood plasma by plague and pseudotuberculosis bacilli // Bull. Exptl. 1963. - Vol. 56. - P. 79-82.

324. Donavan J.E., Nam D., Fukui G., Surgalla M.T. Role of the capsule oiP.pestis in bubonic plague in the guinea pig // J. Infect. Dis. 1961. - V. 109. - № 2. - P. 154157.

325. Douglas J.T., Palmer D.A. Use of monoclonal antibodies to identify the distribution of A and M epitopes on smooth Brucella species // J. Clin. Microbiol. 1988. -Vol. 26.-P. 1353-1356.

326. Edelman G.M., Cunningham B.A., Gall W.E., Gottlieb P.D., Rutishauser U„ Waxdal M.J. The covalent structure of an entire yG immunoglobulin molecule // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969. - Vol. 63. - P. 78-85.

327. Ehrenkanz N.J., Meyer K.F. Studies on the immunization against plague. VIII. Study of three immunizing preparations in protecting primates against plague // J. Infect. Dis. 1955. - Vol. 96. - P. 138-144.

328. Eiler M., Hwang S., Schatz G. Unfolding and refolding of a purified precursor protein during import into isolated mitochondria // EMBO J. 1988. - Vol. 7. - P. 1139-1145.

329. Ey P.L., Prowse S.J., Jenkin C.R. Isolatiob of pure lgG|, IgG2a and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using protein A-Sepharose // Immunochemistry. -1978.-Vol. 15.-P. 429-436.

330. Ezzell J.W., Abshire T.G., Little S.F., Lidgerding B.O., Brown Ch. Identification of Baccilis anthratis by using monoclonal antibody to cell wall galactose-N-acetylglucosamine polysaccharide // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28. - P. 223231.

331. Farid N.R. Anti-idiotypic approach to the study of the TSH receptor // In: Anti-idiotype, receptors and molecular mimicry (Eds. Linthicum D.S., Farid N.R.). -New York: Springer Verlag, 1988. P. 61-72.

332. Fanner J.J., Hickman-Brenner F.W., Kelly M.T. Vibrio. Manual Clin. Microbiol. 4-th ed. - 1985. - P. 282-301.

333. Faruque S.M., Albert M.J., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics and ecology of toxigenic Vibrio cholerae II Microbiol, and Molecul. Biol. Rev. 1998. - Vol. 62.-P. 1301-1314.

334. Favre D., Cryz S.J., Viret J.-F. Construction and characterization of a potential live oral carrier-based vaccine against Vibrio choleare 0139 // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. - P. 3565-3570.

335. Ferber D.M., Brubaker R.R. Plasmids in Yersinia pestis II Infect. Immun. -1981,-Vol. 31.-P. 839-841.

336. Field S.K., Morrison D.C. An anti-idiotype antibody which mimics the inner-core region of lipopolysaccharide protects mice against a lethal challenge with endotoxin // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62. - P. 3994-3999.

337. Field S.K., Pollack M., Morrison D.C. Development of an anti-idiotype monoclonal antibody mimicking the structure of lipopolysaccharide (LPS) inner- core determinants // Microbial. Pathogen. 1993. - Vol. 15. - P. 103-120.

338. Filippov A.A., Solodovnikov N.S., Kookleva L.M., Protsenko O.A. Plasmid content in Yersinia peslis strains of different origin // FEMS Microbiol. Lett. 1990. -Vol. 67. - P. 45-48.

339. Fiss E.H., Hollifield W.C., Jr. and J.B. Nielands. Absence of ferric enterobac-tin receptor modification activity in mutants of Escherichia coli К12 lacking protein a // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. - Vol. 91. - P. 29-34.

340. Forsberg A., Bolin 1., Norlander L. Molecular cloning and expression of calcium-regulated, plasmid-coded protein of Yersinia pseudotuberculosis II Microb. Pathogen. 1987. - Vol. 2. - P. 123-127.

341. Forsberg A., Rosqvist R., Wolf-Watz H. Regulation and polarized transfer of the Yersinia outer proteins (Yops) involved in antiphagocytosis // Trends Microbiol. -1994.-Vol. 2.-P. 14-19.

342. Forsberg A., Wolf-Watz H. Genetic analysis of the yopE region of Yersinia spp. identification of a novel conserved locus, yerA, regulating yopE expression // J. Bacterid. 1990. - Vol. 172. - P. 1547-1555.

343. Fowler J.M., Brubaker R.R. Physiological basis of the low calcium response in Yersinia pestis II Infect. Immun. 1994. - Vol. 62. - P. 5234-5241.

344. Fox E.U., Higuchi K. Synthesis of the fraction I antigenic protein by Pasteurella pestis // J. Bacterid. 1958. - Vol. 75. - P. 209-216.

345. Frithz-Lindsten E., Rosqvist R., Johansson L. The chaperone-like protein YcrA of Yersinia pseudotuberculosis stabilizes YopE in the cytoplasm but is dispensable for targeting to the secretion loci // Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 16. - P. 635647.

346. Fumes G„ Rowley D. Hi. Gen. Microbiol. 1956. - Vol. 15. - P. 140.

347. Galanos C., Luderitz O., Rietschel E.T., Westphal O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides // Eur. J. Biochem. 1969. - Vol. 9. - P. 245-249.

348. Galanos C., Luderitz 0., Rietschel E.T., Westphal 0. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides // Int. Rev. Biochem. 1977. - Vol. 14. - P. 239335.

349. Galanos C., Luderitz O., Westphal 0. Preparation and properties of antisera against the lipid-A component of bacterial lipopolysaccharides // Eur. J. Biochem. -1971.-Vol. 24.-P. 116-122.

350. Galfree G„ Howe S.C., Milstein C., Butcher G.W., Howard J.C. Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines // Nature. 1977.-Vol. 266. - P. 550.

351. Gallut J. Contribution a letude du complexe antigenique «О» des vibrions. III. Recherches sur les agglutinogenes thermostables des vibrions NAG // Ibid. 1963. -Vol. 105.-P. 1080-1097.

352. Gardner A.D., Venkatraman K.V. The antigens of the cholera group of vibrios // J. Hygiene. 1935. - Vol. 35. - P. 262-282.

353. Gemski P., Lazere J.R., Casey T. Plasmid associated with pathogenicity and calcium dependency of Yersinia enterocolitica II Infect. Immun. 1980. - Vol. 27. -P. 682-685.

354. Gemski P., Lazere J.R., Casey Т., Wohlhieter J.A. Presence of a virulence-associated plasmid in Yersinia pseudotuberculosis II Infect. Immun. 1980. - Vol. 28. -P. 1044-1047.

355. Girard G. Absence d'antigene glucido-lipidique chez le bacille de la peste et le bacilla de la pseudotuberculose des rongeurs// C.R.Soc. Biol. 1941. - Vol. 135. - P. 1577-1579.

356. Gitarella R.V., Cornell R.R. Polyphasis taxonomy of the genes Vibrio: polynucleotide seguence relationship among selected Vibrio species // J. Bacteriol. -1970.-Vol. 104.-P. 434-442.

357. Glosnicka R. Studies on Yersinia peslis antigens // Bull. Inst, marit. Trop. Med. Gdynia, 1980. Vol. 31. - № 1. - P. 93-95.

