Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Технология получения биологически активной субстанции из Phallus impudicus и ее применение для конструирования биопрепаратов с противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Технология получения биологически активной субстанции из Phallus impudicus и ее применение для конструирования биопрепаратов с противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами"

РАЗИН Александр Николаевич

Технология получения биологически активной субстанции Phallus impudicus и её применение для конструирования биопрепаратов с противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2011 /. ¿.Iii" 2011

4843901

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ)

Научный руководитель: доктор биологических наук

Волков Михаил Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Букова Наталья Константиновна доктор биологических наук, профессор Еремец Владимир Иванович

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Защита состоится <£тч/ » 2011 года в часов

на заседании диссертационного Совета Д.220.042.01 при ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел. (495) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К. И. Скрябина.

Автореферат разослан л/сиЛъа, 2011 года и размещен на

сайте http://mgavm.ru г

Ученый секретарь диссертационного совета, \

профессор тОп^^! Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Одним из перспективных направлений борьбы со злокачественными новообразованиями является химиопрофилактика биологически активными и химическими соединениями. К настоящему времени накопились значительные сведения о биологически активных соединениях базидиомицетов, обладающих иммуномодулирующим действием, активизирующим звено неспецифической противоопухолевой защиты и повышающим продукцию интерферона в крови. (Ikekawa Т., 2005, Takehara М. 2007)

Проведенный анализ профилактики раковых заболеваний (Заикина H.A. и др., 2007; Oi V. at all, 1999) установил, что некоторые базидиомицеты, и в том числе Lentinus edodes (Шиитаке) и Fallus impudicus (Веселка обыкновенная), обладают защитными свойствами, снижающими частоту и риск появления злокачественных неоплазий.

Базидиомицеты являются перспективным источником получения профилактических и лечебных средств, оказывающих общеукрепляющее и тонизирующее действие на организм. (Цивилева О.М. и др., 2001)

В медицине используются экстракты базидиомицета Phallus impudicus, содержащего большое количество биологически активных веществ. Действующие вещества Phallus impudicus способствуют понижению давления, выведению холестерина; их применяют для лечения незаживающих язв, заболеваний желудочно-кишечного тракта, воспалений почек и печени. Метаболиты Phallus impudicus оказывают противоопухолевое и антимикробное действие. Противоопухолевое / действие базидиомицета Phallus impudicus обусловлено продуцированием j полисахарида-глюкоманнана и некоторых других биологически активных^--' веществ, вызывающих активацию цитотоксических лимфоцитов,

усиление выработки перфоринов, что и приводит к уничтожению-------

опухолевых клеток (апоптозу) (Никитина В.Е., 2008). Антимикробная

активность метаболитов штамма Phallus impudicus определена

>

способностью выработки антибиотических веществ (грибных

фитонцидов), которые в том числе инактивируют вирусы герпеса, гриппа и гепатита. (Денисова Н.П,. 1998)

Благодаря развитию биотехнологии стало возможным искусственное выращивание базидиомицетов методом глубинного культивирования в жидких питательных средах в аппаратах-ферментерах, обеспечивающее получение значительных количеств мицелия грибов и позволяющее выделять биологически активные метаболиты, применяемые для конструирования биопрепаратов с противоопухолевой активностью.

Целью работы являлась разработка технологии получения биологически активной субстанции из базидиомицета Phallus impudicus и на её основе создать биопрепараты, обладающие противоопухолевой и антиоксидантной активностью.

Задачи исследования.

1. Обосновать выбор штамма базидиомицета Phallus impudicus в качестве продуцента биологически активной базидиомицетной субстанции (БС) для конструирования биопрепаратов с противоопухолевыми свойствами.

2. Определить питательную потребность штамма базидиомицета Phallus impudicus и оптимизировать питательную среду для его глубинного культивирования.

3. Определить основные технологические параметры глубинного культивирования базидиомицета Phallus impudicus для максимального накопления БС.

4. Приготовить лабораторные образцы БС по разработанной технологии.

5. Приготовить 5 производственных серий БС и оценить ее противоопухолевые и антиоксидантные свойства на лабораторных животных.

6. Рассчитать экономическую эффективность технологии глубинного культивирования базидиомицета Phallus impudicus.

7. Разработать биологически активную добавку к пище «Веселка» на основе БС.

8. Разработать проект нормативной документации на лекарственное средство для животных: Базидиомицетная субстанция «BECEJIKA-2» и методы контроля ее качества.

Научная новизна.

Впервые разработаны технологические параметры и условия глубинного культивирования Phallus impudicus на новой питательной среде и получена базидиомицетная субстанция для конструирования биопрепаратов с противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами на модели аденокарциномы Эрлиха (далее АКЭ).

Впервые установлено, что БС Phallus impudicus обладает выраженным противоопухолевым действием, стимулируя функциональную активность иммунокомпетентных клеток.

Впервые установлено наличие прямой связи между скоростью роста АКЭ и интенсивностью эндогенного образования оксида азота.

Определена антирадикальная активность БС в условиях in vitro в модельной системе гемоглобин-люминол-пероксид водорода.

Установлена возможность конструирования биопрепаратов с неспецифической противоопухолевой и антиоксидантной защитой для людей и животных на основе биологически активной субстанции БС, полученной из культуры музейного штамма Phallus impudicus Linnaeus, 1753: Persoon 1801 штамм 0781.

Практическая значимость работы.

Определена питательная потребность культуры Phallus impudicus и разработана пропись жидкой оптимизированной глюкозопептонной питательной среды (ГПС) для ее глубинного культивирования в биореакторах.

На базе ООО «Шиитаке» (г. Санкт-Петербург) создана технологическая линия по производству субстанции БС из Phallus

impudicus глубинным методом культивирования в промышленных маштабах.

Для применения в ветеринарии предложена отечественная субстанция БС из Phallus impudicus для конструирования биопрепарата с противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами.

Разработана биологически активная добавка к пище «Веселка» на основе разработанной субстанции Phallus impudicus (ТУ 9164-00558301249-04, ТИ 10-005-58301249-04, СГР № 77.99.23.3.У.18).

Разработан проект нормативной документации на субстанцию БС и методы контроля ее качества для внедрения в ветеринарную практику: стандарт предприятия (СТО 58301249-001-2010), инструкция по применению, регламент производства.

Результаты исследований по оптимизации питательных сред и выбора технологических параметров и условий глубинного культивирования базидиомицетов используются в учебном процессе по дисциплине «Биотехнология» в ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И. Скрябина.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на Международной научно-практической конференции «Здоровое развитие ради будущих поколений» (Киев, 2009) и Международной научной конференции "Актуальные проблемы альгологии, микологии и гидроботаники" (Ташкент, 2009).

Личный вклад соискателя. Автор организовал и непосредственно осуществил исследования по выбору штамма и обоснованию использования штамма Phallus impudicus, оптимизации питательной среды, разработке компонентного состава питательных сред, отработке режимов и параметров глубинного способа выращивания штамма Phallus impudicus, оценке качества препарата, установлению противоопухолевых, иммунокомпетентных и антиоксидантных свойств, анализу и теоретическому обобщению полученных данных, подготовке нормативной документации.

В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с Дерягиной В.П. (Институт онкогенеза РАН, г. Москва), Заикиной НА. и Галынкиным В.А. (ФГОУ СПбХФА, г. Санкт-Петербург), Коваленко А.Е. (Ботанический институт им. Комарова, г. Санкт-Петербург), которым выражаю благодарность за помощь и поддержку.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных работ, все в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 108 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (135 источников, из которых 90 отечественных и 45 иностранных). Работа содержит 18 таблиц, 11 рисунков, 12 страниц приложений.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизированный состав жидкой глюкозопептонной питательной среды на основе установленной питательной потребности базидиомицета Phallus impudicus позволяет накапливать БС в заданных объемах.

2. Технологические параметры и условия глубинного культивирования Phallus impudicus позволяют получать субстанцию БС в промышленных масштабах.

