Таксономия и метаболизм новых термофильных и галофильной сульфатвосстанавливающих бактерий, выделенных из месторождений углеводородов

Белякова, Елена Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Таксономия и метаболизм новых термофильных и галофильной сульфатвосстанавливающих бактерий, выделенных из месторождений углеводородов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Таксономия и метаболизм новых термофильных и галофильной сульфатвосстанавливающих бактерий, выделенных из месторождений углеводородов"

На правах рукописи

БЕЛЯКОВА Елена Владимировна

ТАКСОНОМИЯ И МЕТАБОЛИЗМ НОВЫХ ТЕРМОФИЛЬНЫХ И ГАЛОФИЛЬНОЙ СУЛЬФАТВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МЕСТОРОЖДЕНИЙ УГЛЕВОДОРОДОВ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник

Розанова Елена Петровна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Доктор биологических наук

Жилина Татьяна Николаевна Грабович Маргарита Юрьевна

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Защита диссертации состоится «У-^» ¿//тЬ&ьий- 2006 г. в угао часов на заседании Диссертационного совета Д.002.224.0] при Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Автореферат диссертации разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук . Никитин Леонид Евгеньевич

¿00 £ А 4534

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Сульфатвосстанавливающие бактерий (СВБ) являются постоянными членами микробных сообществ, развивающихся в эксплуатируемых залежах углеводородов, в частности нефтяных месторождениях, подвергающихся заводнению поверхностными и оборотными пластовыми водами Как правило, вторичное заводнение нефтяных гшастш привода- к появлению или увеличению содержания сульфатов, появлению доступного органического вещества и биогенных элементов, в юм числе фосфора Все это способствует активизации СВБ, обитающих в месторождениях нефти. Их жизнедеятельность приводит к изменению состава пластовых вод и вмещающих пород Образуемый ими сероводород растворяется в пластовой воде, нефти, и входит в состав попутного газа, что активизирует корразию нефтепромыслового мега-шичсско! о оборудования и приводит к нежелательным экологическим последствиям. Продукт реакции сероводорода и растворенного двухвалетнот железа (П) - сульфид откладывается в порах пласта, уменьшает приемистость нагнетаемой воды, что может влиять на эффекгавность процесса нефтеотдачи Таким образом, изучение СВБ нефтяных пластов, их свойств, позволяющих им функционировал в нефтяных пластах, является актуальной проблемой. Выявление миктмхяи лничмов с новыми свойствами позволяет расширить знания о биоразнообразии микробного мира, в частности о термофильных и галофильных СВБ.

Состояние вопроса, цели и задачи. В последние десятилетия, в связи с проблемой разработки микробиологических методов увеличения нефтеотдачи пластов, изучение микрофлоры нефтяных месторождений интенсифицировалось и в нем приняли участие европейские ученые - Франции, Норвегии, а также Америки, Японии и других стран В результате многолетних исследований было обнаружено значительное биологическое разнообразие СВБ, обитающих в нефтяных месторождениях. Среди них были выявлены мезофильные и термофильные представители, галофильные и галотолерантные. Если термофильные представители нефтяных пластов составили довольно большую 1р>ппу, то известные галофильные представители нефтяных месторождений немногочисленны. Практически все умеренно-галофильные бактерии, известные на сегодняшний день, выделенные из различных засоленых экосистем, оказались хемолшогетерспрофами и окисляли органические вещества неполностью - до ацетата и СОг Вопрос о существовании хемолитоавютрофных галофильных СВБ, полностью окисляющих органические вещества до СС^, способных развиваться в гиперсоленых условиях, оставался огкрытым В тоже время, большинство нефтяных месторождений, расположенных на больших глубинах, характеризуются высокой соленостью пластовых рассолов Это месторождения Волго-Уральского региона, регионов Каспийского моря, стран Персидского залива и другие. Поэтому, представляло интерес выявить существование галофильной СВБ, способной развиваться в условиях высокой солености пластовых вод, выделить чистую культуру и исследив¡пь ее мешбешим, в частности возможность автотрофного роста и полного окисления органических соединений.

Значительную часть всех изученных термофильных СВБ, обитающих в разных экосистемах, представляют споровые формы рода Эетй/оютасиЬт, Термофильные виды рода ГкьгфЫотаЫит значительно различаются по характеру метаболизма органических соединений и водорода. Некоторые из них способны развиваться в хемолитоавютрофных условиях за счет Н2/СО2, но окисляют органические соединения не полностью до ацетата и СОг, таковыми являются - Оен4/о1отаси!ит аийгЫюит, ОезиУЫотаайит 1ИегтоЬепгокит зиЬзр. йкгтагутйгорЫсит. Другие, полные окислители органических соединений, не окисляют водород. Поэтому, выявление метаболических особенностей и таксономического положения с привлечением современных методов исследования позволило бы внести ясность в характеристику рода ОетЛ/ЫотасиНт и обосновать возможность существования этих микроорганизмов в условиях нефтяных месторождений.

Цель настоящей работы: Исследование метаболизма и таксономии ряда штаммов сульфатвоссганавливающих бактерий, выделенных из месторождений углеводородов с высокой температурой или соленостью пластовых вод.

РОС. НАЦИОНАЛI НАГ ! БИБЛИОТЕК' >

Основные задачи исследования:

1. Поиск и выделение чистой кул муры галофильной сульфатвосеганавливающей бактерии из нефишого месторождения с высокой соленостью пластовой воды; исследование ее морфологии, определение параметров роста, особенностей метаболизма

2. Установление филогении и сиспажлического положения галофильной сульфатвосеганавливающей бактерии - штамма 11.

3. Определение параметров роста термофильных СВБ - штаммов 435, 781 выделенных ранее из

высокотемпературных газового и нефтяного месторождений углеводородов Западной Сибири, а также штамма Д-4, выделенного из высокотемпературного месторождения yi леводородов Китая Выявление особенностей метаболизма этих штаммов

4. Установление филогении и систематического положения термофильных сульфатвосстанавливающих бактерий штаммов 435 и 781.

Научная новизна работы. Впервые выделена и охарактеризована мезофильная факультативно-хемолигоавтепрофная умеренно-га-тофитьная сульфатвосстшавливаюшая бактерия - mravw 11, растущая в средах с содержанием NaCl 30-230 г/л. Вьмвлена способность к окислению жирных кислот - формиата, бутирата и пропионагта и к росту в хемолитоавтотрофных условиях за счет Hj/COjb средах с оптимальным содержанием NaCl 80-100 г/л. В условиях оптимальной солености бутират разлагайся без накопления ацетата. В клетках выращенных на среде с бутиратом, обнаружена высокая активность СОдегяцрогеназы, •по позволило отнести щученную СВБ к метаболическому типу полных окислителей В гиперсоленых условиях среды (200 г/л NaCl) бутират окислялся с образованием ацетата. На основании результатов изучения гено- и фенотипических свойств и метаболических особенностей установлена принадлежность микроорганизма к новому роду и виду Desutfovermiculus halophdus gen. nov., sp. nov., который располагается на отдельной ветви в подкластере филогенетического дерева й-Proteobacteria, представленного микроорганизмами семейства Desulföhalobiaceae.

Три штамма термофильных спорообразуклцих СВБ - 435, 781 н Д-4, обитающих в высокотемпературных месторождениях углеводородов Западной Сибири и Китая, использовали ряд жирных кислот и одноуглеродные соединения метанол, формиат, а также другие органические субстраты. Бактерии росли в хемолитоавтотрофных условиях за счет Н2/СО2. Ряд органических субстратов окислялись полностью. Выявлены некоторые особенности метаболизма, ранее не обнаруженные у представителей рода Desulfotomaadum: показано, стимулирующее действие дрожжевого экстракта на потребление ацетата и влияние начального содержания лакгата на полноту его окисления: новым свойством для СВБ этого рода явилось даспропорционирование тиосульфата. № основании фено- и геногапических свойств, хемотаксономии, метаболических особенностей бактерии были отнесены к новому виду Desulfotomaculum salinum sp. nov.

Практическая значимость работы. Практические аспекты выделения и изучения свойств СВБ. обитающих в нефтяных пластах, определяются возможностью использования их при испытании бактерицидов, применяемых в качестве тесг-обьекгов в технологиях, разрабатываемых с целью борьбы с сероводородной коррозией нефтепромыслового оборудования. Кроме того, образующие сероводород сульфатвосстанавливающие бактерии, реакция которою с растворенным в воде железом приводит к образованию нерастворимых сульфидов, могут играть существенную роль в избирательной закупорке нефтяных пластов в случае применения активации пластовой микрофлоры с целью повышения нефтеотдачи.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов» посвященном 120-летию со дня рождения академика В.Н. Шапошникова (с международным участием) (г. Москва, МГУ, 2004 г), на третьем международном конгрессе биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 14-18 марта, 2005 г), на 9-й международной Путинской штапе-конференции молодых ученых (г Пущино, 18-22 апреля2005 г).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 3-х статьях (4-я в печати) и 4-х тезисах.

Место проведения работы. Работа выполнялась в лаборатории нефтяной микробиологии Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю Раиновой Е.П. за внимание, полезньй советы и помощь при обсуждении результатов Особую благодарность автор приносит Беляеву С С.. Наяиной Т. Н, Ивановой A. R, Лысенко А М, Борзенхову И. А. Плакунову В. К, а также всем коллегам и друзьям, за содействие и поддержку

Объем и структура работы. Диссертация состоит ив разделов' «Введения», «Обзора литературы». «Экспериментальная часть» (включающая главы «Объекты и методы исследования» «Результаты и обсувдение». «Заключение», «Выводы» и «Список литературы» Материалы изложены на 154 страницах печатного текста и включают 38 таблиц, 17 рисунков. Список литературы содержит 59 наименований отечественных и 157 иностранных работ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы 435 (ВКМ В-1492), 781 (ВКМВ-1379) и типовой штамм!) kuznetsovii 17т (=ВКМ В-1805г,= DSM 6П5Т) выделены ранее Розановой ЕЛ и Назиной ТН. из высокотемпературных залежей углеводородов (Назина, Иванова, 1988; Пазина, Розанова, 1978), и были предоставлены диссертанту руководителем работы. Штаммы Д-4 и 11 выделены диссертантом Характеристика источников выделения бактерий.

Характеристика нефтяного месторождения района Персидского залива. ЦЬачм 11 выделен из пластового рассола нефтяного месторождения района Персидского залива (толща Асмари), где нефть залетала й антиклинальной складке и подстилалась пластовым рассолом. В пласт нагнеталась вода из-за контура нефтеносности, которая представляла собой смесь пластовой воды и промывочной жидкости Она относилась к хлоридно-кальциевому гину с общей минерализацией 160 г/л Содержание сульфатов составляло 0.029 г/л. Температура пласта не превышала 90иС. Извлекаемый из добывающей скважины рассол ошосюкя к хлоридно-кальциевому тепу и содержал 200 г/л солей. Содержание сульфатов составляло 0.034 г/л.

Характеристика месторождений Западной Сибири. Шгамм 435 был выделен из сопутствующей воды, вьпекнющей ж i гшшбмшияцей скважины Игримского газокондснсалтюго месторождения, залегающего в терригешюй вогулкикекой толще средней юры (пласт П). Месторождение эксплуатировалось с 1968 года без применения заводнения. В залежи присутствовал углеводородный конденсат мстнново-нафтеновош состава. Газ в основном состоял из метана. Толщу, содержащую углеводороды, подстилали пластовые воды хяоридно-кальциевого типа с минерализацией около 9.88 г/л; сульфаты и сероводород в воде отсутствовали. В газоносной толще имелась маломинерализованная конденсата* вода (соленость - 60 мг/л). I лубина залегания пласта - 1600-1620 м, температура - 59°С. Вода, извлекаемая вместе с газом, была представлена смесью кондепсатной и пластовой вод

Штамм 781 бил выделен из Устъ-Баяыкского нефтяного месторождения, относящегося к Обской группе Залежь расположена в терригенной нижневартовской толще меловых от ложений (пласт ВС j на глубине более 2100 м Температура в пласте составляла 63-70°С. Пластовая вода добывающей скважины относилась к хлоридно-кальциевому типу и содержала 16.0 г/л солей; сульфаты и сероводород в исследованной воде отсутствовали. В месторовдение нагнетали воду Ю> анской Оби с минерализации 195 мг/л и содержанием сульфатов 9.0 мг/л Штамм 781 был выделен из пластовой воды, извлеченной из добывающей скважины, расположенной на участке, не затронутым заводнением

Характеристика нефтяного месторождения Даган. Штамм Д-4 выделен из залежи Кондиан нефтяного месторождений Даган, которое находится в провинции Хебей (КНР) Исследованные песчаные нефтеносные горизонты (1206-1435 м) имели температуру 59 °С, среднюю пористость 33%, проницаемость 1.878 мкм2 Нефп. месторождения Даган имела плотность около 0900 г'см3, содержала 53% насыщенных углеводородов, 20% ароматических соединений, 21 15% составили

смолы i асфальтены, и имела вязкость 73 мПа х сек при 50 "С. Пластовая вода шдрокврбонатно-натриевого тшв имела низкую минерализацию (5.6 г/л).

Состав питательных сред, условия для выделения, поддержания, культивирования и учета микроорганизмов. Выделение, культивирование и определение физиолого-биохимичееких особенностей сульфатвосетанавливаюцщх бактерий осуществляли с применением анаэробной техники Хангейта (Hungate, 1969) и согласно рекомендациям Видделя (Widdel, 1980).

Штаммы 435,781 и D. kuznetsovu 17Т поддерживали путем последовательных пересевов (1 раз в три месяца) на минеральную среду Видделя солоноватую № 1 (Widdel, 1980), содержащую (г/л). NaCI - 5.0; MgClzx 6НгО - 0.6, KCl - 03; СаС12 х 21Ш - 0.1; NH4CI - 03; КП2Р04 - 0.2; Na^ - 2.8; NaHCOj -1.5; с двумя восстановителями (Na^S х 9Н20 - 0.3 г/л и Na^S/.^ - 0.05 г/л) и фумаратм натрия (1 0 г/л), снабженную микроэлементами (!0 мл/л) по рецешу Пфеннига н Линперга (Pfawiig, Lihhert, ¡966) Для выяснения интервала температуры, солености и pH для роста штаммов 435 и 781 использовали ту же среду Писевы инкубировали при температуре 60°С. Штамм Д-4 выделяли на среде того же состава, как и для выделения штаммов 435 и 781 Дм очистки сульфатвоссганавливающих бактерий ш спугников -метанибриующих бакгсрий в среду добавили БЭС (бромжисульфонапг) в концентрации 30 мМ

Минера шпон основой для получения накопительной культуры, выделения чистой галофильной сульфатвосстанавливающсй бактерии, ку льтивирования, а также выяснения нарамегров температуры, pH и солености, обеспечивающих рост цггамма 11, служила модифицированная по содержанию натрия, кальция и магния среда Видделя морская №2 (Widdel, 1980), имеющая в составе (г/л)" NaCl -150; MgCb X 6Н20 - 3, СаС12 X 2Н20 -10; KCl -0.5; NH4CI - 0.3; КН2ГО4 - 0.2; Na2S04 - 2.8; NaHCO, - ! 5 В среду вносили два восстановителя (N%S х 9Н20 0.3 г/л и Na2S204 - 0 05 г/л), раствор селенита натрия (1 мл/л) (Widdel F, 1980) и микроэлементами, приготоапенными, как указано выше. Посевы инкубировали при температуре 37 °С.