358. Glosnicka R., Gruszkiewicz E. Chemical composition and biological activity of the Yersinia peslis envelope substanse // Infect. Immun. 1980. - Vol. 30. - № 2. -P. 506-512.

359. Goguen Y., Youther J., Straley S.C. Genetic analysis of low calcium response in Yersinia peslis Mudi (Ap lac) insertion mutants // J. Bacteriol. 1984. - Vol. 160. -P. 842-848.

360. Greig E.D.W. The serological investigation of cholera-like vibrios isolated from water in Calcutta // Indian. J. Med. Res. 1916. - Vol. 3. - P. 626.

361. Grodberg J., Dunn J.J. ompT encodes the Escherichia coli outer membrane protease that cleaves T7 polymerase during purification // J. Bacteriol. 1988. - Vol. 170.-P. 1245-1253.

362. Grzych J.-M., Rousse-Velge F., Capron A. Use of anti-idiotypic antibodies in approach to immunoprophylaxis of schistosomasis // In: Methods Enzymol. (Ed. Lan-gone). New York Acad. Press, 1989. - Vol. 178. - P. 390-404.

363. Gulati S., McQuillen D.P., Sharon J.,Rice P.A. Experimental immunization with a monoclonal anti-idiotype antibody that mimics the Neisseria gonorrhoeae lipopolysaccharide epitope 2C7 // J. Infect. Dis. 1996. - Vol. 174. - P. 1238-1248.

364. Hall R.H., Khambaty I.M., Kothary M. Non.Ol Vibrio cholerae II Lancet. -1993.-Vol. 342.-P. 430.

365. Hall R.H., Khambaty 1.М., Kothaiy M.H., Keasler S.P., Tall B.T. Vibrio cholerae non-Ol serogroup associated with cholera gravis genetically and physiologically resembles 01 El Tor cholera strains // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62. - P. 38593863.

366. Hanham C.A., Zhao F., Tignor G.H. Evidence from the anti-idiotypic network that the acetylcholine receptor is a rabies virus receptor // J. Virol. 1993. - Vol. 67. -P. 530-542.

367. Haitland E.L., Green S.P., Phillips W.A., Robins-Browne R.M. Essential role of YopD in inhibition of the respiratory busrt of macrophages by Yersinia enterocoli-tica II Infect. Immun. 1994. - Vol. 62. - P. 4445-4453.

368. Hauri H.P., Quaroni A., Isselbacher K.J. Monoclonal antibodies to su-crase/isomaltase: Probes for the study of postnatal development and biogenesis of the intestinal microvillus membrane // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. - Vol. 77. - P. 6629-6633.

369. Heesman J., Gross U., Schmidt N. Immunochemical analysis of plasmid-encoded proteins released by enteropathogenic Yersinia spp. growth in calcium-deficient media// Infect. Immun. 1986. - Vol. 54. - P. 561-567.

370. Higuchi K., Kupferberg L.L., Smith J.L. Studies on the nutrition and physiology of Pasteurella pestis И J. Bacteriol. 1959. - Vol. 77. - P. 317-321.

371. Higuchi K., Smith J.L. Studies on the nutrition and physiology of Pasteirella pestis. IV. A Differential Plating Medium for the Estimation of the Mutation Rate to Avirilence // J. Bacteriol. 1961. - Vol. 81. - P. 605-608.

372. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotipes in silver-stained polyacrylamide gels // J. Bacteriol. -1983.-Vol. 154.-P. 269-277.

373. Hitchcock P.J., Leive L., Makela H., Rietschel E.T., Strittmatter W., Morrison D.C. Lipopolysaccharide Nomenclature past, present and future (minireview) // J. Bacteriol. - 1986. - Vol. 166. - P. 699-705.

374. Hoist O. Chemical structure of the core region of lipopolysaccharides // In.: Endotoxin in Health and disease (Eds. Brade H., Horrison D.C., Opal S., Vogel S.) -Marcel Dekkev Inc., New York, 1999. P. 115-154.

375. Hoist О., Susskind M., Grimmecke D., Brade H. Core structures of enterobacterial lipopolysaccharides // Prog. Clin. Biol. Res. 1998. - Vol. 397. - P. 23-35.

376. Hoist O., Ulmer A.J., Brade H., Flad H.D., Rietschel E.T. Biochemistry and cell biology of bacterial endotoxins // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 16.-P. 83-104.

377. Hsia R., Pannekoek Y., Ingerowski E., Bavoil P.M. Type III secretion genes identify a putative virulence locus of Chlamidia И Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 25. -P. 351-359.

378. Hu P., Brubaker R.R. Characterization of pesticin (Separatien of antibacterial activities) // J. Biol. chem. 1974. - Vol. 249. - P. 4749-4753.

379. Huges J.M., Hollis D.G., Gangarosa E.J. Non-cliolerae infections in the United States: Clinical, epidemiologic, and laboratory features // Annal. Inter. Med. 1978. -Vol. 88. - P. 602-606.

380. Hulett F.M., DeMoss J.A. Subunit structure of anthranilate synthetase from Neurospora crassa // J. Biol. Chem. 1975. - Vol. 250. - P. 6648-6652.

381. Immunization policy. Global programme for vaccines and immunization. -WHO, Geneva, 1996.

382. Imported cholera associated with a newly described toxigenic Vibrio cholerae 0139 strain (California, 1993) // MMRW. 1993. - Vol. 42. - P. 26.

383. Ingole K.V., Jalgaonkar S.V., Fule C„ Fule R.P., Shri V.N. Changing pattern of Vibrio cholerae serotype EL TOR and 0139 in Yavatmal (Maharashtra, India) during 1992 to 1994 // Indian J. Pathol. Microbiol. 1997. - Vol. 40. - P. 369-371.

384. Ivanoff B. Cholera // Working papers of Global programme for Vaccine and Immunization. WHO, Geneva, 1997.

385. Jagielski P Anti-idiotypic antibodies against antibodies to HBsAg and against antibodies to pre-Sl and pre-S2 fragments of HBV in patients with chronic HBs anti-genemia // Med. Dosw. Mikrobiol. 1996. - Vol. 48. - P. 79-85.

386. Janda J.M., Powers C., Biyant R.G., Abbott S.L. Current perspective on the epidemiology and pathogenesis of clinically significant Vibrio spp. // Clin. Microbiol. Rev. 1988. - Vol. 1. - P. 245-267.

387. Janeway C.A., Travers P. Immunobiology. The immune system in health and disease. Current Biol. Ltd., London, UK, 1997.

388. Jann K., Westphal 0. Microbial polysaccharides // In: The Antigens (Ed. M. Sela).- N.Y.: Acad.Press. 1975. - Vol. 3. - P. 1-125.

389. Janssen W.A., Surgalla M.J. Plague bacillus: survival within host phagocytes // Science. 1969. - Vol. 163. - P. 950-952.

390. Jeme N.K. Towards a network theoiy of the immune system // Ann. Inst. Pasteur Immunol. 1974. - Vol. 125. - P. 373-389.

391. Jeme N.K., Roland J., Cazenave P.-A. Reccurent idiotypes and internal image // EMBO J. 1982. - Vol. 243-247.t

392. Jesudason M.V., Cherian A.M., John T.J. Blood stream invasion by Vibrio cholerae 0139 // Lancet. 1993. - Vol. 342. - P. 431.