3. Противоопухолевая эффективность субстанции БС Phallus impudicus при АКЭ и антиоксидантные свойства позволяют использование ее в конструировании биопрепаратов для людей и животных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2005 по 2010 годы на кафедре биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ. Отдельные исследования были выполнены в НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина, лаборатории профилактики онкологических профессиональных заболеваний (г. Москва), на кафедре микробиологии Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии и в производственной лаборатории ООО «Шиитаке» (г. Санкт-Петербург).

Объект исследований - культура гриба базидиомицета штамм Phallus impudicus Linnaeus, 1753: Persoon, 1801, штамм 0781 коллекции культур Ботанического института им. ВЛ. Комарова РАН (г. Санкт-Петербург).

Материалы, питательные среды, растворы и реактивы.

В работе использовались 352 мыши линии С57В1, массой 18-20 г и 129 мышей-шбрцдов линий F|(C57BlxCBA) и Balb/c, массой 18-20 г, разводки питомника «Столбовая» РАМН. В процессе работы было отобрано и исследовано 270 образцов крови, 54 образца мочи, 43 образца опухолевой ткани, 33 образца перитонеального содержимого, 5 образцов мицелия Phallus impudicus, 3 образца маточного раствора.

Стандартные питательные среды на основе сусла, плотные и жидкие, а также питательные среды, разработанные нами в ходе проведения исследований.

Технологическое оборудование. Ферментационный комплекс: ферментатор BioStat (ФРГ), Общий объем ферментатора - 2 литра. Рабочий объем - 1,8 литра. Биореактор БИОР объемом 250 л. Фильтрационная установка - УФ-200. Сушильная конвективная установка КСТО.

Методы исследования.

Оптимизацию компонентного состава питательной среды и технологических параметров и условий культивирования проводили стандартными микробиологическими и биохимическими методами до

достижения максимального накопления биомассы. Контроль качества приготовленных питательных основ и сред проводили по методам, рекомендованным ГИСК им. Л.А.Тарасевича, по следующим показателям: внешний вид, растворимость, цветность, влажность, показатель pH, показатели общего и аминного азота, золы, белка, хлоридов, сульфатов, микроэлементов, редуцирующих веществ и т.д.

Концентрацию белка определяли по методу Лоури.

Определение редуцирующих Сахаров выполняли по ГОСТ 12575-2001. Количественный анализ моносахаридного состава проводили методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ).

Антиоксидантную активность определяли кулонометрическим методом.

Содержание нитритов (НИ) в биологических жидкостях: крови, перитонеальном содержимом и моче определяли методом Грисса.

Рост опухоли оценивали по торможению роста опухоли (ТРО) у животных опытных групп в сравнении с контрольной группой: ТРО = {(Vk - Von)/VK} 100 %, где:

Vk - средний объем опухоли в контрольной группе,

Von - средний объем опухоли в опытной группе (мм3).

Постороннюю микрофлору в исследуемом препарате определяли путем высева на чашки Петри с агаризованными средами методом Дригальского.

Экспериментальные данные обрабатывали методом корреляционного, вариационного и факторного статистического анализа с использованием пакета компьютерных программ «Statgraphics Plus for Windows», «Statistica 6,0» и анализом результатов по Ашмарину И.П. и Воробьеву A.A.(1962)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Определение питательных потребностей Phallus impudicus

Изучение питательных потребностей базидиомицетов позволяет установить физиологические особенности грибов и перейти к выбору субстратов для крупномасштабного глубинного культивирования. Для глубинного культивирования могут применяться натуральные (жидкое сусло) и синтетические среды (глюкозопептонная среда и др.). Важную роль в процессе роста культуры играют источники углерода, так как культуре для развития необходимо достаточное количество легко утилизируемых Сахаров, а содержание азота в среде не оказывает существенного влияния на накопление биомассы. Вместе с тем установлено, что грибы-базидиомицеты не способны расти на средах, содержащих только неорганические источники азота. В качестве источников углерода, возможно, использовать: кукурузный экстракт, концентрат картофельного сока, дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат, нативный картофельный сок.

Установлено, что накопление биомассы определяется сочетанием источников углерода и азота, причём достаточно интенсивное накопление биомассы имеет место на среде с мальтозой, глюкозой, маннитом и галактозой; из источников азота наиболее подходящими оказались нитрат и сульфат аммония, а также нитрат натрия. Одним из важнейших факторов, регулирующих рост и метаболизм высших базидиомицетов в культуре, является pH питательной среды. В процессе роста базидиомицета Phallus impudicus в стандартной жидкой глюкозопептонной среде (далее ГПС): пептон - 1,5 г/л, глюкоза - 15 г/л, NaCl - 0,5 г/л, СаС12 - 0,05 г/л, MgS04 - 0,5 г/л, КН2Р04- 0,6 г/л, К2НР04 - 0,4 г/л, дрожжевой экстракт - 1,5 г/л; и жидкое сусло в концентрации 7,5% (по углеводам) были изучены биохимические показатели: скорость утилизации источников углерода и азота, накопление биомассы, изменение pH среды.

Оптимизацию питательной среды проводили варьированием концентрации источников азота, пептона, дрожжевого экстракта и углерода для определения интенсивности накопления биомассы Phallus impudicus.

Изучение влияния концентрации источников углерода в среде на выход биомассы мицелия Phallus impudicus.

Изучение влияния концентрации источника глюкозы на выход биомассы мицелия проводили культивированием Phallus impudicus в среде ГПС, содержащей 5, 10, 15, 20 г/л глюкозы. Максимальный выход биомассы получен при концентрации 15 г/л.

Изучение влияния источников азота и витаминов (пептон и дрожжевой экстракт) на выход биомассы мицелия проводили, последовательно изменяя концентрации пептона от 2,5 до 4,5 г/л и дрожжевого экстракта от 2 до 5 г/л. Установлено, что изменение концентрации дрожжевого экстракта не приводило к увеличению количества биомассы мицелия. Поэтому концентрация дрожжевого экстракта в среде была неизменна - 2 г/л. Экономически более выгодным источником азота по сравнению с дрожжевым экстрактом является пептон. Увеличение концентрации пептона с 2,5 до 4,5 г/л приводило к заметному увеличению биомассы. При внесении 2,5 г/л пептона количество биомассы составило 5,3±0,3 г/л; при концентрации 3,5 г/л пептона количество биомассы - 6,5±0,3 г/л; при концентрации 4,5 г/л пептона количество биомассы - 6,9±0,2 г/л. В качестве оптимальной концентрации пептона было выбрано значение 3,5 г/л.

Таким образом, было выбрано оптимальное соотношение концентрации пептона и дрожжевого экстракта - 3,5 г/л и 2 г/л соответственно.

Получение посевной биомассы мицелия Phallus impudicus осуществляли способом глубинного культивирования на разработанной жидкой глюкозопептонной среде следующего состава: пептон - 3,5 г/л, глюкоза - 15 г/л, NaCl - 0,5 г/л, СаС12 - 0,05 г/л, MgS04 - 0,5 г/л, КН2Р04 -0,6 г/л, К2НР04 - 0,4 г/л, дрожжевой экстракт - 2,0 г/л; а также жидкое

сусло в концентрации 7,5% (по углеводам). Стерилизацию среды проводили в автоклаве в течение 40 минут при избыточном давлении 0,5 атм. Культуру выращивали на лабораторной качалке при 120 об/мин (при непрерывном перемешивании), при t = 24°С в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл. Исходный посевной материал штамм Phallus impudicus, выращенный на скошенном сусло-агаре - около 1 см плёнки гриба. Для получения посевного материала культуру подращивали в течение 3-4 суток, а затем 10 мл посевного материала засевали в ферментационные колбы. Ферментацию проводили в течение 9 суток.

Получение биомассы мицелия Phallus impudicus при культивировании в оптимизированной глюкозопептонной среде. Исходная среда: пептон - 2,5 г/л; дрожжевой экстракт - 2 г/л; глюкоза -Юг/л.

