Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность

ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность"

004607770

На правах рукопир

Киль Владимир Ильич

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В ЗАЩИТЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ОТ ВРЕДИТЕЛЕЙ И ОЦЕНКЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ НА БИОБЕЗОПАСНОСТЬ

Специальность: 06.01.07- защита растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

~ 2 СЕН 2010

Краснодар, 2010

004607770

Работа выполнена в государственном научном учреждении -Всероссийском научно-исследовательском институте биологической защиты растений Россельхозакадемии (ВНИИБЗР) в 2001-2010 гг.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Волчков Юрий Андреевич доктор биологических наук, Мироненко Нина Васильевна доктор биологических наук, Антонова Татьяна Сергеевна

Ведущая организация: ГНУ Краснодарский научно-исследовательский институт им. П.П. Лукьяненко

Защита состоится 27 октября 2010 г. в 9.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 220.038.06 при ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г.Краснодар, ул. Калинина, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет», с авторефератом - на сайте ВАК: referat_vak@obrnadzor.gov.ru

Автореферат разослан и размещен на сайте « »июля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

профессор

Горьковенко В.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Для успешного осуществления программ защиты сельскохозяйственных растений от вредных членистоногих необходимо изучение биологии и генетики популяций как вредных, так и полезных насекомых. Это включает в себя знание генетической структуры популяций, миграционных процессов (динамики), акклиматизации, поведенческих реакций, условий размножения, отношения полов и трофических связей.

Значительный прогресс в этом отношении был достигнут в 50-60-е годы прошлого столетия, благодаря использованию классических генетических принципов и подходов. Изучение популяционных процессов насекомых исследователи проводили, главным образом, с помощью видимых и хорошо различимых фенотипических маркеров (морфологических и фенетических) таких, как цвет глаз, полосы и пятна, волоски или шипы на теле особи. Это приблизило ученых к пониманию закономерностей распространения насекомых, их поведенческих реакций, включая половые отношения, и наследования отдельных генов, контролирующих те или иные признаки [Behura, 2006].

Использование молекулярно-генетических подходов, начиная с белковых маркеров в 1970-х годах, главным образом изоферментов и позже ДНК-маркеров, во многом способствовало более глубокому пониманию исследуемых закономерностей в популяциях насекомых. Большинство ДНК-маркеров, используемых сегодня - это продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР). ДНК-маркеры позволяют анализировать и объяснять популяционные процессы там, где этого не могут сделать никакие другие методы исследований. Использование ДНК-маркеров необходимо для анализа структуры популяций как полезных насекомых - паразитов и хищников, так и вредителей. Кроме того, они могут использоваться для целей таксономии и филогении [Roehrdanz, Flanders, 1993; Mitchell et al., 2006]. С их помощью можно разделить таксоны насекомых, т.е. биотипы, подвиды, близкородственные виды, а также виды-двойники, т.е. виды, которые трудно различить морфологически или каким-то другим способом [Mitchell et al., 2005, Mitchell, Samways, 2005; Silva-Brandao et al., 2008].

Несмотря на столь широкие возможности ДНК-маркеров, в нашей стране в генетических исследованиях популяций вредителей преобладает использование морфологических и фенетических маркеров. На их основе исследователи продолжают изучать динамику, поведенческие реакции и строят прогнозы о развитии резистентности насекомых к инсектицидам, главным образом для сельскохозяйственно значимых вредителей [Фасулати, Вилкова, 2000; Сухору-ченко, 2001, 2005; Король, Новосельская, 2001; Беньковская и др, 2004; Ростовцева, 2005].

Несмотря на то, что фенетические маркеры просты для использования и часто проявляются на протяжении всего жизненного цикла организма, они имеют ряд существенных недостатков. Основными ограничениями их использования является то, что хорошо различимые фены относительно редки и встречаются далеко не у всех видов насекомых. Проблема идентификации вида по

морфологическим признакам в отдельных случаях значительно затрудняется из-за существования видов-двойников. Кроме того, модификационная изменчивость фенетических маркеров, как правило, весьма значительна, что затрудняет оценку и прогноз динамики популяционных процессов. Более того, идентификация таких маркеров должна базироваться на знании их генетического контроля и того, как гены, контролирующие этот признак, наследуются в потомстве.

Использование для этих целей современных методов молекулярно-генетического анализа, в частности ПЦР-метода и полученных на его основе ДНК-маркеров, может во многом способствовать решению этих проблем. Важно отметить, что использование ДНК-маркеров не умаляет применения фенетических и других морфологических критериев в практике защиты растений от вредителей, но лишь дополняет их и расширяет возможности для популяционных исследований видов насекомых, не имеющих четких фенетических признаков, позволяет повысить точность мониторинга и прогноза. Кроме того, с использованием ДНК-маркеров появляется возможность проследить динамику отдельных генетических элементов, отдельных хромосомных локусов, генов и аллелей генов в популяциях, оценить гетерозиготность, гетерогенность и сходство популяций непосредственно на генетическом уровне и другие параметры, которые невозможно оценить с помощью морфологических критериев.

Таким образом, сегодня исследователям недостает точных методов анализа и прогноза в популяциях вредных и полезных насекомых для целей мониторинга и защиты. Существует также недостаток знаний о молекулярно-генетаческой структуре популяций насекомых и закономерностях ее изменчивости под влиянием стрессовых факторов внешней среды. В этой связи данные исследования, несомненно, актуальны и представляют интерес для практики защиты растений от вредных насекомых.

В то же время многие эксперты по сельскому хозяйству считают, что проблема нехватки продовольствия не может быть решена без применения ДНК-технологий и в частности генной инженерии. Генетическая инженерия по сути продолжает направление традиционной селекции по улучшению генотипов полезных растений, но достигает той же цели более эффективным и быстрым путем. На сегодняшний день генетическая инженерия уже располагает большим арсеналом знаний и методов для эффективного переноса полезных генов из одних организмов в другие [Романов, 2000]. На этой основе уже созданы многие сорта трансгенных или генетически-модифицированных растений (ГМР) и некоторые виды ГМ-насекомых, которые нашли применение в мировой практике защиты сельскохозяйственных растений от вредителей. Однако их использование в нашей стране и в частности ГМ-растений сдерживается недостаточным изучением вопросов их экологической безопасности.

В этой связи данные исследования также актуальны и могут найти свое отражение в практике защиты растений на этапе предрегистрационных испытаний и пострегистрационного мониторинга ГМР и продукции на их основе.

Цель и задачи исследований. Основной целью исследований являлось теоретическое обоснование применения молекулярно-генетических методов в практике защиты сельскохозяйственных растений от вредных насекомых и оценке трансгенных ¿/-защищенных растений на экологическую безопасность и на этой основе разработка новых методов мониторинга популяций вредителей и трансгенов.

Для достижения цели исследований были поставлены следующие задачи:

1. Разработать новые системы описания феноформ рисунка и окраски имаго колорадского жука и клопа вредная черепашка.

2. Изучить ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие популяций колорадского жука, клопа вредная черепашка, картофельной минирующей моли, хлопковой совки и яблонной плодожорки по ЯДРО-, 1881*- и ЗБЯ-маркерам.

3. Изучить влияние инсектицидов, географического положения и условий года на фенетическую, молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяций насекомых-вредителей.

4. Выявить фенетические и ДНК-маркеры резистентности вредителей к инсектицидам и /¿/-картофелю и на этой основе разработать новые методы мониторинга резистентности вредных насекомых.

5. Усовершенствовать методы детекции и количественной оценки трансгенов в биоматериале.

6. Оценить риск вертикального переноса генов для ГМ-картофеля и кукурузы.

7. Оценить пролонгированное влияние трансгенного (ВО картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, на нецелевые виды насекомых, а именно на молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяции картофельной минирующей моли, а также на жизнеспособность насекомых.

Научная новизна.

Разработаны новые системы описания рисунка и окраски имаго колорадского жука и клопа вредная черепашка.

• Выявлены закономерности изменчивости фенетической структуры популяций насекомых под влиянием инсектицидов и других стрессовых факторов внешней среды. Показано, что чувствительность различных фенетических групп насекомых к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций, как считалось ранее, но в первую очередь определяется соотношением внутрипопуляционных групп насекомых, имеющих неспецифическую устойчивость к различным стрессам.

• Выявлена высокая модификационная изменчивость фенетической структуры популяций клопа вредная черепашка, что ограничивает возможность использования фенетических маркеров при мониторинге резистентности этого вредителя к инсектицидам.

• По данным молекулярно-генетических исследований показано генетическое сходство клопа вредная черепашка с другими представителями семейства Рег^отМае, что, по-видимому,- указывает на принадлежность этого вида клопов скорее к семейству Реп1аи)1тпс1ае, чем к Бс^еИег'кЗае.

• Предложен новый подход к отбору резистентных к инсектицидам насекомых для поиска ДНК-маркеров резистентности у моновольтинных видов насекомых.

Новизна предлагаемого подхода заключается в том, что он не требует проведения многоступенчатого, в ряду нескольких поколений, процесса селекции и отбора особей, резистентных к инсектициду. Выявлены ДНК-маркеры резистентности клопа вредная черепашка к инсектициду Би-58 Новый.

Разработана математическая модель, позволяющая проводить прогноз развития резистентности популяций колорадского жука к трансгенному (Ш) картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго.

• Разработан метод полуколичественпой оценки содержания генетически модифицированных источников в зерне сои и соевой муке.

• Разработан новый подход к оценке пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых и метод оценки влияния ^/-картофеля на картофельную моль в ряду нескольких генераций насекомых.

Практическая значимость результатов исследований.

1. Разработаны системы описания феноформ рисунка и окраски имаго насекомых, которые рекомендуется использовать для целей фенетического анализа популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка.

2. Разработана методика оценки ДНК-полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (ЯАРО- и ^Я-РСЯ), которую предлагается использовать для молекулярно-генетического анализа популяций членистоногих.

3. Предложен подход к поиску резистентных к инсектицидам генотипов в популяциях моиовольтинных видов насекомых, основанный на отборе резистентных генотипов в природной популяции вредителя, постоянно взаимодействующей с инсектицидом.

4. Разработаны новые методы детекции и полуколичественной оценки трансгенной вставки в биоматериале, которые предлагается использовать в целях быстрого и эффективного мониторинга ГМ-растений на полях и получаемых на их основе продуктов и кормов.

5. Разработан новый метод мониторинга резистентности колорадского жука к трансгенному (ВО картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго.

6. Предложен подход к оценке пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых и разработана методика оценки влияния #/-картофеля на картофельную минирующую моль, которую рекомендуется использовать на этапе предрегистрационных испытаний ^/-картофеля.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Новые системы описания феноформ рисунка и окраски колорадского жука и клопа вредная черепашка, которые позволяют более эффективно проводить анализ популяционных процессов этих видов насекомых, нежели традиционные. Фенетическая структура популяций насекомых определяется не столько пести-цидным фактором, сколько соотношением генотипов с неспецифической устойчивостью к стрессам.

2. Методика оценки резистентности популяций колорадского жука к й/-картофелю по феноформам рисунка переднеспинки, с использованием предлагаемой нами формулы расчета. Использование для этих целей фенетических маркеров необходимо рассматривать только в качестве предварительной, грубой оценки.

3. Новый подход для поиска и идентификации резистентных к инсектицидам генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых, основанный на обработке инсектицидом выборки насекомых из природной резистентной популяции. ДНК-маркеры резистентности к инсектициду Би-58 Новый в популяции клопа вредная черепашка для целей создания новых методов мониторинга и прогноза развития резистентности.

4. Новый подход для оценки пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых биоценоза и методика оценки влияния трансгенного (Bt) картофеля на картофельную минирующую моль, на основе использования сравнительной оценки генетического разнообразия и изменчивости моле-кулярно-генетической структуры внутрипопуляционных групп особей по ДНК-маркерам.

5. Метод полуколичественной оценки на основе ПЦР по целевому гену устойчивости к гербициду раундап (СР4 EPSPS) для целей мониторинга генетически модифицированных источников в зерне и зернопродуктах сои.

Апробация работы. Исследования проводились в 2001-2010 гг. в Всероссийском научно-исследовательском институте биологической защиты растений Россельхозакадемии (ВНИИБЗР) по программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований РАСХН по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2006-2010 гг. «Разработать агротехнологии интегрированной защиты растений, использования биобезопасных, экологичных и экономически эффективных химических и биологических средств защиты растений нового поколения, сортов сельскохозяйственных культур, устойчивых к вредным организмам, и на их основе региональных систем управления процессами фитосанитарного оздоровления агроценозов» по этапу «Разработать системы технологий фитосанитарного оздоровления и стабилизации агроценозов на основе оптимизации их по экономической эффективности, биологической и экологической безопасности».

Основные результаты исследований ежегодно докладывались на ученых советах ВНИИБЗР, а также научно-практических конференциях: Международной конференции "Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений" (ВНИИБЗР, Краснодар, 2002); третьей региональной научно-практической конференции молодых учёных "Научное обеспечение агропромышленного комплекса" (КубГАУ, Краснодар, 2001); Международной конференции «Генетически модифицированные источники пищи: оценка безопасности, законодательно-нормативная база, маркетинг», (Москва. 2003); Всероссийской научно-технической конференции "Биотехнология 2003" (Сочи, 2003); VII Всероссийском конгрессе «Здоровое питание населения России» (Москва, 2003); 2-м Московском международном конгрессе: "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва,2003); 5-ой региональной научно-практич. конф. молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, КубГАУ, 2003); Международной конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, ВНИИБЗР, 2004); III съезде ВОГиС, «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004); Отчетной научной конференции грантодержателей

РФФИ (Сочи, 2004); IV Семинаре-совещании «Средства защиты растений, регуляторы роста, агрохимикаты и их применение при возделывании сельскохозяйственных культур» (Анапа, 2005); Отчетной научной конференции грантодержа-телей РФФИ (Сочи, 2005); международной конференции «Актуальные вопросы экологии и природопользования» (Ставрополь, 2005); Втором Всероссийском Съезде по защите растений (Санкт-Петербург, 2005); 3-ей международной конференции из серии «Наука и бизнес» «Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность» (2006,Пущино); Международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар.2006); отчетной конференции грантодержа-телей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ-РОССИИ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (пос. Агой туапсин-ского р-на-2006, 2007, 2008); Международной научно-практической конференции «Агротехнический метод защиты растений от вредных организмов» (Краснодар, 2007); 2-й Всероссийской научно-практической конференции Ставропольского отделения Русского энтомологического общества РАН «Проблемы энтомологии Северо-Кавказского региона» (Ставрополь, 2007); 13 съезде Русского энтомологического общества (Краснодар.2007); международной конференции «Информационные системы диагностики, мониторинга и прогноза важнейших сорных растений, вредителей и болезней сельскохозяйственных культур» (Санкт-Петербург-Пушкин, 2008); международной конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 2008); II Международной научно-практической интернет-конференции «Актуальные вопросы энтомологии» (Ставрополь, 2009); X сессии Генеральной Ассамблеи ВПРС МОББ и Международной научно-практической конференции «Биологические основы регулирования вредных организмов в агроценозах» (Киев, 2009).

Работа поддержана субвенциями Миннауки: "Оценка биологической эффективности генно-инженерно-модифицированных растений (ГИМР) и разработка методов оценки их биоценотической безопасности", а также РФФИ и администрацией Краснодарского края: гранты №№ 03-04-96772, 06-04-96737, 06-04-96644,09-04-96514, 09-04-96556 и грантом МНТЦ №3768.

Публикации. Основные положения диссертации изложены в 70 научных трудах, в том числе монографии и 9 статьях - в изданиях, рекомендуемых ВАК для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 348 страницах машинописного текста, состоит из введения, шести глав, выводов, рекомендаций, списка литературы и четырех приложений; содержит 48 таблиц и 60 рисунков. Список литературы содержит 404 источника, из них 66 на русском языке.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность всем соавторам проведенных исследований: сотрудникам сектора биотехнологии, к.б.н. А.П. Савве и сотрудникам лаборатории гербологии; Ж.А.Ширинян, к.б.н.

М.В.Пушие и другим сотрудникам лаборатории массового разведения и применения энтомоакарифагов; к.б.н. И.С. Агасьеной и сотрудникам лаборатории поддержания гос. коллекции энтомоакарифагов; д.б.н. О.Д. Ниязову, д.б.н. В.Г.Коваленкову, а также зам. директора ВНИИБЗР к.б.н. В.Я.Исмаилову и директору ВНИИБЗР академику РАСХН, профессору В.Д.Надыкте за помощь и поддержку в проведении данных исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Молекулярная биология и генная инженерия в практике защиты растений от вредных насекомых

В главе рассматривается практическое применение технологии молекулярных маркеров для целей защиты растений от вредителей. Показано применение ДНК-маркеров для идентификации видов, изучения генетики популяций полезных и вредных видов насекомых, а также мониторинга резистентности вредителей к инсектицидам.

Приводится описание техники трансформации членистоногих для создания трансгенных и паратрансгенных насекомых и их использование в программах биологической защиты растений.

Описывается современное состояние исследований по выращиванию генетически модифицированных (трансгенных) растений. Рассматриваются выгоды и преимущества их возделывания, а также вопросы экологической безопасности генетически модифицированных растений, устойчивых к вредным насекомым.

Глава 2. Материалы и методы

Объект исследования. Объектом исследований явились выборки из популяций различных видов насекомых, представителей четырех отрядов: полужесткокрылые Hemiptera (клопы N czar a viridula, Grophosoma lineatum, Dolicorys baccanim, Eysarcoris incospicmis, Piesodorus ¡ilura/iis, Palomería prasina, Pyrrhocoris apterus, Coreas margínalas, Ewygaster ¡ntegñceps, Perillus bioculalus, Podisus maculiventris)\ жесткокрылые Coleóptera (колорадский жук Leplíno-íarsa decemlineata)\ двукрылые Diptera (муха Ceroxys hortulana)\ чешуекрылые Lepidoptera (яблонная плодожорка, Cydia pomonella\ картофельная минирующая моль Phthorimaea operculella; хлопковая совка Helicoverpa armígera), а также растения картофеля (fíf-защищённые сорта картофеля Супериор Ныолиф («Монсанто», США), Луговской-плюс (Центр «Биоинженерия» РАН), кукурузы (Раундап-устойчивая кукуруза NK 603 RR («Монсанто», США) и сои (Раундап-устойчивая соя сорт Stine 2254 RR («Монсанто», США).

Молекулярно-генетическин анализ.

Основным методом молекулярно-генетических исследований являлась полимеразная цепная реакция (ПЦР). Выделение ДНК из насекомых, семян, проростков и листьев растений, амплификацию ДНК (RAPD-, 1SSR-PCR) и электрофорез в агарозпом геле проводили по протоколам описанным нами ранее [Киль, 2009]. ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Россия) и термоциклере «¡Cycler» (BioRad, США). Во избежание ошибки опыта RAPD- и lSSR-апализ проводили одновременно в одной ПЦР с одним стандартным набором реактивов (Диалат ЛТД, Москва). Сравнение

выборок проводили по воспроизводимым и четко детектируемым ДНК-фрагментам.

SCAR-PCR анализ проводили в 25 мкл реакционной смеси на термоцикле-ре «Терцик» по одной из следующих программ:

- режимы амплификации для 358-промотора, NOS-терминатора, гена актина сои: 3 минуты 30 секунд при 94°С - предварительная денатурация, следующих 40 циклов: 20 секунд денатурация при 94°С, 40 секунд отжиг прай-меров при - 54°С, 60 секунд синтез при 72°С; последний цикл синтеза 3 минуты при 72°С.

- режимы амплификации для генов СР4 EPSPS, лектина сои, зеин-19: 3 минуты при 94°С - предварительная денатурация, следующих 50 циклов: 45 секунд денатурация при 94°С, 45 секунд отжиг праймеров при - 60°С, 25 секунд синтез при 72°С; последний цикл синтеза 10 минут при 72°С.

- режимы амплификации для гена СгуЗА: 10 минут при 94°С - предварительная денатурация, следующих 40 циклов: 30 секунд денатурация при 94°С, 30 секунд отжиг праймеров при - 60"С, 30 секунд синтез при 72°С; последний цикл синтеза 7 минут при 72°С.

Электрофорез продуктов амплификации (SCAR-PCR) осуществляли в 2% агарозном геле (для детекции ГМ-сои и кукурузы) и в 3% агарозном геле (для идентификации Bt-картофеля) при напряженности электрического поля 5В/см.

Визуализацию ампликопов после предварительного окрашивания бромистым этидием проводили в ультрафиолете на трансиллюминаторе ЕСХ-20.М (Vilber Lourmat).

Микросателлитный (SSR-PCR) анализ ДНК популяций насекомых яблонной плодожорки и хлопковой совки проводили в 12,5 мкл реакционной смеси, содержащей 10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 шМ KCl, 3,0 тМ MgCl2, 50 цМ каждого dNTP, 0,4цМ каждого из праймеров, 0,5 U 7'ag^HK полимеразы и 10-50 ng ДНК. SSR-PCR проводили на термоциклере ¡Cycler (BioRad) с предварительной денатурацией (94°С 2 мин) в режиме: денатурация - 94°С 30с, отжиг праймера - 58°С 40с (для Ср2.39\ Ср2.157; HaSSRl; ifaSSRS) и 61°С 40с (для Ср¡.63), элонгация -72°С 40с (35 циклов), конечный синтез - 72°С 3 мин.

Продукты SSR-PCR разделяли в 8% полиакриламидном геле (ПААГ) длиной 20 см, толщиной 1 мм при напряжении 300-400 вольт в течение 4-5 часов.

Статистический анализ данных.

Молекулярно-генетическую структуру описывали по частотам встречаемости в популяциях ДНК-маркеров и проводили сравнительную оценку по критерию хи-квадрат и коэффициенту генетического разнообразия Шеннона. Генетическое разнообразие оценивали по Шеннону с использованием формулы: Н= - £ (р, х In /?,), где pi - частота /-го аллеля в выборке [Chalmers, 1992], а также другим методом - по Nei и Shennon, из пакета компьютерных программ POPGENE version 1.31 (Francis C.Yeh). Уровень ДНК-полиморфизма оценивали как отношение числа полиморфных ДНК-фрагментов к общему числу ДНК-маркеров.

Сравнение средних по выборке проводили по критерию Стыодента, канонический дискриминантный анализ - с использованием общепринятых методов

и пакетов прикладных программ (Statistica 6.0 и SPSS 11.0). Кластерный анализ ПЦР-спектров ДНК проводили методом UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with arithmetical Averages), определение генетических расстояний между генотипами - по Nei и Li [Nei, Li, 1979] из пакета компьютерных программ Treecon [Van de Peer, De Wächter, 1994].

Глава 3. Фенстические маркеры в изучении генетической структуры популяций вредных и полезных насекомых

Рассматривая популяцию с генетической точки зрения, Н.В. Тимофеев-Ресовский и другие исследователи пришли к выводу о необходимости выделения фенетики как отдельного направления в популяционно-генетических исследованиях. Несомненно, использование фенетических маркеров, по сравнению с молекулярными, в популяционных исследованиях обладает рядом преимуществ и, прежде всего, простотой и доступностью для исследователя, но в тоже время имеет ряд существенных ограничений, о которых мы будем говорить ниже.