393. Jirillo E., Kiyono H., Michalk S.M. Immunopharmacology of Endotoxicosis (Ed. M.K. Agarwal, M. Yoshda). Berlin, 1984. - P. 93-114.

394. Johns M., Skehill A., McCabe W.R. Immunization with rough mutants of Salmonella minnesola. IV. Protection by antisera to О and rough antigens against endotoxin // J. Infect. Dis. 1983. - Vol. 147. - P. 57-67.

395. Johnston J.A., Greisman S.E. // Handbook of Endotoxins (Ed. L.B. Hinshaw). Ansterdam, 1985. - Vol. 2. - P. 359-401.

396. Johnson J.A., Panigrahi P., Morris J.G. Non-01 Vibrio cholerae NRT36S produces a polysaccharide capsule that determines colony morphology, serum resistance and virulence in mice // J. Infect. Immunol. 1992. - Vol. 60. - P. 864-869.

397. Jognson J.A., Salles C.A., Panigrahi P., Albeit M.J. Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal is closely related to Vibrio cholerae Eltor but has importent differences//Infect. Immun. 1994.-Vol. 62.-P. 2108-2110.

398. Kaper J.B., Moms J.G., Levine M.M. Cholera // Clin. Microbiol. Rev. -1995.-Vol. 8.-P. 48-86.

399. Kapral F.A., Li I.W. Virulence and coagulases of Staphyllococcus aureus II ' Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 1960. - Vol. 104. - P. 151-153.

400. Karlishev A.V., Galyov E.E., Abramov V.M., Zav'yalov V.P. CaflR gene and its role in the regulation of capsule formation of Y.pestis II FEBS Lett. 1992. - Vol. 305.-P. 37-40.

401. Karlishev A.V., Galyov E.E., Smirnov O.Yu.,Guzayev A.P., Abramov V.M., Zav'yalov V.P. A new gene of the fl operon of Y.pestis involved in the capsule biogenesis // Ibid. Vol. 297. - P. 77-80.

402. Kennedy R.C., Eicliberg J.W., Lanford R.E., Dreesman G.R. Anti-idiotype antibody vaccine for type В viral hepatitis in chimpanzees // Science. 1986. - Vol. 232. -P. 220-223.

403. Kitasato S. The bacillus of bubonic plague // Lancet. 1894. - Vol. 2. - P. 428-430.

404. Knirel Y.A., Paredes L., Jansson P.E., Weintraub A., Widmalm G., Albert M.J. Structure of the capsular polysaccharide of Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal containing D-galactose 4,6-cyclophosphate // Eur. J. Biochem. 1995. - Vol. 232. -P. 391-396.

405. Knirel Y.A., Widmalm G., Senchenkova S.N., Jansson P.-E., Weintraub A. Structural studie on the short-chain lipopolysaccharide of Vibrio cholerae 0139 Bengal // Eur. J. Biochem. 1997. - Vol. 247. - P. 402-410.

406. Kohler G„ Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. - Vol. 256. - P. 495-497.

407. Kummer W. linmunohistochemistiy of the guinea-pig trachea using an antiidiotype antibody recognizing substance // Histochemistry. 1990. - Vol. 93. - P. 541-546.

408. Kunkel H.G., Mannik M., Williams R.C. Individual antigenic specificity of the isolated antibodies // Science. 1963. - Vol. 140. - P. 1218-1219.

409. Kusukawa N., Yura Т., Ueguchi Ch., Akiyama Y., Ito K. Effects of mutations in heat-shock genes groES and groEL on protein export in Escherichia coli II EMBO J. 1989. - Vol. 8. - P. 3517-3521.

410. Kutyrev V.V., Popov Yu.A., Protsenko O.A. Pathogenicity plasmids of the plague microbe (Yersinia pestis) 11 Mol. Genet. Microbiol. Virusol. 1986. -№ 6. - P. 3-11.

411. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the assembly of the Head of Bacteriophage T 4 // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

412. Laird W.J., Cavanaugh D.C. Correlation of autoagglutination and virulence of Yersinia 11 J. Clin. Microbiol. 1980. - Vol. 11. - P. 430-432.

413. Lambin P., Rounger P., Goossens D., Herance N., de Saint Martin J., Fine J.M., Salmon C. Idiotypic specificity of a human monoclonal anti-Rhesus(D) antibody // Ann. Inst. Pasteur. Immunol. 1986. - Vol. 3. - P. 383-390.

414. Landsteiner K. The specificity of serological reactions. Harvard University Press, Cambridge, 1936.

415. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // Lancet. 1993. - Vol. 34. - P. 387-390.

416. Larrabee A.R., Marshall J.D., Crozier D. Isolation of antigens of Past, pestis. I. Lipopolysaccharide-Protein complex and R and S antigens // J. Bact. 1965. - Vol. 90.-P. 116-119.

417. Lawton W.D., Erdman R.L., Surgalla M.J. Biosynthesis and purification of V-and W-antigens in Pasteurella pestis // J. Immunol. 1963. - Vol. 91. - P. 179-184.

418. Lawton W.D., Surgalla MJ. Immunization against plague by a specific fraction of Past. Pseudotuberculosis // J. Inf. Dis. 1963. - Vol. 113. - P. 39-42.

419. Leal N.C., Almeida A.M.P., Ferreira L.C.S. Plasmid composition and virulence-associated factors of Yersinia peslis isolates from a plague outbreak at the Pa-raiba state, Brazil // Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo. 1989. - Vol. 31. - P. 295-300.

420. Leaiy S.E.C., Williamson E.D., Griffin K.F., Eley S.M., Titbal R.W. Active immunization with recombinant V antigen from Yersinia peslis protects mice against plague // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - P. 2854-2858.

421. Levisalles P. Nouvelle pandemic? Cholera: indictanct agent 0139 // J. Int. Med. 1993. - Vol. 289,- P. 51, 53, 55.

422. Leung K.Y., Reisner B.S., Straley S.C. YopM inhibits platelet aggregation and is nessesaiy for virulence of Yersinia peslis in mice // Infect. Immun. 1990. - Vol. 58.-P. 3262-3271.

423. Leytis S.P., Bowles L.K., Konisky J., Mangel W.F. Activation of plasminogen to plasmid by a protease associated with the outer membrane of Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1981. Vol. 78. - P. 1485-1489.

424. Li J.L., Chen J.L., Ouyang M.N. Immunization strategies for the production of rat monoclonal anti-idiotope antibodies // J. Immunol. Metli. 1991. - Vol. 142. - P. 15-20.

425. Lill R., Crooke E., Guthrie В., Wickner W. The «Trigger factor cycle» includes ribosomes, presecretoiy proteins and the plasma membrane // Cell. 1988. -Vol. 54.-P. 1013-1018.

426. Lindberg A.A. Surface carbohydrates of prokaiyotic cell. N.Y.: Acad. Press, 1977. - P. 289-356.

427. Losick R., Robbins P.W. The receptor site for a bacterial virus // Sci. Am. -1969.-Vol. 221.-P. 121-124.

428. Lucas G.P., Cambiaso C.L., Vaerman J.P. Characterization of an anti-idiotypic MoAb bearing an internal image of the receptor-binding epitope of cholera toxin // Clin. Exp. Immunol. 1992. - Vol. 89. - P. 378-383.