При культивировании Phallus impudicus в оптимальной глюкозопептонной среде выход биомассы мицелия (7,8+0,3 г/л) достоверно отличался от значения количества биомассы мицелия после культивирования в исходной ГПС, которая составила 5,8 ± 0,3 г/л (рис. 1).

3 IS

............................ ........................... 7Г «1.....-................................................................................... ; ; Зо i....._

4 i; щ...........

1

| ; 1 £ si «»——

? 1 рфк ;

1 щ Ш......... _.......

ш 1 ■............. ...............л Ж

Пехотная среда Оптимизированная средй

Рис. 1. Выход биомассы мицелия при культивировании Phallus impudicus в исходной и оптимизированной средах

В связи с тем, что количество биомассы мицелия базидиомицетов в условиях глубинного культивирования существенно увеличивается при добавлении в среду высших алифатических спиртов, нами был добавлен в оптимизированную питательную среду цетиловый спирт (С^НззОН). Для этого 3 мг цетилового спирта растворили в 10 мл этанола (96%),

добавили воды до 1 л и вносили все компоненты оптимизированной глюкозопептонной среды. В результате добавления цетилового спирта выход биомассы мицелия увеличился с 5,8 г/л до 6,7 г/л.

Выбор и оптимизация параметров и условий глубинного культивирования проводились по параметрам, оказывающим существенное влияние на рост биомассы: рН, температура культивирования и коэффициент массопередачи кислорода. Для механолабильных культур, к которым относятся базидиальные грибы, при использовании аппаратов с механическим перемешиванием ограничивающим фактором является также критическая линейная окружная скорость мешалки, при превышении которой происходит травмирование гиф грибов.

Выбор оптимального показателя рН обеспечивает наиболее высокую скорость роста и накопления биомассы культуры.

Экспериментальное культивирование проводили в ферментаторе при рН 5,0; 4,5; 4,0 и 3,5.

Оптимальное значение рН 4,5 определяли по наивысшему значению выхода биомассы, составившее 5,2 г/л.

Влияние температуры определяли при установленном оптимальном значении рН 4,5. Температуру культивирования мицелия выбирали из значений наиболее благоприятных его выращивания: 20-22,25-27,30-32 °С.

Максимальное значение накопления биомассы установили при температуре 25-26 °С.

На процесс накопления биомассы большое влияние оказывает скорость доставки питательных веществ для питания базидиомицета. Скорость доставки питательных веществ обеспечивается процессом перемешивания. Процесс перемешивания регламентируется выбором типа мешалки и скоростью ее вращения. Для культивирования базидиомицетов применяют лопастные мешалки с отбойниками или без отбойников.

Также процесс доставки питательных элементов зависит от степени интенсивности аэрации. Для определения выбранных показателей

процесса культивирования проведен эксперимент с изменением скорости вращения мешалки и интенсивности аэрации питательной среды.

Максимальное накопление биомассы установлено при скорости вращения мешалки 250 об./мин., так как при этом значении не происходит разрушения мицелия.

Установлено, что при оптимальном значении pH 4,5 и скорости перемешивания 250 об./мин. значение аэрации 1,0 л/л в мин является оптимальным для максимального накопления биомассы.

В условиях используемого аппарата оптимальным режимом установлены следующие показатели: аэрация 1,0 л/л в мин, скорость перемешивания 250 об./мин., Тк= 26±1 °С, pH 4,5.

Приготовление лабораторных серий препарата.

На лабораторной базе кафедры микробиологии СПХФА провели испытания технологии производства биомассы Phallus impudicus. Получены 5 партий опытных образцов базидиомицетной субстанции Phallus impudicus в ферментаторе BioStat (ФРГ) с показателями плотности 7,0; 6,9; 7,3; 7,2; 7,0 г/л. Биомассу отделяли на вакуумном фильтре с использованием капроновой фильтрующей ткани и сушили в полочной конвекционной сушилке при температуре 45-50 °С.

Лабораторные серии успешно прошли испытания на безопасность, микробиологическую чистоту и показатели качества.

Хранение посевной культуры Phallus impudicus для промышленного производства следует производить на скошенном сусло-агаре с плотностью сусла 7,5 в течение 6 месяцев при t = 4-6 °С.

По истечении времени хранения культуру следует пересевать на твердую питательную среду сусло-агар для последующего хранения.

На основе проведенных испытаний выработаны параметры контроля качества и методы испытаний.

Масштабирование процесса глубинного культивирования осуществлено, исходя из оптимального режима перемешивания и аэрации культуры Phallus impudicus и конструкции ферментера БИОР-

250, на котором были отработаны установленные режимы и учтены все данные по составу питательных сред, а также данные по кинетике роста и метаболизма культуры Phallus impudicus (М0, Ки, бетта|, бетта2, Хтау, Хравновесная, коэффициенты метаболизма по компонентам пластического, энергетического обменов, потребности в микроэлементах и других веществ, определяющих ход и исход ферментации).

Промышленное получение базидиомицетной субстанции Phallus impudicus осуществляли на ферментаторе БИОР - 250. Получены 5 серий базидиомицетной субстанции Phallus impudicus, которые использовались для определения физико-химических свойств и биологической активности.

Физико-химические свойства базидиомицетной субстанции из Phallus impudicus.

Изучение моносахаридного состава и физико-химических свойств базидиомицетной субстанции Phallus impudicus. Для определения моносахаридного состава проводили полный кислотный гидролиз: 20 мг пробы гидролизовали в 1,0 мл 8Н раствора серной кислоты в запаянных ампулах на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Продукты гидролиза изучали методом тонкослойной хроматографии для разделения моносахаров в системе растворителей бутанол-этанол-вода-аммиак в соотношении 40:10:49:1. Проявление хроматограмм проводили кислым фталатом анилина при 80°С в течение 5 минут. На хроматограмме образца присутствуют интенсивно окрашенные в коричневый цвет пятна, соответствующие углеводам контроля.

Количественный анализ моносахаридного состава проводили методом ГЖХ. Субстанцию Phallus impudicus анализировали по следующим показателям: состав образцов (редуцирующие вещества, содержание белка и минеральных примесей), моносахаридный состав.

Было обнаружено 25% редуцирующих веществ. В мицелии обнаружено достаточно высокое содержание белка (15,0%).

Количественный анализ моносахаридного состава проводили методом ГЖХ. По результатам анализа было установлено, что в мицелии содержалось глюкозы 47,0%, маннозы 24,0%, галактозы 18,4 %, ксилозы 9,4% и следовые количества фукозы 0,8 %.

Изучение биологических свойств базидиомицетной субстанции Phallus impudicus.

Изучение антиоксидантной активности методом кулонометрии.

В качестве препарата сравнения выбран 0,05%-ный раствор рутина, обладающий антиоксидантными свойствами. Установлено, что изучаемые фракции и нативный раствор Phallus impudicus обладали антиоксидантной активностью. Наибольшую антиоксидантную активность проявляла фракция водного извлечения мицелия-438 Кп/100 мл.

Определение сравнительного противоопухолевого эффекта проведено на 129 мышах-гибридах линий Fi(C57BlxCBA) и Balb/c. Контролем служили мыши с подкожно перевитой аденокарциномой Эрлиха (106 клеток в 0,5 мл Хенкса). Мыши получали 5 раз в неделю в течение двух недель до перевивки и на протяжении всего эксперимента грибы (трутовик или субстанцию Phallus impudicus) в разовой дозе 15 мг/кг или 188 мг/кг PLE. На ранних сроках наблюдения (6-11 сутки) клетки АКЭ были чувствительны к введению всех видов грибов: трутовика, субстанции Phallus impudicus и PLE, причем субстанция Phallus impudicus вызывала наиболее выраженный ингибирующий эффект, который составил 71,0%.

Годовая экономическая эффективность технологии глубинного культивирования БС из Phallus impudicus на 7,5 млн. рублей выше в сравнении с существующей технологией культивирования веселки обыкновенной.