3.1 Изменчивость фонетической структуры популяций колорадского жука под действием инсектицидов

Целью данного этапа исследований явилось выявление закономерностей изменчивости фенетической структуры популяций колорадского жука в условиях взаимодействия с ^/-картофелем и химическими инсектицидами и разработка на этой основе метода прогноза развития резистентности к /¿/-картофелю по фенетическим маркерам. В этой связи ставилась задача разработать новую систему описания феноформ рисунка переднеспинки колорадского жука.

В настоящее время оценку фенетической структуры популяций колорадского жука Leptinotarsa decemlineala проводят, главным образом, по рисунку переднеспинки взрослых особей в соответствии с методикой, разработанной Фасулати (1986). Однако, по нашим данным, данный подход не учитывает всего многообразия феноформ в популяции и в частности слияние феноформ «А» внизу между собой и с фенокомплексами «Р» и «М». Поэтому мы предложили использовать дополнительно к девяти феноформам (по Фасулати) еще феноком-плексы группы «А», описанные Кохманюк (1982) и новые феноформы, описанные нами впервые: VP; HP; VHP; HY (рисунок 1).

Такой комплексный подход, включающий в себя 17 фенокомплексов, оказался оправданным при анализе ряда популяций колорадского жука Краснодарского края, где наиболее часто встречался именно описанный нами феноком-плекс HP (в среднем примерно 30%) (таблица 1).

Оценка выживаемости под действием стрессового фактора наиболее часто встречаемых фенетических групп насекомых выявила тот факт, что они не являются наиболее устойчивыми к воздействию ßi-картофеля и инсектицидов (лептоцид и дурсбан). Выживаемость особей колорадского жука в условиях пестицидного пресса не коррелировала с исходной частотой их встречаемости в популяциях. Так, например, редко встречаемые насекомые краснодарской популяции фенокомплекса VP являлись наиболее толерантными к инсектицидам (в среднем выживаемость =58,3%), а часто встречаемые феноформы 3 и HP

1Г • уу у

Тип №1 Тип №2 Тип №3

V * •»•у * * V*

Тип №4 Тип №5 Тип №6

V V V V

Тип №7 Тип №8 Тип №9

Рисунок 1 - Основные типы (феноформы) рисунка центральной части переднеспинки имаго колорадского жука (феноформы 1-9 - по Фасулати, 1986; V, Н, УН, У - по Кохманюк, 1982; УР; НР; УНР; НУ - по Киль и др., 2004)

Таблица 1 - Средняя частота встречаемости феноформ в популяциях колорадского жука Краснодарского края, % (2001-2003 гг.)

Феноформа Популяция

краснодарская темрюкская староминская

1 4,7 4,3 5,0

2 3,7 1,2 1,7

3 14,0 10,1 10,3

4 1,0 2,0 1,8

5 2,6 2,0 2,2

6 13,6 13,7 13,2

7 1,2 3,0 2,4

8 0,8 2,4 2,1

9 10,7 13,9 12,0

V 2,2 3,4 1,5

У 4,0 5,0 3,7

УР 1,7 0,2 3,2

НР 27,6* 27,5* 32,1*

НУ 5,5 2,7 3,5

н 4,6 6,5 2,7

УНР 1,4 2,0 2,6

УН 0,1 0,1 0,2

*-достоверно отличается от других феноформ (1фаК1 > 10 5 )

характеризовались невысокой выживаемостью в условиях стресса (в среднем = 12,9; 16,4% соответственно). Это указывало на то, что фенетическая структура популяций колорадского жука определяется не только пестицидным, но и другими стрессовыми факторами окружающей среды. По всей видимости, чувствительность различных феноформ к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций колорадского жука.

В то же время обращала на себя внимание относительная стабильность отклика (примерно одинаковая выживаемость) жуков часто встречаемых феноформ на разные стрессовые воздействия. Несмотря на невысокие показатели устойчивости к инсектицидам, эти фенетические группы насекомых практически одинаково реагировали на различные по своему механизму действия стрессовые факторы. Это наблюдение, в свою очередь, позволило нам сделать следующий вывод о механизмах становления структуры популяций колорадского жука: фенетическая структура популяции колорадского жука определяется наличием и соотношением внутрипопуляционных групп особей, имеющих неспецифическую устойчивость к различным стрессам. Этот вывод подтверждался данными статистической обработки. Результаты анализа показывали, что фенокомплексы 3, 6, 9, НР характеризовались наименьшей дисперсией (о2), которая на порядок, а в отдельных случаях и на два порядка, была ниже, чем у других феноформ. При этом данная закономерность прослеживалась для всех трех исследованных популяций и в течение двух лет испытаний. Вероятно, данные фенетические группы особей характеризуются неспецифической устойчивостью к различным стрессовым факторам внешней среды (засуха, холод, зной и др.), что в конечном итоге и обусловливает их наибольшую представленность в популяциях (специфическая устойчивость к инсектицидам этих феноформ в большинстве случаев ниже среднего).

Становится понятным роль редких феноформ в структуре популяций колорадского жука. Скорее всего, именно эти фенетические группы насекомых являются своего рода резервом генов резистентности, отвечающих за специфическую устойчивость, например, к воздействию пестицидов. Благодаря селективному давлению неблагоприятного фактора эти особи могут выдержать значительный пестицидный пресс и получить дальнейшие преимущества по сравнению с другими особями, что позволяет популяции в целом выжить. В дальнейшем эти, первоначально редкие феноформы насекомых, ставшие впоследствии доминирующими в популяции, могут дать потомство, в котором произойдет расщепление по данному признаку, приводящее в конечном итоге к реверсии популяции к исходной структуре.

Несомненно, интересным представлялась возможность проверить универсальность выявленных закономерностей формирования фенетической структуры популяций на других видах насекомых.

3.2 Фонетическая структура популяций клопа вредная черепашка

В нашей стране популяционные исследования клопа вредная черепашка Ешу^ах1ег \ntegriceps традиционно проводятся на основе феноформ рисунка щитка взрослых особей и в частности в Институте Защиты Растений (Санкт-

Петербург) [Фасулати, 2005]. Некоторые исследователи отмечают адаптивный характер феноформ клопов под действием инсектицидов [Фасулати, 2005; Махоткин, Махоткина, 2006]. В то же время существующая система описания фенетической структуры популяций базируется только на пяти фенокомплек-сах, что с нашей точки зрения явно недостаточно и требовало усовершенствования. При этом важно было определить, носят ли выявленные выше закономерности формирования фенетической структуры популяций универсальный характер, то есть какую роль в адаптивности популяции играют редкие и часто встречаемые феноформы у других видов насекомых, а именно клопа вредная черепашка.

В рамках указанной проблемы на данном этапе исследований ставилась задача разработать новую систему описания фенооблика популяций клопа вредная черепашка, изучить влияние условий года, географического положения и химических инсектицидов на фенетическую структуру популяций.

Новая система описания фенетической структуры популяций клопа вредная черепашка

Нами была разработана новая система описания фенооблика популяций клопа вредная черепашка, которая так же, как и система Фасулати (2005), базировалась на сочетании признаков рисунка и окраски частей тела насекомого. Предложенная нами система описания включала в себя 15 фенокомплексов щитка и 10 морфотипов брюшка (таблицы 2 и 3).

Для апробации новой системы описания феноформ мы проанализировали фенетическую структуру двух выборок краснодарской популяции клопа вредная черепашка. Данные по частотам встречаемости различных феноформ в популяции клопа вредная черепашка приведены в таблице 4.

Можно заметить, что практически все фенотипические классы предлагаемой системы описания были представлены в обеих выборках, кроме фенокомплексов щитка №1 и №3. Однако это не исключало их присутствие при описании других популяций, что в действительности нами и было обнаружено в дальнейшем при фенетическом анализе ставропольской популяции [Киль и др., 2007].

В целом фенооблик обеих выборок, ВНИИБЗР и Елизаветинской (по щитку и брюшку) был одинаков, о чем свидетельствовал и статистический анализ данных распределений (х2фап. = 0, 9 и 1,9, что меньше х2 os)- Это позволяло заключить, что данные выборки принадлежали, вероятно, к одной популяции, а предлагаемая нами система описания феноформ вполне пригодна для оценки изменчивости фенетической структуры популяции клопа вредная черепашка и изучения популяционных процессов этого вида насекомых.

Таблица 2- Классификация феиоформ щитка клопа вредная черепашка

№ феноком- Признак

Окраска щитка Контрастность рисунка

1 Желтый Контрастный

2 Желтый Слабый

3 Желтый без рисунка

4 Коричневый Контрастный

5 Коричневый Слабый

6 Коричневый без рисунка

7 Бурый Контрастный

8 Бурый Слабый

9 Бурый без рисунка

10 темный, серо- Контрастный

11 темный, серо- Слабый

12 темный, серо- без рисунка

13 темно-бурый Слабый

14 темно-бурый без рисунка

15 Черный без рисунка

Таблица 3 - Классификация феноформ брюшка клопа вредная черепашка

№ Признак

феноком- Окраска брюшка Наличие рисунка

1 Оранжевое Рисунок присутствует

2 Оранжевое Без рисунка

3 Бурое Рисунок присутствует

4 Бурое Без рисунка

5 Желтое Рисунок присутствует

6 Желтое Без рисунка

7 темно-серое Рисунок присутствует

8 темно-серое Без рисунка

9 Коричневое Рисунок присутствует

10 Коричневое Без рисунка

Таблица 4 - Частота встречаемости феноформ в краснодарской популяции клопа вредная черепашка, % * (2006 г.)

Фено- Выборка из популяции

комплекс ВНИБЗР Елизаветинская ВНИБЗР самки ВНИБЗР самцы Елизаветинская самки Елизаветинская самцы

Щиток

1 0 0 0 0 0 0

2 1,0 0,5 0 2,0 0,5 0,5

3 0 0 0 0 0 0

4 23,0 20,1 16,1 30,1 14,2 28,4

5 9,7 9,2 6,5 13,1 6,4 12,2

6 7,5 9,2 7,7 7,2 8,7 9,6

7 2,6 2,3 0 5,2 0,5 4,6

8 7,8 8,7 5,2 10,5 5,5 12,2

9 5,5 5,8 4,5 6,5 6,0 5,6

10 13,0 14,0 11,0 15,0 15,1 12,7

11 13,6 13,5 24,5 2,6 20,6 5,6

12 10,7 10,4 18,1 3,3 15,6 4,6

13 1,3 1,9 1,9 0,7 1,8 2,0

14 2,0 1,4 1,3 2,6 1,4 1,5

15 2,3 2,2 3,2 1,3 3,7 0,5

х2 0,9 46,2** 29,7**

Брюшко

1 2,9 3,1 1,9 3,9 2,8 3,6

2 2,6 1,7 0,6 4,6 0 3,6

3 20,8 17,1 12,3 29,4 9,2 25,9

4 24,7 22,9 14,8 34,6 15,6 31,0

5 17,5 17,1 33,5 1,3 28,9 4,1

6 1,9 2,7 1,9 2,0 3,7 1,5

7 .1,0 0,7 1,9 0 1,4 0

8 3,6 2,7 0 7,2 0 5,6

9 19,2 25,5 29,7 8,5 35,3 14,7

10 5,8 6,5 3,2 8,5 3,2 10,2

х2 1,9 71,8** 55,4**

* - % от общего количества всех особей в выборке, для самцов и самок -

от общего количества самцов и самок соответственно;

** - различия достоверны (х2фпкт>X2 05)

Изменчивость фенетической структуры популяций клопа вредная черепашка под влиянием различных факторов внешней среды:

А. Ггографическое положение

С использованием разработанной нами системы описания феноформ окраски и рисунка имаго клопа вредная черепашка был проведен сравнительный анализ фенооблика краснодарской и ставропольской популяций насекомых. При описании феноформ щитка выявились статистически значимые отличия в фенетической структуре популяций. Между самцами и самками наблюдали статистически значимые отличия. При этом наиболее значимые отличия между полами наблюдали по феноформам брюшка у обеих популяций (%2 факт> х2 оО-Одновременно с этим желтое брюшко с узором (фенокомплекс № 5) встречалось почти исключительно у самок. Кроме того, самки с феноформами брюшка № 5 и 9 встречались наиболее часто (свыше 60 % от всех самок).

Полученные данные указывали на сцепленность генов окраски и рисунка имаго клопов с полом. Вполне вероятно, что желтый цвет брюшка у самок клопа вредная черепашка играет важную роль при спаривании, привлекая особей противоположного пола. Так ранее установлено, что желтый цвет является привлекающим фактором для многих видов насекомых, в том числе и клопов. Данный факт известен энтомологам давно и в настоящее время используется при изготовлении цветоловушек для защиты садовых насаждений [Васильева, 2006].

Таким образом, фенетическая структура популяций клопа вредная черепашка подвержена изменчивости в зависимости от географического положения популяции. Отмечены статистически значимые отличия в фенооблике краснодарской и ставропольской популяций, а также сцепление генов рисунка и окраски клопов с полом. Это указывало на то, что исследуемые группы особей относятся к разным популяциям насекомых (этот вывод подтверждался также данными молекулярно-генетических исследований, глава 4 диссертации), а изучение популяционных процессов по фенетическим маркерам необходимо проводить с учетом половых различий.

Б. Инсектициды

Далее проводили оценку изменчивости фенетической структуры популяции клопа вредная черепашка под действием инсектицидов разного спектра действия, Би-58 Новый и суми-альфа. Влияние инсектицидов приводило к значительным изменениям в фенетической структуре популяции. При этом характер изменчивости фенетической структуры зависел от природы инсектицида.

Оценка выживаемости под действием инсектицидов наиболее часто встречаемых фенетических групп насекомых выявила также тот факт, что они не являются наиболее устойчивыми к воздействию стрессового фактора. Выживаемость клопов вредной черепашки в условиях пестицидного пресса не коррелировала с частотой их встречаемости в популяции. Таким образом, чувствительность насекомых различных феноформ к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяции клопа вредная черепашка, как указывали некоторые авторы [Фасулати, 2005; Беньковская и др., 2004; Рославцева, 2005], так как насекомые редких феноформ, как правило, имеют

более высокую толерантность к инсектицидам. Это согласуется с нашими исследованиями на колорадском жуке [Киль, Головатенко, 2006].

Кроме того, обращала на себя внимание относительная стабильность отклика (примерно одинаковая выживаемость) клопов часто встречаемых фено-форм на разные стрессовые воздействия. Несмотря на невысокие показатели устойчивости к инсектицидам, часто встречаемые фенетические группы насекомых практически одинаково реагировали на различные по механизму действия стрессовые факторы, что наглядно демонстрировали результаты статистического анализа: наиболее часто встречаемые в популяции феноформы характеризовались наименьшей дисперсией (о2), которая на порядок, а в отдельных случаях и на два порядка, была ниже, чем у других феноформ.

Таким образом, полученные данные подтверждают сделанный нами ранее (на колорадском жуке) вывод о механизмах становления структуры популяций насекомых и универсальность данных механизмов адаптивности популяций насекомых к стрессовым факторам внешней среды: фенетическая структура популяции определяется наличием и соотношением внутрипопуляционных групп особей, имеющих неспецифическую устойчивость к различным стрессам.

В то же время для достоверности оценки резистентности популяции по феноформам необходимо, помимо наличия сцепления генов резистентности с генами рисунка и окраски, соблюдение следующего важного условия: парати-пическая составляющая признака должна быть, по сравнению с генотипической компонентой, относительно невысокой. Этой части исследований посвящен следующий раздел.

В. Условия года

Несомненный интерес представляло изучение влияния условий года на фенетическую структуру популяции клопа вредная черепашка. Основной целью данного этапа исследований было определить величину паратипической компоненты признака «рисунка и окраски» клопов. Результаты оценки фенооблика популяции клопа вредная черепашка в зависимости от условий года приведены в таблице 5.

Необходимо отметить, что погодные условия были типичными для г. Краснодара только в 2006 году, что подтверждалось данными 2005-2006 гг. -фенетическая структура популяции в эти годы в целом не менялась. Наоборот, погодные условия 2007 года (жаркие и засушливые весна и лето), когда температура уже в мае достигала 40°С и выше и держалась на протяжении четырех-пяти месяцев при практическом отсутствии осадков, привели к существенным изменениям в фенетической структуре популяции клопа вредная черепашка 2007-2008 гг. Экстремальные погодные условия 2007 года привели краснодарскую популяцию клопа вредная черепашка к значительной элиминации, так что это вызвало депрессию численности клопов в 2008 году, и нам с трудом удалось собрать материал для фенетического анализа. Это драматично отразилось и на фенетической структуре популяции 2008 года, что подтверждали данные статистической обработки (таблица 5).

Таблица 5 - Частота встречаемости феноформ краснодарской популяции клопа вредная черепашка в разные годы исследований (молодые особи)*, %

Фено-комп- Самки Самцы

Лекс 2006 2007 2008 2006 2007 2008

Щиток

1 0 1,1 0 0 0 5,0

2 0,2 4,1 2,4 1,3 1,8 1,4

3 0 4,0 0 0 2,4 0

4 15,2 24,7 25,0 29,3 21,1 36,6

5 6,5 ¡7,7 33,9 12,7 15,1 21,7

6 8,2 10,8 10,5 8,4 13,6 5,0

7 0,3 4,5 12,1 4,9 7,3 14,9

8 5,4 3,9 6,5 11,3 6,7 4,0

9 5,3 2,2 0,8 6,1 2,8 0,5

10 13,1 10,0 4,8 13,8 13,1 2,0

11 22,5 8,4 3,2 4,1 10,8 3,0

12 16,8 1,8 0 3,9 0,5 0

13 1,8 3,9 0,8 1,3 3,2 4,0

14 1,4 2,4 0 2,1 0,9 1,4

15 3,5 0,5 0 0,9 0,7 0,5

х2 43,9** 78,2** 15,1 36,8**

Брюшко

1 2,4 0,5 0 3,7 0,9 0

2 0,3 0 0 4,1 0,8 0

3 10,8 5,2 0 27,7 14,4 2,3

4 15,2 10,5 0 32,8 20,0 2,3

5 31,2 19,7 81,5 2,7 9,9 19,8

6 2,8 4,2 4,0 1,8 5,3 12,9

7 1,7 0,2 0 0 0,2 0,5

8 0 0,5 0 6,4 1,0 0

9 32,5 44,8 9,7 11,6 29,2 24,3

10 3,2 14,4 4,8 9,3 18,3 37,6

х2 18,0** 65,7** 31,7** 106,0**

*- общее число особей в 2006 г. - 723; 2007 г. - 871; 2008 г. - 326;

** - есть статистически значимые различия между двумя распределения-

ми, по отношению к 2006 г. (х факт > X таб )

Сравнительный анализ влияния различных факторов внешней среды на фенетическую структуру популяции клопа вредная черепашка приведен в таблице 6.

Таблица б - Влияние различных факторов на фенетическую структуру популяции клопа вредная черепашка (значения %2)

Фактор Самки Самцы

Щиток Брюшко Щиток Брюшко

Географическое положение 50,4* 15,1* 31,5* 24,6*

Условия года 43,9* 18,0* 15,1 31,7*

Инсектицид Би58 Новый 36,3* 36,3* 31,9* 13,7

Инсектицид суми-апьфа 30,5* 30,5* 16,2 51,0*

* * X факт — X 05

Можно заметить, что влияние условий года в некоторых случаях было даже более значительным, чем влияние инсектицидов. Понятно, что сила влияния фактора будет меняться в зависимости от меняющихся условий внешней среды, природы инсектицида и кратности обработок.

Таким образом, можно заключить, что паратипическая компонента признака «рисунок и окраска» щитка и брюшка клопа вредная черепашка весьма значительна, что ставит под вопрос возможность использования фенетических маркеров при мониторинге резистентности популяций этого вредителя к инсектицидам. По-видимому, морфологический анализ популяций клопа вредная черепашка и построенная на нем система мониторинга резистентности к инсектицидам не может являться абсолютно достоверной ввиду наличия значительной модификационной изменчивости фенетических маркеров в меняющихся условиях внешней среды. Поэтому прогноз резистентности по феноформам рисунка имаго или другим морфологическим критериям можно рассматривать только лишь в качестве предварительной, грубой оценки, как мы уже отмечали ранее на колорадском жуке [Киль, Головатенко, 2006], и при необходимости можно дополнить проведением молекулярно-генетического анализа с использованием в частности ЛАРО-маркеров.

3.3 Генетический контроль феноформ окраски щитка и псреднеспинки клопа псриллюса Северо-Американский хищный клоп периллюс Реп///«- Ыоси1а1ш -специализированный энтомофаг колорадского жука, являлся объектом пристального внимания ученых на протяжении многих десятилетий XX века. Попытки его акклиматизации во многих странах не дали положительных результатов. В мае 2008 года при обследовании зарослей амброзии полын-нолистной (на территории ВНИИБЗР), оставленной на поле люцерны в качестве резервата амброзиевого листоеда Zygograma .чи1игаИ.ч, были обнаружены многочисленные личинки периллюса (от 10 до 20 экз/м2 ), активно питающиеся гербифагом. Это предопределило большой интерес к хищнику,

так как вид, очевидно, самостоятельно акклиматизировался и распространился в агроэкосистемах юга России.

В краснодарской популяции клопа Р. Ыоси1а1ш нами были выделены три четко различающихся по окраске щитка и переднеспинки между собой фено-формы: красно-черная, желто-черная и бело-черная. В 2009 г. популяция перил-люса была представлена самой многочисленной красно-черной феноформой -до 70% популяции, бело-черной и оранжево-черной - до 15% каждая. Данный фенетический полиморфизм может явиться хорошим инструментом в дальнейших популяционных исследованиях этого вида насекомых. Однако использование феноформ для этих целей должно базироваться на знании генетики этого признака, его наследуемости и изменчивости.

Целью данного этапа исследований являлось изучение молекулярно-генетического полиморфизма популяции клопа периллюса по признаку «окраска щитка» насекомого. В этой связи ставилась задача провести ПЦР анализ трех исследуемых внутрипопуляционных групп особей.

В общей сложности было испытано 25 ЯДРО- и 15 185Р1-праймеров. Наиболее четкие отличия между исследуемыми группами насекомых наблюдали только по ЛАРО-праймеру ОРЕ07, что подтверждалось данными кластерного анализа. Наблюдали практически полное разделение ЯАРЭ-фенотипов на три кластера, соответственно признаку окраски щитка. Это указывало на наличие сцепления отдельных ДНК-маркеров с генами, контролирующими окраску щитка насекомого. В частности ЯАРО-локус размером 750 пар нуклеотидов (п.н.) наблюдался исключительно у белых особей, тогда как локусы 370 и 390 п.н. -только у клопов с красным щитком.

Таким образом, результаты проведенных исследований указывали на наличие генетического контроля данного признака, что, в свою очередь, делает возможным использование феноформ окраски в дальнейших популяционных исследованиях Р. Ыоси1а1ш.

Глава 4. Молекулярно-гснетнческнй анализ популяций вредных насекомых по ДНК-маркерам

Тестирование генетического разнообразия в популяциях по ДНК-маркерам позволяет проводить мониторинг их состояния вне зависимости от средовых эффектов и видовых особенностей насекомых. Современные методы молекулярно-генетического анализа позволяют оценить уровень ДНК-полиморфизма популяций, внутрипопуляционное генетическое разнообразие, установить степень генетического сходства между видами, популяциями и отдельными индивидуумами непосредственно на генетическом уровне, в отдельных случаях оценить гетерозиготность популяции, изучить генетическую изменчивость по отдельным локусам и аллелям генов.