429. Luderitz O., Jann K., Wheat R. Somatic and capsular antigens of gram-negative bacteria // Compr. Biochem. 1968. - Vol. 26A. - P. 105-228.

430. Luderitz 0., Freudenberg M.A., Galanos Ch., Lehmann V., Rietschel E.Th., Shaw D.H. Lipopolysaccharides of gramnegative bacteria // Current topics in membranes and transport. -N.Y.:Acad. Press., 1982. Vol. 17. - P. 79-151.

431. Luderitz O., Staub A.M., Westphal 0. Immunochemistry of О and R antigens of Salmonella and related Enterobacteriaceae // Bacterial. Rev. 1966. - Vol. 30. - P. 192-255.

432. Luderitz 0., Tanamoto K., Galanos C., Westphal O. Structural principles of lipopolysaccharides and biological properties of synthetic partial structures // Bacterial Lipopolysaccharides. 1983. - P. 1-17.

433. Madison R.R. Fibrinolytic specificity of Baccilns peslis II Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 1936. - Vol. 34. - P. 301-302.

434. Mahajan R., Goel M., Mathur M., Kathuria K., Agrawal D.S., Talwar V. Characterisation of Vibrio cholerae 0139 isolated from diarrhoeal stools // Indian J. Pathol. Microbiol. 1996. - Vol. 39. - P. 121-125.

435. Mahon B.E., Mintz E.D., Greene K.D., Wells J.G., Tauxe R.V. Reported cholera in the United States, 1992-1994: a reflection of global changes in cholera epidemiology // JAMA. 1996. - Vol. 276. - P. 307-312.

436. Majumber R., Sengupta S., Khetawat G. Physical map of the genome of Vibrio cholerae 569B and localization of genetic markers // J. Bacterid. 1996. - Vol. 178. -P. 1105-1112.

437. Martinez R.J. Plasmid-mediated and temperature-regulated surface properties of Yersinia enterocolidca II Infect. Immun. 1983. - Vol. 41. - P. 921-930.

438. Mazza G., Karu A.E., Kingsbury D.T. Immune response to plasmid- and chromosome-encoded Yersinia antigens // Infect. Immun. 1985. - Vol. 48. - P. 676685.

439. McDonough K.A., Falkow S. A Yersinia pestis-specific DNA fragment encodes temperature-dependent coagulase and fibrinolysin-associated phenotypes // Mol. Microbiol. 1989. - Vol. 3. - P. 767-775.

440. McNamura M.K., Ward R.E., Kohler H. Monoclonal idiotope vaccine against Streptococcus pneumoniae infection // Science. 1985. - Vol. 226. - P. 1325-1326.

441. Medearis D., Camitta B.M., Heath E.C. Cell wall coposition and virulence in E.coliII J. Exp. Med. 1968. - Vol. 128.-P. 399.

442. Mertens W., Mochtar A. Comparative study of cholera Vibrio and El Tor Vibrio II Gentig. V. Nedes, Yndic. 1938. - Vol. 78. - P. 2642-2644.

443. Meyer D. Preprotein conformation: the year's major theme is translocation studies // Trends Biochem. Sci. 1988. - Vol. 13. - P. 471-474.

444. Meyer K.F. Immunity in plague: A critical review of some recent studies // J. Immunol. 1950. - Vol. 64. - P. 139-163.

445. Meyer K.F. Active immunisation of man against plague. Lecture 2 // In: WHO. Travelling Seminar on Plague Control (USSR, 2-24 Sept.). -1965. P. 23.

446. Meyer K.F. Plague toxins (critical summary). Lecture 6 // In: WHO. Travelling Seminar on Plague Control. (USSR, 2-24 September, 1965).

447. Meyer K.F., Foster L.E., Baker E.E., Sommer H., Larson A. Experimental appraisal of antiplague vaccination with dead virulent and living avirulent plague bacilli // Stanford Med. Bull. 1948. - Vol. 6. - P. 75-79.

448. Meyer K.F., Hightower J.A., McCrumb F.R. Plague immunization. VI. Vaccination with the fraction 1 antigen of Yersinia pestis II J. Infect. Dis. 1974. - Vol. 129.-P. S41-S45.

449. Michiels Т., Vanooteghem J.-C., Lambert de Rouvroit C., China В., Gustin A., Boudry P., Comelis G. Analysis of virC, an operon involved in the secretion of Yop proteins by Yersinia enterocolitica II J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173. - P. 4994-5009.

450. Michiels Т., Wattiau P., Brasseur R., Ruysschaert J.-M., Comelis G. Secretion of Yop proteins by Yersinia И Infect. Immun. 1990. - Vol. 58. - P. 2840-2849.

451. Mita A., Onta H„ Mita T. // Immunol. 1982. - Vol. 45. - P. 333-340.

452. Morris J.G. Non-0 group 1 Vibrio cholerae: a look at the epidemiology of an occasional pathogen // Epidemiol. Rev. 1990. - Vol. 12. - P. 179-191.

453. Morris T.G., Black R.E. Cholerae and other vibrioses in the United States // N. Engl. J. Med. 1985. - Vol. 312. - P. 267-271.

454. Motin V.L., Nedialkov Y.A., Brubaker R.R. V antigen-polyhistidine fusion peptide: binding to LcrH and active immunity against plague // Infect. Immun. 1996. -Vol. 64.-P. 4313-4318.

455. Nair G.B., Ramamurthy Т., Bhattacharya S.K., Mukhopadhyaya A., Garg S., Bhattachaiya M.K., Takeda Т., Shimada Т., Takeda Y., Deb B.C. Spread of Vibrio cholerae 0139 Bengal in India □/J.DInfect. Dis. П994. - Vol. 169. - P. 1029-1034.

456. Nakajima R., Motin V.L., Brubaker R.R. Suppression of cytokines in mice by protein A-V antigen fusion peptide and restoration of synthesis by active immunization // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - P. 3021-3029.

457. Nakano M., Saito K. // Nature. 1969. - Vol. 222. - P. 1085.

458. Nandy R.K., Sengupta Т.К., Mukhopadhyaya S., Ghose A.C. A comparative study of the properties of Vibrio cholerae 0139, 01 and other non-01 strains // J. Med. Microbiol. 1995. - Vol. 42. - P. 251-257.

459. Nikaido H. // Idem. Int. J. System. Bact. 1970. - Vol. 20. - P. 333.

460. Nilles M.L., Fields K.A., Straley S.C. The V antigen of Yersinia pestis regulates Yop vectorial targeting as well as Yop secretion through effects on YopB and LcrG // J. Bacterid. 1998. - Vol. 180.'- P. 3410-3420.

461. Novotney J., Handschumaker M., Haber E. Location of the antigenic epitopes on antibody molecules//J. Mol. Biol. 1986.-Vol. 189. - P. 715-721.

462. Nowotny A. Molecular aspests of endotoxic reactions // Bact. rev. 1969. -Vol. 33. - P. 72-98.

463. Osborn M.J. // Annu. Rev. Biochem. 1969. - Vol. 38. - P. 501-538.

464. Ostermann J., Horwich A., Newpert W., Haiti F.-U. Protein folding in mitochondria requires complex formation with hsp60 and ATP hydrolysis // Nature. -1989.-Vol. 341.-P. 126-130.