17

ВЫВОДЫ

1. На основе установленных питательных потребностей штамма Phallus impudicus разработана питательная среда для его глубинного культивирования, а введение цетилового спирта обеспечило увеличение выхода биомассы с 5,8 г/л до 6,7 г/л.

2. Разработана технология глубинного культивирования базидиоми-цета штамм Phallus impudicus и оптимизированы условия культивирования по важнейшим параметрам: аэрация 1,0 л/л-в мин, скорость перемешивания 250 об. в мин, Тк= 26±1°С, pH 4,5, обеспечившие максимальное накопление БС.

3. Лабораторные образцы БС Phallus impudicus соответствуют требованиям «Единых санитарно-эпидемиологических и гигиенических требований к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)» Таможенного союза ЕврАзЭС и обладают высокими потребительскими свойствами.

4. Масштабирование процесса глубинного культивирования БС Phallus impudicus с лабораторного биореактора BioStat на промышленный биореактор БИОР-250 обеспечило воспроизводимость технологии на 97%.

5. На лабораторных животных установлены противоопухолевые свойства пяти производственных серий БС Phallus impudicus - среднеарифметическое значение массы опухолей мышей, которым вводили БС Phallus impudicus было на 12,7% меньшим по сравнению с контролем, при этом ингибирующий эффект на рост АКЭ составил 71,0%.

6. Антиоксидантная активность водного извлечения мицелия Phallus impudicus составила 438 Кл/100 мл, что сопоставимо с СТО рутином (4,8 ТЕАС) и связано с наличием в мицелии полисахаридов.

7. Разработана биологически активная добавка к пище «Веселка» со сроком годности 2 года при условии хранения при температуре от минус 20 до плюс 40 °С.

8. Годовая экономическая эффективность технологии глубинного культивирования БС Phallus impudicus на 7,5 млн. рублей выше в сравнении с существующей технологией культивирования Веселки обыкновенной.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. БС Phallus impudicus первая отечественная субстанция с противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами для конструирования биопрепаратов, применяемых при злокачественных образованиях у сельскохозяйственных животных на основе базидиомицетов.

2. Разработаны и утверждены Роспотребнадзором России (СГР № 77.99.19.3.У.4177.10.04 от 12.10.2004 г.) ТУ 9164-005-58301249-04 и ТИ 10-005-58301249-04 на БАД к пище «Веселка».

3. Разработан проект СТО (58301249-001-2010 0), регламент производства № 5432 и нормативная документация на БС Phallus impudicus и методы контроля ее качества для Государственной регистрации и внедрения в ветеринарную практику.

4. Результаты исследований по разработке технологии культивирования базидиальных грибов на примере штамма Phallus impudicus используются в учебном процессе по дисциплине «Биотехнология» в ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И. Скрябина.

5. Установлены антиоксидантные и противоопухолевые свойства БС Phallus impudicus, обеспечившие выбор его в качестве субстанции для конструирования биопрепаратов с противоопухолевым и антиоксидантными действиями.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Материалы работы рекомендуются в качестве методических подходов при проведении исследований по разработке противоопухолевых лечебно-профилактических средств для животных.

2. Рекомендуем использовать БС Phallus impudicus для производства других биопрепаратов с противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами.

3. Результаты исследований по разработке технологии глубинного культивирования базидиальных грибов и оценке их эффективности при аденокарциноме рекомендуется использовать в учебном процессе по дисциплине «Биотехнология» в высших учебных заведениях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Действие Lentinus edodes (Шиитаке) на рост опухолей у мышей на модели химического канцерогенеза / Разин А.Н., Рыжова Н.И., Дерягина В.П. и др. // Российский биотерапевтический журнал. - 2006. -№ 3. - С. 21-25.

2. Разин А.Н., Волков М.Ю. Действие Lentinus edodes на рост подкожно перевитой аденокарциномы Эрлиха // Ветеринарная медицина-2005.-№3-4.-С. 28-29.

3. Разин А.Н., Волков М.Ю., Дрель И.В. Изучение противоопухолевых свойств высших базидиомицетов Шиитаке {Lentinus edodes), Трутовика лиственничного (Laricifomes officinalis) и Веселка (Phallus impudicus) II Ветеринарная медицина. - 2009. -№ 1-2. - С. 71-75.

4. Разин А.Н., Филиппова И.А., Волков М.Ю. Влияние БАД «Шиитаке Фунго-Ши» на метаболизм ксенобиотиков и антиоксидантную активность печени и ее антирадикальная и иммуномодулируюшдя активность в системах in vitro и in vivo // Ветеринарная медицина - 2005. -№ 34. - С. 26-27.

5. Экспериментальное изучение действия Lentinus edodes (Шиитаке) на рост опухоли у мышей на моделях трансплантационного и химического канцерогенеза / Разин А.Н., Дерягина В.П., Рыжова H.H. и др.// Российский онкологический журнал. -2010. -№ 1.-С. 33-38.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 24.03.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0 Печать авторефератов (495)730-47-74,778-45-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Разин, Александр Николаевич

ПЕРЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 . Высшие базидиомицеты, их характеристика и свойства.

1.2 . Условия культивирования базидиомицетов.

1.3 . Биологически активные вещества базидиомицетов.

1.4 . Биологическая активность полисахаридов базидиомицетов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.2.1. Исследования процесса глубинного культивирования базидиомицета в жидких питательных средах.

2.2.2. Определение питательных потребностей Phallus impúdicas.

2.2.3. Оптимизация питательной среды.

2.2.4. Приготовление лабораторной серии препарата.

2.2.5. Промышленное получение биомассы мицелия

Phallus impudicus.

2.2.6.Хранение культуры Phallus impudicus.

2.2.7. Физико-химические свойства препарата мицелия

Phallus impudicus.

2.2.8. Биологические свойства препаратов мицелия базидиомецетов на примере биологической модели in vivo.

3.ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

5.ВЫВОД Ы.

6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Технология получения биологически активной субстанции из Phallus impudicus и ее применение для конструирования биопрепаратов с противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами"

Актуальность темы.

Одним из перспективных направлений борьбы со злокачественными новообразованиями является химиопрофилактика биологически активными и химическими соединениями. К настоящему времени накопились значительные сведения о биологически активных соединениях базидиомицетов, обладающих иммуномодулирующим действием, активизирующим звено неспецифической противоопухолевой защиты и повышающим продукцию интерферона в крови (Ikekawa Т., 2005, Takehara М. 2007).

Проведенный анализ профилактики раковых заболеваний (Заикина H.A. и др., 2007; Oi V. at all, 1999) установил, что некоторые базидиомицеты, и в том числе Lentinus edodes (Шиитаке) и Fallus impudicus (Веселка обыкновенная), обладают защитными свойствами, снижающими частоту и риск появления злокачественных неоплазий.

Базидиомицеты являются перспективным источником получения профилактических и лечебных средств, оказывающих общеукрепляющее и тонизирующее действие на организм (Цивилева О.М. и др., 2001).

В медицине используются экстракты базидиомицета Phallus impudicus, содержащего большое количество биологически активных веществ. Действующие вещества Phallus impudicus способствуют понижению давления, выведению холестерина; их применяют для лечения незаживающих язв, заболеваний желудочно-кишечного тракта, воспалений почек и печени. Метаболиты Phallus impudicus оказывают противоопухолевое и антимикробное действие. Противоопухолевое действие базидиомицета Phallus impudicus обусловлено продуцированием полисахарида-глюкоманнана и некоторых других биологически активных веществ, вызывающих активацию цитотоксических лимфоцитов, усиление выработки перфоринов, что и приводит к уничтожению опухолевых клеток (апоптозу) (Никитина

В.Е., 2008). Антимикробная активность метаболитов штамма Phallus impudicus определена способностью выработки антибиотических веществ (грибных фитонцидов), которые в том числе инактивируют вирусы герпеса, гриппа и гепатита (Денисова Н.П,. 1998).