Микроскопические методы исследования. Морфологию и ультраструктуру клеток бактерий изучали в свет оном микроскопе Jenava!, снабженном фазово-контрастым устройством, при увеличении X 1000 VjihipaHHiKyH) структуру клеток изучали на срезах в члектротюм микроскопе JEM-100C при ускоряющем напряжении 80кВ и инструментальном увеличении 20-30 тыс

Аналитические методы. Рост бактерий в жидкой среде оценивали по приросту сероводорода (X -670 им) и оптической пщпноспи (X - 420 нм) на полуавтоматическом спектрофотометре Specol 21. Содержание белка в микробной биомассе определяли колориметрическим методом Лоури (Lowry et al, 1951). Количества метана, водорода, углекислоты определяли методом газовой хроматографии, летучие жирные кислош - методом ГЖХ. Сероводород анализировали по модифицированному методу Пахмайра (Trüper, Schlegel, 1964). Жирно-кислотаый состав биомассы определен к.б.н. ГА. Осиповым с помощью компьютеризованной системы газовой хромагографии-масо-спсктрометрии на приборе НР-5985 фирмы Хьюллег-Паккард (США). Выделение мономерных компонентов из лини дон клеток производали с помощью кислого метанолиза. Для сопоставления профилей жирных кислот и определения степени корреляции с родственными видами применяли алгоритм распознавания образов Hewlett-Packard Chemslation НР-5995. Возможность образования иона аммония в процессе нитратредукции определяли по интенсивности окрашивания щелочного раствора иодомеркуриата калия К2[Нg}4] - реактива Нессжра, добавленного к пробе (Резников, Муликовская, 1954). Возможность дисмугации тиосульфата штаммами 435 и 781 выявляли на указанной минеральной среде, не содержащей органического источнику к ко трои сульфт заменен тиосульфатом. Образование SO/ измеряли турбидимегрически (Сурюпка, Pfennig, 1986). Определение типа менахинона вели согласно методу Коллинза (Collins, 1985) Наличие в клетках СВБ специфической сульфтредуктазы - десульфовиридана определяли с помощью флуоресцентного спектрофотометра «Hitachi», используя метод, рекомендованный Постгейтом (1959).

Методы определения активности Ферментов. Активность СО-ДГ определяли спеаярофотометрически в регистрирующем спектрофотометре «Specord» (Германия) в анаэробных термостатируемых иовешх по скорости восстановления бегаилвио.чогена водородом при 600 нм и

температуре 37 °С (Пушева, Соколова, 1995).

Методы оценки интенсивности анаэробных микробных процессов. Скорость сульфатредукции в культуралыюй жидкости еульфатвоссгаиавливаюших бактерий огтреде.шш радисгоошпным методом, используя меченый Na23sS04. Суточную интенсивность процесса расчитывали по формуле (Романенко, Кузнецов, 1974).

Молекулярно-биологические методы. Выделение ДНК осуществляли по методу Мармура и Доти (Маппиг, Doty, 1962) Содержание Г+I (-пар ояюваний в ДНК определяли по температуре плавления ДНК, используя регистрирующий спектрофотометр «Pye Unicam SP 1800». Уровень гомологии в ДНК устанавливали методом оптической реассощшщи (De Ley et at., 1970). Амплификацию и секвенирование гена 16S рРНК »¡деленных чистых культур проводили с использованием универсальных праймеров (Edwards et al, 1989). Фрагменты 16S рДНК секвепировали на автоматическом секвенагоре DNA Sequencer 373А с помощью специального набора (Applied Biosystems, США). Анализ последовательностей 16S рДНК вьщеленных штаммов был выполнен к.б.н. Т.П. Туровой с использованием програмного обеспечения Ribosomal Database Prefect (Larsen et aL, 1993). Укорененное филогенетическое дерево исследуемых бактерий было создано с помощью пакета программ TREECON (Van de Peer, De Wächter, 1994)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Г А Л ОФ ИЛЬИ ЛЯ СУЛЬФАТВОССТАНАВЛИВАЮЩАЯ БАКТЕРИЯ 1.1. Морфология клеток

Штамм 11 представлен подвижными на ранних стадиях, за счет одного полярно расположенного жгутика (Рис 1 Б), вибриоидными клетками, одиночными или в парах, не спорообразующими; в стационарной фазе роста клетки значительно удлинены и имеют изогнутую червеобразную, иногда спиралевидную форму (Рис.1 А, Б, В). Размеры клеток варьируют от 0.5-0 6 мкм в ширину до 1-15-20мкм в длину. Микроорганизм имеет грамсярицагельное строение клеточной стенки, окрашивается по Граму отрицательно. На ультратонких срезах в клеточной стснке просматривается нарушая я внутренняя мембраны периплазма Выделяются зона нуклеоида и полирибосомы (Рис 1 Г).

Рис. 1. А) (Слетки 15-ти суточной культуры на среде с лакпггом (1г/л) и дрожжевым экстрактом (05 г/л), содержащей 100 i/.ч NaCl Световой микроскоп, X 1000,

Б) Клетка со жгутиком, 15-ти суточная кулыура iiä срсдс t малатим. Электронный микроскоп. X 8271; В), ВОУлырагонкий срез клеток. ]5-ти суточная кулыура на среде с манатом, (100 г'л NiaCI) Электронный микроскоп, В)Х 15789, В,) X 26875, Г) Ультратопкая организация клеток 15-та суточная культура на среде с чалдгом (!00г/лМаС1) Электронный микроскоп, X 1П928, НМ наружная мембрана, ВМ~ внутренняя мембрана, ПП - периплаз-матическое пространство, Н- нуклеочд, ПР-1Юлирибосомы

1.2. Параметры роста

На среде с малатом натрия штамм 11 рос и продуцировал Н28 в диапазоне концентрации ЫаС1 от 30 до 230 г/л и оптимально - при 80-100 г/л (30 суток культивирования) (рис. 2) Дрожжевой экстракт, внесенный в среду с малатом, ускорял образование Н28, но значения солевых параметров оставались те же. Эти результаты были подтверждены также экспериментом с включением 358/8042' в продукцию сероводорода. При 15-ти суточной инкубации культуры включение радиоактивной метки в Н2Я начинались при содержании в среде N801 в количестве 30 г/л, максимальную скорость наблюдали при 80 г/л Скорость была минимальной при 220 1 /л №0. Значения содержания солей магния и кальция в среде для оптимального роста в пересчете на безводные МйСЬ и СаСЬ, которые составили соответственно 1.38 г/л и 0 37 - 0 75 г/л (Рис 3) На основании этих результатов штамм 11 отнесен к группе умеренно-галофильных сульфатвосстанааливающих бактерий.

К»С1, г/п

Рнс. 2. Рост штамма 11 при различном содержании №С1 (11 и 30 суток культивирования)

4 в

СаС^, МдС1,. г/л

Рис. 3. Продукция Н28 шт. 11 в средах с малатом натрия при различном содержании СаСЬ и МёС12.

Микроорганизм рос в диапазоне рН сред от 6.0 до 8.5 и оптимально при значении рН 7.2 (Рис. 4). Таким образом, штамм 11 являлся нейтрофилом

Штамм 11 относился к мезофильным бактериям и рос при температурах от до 47°( оптимальное значение составило 37°С Слабое дыхание (продукция Н2Я - 0 87 ммоль/л. без прироста оптической плотности) прослеживалось при 50 °С (Рис. 5).

- 0,35 < 3,5

■■ 0,3 ' 3

--0,25 ' 2,5 ■

°'2 51 \ 2

0,15° | ^ 1,5 ■

01 ' 1 Г

0,05 ' 05 т

0 0 -

Рис. 4. Рост штамма 11 при различных значениях рН среды (18 суток культивирования)

25 30 35 40 45 50 Температура, °С

Рис. 5. Рост штамма 11 при различных значениях температур (17 суток культивирования)

1.3. Метаболизм органических соединений и водорода; СО-дегидрогеназная активность; акцепторы электронов; состав хинонов; экономический коэффициент

Штамм 11 являлся облигатным анаэробом и не нуждался в витаминах. В условиях культивирования на оптимизированной среде в присутствии сульфата (без дрожжевого экстракта) рос в средах, содержащих лакгат, малат, фумарагг, пируват, пропионат, бутират, формиат, кротонат, сукцинат, глицерин, этанол, пропанол, аланин и авгготрофно за счет ЬУСОт. Ацетат, валериат, пальмитат. глюкоза, фруктоза, бепзоах, метанол, бутанол, пропанол, глицерин, серии, глицин, бетаин и дрожжевой экстракт не под держивали рост.

Метаболизм штамма 11 на средах с бутиратом и пропионатом был изучен более детально. В среде, содержащей 100 г/л NaO исследованный микроорганизм окислял бутират при его начальной концентрации 11.25 мМ без накопления ацетата. Было окислено 2.55 ммоль/л бутирата и продукция H2S составила 3.84 ммоль/л. Полученный коэффициент молярного отношения Н28/окиеленный бутират - 1.5, оказался ниже теоретического - 2.5, рассчитанного по уравнению дыхания полного окисления (Табл. 1. вар !, уравн. 1) Полученное несоответствие опытного и теоретического молярных коэффициентов вероятно связано с дополнительными затратами субстрата на синтез белка, осмопротекгоров и на поддержание жизнедеятельности клеток.

Разложение бутирата штаммом 11 при содержании в среде 200 г/л Nad сопровождалось накоплением ацетата. При этом было окислено 0.57 ммоль/л бугарита, продукция ацетата составила 0.58 ммоль/л. Коэффициент ацетат/окисленный бутират, составил единицу ( Гайп. 1, вар. 2), что было в два раза меньше, чем величина, рассчитанная по уравнению дьгхания при неполном окислении, осуществляемом Desulfocella halophüa (Welsh, Lindsay et aL. 1996) (Табл. 1, уравн. 2), но соответствовало теоретическому значению, по уравнению дыхания, так называемого частичного окисления, характерного для Desulfotomactdum thermobenzowum (Tasala, Kamagata et al.. 1991) (Табл. 1, уравн. 3). В последнем случае, одна молекула бутирата окисляется с образованием одной молекулы ацетата и двух молекул НСО;". Уют вариант окисления бутирата, как и полное окисление, сво&чиенмо i руине ГВБ - полных окислителей Обращает на себя внимание необычно большое количество сероводорода образовавшегося в гиперсоленой среде при небольшом количестве окисленного субстрата Для объяснения этого феномена сделано предположение о возможном включении процесса диспропоршонирования промежуточных продуктов восстановления сульфата. Прирост оптической плотности в среде с 200 г/л NaCI не наблюдался

Таким образом, окисление бутирата в гиперсоленой деде в процессе сульфатредукшш не благоприятно для роста штамма 11. но способствует) дыхательному процессу и сопровождается окислением ацетата.

При изучении разложения пропионата была исследована способность штамма 11 к полноте его окисления при различном исходном содержании в среде, а также в случае добавления дрожжевого экстракта в качестве стимулирующего субстрата и в условиях солености 100 и 200 г/л NaCI

Было установлено, что с уменьшением начального содержания субстрата, в среде с содержанием 100 rti NaCI, увеличивалось количество окисленного пропионата по отношению к исходному. Чем ниже (ядло начальное содержание пропионата, тем меньше образовывалось ацетата на единицу окисленного субстрата, на что указывал коэффициент К. - молярного отношения ацетат/окисленный пропионат (Табд2, вар. 1, 3, 4). При содержании пропионата в среде 730 мг/л этот коэффициент составил величину 0.81 и приближался к единице - теоретическому значению свойственному процессу дыхания при неполном окислении пропионата При уменьшении начального содержания пропионата до 430 и 175 мг/л, образование ацетата на единицу окисленного субстрат снижалось и К| составлял величины - 0 58 и 0.45 соответственно (Табл. 2 , вар. 3 и 4). С уменьшением образованного ацетата на единицу окисленного пропионата снижается и коэффициент К2 - ацетаг/Н^ (Табл. 2, вар. 1), в то время как К3 - H2S/ окисленный пропионат - увеличивался (Табл. 2, вар 1 и 3). При этом, опытные величины К2 были ниже

теоретических (Табл. 2., вар 1, 3-4), рассчитанных по уравнению неполного окисления пропионата до ацетата (Табл. 2., уравн 1) Таким образом, при снижении концешрации пропионата в среде увеличивалась полнота его окисления и большее количество протонов поступало на восстановление сульфата. Подученные результаты позволяют сделать заключение, что снижение концентрации органическою субстрата в среде, в нашем случае ■это пропионат, способствует его более полному окислению Подобные варианты встречаются в литературе- термофильная СВБ - Dt acetoxidans (Widdel, Kennig. 1981). характеризующаяся наличием ферментов разложения ацетил-КоА до 2-х молекул СС>2(путь Вуда) (Wood 1986), полностью окисляла бутират только при введении его в среду в количествах, лимитирующих рост.

Добавление к среде с пропионатом дрожжевого экстра1сга (0 5 г/л) оказало стимулирующее действие и способствовало полному потреблению пропионата из питательной среды Ацетат накапливался как в среда с дрожжевым экстракюм, так и без него, но в первом случае, количество ацетата на единицу окисленного пропионата было ниже, чем во втором (Табл. 2, вар 2 и 1) В варианте 2, в среде с дрожжевым экстрактом, коэффициент К; - ацетат/окисленный пропионат. полученный опытным путем, оказался намного ниже, чем теоретический, рассчитанный по уравнению неполного окисления пропионата (Табл. 2, уравн. 1) и составил величину 0.28 вместо предполагаемой 1.0. Коэффициент К? -зцстятУНгЧ в варианте с дрпжж<т?ым экстрактом ГГабч. 7, вар 2) пкязяле» ниже чем в няриакге с пропионатом без дрожжевого экстракта (Табл. 2, вар 1). в то время как коэффициент К3 - ITjS /окисленный пропионат - увеличился В варианте 2 {Табп 2} К, составил величину 0 76, г>т дает вспможносяъ рассматривать стимулирующее влияние дрожжевого экстракта на наиногу окисления пропионата, сопровождающееся большим поступлением протонов на восстановление сульфат Таким образом, в проведенных экспериментах часть пропионата окислялась до ацетата, часть до ССЬ. Некоторое количество субстрата потреблялось на построение биомассы и синтез осмопротекторов. Дрожжевой экстракт мог способствовать полноте окисления субстрата за счет активации ферментов пути Вуда.

Разложение пропионата штаммом 11 при содержании в среде 200 г/л NaC'L как и в средах с содержанием ¡00 г/л NaCl, сопровождалось накоплением ацетата. Показатели убыли пропионата, образования ацетата и сероводорода несколько различались (Табл. 2, вар.1 и S) В среде с 200 • /л NaCl количество образованного ацетата на единицу окисленного пропионата было несколько меньшим, чем в среде со 100 г/л NaCl.

Разложение других органических соединений также сопровождалось большим или меньшим накоплением ацетата. Согласно литературным данным многие сульфатвосстанавливающие бактерии, способные к полному окислению некоторых органических соединений до COz, например, Desidfotomaeulum thermobenzoiam, полностью окисляющий бензоат (Tazaki, Kamagala et al., 1991), разлагают другие субстраты с большим или меньшим накоплением ацетата. Полагают, что феномен накопления anemia полными окислителями связан с различиями скоростей накопления ацетил-КоА и его окисления при разложении разных органических соединений (WiddeL Hansen. 1992) Возможно, что наблюдаемые нами различия полпоты окисления бутирата и других субстратов штаммом 11 имеют го же объяснение. Не исключена возможность, что другие субстраты, разлагаемые штамме»! 11 с накоплением ацетата, будут окисляться полностью, при введении их в среду в лимитирующих для роста количествах.

Исследованный микроорганизм явился первым из изученных умеренно-галофильных СВБ. способных полностью окислять органические соединения, в частности соли жирных кислот - бутираг и, по-видимому, пропионат Ранее была известна сульфатвосстанавливающая бактерия - DesidfoceBa hcdophüa. окисляющая жирные кислоты Г>гсгг микроорганизм разлагал жирные кислоты с четным числом атомов углерода до ацетата, а с нечетным - до ацетата и пропионата. Ацетат и пропионат этой бактерией не окислялись (Brandt, Pateletal, 1999).

Активность СО-дегидрогеиазы определяли при участии к.бн. МА. Пушевой В клетках штамма И, вмращенного на среде с бушрагом выявлена высокая активность СО-дегащрогеназы - 675 мкмешь • мин" • мгЛбслка. Эта величина сравнима с активностью этого фермагга в клетках полного окислителя Desidfotvmaculum acetoxidans (6.0), разлагающего ацетат (Spormann, Thauer, 1988)

Таблица 1. Разложение бутирата в процессе сульфатредукдии при содержании в ереди 10% и 20% NaCl.