465. Nair G.B., Ramamurthy Т., Bhattacharya S.K. Spread of Vibrio cholerae 0139 Bengal in India // J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 169. - P. 1029-1034.

466. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gels. IV. Types of reactions in coordinated systems of diffusion // Acta Pathol, et Microbiol. Scand. 1953. - Vol. 32.-P. 231-240.

467. Oudin J., Michel M. Une nouvelle forme d'allotipe des globulines gamma du serum de lapin apparemment liee a la fonction et a la specificite anticoips // C.R. Hebd. Seances Acad. Sci. Paris. 1963. - Vol. 257. - P. 805-808.

468. Oyston P.C.F., Williamson E.D., Leary S.E.C., Eley S.M., Griffin K.F., Titball R.W. Immunization with live recombinant Salmonella typhimuriiim aroA producing FI antigen protects against plague // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - P. 563-568.

469. Pai C.H., DeStephano L. Serum resistance associated with virulence in Yersinia enterocolitica // Infect. Immun. 1982. - Vol. 35. - P. 605-611.

470. Репу R.D., Brubaker R.R. Vwa+ phenotype of Yersinia enterocolitica II Infect. Immun. 1983. - Vol. 40. - P. 166-171.

471. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis Etiologic agent of plague // Clinical. Microbiol. - 1997. - Vol. 10. - P. 35-66.

472. Perry R., Harmon P., Bowmer W., Straley S.C. A low-Ca2+ response operon encodes the V-antigen of Yersinia pestis II Infect. Immun. 1986. - Vol. 54. - P. 428434.

473. Peny R.D., Straley S.C., Fetherston J.D., Rose D.J., Gregor J., Blattner F.R. DNA sequencing and analysis of the low-Ca2t-response plasmid pCDl of Yersinia pestis KIM5 // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 4611-4623.

474. Pierce N.F., Kaper J.B., Mecalanos S.J., Cray W.C. Cholera toxin in enteric colonization by Vibrio cholerae 01 in rabbits // Infect. Immun. 1985. - Vol.50. -№ 3. - P. 813-816.

475. Pojak R.J. An idiotope-anti-idiotope complex and the structural basis of molecular mimicring // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 1599-1600.

476. Poland J.D., Barnes A.M. Plague // In: RC handbook series in zoonoses. Section A. Bacterial, rickettsial, and mycotic diseases. (Ed. Steele J.H.). CRC Press Inc., Boca Raton, Fla, 1979. - Vol. 1. - P. 515-559.

477. Porter R.R. The hydrolysis of rabbit y-globulin and antibodies with crystalline papain // Biochem. J. 1959. - Vol. 73. - P. 119-126.

478. Portnoy D., Blank H.F., Kingsbury D.T., Falkow S. Genetic analysis of essential plasmid determinants of pathogenicity in Yersinia peslis II J. Infect. Dis. 1982. -Vol. 148. - P. 297-304.

479. Portnoy D.A., Falkow S. Virulence-associated plasmids from Yersinia entero-colitica andl Yersinia pestis И J. Bacterid. 1981. - Vol. 148. - P. 877-883.

480. Portnoy D.A., Martinez R.J. Role of a plasmid in the pathogenicity of Yersinia species // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1985. - Vol. 118. - P. 29-51.

481. Portnoy D.A., Moseley S.L., Falkow S. Characterization of plasmids and plasmidassociated determinants of Yersinia enleroco/itica pathogenesis // Infect. Immun. 1981. - Vol. 31. - P. 775-782.

482. Portnoy D.A., Wolf-Watz H., Bolin I., Falkow S. Characterization of common virulence plasmids in Yersinia species and their role in the expression of outer membrane proteins // Infect. Immun. 1984. - Vol. 43. - P. 108-114.

483. Poskitt D.C., Jean-Francois M.J.В., Tumbull S., MacDonald L., Yasmeen D. The nature of immunoglobulin idiotypes and idiotype-antiidiotype interactions in immunological nerworks // Immunol. Cell Biol. 1991. - Vol. 69. - P. 61-70.

484. Powell J.L., Wright A.C., Wasserman S.S., Hone D.M., Morris J.G. Release of Tumor Necrosis Factor Alpha in Response to Vibrio vulnificus Capsular Polysaccharide in In Vivo and In Vilro Models // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. - P. 37133718.

485. Preston N.W. Cholera isolates in relation to the «eighth pandemic» // Lancet. -1993,-Vol. 42.-P. 925-927.

486. Price S.B., Cowan С., Репу R.D., Straley S.C. The Yersinia pestis V antigen is a regulatoiy protein necessary for Ca -dependent growth and maximal expression of low Ca2+ response virulence genes // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173. - P. 26492657.

487. Protsenko O.A., Filippov A.A., Kutyrev V.V. Integration of the plasmid encoding the synthesis of capsular antigen and murine toxin into Yersinia pestis chromosome//Microbial. Pathogen. 1991.-Vol. 11.-P. 123-128.

488. Qadri F., Azin Т., Chowdhury A., Hossain J., Sack R.B., Albeit M.J. Production, characterization and application of monoclonal antibodies to Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // Clin. Diagn. Immunol. 1994. - Vol. 1. - P. 51-54.

489. Rietschel E.T., Brade L., Hoist 0. Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions. (Eds Nowotny A., Spitser J.J., Ziegler E.J.). Amsterdam: Elsevier, 1990. -P. 15-32.

490. Rietschel E.T., Brade H., Hoist O. Bacterial endotoxin: Chemical constitution, biological recognition, host response, and immunological detoxification // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1996. - Vol. 216. - P. 39-81.

491. Rietschel E.T., Gottert H., Luderitz O., Westphal 0. Nature and linkages of the fatty acids present in the lipid-A component of Salmonella lipopolysacharides // Eur. J. Biochem. 1972. - Vol. 28. -P. 166-173.

492. Roantree R. // Ann. Rev. Microbiol. 1967. - Vol. 21. - P. 443.

493. Rochu D. ABO-blood-group-related idiotypic network: mimiciy of oligosaccharide epitope by rabbit antiidiotypic antibodies to murine monoclonal anti-A antibody // Res. Immunol. 1990. - Vol. 141. - P. 373-387.

494. Rolf J.M., Gaudin H.M., Tirrell S.M., MacDonald A.B., Eidelis L. Anti-idiotypic antibodies that protect cells against the action of diphteria toxin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol. 86. - P. 2036-2039.

495. Roop R.M., Preston-Moore D., Bugchi Т., Schuring G.G. Rapid identification of smooth Brucella species with a monoclonal antibody // J. Clin. Microbiol. 1987. -Vol. 25. - P. 2090-2093.

496. Rosqvist R., Forsberg A., Rimpilainen M., Bergman Т., Wolf-Watz H. The cytotoxic protein YopE of Yersinia obstructs the primary host defence // Mol. Microbiol. 1990. - Vol. 4. - P. 657-667.

497. Rosqvist R., Magnusson K.-E., Wolf-Watz H. Target cell contact triggers expression and polarized transfer of Yersinia YopE cytotoxin into mammalian cells // EMBO. 1994. - Vol. 13. - P. 964-972.