Благодаря развитию биотехнологии стало возможным искусственное выращивание базидиомицетов методом глубинного культивирования в жидких питательных средах в аппаратах-ферментерах, обеспечивающее получение значительных количеств мицелия грибов и позволяющее выделять • биологически активные метаболиты, применяемые для конструирования биопрепаратов с противоопухолевой активностью.

Цель работы.

Разработать технологию получения биологически активной субстанции из базидиомицета Phallus impudicus и на её основе создать биопрепараты, обладающие противоопухолевой и антиоксидантной активностью.

Задачи исследования.

1. Обосновать выбор штамма базидиомицета Phallus impudicus в качестве продуцента биологически активной базидиомицетной субстанции (БС) для конструирования биопрепаратов с противоопухолевыми свойствами.

2. Определить питательную потребность штамма базидиомицета Phallus impudicus и оптимизировать питательную среду для его глубинного культивирования.

3. Определить основные технологические параметры глубинного • культивирования базидиомицета Phallus impudicus для максимального накопления БС.

4. Приготовить лабораторные образцы БС по разработанной технологии.

5. Приготовить 5 производственных серий БС и оценить ее противоопухолевые и антиоксидантные свойства на лабораторных животных.

6. Рассчитать экономическую эффективность технологии глубинного культивирования базидиомицета Phallus impudicus.

7. Разработать биологически активную добавку к пище «Веселка» на основе БС.

8. Разработать проект нормативной документации на лекарственное средство для животных: Базидиомицетная субстанция «ВЕСЕЛКА-2» и методы контроля ее качества.

Научная новизна.

Впервые разработаны технологические параметры и условия глубинного культивирования Phallus impudicus на новой питательной среде и получена базидиомицетная субстанция для конструирования биопрепаратов с противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами на модели аденокарциномы Эрлиха (далее АКЭ).

Впервые установлено, что БС Phallus impudicus обладает выраженным противоопухолевым действием, стимулируя функциональную активность иммунокомпетентных клеток.

Впервые установлено наличие прямой связи между скоростью роста АКЭ и интенсивностью эндогенного образования оксида азота.

Определена антирадикальная активность БС в условиях in vitro в модельной системе гемоглобин-люминол-пероксид водорода.

Установлена возможность конструирования биопрепаратов с неспецифической противоопухолевой и антиоксидантной защитой для людей и животных на основе биологически активной субстанции БС, полученной из культуры музейного штамма Phallus impudicus Linnaeus, 1753: Persoon 1801 штамм 0781.

Практическая значимость работы.

Определена питательная потребность культуры Phallus impudicus и разработана пропись жидкой оптимизированной глюкозопептонной питательной среды (ГПС) для ее глубинного культивирования в биореакторах.

На базе ООО «Шиитаке» (г. Санкт-Петербург) создана технологическая линия по производству субстанции БС из Phallus impudicus глубинным методом культивирования в промышленных маштабах.

Для применения в ветеринарии предложена отечественная субстанция БС ' из Phallus impudicus для конструирования биопрепарата с противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами.

Разработана биологически активная добавка к пище «Веселка» на основе разработанной субстанции Phallus impudicus (ТУ 9164-005-58301249-04, ТИ 10-005-58301249-04, СГР№ 77.99.23.3.У.18).

Разработан проект нормативной документации на субстанцию БС и методы контроля ее качества для внедрения в ветеринарную практику: стандарт предприятия (СТО 58301249-001-2010), инструкция по применению, регламент производства.

Результаты исследований по оптимизации питательных сред и выбора технологических параметров и условий глубинного культивирования базидиомицетов используются в учебном процессе по дисциплине «Биотехнология» в ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И. Скрябина.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы доложены на Международной научно-практической конференции «Здоровое развитие ради будущих поколений» (Киев, 2009) и Международной научной конференции "Актуальные проблемы альгологии, микологии и гидроботаники" (Ташкент, 2009).

Личный вклад соискателя.

Автор организовал и непосредственно осуществил исследования по выбору штамма и обоснованию использования штамма Phallus impudicus, оптимизации питательной среды, разработке компонентного состава питательных сред, отработке режимов и параметров глубинного способа выращивания штамма Phallus impudicus, оценке качества препарата, установлению противоопухолевых, иммунокомпетентных и антиоксидантных свойств, анализу и теоретическому обобщению полученных данных, подготовке нормативной документации.

В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с Дерягиной В.П. (Институт онкогенеза РАН, г. Москва), Заикиной H.A. и Галынкиным В.А. (ФГОУ СПбХФА, г. Санкт-Петербург), Коваленко А.Е. (Ботанический институт им. Комарова, г. Санкт-Петербург), которым выражаю благодарность за помощь и поддержку.

Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных работ, все в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 104 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом ' использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (135 источников, из которых 90 отечественных и 45 иностранных). Работа содержит 18 таблиц, 11 рисунков, 12 страниц приложений.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Разин, Александр Николаевич

5. ВЫВОДЫ

1. На основе установленных питательных потребностей штамма Phallus impudicus разработана питательная среда для его глубинного культивирова- • ния, а введение цетилового спирта обеспечило увеличение выхода биомассы с 5,8 г/л до 6,7 г/л.

2. Разработана технология глубинного культивирования базидиомицета штамм Phallus impudicus и оптимизированы условия культивирования по важнейшим параметрам: аэрация 1,0 л/л-в мин, скорость перемешивания 250 об. в-мин, Тк— 26±1°С, pH 4,5, обеспечившие максимальное накопление БС.

3. Лабораторные образцы БС Phallus impudicus соответствуют требованиям «Единых санитарно-эпидемиологических и гигиенических требований к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)» Таможенного союза ЕврАзЭС и обладают высокими потребительскими свойствами.

4. Масштабирование процесса глубинного культивирования БС Phallus impudicus с лабораторного биореактора BioStat на промышленный биореактор БИОР-250 обеспечило воспроизводимость технологии на 97%.

5. На лабораторных животных установлены противоопухолевые свойства пяти производственных серий БС Phallus impudicus - среднеарифметическое значение массы опухолей мышей, которым вводили БС Phallus impudicus было на 12,7% меньшим по сравнению с контролем, при этом ингибирующий эффект на рост АКЭ составил 71,0%.

6. Антиоксидантная активность водного извлечения мицелия Phallus impudicus составила 438 Кл/100 мл, что сопоставимо с СТО рутином (4,8 ТЕАС) и связано с наличием в мицелии полисахаридов.

7. Разработана биологически активная добавка к пище «Веселка» со сро- . ком годности 2 года при условии хранения при температуре от минус 20 до плюс 40 °С.

8. Годовая экономическая эффективность технологии глубинного культивирования БС Phallus impudicus на 7,5 млн. рублей выше в сравнении с существующей технологией культивирования Веселки обыкновенной.

6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. БС Phallus impudicus первая отечественная субстанция с противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами для конструирования биопрепаратов, применяемых при злокачественных образованиях у сельскохозяйственных животных на основе базидиомицетов.

2. Разработаны и утверждены Роспотребнадзором России (СГР № 77.99.19.3.У.4177.10.04 от 12.10.2004 г.) ТУ 9164-005-58301249-04 и ТИ 10005-58301249-04 на БАД к пище «Веселка».

3. Разработан проект СТО (58301249-001-2010 0), регламент производства № 5432 и нормативная документация на БС Phallus impudicus и методы контроля ее качества для Государственной регистрации и внедрения в ветеринарную практику.

4. Результаты исследований по разработке технологии культивирования базидиальных грибов на примере штамма Phallus impudicus используются в учебном процессе по дисциплине «Биотехнология» в ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И. Скрябина.

5. Установлены антиоксидантные и противоопухолевые свойства БС Phallus impudicus, обеспечившие выбор его в качестве субстанции для конструирования биопрепаратов с противоопухолевым и антиоксидантными действиями.

7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Материалы работы рекомендуются в качестве методических подходов при проведении исследований по разработке противоопухолевых лечебно-профилактических средств для животных.