В данной главе диссертации приводятся результаты анализа ДНК-полиморфизма и молекулярно-генетической структуры различных популяций некоторых наиболее сельскохозяйственно значимых вредных видов насекомых: колорадского жука, клопа вредная черепашка, картофельной минирующей моли, хлопковой совки и яблонной плодожорки. При этом проводили ПЦР анализ как

природных, так и лабораторных популяций, а также насекомых из энтомологических коллекций, с использованием различных типов ДНК-маркеров (RAPD-, ISSR- и SSR-PCR). Так с использованием метода RAPD-PCR нами был исследован ДНК-полиморфизм различных популяций клопа вредная черепашка и других представителей отряда полужесткокрылых (Hemiptera).

4.1 ДНК-полиморфизм различных видов клопов (Ilcmiptcra)

Всего было проанализировано 127 особей из различных таксонов. В целом по всем изученным видам насекомых с помощью праймера ОРАОб было выявлено от 16 до 35 RAPD-маркеров; с помощью праймера GT09 - от 12 до 27. Среднее число ампликонов на особь по праймерам ОРАОб и GT09 колебалось в зависимости от вида в пределах 5,6 -s- 11,7; и 4,2 4- 13,5 соответственно. Средний уровень полиморфизма составил 92,4 % (ОРАОб) и 86,2 % (GT09). Размеры продуктов амплификации варьировали от 100 до 2300 (ОРАОб) и от 170 до 2700 пар нуклеотидов (GT09).

По наиболее часто встречаемым и воспроизводимым ДНК фрагментам для обоих праймеров вместе (по 58 RAPD-маркерам) был проведен кластерный анализ (метод UPGMA) и канонический дискриминантный анализ (КДА). Все особи четко распределились в отдельные кластеры в соответствии с их видовой принадлежностью. При этом в самостоятельный кластер выделились особи клопов Pyrrhocorix aptems и Coreas marg'malvs, принадлежащих к семействам, отличным от клопов-щитников (Pentatomidae). КДА подтвердил результаты кластерного анализа и позволил выявить генетическое сходство клопов вредной черепашки с клопами щитниками более отчетливо (рисунок 2).

Рисунок 2 - Дискриминация девяти видов клопов в пространстве первой и второй дискриминантных функций

Генетические расстояния шести исследуемых видов клопов-щитников до центроида составляли 9,4 -И2,7 (у клопа вредная черепашка - 12,0), тогда как представители других семейств отстояли от центроида щитников на расстоянии 13,9 (Coreus marginatus, Coreidae) и 17,6 (Pyrrhocoris apterus, Pyrrhocoridae).

Таким образом, на основании проведенных исследований нам представляется необходимость в более детальном изучении таксономической принадлежности клопа вредная черепашка Eurygaster inlegriceps Put. и других представителей семейства Scutelleridae. Этот вид, по всей вероятности, скорее можно отнести к семейству Pentatomidae, о чем ранее высказывались и другие исследователи [Бей-Биенко и др., 1955].

4.2 ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие различных видов чешуекрылых (Lepidoptera)

В данном разделе диссертации приводятся данные по молекулярно-генетической структуре различных видов чешуекрылых: картофельной минирующей моли, хлопковой совки и яблонной плодожорки.

SSR-аиализ различных географических популяции яблочной плодожорки

Проведение молекулярно-генетического анализа популяций яблонной плодожорки С. pomonella с использованием кодоминантных маркеров, таких как микросателлиты (SSR, simple sequence repeat), стало возможным благодаря исследованиям последних лет [Zhou et al, 2005; Franck et al, 2005]. Так сконструированные французскими учеными для яблонной плодожорки SSR-праймеры [Franck et al, 2005] позволили проанализировать молекулярно-генетическую структуру популяций С. pomonella по микросателлитным локусам во Франции [Franck et al, 2007] и Чили [Fuentes-Contreras et al, 2008].

Целью данного этапа работы явилось изучение ДНК-полиморфизма и генетического разнообразия различных географических популяций яблонной плодожорки из России и Украины по трем микросателлитным локусам Ср1.бЗ\ Ср2.39 и С,р2.157 [Franck et al, 2005].

Объектом исследований явились выборки из популяций различных географических популяций яблонной плодожорки из Украины (две выборки: гг.Киев и Мелитополь) и России (четыре выборки: гг. Краснодар (Учхоз «Кубань»), Ейск («Колледж Ейский»), Ставрополь (НПК «Незлобнинский») и Санкт-Петербург). В ПЦР использовали три пары микросателлитных праймеров Ср1.63 (мотив повтора (GA)l9), Ср2.39 (мотив повтора (ТС)4ЛС(ТС)П) и Ср2.157 (мотив повтора (GA)I0).

Всего было исследовано 120 насекомых (по 20 особей из каждой выборки). Наиболее высокое соотношение нулевых аллелей (более 50%) было отмечено для локуса Ср2.157, поэтому он был исключен из дальнейшего анализа.

Результаты Г1ЦР анализа ДНК яблонной плодожорки по двум микросателлитным локусам приведены на рисунке 3.

Можно заметить, что основная часть ДНК-фрагментов для локуса С.р2.39, по сравнению с Ср1.63, смещена несколько в более высокомолекулярную часть спектра. Размеры детектируемых ДНК-фрагментов варьировали от 100 до 370 пар нуклеотидов (п.н.) для Ср1.63 и от 100 до 480 п.н. - для Ср2.39. По всем

Рисунок 3 - 88К-фенотипы яблонной плодожорки. Электрофореграмма ампли-конов С. ротопеПа в 8% ПААГ (ПЦР анализ по двум микросателлитным локу-сам Ср1.63 и С.р2.39).М-маркеры молекулярных масс, пар нуклеотидов (п.н.).

популяциям в целом оба локуса были высоко полиморфны (уровень полиморфизма 100%). Среднее количество аллелей на локус по всем популяциям составило 2,3 и 3,2 для Ср1.63 и Ср2.39, соответственно. Доля гетерозигот в среднем для обоих локусов была равна 0,57 (таблица 7).

ПЦР анализ насекомых из Украины и России выявил значительные отличия в молекулярно-генегической структуре исследуемых популяций C.pomonella. Среди выборок из разных стран наиболее гетерогенны были выборки из Мелитополя, Киева и Краснодара. Наиболее высокий генетический полиморфизм и генетическое разнообразие наблюдали в выборке из Мелитополя (Украина). Эта популяция характеризовалась наибольшим числом аллелей на особь (Аг = 3,2 - для локуса С.р1.бЗ и Аг = 7,3 для - Ср2.39), наибольшей долей гетерозигот, отсутствием нулевых гомозигот и наиболее высоким генетическим разнообразием (по двум локусам h=0,18 и 1=0,29). В свою очередь, наименьшим генетическим разнообразием характеризовались выборки из Ейска и Ставрополя (h=0,04 и 0,03; 1=0,08 и 0,07 по двум локусам, соответственно). Эти же выборки характеризовались наименьшим количеством выявляемых аллелей в среднем на локус и на одну особь.Полученные нами данные по генетическому полиморфизму популяций C.pomonella из России и Украины в целом сопоставимы с полученными ранее для популяций Франции, Италии, Армении и Чили (Franck et al., 2007). В работе французских исследователей наблюдали также относительно

Таблица 7 - ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие в различных выборках из географических популяций С.ротопеПа по двум микросателлитным

локусам

По- Выборка По всем популяциям

Локус каза тель Краснодар Ейск Ставрополь С.Петербу рг Киев Мелитополь

Яг 110-320 110-310 110-160 100-260 100-370 100-350 100-370

А 20 11 7 15 30 24 43

Аг 2,9 1,7 1,0 1,8 3,0 3,2 2,3

Ср. 1.63 N 0,10 0 0,20 0,15 0,10 0 0,09

т 0,80 0,45 0,10 0,60 0,65 0,80 0,57

ь 0,13±0,14 0,07±0,1 0,06±0,07 0,1±0,1 0,11 ±0,07 0,14±0,12* 0,11 ±0,07

I 0,21±0,21 0,13±0,17 0,11±0,14 0,19±0,16 0,21 ±0,13 0,24±0,18* 0,21 ±0,11

Бг 100-460 190-240 200-250 100-460 100-480 100-480 100-480

А 29 7 16 16 24 25 45

Аг 4,1 0,9 1,1 1,3 4,3 7,3 3,2

Ср. 2.39 N 0,05 0,40 0,70 0,25 0,05 0 0,24

т 0,75 0,20 0,20 0,45 0,80 1,00 0,57

и 0,12±0,Ю* 0,02±0,05 0,02±0,03 0,05±0,08 0,11±0,12* 0,20±0,15* 0,10±0,07

I 0,22±0,17* 0,05±0,10 0,04±0,07 0,10±0,14* 0,19±0,19* 0,31±0,23* 0,19±0,10

По всем и 0,12±0,12* 0,04±0,08 0,03±0,08 0,07±0,09* 0,11±0,10* 0,18±0,14* 0,10±0,07

локусам I 0,22±0,18* 0,08±0,14 0,07±0,11 0,13±0,15* 0,20±0,17* 0,29±0,21 * 0,20±0,11

5г- размеры ДНК-фрагментоп, ii.ii. (пар нуклеотидов)

А - число аллелей

Аг - обогащенность аллелями (аНеНс пЫтей?) - средняя частота аллелей па особь

N - доля пулевых гомозигот

Ж - доля гстерозигот

Ь - генетическое разнообразие по Ые1 (± стандартное отклонение)

1 - индекс Шеннона (± стандартное отклонение)

*-достоверно отличается от ставропольской выборки (1факт > Ю5)

более высокое число аллелей и «обогащенность» аллелями для локуса Ср2.39 по сравнению с Ср1.63 для всех исследуемых популяций (в 1,5-2 раза у популяций из европейских стран). Кроме того, анализ данных по всем исследуемым 27 выборкам так же, как и в нашей работе, выявил значительную (более 20%) долю нулевых аллелей по локусу Ср2.157.Снижение генетического полиморфизма и гетерогенности популяций С.ротопеПа из России (выборки из Ейска, Ставрополя и Санкт-Петербурга), вероятно, было связано с большей пестицидной нагрузкой на фруктовые сады. Так в частности нам известно, что популяции из Киева и Мелитополя, практически не подвергались инсектицидным обработкам. За последние годы в этих садах проводили от 1 до 5 обработок, тогда как, например, в Ейском районе (фруктовый сад хозяйства «Колледж Ейский») и в Ставрополе (НПК «Незлобнинский») количество обработок против вредителей ежегодно достигало 10-12. В то же время полученные данные можно рассмат-

ривать лишь как предварительные и требующие более детальной проверки на генетически однородном биоматериале (выборки из одной популяции, но с разными, показателями резистентности к инсектицидам).

На основании полученных данных по частотам встречаемости аллелей нами проведена оценка генетического сходства исследуемых популяций. Генетическая идентичность и генетические расстояния между исследуемыми географическими выборками из популяций яблонной плодожорки приведены в таблице 8.

Таблица 8 - Генетическая идентичность и генетические расстояния [noNei (1978) Genetics 89:583-590]

Выборка Киев Мелитополь Ставрополь С.Петербург Краснодар Ейск

Киев ***** 0.9874 0.9965 0.9971 0.9941 0.9966

Мелитополь 0.0126 * * * * % * 0.9829 0.9857 0.9892 0.9815

Ставрополь 0.0035 0.0029 0.0173 ****** 0.9987 0.9951 1.0000

С.Петербург 0.0144 0.0013 ****** 0.9943 0.9991

Краснодар 0.0059 0.0109 0.0049 0.0057 ****** 0.9949

Ейск 0.0034 0.0186 0.0000 0.0009 0.0052 ******

генетическая идентичность (над диагональю) и генетические расстояния (под диагональю)

Можно заметить, что наиболее близки в генетическом отношении оказались выборки из Ейска и Ставрополя (генетическая идентичность по = 1,0), что, вероятно, указывает на принадлежность этих выборок к одной популяции. Это также наглядно демонстрируют данные кластерного анализа (рисунок 4), где обе эти выборки входили в один кластер.

Наиболее близкой к ним с генетических позиций, несмотря на географическую удаленность, была выборка С.ротопеПа из Санкт-Петербурга, а наиболее удаленной от них в генетическом отношении была выборка насекомых из Мелитополя.

Таким образом, описана молекулярно-генетическая структура ряда популяций яблонной плодожорки из России и Украины по микросателлитным локу-сам. Обнаружены значительные отличия в молекулярно-генетической структуре между популяциями как по числу аллелей на локус, степени гетерозиготности, так и по внутрипопуляционному генетическому разнообразию. Данные различия, вероятно, связаны не только с географическим положением, но и с пести-цидным прессом, которому подвергались популяции насекомых. Определены

0.1650')

0.00016

Киев

Ставрополь Ейск

С.Петербург

Краснодар Мелитополь

Рисунок 4 - Дендрограмма по №¡'5 (1978). Генетические расстояния: метод иРвМА

коэффициенты генетического сходства и генетические расстояния между исследуемыми выборками насекомых. Снижение гетерогенности отдельных популяций, по-нашему мнению, может быть связано с большим количеством пестицид-ных обработок в этих садах.

Глава 5. ДНК-маркеры резистентности популяций вредителей к инсектицидам

Исследование насекомых-вредителей молекулярно-генетическими методами позволяет изучать механизмы изменчивости структуры популяций под влиянием стрессовых факторов внешней среды, в том числе инсектицидов, а также приблизить нас к пониманию механизмов развития резистентности к инсектицидам непосредственно на генетическом уровне. В данной главе диссертации представлены результаты оценки влияния инсектицидов и условий года на молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяции яблонной плодожорки и клопа вредная черепашка.

Проблема поиска ДНК-маркеров резистентности к инсектицидам по сути связана с проблемой идентификации генотипов (в нашем случае резистентных насекомых) по фенотипу (RAPD-фенотипу). Попытки идентификации резистентных к инсектицидам генотипов методом RAPD-PCR были предприняты для разных видов насекомых [Сидоренко и др., 2000; Баринов и др., 2005; Guerrero et al, 1997].

Для молекулярно-генетического анализа исследуемой популяции насекомых прежде всего необходимо иметь две группы особей, близких в генетическом отношении, но различающихся по признаку «резистентность к инсектициду». При этом выбор исходного материала для поиска молекулярных (ДНК) маркеров резистентности к инсектицидам базируется на отборе резистентных

генотипов в ходе лабораторной селекции в ряду нескольких поколений поли-вольтинных видов насекомых при постоянном воздействии селектирующего фактора (инсектицида).

В то же время для моновольтинных видов, дающих в природе только одно поколение в год или в несколько лет, использование такого подхода пе представляется возможным, поскольку получение резистентных генотипов в лаборатории предполагает посемейный отбор в ряду как минимум 10-20 поколений, что, в свою очередь, требует многолетней работы. При этом исходные особи насекомых должны быть чувствительными к инсектициду. Кроме того, при доминантном характере наследования признака гетерозиготные самки (самцы) при скрещивании будут снова давать расщепление по данному признаку.

В этой связи нами был использован новый подход к отбору резистентных к инсектицидам генотипов. Он не требует проведения многоступенчатого, в ряду нескольких генераций, процесса селекции и постоянного посемейного отбора особей, резистентных к инсектициду. Предлагаемый нами подход заключается в том, что выборку из природной популяции обрабатывают определенной концентрацией инсектицида и наблюдают динамику смертности насекомых, отбирая при этом особей погибших первыми (чувствительные) и погибших последними, или оставшихся в живых, в зависимости от используемой концентрации инсектицида (устойчивые). При этом количество отобранных особей должно быть не более 10% от объема выборки. Кроме того, исследуемая популяция насекомых должна находиться в постоянном взаимодействии с инсектицидами и иметь высокий показатель (уровень) резистентности, что априори предполагает наличие резистентных генотипов в исследуемой выборке. Данный подход позволил нам отобрать резистентные к инсектицидам генотипы из природной популяции моновольтинного вида - клопа вредная черепашка Е. integr¡ceps.

С использованием имеющегося у нас набора ЯАРО-праймеров нами было получено 280 ДНК-маркеров, но только по восьми из них найдены отличия между двумя группами насекомых, а наиболее характерные - по двум ДНК-фрагментам (рисунок 5).

Так устойчивые к инсектициду особи характеризовались более высокой частотой встречаемости ДНК-маркера ОРА18/520, а также наличием маркеров ОРА07/410 и ОРА06/470 при отсутствии таковых у чувствительных особей. В свою очередь для чувствительных особей было характерно 100%-ное присутствие маркера ОРА06/430 при практическом отсутствии его у устойчивых особей и более высокая частота встречаемости маркеров ОРА 18/400, ОРА07/470, ОРА07/450. Наиболее характерные различия между двумя выборками наблюдали по праймеру ОРАОб (ЯАРб-маркеры 470 и 430 п. п.).

Можно было заключить, что устойчивость/чувствительность к инсектициду Би-58 определялась в данном случае присутствием двух главных ЯАРЭ-локусов, по которым отличались конкретные генотипы. Присутствие одного из маркеров, как правило, сопровождается отсутствием другого, что, вероятно, указывает на существование определенной взаимосвязи между маркируемыми ло-кусами. Более того, вполне вероятно, что исследуемый признак контролируется большим числом генов и маркируется соответственно большим числом ДНК-

470 п.н

Рисунок 5 - ЯАРО-фенотины клопов вредной черепашки, различающихся чувствительностью к инсектициду Би-58 (праймер ОРАОб). Дорожки: 1-8 - чувствительные особи; 9-17-устойчивые особи. М - Маркеры молекулярных масс ХРзН)

фрагментов. В целом влияние инсектицида Би-58 Новый на молекулярно-генетическую структуру и гетерогенность краснодарской популяции клопа вредная черепашка было весьма существенным. Оценка по наиболее значимым ЯАРО-маркерам между двумя исследуемыми выборками насекомых (чувстви-тельные/устойчивые)показала, что коэффициент генетического сходства между ними был незначителен и составил 0,61 (по 1978). Важно отметить также, что наблюдаемое генетическое разнообразие клопов в резистентной выборке было (так же, как и для резистентной популяции яблонной плодожорки) достоверно меньше, чем у чувствительных особей (таблица 9). Это вполне объяснимо, так как действие инсектицида ведет к элиминации чувствительных особей, а, следовательно, и к снижению гетерогенности популяции в целом, выявляемой в частности по отдельным ДНК-локусам.

Таким образом, влияние инсектицида Би-58 Новый на клопов вредной черепашки сопровождается изменениями в молекулярно-генетической структуре и снижением генетического разнообразия популяции. Поиск ДНК-маркеров резистентности к инсектицидам у моновольтинных видов природных популяций вредителей, постоянно взаимодействующих с инсектицидами, рекомендуется проводить с использованием предлагаемого нами подхода. ЯАРО-метод позволяет оценить различия по чувствительности к инсектицидам у клопа вредная черепашка и выявить резистентные к инсектицидам генотипы.

В то же время из-за низкой воспроизводимости ЯАРО-маркеров к их использованию для целей мониторинга резистентности необходимо подходить с осторожностью. Чтобы избежать ошибки опыта эксперименты необходимо ставить в нескольких аналитических повторностях, а сравнительный анализ ДНК проводить с одним набором реактивов, на одном амплификаторе, в одной ПЦР. Кроме того, для большей репрезентативности необходимо последующее

Таблица 9 - Генетическое разнообразие и частота встречаемости отдельных ЯАРЭ-локусов в выборках клопов вредной черепашки, различающихся чувствительностью к инсектициду Би-58

RAPD-локус Чувствительные Устойчивые

ОРА18/520 0.25 0,50

ОРА18/450 0,50 0,06

ОРА07/470 0,25 0,10

ОРА07/450 0,21 0,06

ОРА07/430 0,29 0

ОРА07/410 0 0,34

ОРА06/470 0 1,0

ОРА06/430 1,0 0,03

Генетическое разнообразие по Nei (h ± а) 0,25 ±0,21 0,17 ± 0,19*

Индекс Шеннона (I ± а) 0,37 ±0,31 0,28 ± 0,26

*- t<j)aKT-~to5 - достоверно отличаются от чувствительных

преобразование RAPD- в SCAR-маркеры (sequences-characterized amplified region). В этой связи полученные данные носят лишь предварительный характер, в то же время это не снижает значимости самого подхода. В конечном итоге результаты подобных экспериментов могут дать в руки исследователю дополнительный инструмент контроля за развитием резистентности насекомых к инсектицидам и помогут лучше понять механизмы формирования этого процесса.

Глава 6. Изучение экологической безопасности трансгенных растений с использованием фснетических и ДНК-маркеров

Создание трансгенных или генетически модифицированных растений (ГМР) в конце прошлого века и активное их использование в мировом сельскохозяйственном производстве ставит вопрос об их экологической безопасности. Это равным образом относится и к ^/-защищенным растениям, с признаком устойчивости к вредным насекомым и в частности к Д/-картофелго, устойчивому к колорадскому жуку.

6.1 Мониторинг резистентности колорадского жука к ^/-картофелю Во многих работах подтверждена взаимосвязь адаптивности популяций колорадского жука к инсектицидам с рисунком центральной части переднеспин-ки имаго [Кохмашок, 1982; Фасулати, 1986; Король, Новосельская, 2001]. Вот почему нам казалось естественным исследовать возможность оценки резистент-

ности популяций колорадского жука к /¿/-картофелю (растение-инсектицид) по фенетическим маркерам, что может являться основой для более простого метода мониторинга популяций этого вредителя.

В задачу данного этапа исследований входило изучение изменчивости фенетической структуры популяций колорадского жука под действием Ш-картофеля и на этой основе поиск фенетических маркеров резистентности. Для изучения взаимосвязи чувствительности популяций колорадского жука к В/картофелю и их фенетической структуры мы оценивали частоту встречаемости феноформ под влиянием трансгенного картофеля и чувствительность к /)/-токсину у ряда популяций Краснодарского края.

По полученным данным нами проведена формализация исследуемой зависимости, на основании которой можно оценить продолжительность жизни личинок колорадского жука (IV возраста) от частоты встречаемости феноформы «V»: Г~5, если Х< 6,5;

У= |5 + 1,4 (Х-6,5), если X > 6,5,

где У - продолжительность жизни личинок колорадского жука IV возраста (сут); X - частота встречаемости феноформы «V» (%).

Предложенная математическая модель достаточно адекватно описывает исследуемые закономерности в данной группе популяций. Возможно для других популяций колорадского жука предложенная модель может быть модифицирована. В то же время это не снижает значимости самого подхода, но только конкретизирует необходимость проведения аналогичных мероприятий для тех популяций и в тех зонах возделывания, где планируется возделывать бл-сорта.

Таким образом, мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному картофелю можно проводить по феноформам рисунка переднеспинки имаго, используя в качестве индикатора /^-чувствительности фенокомплекс «V» и прогноз развития резистентности по разработанной формуле расчета.

В то же время мы понимаем, что морфологический анализ и построенная на нем система мониторинга не может являться абсолютно достоверной, тем более в виду наличия значительной модификационной изменчивости фенетических маркеров в меняющихся условиях внешней среды. Вот почему мониторинг по ДНК-маркерам, как нам кажется, будет более достоверным, хотя, несомненно, и более дорогостоящей процедурой. В то же время, данный подход также может иметь право на жизнь. Вероятно, совместное использование всех доступных методов позволит проводить эффективный мониторинг резистентности популяций колорадского жука к Д/-картофелю по морфо-генетическим критериям.