498. Rosqvist R., Skurnik M., Wolf-Watz H. Increased virulence of Yersinia pseudotuberculosis by two independent mutations //Nature. 1988. - Vol. 334. - P. 522525.

499. Roux K.H., Metzger D.W. Cross-reactive idiotypes on heterologous anti-allotype antibody//J. Immunol. 1984.-Vol. 132.-P. 1341-1345.

500. Rowland S. The morphology of the plague bacillus // J. Hyg. Plague Suppl. -1914,-Vol. 13.-P. 418-422.

501. Rowley D„ Turner K. // Immunology. 1964. - Vol. 7. - P. 394.

502. Sacks D.L., Esser K., Slier A. Immunization of mice against African trypano-somoasis using antiidiotypic antibodies // J. Clin. Med. 1982. - Vol. 155. - P. 11081119.

503. Sakazaki R., Donovan T.J. Serology and epidemiology of Vibrio cholerae and Vibrio mimicus II In: Methods in Microbiology. (Ed. T. Bergan). 1984. - Vol. 16. -P. 271-289.

504. Sakazaki R., Tamura K., Gomes C.Z. Serological studies on the cholerae group of Vibrios II Jap. J. Med. Sci. Biol. 1970. - Vol. 23. - P. 13-20.

505. Sample A.,. Brubaker R.R. Post-translational regulation of Lcr plasmid-mediated peptides in pesticinogenic Yersinia pest is II Microb. Pathogen. 1987. - Vol. 3. - P. 239-249.

506. Sample A., Fowler J.M., Brubaker R.R. Modulation of the low calcium response in Yersinia peslis via plasmid-plasmid interaction // Microb. Pathogen. 1987. -Vol. 2.-P. 443-453.

507. Sato К., Nakajima R., Нага F., Une Т., Osada Y. Preparation of monoclonal antibody to V antigen from Yersinia pestis // Contrib. Microbiol. Immunol. — 1991. — Vol. 12. P. 225-229.

508. Schaitman C. Effect of ethylenediaminetetraacetic acid, Triton X-100, and ly-sozyme on the morphology and chemical composition of isolated cell walls of Escherichia coli II J. Bacteriol. 1971. - Vol. 108. - P. 553-563.

509. Schick M.R. Induction of an anti-hepatitis В surface antigen response in mice by nonintemal image (Ab2 alpha) anti-idiotypic antibodies // J. Immunol. 1987. -Vol. 138.-P. 3419-3425.

510. Shick M.R., Kennedy R.C. Production and characterization of anti-idiotypic antibody reagents // In: Methods Enzymol. (Ed. J. Langone). New York: Acad. Press, 1989. - Vol. 178. - P. 3648.

511. Scheiber J.R. Anti-idiotype vaccines for immunity to bacterial polysaccharides: induction of functional antibodies to polysaccharide antigens of Psendomonas aeruginosa II Springer Semin. Immunopathol. 1993. - Vol. 15. - P. 235-246.

512. Schreiber J.R., Dahlauser P. Immunogenicity of tetanus toxoid conjugates of anti-idiotypes that mimic Pseuclominas aeruginosa surface polysaccharide // Infect. Immun. 1994.-Vol.62.-P. 308-312.

513. Schreiber J.R., Nixon K.L., Tosi M.F., Pier G.B., Patawaran M.B. Anti-idiotype-induced, lipopolysaccharide-specific antibody response to Pseudomonas aeruginosa II J. Immunol. 1991.-Vol. 146.-P. 188-193.

514. Schutze H. Studies in Bacterium pestis antigens. I. The antigens and immunity reactions of B.pestis II Br. J. Exp. Pathol. 1932. - Vol. 13. - P. 284-288.

515. Schutze H. Studies in Bacterium pestis antigens. III. The prophylactic value of the envelope and somatic antigens of B.pestis II Br. J. Exp. Pathol. 1939. - Vol. 19. -P. 293-298.

516. Seal S.C. Isolation of an active polysaccharide fraction from plague organism // Proc. Soc. exp. Biol. Med. 1951. - Vol. 77. - P. 675-677.

517. Secher D.S., Burke D.C. A monoclonal antibody for large scale purification of human leukocyte interferon // Nature. 1980. - Vol. 285. - P. 446-450.

518. Sengupta D.K., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. Antibody against the capsule of Vibrio cholerae 0139 protects against experimental challenge // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. - P. 343-345.

519. Sengupta D.K., Sengupta Т.К., Grose A.C. Antibodies to outer membrane proteins of V.cholerae induce protection by inhibition of intestinal colonization of vibrios // FEMS Microbiol. Immunol. 1992. - Vol. 89. - P. 261-266.

520. Sheladia V., Chambers J.P., Guevana J.Gr., Evans D.J. Isolation, purification and partial characterization of type V-hemagglutinin from Escherichia coli GC-1201:H// J. Bacteriol. 1982.-Vol. 152.-P. 757-761.

521. Shimada Т., Arakawa E., Itoh K., Okitsu Т., Matsushima A., Asai Y., Yamai S., Nakajato Т., Nair G.B., Albert M.J., Takeda Y. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae II Curr. Microbiol. 1994. - Vol. 28. - P. 175-178.

522. Shimada Т., Balakrish N.P., Deb B.P. Outbreak ob Vibrio cholerae non 01 in India and Bangladesh // Lancet. 1993. - Vol. 341. - P. 1347.

523. Shimada Т., NairG.B., Deb B.C., Albert M.J., Sack R.B., Takeda Y. Outbreak of Vibrio cholerae non-Ol in India and Bangladesh // Lancet. 1993. - Vol. 341. - P. 1347.

524. Shimada Т., Sakazaki R. Additional serovars and inter-0 antigenic relationships of V.cholerae И Jan. J. Med. Sci. Biol. 1977. - Vol. 30. - P. 275-277.

525. Siddique A.K., Akram K., Zaman K., Mutsuddy P., Eusof A., Sack R.B. Vibrio cholerae 0139: how great is the threat of a pandemic? // Trop. Med. Int. Health. -1996.-Vol. 1,-P. 393-398.

526. Shimada Т., Sakazaki R., Tobita K. Vibrio fluvialis a new serogroup (19) possessing the Inaba factor antigen of Vibrio cholerae 01 // Jap. J. Med. Sci. Biol. -1987. Vol. 40. - P. 153-157.

527. Simpson W.J., Thomas R.E., Schwan T.G. Recombinant capsular antigen (fraction 1) from Yersinia pestis induces a protective antibody response in Balb/c mice // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1990. - Vol. 43. - P. 389-396.

528. Singer S.J., Nikolson G.L. The structure and chemistry of mammalian cell membranes // American. J. Pathol. 1971. - Vol. 65. - P. 427-438.

529. Skrzypek E., Straley S.C. Differential effects of deletions in IcrV on secretion of V antigens, regulation of the Low-Ca response and virulence of Yersinia pestis И J. Bacterid. 1995. - Vol. 17. - P. 2530-2542.

530. Skuniik M. Expression of antigens encoded by the virulence plasmid of Yersinia enterocolitica under different growth conditions // Infect. Immun. 1985. -Vol. 47.-P. 183-190.