2. Рекомендуем использовать БС Phallus impudicus для производства других биопрепаратов с противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами

3. Результаты исследований по разработке технологии глубинного культивирования базидиальных грибов и оценке их эффективности при аденокарци-номе рекомендуется использовать в учебном процессе по дисциплине «Биотехнология» в высших учебных заведениях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Разин, Александр Николаевич, Москва

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж. Молекулярная биология клетки. // 3 т. 2-е изд., - М.: «Мир», 1993.

2. Ананьева Е. П., Турина C.B., Кожемякина Н. В. Состав и биологическая активность углеводных фракций Pleurotus ostreatus // Проблемы медицинской микологии 2007, - Т.9, № 1 .-С. 30-32.

3. Бабицкая В. Г., Лобанков А. Г., Пленина Л. В. // Новая биологически активная добавка к пище. / Успехи медицинской микологии. Том 5. Глава 7. С. 359.

4. Бабицкая В. Г., Хлюстов СВ., Пленина Л.В Физиологически активные соединения и биологическое действие глубинного мицелия базидиомицета Ganoderma lucidium. //Биотехнология. 2003. № 4. С. 33-44.

5. Бадалян С. М. Химическое и фармакологическое исследование высших грибов. //Микол. и фитопатол. 1996. Т. 30, вып. 4, С. 79-86.

6. Бадалян С. М., Мнауакаян В.Л., Арутюнян Л.С. Химическое и фармакологическое исследование высших грибов // Микол. и фитопатол. 1997. Т. 31 .вып. 3.С. 61 -66.

7. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М.:1. Мир», 1989. 2т. С. 356

8. Белова Н. В., Природа биологической активности высших грибов // Успехи медицинской микологии. 2006.Т. 1 .С. 230-233.

9. Белова, Н. В. Перспективы использования биологически активных соединений высших базидиомицетов в России // Микология и фитопатология. 2004. - Т. 38. - вып. 2. - С. 1-7.

10. Билынский Б. Т., Волоько H.A., Шпарык Я.В. Иммунологические механизмы естественной противоопухолевой резистентности. Киев: Наукова думка. 1991. С. 248.

11. Бисько Н. А., Бухало А. С., Вассер С. П. Высшие съедобные базидиомицеты в поверхностной и глубинной культуре. Киев : Наук. Думка. 1983. С. 312.

12. Бисько Н. А., Митропольская Н. Ю. Перспективы использования лекарственного гриба Ganoderma lucidium в лечебно-профилактических целях // Успехи медицинской микологии. 2006. Т.1. С. 234-235.

13. Будников Г.К., Чернышева H.H. Способ определения интегральной антиоксидантной емкости продуктов питания и напитков.// Заявка на пат. РФ № 2003132741/20 от 10.11.2003 г.

14. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. М.: Пранд, 1999.

15. Вишняков А. В. Приготовление питательных сред на основе гидролизата соевой муки для глубинного культивирования бактерий рода Bacillus. Диссер. канд. Биол. Наук М. 2006г.

16. Владимиров Ю. А., Азизова O.A., Деев А.И. Свободные радикалы в живых системах.// Итоги науки и техники. 1991г. Сер. «Биофизика». М. ВИНИТИ. 24. С. 177.

17. Воюцкий С. С. Курс коллоидной химии, М. 1964г.

18. Галынкин В. А. Высокоплотностное культивирование. С-Петербург.: СПХФА, 1997 г.

19. Галынкин В. А., Заикина Н. А., Миндукшев И. В. Промышленная микология. // СПБ. Изд-во СПХФА. 2003г. С. 220.

20. Галынкин В.А., Ганин П.Г., Деркачев Э.Ф. Альтернативность программ роста и индукции дыхательных систем в процессе ферментации на н-алканах. // «Перспективные направления химии и химической технологии» Л. «Химия». 1991 г. С. 113-121.

21. Галынкин В.А., Заикина Н. А., Потехина Т.С. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии с основами асептики и биотехнологии. // Курск. 2002 г.

22. Герасименя, В. П. Антимикробные, антитоксические, радиопротекторные и радиосорбционные свойства новой биологически активной добавки к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВО-Д» // Успехи медицинской микологии. 2001. Т. 1. С. 265-267.

23. Голощев, А. М. Очистка и изучение иммуномодулирующих свойств экстракта из плодовых тел Pleurotus ostreatus / А.М. Голощев, Ю.О. Максимова, М.М. Шамцян, В.И. // Успехи медицинской микологии. 2003.Т. 1. С. 176-179.

24. Горшина Е. С., Скворцова М. М., Высоций В. Г. Биотехнологический препарат лекарственного гриба Траметеса // Успехи медицинской микологии. 2006 г.Т. 1.С. 274-276.

25. Горшина Е. С. Грибы рода Trametes fr. Как объекты биотехнологии //Совеременная микология в россии. Том 2. Материалы 2 -ого Съезда микологов в России. М: национальная академия микологов, 2008.-С. 548.

26. ГОСТ 11.0044 -74 (СТ СЭВ 876 78). Прикладная статистика. Правила определения оценок и доверительных границ для параметров нормального распределения. - Переизд. Янв. 1980 с изм. 1. - Введ. 01.07.75.-М.: Изд. Стандартов, 1984.-20 С.

27. Дейчман Г. И. (1984). Итоги науки и техники. Сер. «Онкология», М.: ВИНИТИ, 13, С. 46-70.

28. Дейчман Г. И. Естественный отбор и ранние изменения фенотипа опухолевых клеток in vivo: приобретение новых механизмов защиты //

29. Биохимия, 2000-, том 65, вып. 1, С. 92-111.

30. Денисова, Н. П. Лечебные свойства грибов. Этномикологический очерк / Н.П. Денисова. СПб.: Изд.-во СПбГМУ, 1998. - С. 59.

31. Дерягина В. П. Экспериментальное изучение функциональной активности нейтрофилов и макрофагов в условиях воздействия нитрита натрия //Биомедицинская химия, 2003, том 49, № 1, С. 19-26.

32. Дудка И. А., Вассер С. П. Справочник миколога и грибника. Киев: • Наукова думка. 1987. С. 536.

33. Еленов Н. П., Ананьева Е.П., Коссиор Л.А. Эуглипор новый противоожоговый препарат. // Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств: Тез. докл. всерос. научной конференции 21—23 ноября 1996 г. СПХФА, 1996 г. - С. 120.

34. Блинов Н. П. Химия микробных полисахаридов: // Учеб. Пособие для ВУЗов по спец. "Фармация"Биология М.:Высшие школа, 1984.-256 С.

35. Блинов Н. П. Рецензия. Н.П.Денисова «Лечебные свойства грибов. Этномикологический очерк», 1998. // Проблемы медицинской микологии.-1999. -Т. 1. №3

36. Блинов Н. П., Кравченко С. Б., Успехи в области изучения и производства антибиотиков. Проблемы биотехнологии физиологически активных веществ. // ВНИИ антибиотиков — М. 1990 С. 38 - 42.

37. Елинов Н. П. Некоторые микробные полисахариды и их практическое применение // Успехи микробиологии. 1982. - № 17. - С. 158-177.

38. Елинов Н. П. Основы биотехнологии. // СПб. Наука, 1995, 600 с.

39. Елинов Н. П. Предпосылки к обобщению биологических функций природных полисахаридов // Материалы науч. конф. "Итоги научного исследовательской работы ЛХФИ за 1970 г. " Л., 1971. - С. 5-7.

40. Жизнь растений. Т. 2 Грибы. Под ред. Проф. М.В. Горленко. М. «Просвещение», 1976 г.

41. Жоголев К. Д., В.Ю.Никитин, В.Н.Цыган. Хитозан в медицине и . рациональном питании // 2000г.СПб С. 24.

42. Заикнна Н. А., Коваленко А. Е., Основы биотехнологии высших грибов.// СПб. СПБХФИ 2007. С. 37-39.

43. Иванов В. Н., Угодчиков Г.А. Клеточный цикл микроорганизмов и гетерогенность их популяций. // Киев: «Наукова Думка», 1984г.