Субстрат

Содерж. NaCl, г/л

Срок культ, суг.

Начадьиая концентрация _мг/л (мМ)

Бушраг

Окислено мг/л(мыоиь'л)

Ацетат, продукция

мг/л (ммедь/л)

H,S,

нрод>"КЦИЯ

мг'л (ммоль/л)

К| - Ацетат/ оку сл. бутираг

Bow.pt: Теор.

Коэффициешы

К2-Ацетат/H2S

В опыте Теор.

К3 - Нг&'окисл. бугират

В опыте Гео]

Бушрат

100

990(1125)

225(2.55)

131(3.84)

1.50

200

103

670 (7.61)

50(0.57)

350(0.58)

43 (1.28)

1.0

2.0 1.03

0.17

4.0 0.661

2.24

гУ1

052)

1.53)

0.5 й

1.5

Примечания: 1) По уравнению дыхания полного окисления, выведенного m обшей формулы окисления жирных кислот с четным числе» атомов углерода (Widdel, Hansen, 1992)- 2СН3(СН;)2СОО +5 SO,,2' — 8НСО.+5HS+H'; 2) По уравнению дыхания неполного окисления дл< Detuifbcelh hdophila (Welsh, Lindsay et al.,1996). СН-,(СН2)2СООЧ1/2 S042" -» 2CHiCOO+1,2HS"+1/2H*; 3)По уравнению дыхания частичного окисления для Deiulfotomactdum thermobenzoicum (Tasaki, Kamagata et al., 1991): C'H3(CH2)2COO +1.5 SO<J" -» CH,C 00"+2 HCO3'+0.5 К*+! SUS"

Вари -ант, № Срок KJ'.lb-тивиро -вания, суг. Содерж NaCl, г/л Дрож. жегр.в среде, г/л Пропинат Ацетат. Началь- 1 ' продуки.. H2S, продукц., мг'л (ммоль'л) К] - Ацетат/ окисл. пропионаг к2- Ацстат/HiS KJ-HJS/ Окисл пропионаг

иая концентрация мг/л (мМ) икислено, мг/л мг/л (ммолыл) (ммоль/л) | В опыте Геор1' В опыте Теор. 1) В опыте Теор

1 75 100 0 730(9 86) 505(6 88) j 336(5.60) 153(4.50) 1 0.81 1.00 1.24 1.33 0.65 ÔJS17' 1.7531

2 15 100 05 930(12 57) 930(12.57) ' 210(3.58) 328(9 64) 5.28 1.00 0.38 1.33 0.76 0.75 » 1.75«

3 20 100 0 430(5.81) 367(4 72) ' 167(2.75) 127(3.74) 0.58 1.00 0.73 1.33 0.80 0 75 " 1.75 4

4 20 100 0 175(2.36) 154 (2.08) 1 58(0 95) % (2.82) ГО .45 1.00 0.33 133 1.35 0.75 » 1.75*'

5 103 200 0 750(1014) 535(7.35) | 455(7.58) 1 J 72 (5.0} j 1.03 1.00 1.51 1.33 _J 0.68 0 75 " 175 21

■■I—— nciiujinum икт.лсни>1 пржнонашире-деганигелями рода uesiujooiutjus iкпагм-is, Hansen, wioael, ¿UU4):

4CHiCHîC00 +3S042 -»4CH3COO"+4HCO/+3HS"+lf, ДО01- -150 kJ. ( 1 ). 2) По уравнению .дыхания полного окисления (ni общей формулы окисления жирных кислот с нечешымчислом атомов углерода (Widdel, Hansen, 1992): 4Н(СН2)дСОО 47SO.»1 -> 12HCOV+7HS"+H*(2)

Рост в лнтоавтотрофных условиях за счет окисления Н;. Штамм 11 образовывал H2S -(155.1 мг/л) в условиях хемояитоавтотрофного роста за счет Hj/COj, что также сопровождалось увеличением оптической плотности. В процессе авгогрофного роста на H2/COi наблюдали образование небольших количеств метана (286 нмоль/100 мл культуральной жидкости), что свойственно микроорганизмам, характеризующимся высокой активностью СО-даидрогеназы.

Таким образом, можно заключить, что исследованный цпамм 11 относился к группе полных окислителей органических соединений, но в определенных условиях - при высоких концентрациях субстрата и солености сред - окисление протекало с накоплением ацетата Результаты позволяют заключить, что в клетках присутствуют ферменты пути Вуда (Wood, 1986), ответственные за разложение ацетил - КоА до СОг. Одним из них является СО-дегндрогеназа высокая активность которой в клетках штамма И доклана настоящим исследованием. Образование небшшш количеств метана в процессе авгогрофного роста на II2/CO. свидетельствует о наличие ферментов пути Вуда, ответственных за синтез ацешл-КоА ш 2-х молекул СОг Согласно литературным данным, ферметы синтеза и разложения ацетил-КоА могут быть различны (Rhabus. Hansen, Widdel, 2004)

Акцепторы электронов. В отсутствие су.1ьфагов штамм И сбраживает пируват и фумараг Акцепторами электронов служат сульфат, сульфит, тиосульфат, элементная сера и ютрат Следует отмстигь, что при росте на элементной ссрс наблюдалось увеличение оптической плотности клегочной сусле»пни, значение которой составило Dn - 0 102. и продукция сероводорода составила - 215 6 мг/л. Нитрат натрия не обеспечивал накопления биомассы, а только восстанавливался до аммония

Состав изопреноидных жиноиов определен к.бл. Зякуном А.М. При исследовании штамма 11 на наличие изопреноидных хинонов в масс-спектре обнаружен характерный для менахшюнов интенсивный пик с m/z 225 и молекулярный ион с массой 648 в стандартных условиях масс-отекгрометрического анализа менахипонов. Сделан вывод о том, что в данной полосе присутствует менахинон МК-7.

В клетках штамма 11 десульфовириднн не был обнаружен.

Экономический коэффициент, рассчитанный для штамма 11 (Табл. 3) оказался выше на среде с бугаратом. По-видамому, это связано с тем, что процесс полного окисления бутирага дает больший энергетическим выход, обеспечивающий больший урожай биомассы, чем процесс неполного окисления пропионата. Дрожжевой экстракт не являлся ростовым субстратом и практически не повлиял на величину экономического коэффициента при росте на пропионате.

Таблица 3. Экономический коэффициент при окислении пропноиата я бутирата ттаммом 11.

Вариант, № Субстрат Белок, M1/J." Экономический коэффициент белок / окиси субстр.2)

Орг. в-во Нач. кол-во субст,мт/л Окисл. субсг, мг/л Дрожж. экстр., г/л А Б

1 Бушрат 990 3700 0 20.48 0.055 0.045

2 Пропионат 730 5800 0 13.23 0,021 0 021

3 Прошюнш 930 930.0 05 20.64 0.022 0.021

Примечания: 1. Урожай белка определяли в конир логарифмической фазы роста, 2 - А) результаты экономического шэффицие!па рассчитанного по данным в единицах мг/т Б) — в единицах С-субстрета и Сабеям мг/л.

1.4. Геиотипическая характеристика и филогенетический анализ

Содержание Г+Ц- пар в ДНК цггамма 11 составляло 552 мол.% Для установления филогенстического положения ппамма II была определена полная последовательность гена 16S рРИК (1429 нуклеотидов на позициях 8-1520 номенклатуры £ coli). Согласно проведенному предварительному скринингу по базе данных RDP, последовательность гека 16S рРНК изучаемо! о штамма била наиболее

близка к аналогичным последовательностям представителей семейства Desulfohalobiaceae 5-Proteobactena Семейство Desulfohalobiaceae было охарактеризовано Куйиером и соавторами (Kuever, Raynev, WiddeL 2003) и к нему были шнесены филогенетически близкие и облигатно зависимые от NaCl сульфатаоссгаиавливающие бактерии. В их число вошли Desulfohalobium retbaense (Olltvier, et al.. 1991), Desuifbnatronovibno hydrogenovorans (Zhilina, Zavarzin et a!., 19971 окисляющий алканы термофил рода Desuljbthermus (Rabus. Hansen et al., 1991) По данным филогенетического анализа к этому семейству принадлежит также Desutfonauticus mbmarinus (Audiflnn, et al, 2003), однако этот микроорганюм no отношению к NaCl является галотолерантом.

Г*С

•Desulfovibrio Utoralis DSM П393г. X99504

~~ Desulfnvibrin desulfuricans subsp. detulfuricans ATCC —Desulfovibrio halophilus DSM 5663т, X99237 •Desulfovibrio qfricamts DSM 2603т. X99236

100 j Desulfomicrobmm apsheronum DSM 59! 8 , U64865

LDenilfrmicrohium baculatum VKM B-l378T, AF030438

too Г* Desulfonatronum cooperativum Z-7999T, AY725424 "V Desulfonatronum lacustre DSM 10312T, AF418171 Desulfonatronum thiodismutarts MLF1T, AF373920

'Desulfonatrommbrio hydrogenovorans DSM 9292T, X99234>|

«j-Desulfohalobium retbaense DSM 569?r, X99235 '

'-Штамм 11, BKM В - 2364

~ 'Desulfothermus navhthae' TD-3. X80922

DonilMntloWac*»

~11-Dei

«11-D

100 I

Desutfonauticus submarine? 6N AF524933 Desulfacinum infernum ACM 3991T, L27426

-Desulfomomle tiedjei ATCC 49306т. M26635

" Desulfuromonas acetoxidans DSM 684т, M26634

-Desulfocelta halophila GSL-But2T. AF022936 -Desulfosarcina variabilis DSM 2060т, M34407 -Desulfobactermm autotrophicum DSM 3382т, M34409 - Desulfobacterpostgatei DSM 2G34T, M26633 DemifvreUo nci'timram DSM S264T. X72768

Рисунок 6. Филогенетическое положение штамма 11 в подразделении &-Рго(еоЬас1епа внутри кластера семейства ПеяЫГоМоЫасрзе на основании сравнения носледошлельносгей генов 16 рРНК. Масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «ЬооМаг>|-анализа (значащими признаются величины показателя «ЬооМаг»- более 95 %)

На филогенетическом дереве, полученном с помощью га^ЬоиНотвщ алгоритма, посждовательность 16в рРНК штамма 11 относилась к кластеру, объединяющему представителей семейства Ое.<шУ'оЫоЫасеае, в котором он составлял новую самостоятельную ветвь. Из описанных представителей этого семейства наиболее близким к изучаемом)' пггамму оказался единственный нвд типового рода данного семейства ОезиЦсМбЫхт геЛюете (90.2% сходства последовательностей) Уровень сходства последовательностей 168 рРНК штамма

! 1 с представителями датах родов этого семейства сиггавчяд 87 1 -88 14, соответствуя межродовом) для этого семейства (86.7-88.2%).

Принципиальные отличия штамма 11 от других филогенетически близких представителей семейства Desulfohatobiaceae заключается в возможности полного окисления бутирэта при высокой солености сред (100 г/л NaCl), в высокой активности фермента СО-дегидрогеназы в клетках, выращенных на среде с бутирагом и в росте за счет Н/СО. в хемолитоавтотрофных условиях Рассмотрение свойств ранее известных умерен! ю-галофильных сульфзгаосстанаиливающих баюсрий показываег, что штамм 11 - является первой умеренно-галофильной СВБ, способной к полному разложению жирных кислот и к росту в хемолитоавтотрофных условиях за счет HyCOb. На основании совокупности фено- и генотипических характеристик, а также филогенетического анализа штамму 11 присвоен статус нового рода и вида - Desid/avermiculus hataphdus gen. nov., sp.nov внутри семейства [tevulfohalobiacttat.

Прсасгавмс/вородаDesulfovermicalus(De.sul fo ver mic.ulus.-de-приставка, sulfur- cepa,L vermis червь, ul уменьшительный суффикс, us окончание. Сульфатредуцируюшая червеобразная вибриоидная бактерия) свойственны следующие призики1 облиппиый анаэроб с вибриоидной формой клеток и грамотршшетьным типом клеточной стенки; характерен дыхательный тип метаболизма на средах с сульфатами или другими окисленными соединениями серы; хемооргавслроф- использует различньте органические субстраты как источники углерода и доноры электронов для анаэробного дыхания, в том числе натриевые соли отдельных жирных кислот, разлагает органические соединения полностью (до (ХЫ или с образованием ацетата в больших иди меньших количествах, в зависимости от концентрации сгтхл para в среде, факультативный хематшшятспроф' растет за счст íí^CО2 или формиапа б отсутствие других органических соединений; сбраживает некоторые сатанические субстраты; умеренный галофил. нейтрофил и мезофилл, десульфовиридин в клетках отсутствует. присутствует мешхинон 7 Роду DesuSfuvermicuhe принадлежит вид Desulfovemaculus hobphUus, зр. nov.

1.5. Описание Desulfovermicutus kalophttus gen. nov., sp. nov.

(ha.lo.phil.us: L. halophil- галофильный, солелюбивый, us- окончание)

Не епорообразующие вибрионы размером 0.5-0 6 х 1.0-10 мкм, подвижные на ранней стадии роста за счет од ного полярно расположенного жгутика. При длительном культивировании на среде с лактагом клетки достигают размеров 15-20 мкм в длину и принимают червеобразную или спиралевидную форму Окраска клеток по Граму отрицательная и строение клеточной стенки типично для грамеггрицательных бактерий. Температурный интервал роста от 25 до 47°С с отимумом при 37°€. Растет в интервале рН от 6.4 до82с оптимальным ростом при 7.2. Проявляет высокую толерантность к содержанию NaCl и растет при содержании в средах от 30 до 230 г/л NaCl оптимальный рост в сред ах с NaCl 80-100 г/л. Строгий анаэроб. Восстанавливает сульфаты с образованием сероводорода в средах с лактагом, манатом, фумаратом, пируватом, пропионатом. бутирагом, формиатом, Н2/СО2, кротонатом, сукцшшгом. глицеринам, этанолом, ала) (ином. Бутират разлагается полностью без накопления ацетата. В клетках, выращенных на бугирагге. обнаружена высокая активность СО-дегидрогеназы. составившая 6.75 мкмоль • мгеГ1 • мг'/белка. Другие субстразы ра&тагает с большим или меньшим накоплением ацетата. В догеишигельиых факторах роста не нуждается, однако при добавлении к среде с пропионатом дрожжевою экстракта скорость роста увеличивается в 2.5 раза Растет в хемолитоавтотрофных условиях за счет формшта и H;/OOz в присутствие сульфата; в газовой фазе с Hj/CQ. обнаружен «мини-метан» Не использует серии, глицин, бетаин, дрожжевой экстракт, глюкозу, фруктозу, цитрат, глицерин, бутанол, пропанол, мешки, бензоат. ацетат, яалернат, пальмигаг. В отсутствие сульфатов сбраживает шфуват и фумарет. Акцепторами электронов, помимо сульфата, служат сульфит, тиосульфат, и элементная сера. Десульфовирвдин в клетках не обиаружииекя, присутствует менахинон МК-7. Содержание ГЦ в ДНК - 552 мол % Филогенетически принадлежит к 5-Prateobaeteria. Образует обособленную ветвь в подкласгсрс представителей семейства Desuifbhalobáceae Уровень сходства последовательности} оснований 16SpPHKc Destdfohalobwmretbaerae составляет 902 %. Типовой штамм 11т (ВКМ-В 2364) Выделен из шижоминерализоиашой шиповой воды нефтяного месторождения.

г. ТЕРМОФИЛЬНЫЕ СУЛЬФАТВОССТАНАВЛИВАЮЩИЕ БАКТЕРИИ

2.1. Морфология клеток

Морфология и субмикроскопическая организация клеток штаммов 435 и 781 была детально исследована ранее (Назина, Рсоанова, 1978, Назина, Пивоварова, 1979) Грачпаюжитслыые хлткн подвижны. содержат споры Бактерии являются типичными представителями рода йеафЛатааЖвп

2.2. Параметры роста

Результаты исследований показали, что штамм 435 рос и продуцировал Н28 в интервале температур от45 до 75 °С. а штамм 781 - от45 до 70 °С. Оптимальные значения дня роста и дыхания обоих штаммов составили 60-65 °С (Рис.7,8).