531. Skuniik M., Bolin I., Heihkinen H. Virulence plasmid-associated autoaggliti-nation in Yersinia spp. // J. Bacteriol. 1984. - Vol. 158. - P. 1033-1036.

532. Smimov G.B. Molecular biology of the factors responsible for Yersinia virulence // Biomed. Sci. 1990. - Vol. 1. - P. 223-232.

533. Smith H.L. Serotyping of non-cholera vibrios // J. Clin. Microbiol. 1979. -Vol. 10. - P. 85-90.

534. Smith H.L., Goodlier K. On the classification of vibrios // In: Proc. Cholera Res. Symp. Jan. 24-29, 1965 (Honolulu, Hawaii). Washington, 1965. - P. 4-8.

535. Sodeinde O.A., Goguen J.D. Genetic analysis of the 9.5-kilobase virulence plasmid of Yersinia pestis H Infect. Immun. 1988. - Vol. 56. - P. 2743-2748.

536. Sodeinde O.A., Goguen J.D. Nucleotide sequence of the plasminogen activator gene of Yersinia pestis: relationship to ompT of Escherichia coli and gene E of Salmonella typhimurium II Infect. Immun. 1989. - Vol. 57. - P. 1517-1523.

537. Sodeinde O.A., Sample A.K., Brubaker R.R., Goguen J.D. Plasminogen acti-vator/coagulase gene of Yersinia pestis is responsible for degradation of plasmid-encoded outer membrane proteins // Infect. Immun. 1988. - Vol. 56. - P. 2749-2752.

538. Sodeinde O.A., Subrahmanyam Y.V.B.K., Stark K., Quan Т., Bao Y., Goguen J.D. A surface protease and the invasive character of plague // Science. 1992. - Vol. 258.-P. 1004-1007.

539. Spivack M.L., Foster L., Larrou A., Chen F.N., Baker E.E., Meyer K.F. The immune response of the guinea-pig to the antigens of Pasteurella pestis // J. Immunol. 1958.-Vol. 80.-P. 132-141.

540. Straley S.C. The plasmid-encoded outer-membrane proteins of Yersinia pestis II Rev. Infec. Dis. 1988. - Vol. 10. - P. 323-326.

541. Straley S.C., Bowmer W.S. Virulence genes regulated at the transcriptional level by Ca2+ in Yersinia pesti include structural genes for outer membrane proteins // Infect. Immun. 1986. - Vol. 51. - P. 445-454.

542. Straley S.C., Brubaker R.R. Cytoplasmic and membrane proteins of Yersinia cultivated under conditions simulating mammalian intracellular environment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - Vol. 78. - P. 1224-1228.

543. Straley S.C., Brubaker R.R. Localization in Yersinia pestis of peptides associated with virulence // Infect. Immun. 1982. - Vol. 36. - P. 129-135.

544. Straley S.C., Cibull M.L. Differential clearence and host pathogen interaction of YopE- and YopK- YopL- Yersinia pestis in BALB/c mice // Infect. Immun. 1989. -Vol. 57.-P. 1200-1210.

545. Straley Т.Е., Colwell R.R. Polynucleotide seguence relationships among Japanese and American strains of Vibrio parahaemolyticas II J. Bacterid. 1973. - Vol. 114.-P. 916-917.

546. Straley S.C., Harmon P.A. Growth in mouse peritoneal macrophages of Yersinia pestis lacking established virulence determinants // Infect. Immun. 1984. -Vol. 45. - P. 649-654.

547. Straley S.C., Harmon P.A. Yersinia pestis grows within phagolysosomes in mouse peritoneal macrophages // Infect. Immun. 1984. - Vol. 45. - P. 655-659.

548. Straley S.C., Piano G.V., Skrzypek E., Haddix P.L., Fields K.A. Regulation by Ca2+ in the Yersinia low-Ca2+ response // Mol. Microbiol. 1993. - Vol. 8. - P. 10051010.

549. Straley S.C., Skrzypek E., Piano G.V., Bliska J.B. Yops of Yersinia spp. pathogenic for humans // Infect. Immun. 1993. - Vol. 61. - P. 3105-3110.

550. Stroeher U.H., Parasivam G., Dredge B.K., Manning P.A. Novel Vibrio cholerae 0139 genes involved in lipopolysaccharide biosynthesis // J. Bacteriol. 1997. -Vol. 179.-P. 2740-2747.

551. Sugiyama Y., Takashima I., Hashimoto N The analysis of V-antigen of Yersinia species with monoclonal antibodies // Jap. J. Vet. Sci. 1987. - Vol. 49. - P. 267-278.

552. Surgalla M.J. Properties of virulent and avirulent strains of Pasteurella pestis II Ann. N.Y. Acad. Sci. 1960. - Vol. 88. -№ 5. - P. 1136-1145.

553. Surveillance of cholera due to Vibrio cholerae 0139 // Wkly Epidem. Rec. -1994.-Vol. 9.-P. 2.

554. Sutherland A.D., Davies R.C., Murray J. An experimental anti-idiotype vaccine mimicking lipopolysaccharide gives protection against Pasteurella mullocida type A infection in mice // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1993. - Vol. 7. - P. 105110.

555. Taylor J., Pandit S.R., Read W.D.B. A study of the vibrio group and its relation to cholera// Indian J. med. Res. 1937. - Vol. 24. - P. 931-977.

556. Thanavala Y. An idiotype approach for a vaccine against hepatitis В surface antigen // In: Anti-idiotype, receptors and molecular mimicry. (Eds. Linthicum D.S., Farid N.R.). New York: Springer Verlag, 1988. - P. 285-300.

557. Towbin H., Stachelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76. - P. 4350-4353.

558. Towbin H., Schoenenberger C., Ball R., Braun D.G., Rosenfelder G. Glyco-sphingolipid-bloting: an immunolojical detection procedure after separation by thin layer chromatography ( JIM 03169 ) // J. Immunol. Meth. 1984. - Vol. 72. - P. 471479.

559. Truffa-Bachi P., Cohen G.N. Amino acid metabolism // Annu. Rev. Biochem. 1973.-Vol. 42.-P. 113-134.

560. Tsai C.M., Frasch C.F. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccha-rides in polyacrylamide gels// Anal. Biochem. 1982.-Vol. 119.-P. 115-119.

561. Tsuyuoka K. Characterization of a T cell line specific to an anti-Id antibody related to the carbohydrate antigen sialyl SSEA-1, and the immunodominant T cell antigenic site of the antibody //J. Immunol. 1996. - Vol. 157. - P. 661-669.

562. Une Т., Brubaker R.R. Roles of V antigen in promoting virulence and immunity in Yersinia И J. Immunol. 1984. - Vol. 133. - P. 2226-2230.

563. Une Т., Nakajima Т., Brubaker R.R. Roles of V antigen in promoting virulence in Yersinia И Contrib. Microbiol. 1986. - Vol. 9. - P. 179-185.

564. Urbain J., Wikler M., Franssen J.D., Collignon C. Idiotypic regulation of the immune system by the induction of antibodies against anti-idiotypic antibodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74. - P. 5126-5130.