44. Кожемякина Н. В., Турина С. В., Ананьева Е. П. Глубинное культивирование некоторых базидиомицетов // Современная микология в России. Т. 2. Материалы 2-го съезда микологов в России. М. Национальная академия микологов. 2008. — 548 С.

45. Красная книга Красноярского края // 2005 г.

46. Купин В. И.,. Уткина М.В, Малахова Н.В. Препараты растительного происхождения перспективные индукторы цитокинов в организме в норме . и патологии // Вестник ОНЦ АМН России. 1994, № 2, С. 12-19.

47. Лакович Дж. Основы Флуоресцентной спектроскопии // М.: «Мир», 1986.

48. Ландсберг Г. С. Оптика// 4 изд., М., 1957г.

49. Литвинов М. А. Определитель микроскопических грибов. // Л. 1986.- 199 с.

50. Лысак В. В., Желдакова Р. А. Микробиология. БГУ, 2002 г.

51. Мартынова Е. Я. Клинические наблюдения больных раком желудка, легких, пищевода IV стадии при лечении чагой / Е.Я. Мартынова // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. // Л., 1959 г. С. 271-293.

52. Машковский М. Д. Лекарственные средства. // 15-е изд., перераб., испр. доп. М: РИА «Новая вольна», 2007 г, с. 270.

53. Мюрей Э.Ю., Киршнер М.У. Чем регулируется клеточный цикл.// М. 1991 г. С. 58.

54. Никитин А. В., Макаровская Л. Н. Изучение в многофакторном эксперименте сочетанного действия антибиотика и полисахарида при ' экспериментальной инфекции // Антибиотики и химиотерапия. — 1992 г. -№2. -С. 31-33.

55. Перова Н. В., Горбунова И.А. Макромицеты юга Западной Сибири. //Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2001. С. 158.

56. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. // М.: «Мир», 1978 г.

57. Печуркин Н.С. Популяционная микробиология. // АН СССР. Новосибирск: «Наука СО АН СССР», 1978 г.

58. Прозоровский В. Б., Прозоровская М. П., Демченко В.М. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и его ошибки // Фармакология и токсикология. 1978 г. - Т. 61. № 4. - С. 497 - 502.

59. Проскуряков С. Я., Коноплянников А.Г., Иванников А.И. Оксид . азота в неопластическом процессе // Вопросы онкологии, 2001 г. Т. 47. № 3, С. 257-269.

60. Пучкова Т. А., Щерба В. В. Полисахариды глубинного мицелия и культуральной жидкости грибов Ganodrema lucidum и Lentinus edodes // Успехи медицинской микологии. 2006 г. Т. 1. С. 275-276.

61. Работнова И. JL, Позмогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов. // М.: «Наука», 1979 г.

62. Разин А.Н., Волков М.Ю. Действие Lentinus edodes на рост подкожно перевитой аденокарциномы Эрлиха // Ветеринарная медицина 2005 - № 3-4.-С. 28-29.

63. Разин А.Н. , Рыжова Н.И Действие Lentinus edodes (Шиитаке) на ' рост опухолей у мышей на модели химического канцерогенеза // Российский биотерапевтический журнал. — 2006 г. № 3. — С. 21-25.

64. Разин А.Н., Волков М.Ю. Изучение противоопухолевых свойств высших базидиомицетов Шиитаке (Lentinus edodes), Трутовика лиственничного (Laricifomes officinalis) и Веселка {Phallus impudicus) II Ветеринарная медицина. 2009 г. -№ 1-2. - С. 71-75.

65. Разумов И. А. Высшие базидиальные грибы — продуценты • антивирусных соединений // Современная микология в России.: сб. ст. М., 2008 г. Т. 2. С. 518.

66. СОВРЕМЕННАЯ МИКОЛОГИЯ В РОССИИ ТОМ 2 Москва, 2008 г. С. 58-60.

67. Соколова И. П., Блинов Н. П. Изучение механизма активации иммуногенеза под влиянием противоопухолевого полисахарида маннана. Сборник науч. Тр. / Рижский мед. институт Рига. 1989 г. С. 56.

68. Соломко Э. Ф., Дудка И. А. Перспективы использования высших базидиомицетов в микробиологической промышленности (обзорная информация). // М. 1985 г. С47

69. Сосин П. Е. Определитель гастеромицетов СССР. // Л.: «Наука», 1973. С. 7-17.

70. Сотникова Н. Ю. Иммуномоделирующее действие сока гриба шиитаке in vitro // Успехи медицинской микологии. 2001 г. Т. 1. С. 286-287.

71. Суздалева В.В. Улучшенные препараты гидролизата казеина для парентерального белкового питания // Пробл. гематологии и переливания крови.- 1974 г. Т. 19. № 1. С. 30-32.

72. Суслов А. П. (1990) Итоги науки и техники. // Сер. «Онкология», М.: ВИНИТИ. 19 С. 167.

73. Тагер А. А. Физикохимия полимеров, // М., 1963 г.

74. Тарков М.И. Микробиологические методы оценки искусственных питательных сред // Кишинев: Штиинца. 1972 г. С. 89.

75. Телишевская Л.Я. Белковые гидролизаты. Получение, состав, применение // М.: Знание,- 2000 г. С. 241.

76. Тихонов И. В. Совершенствование технологии производства пробиотика «Биод-5» и методов его контроля // Ветеринарная медицина.- Изд-во «Агровет». 2004 г. .№ 4. С. 40-41.

77. Тихонов И. В. Терапевтическая эффективность пробиотика «Биод-5» при желудочно-кишечных болезнях лошадей /Тихонов И.В., Грязнева Т.Н., Васильев П.Г. //Ветеринарная медицина.-Изд-во «Агровет».- 2004.-№ 4.- С.9.

78. Турина С. В., Влияние дрожжевых пoлиcáxapидoв на некоторые компоненты иммунной системы в эксперименте: Дис. .Канд. биол. наук-JI., 1988 г. С. 185.

79. Урбах В. Ю. Биометрические методы.// М.: Медицина. 1964 г. - 416 С.

80. Успехи медицинской микологии. Под общей научной редакцией Ю.В.Сергеева,// Том 1., Научное издание, 2001 г.

81. Фараджева Е. Д., Болотов Н.А. Производство хлебопекарных дрожжей. С-Петербург., 2002 г.

82. Феофилова Е. П. Клеточная стенка грибов //1983 г. Изд. Наука. 2481. С.

83. Феофилова Е. П. Прогресс в области экспериментальной микологии // Микробиология. 1997. - Т. 66. - с. 302 - 309

84. Феофилова Е. П. Прогресс в области экспериментальной микологии //Микробиология. 1997. Т.66. №3. С.315-319.

85. Феофилова Е. П. Использование высших базидиальных грибов для создания лекарственных препаратов. // Матер. III Междунар. конгр. «Наука и практика грибоводства». Россия. Кашира. 1996 г. С. 17-20.

86. Хаитов Р. М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. //М. ВНИРО. 1995 г. 219 С.

87. Чехенкели В. А., Никифорова Т. И. Антимикробное действие дереворазрушающего гриба Coriolus pubescens (Shum.:Fr.) Quel. // Микол. и фитопатол. 1998. Т. 32.Вып.1. С. 69-72.

88. Babitskaya V.G., Bisko N. A. Some biologically active substances from medicinal mushroom Pleurotus ostreatus (Jack.: Fr.) P. kumm.(Agaricomycetideae) // Int. J. Med. Muslir. 1999. Vol. 1. № 4. P. 345-349.

89. Bang Luu //International Symposium on Ganoderma Lucidum, 4-th. -Seul, 1992.-P. 49-52.

90. Chihara G. Immunopharmacology of lentinan, a polysaccharide isolated from Lentinus edodes: Its application as a host defense potentiator // Int. J. Orient Med. 1992.V.17. P.57-77.

91. Choi H. S., Shin H. H. Purification and partial characterization of a fibrinolytic protease in Pleurotus ostreatus // Mycologia. 1998. Vol. 90. № 4. P. 674-679.