Оба штамма росли и накапливали Щ> в интервалах рН сред от 6 0 до 80 Наибольший прирост оптической плотности наблюдали при рН 7 0 а максимум продукции сероводорода был сдвинут в сторону более высоких значений рН - 8 0 (рис 9.10) Анз логичный сдвиг оптимальных значений рН для накопления наблюдали также авторы, исследовавшие О $аротстскт (ВД<Ме11992)

Настоящие исследования гтевволи.™ уточнить результаты, касающиеся солевых параметров штаммов 435 и 781, ранее установленных для семисутачных культур. Прирост сульфида в средах при культивировании обоих пггаммов в течение 7-ми суток наблюдали в отсутствие №0. а максимальные значения содержания N801 соответствовали 40 тУл для обоих штаммов Однако при более продолжительном культивировании до ! 5 - та суток - максимальные значения содержания №С1 составили 45 г/л для пттамш 781 и60 г/лдяя штамма 435(рис 11) Полученные результаты позволяют отнести исследованные бмегерии к группе галошлераишых микроорганизмов.

Рис.11. Продукция !Ь8 ш!аммами 435 и 781 на среде с лактатом при рауичном содержании ЫаС1 (7 и 15 суток культивирования)

2.3. Метаболизм органических соединений и но/юрода; акнепшрм ».тектронои

Доноры злектроиов и углерода. Оба штамма не нуждались в витаминах, спектр доноров электронов существенно не различался. Бактерии росли в средах с сульфатами и натриевыми солями молочной, пировгаюградной, яблочной, муравьиной, фумаровой, »парной. масляной, валерьяновой,

46 50 55 60 В5 70 Температура, °С

Рис. 7. Рост и продукция Н25 дгг. 435 при различных значениях температуры (13 суток культивирования).

7 6

1 4

2 3

2 1 0

Рис. 9. Рост и продукция Нзв шт. 435 при различных значениях р11 среды (9 суток куль I ивирования)

Рис. 8. Рост и продукция Н^ шт. 781 при различных значениях температуры (13 су гок культивирования}.

Рис. 10. Рост и продукция Нзв ни 781 при различных значениях рН среды (9 суток культивирования).

капроновой и пальмитиновой кислот, а также с метанолом, этанолом, протоколом и буганояом. Микроорганюмы не использовали Ь-аланин, L-серин, I .--аргинин, L-цистеин, пвоюяу, фруктозу, лактгоу, бетоат, цитрат, тзртрат, глицерин, ппутамат, треонин, триптофан, аспарагин, глутамат. фешиаланин. Нами обнаружено потребление ацетата обоими штаммами.

Особенности окисления ацетата, лактата и бутирата штаммами 43S и 781 представлены в Таблицах 3,4,5.

На средах с ацетатом (2-й последовательный пересев) СВБ накапливали сероводород, однако процесс протекал чрезвычайно медленно - за 56 суток культивирования (Табя 3, вариант 1 и 3) В культурах штаммов 435 и 781 убыль ацетата составила соответственно 1.76 и 128 ммоль/л. Продукция H2S в молярном отношении была немного меньше, чем убыль ацетата и коэффициент -Н28/окисленный ацетат был представлен величинами 0.90 и 0.93. По данным уравнения дыхания (Табл,3, уравнение 3), рассчитанного для Desutfotomaadum acetoxidans (Widdel, Pfennig, 1977), за счет одного моля окисленного ацетата образуется один мють сульфида Таким образом, судя по показателям молярных отношений Н2&/ацетат, можно заключить, что большая часть ацетата, окисленного бактериями штаммов 435 и 781. поступала на дыхательный процесс. Количества клеток не увеличивались, и численность их не превысила единиц х 106 в 1мл. Первоначальная численность клеток при внесении посевного материала также соответствовала единипам х 106 в 1мл Возможно, за /тигельный перио.ч кулгьшвироваиив часть нигиоаинних клеток дотировалась Подобные варианты встречаются в литературе Например, в культурах Dsapomandem ацетат, присутствующий в средс в кондапрачдах 1 мМ и 10 мМ, медленно разлагался Образование сульфида при содержании 1 мМ ацетата не сопровождалось накоплением биомассы (Cord-Ruwisch. Garcia, 1985)

Таблица 3. Разложение ацетата штаммами 435 и 781 (56 суток культивирования).

Штамм Вариант опыта Субстраты икисл. ацетат, ммоль/л Продукция H2S, ммоль/л H2S окисл. ацетат Числ, клеток в 1 мл

Ацетат jM Др. эк., 1/л В опытах Теор. 1)

435 4 1 460* 1.76 (+ 0.03) 1.60(+ 0.09) 176 0.90 3.7 х ¡0" 4.0 * Uf

2 4.60 0.5 1.85 (+ 0.05) 1.72(+ 0.06) 0.92

781 3 4.60 - 1.28(+ 0.05) Ш+ 0.01) 1.28 . 0.93 52 х Ю"

4 4.60 0.5 2.90 0 0.04) 4.70(+ 0.03) 2.90 1 1.62 1 JJMxlO7

1) По уравнению дыхания для СМ асеккйЬт- ШзС00'+80/ -> 2НС03'+Н8' (3) ОУикЫ, Р&ющ ,

1977); 2) Средние результаты из четырех повторностей; 3) Прочфки - ацетат (юш дрожжевой эктрает) отсутствует в исходной среде; 4) ид. - нет данных; 5) - «+_» статистический разброс данных.

По предположению Видделя медленное окисление ацетата сульфаггеосстанавливающими бактериями шорой метаболической группы (иногда не сопровождающееся существенным накоплением клеточной массы), объясняется отсутствием 2-кетоглутараг-депздрогеназы в реакциях конструктивного обмена (незавершенный ЦТК), ведущих к образованию КоА Активация ацетата •этими микроорганизмами с образованием Ацетил-КоА требует затраты АТФ (Widdel. 1987).

Присутствие в среде дрожжевого экстракта (0.5 т/л) практически не повлияло на процесс разложения ацетата штаммом 435 Напомним, чю дрожжевой экстракт служил субстратом для штаммов 435 и 781. Ацетат при разложении дрожжевого экстракта не накапливался. Однако дрожжевой экстракт стимуяироват разложение ацетата штаммом 781: количество окисленного ацетата в присутствии дрожжевого экстракта возросло до 2.90 мМ. Увеличились также продукция сульфида и численность клеток (Табл.3, вар. 4). По данным Видделя, дополнительные доноры электронов способствовали окислению ацетата СВБ рода Desutfonema (Widdel, 1987).

Эффект стимуляции окисления ацетата введением в среду дополнительных органических веществ ранте че быч ивестен для СВБ. Полученные результаты показали, чгго для выявления потребления ацетата представителями рода Desutfotomaeuhm требуются значительный период времени и введение дополнительного легко усвояемого субстрата, разложение которого не приводит к образованию

ацетата 'Этим субстратом в нашем сл> чае явится дрожжевой экстракт

В процессах роста иссчелованных ПЗБ га средах с л акт-лом наблюдало«, образование ацетата Пабл 4, Для штаммов 435 и 781 молярные отношения оцетат'Н.Ч составили ихгшеичиешю значения 3 О и ? 4 в вариантах 1 и 4 с содержанием лактата ? гш, менее единицы - в вариантах 2 и 5 с содержанием лактата 0 5 г/л (Табл 4, вар 3 и 6)

Таблица 4. Разложение лактата штаммами 435 и 781 (10 суток культивирования).

Штамм

435

781

Вариант опыта О

Субстраты

Лакгнт, г/л (мМ)

;р (1785мМ)

0 5 (4 45 мМ)

0< (4 45 мМ)

20 q 7.85 мМ)

0 5 (4 45 мМ)

0 5 (4 45мМ)

Дрпж. экстр, г'л

Продукция, ммоль.л

0 5

Ацетат,

15,67 003Ф

2.68 Н.. 003) " 1.63 (+ ,0.07)

12,80 (t 0 W)

3.00 (+_0ЛП)

1.68 (ь 0 05)

H;S, ммоль

Ацегат/HjS

в'

006/

А2!!

3.72 (- 0 06) 3,92 (ь 009)

3.01

5.24 (т 007)

4.27 0U6>

0.72 0.41

2.44

0.70

4.861+ 006)

0.39

Теор 2)

!) Средние з№'».пнл «з да/ч ловторкистсй. 2» По уравнению дыхания неполного окисления для Deculpvibrto 2С1ШЮНШО ¡S04'2 -»2СН,С(Ю'2НСО)+НЬ+Н <4)(WiddeU987) 3)Прочерки - отсутствует в исходной среде, 4) <<-_ л сшишмческий разброс данных

Таким об(мзим, при уменьшении содержании лактата в средах, снижалось накопление ацетата по отношению к образующему ся H2S, что предполагает большею полноту окисления ацетил-КоА до С'!> Подобная игу ация наблюдалась и в ку илурах/Л fKOlhemiaim растущих на бутирате (Daumas, (\ord-Ruwisch, Garcia. ¡988) и в культурах /V gibsoivi/e при уменьшении содержания Этанола (bluever, Rsuney, Hippe, 1999/ Ацетат не накаатирдлся eci« кониешрания бу гцяоча составляла менее одного мМ.

Теоргтичкки ацетч-KoA - промежуточный продукт окисления лактата - разлагается СВБ -неполными окислителями - до ацетата, полными - до СО; Однако реально, в культу (зальной жидкости многих СВБ - полных окислителей в том числе представителей posa Ilentlfatomaaihim, развивающихся на тактате, часто обнаруживается ацетат В этих случаях, мотярные отношения ацетат окислен! шй лактат и ацетат-Н-Х лютут быть меньшими, чем 1 и 2. В частности при окислении 5мМ лактата в культуре Dt thermoacetoxidam молярное отношение ацетат/ окисленный лакгат составило 0 83 мМ (Mm. Zinder, 1990)

Для накопления ацетата в экспериментах со штаммами 435 и 781, выращиваемыми на среде с лвктатом, можно применить объяснение Виддеяя (Widdel, 1987 Widdel, Hansen, 1992) образование ацетил - КоЛ происходит быстрее, чем его терминальное окисление до и избыток первого превращается в ацетат

Характер метаболизма бутирата, как и яакгата, определяет принадлежность СВБ к той или иной метаболической группе По результатам, указанным в таблице 5. в десятисугочных культурах штаммов 435 и 781 было окислено соответственно 3 9 и 4 0 ммолъ/л бутирата из исходного 7 мМ и образовалось 6 5 и 6 0 ммоль/л №5 (Табл 5, вар 1 и 3). В четырехсу точной культуре штамма 781 был обнаружен ацетат - 0 3 ммолъ/л (Табл 5, вар 2), который в данном случае якился п|юмежуточным продуктом и при дальнейшем ку льтивировании исчезал

Полное окисление бутирата относитстьно редко встречается среда представителей рода Dendfolomactilum, обладающих ферментами пути Вуда (полных окислителей), обычно, в этом процессе в бо^шшей или меньшей степени накапливается ацетат С одной стороны, накопление ацетата связано с концентрацией субстрата в среде, с друюй, образование ацетата из бутирата - СВБ полными окислителями, по мнению Шодера и соавторов (1986), связано с дефицитом кпфермешп-А который требуется для активации бутирата и продуктов ею разложения В целом, данные по разложению бутирата су льфатвосстанавтивающими бактериями и, в частности, представителями

рода Destdfolomaculum различны Исследованные микроорганизмы, штаммы 435 и 781, разлагали бугират (концентрации в среде 7 мМ) полностью, до СО; также, как Dt sapomandem (Cord-Ruwisch, Garcia, 1985).

Таблица 5. Разложение бутирата штаммами 435 и 781 (4 и 10 суток культивирования).

Штамм Вариант опыта Срок культ. Бугират Продукция, ммоль/л H2S/owcn бугират

сутки. Начал, конц., мМ Ок. бугират, ммоль/л Ацетат Сульфид В опытах Теор

435^ 1 10 7.0 3.90 (+ 0.08) 6Л0(+ 0 06) 166 1 2.5

j 781 2 4 7.0 0.60 (+ от) 03(+ 0.05)41 1.0 (+ 0.03) 1.66 -

3 10 7.0 4.00(4 0 08) - 6.00 (+ 0.06) 150 2.5 J

1) По уравнению дыхания для СВБ, полностью окисляющих бугират до С02: 2СН,(СН2)2СОО'+5Ю42' -> 8НСО, +5Н8-+К* (5) (Widdel. 1987); 2) Средние значения из двух повторносгей; 3) Прочерки - ацетат отсутствует: 4) - «+_» статистический разброс данных

При полном разложении бутирата по уравнению дыхания 5 (табл5) молярное отношение HjS/окисленньш бугират составляет величину 2.5, а в наших экспериментах - i 66 и 1 50 Более низкие величины обусловлены тем, что часть образующегося ацетил - КоА в растущей культуре мажет потребляться в конструктивных процессах. Соответственно снижается продукция сульфида

Таким образом, можно заключить, что полное окисление бутирата, присутствующего в среде в ошоеите;1ьнй высокой концентрации (7 мМ), является особенностью исследованных СВБ (шгамов 435 и 781) По - видимому, микроорганизмы характеризуются наличием ферментов пути Вуда, в частности СО-дегвдрогеназой. Этому заключению соответствует обнаруженная нами способность исследованных штаммов разлагать ацетат, который в процессах окисления преобразуется в ацетил-КоА и далее окисляется до двух молекул COj.

Штаммы 435 и 781 росли в хемолитоавтогрофных условия» за счет окисления Н],/СОз и накапливали H2S (10 4 и 9.4 ммоль/л соответственно), как и многие другие представители рода Desulfotomaeuhm, способные к полному окислению органических соединений (Тазай, Kaim^sta, 1991; Love, Pak!, 1993, Fatdeau, Oilbier, 1995), что свидетельствует о способности синтезировать ацетил - КоА из двух молекул СС2 Образование II2S сопровождалось увеличением численности клеток от 106 до К^в 1мл.

Образование метана при росте на Hi/CO^ Доказательством возможности синтеза ацетил-КоА по пути Вуда является образование исследованными СВБ небольших количеств СН4 -так называемого, мини метана (Schauder, Eikmarms, 1986) при росте на минеральных средах с газовой фазой Н2/СОг Количества мини-метана, обнаруживаемого в газовой фазе, составившие для штаммов 435 и 781 соответственно 122 и 118 нмолей в пересчете на 100 мл культуральной жидкости, сопоставимы с мини-метаном, образованным Dt acetaxidans -180 нмолей (Schauder, Eikmanns, 1986) (Табл. 26) По предположению Шодера (Schauder, Eüananns, 1986) мини - метан формируется как побочный продукт из связанной с носителем группы СН3Х, возникающей в процессах синтеза (и разложения) ацетил - КоА из С02 по пути Вуда

Сбраживание органических соединений. Исследованные бактерии сбраживали пируват при содержании его в среде 1 г/л (10 мМ): в культуральной жидкости штамма 435 появились ацетат (9мМ) и пропионат (0.5мМ), а в газовой фазе в небольшом количестве был обнаружен водород при этом, прирост огпической плотности культуральной жидкости составил 0.117; слабый рост наблюдался также на фумарате. Из 6 мМ фумарата образовался 1 мМ ацетата и прирост оптической плотности составил 0.024. Ферментации лактата не было зафиксировано

Акцепторы электронов. Оба штамма проявляли способность к использованию одних и тех же акцепторов электронов: наряду с сульфатами, акцепторами служили Юз2", S2O32", S0, но не N03".

Время удвоении численности клеток на среде с лактатом составила 6 и 32 клсттж'час для штаммов 435 и 781 соответственно и была выше, чем на среде с фумаратом (шт. 435 - 4 клеток/час и

шг, 781 - 21 клеток/час)

Диспропорцяонирование тиосульфата штаммами 435 и 781. Впервые для представителен рода Demlfatamacuhm была показано диспропорционирование тиосульфата исследованными СВБ (Табл. б)

Таблида 6. Диспропорционирпваиие тиосульфата штаммами 435 и 781.