6.2 Влияние /¿/-картофеля па молекулярно-гснетическую структуру популяции и жизнеспособность нецелевых видов насекомых

Одним из экологических рисков является возможное негативное влияние ГМР на нецелевую биоту, что может негативно отразиться на биоразнообразии видов и в том числе нецелевых насекомых биоценоза. В настоящее время исследователей и общественность волнует главным образом вопрос не острой токсичности ГМР, но пролонгированного действия /¿/-растений на нецелевые виды

биоты [Соколов и др., 2005]. Действительно, долговременное влияние fíl-токсинов (в ряду нескольких генераций насекомых) может сказаться на внутри-популяционной структуре и генетическом разнообразии популяций организмов, населяющих биоценоз ¿¡/-картофеля и питающихся листьями, клубнями или пыльцой трансгенного растения. Это, в свою очередь, может отразиться на адаптивности популяций и в конечном итоге на виде в целом.

Кроме того, влияние fiz-токсинов может привести не к элиминации, а наоборот, к увеличению жизнеспособности насекомых, относящихся к нецелевой группе. Применительно к вредителям данное явление крайне нежелательно, так как неизбежно скажется на росте их численности и соответственно на урожае картофеля. Эти аспекты биобезопасности ГМР до настоящего времени оставались вне поля зрения ученых и требовали своего рассмотрения.

Целью данного этапа исследований являлось изучить влияние /¿/-токсинов на некоторые нецелевые виды насекомых, населяющих биоценоз трансгенного картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, в ряду первых нескольких генераций. В этой связи ставилась задача провести сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры и генетического разнообразия в частности популяции картофельной минирующей моли при питании исходным и трансгенным (Bt) картофелем. Кроме молекулярно-генетических исследований ставилась задача провести оценку исследуемых двух групп насекомых по некоторым показателям их роста и развития, при этом в анализ планировали включать каждые пять-семь поколений насекомых. Важно отметить, что картофельная минирующая моль Phthorimaea operculeü, как нецелевой вид для Bl-картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, является удобным объектом для такого рода исследований, так как способна размножаться на искусственных питательных средах и в лабораторных условиях может дать до 13 генераций насекомых в год.

Проведенный анализ исходной популяции картофельной моли и первых двадцати пяти ее генераций на среде с /¿/-токсином показал, что молекулярно-генетическая структура и генетическое разнообразие популяции в условиях питания /¿/-картофелем остаются неизменными. Статистически значимых отличий по показателям роста и развития также отмечено не было [Киль и др. 2008, 2009,2010]. В этом разделе автореферата представлены результаты анализа двадцатой и двадцать пятой генерации насекомых, содержащихся на среде с токсином СгуЗА.

Опыт проводили в лабораторных условиях. Выборки из популяции насекомых, содержащихся на искусственной питательной среде с листьями исходного и /¿/-картофеля, анализировали по RAPD- и lSSR-маркерам и некоторым показателям роста и развития. Молекулярно-генетическую структуру описывали по частотам встречаемости в популяциях ДНК-маркеров и проводили сравнительную оценку по критерию хи-квадрат и коэффициенту генетического разнообразия Шеннона (Н) [Chalmers et al, 1992]. После проведения предварительного скрининга 20 RAPD- и 10 ISSR-праймеров для целей исследования были

отобраны наиболее информативные четыре: КАГО-праймеры ОРА07, ОРА20, ОРВ01 и 158Я-праймер 11ВС810.

Оценка внутрипопуляционного генетического разнообразия по Шеннону не выявила существенных различий между исследуемыми выборками насекомых, питающихся традиционным и трансгенным (ГН) картофелем. Сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры внутрипопуляционных групп насекомых также показал отсутствие статистически значимых различий в исследуемых выборках (таблица 10).

Таблица 10 - Изменчивость молекулярно-генетической структуры и генетического разнообразия в популяции P. opercule/la при питании исходным и траисгепным картофелем (двадцатая генерация насекомых)

Индекс Шеннона (Н) Критерий хи-квадрат(х2)

Праймер Исходный картофель Bt-картофель

UBC810 1,87 1,94 M

OPAÛ7 3,0 2,66 2,5

ОРА20 4,25 4,31 4,9

OPBOl 4,25 4,24 5,4

Х2факт S Х205- различия не достоверны

Результаты анализа насекомых картофельной минирующей моли, содержащихся при разных условиях питания по некоторым показателям роста и развития насекомых приведены в таблице 11.

Можно заметить, что различия между двумя исследуемыми выборками были несущественны: фактические значения критерия Стыодента по всем показателям были меньше табличного.

Таким образом, сравнительный анализ частот встречаемости ДНК-маркеров показал, что молекулярно-генетическая структура и генетическое разнообразие популяции картофельной моли в условиях питания /^-картофелем (сорт Луговской плюс) остаются неизменными. Статистически значимых отличий по показателям роста и развития также отмечено не было. Для оценки пролонгированного действия трансгенного /^-картофеля на нецелевых насекомых можно использовать в качестве модельного объекта картофельную минирующую моль по предлагаемой нами методике. Оценку пролонгированного влияния ГМР на нецелевых насекомых на этапе предрегистрационных испытаний рекомендуется проводить с использованием предлагаемого нами подхода, в основе которого лежит содержание поливольтинных видов насекомых на искусственной питательной среде, содержащей Д/-токсины (опыт) и исходный сорт (контроль), и сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры, генетического разнообразия и показателей роста и развития исследуемых двух групп насекомых.

Таблица 11 - Средние значения показателей роста и развития картофельной минирующей моли в условиях питания /¿/-картофелем (двадцать пятая генерация)

Сорт картофеля Количество яиц, отложенных одной самкой, шт (п=20) Отрож- дение гусениц (фер- тиль- ность яиц), % (п=20) Окуклилось гусениц, % (п=20) Масса куколок, мг (п=27) Количество вылетевших бабочек, % (п=20) Продолжительность развития от яйца до имаго, сут (п=20)

Bt-

картофель (Луговской плюс) 63,5+1,1 76,9+1,0 56±0,7 6,5+0,6 46,0±0,7 30,0±0,2

Исходный картофель (Луговской) 64,0±1,3 77,2±1,1 54,7+0,8 7,4±0,9 46,3±1,0 29,8±0,2

Критерий Стыодента 0,29 0,21 1,31 0,75 0,26 0,96

Х2факт<Х205- различия не достоверны

. 6.3 Оценка риска вертикального переноса генов от ГМ-культур к их диким сородичам и традиционно возделываемым сортам

Одним из аспектов экологической безопасности ГМ-культур является оценка риска вертикального переноса генов от ГМ-растений к культурным сортам и диким сородичам. Под вертикальным переносом генов понимают передачу генетического материала в поколениях половым путем. Потенциальная опасность здесь заключается в том, что новые привнесенные признаки устойчивости дадут дополнительные преимущества диким видам растений, и будут способствовать их быстрому распространению. В результате это приведет к появлению так называемых «суперсорняков» и увеличению засоренности полей, что может создать экологическую проблему.

Вопросы риска вертикального переноса генов от ГМ-картофеля и ГМ-кукурузы к их диким сородичам и другим возделываемым сортам также исследованы нами с применением метода ПЦР. При этом анализ генетической вставки проводили с использованием SCAR-праймеров, направленных на регуляторные области генома, 358-промотор (детектируемый фрагмент размером 195 п.н.), Nos-терминатор (180 п.н.) и целевые гены, в частности ген СгуЗА /¿/-картофеля (117 п.п.).

Результаты экспериментов по вертикальному переносу генов от Bt-картофеля выявили отсутствие переноса генетической конструкции к диким видам и культурным сортам картофеля. Необходимо отметить, что, несмотря на

то, что картофель является самоопылителем, перекрестное опыление может составлять у него от 0 до 20 % [РЫз1ес1, 1980]. Если учесть, что в качестве посадочного материала в нашей стране служат клубни картофеля, а не семена, можно заключить, что риск вертикального переноса генов от трансгенного картофеля минимален. К тому же дикие родственники картофеля на территории Российской Федерации не произрастают, а если бы и произрастали, гибридные семена не образовывались бы, что подтверждалось результатами наших опытов.

На закрытых сертифицированных участках опытных полей ВНИИБЗР был проведен также многолетний опыт по изучению возможности вертикальной передачи генов от раундап-устойчивой кукурузы к традиционно возделываемым сортам. В задачу исследований входило изучение возможности переноса пыльцы, дистанция рассеивания пыльцы, определение зоны безопасности и пространственной изоляции при выращивании трансгенной кукурузы.

ПЦР анализ выявил наличие трансгенной вставки у образцов, взятых по различным направлениям переносимой ветром пыльцы (рисунок 6). Перенос генов от ГМ-кукурузы к традиционно возделываемым сортам наблюдали главным образом на дистанции 5-10 м, однако в отдельных случаях — до 200 м (юго-западное направление).

Рисунок б - ПЦР-анализ семян кукурузы на наличие трансгенной вставки.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что риск вертикального переноса генов от ГМ-кукурузы к культурным сортам существует. Степень перекрестного опыления между трансгенной кукурузой и культурными сортами, находящимися поблизости, будет зависеть от ряда факторов, таких как расстояние между ними, локальных барьеров на пути движения пыльцы, местного климата и топографии. Вследствие этого поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, а также необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы. В России дикие сородичи кукурузы не встречаются, поэтому, риск иитрогрессии трансгенов от ГМ-кукурузы к ее диким видам в Российской Федерации отсутствует [Крутенко, 2006].

Вопросы ПЦР-детекции и идентификации трансгенов при мониторинге вертикального переноса генов от ГМ-культур тесно связаны с методами контроля за ГМ-семенами, зерном, растениями и продукцией на их основе. При этом встает вопрос не только детекции и идентификации трансгенов, но и их количественной оценки в образцах.

Полу количественная оценка ГМИ в семенах сои

Существующие сегодня методы количественной оценки генетически модифицированных источников (ГМИ) в пище, зерне и кормах основаны главным образом на применении техники «Real Time RCR». Такая техника исследований требует использования флуоресцентной метки и дорогостоящего оборудования. Вот почему нами была предпринята попытка количественной оценки ГМИ с использованием стандартного метода ПЦР, на основе подбора оптимальных условий для высокоспецифичной амплификации ДНК [Киль, Крутенко, 2003].

Объектом исследования являлась раундап-устойчивая соя, сорт Stine 2254 RR (Монсанто, США).

На рисунке 7 представлена электрофореграмма продуктов амплификации образцов ДНК сои, выделенных из навесок соевой муки с массовым содержанием ГМ-компонента 10,0 %; 5,0 %; 3,0 %; 1,0 %; 0,5 %; 0,01 %.

Рисунок 7 - Полуколичественная оценка содержания ГМ-компонента (ЯЛ-сои) в соевой муке по целевому гену ЕР8Р8 (праймеры RR01 и RR04, размер фрагмента 356 п.н.). М-маркеры молекулярных масс (М100 Ьр).

Можно заметить хорошо различимое изменение интенсивности полос при соответствующем изменении концентрации ГМИ в зерне, что позволяет проводить полуколичественную оценку ГМИ в образцах на основе простой визуальной оценки. Эти данные, в свою очередь, позволяют построить калибровочный график зависимости от концентрации ГМИ в образце и интенсивности ДНК-фрагмента, используя соответствующие статистические методы и программы, и на этой основе количественно оценить содержание ГМИ в исследуемом образце.

Таким образом, подобрана оптимальная система полуколичественной оценки ГМИ в семенах сои (в диапазоне концентраций 0,1-10 %), что позволяет проводить быстрый и эффективный мониторинг ГМ-сои как в агроценозах, так и в сельскохозяйственной продукции на ее основе.

ВЫВОДЫ

В результате проведенных исследований можно сделать следующие основные выводы:

1. Созданы новые более информативные системы описания фенетической структуры популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка.

2. Чувствительность различных фенетических групп насекомых к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций колорадского жука. Фенетическая структура популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка в первую очередь определяется соотношением внут-рипопуляционных групп насекомых, имеющих различную неспсцифическую устойчивость к различным стрессам, что указывает также на универсальный характер выявленных закономерностей.

3. Выявлена сцепленность генов окраски и рисунка имаго клопов вредной черепашки с полом. Изучение популяционных процессов клопа вредная черепашка по фенетическим маркерам необходимо проводить с учетом половых различий.

4. Выявлена высокая модификационная изменчивость фенетической структуры популяции клопа вредная черепашка, что ставит под вопрос использование фенетических маркеров при мониторинге резистентности клопов к инсектицидам.

5. Предложен новый подход к отбору резистентных к инсектицидам насекомых для поиска ДНК-маркеров резистентности у моновольтинных видов насекомых. Новизна предлагаемого подхода заключается в том, что он не требует проведения многоступенчатого, в ряду нескольких поколений, процесса селекции и отбора особей, резистентных к инсектициду. Выявлены ДНК-маркеры резистентности к инсектицидам Би-58 Новый: ЯАРО-маркеры ОРА06/470 и 430 п. н.

6. Показано генетическое сходство клопов-черепашек с другими представителям семейства щитников (Реп1а1от1с1ае), что, по-видимому, указывает на принадлежность этого вида клопов скорее к семейству РеЩакшпске, чем к 8сЩе11епс1ае.

7. Мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному картофелю можно проводить по феноформам рисунка переднеспинки имаго, используя в

качестве индикатора /¿/-чувствительности фенокомплекс «V» и прогноз развития резистентности - по разработанной формуле расчета.

8. Молекулярно-генетический анализ и оценка показателей роста и развития картофельной минирующей моли свидетельствует об отсутствии позитивного / негативного влияния /¿/-картофеля (сорт Луговской плюс) на генетическое разнообразие, структуру популяции, жизнеспособность и репродуктивные функции этого нецелевого вида насекомых как минимум в первых двадцати пяти поколениях.

9. Риск вертикального переноса генов от /¿/-картофеля к его диким сородичам и культурным сортам минимален, тогда как риск вертикального переноса генов от ГМ-кукурузы к культурным сортам существует. Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, при этом необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы.

10. Разработан метод полуколичественной оценки содержания ГМИ, основанный на амплификации участка целевого гена СР4 ЕРБРЗ с использованием пары праймеров: ЯЯ01 и ЯЯ04, фланкирующих участок целевого гена размером 356 п.н., который позволяет проводить не только ПЦР-детекцию и идентификацию трансгенов в зерне и зериопродуктах сои, но и определять их количественное содержание.

Практические рекомендации

1. Для целей фенетического анализа популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка предлагается использовать новые системы описания фено-форм рисунка и окраски имаго насекомых.

2. Для молекулярно-генетического анализа популяций насекомых предлагается использовать разработанную нами методику: «Методика оценки ДНК-полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (ЯАРЭ- и 158Я-РСЯ)».

3. Поиск резистентных к инсектицидам генотипов в популяциях моноволь-тинных видов насекомых рекомендуется проводить с использованием предлагаемого нами подхода, основанного на обработке инсектицидом выборки из природной резистентной популяции.

4. В целях быстрого и эффективного мониторинга ГМ-растений на полях и получаемых на их основе продуктов и кормов использовать предлагаемые нами методы детекции и полуколичественной оценки трансгенной вставки в биоматериале.

5. Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, а также необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы. Изоляции полей с трансгенным картофелем не требуется.

6. Мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному (ВО картофелю проводить с использованием предлагаемого нами метода: «Метод оценки чувствительности популяций колорадского жука к трансгенному (В1) картофелю по феноформам рисунка переднеспиики имаго».

6. На этапе предрегистрационных испытаний оценку пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых проводить с использо-

ванием предлагаемого нами подхода и в частности оценку /¡/-картофеля - по предлагаемой нами методике: «Методика оценки пролонгированного действия трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых», основанной на использовании сравнительной оценки генетического разнообразия и изменчивости молекулярно-генетической структуры внутрипопуляционных групп особей по ДНК-маркерам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Монографии

1 Ки п., В.И. ДНК технологии в защите сельскохозяйственных растений от вредных насекомых [Текст] / В.И. Киль, Россельхозакадемия, ВНИИ биологической защиты растений,- Краснодар: ООО «Просвещение-Юг», 2009.- 160 е.: ил.; - Библиогр.: с.128-159,-300 экз. - ISBN- 978-5-9000297-4-3.

Статьи п изданиях, рекомендуемых ВАК дли публикации основных результатов диссертации на соискание ученой стспснп доктора наук

2 Кил f., В.И. Генетически модифицированный картофель, устойчивый к колорадскому жуку [Текст]/Киль В.И., Надыкта В.Д. //Arpo XXI,- 2002. - № 1,- С. 12-15.

3 Киль, В.И. Оценка риска вертикального переноса генов у Bt-картофеля и других трансгенных культур [Текст] / Киль В.И. // Агрохимия.-2003.4,- С.81-89.

4 Киль, В.И. Управление развитием резистентности колорадского жука к Bt-защищеиному картофелю [Текст] / Киль В.И. // Arpo XXI,- 2003/2004,- №7-12,- С.22-24.

5 Киль, В.И.. Выгоды и преимущества возделывания трансгенных растений [Текст] / Киль В.И., Исмаилов В.Я., Мадыкта В.Д // Достижения науки и техники АПК.-2003.-Ж 10.-С.26-30.

6 Киль, В.И. Резистентность вредителей к трансгешюму картофелю и другим Bt-защищенпым культурам [Текст] / Киль В.И., Головатеико H.A., Крутенко Д.В.// Агро-химия.-2004.-№7.-С.77-91.

7 Киль, В.И. Мониторинг резистентности колорадского жука к трансгепному картофелю по фенетическим маркерам [Текст] / Киль В.И., Головатеико H.A. // Агрохимия.-2006.-№2.-С.58-64.

8 Киль, В.И. О полиморфизме RAPD-маркеро» у различных таксонов полужесткокрылых (Ilemiptera) [Текст] / В.И. Киль, В.В. Гронин, Д.В. Крутенко, В Л. Исмаилов // Сельскохозяйственная биология,- 2008.-№1.-С.70-76.

9 Кнль, В.И. Идентификация резистентных к инсектицидам генотипов в популяции клона вредная черепашка по фенам рисунка и RAPD-маркерам [Текст] / В.И. Киль,

B.Я. Исмаилов // Агрохимия,- 2009.-№1.-С.38-49.

10 Кнль, В.И. Изучение пролонгированного действия трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых [Текст] / В.И. Киль, Е.П.Кеседина, М.В.Пушня, В.Я.Исмаилов // Труды Кубанского государственного аграрного универеитета.-20!0.-Выпуск 1(22).-

C.96-100.

Статьи it реферируемых журналах

11 Киль, В.И. Морфологические маркеры чувствительности популяций колорадского жука к трансгешюму картофелю [Текст] / Киль В.И., Головатенко H.A. // Наука Кубани.-2004.-№ 3, Ч.1.-С.116-119.

12 Киль, В.И. Генетичесие маркеры чувствительности популяций колорадского жука к трансгешюму картофелю [Текст] / Киль В.И., Гронии В.В. // Наука Кубапи.-2005.-№4-С. 126-130.

13 Киль В.И. Молекулярно-генетическая структура популяции картофельной минирующей моли Phlhorimaea operculella Z. (Lep¡doplera:Gclechiidac) [Текст] / Киль

B.И., Крутенко Д.В., Гронип В.В. // Наука Кубани-2007-№4.-С.25-29.

14 Киль, В.И. Использование метода RAPD-PCR для выявления резистентных к инсектициду Би-58 генотипов клопов вредной черепашки [Текст] / В.И. Киль, М.В. Пушия, Ж.А. Ширинян // Наука Кубани.-Приложение.-2008.-С.87-92.

15 Киль, В.И. RAPD-анализ популяции хлопковой совки Ilelicoverpa armígera НЬп. (Lepidoptera:Noctu¡dae) [Текст] / В.И. Киль, Ж.А. Ширинян // Наука Кубани - Приложение,- 2008.-С. 176-179.

16 Киль, В.И. Влияние трапегенного картофеля на молекулярпо-геиетическую структуру популяции и жизнеспособность картофельной минирующей моли в ряду генераций [Текст] / Киль В.И., Бсседина E.H., Пушня М.В., Исмаилов В.Я // Наука Ку-бапи.-2009.-№3,- С.69-73.

17 Киль В.И. ДИК полиморфизм клопов вредной черепашки Eurygaster integriceps Put (Hemiplera: Scutclleridae) по межмикросателлитным локусам [Текст] / Киль В.И // Наука Кубани.-2009.-№4.-С.42-45.

Статьи п аналитических сборниках

18 Киль, В.И. Методические подходы к определению наличия трансгенов в пищевых продукт;« и кормах [ Текст] / Киль В.И. // Материалы международной научно-практической конференции: «Трансгениыс растения - новое направление в биологической защите растений» (ВИИИБЗР, Краснодар, 19-22 июня 2002 г).- Краснодар.-2003,-

C. 193-208.

19 Кнль, В.И. Мониторинг гешю-инженерно-модифицированных растений: ПЦР-детекция RR - сои [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В. // Тез. докл. на Всероссийскую научно-техническую конференцию "Биотехнология 2003".-Сочи.-2003.-С.87-89.

20 Киль, В.И. Сравнительный анализ методов ПЦР-детекции семян RR-сои и полуколичествен пая оценка их содержания в зерне и кормах [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В. // Тезисы VII Всероссийского конгресса «Здоровое питание населения Рос-сии».-Москва 12-14 ноября 2003.-С.235-236.

21 Кнль, В.И. Идентификация и полуколичественная оценка содержания семян RR-сои в зерне [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В. // Тезисы 2-го Московского международного Конгресса: "Биотехнология: состояние и перспективы развития".-Москпа,10-14 ноября 2003.-С. 199-200.

22 Кнль, В.И. Молекулярно-генстический анализ популяции колорадского жука по признакам пола и окраски яиц [Текст] / Киль В.И., Игнатов A.M., Калисничепко С.М., Головатенко H.A., Крутенко Д.В., Дорохов Д.Б. // Тезисы 2-го Московского международного Конгресса: "Биотехнология: состояние и перспективы развития",-Москва, 10-14 ноября 2003.-С.200-201.

23 Головатенко, H.A. Оценка базовой чувствительности различных географических популяций колорадского жука к трансгенному картофелю [Текст] / Головатенко H.A., Киль В.И. // Тез. Докл. 5-й региональной научно-практич. конф. Молодых уче-

hi,ix «Научное обеспечение агропромышленного комплекса», Краснодар, КГАУ, 2003,-С.82-83.

24 Киль, B.U. Новый подход к описанию рисунка псреднеспинки имаго колорадского жука на примере некоторых его популяций в краснодарском крас [Текст] / Киль В.И.,. Головатснко Н.А, Есипснко Л.П. // Материалы докладов конф., поев. 100-летию со дня рожд. Е.М.Степанова (Краснодар, 8-9 окт, 2002).- Краснодар-2004.-С.126-133.

25 Головатснко, H.A. Изменчивость фонетической структуры популяций колорадского жука под влиянием Bt-картофеля и инсектицидов на основе комплексного описания рисунка передмеспинки имаго жуков [Текст] / Головатснко H.A., Киль В.И., Есипснко Л. П. // Материалы докладов конф., поен. 100-лстию со дня рожд. Е.М.Степанова. (Краснодар, 8-9 окт, 2002).- Краснодар.-2004.-С.133-147.