92. Effect of Inhalant Fungotherapy on Lewis Lung Carcinoma Spreading in Mice. The European Journal of Cancer, 1994 Vol 30A Supplement 1, Sll P. 50

93. Experimental Assessment of Succus Phalli Impudici Applying Possibilities in Cancer Therapy and Prevention. Suppl. 5 to Volume 5 of Annals of Oncology, March 1994. N 111, P. 96

94. Francia C., Rapior S.Current research findings on the effects of selected " mushrooms on cariovascular diseases // Int. J. Med. Mushr. 1999. Vol. 1. № 2. P. 169-172.

95. Fumio Yagil, Tomo Sakail, Hemagglutinins (lectins) in fruit bodies of Japanese higher fungi. Mycoscience, Volume 41, Number 4 / 2000, P. 323-330

96. Gunde-Cimmerman N. Medicinal Value of the Genus Pleurotus (Ft.) P. Karst. (Agaricales s. 1., Basidiomycetes) // Int. J. Med. Mushr. 1999. Vol. 1. № 1. p. 69-80.

97. Heberer M., Ernst M. Cancer Detect Preven. , 1983, P. 273-280.

98. Immune Correction of Alveolar Macrophage Function in Mice with Lewis Lung Carcinoma. European Journal of Haematology, No59 Vol 57, BP13 1996

99. Jong, S.C., Donovick, R. Antitumour and antiviral substances from fungi. Advances in Applied Microbiology 34, 1989 183-261.

100. Jong, S.C., Birmingham, J.M. Immunomodulatory substances of fungal origin. Journal of Immunology and Immunopharmacology 11, 1991. P. 115-122.

101. Kato T., Wokalek H. (1981) Klin. Wochenschr., 59, P. 203-211.

102. Kuznecovs S. Kuznecova G: Phallus impudicus in treatment of Lewis lung carcinoma. XVT1 International Congress of Allergology and Clinical Immunology ICACI XVII, Sydney, P. 421, 2000.

103. Kuznecovs S, Jegina K, Kuznecovs I and Kuznecova G: Phallus impudicus in thromboembolic disease prevention in cancer. Abstracts of the 16th MASCC International Symposium Miami Beach, FL, P . 379, 2004.

104. Kuznecovs, S. Jegina, Phallus impudicus: From Folk Medicine to Supportive Cancer Care INTERNATIONAL JOURNAL OF MEDICINAL MUSHROOMS. 2007, VOL 9; NUMB 3/4, P. 263

105. Minato, K., Mizuno. Influence of storage conditions on immunomodulating activities of Lentinus edodes. International Journal of Medicinal Mushrooms 1, 1999. P. 243-250.

106. Mizuno T. A development of antitumor polysaccharides from mushroom fungi // Foods, Food Ingred. J.(Japan).1996.V.66. P.69 -85.

107. Mizuno T. Shiitake, Lentinus edodes: functional properties for medical and food purposes//Food reviews international. 1995. 1 1(1). P. Ill -128.

108. Mizuno T. The Extraction and Development of Antitumor-Active Polysaccharides from Medicinal Mushrooms in Japan (Review) // International Journal of Medicinal Mushrooms. 1999. Vol.1. P.9-29.

109. Ohno N., Miura N. N. Comparison of the immunopharmacological activities of triple and single-helical schizophyllan in mice // Biol. And Pharma. Bull. 1995. 18. № 9. P. 1242-1247.

110. Ooi V. E. C., Liu F. A review of pharmocological activities of mushroom polysaccharides // Int. J. Med. Mushr. 1999. Vol. 1. № 4. P. 331-336.

111. Ooi V. E.C and Liu. F. A Review of Pharmacological Activities of Mushroom Polysaccharides// International Journal of Medicinal Mushrooms. 1999.1. Vol.1. P. 195-206.

112. Phallus Impudicus as a Possible Antidepressant of Macrophage Cytotoxicity in Tumour Carriers. European Journal of Haematology, No59 Vol 57, DP005 1996.

113. Phallus impudicus in nutrition for cancer pain adjuvant control after palliative radiotherapy. 15th MASCC International Symposium. Supportive Care in Cancer. 2003 103.P.415.

114. Phallus Impudicus in Thromboembolic Disease Prevention in Cancer. ' 16th MASCC International Symposium. Supportive Care in Cancer.2004 A-43. P.379

115. Phallus Impudicus in thromboprophylaxis in breast cancer patients undergoing chemotherapy and hormonal treatment. The Breast, Volume 16, Supplement 1, March 2007. S56 P. 151.

116. Phallus impudicus Prolongs Survival Time of Patients With Advanced Cancer in a Prospective Long-Term Epidemiological Cohort Study. Supportive Care in Cancer. 2006, Vol. 14. Nr. 6 June 2006, 09-063,P.616

117. Rajarathnam S., Shashirekha M. N., Bano Z. Biodegraditive and biosynthetic capacities of mushrooms: present and future strategies // Crit. Rev. biotechnol. 1998. Vol. 18 (2, 3). P. 91-238.

118. Remosova O. V., Denisova N. P. The action higher Basidiomycetes mushrooms mycelia on plasma lipids and lipoproteins of hyperlipidimic rats and guinea pigs// Int. J. Med. Mushr. 1999. Vol. 1. № 1. P. 69-80.

119. Reshetnikov, S.V., Wasser, S.P. Higher Basidiomycetes as a source of antitumour and immunostimulating polysaccharides (Review). International Journal of Medicinal Mushrooms 3. 2001. P. 361-394.

120. Sakagami, H. and Aoki, T. 1991. Induction of immunopotentiation ■activity by a protein-bound polysaccharide. PSK (review). Anticancer Research 11, P. 993-1000.

121. Sasaki, T. and Takasuka, N. Further study of the structure of lentinan, an antitumour polysaccharide from Lentinus edodes. Carbohydrate Research 47, 1976. P. 99-104.

122. Special issue on mushrooms: the versatile fungus-food and medicinal properties. Chemistry, biochemistry, biotechnology and utilization// Food. Rev. Int. 1995.-Vol. 11,№ l.-P. 1 -234.

123. Takita, Hitoshi, Wada, Toshihiko, Mukaida, Yutaka, Enomoto, Satoru, Nakajima, Akiyoshi (Mibu, JP), Okubo, Azuma (Mibu, JP) et al.: Growth promoting method for basidiomycetes United States, Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha.- 1983.

124. Tamir S.,Tanenbaum S.R. The role nitric oxide (NO.) in the carcinogenic process //Biochim. Biophys. Acta. -1996. Vol. 14. -P. 31-36.

125. Thomas J. Duffy, Toxic Fungi of Western North America Pubblished by MykoWe 2009. ykoweb.com March, 2008 (Web) August, 2008 (PDF)

126. Wasser S. P. Weis A. Medicinal Properties of Substances Occurring in Higher Basidiomycetes Mushrooms: Current Perspectives (Review) // International Journal of Medicinal Mushrooms. 1999. Vol.1. P. 3 1-62.

127. Wasser S. P., Weis A. L. General description of the most important medicinal higher basidiomycetes mushrooms. // Int. J. Med. Mushr. 1999. Vol. 1. №2. p. 351 -370.

128. Yoshioka Y., Tabeta R. Antitumor polysaccharides from Pleurotus ostreatus: isolation and structure of bet-glucan // Appl. Microbiol. B. T. 2002. Vol. 58. P. 582-599.

129. Zhang C., Mizuno T. Biological Responses from Grifola frondosa (Dick.; Fr.) S.F. Gray — maitake (Aphyllophoromycetideae) // Int. J. Med. Mushr. 1999. Vol. l.№4. P. 317-324

130. Zhang H., Gong F., Feng Y., Zang Ch. Flammunlin purified from Suit bodies of Flammulina velutipes (Curt Fr.) P. karst // Int. J. Med. Mushr. 1999. Vol. 1. № 1. p. 89 92.