565. Vemer K., Schatz G. Protein translocation across membranes // Science. -1988,-Vol. 241.-P. 1307-1313.

566. Vesikari Т., Nurmi Т., Maki M., Skurnik M., Sundqvist C., Granfors K., Gron-roos P. Plasmids in Yersinia enterocoiitica serotypes 0:3 and 0:9 correlation with epithelial cell adherence in vitro II Infect. Immun. 1981. - Vol. 33. - P. 870-876.

567. Vestweber D., Schatz G. Point mutations destabilizing a precursor protein enhance its post-translational import into mitochondria // EMBO J. 1988. - Vol. 7. - P. 1147-1151.

568. Visser L.G., Annema A., van Furth R. Role of Yops in inhibition of phagocytosis and killing of opsonized Yersinia enterocoiitica by human granulocytes // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - P. 2570-2575.

569. Wake A., Maruyama Т., Akiyama K., Yamamoto M. The role of virulence antigens (VW) in the protection of mice against Yersinia peslis infection // Curr. Microbiol. 1983. - Vol. 8. - P. 73-77.

570. Waldor M.K., Colwell R., Mekalanos J.J. The Vibrio cholerae 0139 sero-group antigen includes an O-antigen capsule and lipopolysaccharide virulence determinants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 11388-11392.

571. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Emergence of a new cholera pandemic: molecular analysis of virulence determinants in Vibrio cholerae 0139 and Development of a live vaccine prototype // J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 170. - P. 278-283.

572. Walker R.V. Plague toxins a critical review // Ergebnisse der Microbiologic und Immitatsforschung. - 1967. - Vol. 41. - P. 23-42.

573. Walker R.V. Comparative physiopathology of plague endotoxin in mice, guinea-pigs and monkeys // J. Infect. Dis. 1968. - Vol. 118. - P. 188-196.

574. Walker R.V., Barnes M.G., Higgins E.D. Composition of and physiopathology produced by plague endotoxins // Nature. 1966. - Vol. 209. - P. 1246.

575. Watkins H. // Anh. N.Y. Acad. Sci. 1960. - Vol. 88. - P. 1167.

576. Wattiau P., Bemier В., Deslee P., Michiels Т., Comelis G.R. Individual chap-erones required for Yop secretion by Yersinia II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. -Vol. 91.-P. 10493-10497.

577. Wattiau P., Comelis G.R. SycE, a chaperone-Iike protein of Yersinia enleroco-litica involved in the secretion of YopE // Mol Microbiol. 1993. - Vol. 8. - P. 123131.

578. Wattiau P., Woestyn S., Comelis G.R. Customized secretion chaperones in pathogenic bacteria // Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 20. - P. 255-262.

579. Weintraub A., Widmalm G., Jansson P., Jansson M., Hultenby K., Albert M.J. Vibrio cholerae 0139 Bengal possesses a capsular polysaccharide which may confer increased virulence // Microbial. Pathogen. 1994. - Vol. 16. - P. 235-241.

580. West P.A., Colwell R.R. Identification and classification of Vibrionaceae an overview // Vibrio in the Environment. - 1984. - P. 285-363.

581. Westemik M.A.J., Apicella M.A. Anti-idiotipic antibodies as a vaccines against carbohydrate antigens // Springer Semin. Immunopathol. 1993. - Vol. 15. -P. 227-234.

582. Westphal 0., Luderitz 0., Bister F. Ueber di von Bakterien mit Phenol-Wasser // Z. Naturforsh. 1952. - B. 7. - S. 148-155.

583. Williams J.E., Arntzen L., Tyndal G.L., Isaacson M. Application of enzyme immunoassays for confirmation of clinically suspect plague in Namibia // Bull. W.H.O. 1982. - Vol. 64. - P. 745-752.

584. Williams J.E., Gentry M.K., Braden C.M., Leister F., Yolken R.H. Use of an enzyme-linkes immunosorbent assay to measure antigenaemia during acute plague // Ibid.-1984. Vol. 62. - P. 463-466.

585. Williams R.C.G., Gewurz H.Q.P. Effects of Fraction I from Yersinia pestis on phagocytosis in vitro // J. Infect. Diseases. 1972. - Vol. 126. - P. 235-241.

586. Williamson E.D., Eley S.M., Griffin K.F., Green M., Rusel P., Titball R.W. A new improved sub-unit vaccine for plague: the basis of protection // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1995. - Vol. 12. - P. 223-230.

587. Wilson R., Lieb S., Roberts A. Non-0 group 1 Vibrio cholerae gastroenteritis associated with eating raw oysters // Amer. J. Epidemiol. 1981. - Vol. 114. - P. 293298.

588. Wolf-Watz H., Bolin I., Forsberg A. Possible determinants of virulence of Yersinia II In: Protein-Carbohydrat interaction. (Ed. D. Larc). London, Academic Press Inc., 1986.-P. 329-334.

589. Wolf-Watz H., Poitnoy D.A., Bolin I., Falkow S. Transfer of the virulence plasmid of Yersinia pestis to Yersinia pseudotuberculosis II Infect. Immun. 1985. -Vol. 48.-P. 241-243.

590. Wu T.T., Kabat E.A. An analysis of the sequences of the variable region of Bence Jones proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity // J. Exp. Med. 1970. - Vol. 132. - P. 211-250.

591. Xuan X.N. Induction of antibodies to cannine herpesvirus in mice by immunization with anti-idiotypic antibodies // Vet. Microbiol. 1991. - Vol. 28. - P. 257-267.

592. Yu G.Q., Hong J.S. Identification and nucleotide sequence of the activator gene of the externally induced phophoglycerate transport system of Salmonella typhi-murium II Gene. 1986. - Vol. 45. - P. 51-57.

593. Yuk M.H., Harvill E.T., Miller J.F. The BvgAS virulence control system regulates type 111 secretion in Bordelellci bronchiseptica // Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 28. - P. 945-959.

594. Zahorchak R.J., Brubaker R.R. Effect of exogenous nucleotides on Ca2+ dependence and V antigen synthesis in Yersinia pestisll Infect. Immun. 1982. - Vol. 38.-P. 953-959.

595. Zahorchak R.J., Chametzky W.T., Little R.V., Brubaker R.R. Consequence of Ca2+ deficiency on inacromolecular synthesis and adenylate energy charge in Yersinia pestis И У Bacterid. 1979. - Vol. 139. - P. 792-799.

596. Zanetti M. Antigenized antibodies // Nature. 1992. - Vol. 355. - P. 476-477.

597. Zav'yalov V., Denesyuk A., Zav'yalova G., Korpela T. Molecular modeling of the steric structure of the envelope F1 antigen of Yersinia pestis И Immunol. Lett. -1995.-Vol. 45.-P. 19-22.

598. Ziegler E.J., McCutchan J.A., Braude A.T. // Clin. Res. 1981. - Vol. 29. - P. 576.fUn &

599. Zink D.L., Feeley J.C., Wells J.G., Vanderzant C., Vickery J.C., O'Donovan G.A. Possible plasmid-mediated virulence in Yersinia enierocolitica // Yrans. Gulf Coast Mol. Biol. Conf. 1978. - Vol. 3. - P. 155-163.

600. Zink D.L., Feeley J.C., Wells J.G., Vanderzant C., Vickeiy J.C., O'Donovan G.A. Possible plasmid-mediated tissue invasiveness in Yersinia enierocolitica // Nature. 1980. - Vol. 283. - P. 224-226.