26 Надыкта, В.Д. Биологическая эффективность и биоцснотичсская безопасность генпо-инженерно-модифицированных сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции, устойчивых к колорадскому жуку [Текст] / Надыкта В.Д., Исмаилов В.Я., Ширинян Ж.А., Пушня М.В., Крутенко Д.В., Киль В.И. // Тез. Докл. на Ш съезд ВОГиС, «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, 6-12 июня 2004,- С. 477.

27 Мсмаплов, В.Я. Методы мониторинга резистеитности колорадского жука к Bt-картофелю [Текст] / Исмаилов В.Я., Ширинян Ж.А., Пушия М.В., Головатснко H.A., Киль В.И. // Тез. Докл. на III съезд ВОГиС, «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, 6-12 июня 2004,- С.500.

28 Зотов, U.C. Оценка генетических различий между популяциями колорадского жука мультивариантпым ПЦР анализом [Текст] / Зотов B.C., Игнатов А.Н., Маллабае-ва Д.Ш., Киль В.И., Дорохов Д.Б. // Тез. Докл. на III съезд ВОГиС, «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, 6-12 июня 2004, С.48.

29 Киль, В.И. К вопросу о механизмах формирования структуры популяций колорадского жука в связи с резистентностью к инсектицидам [Текст] / Киль В.И., Головатснко H.A. // Материалы докладов международной конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 29 сент.-1 окт.2004).- Красподар.-2004.-Вып.2,- С.201-209.

30 Киль, В.И. RAPD-анализ ДНК имаго колорадского жука Leptinotarsa decem-lineata (Say) различных географических популяций [Текст] / Киль В.И., Головатснко H.A., Крутенко Д.В., Гронин В.В. // Материалы докладов международной конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 29 ceiiT.-l окт.2004).- Красподар.-2004.-Вып.2.- С.209-222.

31 Киль, В.И. Возможность оценки продолжительности жизни личинок колорадского жука, питающихся Bt-картофелем, по фенам рисунка переднеспинки имаго [Текст] / Киль В.И., Головатенко H.A.// Материалы докладов международной конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем», (Краснодар, 29 сент.-1 окт.2004).- Краснодар.-2004.-Вып.2.- С.222-229.

32 Крутенко, Д.В. Методы ПЦР-дстскции трансгенных растений [Текст] / Крутенко Д. В., Киль В. И. // Материалы докладов международной конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 29 сспт.-1 окт.2004).- Красподар.-2004.-Вып.2.- С.303-313.

33 Надыкта, В.Д. Генетически улучшенные культуры - новое средство биологической защиты растений [Текст] / Надыкта В.Д., Исмаилов В.Я., Киль В.И. // Тез. докл. участников IV Семинара-Совещания «Средства защиты растений, регуляторы роста,

агрохимикаты и их применение при возделывании сельскохозяйственных культур».-5-9 сентября 2005.-Лнаиа.-2005.-С. 118-121.

34 Киль, В.И. Изучение закономерностей изменчивости фонетической структуры популяций колорадского жука иод влиянием инсектицидов и генетически модифицированного картофеля [ Текст] / Киль В.И., Головатснко И.Л. // Сборник материалов международной конференции «Актуальные вопросы экологии и природопользования» (Ставроиоль.-16-19 ноября, 2005).-Ставрополь. «Агрус».-2005.-Т.1.-С. 140-151.

35 Киль, В.И. Генетический полиморфизм популяций колорадского жука, различающихся чувствительностью к трапегенному картофелю [Текст] / Киль В.И., Гронип В.В. // Материалы Второго Всероссийского съезда по защите растений «Фитосанитар-ное оздоровление экосистем», Симпозиум «Резистентность вредных организмов к пестицидам».- Санкт-Петербург.- 5-10 декабря, 2005.-С.33-34.

36 Киль, В.И. Изучение генетического полиморфизма популяций колорадского жука с целыо управления их резистентностью к инсектицидам и трапегенному картофелю [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Головатепко II. А., Крутенко Д. В. // Тез. докл. на Заключительную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «р2003юг» (п. Агой, Туапсинского р-на, 28 ноября - 1 декабря 2005).- Краснодар. - 2005.-С.101-103.

37 Кнль, В.И. Полиморфизм ДИК различных видов клопов по RAPD-маркерам [Текст] / Киль В.И., Гронип В.В., Крутенко Д.В., Исмаилов В.Я. // Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность-Материалы 3-ей международной конференции из серии «Наука и бизнес».-19-21 июня 2006.-Пущино.-2006.-С.114-117.

38 Киль, В.И. ПЦР анализ ДНК некоторых видов клопов из энтомологической коллекции [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В. // Материалы международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 20-22 сентября, 2006).- Краснодар.-2006.- Вып.4.-С.435-436.

39 Кнль, В.И. Изучение молскулярно-генетического полиморфизма различных видов клопов методом RAPD-PCR [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Крутенко Д.В., Исмаилов В.Я. // Материалы международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 20-22 сентября, 2006).- Краснодар.-2006,- Вып.4.-С.437-441.

40 Кнль, В.И. Полиморфизм ДИК популяции картофельной минирующей моли Phlhorimaea opercitklla Z. (Lepidoptera.Gelechiidae) по RAPD-маркерам [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В. // Материалы международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем (Краснодар, 20-22 сентября, 2006).- Краснодар.-2006,- Вып.4.-С.442-446.

41 Киль, В.И.. Полиморфизм ДНК популяции клопов-вредной черепашки Eurygaster ¡ntegriceps Pul. по RAPD-маркерам [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Голо-ватенко Н.А. // Материалы международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 20-22 сентября, 2006).- Краснодар.-2006.- Вып.4,- С.447-451.

42 Киль, В.И.. Изучение влияния трансгенного картофеля на генетическую структуру популяций и жизнеспособность нецелевых видов насекомых. [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В., Пушня М.В., Ширинян Ж.А. // Тезисы докладов на отчетную конференцию 1рантодержателсй регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ-РОССИИ», «Вклад фундаментальных исследова-

ний в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» -2006.-С. 175-177.

43 Киль, В.И. Изучение особенностей формирования морфо-генетической структуры популяций клопа - вредная черепашка под воздействием пестицидов и других стрессовых факторов внешней среды [Текст] / Киль В.И., Кругенко Д.В., Гропин В.В. // Тезисы докладов на отчетную конференцию грантодержатслей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ-РОССИИ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края»-2006.-С. 138-139.

44 Грошш, В.В. Новая система описания фенов в популяциях клопов-вредпой черепашки [Текст] / Г'ропип В.В. Крутенко Д.В., Киль В.И. II Материалы VIII Региональной научно-практической конференции молодых ученых (Краснодар, 7-8 декабря,

2006).- Краснодар.-2006,- С. 108-110.

45 Ku.ru., В.И. Методика популяционнмх исследований насекомых вредителей сельскохозяйственных культур с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) [Текст] / Киль В.И. // Высокопроизводительные и высокоточные технологии и методы диагностики и фигосанитарпого мониторинга,- Россельхозакадемия, М,- 2007.- С. 8-15.

46 Киль, В.И.. Мониторинг резистентности популяции клопа вредная черепашка к инсектициду Би-58 но RAPD-маркерам [Текст] / Киль В.И., Кругенко Д.В., Гронин

B.В. // Материалы 4 Международной научно-практической конференции «Агротехнический метод защиты растений от вредных организмов» (Краснодар, 13-17 июня,

2007).- Краснодар.-2007.-С.396-398.

47 Киль, В.И. Новая система описания фенов рисунка и окраски имаго клопов вредной черепашки [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Кругенко Д.В. // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества. Вып. 3: материалы 2-й Всероссийской научно-практической конференции.- Ставрополь: АГРУС, 2007.-С.28-34.

48 Киль, В.И. Фонетическая структура Краснодарской и Ставропольской популяций клопов вредной черепашки. [Текст] / Киль В.И., Гропин В.В., Крутенко Д.В. // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества. Вып. 3: материалы 2-й Всероссийской научно-практической конференции.- Ставрополь: АГРУС, 2007.-С.34-40.

49 Киль, В.И. Молекулярпо-генстическая структура Краснодарской и Ставропольской популяций клопов вредной черепашки [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Кругенко Д.В. // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества. Вып. 3: материалы 2-й Всероссийской научно-практической конференции,- Ставрополь: АГРУС, 2007.-С.40-46.

50 Киль, В.И. Влияние инсектицида Би58-новый па фспетичсскую и молекулярпо-генетическую структуру популяции клопа вредная черепашка. [Текст] / Киль В.И., Гропин В.В., Крутенко Д.В. // Тезисы докладов ХШ съезда Русского энтомологического общества «Достижения энтомологии на службе агропромышленного комплекса, лесного хозяйства и медицины», Краснодар, 9-15 сентября 2007 г.- Краснодар.-2007,-

C.92-93.

51 Киль, В.И. Полиморфизм ДНК популяции хлопковой совки Helicovcrpa armígera Hbn. (LEPIDOPTERA:NOCTUIDAB) по RAPD-маркерам [ Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В., Ширипян Ж.А. // Тезисы докладов XIII съезда Русского энтомологического общества «Проблемы и перспективы общей энтомологии», Краснодар, 9-15 сентября 2007 г.- Краснодар.-2007.-С.144-145.

52 Киль, В.И. Изменчивость морфо-генетической структуры популяций клопов вредной черепашки под воздействием пестицидов и других стрессовых факторов внешней среды [Текст] / В.И. Киль, Д.В. Крутенко, В.В. Гроиин, М.В. Пушня // Тезисы докладов па отчетную конференцию граптодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «101-РОССИИ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (п. Агой, Туапсинского района, 24-28 октября, 2007).-2007.-С.144-146.

53 Киль, В.И. Влияние трансгенного картофеля на моле куля pi ю-генетическую структуру популяций, рост и развитие нецелевых видов насекомых [Текст] / В.И. Киль, Д.В. Крутенко, В.В. Гроиин, Е.Н. Беседина, М.В. Пушня, Ж.Л Ширинян // Тезисы докладов па отчетную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ-РОССИИ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (п. Агой, Туапсинского района, 24-28 октября, 2007).-2007.-С.190-192.

54 Киль, В.И. Полиморфизм ДНК популяции клопа вредная черепашка Eurygaster inlegriceps Put (Hemiptera: Scutelleridac) no RAPD- и lSSR-маркерам [Текст] / В.И. Киль // - Тезисы докладов международной конференции «Информационные системы диагностики, мониторинга и прогноза важнейших сорных растений, вредителей и болезней сельскохозяйственных культур» (Санкт-Петербург -Пушкин, 12-16 мая 2008).- Санкт-Петербург-Пушкин.-2008.-С.44-46.

55 Киль, В.И. RAPD- и ISSR-анализ популяций картофельной минирующей моли и хлопковой совки при питании обычным и трансгенным (Bt) картофелем [Текст] / В.И. Киль, Е.Н. Беседина // Тезисы докладов международной конференции «Информационные системы диагностики, мониторинга и прогноза важнейших сорных растений, вредителей и болезней сельскохозяйственных культур» (Санкт-Петербург - Пушкин, 1216 мая, 2008).- Санкт-Петербург - Пушкин.-2008,- С.46-49.

56 Киль, В.И. ДНК полиморфизм популяций хлопковой сопки и картофельной минирующей моли по lSSR-маркерам [Текст] / В.И. Киль, Е.Н. Беседина // Материалы международной научно-практической конференции «Биологическая зашита растений — основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 23-25 сентября, 2008).- Красподар.-2008,-ВЫП.5.-С.415-420.

57 Киль, В.И. Изменчивость молекулярпо-гепетической структуры нецелевых видов насекомых в условиях питания трансгенным картофелем, устойчивым к колорадскому жуку: анализ первых генераций [Текст] / В.И. Киль, Е.Н. Беседина, М.В. Пушня, Ж.А. Шириняи, В.Я. Исмаилов // Материалы международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 23-25 сентября, 2008).- Краснодар.- 2008,- Вып.5.-С.421-425.

58 Киль, В.И. Использование метода RAPD-PCR для отбора резистентных к Би-58 Новый генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых на примере клопа вредная черепашка [Текст] / В.И. Киль // Материалы международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 23-25 сентября, 2008).- Краснодар.- 2008.- Вып.5.-С.400-409.

59 Киль, В.И. RAPD- и ISSR-анализ клопов вредной черепашки, различающихся чувствительностью к инсектициду суми-альфа [Текст] / В.И. Киль // Материалы международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений -основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 23-25 сентября, 2008).- Краснодар.-2008.- Вып.5.-С.409-415.

60 Киль, В.И. Биобезоиаспость транспепного картофеля: оценка влияния В1-токсинов на нецелевые виды насекомых в ряду поколений [Текст] / В.И. Киль, Е.Н. Бсседипа, М.В. Пушня, Ж.А Ширичян // Тезисы докладов на отчетную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (и. Агой, Туапеинского района, 23-27 ноября, 2008).-2008.-С.55-56.

61 Киль, В.И. Молекулярпо-генетический и фонетический анализ популяций клопа вредная черепашка, различающихся чувствитслыюстыо к инсектицидам |Текст] / В.И. Киль // Тезисы докладов на отчетную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (п. Агой, Туапеинского района, 23-27 ноября, 2008).-2008.-С.53-54.

62 Киль, В.И. ГИДР анализ хищных клопоп РегШих Ыоси!а1их различающихся окраской щитка, по ПАРВ- и 188Я-марксрам [Текст] / В.И. Киль, Р..II. Бсседипа, О.О. Федичева, В.Я. Исмяилои // Информационный бюллетень Восточно-Палсарктической региональной секции Международной организации по биологической борьбе с вредными животными и растениями №2 39 : материалы X сессии Генеральной Ассамблеи ВПРС МОББ и Международной научно-практической конференции «Биологические основы регулирования вредных организмов в агроцепозах» (г.Киев, 18-22 мая 2009 г.).- КИСВ.-2009.- С.128-130.

63 Киль, В.П. Закономерности формирования фенетической структуры популяции клопа вредная черепашка [Текст] / В.И. Киль // Груды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества: материалы II Международной научно-практической интернет-конференции «Актуальные вопросы энтомологии» (г.Ставрополь, 1 марта 2009 г.).- Вып.5 / Ставропольский государственный аграрный университет,- Ставрополь : АГРУС, 2009.-С. 17-22.

64 Киль, В.И. К вопросу о мониторинге резистентности популяций клопа вредная черепашка к инсектицидам по фенам рисунка и окраски имаго [Текст] / В.И. Киль // Труды Ставропольского отделения Русского энтомолог-ичсского общества: материалы II Международной научно-практической интернет-конференции «Актуальные вопросы энтомологии» (г.Ставрополь, 1 марта 2009 г.).- Вып.5 / Ставропольский государственный аграрный университет.- Ставрополь : АГРУС, 2009.-С.220-223.

65 Киль, В.И. ДИК полиморфизм различных популяций яблонной плодожорки СусНа ротстеПа (Ь.) (Еер1с)ор1ега: Тотбас1ае) [Текст] / В.И. Киль, Е.Н. Бсседипа, О.О. Федичева // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества: материалы II Международной научно-практической интернет-конференции «Актуальные вопросы энтомологии» (г.Ставрополь, 1 марта 2009 г.).- Вып.5 / Ставропольский государственный аграрный университет,- Ставрополь : АГРУС, 2009.-С.154-157.

66 Киль, В.И. Молекулярпо-генетический анализ хищных клопов РегШик Ыоси1а-/¡/£ (НепщЛега: Реп1а1о1Гпс1ае), различающихся по фенам окраски щитка [ Текст] / В.И. Киль, Е.Н. Бсседипа, О.О. Федичева, В.Я. Исмаилов // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества: материалы II Международной научно-практической интернет-конференции «Актуальные вопросы энтомологии» (г.Ставрополь, 1 марта 2009 г.).- Вып.5 / Ставропольский государственный аграрный университет,- Ставрополь : АГРУС, 2009.-С.158-162.

67 Киль, В.И. Молекулярпо-генетический анализ популяций яблонной плодожорки СуеНа ротопеПа I.. по КАРО- и 188К-маркерам [Текст] / В.И, Киль, Е.Н.

Беседина, О.О. Фсдичева // Информационный бюллетень Восточно-Палеарктической региональной секции Международной организации но биологической борьбе с вредными животными и растениями № 40 : материалы докладов международного симпозиума «Защита растений - достижения и перспективы» (г.Кишинев, 19-22 октября 2009 г.). Кишинев. -2009,- С.92-94.

68 Киль, В.И. ПЦР анализ популяций яблонной плодожорки Cydia Pomonella [Текст] / В.И. Киль, E.H. Бсседииа, О.О.Федичева // Тезисы докладов на отчетную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (г. Анапа, 26-30 октября, 2009). -2009.- С.37-38.

69 Исмаилов, В.Я. Биологические особенности и морфогенетическая структура популяции хищного клопа Perillus bioculcttus F. (Hemiptera: Pentalomidae) [Текст] / В.Я.Исмаилов, В.И. Киль, И.С.Агасьева, Е.В.Федоренко, О.О.Федичева, Д.В.Степанов, E.H. Беседина // Тезисы докладов па отчетную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (г.Анапа, 26-30 октября, 2009).-2009.-С.34-35.

70 Киль, В.И. Методика оценки ДНК полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (RAPD- и ISSR-PCR) [Текст] / В.И. Киль // Методические рекомендации. ООО «Просвсщеиие-Юг». Краснодар. 2009. 16 с.

Подписано в печать 16.07.2010. Печать трафаретная. Бумага тип. № 1. Гарнитура «Тайме». Уч. печ. л. 2,00. Формат 6()х84'/16. Тираж 100 экз. Заказ № 10198.

Тираж изготовлен с оригинал-макет'а заказчика в типографии ООО «Просвещение-Юг» 350059, г. Краснодар, ул. Селезнева, 2. Тел./факс: 239-68-31

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Киль, Владимир Ильич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Молекулярная биология и генная инженерия в практике защиты растений от вредных насекомых (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1 Типы ДНК-маркеров, их преимущества и недостатки.

1.2 Использование ДНК-маркеров в интегрированных системах защиты растений от вредителей.

1.2.1 идентификация видов.

1.2.2 изучение генетики популяций вредных и полезных насекомых.

1.2.3 мониторинг резистентности насекомых к инсектицидам.

1.3 Генетически-модифицированные организмы в защите растений от вредителей.

1.3.1 Трансгенные насекомые.

1.3.1.1 Техника трансформации ДНК членистоногих.

1.3.1.2 Трансгенные насекомые в практике защиты растений.

1.3.1.3 Паратрансгенные насекомые.

1.3.2 Трансгенные растения.

1.3.2.1 Современное состояние выращивания трансгенных растений в мире.

1.3.2.2 Выгоды и преимущества использования трансгенных растений.

1.3.2.3 Экологическая безопасность трансгенных растений.

1.3.2.3.1 Оценка риска вертикального переноса генов.

1.3.2.3.2 Резистентность вредителей к ¿?/-токсинам.

1.3.2.3.3 Оценка влияния ^-токсинов на нецелевые виды насекомых.

1.3.2.4 Методы контроля ГМР.

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Фенетические маркеры в изучении генетической структуры популяций вредных и полезных насекомых.

3.1 Изменчивость фенетической структуры популяций колорадского жука под действием инсектицидов.

3.2 Фенетическая структура популяций клопа вредная черепашка.

3.3 Генетический контроль феноформ окраски щитка и переднеспинки клопа периллюса.

Глава 4. Молекулярно-генетический анализ популяций вредных насекомых по ДНК-маркерам.

4.1 ДНК-полиморфизм популяций колорадского жука.

4.1.1 Тестирование праймеров на информативность для RAPD-анализа популяций насекомых на примере колорадского жука.

4.1.2 Изменчивость генетической структуры популяций колорадского жука в зависимости от географического положения.

4.2 ДНК-полиморфизм различных видов клопов (Hemiptera).

4.2.1 ПЦР анализ некоторых видов клопов из энтомологической коллекции.

4.2.2 Систематика вида Eurygaster integriceps Put.

4.2.3 Молекулярно-генетический анализ различных популяций клопа вредная черепашка по RAPD- и ISSR-маркерам.:.

4.3 ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие различных видов чешуекрылых (Lepidoptera).

4.3.1 Картофельная минирующая моль Phthorimaea operculella Z. (Lepidoptera:Gelechiidae).

4.3.2 Хлопковая совка Helicoverpa armígera Hbn. (Lepidoptera:Noctuidae).

4.3.3 Яблонная плодожорка Cydia pomonella (L.) (Lepidoptera: Tortricidae).

4.4 Сравнительный анализ генетического разнообразия различных видов насекомых.

Глава 5. ДНК-маркеры резистентности популяций вредителей к инсектицидам.

5.1 Влияние инсектицидов на молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяции яблонной плодожорки.

5.2 ДНК-маркеры резистентности к инсектициду Би-58 Новый в популяции клопа вредная черепашка.

Глава 6. Изучение экологической безопасности трансгенных растений с использованием фенетических и ДНК-маркеров.

6.1 Мониторинг резистентности колорадского жука к ^-картофелю.

6.2 Влияние 2?£-картофеля на молекулярно-генетическую структуру популяций и жизнеспособность нецелевых видов насекомых.

6.3 Оценка риска вертикального переноса генов от ГМ-культур к их диким сородичам и традиционно возделываемым сортам.

6.4 Методы контроля ГМР.

Выводы.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность"

Для успешного осуществления программ защиты сельскохозяйственных растений от вредных членистоногих необходимо изучение биологии и генетики популяций как вредных, так и полезных насекомых. Это включает в себя знание генетической структуры популяций, миграционных процессов (динамики), акклиматизации, поведенческих реакций, условий размножения, отношения полов и трофических связей.

Значительный прогресс в этом отношении был достигнут в 50-60-е годы прошлого столетия, благодаря использованию классических генетических принципов и подходов. Изучение популяционных процессов насекомых исследователи проводили, главным образом, с помощью видимых и хорошо различимых фенотипических маркеров (морфологических и фенетических), таких как окраска и рисунок, волоски или шипы на теле особи. Это приблизило ученых к пониманию закономерностей распространения насекомых, их поведенческих реакций, включая половые отношения, и наследования отдельных генов, контролирующих те или иные признаки [ВеЬига, 2006].

Использование молекулярно-генетических подходов, начиная с белковых маркеров в 1970-х годах, главным образом изоферментов (продуктов различных локусов, но со сходной функцией) и позже ДНК-маркеров, во многом способствовало более глубокому пониманию исследуемых закономерностей в популяциях насекомых. Большинство ДНК-маркеров, используемых сегодня - это продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые могут быть получены из экстремально малого количества биоматериала (из яйца, личинки, куколки, имаго насекомого или его отдельных органов).

В последние несколько лет использование молекулярных маркеров в энтомологии широко обсуждалось в различных обзорах [Удалов и др., 2003;

Behura, 2006.,' Loxdale, MacDonald, 2004; MacDonald., Loxdale, 2004]. Молекулярные маркеры позволяют анализировать и объяснять популяционные процессы там, где этого не могут сделать никакие другие методы исследований. Использование ДНК маркеров необходимо для анализа структуры популяций как полезных насекомых - паразитов и хищников - так и вредителей, являющихся объектом контролирующих их биоагентов. Кроме того, они могут использоваться для целей таксономии и филогении [Roehrdanz, Flanders, 1993; Mitchell et al., 2006]. С их помощью можно разделить таксоны насекомых, т.е. биотипы, подвиды, близкородственные виды, а также виды-двойники, т.е. виды, которые трудно различить морфологически или каким-то другим способом [Mitchell et al., 2005, Mitchell, Samways, 2005; Silva-Brandao et al., 2008].