Штамм Продукция HjS/SO/, мМ

SO/, мМ Н&мМ

435 160 2М 1.07+ 0.06

781 i 230 2.65 1.15+_ 0.06

2.4. Генотипичеекая характеристик!! и филогенетический анализ

По результатам анализа содержание Г*Ц-пар в ДНК пггаммов 435 и 781 составляло 50,8 и 50 6 мол.% соответственно. Уровень ДНК-ДНК гибридизации этах штаммов между собой был равен 97%. «то свидетельствовало об их принадлежности к одному виду. Уровень ДНК-ДНК гибридизации штаммов 435 и 781 с D kuznetsovn 17Т составлял 52 и 51% соответственно. Эти значения (выше 30 % и ниже 70 %), позволяют вьдоппь штаммы 435 и 781 в самостоятельный вид внутри рода Desuybtomaculum (Wayne, Brenner et ai, 1987). Для предварительного скрининга по базе данных GenBank были определены частичные последовательности (около 500 нуклеапедов) генов 16S рРНК обоих новых изолэтов 435 и 781. Обе последовательности оказались идентичным^i00% сходства) и согласно проведенному скринингу относились к роду Desutfotomaculum. Последовательности генов 16S рРНК штаммов 435 и 781. которые соответствовали 1528 и 1457 нуклеатдам и оказались практически идентичными (99 9% сходства) Содержание Г+Ц в обеих 16S рРНК составляло 591-59 2 моя %.

Штаммы 435 и 781 формировали самостоятельную ветвь в подкластере С го филогенетическом дереве последовательности 16S pDNA, к которому принадлежали также другие близкородственные термофилшые вида D htznetsovn, D aiatraticum, D thermocistemum, D luciae и D sobfetanewn (Love, PateL 1993; Liu, Kamauchow, 1997; Goorissea Boschker, 2003; Nilsen, Torsvik, 1996; Назина, Иванова, 1988; Wayne, Brenner, 1987) Оба изучаемых штамма кластировались с видом D. hanetsovii По структуре 16S рРНК штаммы 435 и 781 существенно отличались от D. htznetsovn, в геноме которого рибосомный ген был представлен двумя копиями, различающимися присутствием сверхдлинных вставок, расположенных в вариабельных 5' и 3'-концевых областях гена 16S рРНК на позициях, соответствующих 68-101 и 1445-1457 по номенклатуре £ coli. Присутствие сверхдлитшых вставок в вариабеяьнш районах последовательностей было обнаружено и в структурах генов 16S рРНК всех описанных видов покластера С (кроме D. thermocisternum, для которого 5'-концевой участок последовательности не определен) (дат. по Турова, Кузнецов 2001) Однако в последовательностях генов 16S рРНК штаммов 435 и 781 сверхдяинные вставки в вариабельных районах не были обнаружены. Если принимать во внимание вариабельные участки, то при сравнительном анализе уровень сходства обеих последовательностей гена 16S рРНК D kuznetsovii 17 и штамма 435 буди составлять 94.0-96.6% и будет находиться в пределах видовых различий для этого кластера. Штаммы 435 и 781 были филогенетически наиболее удалены от типового вида рода - D mgrißcam, принадлежащего к подкластсру А (88.6%).

2.5. Хемотаксономическая характеристика

Состав клеточных жирны! кислот. В спектрах жирных кислот штаммов 435 и 78! доминировали изокислоты С|5 (22.1 и 32.7% от общей суммы кислот соответственно) и Ci7 (9.4 и 18.0%) и нормальные жирные кислоты С,6 о (21.1 и 25.5%) и Ci8o (31.5 и 10.7%),

0.05

II781 '435

. и \и

"С

О кшпеШтг ЭЯМ 6115, ген ггпЪ, АУ036904

> с

Я;'

к» I

тг

I ш

I и п

»[р О б

435

Г> нА/аШпсит У21т, АУ084078

кигпегюуи П8М 6115т, ген гтоА, АУ036903 ■ О 1иаае 8ЬТт, АР069293 Б ашягсАют А1333, М96665 О ¡кегтпсШегпит $Т90т, 1133455

О сНегтоЬепгакит 08М 6193т, У11574 Д (/¡егтоасе>охШт 08М5$1?, У11573

1ИегтоЬепго1сит взр ¡ИегтмуМгорЫсит ТРОт, АУ007190 Г) geothermICUm ОвМ 3669х, УИ567 ¡Ьегтошротгат ОвМ 65621, У11575 — О фытае ОЯМ 7213т, А1294431 В

О яаротапЛет ШМ 3223т, АН 68365 . О Ьа1орМ1ит БЕВИ 3139т, Ш8891

}

■ й а!каЬрЫЫт%\ , АР097024 -£> асеЮхШат ОвМ 771т, У11566

■ О т%п_Псат КСТМВ 8395т, Х62176 О риШ SMCCW45ST,AF053929 О гипиш ОЯМ 21541, У11572 О аегопаиНситЪШ 10349т,Х98407

■ О гссЬсега МЫ1, Ш5951 'Оепфзрогоьгпш опгиЛЧ 08М 7651, У11570

ОеяиуЬзрогощпш аиг1р1£тепп ОЯех , 1)85624

Рисунок 17. Филогенетическое положение сульфатвосстанавливающих бактерий рода Ое.?и1/оЮтасиЫт, штаммов 435 и 781 внутри клостридиального подразделения фамположительных бактерий на основании сравнения последовательности 16в рОНА.

По составу жирных кислот эти штаммы несколько различались между собой и по коэффициенту корреляции не попадали ни в один из видов рода ОепфЫотасШит, для которых известен состав жирных кислог. Необычное совместное присутствие нечетных разветвленных (¡яоСшь ноС|?о) и четных прямоцепочечных (Сию, С-ко) жирных кислот у этих штамм» является важным для хемодафференциации признаком. Таким образом, судя по составу жирных кислот, исследовага гыебакгерии представляют новый вид.

Ранее было показано, что в клетках штаммов 435 и 781 присутствуют цитохромы Ь- и с-типов, десульфовиридии не был обнаружен (Назина, Розанова, 1978).

2.6. Краткая характеристика штамма Д-4

Штамм Д-4. выделенный из высокотемпературного месторождения Дацин (Китай), по филогенетическому анализу нуклеошдных последовательностей гена 16S рРНК оказался на 99% близок к изученному штамму 435. Приводим краткую характеристику штамм Д-4.

2.6.1. Параметры роста

На среде с чал атом и дрожжевым экстрактом за 7 суток культивирования штамм Д-4 и продуцировал 214.3 мг'л H2S при 60 °С Процесс дыхания наблюдался в диапазоне температур от 45 до 75 °С

Оптимальное содержание NaCl в среде для образования H2S штаммом Д-4 (7 суток культивирования) составляло 0.5 % (H2S - 2312 мг/л), как и для ппамма 781. Восстановление сульфата также наблюдали в средах в остсутствие NaCl (H2S - 232J мг/л) и при содержании до 4% NaCl.

2.6.2. Метаболизм

Донорами электронов для исследованного микроорганизма являлись Hj/COj (80.20 об. %) (хечолитоавплрофный рост), мешюл, формиат. ацетат, пропяонат, бутярят (!г/д), вяш-риат чакгат, манат, фу wapai. Бумрда, пропионаг и Валерии окислялись штаммом Д-4 без накопления ацетата. Ацетат окислялся быстро, обеспечивая высокую продукцию H2S - 211 мг/л.

Полученные результат исследования свцвегельсгвуюг о том, что штаммы 435 и 78! близки между собой по морфологии, спектру используемых доноров и акцепторов электронов, геногапичесюш и филогенетическим характеристикам. Некоторые различия наблюдаются е температурных и солевых параметрах роста. Штамм 435 растет при более высокой максимальной температуре и содержании NaCl в среде, чем шглмм 781. По рассмотренным метаболическим свойствам оба штамма наиболее близки к Desulfotomacuium kuznetsovii, от которого они сгашчались меньшей максимальной температурой для роста (70-75 °С в сравнении с 85°С у D. kuznetsovii) и устойчивостью к большему содержанию сши в среде. Кроме юго, в процессе сульфатрсдувдда при росте за счет окисления Н2 штаммы 435 и 78! образовывали небольшие количества метана, в то время как D kuznetsovii из Н2/СО> синтезировал ацетат (Parshina, Kijlstra, et al, 2005). Штамм Д-4 также близок к штаммам 435 и 781 филогенетической характеристике, а также по ряду используемых доноров электронов. Отличительной особенностью штамма Д-4 является эффективное использование ацетата.

Ог другою филогенетически близкого представителя этого рода - D solfatartewn, штаммы 435 и 781 отличались более широким интервалом NaCl для роста, неспособностью восстанавливать сульфаты в средах с глюкозой и фруктозой и отсутствием потребности в витаминах Ог вида D luciae штаммы 435 и 781 отличались также повышенной устойчивостью к Nad в среде, способностью потреблять малат, метанол, пальмигат, а также ацетат (хотя и очень медленно).

Таким образом, проведенные исследования, выявили дополнительные метаболические возможности изучаемых штаммов 435 и 781 и позволили уточнить их систематическое положение. Ранее на основании данных неполных исследований (окисление лактата с образованием ацетата и невозможности разложения жирных кислот эти штаммы были отнесены к виду Desulfotomacuium ragrificans, subsp salinus(\si 435) (Назина, Розанова. 1978) Однако, D nigrißcans растет на Н?-ЧХ>2 в литогетеротрофных условиях, не способен полностью окислять органические вещества и разлагал? жирные кислоты (Klemps,Cypionka, 1985) и располагается в подкласгере А вместе с мезофильными видами, также не полностью окисляющими органические вещества (рис. 17).

Полученные результаты (ДНК-ДНК гибрвдюация, определения жирнокислогного состава липидов, филогенетический анализ, хемотаксономия и особенности метаболизма) позволяю! пересмотреть таксономическое положение штаммов 435 и 781 и отнести их к новому виду Desulfotomacuium salinum sp. nov.

2.7. Описание вида Desulfotomacuíum salinum sp. nov.

Базоним Desulfotomacuíum nigrificans subsp satinus (Назина, Розанова. 1978) sal in urn sale - соль, in - суффикс, urn - окончание, соляной).

Прямые или слепо изогнутые палочки размером 0.9-1.3 х 2-5 мкм (шг 435) и 06-1.0 х 2-5 мкм (шг. 781), передвигаются за счет перетгрихиально расположенных жгутиков Сферические споры расположены центрально или субтсрминально, слегка расширяют клетку, придавая ей лимоновидную или веретеновидную форму. Окраска клеток по Граму - отрицательная, но строение клеточной стенки типичное для грамположительных бактерий, Температурный интервал роста от 45 до 70-75°С, с оптимумом при 60-65°С. Растут в интервале pli среды от 6.0 до 8.5 с максимумом накопления биомассы при рН 7 0 Добавление NaCl в среду не является необходимым для роста. Растут при содержании от 0 до 4.5-6% NaCl в среде, с оптимумом при 0.5-1% Строгие анаэробы. Восстанавливают сульфаты с образованием сероводорода в средах с Н2/СО2, формивтом, лакгатом, пирувгггом, манатом, фумарагом, сукцинатом, метанолом, ттанолом, пропанолом, бутанолом, бутаратом, валератом, пальмипггом и дрожжевым экстрактом. Лактат окисляют с образованием ацетата; бутират окисляют полностью Слабо и медленно растут на ацетате Не нуждаются в витаминах и других факторах роста, однако внесение дрожжевого ткешакта улучшает вост. При росте в сульфатсодержащсй срсдс с Н2/СО2 образуют «мини-метан». Не используют L-аланин. L-серин, L-аргинин, 1 -писгеич, гтоксяу, фруктоту латстгпу бензоат, нитрат, тарграт глицерин, глутамат, треонин, гриптофан, аспарагин, тутамат, фенилаланин. Сбраживают пируват и слабо фумарат; лактат не сбраживают Акцепторами электронов служат сульфат, сульфит, тиосульфат и элементная сера, но не нитрат. Осуществляют дисмутацию тиосульфата до сульфата и сероводорода Содержат шттохромы Ь- и с-типов. лесульфовирилин отсутствует В спекгоах жирных кислот доминируют гоокислоты - изоСц (22 1-32.7% от общей суммы кислот) и изоС.? (9.4-18,0%), и нормальные С16-о, (21 1 и 25 5%) и С)м> (31 5 и 10 7%) кислоты. Содержание Г+П в ДНК - 50 6-50 8 мол.% Филогенетически принадлежат к подкластеру 1С рода Desulfotomacuíum Типовой гитами -435т (ВКМ В 1492) Выделен из смеси пластовой и конденсационной воды, извлекаемой вместе с газом, из Игримского газоковденсатного месторождения (Западная Сибирь). Реферешный штамм 781 (ВКМВ1379).

3. ВОЗМОЖНОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ИССЛЕДОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПРИРОДНЫХ ЭКОТОПАХ

Рассматривая вопрос о возможности функционирования изученной галофильной СВЬ в жо'гаие месторождения нефти, в районе Персидского залива, можно отметить следующее: соленость пластовой воды источника выделения укладывается в рамки параметров солености сред допускающих рост и эту бактерию также можно рассматривав как аборигена пласта. Микроорганизмы, сходные с исследованным штаммом И могут существовать и в нефтяных месторождениях других регионов, в частности в месторождениях ВолтоУральского региона, где было зафиксировано медленное развитие биогенной сульфатредукции в пластовых водах с соленостью более 200 г/л (Тарасов, Борзенков и др., 2002).

Таким образом, полученные результаты позволили выявить и описать свойства микроорганизма, способного осуществлять су л ьфатредукцию в высокосоленых пластовых рассолах нефтяных месторождений. Ранее такие сульфатвосстананливающве бактерии не были охарактеризованы.

Изучение свойств термофильных СВБ - штаммов 435 и 781, выделенных из углеводородных месторождений Западной Сибири, вызывает интерес в связи с выяснением возможной роли этих микроорганизмов в генезисе минералов вмещающих пород и формировании пластовых вод углеводородных толщ, а также в связи с их геохимической деятельностью, проявляемой в процессах разработки месторождений с применением заводнения. Литературные данные и результаты

настоящих исследований позволили дать гипотетическое объяснение геохимической деятельности термофильных СВБ рода Desutfotomaculum, обитающих в нефтяных месторождениях Западной Сибири В начале разработки пластовые воды не содержали сульфатов и сероводорода, в воде присутствовало Fe1*. В процессах разработки пластовая вода нефтяных месторождений обогащалась сульфатами, в количествах нескольких десятков мг/д Происхождение сульфатов связано с окислением сульфидов вмещающих пород, при закачке в пласты поверхностной воды, содержащей растворенный кислород. С появлением в воде сульфатов дремлющие в пласгах СВБ активизируются и развивается процесс сульфапредукции. Вполне вероятно, также, что сульфиды вмещающих пород образовались как результат жизнедеятельности СВБ, что и привело к исчезновению сульфатов из пластовых вод. Изучаемые СВБ штаммы 435 и 781 приспособлены к условиям температуры и солености местообитания: они являются спороносными, те. устойчивыми к временному фактору, поэтому существует вероятность, что они являются аборигенными формами. Существование исследованных термофильных СВБ в высокотемпературных нефтяных месторождениях, заводняемых холодной водой, свидетельствует об их аборигенной природе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выделена и охарактеризована умерев» иалофильная СВБ штамм И с грамсугришнгяьным строением клеточной стенки отнесенная к новому роду и виду Demlfovermwulus halophUus, развивающаяся в условиях высокого содержания NaCl в средах до 230 г/л с «пимумом 80 - 100 i /л. Статус нового родового таксона был присвоен этой СВБ на основании совокупности результатов исследования геко и ^сношпических особенностей Штзмм ! 1 "зсподагзется ня отдельной bchím в подкласгере филогенетического дерева дельтя-Proteobacleria, образующем новое семейство Desuirohalobúceae. Исследованный микроорганизм значительно шличаетси гю феншипическич свойствам от веек известных умерено-галофилышх СВБ, прежде всего, способность1« полного окисления органического субстрата - бугарата. Клетки, выращенные на бугирате, обладали высокой активностью СО-дегнщжденазы. что свидетельствовало о наличии ферментов пути Вула разложения ацегил-КоА до двух СОг.

Разложение штаммом ¡1 прогшонага и друтих органических соединений, содержащихся в средах R относительно высоких концентрациях, сопровождалось накоплением ацетат Однако, при снижении содержания пропиопага в среде происходило значительное уменьшение накопления ацетата на единицу потребленного субстрата.

Таким образом, по результатам нашеш исследования впервые было показано существование умфенно-шюфильной СВБ - полного окислителя, с возможностью роста при высоких концентрациях NaCl, что в раде обзорных работ ставилось под сомнение.

Образование ацетата штаммом 11 при окислении бутирэта в средах с содержанием NaCl 200 г/л позволило дать объяснение накоплению ацетата в гиперсоленых условиях экосистем, в частности в рассолах нефтяных месторождений.

Сравнение ростовых харакгеристк штамма 11 и жолотческих условий актина - источника выделения, привело к заключению, что эта СВЬ является аборигеном пласта. Подобные микроорганизмы могут существовать в пластовых рассолах нефтяных месторождений Волго-Уральского региона, где экологические условия соответствуют его ростовым характеристикам.

Полученные в работе результаты позволили расширить сведения о разнообразии термофильных представителей СВБ рода Desulfotomacuhtm - полных окислителей органических соединений Охарактеризованы два штамма - 435 и 781 термофильных СВБ, которые на основании совокупности морфологических характеристик, параметров роста, метаболических свойств, хемоггаксономических паризнаков, результатов геносистематики и филогенетического анализа огнесениы к новому виду D salinum, вошедшему в подкластер 1 филогенетического дерева рода Desutfotomaculum. По ряду метаболических характеристик штаммы D solimán sp nav отличаются от большинства других членов подкласгера 1 С, но близки к D kusnetzovii. Исследованные СВБ окисляог

большой набор органических соединений, в том числе жирные кислоты, одноуглеродные соединения, формиаг и метанол (в отсутствие других источников углерода) и развиваются в хемолигоавшгрофных условиях за счет Н^СОг.

Штаммы 435 и 781 пополнили число видов рода Нет\fotomaadum, способных окислять бутират, содержащийся в среде в не лимитированных количествах, без накопления ацетата На примере зггих штаммов впервые для представителей рода ГкыфЮтаЫит показано, что снижение концентрации лактага приводит к уменьшению накопления ацетата. Кроме того.было показано, что ацетат может медленно окисляться этими штаммами и в присутствии дрожжевого экстракта количество окисленного ацетата увеличивается. Ранее данные по стимуляции окисления ацетата дрожжевым экстрактом, касающиеся СВ6, отсутствовали

Из месторождения Даган (Китай) был выделен и кратко охарактеризован штамм Д-4 По филогенетическому анализу (сиквенс оснований 165 рРНК) микроорганизм оказался идентичным со штаммом 435 - £> ¡а1тит >р пек. ни имел некоторые отличия от штамма 435 в метаболизме органических соединений, в частости, быстрый и эффективный рост на ацетате.

Таким образом, мы дали относительно полную метаболическую характеристику исследованных термофильных СВБ (штаммов 435 и 781) рода Эе^оЬтаЫит, которая может помочь в интерпретации некоторых результатов, касающихся полноты окисления органических соединений, полученных для друик представителей подкластсра 1 С.

Сравнение ростовых параметров штаммов 435 и 781 и параметров экологических условий местообитания шнвиляет сделать заключение и том, что эти СВБ могут фушционировапъ в заделах углеводородов Западной Сибири и их жизнедеятельность может являться причиной появления сероводорода в месторождениях нефти, подвергающихся вторичному заводнению. Кроме лжи, полученная характеристика штаммов позволяет дать спекулятивную оценку их роли в исчезновении сульфатов из пяаеговьи вод на ранних стадиях формирования вмещающих пород.

Полученные результаты - распространение термофильных СВБ на глубинах углеводородных залежей Западной Сибири, заводняемых холодной водой (или не заводняемых - пазовое месторождение) вместе с результалми обнаружения бактерий одного вида в месторождениях географически удаленных регионов, позволяет рассматривать изученные штаммы, как аборигенную микрофлору и дают осиовадие думать, что то« микроорганизмы являются представителями «общей биосферы»

выводы

1 Из пластового рассола нефгяного месторождения выделена новая чеэофштьная

умсренно-галофильная сульфатвосстанавливающая бактерия. Мшфоорганизм имеет вибриоидную форму клеток, и относится к грам отрицательным бактериям Растет в средах с содержанием КаС! 3-23 % (оптимально при 8-10 %), окисляя ряд органических соединений Бактерия является первой из известных умеренно-галофильных султфатаоссганавливающих бактерий (развивающихся в средах с соленостью более 13%), способных к полному окислению жирных кислот (формиат, пропиояат и бутирап) и росту в авгогрофных условиях за счет Нг'СОг

2. По совокупности морфологических, метаболических и биохимических особенностей,

а также по резулымам геюттшческих свойств и филогенетического анализа микроорганизм отнесен к новому роду и виду Desulfavermiadus halophlus gen. nov. sp. nov., типовой пгг&мм i 1т. Является представителем семейства Desulfohafoteaeeae.

3 Термофилы ме спорообразующие сульфагаосешнавливающие бакпфии - нпаммы

435 и 781 являются галотолерангными. разлагают большой набор органических соединений и относятся к группе полных окислителей. В хемолитоавл ггрофных условиях растут за счет Н^/СОг. Диспропорционирукл таосулъфип, что являем новым свойством для представителей рода ПенифЛатапйшп. Впервые для сульфзгвосстанавпивающих бактерий выявлена стимуляция окисления ацетата дрожжевым экстрактом

4 На основании результатов молекулярно-генетических, хемотахсономических

игпрдпвяний и феногипических свойств штаммы 435 и 781 отнесены к новому виду ГХ>чй/а1отааАит чсй'тит ер поу, типовой штамм - 4351 На филогенетическом дереве бактерий рода ПеЫ/оЬтиЫит штаммы 435 и 781 представлены отдельной ветвью в подаластере 1С.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белякова Е.В., Розанова Е П. Дополнительные свойства спорообразующих сульфатвосстанавливающих бактерий рода Desulfotomaculum. штаммов 435 и 781 // Микробиология. 2004. Т. 73. № 2. С. 284-286.

2. Белякова Е.В, Розанова Е.П.. «Новые экстремофильные сульфатвосстанавливающие бактерии, способствующие развитию сероводородной коррозии оборудования в залежах углеводородов с высокой температурой и соленостью пластовых вод». // Тезисы стендовых сообщений Всероссийского симпозиума - «Биотехнология микробов» посвященного 120-летаю со дня рождения академика В.Н Шапошникова (с международным участием). МГУ им. Ломоносова. Москва. 20-23 октября 2004 г. С 11.

3. Белякова Е.В., Розанова Е. П. «Новые свойства галофильной сульфатвосстанавливающей бактерии из нефтяного месторождения».// Тезисы стендовых сообщений 9-й международной Путинской школы - конференции молодых ученых «Биология- наука 21 века». 18-22 апреля 2005 года. С. 182.

4. Иванова А.Е., Белякова Е.В., Розанова Е.П. «Особенности сульфатвосстанавливающих бактерий из углеводородных залежей с повышенной температурой и соленостью пластовых вод».// Тезисы докладов Третьего Московского Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Часть 2. Москва. Россия. 14-18 марта.2005 г.С. 236.

5. Белякова Е В, Розанова Е.П. «Фенотипические и генотипические свойства новой умеренно-галофильной сульфатвосстанавливающей бактерии из нефтяного месторождения». // Тезисы стендовых сообщений Третьего московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Часть 2. Москва. Россия. 14-18 марта.2005 г С. 230.

6. Назина Т.Н., Розанова Е.П., Белякова Е.В., Лысенко A.M., Полтараус А,Б., Турова ТП., Осипов Г'.А , Беляев С.С . Описание "Desulfotomaculum nigriflcans subsp. salinus" в качестве нового вида Desulfotomaculum salinum sp. nov. // Микробиология. 2005. Т. 74. №5. С 654-662.

7. Белякова Е.В., Розанова Е.П., Борзенков И.А., Турова Т.П., Пушева М.А., Лысенко A.M., Колганова Т.В. «Новая факультативно-хемолитоавтотрофная умеренно-галофильная сульфатвосстанавливающая бактерия Desulfovermiculus halophilus gen. nov., sp. nov., выделенная из нефтяного месторождения».// Микробиология. 2006. Т. 75. № 2 С. 201211.

8. Rozanova Е.Р., Ivanova А.Е., Belyakova E.V. «Distinctive Features of Sulfate-reducing Bacteria from Hydrocarbon-bearing Reservoirs Having an Elevated Temperature or Salinity of Stratal Waters». // Сборник трудов Третьего Московского Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (принята в печать).

КОГШ-ЦЕНТРсв. 7:07: 10429 Тираж 100 экз. Тел. 185-79-54 г. Москва, ул. Енисейская д. 36

ZÔQG А

Iii " 4 5 3 4

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белякова, Елена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Общие представления о нефтяных месторождениях как экосистемах и о развитии в них микробных процов11.

1.1. Экологичие овия нефтяных плов 12.

1.2. Ррранение и количвенная оценкаорейвременных биогеохимичих процовльфатредукции в морождениях нефти17.

Глава 2. Общая характеристика и систематика сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ)20.

2.1. Систематика.21.

2.2. Метаболизм22.

2.2.1. Доноры электронов (протонов) и углерода 27.

2.2.2. Акцепторы электронов28.

Глава 3. Галофильпые и термофильные СВБ.

3.1. Галофильные СВБ32.

3.1.1. Клификация галофильных СВБ32.

3.1.2. Галофилия. Возможные механизмы адаптации микроорганизмов к вким концентрациямлейЗЗ.

3.1.3. Таномичое положение и метаболизм умереппо-галофильных СВБ37.

3.2. Термофильные СВБ42.

3.2.1. Клификация термофильных микроорганизмов42.

3.2.2. Механизмы термофилии 43.

3.2.3. Таномичое положение и метаболизм термофильных СВБ:44.

Выводы по обзору литературы53.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ55.

4.1. Объекты ледования55.

4.2. Характерика очников выделения бактерий55.

4.2.1. Характерика нефтяного морождения района Пеого залива55.

4.2.2. Морождения Западной Сибири56.

4.2.3. Характерика нефтяного морождения Китая56.

4.3. Сав питательныхед, овия для выделения, поддержания, культивирования и учета микроорганизмов57.

4.4. Получение клеточнойспензии59.

4.5. Микропичие методы59.

4.6. Аналитичие методы60.

4.7. Методы определения активни ферментов66.

4.8. Молекулярно — биологичие методы67.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение и описание микроорганизмов выделенных из нефтяных месторождений

Глава 5. Галофильные СВБ70.

5.1. Морфология клеток70.

5.2. Параметры ра70.

5.3. Метаболизм72.

5.4. Биохимичие характерики91.

5.5. Генотипичесике характеристики и филогенетический анализ.с 92.

5.6. Опние рода Desulfovermiculus gen. nov98.

5.6.1. Описание вида Desulfovermiculus halophilus gen. nov., sp. nov.c.99.

Глава 6. Термофильные СВБ 100.

6.1. Морфология клеток. 100.

6.2. Параметры ра 100.

6.3. Метаболизм. 104.

6.4. Краткая характерика штамма Д-4 114.

6.5. Гепотипичая характерика и филогенетичий анализ116.

6.6. Хемотаномичий анализ 119.

6.7. Опние вида Desulfotomaculum salinum sp. nov 121.

Глава 7. Возможности функционирования исследованных микроорганизмов в природных экотопах 126.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Таксономия и метаболизм новых термофильных и галофильной сульфатвосстанавливающих бактерий, выделенных из месторождений углеводородов"

Актуальность проблемы

Сульфатвосстанавливающие бактерии (СВБ) являются постоянными членами микробных сообществ, развивающихся в эксплуатируемых залежах углеводородов, в частности нефтяных месторождениях, подвергающихся заводнению поверхностными и оборотными пластовыми водами. Как правило, вторичное заводнение нефтяных пластов приводит к появлению или увеличению содержания сульфатов, появлению доступного органического вещества и биогенных элементов, в том числе азота и фосфора. Все это способствует активизации СВБ, обитающих в нефтяных месторождениях. Их жизнедеятельность приводит к изменению состава пластовых вод и вмещающих пород. Образуемый ими сероводород растворяется в пластовой воде, нефти, и входит в состав попутного газа, что активизирует коррозию нефтепромыслового металлического оборудования. Продукт реакции сероводорода и растворенного двухвалентного железа (II) -сульфид откладывается в порах пласта и уменьшает приемистость нагнетаемой воды. Таким образом, изучение СВБ нефтяных пластов, их свойств, позволяющих им функционировать в нефтяных пластах, является актуальной проблемой.

Состояние вопроса, цели и задачи

Впервые СВБ были выявлены в нефтяных пластах в 1926 году Бастином в Америке и Гинзбург-Карагичевой в Советском союзе. Затем вклад в изучение этой группы микроорганизмов, обитающих в углеводородных залежах, внесли исследования Зо Белла в Америке и исследователи школы С.И. Кузнецова в СССР (Кузнецова, Горленко, Розанова, Назина и др.). В последние десятилетия, в связи с проблемой разработки микробиологических методов увеличения нефтеотдачи пластов, изучение микрофлоры нефтяных месторождений интенсифицировалось и в нем приняли участие европейские ученые — Франции, Норвегии, Америки, Японии и других стран (Назина, Беляев, 2004). В результате всех этих исследований было обнаружено значительное биологическое разнообразие СВБ, обитающих в нефтяных месторождениях. Среди них были выявлены мезофильные и термофильные представители, галофильные и галотолерантные. Если термофильные представители нефтяных пластов составили довольно большую группу, то известные галофильные представители нефтяных месторождений немногочисленны. Все галофильные бактерии, известные на сегодняшний день, и выделенные из различных засоленых экосистем оказались хемолитогетеротрофами и окисляли органические вещества неполностью - до ацетата и СОг (исключение Desulfobacter halotoleranse (Brandt, Ingvorsen, 1997)). Вопрос о существовании автотрофных галофильных СВБ, полностью окисляющих органические вещества до СОг, способных развиваться в гиперсолепых условиях, оставался открытым. В тоже время, большинство нефтяных месторождений, расположенных па больших глубинах, характеризуются высокой соленостью пластовых рассолов. Это месторождения Волго-Уральского региона, регионов Каспийского Моря, стран Персидского залива и другие. По литературным данным, в гиперсоленых экосистемах, в том числе в нефтяных месторождениях, накапливается ацетат. Поэтому^ представляло интерес выявить существование галофильной СВБ, способной развиваться в условиях высокой солености пластовых вод, выделить чистую культуру и исследовать ее метаболизм, в частности возможность автотрофного роста и полного окисления органических соединений.

С точки зрения изучения биоразнообразия термофильных СВБ было целесообразно продолжить исследование термофильной микрофлоры высокотемпературных нефтяных месторождений. В Советском Союзе такие исследования проводились на месторождениях Апшеронского п-ва (Назипа, Розанова, 1978). Термофильная сульфатредуцирующая микрофлора высокотемпературных месторождений углеводородов Западной Сибири оставалась недостаточно изученной. В то же время, было известно, что заводнение месторождений Западной Сибири значительно активизирует биогенные процессы сульфатредукции и приводит к накоплению сероводорода в пластовых водах.