Несмотря на столь широкие возможности ДНК-маркеров, сегодня в нашей стране в генетических исследованиях популяций вредителей преобладает использование морфологических и фенетических маркеров. На их основе исследователи продолжают изучать динамику, поведенческие реакции и строят прогнозы о развитии резистентности насекомых к инсектицидам, главным образом для сельскохозяйственно-значимых вредителей [Фасулати, Вилкова, 2000; Сухорученко, 2001, 2005; Король, Новосельская, 2001; Беньковская и др, 2004; Ростовцева, 2005;].

Несмотря на то, что фенотипические маркеры просты для использования и часто проявляются на протяжении всего жизненного цикла организма, они имеют ряд существенных недостатков. Основными ограничениями их использования является то, что хорошо различимые фены относительно редки и встречаются далеко не у всех видов насекомых. Проблема идентификации вида по морфологическим признакам в отдельных случаях значительно затрудняется из-за существования видов-двойников. Кроме того, модификационная изменчивость фенотипических маркеров, как правило, весьма значительна, что б затрудняет оценку и прогноз динамики популяционных процессов. Более того, идентификация таких маркеров должна базироваться на знании их генетического контроля и того как гены, контролирующие этот признак, наследуются в потомстве.

Использование для этих целей современных методов молекулярно-генетического анализа, в частности, ПЦР-метода и полученных на его основе ДНК-маркеров, может во многом способствовать решению этих проблем. Важно отметить, что использование ДНК-маркеров не умаляет применения фенетических и других морфологических критериев в практике защиты растений от вредителей, но лишь дополняет их и расширяет возможности для популяционных исследований видов насекомых, не имеющих четких видимых морфо-фенетических признаков, позволяет повысить точность мониторинга и прогноза. Кроме того, с использованием ДНК-маркеров появляется возможность проследить динамику отдельных генетических элементов, отдельных хромосомных локусов, генов и аллелей генов в популяциях, оценить гетерозиготность, гетерогенность и генетическое сходство популяций и другие параметры, которые невозможно оценить с помощью морфологических критериев.

Таким образом, сегодня исследователям недостает точных методов анализа и прогноза в популяциях вредных и полезных насекомых для целей мониторинга и защиты рстений. Также существует недостаток знаний о молекулярно-генетической структуре популяций насекомых и закономерностях ее изменчивости под влиянием стрессовых факторов внешней среды. В этой связи данные исследования, несомненно, актуальны и представляют интерес для практики защиты растений от вредных насекомых.

В то же время многие эксперты по сельскому хозяйству считают, что проблема нехватки продовольствия не может быть решена без применения ДНК технологий и, в частности, генной инженерии. Генетическая инженерия, по 7 сути, продолжает направление традиционной селекции по улучшению генотипов полезных растений, но достигает той же цели более эффективным и быстрым путем. На сегодняшний день генетическая инженерия уже располагает большим арсеналом знаний и методов для эффективного переноса полезных генов из одних организмов в другие [Романов, 2000]. На этой основе уже созданы многие сорта трансгенных или генетически-модифицированных растений (ГМР) и некоторые виды ГМ-насекомых, нашедшие сегодня применение в мировой практике защиты сельскохозяйственных растений. Однако их использование в нашей стране сдерживается недостаточной изученностью вопросов их экологической безопасности.

В этой связи данные исследования также актуальны и могут найти свое отражение в практике защиты растений на этапе предрегистрационных, регистрационных испытаний и пострегистрационного мониторинга ГМР и продукции на их основе.

Заключение Диссертация по теме "Плодоводство, виноградарство", Киль, Владимир Ильич

выводы

В результате проведенных исследований можно сделать следующие основные выводы:

1. Созданы новые более информативные системы описания фенстической структуры популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка.

2. Чувствительность различных фенетических групп насекомых к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций колорадского жука. Фенетическая структура популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка в первую очередь определяется соотношением внутрипопуляционных групп насекомых, имеющих различную неспецифическую устойчивость к различным стрессам, что указывает также на универсальный характер выявленных закономерностей.

3. Выявлена сцепленность генов окраски и рисунка имаго клопов вредной черепашки с полом. Изучение популяционных процессов клопа вредная черепашка по фенетическим маркерам необходимо проводить с учетом половых различий.

4. Выявлена высокая модификационная изменчивость фенетической структуры популяции клопа вредная черепашка, что ставит под вопрос использование фенетических маркеров при мониторинге резистентности клопов к инсектицидам.

9. Риск вертикального переноса генов от ^/-картофеля к его диким сородичам и культурным сортам минимален, тогда как риск вертикального переноса генов от ГМ-кукурузы к культурным сортам существует. Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, при этом необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы.

10. Разработан метод полу количественной оценки содержания ГМИ, основанный на амплификации участка целевого гена СР4 ЕРБРБ с использованием пары праймеров: ЯШИ и ЫШ)4, фланкирующих участок целевого гена размером 356 п.н., который позволяет проводить не только ПЦР-детекцию и идентификацию трансгенов в зерне и зернопродуктах сои, но и определять их количественное содержание.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для целей фенетического анализа популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка предлагается использовать новые системы описания феноформ рисунка и окраски имаго насекомых.

2. Для молекулярно-генетического анализа популяций насекомых предлагается использовать разработанную методику: «Методика оценки ДНК-полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (КАРБ- и ^БЯ-РСК)».

3. Поиск резистентных к инсектицидам генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых можно проводить с использованием предлагаемого нами подхода.

4. В целях быстрого и эффективного мониторинга ГМ-растений на полях и получаемых на их основе продуктов и кормов использовать предлагаемые нами методы детекции, идентификации и полуколичественной оценки трансгенной вставки в биоматериале.

5. Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы. Изоляции полей с трансгенным картофелем не требуется.

6. Мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному (В1:) картофелю проводить с использованием предлагаемого нами метода: «Метод оценки чувствительности популяций колорадского жука к трансгенному (В^ картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго».

7. На этапе предрегистрационных испытаний оценку пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых проводить с использованием предлагаемого нами подхода и, в частности, оценку В1-картофеля - по предлагаемой нами методике: «Методика оценки пролонгированного действия трансгенного (В1;) картофеля на нецелевых насекомых».

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, доктора биологических наук, Киль, Владимир Ильич, Краснодар

1. Бей-Биенко Г.Я., Богданов-Катъков H.H., Чигарев Г.А., Щеголев В.Н. 1955. Сельскохозяйственная энтомология.-М. Сельхозгиз, 616с.

2. Бенъковская Г.В., Удалое М.Б., Поскряков A.B., Николенко А.Г. 2004. Феногенетический полиморфизм колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say и его чувствительность к инсектицидам на территории Башкортостана. // Агрохимия. №12. С.23-28.

3. Будин К. 3. 1982. Эволюция и филогения видов секции Tuberarium (Dun.) Buk. рода Solanum L. // Труды по прикл. бот., ген. и селекции. ВИР. Т. 73, вып. 2. С. 3-14.

4. Булат С. А., Захаров И. А. 1992. Выявление ДНК методом полимеразной цепной реакции в материале энтомологических коллекций // Журнал общей биологии. Т.53, N6.C.861-863.

5. Бурьянов Я.И. 1999. Успехи и перспективы генно-инженерной биотехнологии растений// Физиология растений.Т.46, №6.С.930-944.

6. Вельков В.В., Соколов М.С., Мёдвинский А.Б. 2003. Оценка агроэкологических рисков производства трансгенных энтомоцидных растений // Агрохимия. №3. С.74-96.

7. Генно-инженерные технологии. 2001 // Информационный дайджест. Центр «Биоинженерия» РАН. N6. 28 с.

8. Генно-инженерные технологии. 2001 // Информационный дайджест. Центр «Биоинженерия» РАН. N7. 24 с.

9. Генно-инженерные технологии. 2002 // Информационный дайджест. Центр «Биоинженерия» РАН. N8. 28 с.

10. Генно-инженерные технологии. 2002 // Информационный дайджест. Центр «Биоинженерия» РАН. N9. 32 с.

11. Глазко В.И., Глазко Т.Т. 2006. ДНК-технологии в генетике и селекции: Курс лекций. Краснодар- 399 с.

12. Глазко В.К, Дунин И.М., Глазко Г.В., Калашникова Л.А. 2001. Введение в ДНК-технологии. М.: ФГНУ «Росинформагротех» - 436 с.

13. Дорохов Д.Б., Клоке Э. 1997. Быстрая и экономичная технология RAPD-анализа растительных геномов // Генетика. Т. 33. №4. С.443-450.

14. Киль В.И., 2009. Методика оценки ДНК полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (RAPD- и ISSR-PCR) // Методические рекомендации. «ООО Просвещение-Юг». Краснодар. 16 с.

15. Киль В.И., Головатенко H.A., 2006. Мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному картофелю по фенетическим маркерам // Агрохимия. №2. С.58-64.

16. Киль В.И., Гронин В.В., Крутенко Д.В., Исмаилов В.Я., 2008. О полиморфизме RAPD-маркеров у различных таксонов полужесткокрылых (Hemiptera) II Сельскохозяйственная биология. №1. С.70-76.

17. Киль В.И., Исмаилов В.Я., 2009. Идентификация резистентных к инсектицидам генотипов в популяции клопа вредная черепашка по фенам рисунка и RAPD-маркерам // Агрохимия. №1. С.38-49.

18. Киль В.И, Исмаилов В.Я., Надыкта В Д. 2003. Выгоды и преимущества возделывания трансгенных растений // Достижения науки и техники АПК. N.10.C.26-30.

19. Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В., 2007.Молекулярно-генетическая структура популяции картофельной минирующей моли Phthorimaea operculella Z. (Lepidoptera:Gelechiidae) // Наука Кубани. №4. С.25-29.

20. Киль В.И., Ширинян Ж.А., 2008. RAPD-анализ популяции хлопковой совки Helicoverpa armígera Hbn. (Lepidopterá:Noctuidae) II Наука Кубани.- Приложение. С. 176-179.

21. Коваленков В.Г., Тюрина Н.М., Казадаева C.B. 2007. Разноуровневая резистентность вредителей сельскохозяйственных культур к инсектоакарицидам и принципы ее биоценотического контроля в условиях Ставрополья // Агрохимия. № 8. С. 48-57.

22. Король Т.С., Новосельская Т.Г. 2001. Мониторинг популяции колорадского жука по рисунку переднеспинки имаго // Биологизация защиты растений: состояние и перспективы. Материалы докл. междунар. конф. 18-22 сентября 2000 г., г. Краснодар. Ч. 2. С. 19-21.

23. Кохманюк Ф.С. 1982. Изменчивость фенетической структуры популяций колорадского жука в пределах ареала. / В кн.: Фенетика популяции. М.: Наука. С. 233-243.

24. Крутенко Д.В. 2006. Изучение вертикального переноса генов от биозащищенных растений к их диким сородичам и традиционно возделываемым сортам. // Автореферат дисс. канд. биол. наук., Краснодар.

25. Медицинские биотехнологии (специальный выпуск), 2000 // Информационный дайджест. Центр «Биоинженерия» РАН. №4. 32с.

26. Романов Г.А. 2000. Генетическая инженерия растений и пути решения проблемы биобезопасности // Физиология растений.Т.47, №3, С.343-353.

27. Рославцева С.А. 2005. Мониторинг резистентности колорадского жука к инсектицидам // Агрохимия. №2. С.61-66.

28. Сидоренко А.П., Березовская О.П. Созинов А.А., 2000. Оценка генетического полиморфизма в популяциях колорадского жука Leptinotarsa decemlineata (Say) по RAPD-маркерам // Генетика. Т. 36. №5. С.651-656.

29. Сидоренко А.П., Березовская О.П. 2001. Индивидуальный полиморфизм по RAPD-маркерам в весенней генерации колорадского жука Leptinotarsa decemlineata (Say) // Генетика. Т.37. №10. С.1348-1352.

30. Сидоренко А.П., Березовская О.П. 2002. Генетическая структура популяций колдорадского жука Leptinotarsa desemlineata (Coleóptera: Chrysomelidae) //Генетика.T.38. № 1 l.C. 1485-1491.

31. Соколов M.C., Марченко А.И., Бельков В.В. и др. 2005. Система эколого-токсикологической оценки генетически модифицированных энтомоцидных растений (концептуальное обоснование) // Агрохимия. №9. С.76-90.

32. Соломина И. П., Макаров П. П. 1986. Современные тенденции в селекции картофеля. М.: ВНИИТЭИагропром. 61с.

33. Сухорученко Г.И. 2001. Резистентность вредных объектов к пестицидам в конце XX столетия // Защита и карантин растений. №6. С. 2328.

34. Сухорученко Г.И. 2005. Экотоксикологический мониторинг основа рационального применения пестицидов // Защита и карантин растений. №1. С. 18-21.

35. Тимофеев-Ресовский Н.В., Яблоков A.B. 1973. Фены, фенетика и эволюционная биология // Природа. №5. С. 40-51.

36. Уайтхед Т., Мак-Интош Т., Финдлей У. 1955. Картофель здоровый и больной. / пер. с англ. под ред. Пушкарева И. И. М.: "Иностранная литература". 608 с.

37. Удалое М.Б., Поскряков A.B., Бенъковская Г.В., Николенко А.Г., 2003. Молекулярно-биологические методы мониторинга резистентности к инсектоакарицидам в популяциях членистоногих // Агрохимия. № 6. С. 81-88.

38. Фасулати С.Р. 1986. Анализ структуры популяций колорадского жука и его значение для разработки зональных систем защиты картофеля // Бюлл. ВИЗР. №63. С. 38-43.

39. Шевелуха B.C. 2001. Эволюция агроэкотехнологий и перспективная стратегия адаптивной селекции растений. Главные задачи отечественной селекции и биотехнологии на ближайшую перспективу // Arpo ХХ1.№1. С. 1416.

40. Шоболта О.М., Переро М. 1996. Питательные среды для выращивания картофельной моли в биолабораториях. // Садоводство и виноградарство. № 2. С. 50.

41. Яблоков A.B., Ларина Н.И. 1985. Введение в фенетику популяций. Новый подход к изучению природных популяций: Учебное пособие для283студентов вузов. М.: Высшая школа. 159с.

42. Abdullahi I, Winter S, Atiri GI, Thottappilly G. 2003. Molecular characterization of whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) populations infesting cassava // Bull. Entomol. Res. Vol.93, N 2. P. 97-106.

43. A Bioengineered Plague. Phenotypes New Insects/Plants Among us // http://www.morphborgs.blog.com. (October, 2006).

44. Agusti, N., De Vicente, M. C., Gabarra, R., 2000. Developing SCAR markers to study predation on Trialeurodes vaporariorum // Insect Molecular Biology, Vol.9. P. 263-268.

45. Allmann M., Candrian U. Hofelein C., Luthy J. 1993. Polymerase chain reaction (PCR): a possible alternative to immunochemical methods ensuring Safety and quality of food//Z.Lebensm.Unters.Forsch.V. 196. P.248-251.

46. Alstad D.N., Andow D.A. 1995. Managing the evolution of insect resistance to transgenic plants// Science. V.268. P. 1894-1896.

47. Alyokhin A. V., Ferro D. N. 1999. Relative fitness of Colorado potato beetle {Coleoptera: Chrysomelidae) resistant susceptible to the Bacillus thuringiensis СгуЗА toxin // J. Econ. Entomol. V. 92. P. 510-515

48. Alvarez, J- M. and Hoy, M. A., 2002. Evaluation of the ribosomal ITS2 DNA sequences in separating closely related populations of the parasitoid Ageniaspis (Hymenoptera: Encyrtidae) // Annals of the Entomological Society of America, Vol. 95. P. 250-256.

49. Althoff, D. M., Thompson, J. N., 2001. Geographic structure in the searching behaviour of a specialist parasitoid: combining molecular and behavioural approaches // Journal of Evolutionary Biology. Vol. 14. P.406-417.

50. Andow D. A., Hutchison W. D. 1998. Bt corn resistance management//In: M. Mellon and J. Rissler (eds.). Now or Never: Serious New Plants to Save a Naturel Pest Control. Union of Concerned Scientists: Cambridge, M.A. P. 16-66.

51. Anon. 1994. The Regulatory Directive Dir94-ll: The biology of Zea mays L. (Corn/Maize) // Plant Biotechnology Office, Plant Health and Production Division, Canadian Food Inspection Agency.

52. Arias D. M., Rieseberg L. H. 1994. Gene Flow between cultivated and wild sunflower // Theor. Appl. Genet. V. 89. P. 655-660.

53. Arndt G. C., Rueda J. L., Kidane-Mariam H. M, Peloquin S. J. 1990. Pollen fertility in relation to open pollinated true seed production in potatoes. // American Potato Journal. V. 67. P. 499-505.

54. Arnold M. L. 1997. Natural hybridization and evolution. N. Y.: Oxford University Press. 196 p.

55. Arriola P. E., Ellstrand. 1997. Fitness of interspecific hybrids in the genus Sorghum: persistence of crop genes in wild populations. // Ecol. Appl. V. 7. P. 512-518.

56. Bateman, A. J., 1947. Contamination in seed crops I. Insect pollination // J. Genet. V.48. P. 257-275.

57. Bonnett O. T„ 1947. Development of the corn kernel // In: Growth and development of the corn plant. American Seed Trade Association. P. 32-36.

58. Burdon J. J. 1987. Diseases and plant population biology. New York: Cambridge University Press, 148 p.

59. Barton K., Binns A., Matzke A., Chilton M.-D. 1983. Regeneration of intact tobacco plants containing full length copies of genetically engineered T-DNA to R1 progeny// Cell.V.32.P. 1033-1043.

60. Bartsch D., Schmidt M., Pohl-Orf M. e. a. 1996. Competitiveness of transgenic sugar beet resistant to beet necrotic yellow vein virus and potential impact on wild beet populations. // Mol. Ecol. V. 5. P. 199-205.

61. Beard C.B., Durvasula R.V., Richards F.F., 2000. Bacterial symbiont transformation in Chagas disease vectors // In: Insect Transgenesis. Methods and Applications. / Eds. A. M. Handler and A. A. James. CRC Press, Boca Raton. FL. pp. 289-303.

62. Beard C.B., Mason P.W, Aksoy S., et al., 1992. Transformation of an insect symbiont and expression of a foreign gene in the Chagas' disease vector Rhodniusprolixus // Amer. J. Trop. Med. Hyg. Vol.46. P. 195-200.

63. Beard C.B., O'Neill S.L., Tesh R.B., et al, 1993. Modification of arthropod vector competence via symbiotic bacteria // Parasitol. Today. Vol. 9. P. 179-183.

64. Beaty B.J., 2000. Genetic manipulation of vectors: a potential novel approach for control of vector-borne diseases // Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 97. P. 10295-10297.

65. Behura S.K., 2006. Molecular marker systems in insects: current trends and future avenues //Molecular Ecology. Vol. 15. P. 3087-3113.

66. Berghammer A.J, Klingler M., Wimmer E.A., 1999. A universal marker for transgenic insects //Nature. Vol. 402. P. 370-371.

67. Blake N.K., Ditterline R.L., Stout R.G. 1991. Polymerase chain reaction used for monitoring multiple gene integration in Agrobacterim-mediated transformation// Crop Science.V.31. P.1686-1688.

68. Brand A. 1995. GFP in Drosophila // Trends Genet. Vol. 11. P.324-325.

69. Brouat C., Sennedot F., Audiot P., et al., 2003. Fine-scale genetic structure of two carabid species with contrasted levels of habitat specialization // Molecular Ecology. Vol.12. P. 1731-1745.

70. Canadian Food Inspection Agency (CFIA). 2000. .Summary of Consultation on Pest resistance management strategies for Bt potatoes. January 20. (htt^://www.inspection.gc.cayenglish/plaveg/pbo/bt/potpome.shtml).

71. Cao J, Zhao JZ, Tang D, et al., 2002. Broccoli plants with pyramided cry 1 Ac and crylC Bt genes control diamondback moths resistant to CrylA and CrylC proteins // Theor Appl Genet. V. 105. N 2-3. P. 258-264.

72. Carriere Y, Ellers-Kirk C, Liu YB, et al., 2001. Fitness costs and maternal effects associated with resistance to transgenic cotton in the pink bollworm (Lepidoptera: Gelechiidae)// J. Econ. Entomol. . V.94, N6. P. 1571-1576.

73. Carriere Y, Ellers-Kirk C, Patin AL, et al., 2001. Overwintering cost associated with resistance to transgenic cotton in the pink bollworm (Lepidoptera: Gelechiidae)// J. Econ. Entomol. V.94, N4. P. 935-941.

74. Carriere Y, Ellers-Kirk C, Sisterson M, et al, 2003. Long-term regional suppression of pink bollworm by Bacillus thuringiensis cotton// PNAS USA. V.100. N4. P. 1519-1523.

75. Cassanelli S., Reyes M., Rault M., et al., 2006. Acetylcholinesterase mutation in an insecticide-resistant population of the codling moth Cydia pomonella (L.) // Insect Biochemistry and Molecular Biology. Vol.36. N 8. P.642-653.

76. Chalmers, K.J., Waugh J.I., Sprent A.J., Simons A.J., Powell W. 1992. Detection of genetic variation between and within populations of Gliricidia sepium and G.maculata using RAPD markers // Heredity. V.69. P.465-472.

77. ChalfieM., Tu Y, Euskirchen G., etal, 1994. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science. Vol. 263. P. 802-805.

78. Chaufaux J, Muller-Cohn J, Buisson C. e.a 1997. Inheritance of resistance to the Bacillus thuringiensis Cry IC Toxin in Spodoptera Littoralis2871.pidoptera: Noctuidae)//J. Econ. Entomol. V. 90. №4. P. 873-878.

79. Chin E. C. L., Senior M. L., Shu H. et al. 1996. Maize simple repetitive DNA sequences: abundance and allele variation // Genome. V. 39. P. 866-873.

80. Coates C.J., Jasinskiene N., Miyashiro L., James A.A. 1998. Mariner transposition and transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti // PNAS. Vol. 95. P. 3748-3751.

81. Coates C.T., Jasinskiene N., Pott G.B., James A.A. 1999. Promoter-directed expression of recombinant fire-fly luciferase in the salivary glands of //ernes-transformed Aedes aegypti /'Gene (Amsterdam). Vol. 226. P. 317-325.

82. Coates C.J., Turney C.L., Frommer M, et al, 1995. The transposable element mariner can excise in non-drosophilid insects. // Mol. Gen. Genet. Vol. 249. P. 246-252.

83. Coates C.J., Turney C.L., Frommer M, et al 1997. Interplasmid transposition of the mariner transposabie element in non-drosophilid insects // Mol. Gen. Genet. Vol. 253. P.728-733.

84. Collins F.H., Kamau L., Ranson H.A., Vulule J.M. 2000. Molecular entomology and prospects for malaria control // Bull World Health Org. Vol. 78. P.1412-1423.

85. Comparison of the ABI 7700 system (TagMan) and competitive PCR for quantitation of IS6110 DNA in sputum during treatment of tuberculosis. 1998. // J.Clin.Microbiol. V.36. P.1964-1968.