Значительную часть всех изученных термофильных СВБ, обитающих в разных экосистемах, представляют споровые формы рода Desulfotomaculum. Среди представителей нефтяных пластов описаны Desulfotomaculum thermocisternum (Nilsen, Torsvik, Lien; 1996), Desulfotomaculum kusnetzovii (Назина, Иванова; 1988), Desulfotomaculum nigrificans (Werkman, Weaver; 1927). Термофильные виды рода Desulfotomaculum значительно различаются по характеру метаболизма органических соединений и водорода. Некоторые из них способны развиваться в хемолитоавтотрофных условиях за счет Н2/СО2, но окисляют органические соединения не полностью, таковыми являются - Desulfotomaculum australicum, Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum (Plügge, Balk, Stams, 2002). Другие полпые окислители органических соединений не окисляют водород. D. nigrificans, является хемолитогетеротрофом и не полностью окисляет органические соединения до ацетата и СОг.

В коллекции ИНМИ имелись два представителя рода Desulfotomaculum - штаммы 435 и 781, выделенные из высокотемпературных углеводородных залежей Западной Сибири, которые па основании некоторых изученных свойств были отнесены к виду £>. т^г/гсапэ (Назина, Розанова, 1978). В настоящее время^эти^данные оказались недостаточными, чтобы полностью охарактеризовать ,эти СВБ, поэтому возник вопрос об уточнении систематического положения этих микроорганизмов и выявлении метаболических особенностей с привлечением современных методов исследования, ^то позволило бы внести ясность в характеристику рода Ве$и1/оШтаси1ит и объяснить возможность их существования в нефтяных месторождениях Западной Сибири.

Практические аспекты выделения и изучения свойств СВБ, обитающих в нефтяных пластах, определяются возможностью использования их при испытании бактерицидов, применяемых в качестве тест-объектов в технологиях, разрабатываемых с целью борьбы с сероводородной коррозией нефтепромыслового оборудования.

Ч*

Цель и задачи исследования

Цель:

Исследование метаболизма и таксономии ряда штаммов сульфатвосстанавливающих бактерий, выделенных из месторождений углеводородов с высокой температурой или соленостью пластовых вод.

Основные задачи исследования: И

1. Поиски выделение чистой культуры галофилыюй сульфатвосстанавливающей I бактерии из нефтяного месторождения с высокой соленостью пластовой воды; исследование ее морфологии, определение параметров роста, особенностей метаболизма.

2. Установление филогении и систематического положения галофильной сульфатвосстанавливающей бактерии - штамма 11.

3. Определение параметров роста термофильных СВБ - штаммов 435, 781 выделенных ранее из высокотемпературных газового и нефтяного месторождений углеводородов Западной Сибири, а также штамма Д-4, выделенного из высокотемпературного месторождения углеводородов Китая. Выявление особенностей метаболизма этих штаммов.

Научная новизна

Расширены знания о биологическом разнообразии галофильных и термофильных СВБ, обитающих в экотопах нефтяных месторождений.

Впервые выделена и охарактеризована хемоорганотрофная и факультативно-хемолитоавтотрофная умеренно-галофильпая сульфатвосстанавливающая бактерия — штамм 11, развивающаяся в средах с содержанием NaCl 30-230 г/л. Бактерия полностью окисляет бутират и развивается в хемолитоавтотрофных условиях за счет Н2/СО2 в средах с оптимальным количеством NaCl 80-100 г/л. На основании гено- и фенотипических свойств микроорганизм отнесен к новому роду и виду Desulfovermiculus halophilus gen. nov., sp. nov. и помещен на отдельную ветвь подкластера филогенетического дерева дельта-протеобактерий, в который включены микроорганизмы семейства Desulfohalobiaceae. Штамм 11 представлен грамотрицательными подвижными вибрионами, является мезофилом и нейтрофилом; в процессах сульфатредукции окисляет ряд органических соединений, в том числе лактат, аланин, жирные кислоты — формиат, бутират и пропионат. В клетках^выращенных на среде с бутиратом^ обнаружена высокая активность СО-дегидрогеназы. Это позволило отнести изучаемый микроорганизм к метаболическому типу сульфатвосстанавливающих бактерий — полных окислителей, характеризующихся наличием ферментов пути Вуда, которые принимают участие в разложении ацетил-КоА до 2-х молекул СО2. Окисление бутирата в гиперсоленых условиях 200 г/л NaCl сопровождается образованием ацетата. Ряд других субстратов, в том числе пропионат, разлагались с накоплением ацетата. Ростовые характеристики и метаболические свойства штамма 11 дают основание заключить, что микроорганизм может являться обитателем ряда глубинных нефтяных месторождений с высокой соленостью пластовых вод, в том числе Волго-Уральского региона.

Охарактеризованы два штамма термофильных спорообразующих СВБ - 435 и 781, обитающих в высокотемпературных месторождениях углеводородов Западной Сибири. На основании гепотипических свойств и филогении бактерии были отнесены к новому виду Desulfotomaculum salinum sp. nov. Исследованные штаммы располагаются в подкластере 1С филогенетического дерева 16S рРНК рода Desulfotomaculum. В процессах сульфатредукции бактерии разлагали широкий круг органических соединений, в том числе жирные кислоты и одноуглеродные соединения — метанол и формиат. Ряд органических соединений окислялись без накопления ацетата, что свидетельствует о принадлежности исследованных СВБ к метаболическому типу полных окислителей. Лактат окислялся с образованием ацетата. Кроме того, эти микроорганизмы росли в хемолитоавтотрофных условиях, используя в процессах сульфатредукции Н2/СО2, образуя небольшие количества СН4. Выявлены некоторые особенности метаболизма, ранее не обнаруженные у представителей рода Ве8и1/о1отаси1ит: показано, что ацетат окислялся слабо, однако присутствие дрожжевого экстракта стимулировало потребление ацетата. Уменьшение содержания лактата в среде приводило к снижению образования ацетата на единицу окисленного субстрата. Новым свойством для представителей рода Ое5и1/о1отаси1ит являлось диспропорциопирование тиосульфата.

По ростовым характеристикам и метаболическим свойствам бактерии приспособлены к средам обитания и это позволяет считать, что они функционируют в пластах заводняемых нефтяных месторождений Западной Сибири и участвуют в образовании сероводорода.

Практическая значимость работы

Полученные результаты могут быть применены в разработках технологий борьбы с сероводородной коррозией нефтепромыслового оборудования, где используют бактерициды, подавляющие развитие СВБ.

В качестве тест-объектов, как правило, применяют коллекционные СВБ, выделенные из слабосоленых вод. В то же время известно, что бактерии устойчивые к высокой солености, более устойчивы к воздействию бактерицидов. Поэтому, при апробации бактерицидов в случае разработки технологий подавления сульфатредукции для месторождений с пластовыми рассолами, в частности Волго-Уральского региона, в качестве тест-объектов целесообразно использовать микроорганизмы, устойчивые к высоким концентрациям солей. Таким микроорганизмом является исследованный нами галофильный штамм 11.

Изученные термофильные СВБ также могут служить тест-объектами для разработки указанных технологий, применительно к месторождениям Западной Сибири. Известно, что клетки термофилов более устойчивы к различным неблагоприятным факторам, чем клетки мезофилов, а споры представителей рода Ое$и1/о1отаси1ит более устойчивы, чем вегетативные клетки.

По литературным данным известно, что биомасса бактериальных клеток является агентом, закупоривающим поры пластов. Поры наиболее проницаемых, промытых водой пропластков нефтяных залежей, закупориваются в первую очередь, что является причиной изменения направления потоков воды, поступающих в менее промытые пропластки, и приводит к увеличению нефтеизвлечения. Такая закупорка может быть составной частью механизмов, приводящих к увеличению нефтеотдачи пластов в разработанной в ИНМИ РАН технологии повышения нефтеотдачи, основанной на активизации пластового бактериального сообщества. Существенную роль в избирательной закупорке могут оказывать СВБ, образующие сероводород, реакция которого с растворенным в воде железом приводит к образованию нерастворимых сульфидов. На Локбатанском месторождении Апшсрона, заводняемом морской водой, применялась указанная технология. Увеличение нефтеизвлечения сопровождалось здесь активизацией жизнедеятельности СВБ. Таким образом, изучение свойств СВБ нефтяных пластов приобретает важное значение в связи с вопросами, имеющими отношение к биотехнологиям нефтеизвлечения.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов» посвященном 120-летию со дня рождения академика В.Н. Шапошникова (с международным участием) (г. Москва, МГУ, 2004 г), на третьем международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 14-18 марта, 2005 г), на 9-й международной пущипской школе-конференции молодых ученых (г. Пущипо, 18-22 апреля 2005 г).

Публикации

Основные материалы диссертации опубликованы в 3-х статьях (4-я принята в печать) и 4-х тезисах.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из разделов: «Введения», «Обзора литературы», «Экспериментальная часть» (включающая главы «Объекты и методы исследования» «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Материалы изложены на 154 страницах печатного текста и включают 38 таблиц, 17 рисунков. Список литературы содержит 54 наименования отечественных и 157 иностранных работ.

Место проведения работы

Работа проведена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН в лаборатории нефтяной микробиологии (зав. лаб. - д.б.п. проф. С.С. Беляев) под руководством в.н.с., д.б.н. Е.П. Розановой. В работе по определению скорости сульфатредукции в средах с различной соленостью принимал участие И.А. Борзенков. Электронно-микроскопические исследования проводили в ИНМИ РАН совместно с JT.JT. Митюшиной; геносистематические 9 с A.M. Лысенко (ИНМИ РАН), Т.П. Туровой и А.Б. Полтараусом (ИМБ РАН); хемотаксономические с Г.А. Осиповым (РАМН). Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю в.н.с. д.б.н. Е.П. Розановой за постоянное внимание, поддержку и ценные советы при обсуждении результатов, зав. лаб. проф. С.С. Беляеву, Т.Н. Назиной, А.Е. Ивановой, а также всем коллегам и друзьям ИНМИ за содействие и поддержку.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Белякова, Елена Владимировна

выводы

Из пластового рассола нефтяного месторождения выделена новая мезофильная умеренно-галофильная сульфатвосстанавливающая бактерия. Микроорганизм имеет вибриоидную форму клеток, и относится к грамотрицательным бактериям. Растет в средах с содержанием NaCl 3-23 % (оптимально при 8-10 %), окисляя ряд органических соединений. Бактерия является первой из известных умеренно-галофильных сульфатвосстанавливающих бактерий (развивающихся в средах с соленостью более 13%), способных к полному окислению жирных кислот (формиат, пропионат и бутират) и росту в автотрофных условиях за счет

Н2/С02.

По совокупности морфологических, метаболических и биохимических особенностей, а также по результатам генотипических свойств и филогенетического аиализа микрооргаиизм отнесен к новому роду и виду Desulfovermiculus halophilus gen. nov. sp. nov., типовой штамм 11 . Является представителем семейства Desulfohalobiaceae.

Термофильные спорообразующие сульфатвосстанавливающие бактерии -штаммы 435 и 781 являются галотолерантными, разлагают большой набор органических соединений и относятся к группе полных окислителей. В хемолитоавтотрофных условиях растут за счет Н2/СО2. Диспропорционируют тиосульфат, что является новым свойством для представителей рода Desulfotomaculum. Впервые для сульфатвосстанавливающих бактерий выявлена стимуляция окисления ацетата дрожжевым экстрактом.

На основании результатов молекулярпо-генетических, хемотаксопомических исследований и фепотипических свойств, метаболизма штаммы 435 и 781 отнесены к новому виду Desulfotomaculum salinum sp. nov., типовой штамм - 435т. На филогенетическом дереве бактерий рода Desulfotomaculum штаммы 435Т и 781 представлены отдельной ветвью в подкластере 1 С.

Заключение

Выделена и охарактеризована умеренно-галофильная СВБ штамм И с грамотрицательным строением клеточной стенки, отнесенная к новому роду и виду Desulfovermiculus halophilus, развивающаяся в условиях высокого содержания NaCl в средах до 230 г/л с оптимумом 80 - 100 г/л. Статус нового родового таксона был присвоен этой СВБ на основании совокупности результатов исследования гено- и фенотипических особенностей. Штамм 11 располагается на отдельной ветви в подкластере филогенетического дерева дельта-Proteobacteria, образующем новое семейство Desulfohalobiaceae. Исследованный микроорганизм значительно отличается по фенотипическим свойствам от всех известных умерено-галофильных СВБ, прежде всего, способностью полного окисления органического субстрата - бутирата. Клетки, выращенные на бутирате, обладали высокой активностью СО-дегидроденазы, что свидетельствовало о наличии ферментов пути Вуда — разложения адетил-КоА до двух С02.

Разложение штаммом 11 пропионата и других органических соединений, содержащихся в средах в относительно высоких концентрациях, сопровождалось накоплением ацетата. Однако, при снижении содержания пропионата в среде происходило значительное уменьшение накопления ацетата на единицу потребленного субстрата.

Таким образом, по результатам нашего исследования впервые было показано существование умеренно-галофильной СВБ - полного окислителя, способного расти при высоких концентрациях NaCl, что в ряде обзорных работ ставилось под сомнение.

Образование ацетата штаммом 11 при окислении бутирата в средах е содержанием NaCl 200 г/л позволило дать объяснение накоплению ацетата в гиперсоленых условиях экосистем, в частности в рассолах нефтяных месторождений.

Сравнение ростовых характеристик штамма 11 и экологических условий экотопа -источника выделения, привело к заключению, что эта СВБ является аборигеном пласта. Подобные микроорганизмы могут существовать в пластовых рассолах нефтяных месторождений Вол го-Уральского региона, где экологические условия соответствуют его ростовым характеристикам.

Полученные результаты позволили расширить сведения о разнообразии термофильных представителей СВБ рода Desulfotomaculum - полных окислителей органических соединений. Охарактеризованы два штамма-435 и 781 термофильных СВБ, которые на основании совокупности морфологических характеристик, параметров роста, метаболических свойств, хемотаксономических паризнаков, результатов геносистематики и филогенетического анализа отиесеипы к новому виду D. salinum, вошедшему в подкластср 1 филогенетического дерева рода Desulfotomaculum. По ряду метаболических

134 характеристик штаммы D. salinum sp. nov. отличаются от большинства других членов подкластера 1С, но близки к D. kusnetzovii. Исследованные СВБ окисляют большой набор органических соединений, в том числе жирные кислоты, одноуглеродные соединения, формиат и метанол (в отсутствие других источников углерода) и развиваются в хемолитоавтотрофпых условиях за счет Н2/СО2.

Штаммы 435 и 781 пополнили число видов рода Dcsulfotomaculum, способных окислять бутират, содержащийся в среде в не лимитированных количествах, без накопления ацетата. На примере этих штаммов впервые для представителей рода Dcsulfotomaculum показано, что снижение концентрации лактата приводит к уменьшению накопления ацетата. Кроме того, было показано, что ацетат может медленно окисляться этими штаммами и в присутствии дрожжевого экстракта количество окисленного ацетата увеличивается. Ранее данные по стимуляции окисления ацетата дрожжевым экстрактом, касающиеся СВБ, отсутствовали.

Из месторождения Даган (Китай) был выделен и кратко охарактеризован штамм Д-4. По филогенетическому анализу (сиквенс оснований 16S рРНК) микроорганизм оказался идентичным со штаммом 435 - D. salinum sp. nov., но имел некоторые отличия от штамма 435 в метаболизме органических соединений, в частности, быстрый и эффективный рост на ацетате.

Таким образом, мы дали относительно полпуго характеристику метаболизма исследованных термофильных СВБ (штаммов 435 и 781) рода Dcsulfotomaculum, которая может помочь в интерпретации некоторых результатов, полученных для других представителей подкластера 1С.

Сравнение ростовых параметров штаммов 435 и 781 и параметров экологических условий местообитания позволяет сделать заключение о том, что эти СВБ могут функционировать в залежах углеводородов Западной Сибири и их жизнедеятельность может являться причиной появления сероводорода в месторождениях нефти, подвергающихся вторичному заводнению. Кроме того, полученная характеристика штаммов позволяет дать спекулятивную оценку их роли в исчезновении сульфатов из пластовых вод на ранних стадиях формирования вмещающих пород.