86. Crampton J.M., 1994. Molecular studies of insect vectors of malaria // Adv. Parasitol.Vol. 34. P. 1-31.

87. Crampton J.M., Morris A., Lycett G., et al. 1990. Transgenic mosquitoes: a future vector control strategy? // Parasitol. Today. Vol. 6. P. 31-36.

88. Cupta M., Chyi Y-S, Romero-Severson J, Owen JL. Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats // Theoretical and Applied Genetics, 1994. Vol. 89. P. 998-1006.

89. Curtis C.F., 2001. Present and future control of malaria // Science. Vol. 291. P. 436.

90. Cuthbertson A.G.S., Fleming C.C., Murchie A.K., 2003. Detection of Rhopalosiphum insertum (Apple-grass aphid) predation by the predatory mite Anystis baccarum using molecular gut analysis // Agricultural and Forest Entomology, Vol.5. P. 219-225.

91. Daniell H., Datta R., Varma S. e. a. 1998. Containment of herbicide resistance through genetic engineering of the chloroplast genome. // Nat. Biotechnol. V. 16. P. 345-348.

92. De La Rua P., Galian J., Serrano J., Moritz R. F. A., 2003. Genetic structure of Balearic honeybee populations based on microsatellite polymorphism // Genetics Selection Evolution, Vol.35. P. 339-350.

93. De La Rua P., Galian J., Serrano J., Moritz R. F. A., 2001. Molecular characterization and population structure of the honeybees from the Balearic islands (Spain) H Apidologie, Vol.32. P. 417-427.

94. Doebley, J., Stec, A., Wendel, J. & Edwards, M. 1990. Genetic and orphological analysis of a maize-teosinte F2 population: Implications for the origin of maize //PNAS USA, V.87. P. 9888-9892.

95. Dunwell, J. M. 2000. Transgenic approaches to crop improvement // J Experiment Bot. Vol.51. P.487-496.

96. Durvasala R, Gumbs A., Panackal A., et al, 1997. Prevention of insect borne disease: an approach using transgenic symbiotic bacteria // PNAS USA. Vol. 94. P. 3274-3278.

97. Edwards 0. R., Hoy M. A., 1993. Polymorphism in two parasitoids detected using random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction//Biological Control, Vol. 3. P. 243-257.

98. Eggleston P., 1991. The control of insect-borne disease through recombinant DNA technology // Heredity. Vol.66. P. 161-172.

99. Elick T.A., Bauser C.A., Eraser M.J. 1996. Excision of the piggyBac transposable element in vitro is a precise event that is enhanced by the expression of its encoded transposase // Genetica (Dordrecht). Vol. 98. P. 33-41.

100. Elick TA., Lobo N„ Eraser MJ. 1997. Analysis of the cis-acting DNA elements required for piggyBac transposable element excision // Mol. Gen. Genet. Vol.289255. P. 605-610.

101. Ellstrand N. C. 1992. Gene Flow by pollen: implications for plant conservation genetics. // Oikos. V. 63. P. 77-86.

102. Ellstrand N. C., Hoffman C. A. 1990. Hybridization as an avenue for the escape of engineered genes. // Bioscience.V. 40.P. 438-442.

103. Ellstrand N. C., Prentice H. C., Hancock J. R. 1999. Gene flow and introgression from domesticated plants into their wild relatives // Annual Review of Ecology & Systematics. V. 30. P. 539-563.

104. Emberlin, J., Adams-Groom, B. & Tidmarsh, J. 1999. The dispersal of maize (Zea mays) pollen // A report commissioned by the Soil Association: National Pollen Research Unit, University College Worcester, UK.

105. English L., Slatin S. L. 1992. Mode of action of delta-endotoxins from Bacillus thuringiensis: a comparison with other bacterial toxins. // Insect. Biochem. Mol. V.22. P. 1-7.

106. Endersby, N.M., McKechnie, S.W., Ridland, P.M. et al. 2006. Microsatellite reveal lack of structure in Australian populations of the diamondback moth, Plutella xylostella (L.) // Mol. Ecol. Vol. 15. P. 107-118.

107. Endersby, N.M., Hoffmann, A.A., McKechnie, S. W., Weeks, A.R. 2007. Is There genetic structure in populations of Helicoverpa armigera from Australia? // Entomol. Exp. Appl. Vol.122. P.253-263.

108. Esse link G.D., Belder E., Elderson J., Smulders M.J.M., 2006. Isolation and characterization of trinucleotide repeat microsatellite markers for Plutella xylostella L. // Molecular Ecology Notes. Vol.6, N 4. P. 1246 1248.

109. Essential Biosafaty. 2000. Agriculture and Biotechnology Strategies

110. AGBios) Inc. ( http: // biobel. basnet.by / biosafaty/agbios/static/SHORT24.html).

111. EPA (US Environmental Protection Agency). 2000. Pesticide Fact Sheet: Bacillus thuringiensis Cry III(A) delta endotoxin and the genetic material necessary for its production in potato. April. EPA.Pub.Number: 730-F-00-008. 1 lp.

112. European Commission Official Journal. 2000 /L 006, 13-14.

113. Fagan L., Schoel B., Haegert A. e.a. 2001. Performance assessment under field conditions of a rapid IMMUNOLOGICAL TEST FOR TRANSGENIC SOYBEANS // Int.J.of Food Science and Technology. V.36. P.357-367.

114. Feitelson J.S, Payne J., Kim L. 1992. Bacillus thuringiensis: insects and beyond//Bio/Technology. V. 10. P. 271-275.

115. Ferre J., Real M. D., van Rie J. e.a. 1991. Resistance to the Bacillus thuringiensis bioinsecticide in field population of Plutella xylostella is due to a change in a midgut membrane receptor. // PNAS USA. V. 88. P. 5119-5123.

116. Ferre J., Van Rie. 2002. Biochemistry and genetics of insect resistance to Bacillus thuringiensis. II Annu. Rev. Entomol. V. 47. P. 501-533.

117. Foster G.G., 1973. Temperature-sensitive mutations in Drosophila melanogastenXUI. Temperature-sensitive periods of the lethal and morphological phenol-types of selected combinations of Notch-locus mutations. // Dev. Biol. Vol. 32. P. 282296.

118. Ffrench-Coustant R. H., Roush R. T. 1990. In. Pesticide Resistance in Arthropods; Roush R. T., Tabashnik B.E. (eds); Chapman and Hall, N. Y., P. 4-38.

119. Franck P., Guerin F., Loiseau A., Sauphanor B.t 2005. Isolation and characterization of microsatellite loci in the codling moth Cydia pomonella L. (Lepidoptera, Tortricidae) // Molecular Biology Notes. Vol.5. N 1. P. 99-102.

120. Franck P., Reyes M., Olivares J., Sauphanor B., 2007. Genetic architecture in codling moth populations: comparison between microsatellite and insecticide resistance markers // Mol. Ecology. Vol.16. P. 3554-3564.

121. Fredshaven, J. R. and G. S. Poulsen. 1996. Growth behavior and competitive ability of transgenic crops // Field Crops Res. Vol. 54. P. 11-18.

122. Fryxell K.J., Miller T.A 1995. Autocidal biological control: A general strategy for insect control based on genetic transformation with a highly conserved gene // J Econ Entomol. Vol. 88. P. 1221-1232.

123. Fuentes-Contreras E., Espinoza J.L., Lavandero B., Ramirez C.C., 2008. Population Genetic Structure of Codling Moth (Lepidoptera: Tortricidae) from Apple Orchards in Central Chile // Journal of Economic Entomology. Vol.101. N 1. P. 190198.

124. Gahan L. J., Gould F., Heckel D. G. 2001. Indentification of gene associated with Bt resistance in Heliothis virescens. II Science. V. 293. P. 857-860.

125. Gary L.C., Goebel M, Corsaro H.H., et al., 1989. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-Locus of nuclear polyhedrosis viruses // Virology. Vol. 161. P. 8-17.

126. Gasser C. S., Fraley M. 1989. Genetically engineered plants for crop improvement. // Science. V. 244. P. 1293-1299.

127. Gene Flow / Outcrossing questions . 2001 // SAP report № 2000-07. March 12, (http://www.epa.gov).

128. Genetically modified Crops and Foods. 2000 // Report of the American Medical Association Council on Sci. Affairs (CSA). 263p.

129. Genetically Modified Pest-protected plants: Science and regulation. 2000 // US National Research Council -National Academy Press: Washington, DC, USA-214 p.

130. Georghiou G. P., 1990. Overview of Insecticide Resistance // Managing Resistance to Agrochemicals / Eds. M. B. Green, et al., Washington, DC: American Chemical Society. P. 18-41.

131. Georghiou G. P. 1994. Principles of insecticide resistance management. //Phytoprotection. V. 75 (suppl.). P. 51-59.

132. Gonzalez-Cabrera J, Herrero S, Ferre J. 2001. High genetic variability for resistance to Bacillus thuringiensis toxins in a single population of diamondback moth// Appl. Environ. Microbial. V. 67. P. 5043-5048.

133. Gonzalez-Cabrera J, Herrero S, Sayyed AH, et al., 2001. Variation in susceptibility to Bacillus thuringiensis toxins among unselected strains of Plutella xylostella //Appl. Environ. Microbiol. V.67, N.10. P.4610-4613.

134. Gopinathan K.P., 1992. Biotechnology in sericulture // Current Sci. Vol. 62. P. 283-287.

135. Goto F. et.al. 1999 //Nature Biotechnology.V. 17. P.282-286.

136. Gould F. 1986. Simulation models for predicting durability of insect-resistant germ plasm: A deterministic diploid, two-locus model // Environ. Entomol. V. 15. P. 1-10.

137. Gould, F. 1986. Simulation models for predicting durability of insect-resistant germ plasm: Hessian fly (Diptera: Cecidomyiidae)-resistant winter wheat//Environ. Entomol. V. 15. P. 11-23.

138. Gould F. 1998. Evolutionary biology and genetically engineered crops // Bioscience. V. 38. P. 26-33.

139. Gould F. 1998. Sustainability of transgenic insecticidal cultivars: Integrating pest genetics and ecology // Annu. Rev. Entomol. V. 43. P. 701-726.

140. Grant V. 1981. Plant speciation // Columbia University Press, N.Y. 203p.

141. Gray P. J. 2000. The transfer of traits to wild relatives // BCPC Symp. Proc. No. 74: Predicting field performance in crop protection. P. 165-174.

142. Gray A. J., Raybould A. F. 1999. Environmental risks of herbicide-tolerant oilseed rape // DETR Research Report.-London, № 15.P. 96-100.

143. GresselJ. 1999. Tandem constructs: preventing the rise of superweeds. // Trends Biotechnol. V. 17. P. 361-366.

144. Gresswel J. E., Bassom A. P., Bell S. A. e. a., 1995. Predicted pollen dispersal by honey-bees and three species of bumble bee foraging on oilseed rape: A comparison of three models. // Funct. Ecol. V. 9. P. 829-842.

145. Griffitts J. S., Whitacre J. L., Stevens D. E., Aroian R. V. 2001. Bt toxin resistant from loss of putative carbohydrate-modifying enzyme. // Science. V. 293.1. P. 860-864.

146. Grossman G.L., Rafferty C.S., Fraser M.J., Benedict M.Q., 2000. The piggyBac element is capable of precise excision and transposition in cells and-embryos of the mosquito, Anopheles gambiae. //Insect Biochem. Molec. Biol. Vol. 30. P. 909-914.

147. Groeters FR, Tabashnik BE. 2000. Roles of selection intensity, major genes, and minor genes in evolution of insecticide resistance// J. Econ. Entomol.V.93. N.6. P.1580-1587.

148. Guretzky J. A., Louda S. M. 1997. Evidence for natural biological control: insects decrease survival and growth of native thistle. // Ecol. Appl. 1997. V. 7. P. 1330-1340.

149. Haffani YZ, Cloutier C, Belzile FJ. 2001. Bacillus thuringiensis cry3Cal protein is toxic to the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say)// Biotechnol Prog. V. 17. P. 211-216.

150. Hall H. G., 1998. PCR amplification of a locus with RFLP alleles specific to African honey bees // Biochemical Genetics, Vol. 36. P. 351 -361.

151. Handel S. N. 1983. Pollination ecology, plant population structure, and gene flow. // Pollination biology (L. Real ed.). Academic Press, Orlando, FL. P. 163211.

152. Handler A.M., Harrell III R.A. 1999. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector // Insect Mol. Biol. Vol. 8. P. 449-457.

153. Handler A.M., Harrell III R.A., 2001. Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. // Insect Biochem. Mol. Biol. Vol. 31. P. 199-205.

154. Handler A.M., McCombs S.D., Fraser M.J., Saul S.H. 1998. The lepidopteran transposon vector, piggyBac, mediates germ line transformation in the

155. Mediterranean fruit fly // PNAS USA Vol.95. P. 7520-7525.

156. Hupfer C., Hotzel H„ Sachse K., Engel K.H. 1998.Detection of genetic modification in heat treated products of Bt-maize by polymerase chain reaction// Z.Lebensm.Unters.Forsch. V.206. P.203-207 (German).

157. Hassan-Hauser C., Mayer W., Hörtner H. 1998. Detection of the starch modifying gbss-antisense construct in transgenic potatoes// Z.Lebensm.Unters.Forsch. V. 206. P.83-87 (German).

158. Hawthorne D.J., 2001. AFLP-based genetic linkage map of the Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata: sex chromosomes and a pyrethroid-resistance candidate gene // Genetics. Vol.158. P. 695-700.

159. Hechel D.G. 1994. The complex genetic basis of resistance to Bacillus thuringiensis toxins in insects//Biocontrol. Sei. Technol. V.4. P. 405-417.

160. Hechel D.G., Gahan L.J., Liu Y.B., et al. 1999. Genetic mapping of resistance to Bacillus thuringiensis toxins in diamondback moth using biphasic linkage analysis II PNAS USA. Vol.96. P. 8373-8377.

161. Heckel D. G., Gahan L. J., Daly J. C., Trowell S. 1998. A genomic approach to understanding Heliothis and Helicoverpa resistance to chemical and biological insecticides. // Phil. Trans. R. Soc. London Ser. B 353. P. 1713-1722.

162. Hedinger M., Niessen M., Wimmer E.A., et al., 2001. Genetic transformation of the housefly Musca domestica with the lepidopteran derived transposonpiggyBac // Insect Mol. Biol. Vol.10. P. 113-119.

163. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. 1996. Real time quantitative PCR// Genome Res.Vol.6. P.986-994.

164. Herrera-Estrella R. 2000. // Plant Physiol.V.124, N3. P.923-925.

165. Herrera-Estrella L., Depicker A., Van Montagu M., Svhell J. 1983. Expression of Chimeric Genes Transfered into plant cell ising a Ti-plasmidderived vector// Nature. V.303 .P.209-213.

166. Higgs S., Lewis D.L. 2000. Green fluorescent protein (GFP) as a marker for transgenic insects // in "Insect Transgenesis: Methods and Applications" /Eds A.M. Handler and A.A. James. CRC Press, Boca Raton. FL. pp. 93-108.

167. Hokanson S. G, Grumet R., Hancock J. F. 1997. Effect of border rows and trap / donor ratios on pollen-mediated gene movement. // Ecol. Appl.V. 7. P. 1075-1081.

168. Hoy M. A., Jeyaprakash A., Morakote R., et al., 2000. Genomic analyses of two populations of Ageniaspis citricola (Hymenoptera: Encyrtidae) suggest that a cryptic species may exist // Biological Control, Vol.17. P.l-10.

169. Huang F., Buschman L.L., Higgins R.A., McGaughey W. H. 1999. nheritance of resistance to Bacillus thuringiensis toxin (Dipel ES)) in the Europian Corn borer II Science. V.284. P.965-967

170. Implications of Testing and Segregating Nonbiotech Crops for Grain Grades and Standarts. -2000. / U.S.Department of Agricultural, Economic Research Service, Economic Issues in Agric.Biotechnology/ AIB-762.

171. Ingram, J. 2000. Report on the separation distances required to ensure296cross-pollination is below specified limits in non-seed crops of sugar beet, maize and oilseed rape // MAFF Project. -No. RG0123.

172. Ioannidis P.I., Grafius E.J., Whalon M.E. 1991. Patterns of insecticide resistance to azinphosmethyl, carbofuran, and permethrin in the Colorado potato beetle (Coleóptera: Chrysomelidae) //J.Econ. Entomol. V. 84. P. 1417-1423.

173. Jack G., Goruhardt B., Mundy J. e.a 1995. Enhanced quantitative resistance against fungal diseases by combinatorial expression of different barley antifungal proteins in transgenic tobacco // Plant J. V. 8. P.97-109.

174. James A.A., 2001. Present and future control of malaria // Science. Vol. 291.1. P. 435.

175. James C. 2001. Global review of commercialized transgenic crops: 2000 // ISAAA Briffs. N21 .ISAAA:Ithaca, NY.

176. James C., 2003. Global review of commercialized transgenic crops: 2002 // ISAAA Briefs. N27. ISAAA: Ithaca, NY.

177. Jang J.S., Ju T.-A., Cheng G.-H., Yeh S.-D. 1996. Transgenic papaya plants from Agrobacterium mediated transformation of petioles of in vitro propagated multishoots// Plant Cell Reports, V.15. P.459-464.

178. Jasinskiene N., Coates C.J., Benedict M.O., et al. 1998. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly // PNAS. Vol. 95. P. 3743-3747.

179. Ji Ya-Jie, Zhang De-Xing. 2004. Charateristics of microsatellite DNA in lepidopteran genomes and implications for their isolation // Acta Zoologica Sinica, V. 50 (Issue 4). P. 608-614.

180. Ji Y. J., Zhang D. X., Hewitt G. M., KangL., Li D. M. 2003. Polymorphic microsatellite loci for the cotton bollworm Helicoverpa armígera (Lepidoptera: Noctuidae) and some remarks on their isolation. // Molecular Ecology Notes. Vol. 3. N l.P. 102-104.

181. Johnston S. A., T. P. M. den Nijs., S. J. Peloquin, R. E. Hanneman, Jr., 1980. The significance of genie balance to endosperm development in interspecific crosses. // Theoretical and Applied Genetics. V. 57. P. 5-9.297

182. Jones D. 1998. Paper Presented to the research and development perspectives workshop. // Agricultural Biotech. And Environmental Quality : Gene Escape and Pest Resistance. NABC Report 10. P. 11-14 (http://www.cals.cornell.edu/extension/nabc).

183. Jones, M. D. & Brooks, J. S., 1950. Effectiveness of distance and border rows in preventing outcrossing in corn // Oklahoma Agricultural Experimental Station, Technical Bulletin. No. T-38.

184. Jones, M. D. & Brooks, J. S. 1952. Effect of tree barriers on outcrossing in corn. Oklahoma Agricultural Experimental Station // Technical Bulletin. No T-45.

185. Keller I., Largiader C. R., 2003. Five microsatellite DNA markers for the ground beetle Abax parallelepipedus (Coleoptera, Carabidae) // Molecular Ecology Notes, Vol. 3. P. 113-114.

186. Kinderlerer, J. 2001. Effects on non-target organisms of the release of genetically modified crops into the environment // R. Custers, Editor. Safety of Genetically Engineered Crops. Jo Bury VIB Publishers, Zwijnaarde, Belgium. P. 88107.

187. Klassen W., Knipling E.F., McGuire J.U., 1970. The potential for insect population suppression by dominant conditional lethal traits // Ann.Entomol.Soc.Am. Vol.48. P. 459-462.

188. Kleppe K, Ohtsuku E., Kleppe R., e.a 1971. Studies on polynucleotides. Repair replication, of short synthetic DNAs as catalysed by DNA polymerase // J.Mol.Biol.V.56. P.341-361.

189. Klinger T., Ellstrand N. C. 1994. Engineered genes in wild populations: fitness of weed-crop hybrids of Raphanus sativus. // Ecological Application. V. 4. P. 117-120.

190. Knowles B. H., Dow J.A.T. 1993. The crystal 5-endotoxin of Bacillus thuringiensis: models for their mechanism of action on the insect gut. // BioEssays. V. 15. P. 469-475.

191. Koller C. N., Bauer L. S., Hollingworth R. M. 1992. Characterisation of the pH-mediated solubility of Bacillus thuringiensis var. sandiego native 5-endotoxin crystals. // Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 184. P. 692-699.

192. Kota M., Daniell H., Varma S. e.a. 1999. Overexpression of the Bacillus thuringiensis (Bt) Cry2Aa2 protein in chloroplasts confers resistance to plants against susceptible and Bt-resistant insects // Proc. Natl. Acad. USA. V. 96. P. 1840-1845.

193. Krohn A., Pfleger H. 1994. Alles Kase-der "Hurdenlauf' des Chymosins aus anwalilicher Sicht. ZLR, 5-6:511-528.

194. Kuvshinov V., Koivu K, Kanerva A., Pehu E. 2001. Molecular control oftransgene escape from genetically modified plants // Plant science. V. 160. P. 517522.

195. Langevin S. A., Clay K., Grace J. 1990. The incidence and effects of hybridization between cultivated rice and its related weed red rice (Oryza sativa L.). // Evolution. V. 44. P. 1000-1008.

196. Lee M. K., Rajamohan F„ Gould F., Dean D. H. 1995. Resistance to Bacillus thuringiensis Cry 1A 8-endotoxin in a laboratory-selected Heliothis virescens straine is related to receptor alteration. // Appl. Environ. Microbiol. V. 61. P. 38363842.

197. Lefol E., Danielou V., Darmency H. 1996. Predicting hybridization between transgenic oilseed rape and wild mustard // Field Crops Research.V 45.P. 153-161.

198. Lerv X, LaRue B, Cossette J, Charpentier G. 2003. Characterization and authentication of insect cell lines using RAPD markers // Insect Biochem Mol Biol. 0ct;33(10). P. 1035-41.

199. Liebherr J. K., 1986. Comparison of genetic variation in two carabid beetles (Coleoptera) of differing vagility // Annals of the Entomological Society of America. Vol. 79. P. 424-433.

200. Liebherr J. K., 1988. Gene flow in ground beetles {Coleoptera, Carabidae) of differing habitat preference and flight-wing development // Evolution. Vol. 42. P. 129-137.

201. Lipp M, Anklam E, Stave J. W. e.a. 2000. Validation of an immunoassay for detection and quantitation of a genetically modified soybean in food and food fractions using reference materials: interlaboratory study // J.AOACInt. V.83(4). P.919-927.

202. Liu, Y.B., Tabashnik B.E., 1997. Experimental evidence that refuges delay insect adaptation to Bacillus thuringiensis// Proc. Roy. Soc. Lond. Ser.B. V. 264. P. 605-610.

203. Liu Y-B., Tabashnik B.E., Dennehy T.J., et al., 1999. Development time and resistance to Bt crops^ // Nature. V.400. P. 519.

204. Liu YB, Tabashnik BE, Dennehy TJ, et al, 2001. Effects of Bt cotton and crylac toxin on survival and development of pink bollworm (Lepidoptera: Gelechiidae)// J. Econ. Entomol. V.94, N5. P. 1237-1242.

205. Liu YB, Tabashnik BE, Meyer SK, Crickmore N. 2001. Cross-resistance and stability of resistance to Bacillus thuringiensis toxin CrylC in diamondback moth.//Appl Environ. Microbiol. V.67, N7. P.3216-3219.

206. Lobo N.F., Hua-Van A., LiX., et al., 2002. Germ line transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, mediated by transpositional insertion of a piggyBac vector // Insect Mol. Biol. Vol. 1 1. P. 133-139.

207. Loseva O, Ibrahim M, Candas M, et al., 2002. Changes in protease299activity and Cry3Aa toxin binding in the Colorado potato beetle: implications for insect resistance to Bacillus thuringiensis toxins // Insect Biochem Mol Biol. V. 32. P. 567-577.

208. Losey JRayor L., Carter M. 1999. Transgenic pollen harms monarch larvae //Nature. V.399. N 6733. P.1710-1716.

209. Loukeris T.G., Area B., Livadaras /., et al, 1995. Introduction of the transsposable element Minos into the germ line of Drosophila melanogaster // PNAS. Vol.92. P.9485-9489.

210. Loxdale H. D., Lushai O., 1998. Molecular markers in entomology. // Bulletin of Entomological Research,"Vol. 88. P. 577-600.

211. Lynch M., Milligan B. G., 1994. Analysis of population genetic structure with RAPD markers I I Molecular Ecology, Vol. 3. P. 91-99.

212. Lushai G., Loxdale H. D., Brookes C. P., et.al, 1997. Genotypic variation among different phenotypes within aphid clones // Proceedings of the Royal Society, London, Series B, Vol. 264. P. 725-730.

213. Lushai G., Markovitch O., Loxdale H.D., 2002. Host-based genotype variation in insect revisited // Bulletin Entomol. Res. Vol. 92. P. 159-164.

214. Macdonald C., Brookes C.P., Edwards K.J., et al., 2003. Microsatellite isolation and characterisation in the beneficial parasitoid wasp Diaeretiella rapae (M'lntosh) (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiidae) // Molecular Ecology Notes, Vol. 3. P. 601-603.

215. MacDonald C., Loxdale H.D., 2004. Molecular marcers to study population structure and dynamics in beneficial insects (predators and parasitoids) // International Journal of Pest Management. Vol. 50. N 3. P. 215-224.

216. Margaritopoulos J.T., Bacandritsos N., Pekas A.N., e.a. 2003. Genetic variation of Marchalina hellenica (Hemiptera: Margarodidae) sampled from different hosts and localities in Greece // Bull. Entomol. Res. Vol.93. N 5. P. 447-53.

217. Matten S. R. 1998. EPA regulation of plant-pesticides and Bt plant-pesticide resistance management// NABC Report 10. P. 121-143. (http://www.cals.cornell.edu/extension/nabc).

218. Matten S. R. Lewis P. I. Tomimatsu G. e.a. 1996. The US environmental protection agency's role in pesticide resistance management // In.: Molecular genetics and evolution of pesticide resistance; Ed. T. Brown. ACS. Washington. DC. P. 243-253.

219. McGaughey W. H., Beeman R. W. 1988. Resistance to Bacillus thuringiensis in colonies of Indianmeal moth and almond moth (Lepidoptera:Pyralidae)//J.Econ. Entomol. V. 81. P. 28-33.

220. McCaughey W.H., Whalon M.E. 1992. Managing Insect resistance to Bacillus thuringiensis toxins// Science. V.258. P. 1451-1455.

221. Mclnnis D.O., D.R. Lance D.R., C.G. Jackson C.G. 1996. Behavioral resistance to the Sterile Insect Technique by Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) in Hawaii //Ann. Entomol. Soc. Am. Vol. 89. P. 739-744.

222. Meyer R. 1995. Detection ot genetically engineerid plants the FLAVR SAVR tomato as an example// Z.Lebensm.Unters.Forsch. V.201. P.583-586 (German).

223. Meyer R., Candrian U., Lüthy J. 1993. Tierartbestimmung und Soyanachweis in erhitzten Fleischprodukten mittels der Polymerase Kettenreaktion // Mitt.Gebiete Lebensm.Hyg., V.84. P.l 12-121.

224. Mikkelsen T. R., Andersen B., Jorgensen R. B. 1996. The risk of crop transgene spread//Nature. V. 380.P. 31.

225. Miller T.A., 2004. Use of transgenic insects in plant protection. // Proceedings of the 15th International Plant Protection Congress. "Plant protection towards the 21st century", Beijing, China, May 11-16, P.17-21.

226. Miller T. 2005. Designing insects. //http://www.actionbioscience.org/biotech/miller.html

227. Mitchell A., Mitter C., Regier J.C., 2006. Phylogeny of Noctuidae (Lepidoptera): Evidence from nuclear protein-coding genes // Systematic Entomology. Vol. 31. P. 21-46.

228. Mitchell A., Samways M.J., 2005. DNA evidence that the morphological 'forms' of Palpopleura lucia (Drury) are separate species (Odonata: Libellulidae). // Odonatologica. Vol. 34. P. 173-178.

229. MollS. 1998. //Brighton CropProf. Conf."Weeds": Proc. Int. Conf. Brit. Crop.Prot.Counc., Brighton, 17-20 Nov., 1997.Vol.3.Farnham, P.931-940.

230. Moya A, Guirao P., Cifuentes D., e.a. 2001. Genetic diversity of Iberian populations of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) based on random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction //Mol. Ecol. Vol.10. N 4. P. 891-897.

231. Naimov S, Weemen-Hendriks M, Dukiandjiev S, de Maagd RA. 2001. Bacillus thuringiensis delta-endotoxin Cryl hybrid proteins with increased activity against the Colorado potato beetle // Appl Environ Microbiol. V. 67. P. 5328-5330.

232. National Research Council. Genetically modified pest-protected plants: Science and regulation. 2000.// Washington. DC: National Academy Press; V. 1. P. 81-93.

233. Navarro, Mariechel J. (Ed.) 2009. Communicating Crop Biotechnology: Stories from Stakeholders. ISAAA Brief No. 40. IS AAA: Ithaca, NY.

234. Nei,M, W.H. Li. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Vol.76. P. 5269-5273.

235. New Report Finds Genetically Modified Insects May Offer Public Health And Agricultural Benefits, But Clear Regulatory Oversight Is Lacking // http://www.ScienceDaily.com (Jan. 22, 2004)

236. O'Brochta D.A., Warren W.D., Saville K.J., Atkinson P. W., 1996. Hermes, a functional non-drosophilid insect gene vector from Musca domestica. // Genetics. Vol.142. P. 907-914.

237. Oppert B., Kramer K. J., Beeman R. W. e.a. 1997. Proteinase-mediatedinsect resistance to Bacillus thuringiensis toxins. // J. Biol. Chem. V. 272. P. 2347323476.

238. Oppert B., Kramer K. J., Johnson D. E. e.a. 1994. Altered protoxin activation by midgut enzymes from a Bacillus thuringiensis resistant strain of Plodia interpunctella. // Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 198. P. 940-947

239. Owen, M. D. K. 2001. World maize/soybean and herbicide resistance // In S. B. Powles and D. L. Shaner (eds.). Herbicide Resistance and World Grains. CRC Press, Boca Raton, Florida. P. 101-163.

240. Patemiani, E. & Stort, A. C. 1974. Effective maize pollen dispersal in the field//Euphytic. V.23. P. 129-134.

241. Peakall R. 1989. A new technique for monitoring pollen flow in orchids //Oecologia (Berl.) V. 79. P. 361-365.

242. Peloquin J J., Thibault S.T., Staten R., Miller T.A., 2000. Germ-line transformation of pink bollworm (Lepidoptera: Gelechiidae) mediated by the piggyBac transposable element. // Insect Mol Biol. Vol. 9. P. 323-333.

243. PengJ.R. et. al. 1999//Nature.V.400.P.256-261.

244. Perera O.P., Harrel R.A., Handler A.M., 2002. Germ-line transformation of the South American malaria vector. Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient // Insect Mol. Biol. Vol. 11. P. 291-291.

245. Perez C.J., Shelton A.M. 1997. Resistance of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae), to Bacillus thuringiensis Berliner in Central America// J. Econ. Entomol. V.90. P.87-93.

246. Pietsch K, Waiblinger H.U., Brodman P., Würz A. 1997. Screeningverfahren zur Identifizierung "gentechnish veränderter" pflanzlicher Lebensmittel //Dtsch.Lebensm.Rundsch. V.93. P.35-38 ( German.).

247. Pinto Y.M.et.al. 1999 //Nature Biotechnology.V.17. P.702-707.

248. Pleasants, J. M., Hellmich, R. L. & Lewis, L. C. 1999. Pollen depositionon milkweed leaves under natural conditions // Presentation at the Monarch Butterfly Research Symposium, Chicago.

249. PonsieM.E., Mitchell A., Edwards T.J., Johnson S.D., 2007. Phylogeny of Bonatea (Orchidaceae: Habenariinae) based on molecular and morphological data // Plant Systematics and Evolution. Vol. 263. P. 253-268.

250. Pradeep A.R., Chatterjee S.N., Nair C.V., 2005. Genetic differetiation induced by selection in an inbred population of the silkworm Bombyx mori, revealed by RAPD and ISSR marker systems. // J. Appl. Genet. Vol.46. N 3. P. 291-298.

251. Prinsloo G., Chen Y, Giles K. L., Greenstone M. H., 2002. Release and recovery in South Africa of the exotic aphid parasitoid Aphelinus hordei verified by the polymerase chain reaction // Biocontrol. Vol. 47. P. 127-136.

252. Rahardja U., Whalon M. E. 1995. Inheritance of resistant to Bacillus thuringiensis subsp. Tenebrionis Cry III A 5-endotoxin in Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae). // J. Econ. Entomol. V. 88. P. 21-26.

253. Raynor G. S., Ogden E. C., Hayes J. V. 1972. Dispersion and deposition of corn pollen from experimental sources. // Agron. J. V. 64. P. 420-427.

254. Rees M., Raynter O. 1997. Biological control of Scotch broom: Modeling the determinants of abundance and the potential impact of introduced insect herbivores. //J. Appl. Ecol. V. 34. P. 1203-1221.

255. Rieseberg L. H, Wende J. 1993. Introgression and its consequences in plants. // Hybrid zones and the evolutionary process (Harrison R. ed.) Oxford University Press, London. P. 70-102.

256. Robinson K.O., Ferguson H.J., Cobey S., et al. 2000. Sperm-mediated transformation of the honey bee, Apis mellifera //Insect Mol. Biol. Vol. 9. P. 625-634.

257. Roush R T. 1994. Managing pests and their resistance to Bacillus thuringiensis: Can crops be better than sprays? // Biocontrol Science and Technology. V.4. P. 501-516.

258. Roush RT. 1997. Managing resistance to transgenic crops // In Advances in Insect Control: The Role of Transgenic Plants, N. Carozzi, M.Koziel, eds. London: Taylor and Francis. P. 271-294.

259. Rubin G.M., Spradling A.C., 1982. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.// Science. Vol. 218. P. 348-353.

260. Rubin G.M., Spradling A.C. 1983. Vectors for P element-mediated gene transfer in Drosophila // Nucleic Acids Res. Vol. 11. P.6341-6351.

261. Saeedi Z, Esmaili M, Abd-Mishani C., et al. 1999. Detection of DNA polymorphisms between populations of Eurygaster integriceps Put. in Iran using RAPD-PCR // Iranian Journal of Agricultural Sciences. Vol.30. N 2. P. 331-340.

262. Saiki R.H., ScharfS., Faloona F. e.a. 1985. Enzymatic amplification of beta-globulin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of Sickle cell anemia/// Science.V.230. P. 1350-1354.

263. Sarkar A. Coates C.J., Whyard S., et al. 1997. The Hermes element from Musca domestica can transpose in four families of cyclorrhaphan flies // Genetica (Dordrecht). Vol. 99. P. 15-29.

264. Sarkar A., Yardley K., Atkinson P.W., et al., 1997. Transposition of the

265. Hermes element in embryos of the vector mosquito Aedes aegypti // Insect Biochem. Mol. Biol. Vol. 27. P. 359-363.

266. Sayyed AH, Wright DJ. 2001. Cross-resistance and inheritance of resistance to Bacillus thuringiensis toxin Cry 1 Ac in diamondback moth (Plutella xylostella L) from lowland Malaysia // Pest Manag Sci. V. 57. P. 413-421.

267. Scientific Methods Workshop: Ecological and Agronomic Consequences of Gene Flow from Transgenic Crops to Wild Relatives. 2002 // Meeting Proceedings, The Ohio State University, March 5, 6., P.43-49.

268. Schihalius D.I. Cheng O., Reilly P.E., et.al, 2002. Genetic linkage analysis of the lesser grain borer Rhyzopertha dominica identifies two loci that confer high-level resistance to the fumigant phosphine // Genetics. Vol.161. P. 773782.

269. Scott, K.D, Lange, C.L, Scott, L.J, Graham, G.C. 2004. Isolation and characterization of microsatellite loci from Helicoverpa armigera. Htibner (Lepidoptera:Noctuidae) // Molecular Ecology Notes V. 4. P.204-205.

270. Scott, L.J., Lawrence, N. Lange, C.L., et al. 2006. Population dynamics and gene flow of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) on cotton and grain crops in the Murrumbidgee Valley, Australia // J. Econ. Entomol. Vol.99. P. 155-163.

271. Scott S. E., Wilkinson M. J. 1998. Transgene risk is low // Nature. № 393.1. P. 320.

272. Sears M.K., Hellmich R.L., Stanley-Horn D.E. e.a. 2001. Impact of Bt corn pollen on monarch butterfly populations: A risk assessment // PNAS USA.-V.98, N21. P. 11937-11942.

273. Seiler G. J. 1992. Utilization of wild sunflower species for the improvement of cultivated sunflower. // Field Crops Res. V. 30.P. 195-230.

274. SheltonA. M., Tang J. D., Roush R. T. e.a. 2000. Field tests on managing resistance to Bt-engineered plants // Nat. Biotechnol. V. 18. P.339-342.

275. Shirai N., Momma K., Ozawa S. e.a. 1998. Safety assessment of genetically engineered food: detection and monitoring of glyphosate-tolerant soybeant/ Biosci Biotechnol. Biochem.V.62(7).P. 1461-1464.

276. Silva-Brandao K. L., Azeredo-Espin A. M. L., Freitas A. V. L., 2008. New evidence on the systematic and phylogenetic position of Parides bitrchellanus1.pidoptera: Papilionidae) // Molecular Ecology Resources. Vol. 8. N 3. P. 502-511.

277. Skene Loane., 2000.// Cenet.Law Monit.-V. 1, N1 .-P.9-10.

278. Snow A. A., Moran-Palma P., Rieseberg L. H., Wszelaki A. 1998. Fecundity, phenology and seed dormancy of Fj wild-crop hybrids in sunflower (Helianthus annuus, Asteraceae). // Am. J. Bot. V. 85. P. 794-801.

279. Spradling A.C., Rubin G.M., 1982. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes // Science. Vol. 218. P.341-347.

280. Steward C. K, All J. N., Raymer P. L., Ramachadrans. 1997. Increased fitness of transgenic insecticidal rapeseed under insect selection pressuse // Mol. Ecol. V. 6. P. 773-779.

281. Stewart C. N., Prakesh C. S. 1998. Chloroplast transgenic plants are not a gene flow panacea. // Nat. Biotechnol. V. 16. P. 401.

282. Stoger et.al. 2000.//Plant Molecular. Biology.V.42. P.583-590.

283. Stone T.B., Sims S.R. 1993. Geographic susceptibility of Heliothis virescens and Helicoverpa zea (Helioptera: Noctuidae) to Bacillus thuringiensis!'/ J. Econ. Entomol. V. 86. P. 989-994.

284. StuderE., Rhuner C„ LiithyJ., Hubner P. 1998. Quantitative competitive PCR for the detection of genetically modified soybean and maize// Z.Lebensm.Unters.Forsch. V.207. P.207-213(German).

285. Subramanian S., Mohankumar S., 2006. Genetic variability of the bollworm, Helicoverpa armigera, occurring on different host plants // Journal of Insect Science, Vol.6. P.26, available online: insectscience.org/6.26.

286. Sudeep AB., Khushiramani R, Athawale SS, Mishra AC, Mourva DT 2005. Characterization of a newly established potato tuber moth (Phthorimaea operculella Zeller) cell line // Indian J Med Biol. Mar,121(3). P.159-63.

287. Sunil Archak., 2006. Insect genetics and genomics on the fast track // Current Science.Vol.91. N.5. P.575-578 (a report on the International Symposium on Insect Genetics and Genomics. 9-11 january 2006, India)

288. Sunil Archak, Eshwar Meduri, P. Sravana Kumar, J. Nagaraju., 2007. InSatDb: a microsatellite database of fully sequenced insect genomes // Nucleic Acids Research. Vol. 35, Database issue D36-D39.

289. Tabashnik, B.E. 1994. Evolution of resistance to Bacillus thuringiensis. II Ann. Rev. Entomol. V.39. P. 47-79.

290. Tabashnik B. E„ Cushing N. L., Finson N. Johnson M. W. 1990. Field development of resistant to Bacillus thuringiensis in diamondback moth CLepidoptera: Plutellidae). II J. Econ. Entomol. V. 83. P. 1671-1676.

291. Tabashnik BE, Dennehy TJ, Sims MA, et al., 2002. Control of resistant pink bollworm (Pectinophora gossypiella) by transgenic cotton that produces Bacillus thuringiensis toxin Cry2Ab //Appl. Environ. Microbiol. V.68, N.8. P.3790-3794.

292. Tabashnik B. E., Finson N., Chilcutt C. F., et al, 1993. Increasing Efficiency of Bioassays: Evaluating Resistance to Bacillus thuringiensis in Diamondback Moth (Lepidoptera: Plutellidae) // J. Econ. Entomol. V.86. P. 635 -644.

293. Tabashnik BE, Liu YB, de Maagd RA, Dennehy TJ. 2000. Cross-resistance of pink bollworm (Pectinophora gossypiella) to Bacillus thuringiensis toxins.// Appl. Environ. Microbiol. V.66, N. 10. P.4582-4584.

294. Tabashnik BE, Liu YB, Dennehy TJ, et al., 2002. Inheritance of resistance to Bt toxin crylac in a field-derived strain of pink bollworm (Lepidoptera: Gelechiidae)// J. Econ. Entomol. V.95, N5. P.1018-1026.

295. Tabashnik BE, Finson N, Groeters FR, et al., 1994. Reversal of resistance to Bacillus thuringiensis in Plutella xylostella.// Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. V.91, N.10. P.4120-4124.

296. Tabashnik B. E, RoushR. T., Earle E. D., SheltonA. M. 2000. Resistance to Bt toxins. II Science. V.287. P.42 -45.

297. Tamura T., Thibert C., Royer C., et al.,. 2000. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector // Nature Biotechnol. Vol.18. P. 81-84.

298. Tan S, Chen X, Zhang A, Li D. 2001. Isolation and characterization of DNA microsatellites from cotton bollworm {Helicoverpa armigera. Hiibner) //

299. Molecular Ecology Notes V. 1. P.243-244.

300. Tanavala Y. et.al. 1995 //PNAS (USA).V.92, N8. P.3358-3361.

301. Teuber M. 1993. Genetic Engineering techniques in Food Microbiology and enzymology/ Food Reviews Int., 9:389-409.

302. Thomas D.D., Donnelly C.A., WoodR.J., Alphey L.S. 2000. Insect population control using a dominant, repressible, lethal genetic system. // Science. Vol. 287. P. 2474-2476.

303. Tilmon K. J., Danforth B. N. Day W. H., Hoffmann M. P., 2000. Determining parasitoid species composition in a host population: A molecular approach. // Annals of the Entomological Society of America. Vol. 93. P. 640-647.

304. Timm, A.E., Geertsema, H., Warnich, L. 2006. Gene flow among Cydia pomonella (L.) (Lepidoptera: Tortricidae) geographic and host populations in Soush Africa//J. Econ. Entomol. Vol.99. P.341-348.

305. Treu, R. & Emberlin, J. 2000. Pollen dispersal in the crops Maize (Zea mays), Oil seed rape (Brassica napus ssp oleifera), Potatoes {Solanum tuberosum), Sugar beet {Beta vulgaris ssp vulgaris) and wheat {Triticum aestivum) II Soil Association.

306. Trisyono A., Whalon M. E. 1997. Fitness costs of resistance to Bacillus thuringiensis in Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) // J. Econ. Entomol. V. 90. P. 267-271.

307. Vaughn T. T., Antolin M. F., 1998. Population genetics of an opportunistic parasitoid in an agricultural landscape // Heredity. Vol. 80. P. 152-162.

308. Vijayan K., Anuradha H.J., Nair C. V, et al., 2006. Genetic diversity and differentiation among population of the Indian eri silkworm, Samia Cynthia ricini, revealed by ISSR markers // Journal of Insect Science. Vol. 6. N 30. P. 1-11.

309. Weatherwax, P. 1955. Structure and development of reproductive organs // In: Sprague, G. F. (ed.), Corn and corn improvement, Academic Press, New York. Chap. III. P. 89-121.

310. Welsh J., McClelland M., 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Research, Vol. 18. P. 7213-7218.

311. Whalon M. E., Miller O. L., Hollingworth R. M. e. a. 1993. Selection of a Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) strain resistant to Bacillus thuringiensis // J. Econ. Entomol. V. 86. P.226-233.

312. Whalon M. E., Wierenga J. M. 1994. Bacillus thuringiensis resistant Colorado potato beetle and transgenic plants:some operational and ecological implications for deployment 11 Biocontrol Sci. Technol. V. 4. P. 555-561.

313. Wilkes, H. G. 1977. Hybridisation of maize and teosinte, in Mexico and Guatemala and the improvement of maize // Economic Botany. Vol.31. P. 254-293.

314. Wilkinson M. J., Davenport J., Charters Y. M., et.al. 2000. A direct regional scale estimate of transgene movement from GM oilseed rape to its wild progenitors //Molecular Ecology.№ 9.P. 983-991.

315. Williams J. G. K., Kublelik A. R., Livak K. J., et al., 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Research, Vol. 18. P. 6531-6535.

316. Wolfe AX)., Qiu-Yun Xiang., Kephart S.R., 1998. Assessing hibridizationin natural populations of Penstemon (Scrophulariaceae) using hypervariable intersiraple sequence repeat (ISSR) bands // Molecular Ecology. Vol.7. P. 1107-1125.

317. Wozniak C. A. 2002. Gene Flow assessment for Plant-Incorporated Protectants by the biopesticide and pollution prevention division, U. S. EPA. // Gene Flow Workshop, The Ohio State University, March 5, 6. P. 146-161.

318. Wu K.-S., Jones R., Danneberger L., Scolnik P.A., 1994. Detection of microsatellite polymorphism without cloning // Nucl. Acids Res. Vol. 22. P.3257-3258.

319. Xudong Ye et.al. 2000 // Science.V.287.P.303-306.

320. Zhou Y., Gu H., Dorn S., 2005. Isolation of microsatellite loci in the codling moth, Cydia pomonella (Lepidoptera: Tortricidae) // Molecular Ecology Notes. Vol. 5. P. 226-227.

321. Zhu Y. C., Williams L., 2002. Detecting the egg parasitoid Anaphes iole (Hymenoptera: Mymaridae) in tarnished plant bug (Heteroptera: Miridae) eggs by using a molecular approach // Annals of the Entomological Society of America, Vol. 95. P. 359-365.

322. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D., 1994. Genome finger-printing by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genetics. Vol.20. P. 176-183.