Полученные результаты - распространение термофильных СВБ на глубинах углеводородных залежей Западной Сибири, заводняемых холодной водой (или незаводняемых - газовое месторождение) вместе с результатами обнаружения бактерий одного вида в месторождениях географически удаленных регионов, позволяет рассматривать изученные штаммы, как аборигенную микрофлору. Таким образом, по результатам проведенного исследования есть основание полагать, что микроорганизмы, рассмотренные в настоящей работе, являются предствителями «общей биосферы».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белякова, Елена Владимировна, Москва

1. Беляев С.С. Микробиологическое образование метана в различных экосистемах. — В сб.: Роль микроорганизмов в круговороте газов в природе. М. «Наука». 1979. С. 205-219.

2. Беляев С.С., Лауринавичус К.С., Образцова А.Я., Горлатов С.Н., Иванов М.В. Микробиологические процессы в призабойной зоне нагнетательных скважин нефтяных месторождений //Микробиология. 1982. Т. 51. Вып. 6. С. 991-1001.

3. Беляев С.С., Иванов М.В. Современная геохимическая деятельность микроорганизмов в разрабатываемом нефтяном месторождении возможность ее регуляции //Геохимия. 1990. № 11. С. 1618-1625.

4. Беляев С.С., Розанова Е.П., Борзенков И.А., Чарахчьян И.А., Миллер Ю.М., Соколов М.Ю., Иванов М.В. Особенности микробиологических процессов в заводняемом нефтяном месторождении Среднего Приобья // Микробиология. 1990. Т. 59. (5). С. 1075-1081.

5. Белякова Е.В., Розанова Е.П. Дополнительные свойства спорообразующих сульфатвосстанавливающих бактерий рода Dcsulfolomaculum, штаммов 435 и 781 // Микробиология. 2004. Т. 73. № 2. С. 284-286.

6. Борзенков И.А., Беляев С.С., Миллер Ю.М., Давыдова И.А., Иванов М.В. Метаногепез в высокоминерализованных водах Бондюжского месторождения // Микробиология. 1997. Т. 66. Вып. 1. С. 122-129.

7. Борзенков И.А., Тетличенко М.М., Милехина Е.И., Беляев С.С., Иванов М.В. Метанокисляющие бактерии и их активность в пластовых водах нефтяных месторождений Татарской АССР. // Микробиология. 1991. Т. 60. Вып. 3. С. 558563.

8. Галушко A.C. Розанова Е.П., Иванова А.Е. Сульфатредукция в сборных водах, нагнетаемых в нефтяные пласты. // Микробиология. 1993. Т.62. Вып. 6. С. 11271134.

9. Горленко В.М., Кузнецова В.А. Бактериальное восстановление сульфатов при совместном культивировании Dv. desulfuricans и углеводородокисляющих бактерий на минеральной среде с нефтью. // Прикладная биохимия и микробиология. 1966. Т. 2. Вып. 3. С. 264-270.

10. Гроссман JL, Молдейв К. (Ред.) Методы исследования нуклеиновых кислот. М. Мир. 1970. 280 е.; Герхард Ф. (Ред.) Методы общей бактериологии. М. «Мир». 1984.

11. Досон Р., Эллиот Д. и др. Справочник биохимика. Издательство «Мир». М. 1991, С. 354-369.

12. Иванов М.В., Беляев С.С., Зякун A.M., Бондарь В.А., Лауринавичус К.С. Микробиологическое образование метана в разрабатываемом нефтяном месторождении // Геохимия. 1983. № 11. С. 1647-1654.

13. Иванов М.В., Беляев С.С., Лауринавичус К.С., Образцова А.Я., Горлатов С.Р. Распространение и геохимическая деятельность микроорганизмов в заводняемом нефтяном месторождении // Микробиология. 1982. Т. 51. Вып. 2. С. 336-341.

14. Иванов М.В., Горленко В.М. Изучение микробиологического образования H2S в месторождениях с применением S3504- // Микробиология. 1966. Т. 35. №1. С. 146149.

15. Исмаилов Н.М., Рзаева Ф.М. Биотехнология нефтедобычи. Принципы и применение. Баку-«ЭЛМ»-1998. 198 с.

16. Кашнер Д. Жизнь микроорганизмов при высоких концентрациях солей и растворенных веществ. // Жизнь микробов в экстремальных условиях. (Под ред. Кашнера Д.). М. «Мир». 1985. С. 365-415.

17. Кузнецов С.И., Дубинина Г.А. Методы изучения водных микроорганизмов (под ред. д.б.н. Сорокина Ю.И.). М. «Наука». 1989. С.234 285.

18. Логинова Л.Г. Анаэробные термофильные бактерии. М. «Наука». 1982. 100 с.

19. Матвеева Н.И., Воронина H.A., Борзенков И.А., Плакунов В.К., Беляев С.С. Состав и количественное содержание осмопротекторов в клетках нефтеокисляющих бактерий при разных условиях культивирования. // Микробиология. 1997. Т. 66. № 1.С. 32-37.

20. Методы общей бактериологии (Под редакцией Герхарда и др.). М. «МИР». 1983. Т 1.С. 433.

21. Милехина Е.И., Борзенков И.А., Звягинцева И.С., Кострикина H.A., Беляев С.С. Эколого-физиологические особенности аэробных эубактерий из нефтяных месторождение Татарии. // Микробиология. 1998. Т. 60. №2. С. 208-214.

22. Назина Т.Н. Анаэробная микрофлора терригепиых нефтяных пластов. Дис. . k.6.h. М. 1983.202 с.

23. Назина Т.Н., Розанова Е.П., Беляев С.С., Иванов М.В. Химические и микробиологические методы исследования пластовых жидкостей и кернов нефтяных месторождений. Препринт. Пущино.: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1988. 25 с.

24. Назина Т.Н., Иванова А.Е., Канчавели Л.П., Розанова Е.П. Новая спорообразующая термофильная метилотрофпая сульфатвосстанавливающая бактерия Desulfotomaculum kuznetsovii sp. nov. // Микробиология. 1988. Т. 57. № 5. С. 823827.

25. Назина Т.Н., Беляев С.С. Биологическое и метаболическое разнообразие микроорганизмов нефтяных месторождений. Юб. Сборп. М. 2004. Вып. XII. С. 289317.

26. Назина Т.Н., Иванова А.Е., Голубева О.В., Ибатуллин P.P., Беляев С.С., Иванов М.В. Распространение сульфат- и железоредуцирующих бактерий в пластовых водах Ромашкинского месторождения. // Микробиология. 1995. Т. 64. Вып. 2. С. 245-251.

27. Назина Т.Н., Иванова А.Е., Ивойлов B.C., Миллер Ю.М., Ибатуллин P.P., Беляев С.С., Иванов М.В. Микробиологическая и геохимическая характеристика карбонатных нефтяных коллекторов Татарии. // Микробиология. 1998. Т. 67. N. 5. С. 694-700.

28. Назина Т.Н., Пивоварова Т.А. Субмикроскопическая организация и спорообразование у Desulfotomaculum nigrificans. II Микробиология. 1979. Т. 48. № 2. С. 302-306.

29. Назина Т.Н., Розанова Е.П. Термофильные сульфатвосстанавливающие бактерии из нефтяных пластов. // Микробиология. 1978. Т. 47. № 1. С. 142-148.

30. Плакунов В.К., Арзуманян В.Г., Воронина H.A., Беляев С.С. Взаимосвязь кинетики роста и дыхания у родококков в присутствии высоких концентраций солей // Микробиология. 1999. Т. 68. №1. С. 40-44.

31. Пушева М.А., Соколова Т.Г. Распределение активности СО-дегидрогеназы при СО-зависимом и пируватзависимом росте анаэробной термофильной карбоксидотрофной бактерии Carboxydothermus hydrogenoformans. Микробиология. 1995. Т. 64. № 5. С. 581-586.

32. Резников A.A., Муликовская. Методы анализа природных вод. Москва. 1954. 153 с.

33. Розанова Е.П., Назина Т.Н. Сульфатвосстанавливающие бактерии. Систематика и метаболизм. //Успехи микробиологии. 1989. Т. 23. С. 191-226

34. Розанова Е. П., Саввичев A.C., Каравайко С. Г., Миллер М.Ю. Микробиологическая обстановка в Савуйском нефтяном месторождении Приобья. // Микробиология. 1995. Т. 64. С. 104-111.

35. Розанова Е.П., Саввичев A.C., Миллер Ю.М., Иванов М.В. Микробиологические процессы в нефтяных пластах Западной Сибири, заводняемых с применением комплекса органических веществ. // Микробиология. 1997. Т. 66. №6. С. 852-859.

36. Розанова Е. П., Борзенков И.А., Тарасов А.Л., Сунцова Л.А. и др. Микробиологические процессы в высокотемпературном нефтяном месторождении. //Микробиология. 2001. Т. 70. С. 118-127.

37. Розанова Е.П., Быков В.Н., Балдина А.Л., Косогорова Т.А. Закономерности развития сульфатредукции в заводняемом нефтяном коллекторе. // Микробиология. 1973. Т. 42. Вып. 2. С. 347-353.

38. Розанова Е.П., Кузнецов С.И. Микрофлора нефтяных месторождений. М. «Наука». 1974.197 с.

39. Розанова Е.П., Назина Т.Н. Распространение термофильных сульфатвосстанавливающих бактерий в нефтяных пластах Апшерона и Западной Сибири // Микробиология. 1979. Т. 48. Вып. 6. С. 1113-1117.

40. Розанова Е.П., Назина Т.Н. Современные представления о сульфатвосстанавливающих бактериях. Хемосинтез. М. «Наука» 1989. С. 199-227.

41. Розанова Е.П., Пивоварова Т.А. Реклассификация Desulfovibrio thermophilus (Розанова, Худякова, 1974) // Микробиология. 1988. Т. 57. Вып. 1. С. 102-106.

42. Розанова Е.П., Худякова А.И. Новый бесспоровый термофильный организм, восстанавливающий сульфаты, Desulfovibrio thermophilus nov. sp. // Микробиология. 1974. Т. 43. С. 1069-1073.

43. Слободкин И.А., Заварзина Д.Г. и др. Диссимиляционное восстановление неорганических акцепторов электронов термофильными анаэробными прокариотами. Микробиология. 1999. Т. 68. № 5. С. 600-622.

44. Тарасов А.Л., Борзепков И.А., Милехина Е.И., Беляев С.С., Иванов М.В. Динамика микробных процессов в пластовых водах Ромашкипского нефтяного месторождения. // Микробиология. 2002. Т. 71. N. 6. С. 849-857.

45. Турова Т.П., Кузнецов Б.Б., Новикова Е.В., Полтараус А.Б., Назина Т.Н. Гетерогенность нуклеотидных последовательностей генов 16S рибосомной РНК типового штамма Desulfotomaculum kuznetsovii. II Микробиология. 2001. Т. 70. № 6. С. 788-795.

46. Чарахчьян И.А, Митюшина Л.Л., Кузнецова В.Г., Беляев С.С. Морфология и ультраструктура Methanococcoides euhalobius и роль кальция в его морфогенезе. // Микробиология. 1989. Т. 58. № 5. С. 825-830.

47. Adams M.W., Kelley R. М «Enzymes from microorganisms in extreme environments» // Chem. End News. 1995. V. 73. P. 32-42.

48. Aeckersberg F., Bak F., Widdel F. Anaerobic oxidation of saturated hydrocarbons to CO2 by a new type ofsulfate-reducing bacteria. //Arch. Microbiol. 1991. V. 156. P. 5-14.

49. Audiffrin C., Cayol J.-L. et al. Desulfonauticus submarinus gen. nov., sp. nov., a novel sulfate-reducing bacterium isolated from a deep-sea hydrothermal vent. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1585-1590.

50. Azachi M., Sadka A., Fisher M., Goldshlag P., Ghokhman I., Zamir A. Salt introduction of fatty acid elongase and membrane lipid modifications in the extreme halotolerant alga Dunaliella salina. II Plant. Physiol. 2002. V. 129. P. 1320-1329.

51. Babel W., Rosenthal H., Rapoport S. A unified hypothesis on the causes of the cardinal temperatures of microorganisms; the temperature minimum of Bacillus stearothermophilus. II Asta. Biol. Med. Germ. Vol. 28. P. 565-576. 6*/f <v

52. Baena S., Fardeau M.-L., Labat M. et al. Desulfovibrio aminophilus sp.nov., a novel Amino Acid Degrading and Sulfate-reducing Bacterium from an Anaerobic Dairy Wastewater Lagoon. // System. Appl. Microbiol. 1998. V. 21. P. 498-504.

53. Bak F., Widdel F. Anaerobic degradation of phenol and phenol derivates by Desulfobactcrium phenolicum sp. nov. // Arch. Micribiol. 1986. V. 146. P. 177-180.

54. Beeder J., Torsvik T., Lien T. Thermodesulforhabdus norvcgicus gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic sulfate-reducing bacterium from oil field water. // Arch. Microbiol. 1995. V. 164. P. 331-336.

55. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Second Ed. V. II. The Proteobacteria. Part C. The Alpha-, Beta-, Delta-, and Epsilonproteobacteria. (Ed. Brenner D.J., Krieg N.B., Staley J.T.). 2005. 1388. p.

56. Blochl E., Rachel R. et al. Pyrolobus fumarii, gen. nov., represents a novel group of archaea, extending the upper temperature limit for the life to 113 °C. // Extremofiles 1997. V. l.P. 14-21.

57. Brandt K.K., Patel B.K.C., Ingvorsen K. Desulfocella halophila gen. nov., sp. nov., a halophilic, fatty-acid-oxidizing, sulfate-reducing bacterium isolated from sediments of the Great Salt Lake. // Int. Journ. System. Bact. 1999. V. 49. P. 193-200.

58. Brandt K.K., Ingvorsen K. Desulfobacter halotolerans sp. nov., a halotolerant acetate-oxidizing sulfate-reducing bacterium of Great Salt Lake, Utah. // Syst. Appl. Microbiol. 1997. V. 20. P. 366-373.

59. Brysch K., Schneider C. et al. Litoautotrophic growth of sulfate-reducing bacteria, and description of Desulfobactcrium autotrophicum gen. nov., sp. nov. // Arch. Microbiol. 1987. V. 148. P. 264-274.

60. Burggaraf S., Jannasch H.M., Nicolaus B., Stetter K.O. Archaeoglobus profundus sp. nov., represents a new species within the sulfate-reducing archaebacteria. // Syst. Appl. Microbiol., 1990. V. 13. P. 24-28.

61. Campbell L.L., Postgate J.R. Classification of the spore-forming sulfate-reducing bacteria. // Bacteriol. Rev. 1965. V. 29 (3). P. 359-362.

62. Castro ILF., Williams N.H., Ogram A. Mini Review. Phylogeny of sulfate-reducing bacteria.//FEMS Microbiology Ecology. 2000. V. 31. P. 1-9.

63. Caumette P., Cohen Y., Matheron R. Isolation and characterization of Desulfovibrio halophilus sp. nov., a halophilic sulfate-reducing bacterium isolated from Solar Lake (Sinai). // Syst. Appl. Microbiol. 1991. V. 14. P. 33-38.

64. Coleman M.L., Hedrick D.B. et al. Reduction of Fe (III) in sediments by sulfate-reducing bacteria. //Nature. 1993. V. 361 (4). P. 436-438.

65. Collins M.D. Analysys of isoprenoid quinines. In: Methodes in Microbiology. 1985. V. 18. P. 329-363.

66. Cord Ruwisch R., Ollivier B., Garcia J.L. Fructose degradation by Desulfovibrio sp. in pure culture and in co-culture with Methanospirillum hungatei. // Curr. Microbiol. 1986 V. 13. P. 285-289.

67. Cord-Ruwich R., Garsia J.L. Isolation and characterization anaerobic benzoate degrading spore-forming sulfate-reducing bacterium Desulfotomaculum sapomandens sp. nov. // FEMS Microbiol. Lett. 1985. V. 29. P. 325-330.

68. Corg-Ruwicsh R., Widdel F. Corroding iron as a hydrogen source for sulfate reduction in growing cultures of sulfate-reducing bacteria // Appl. Microbiol. Biotehnol. 1986. V. 25. P. 169-174.

69. Costerton J.W., Lewandowski Z., DeBeer D., Caldwell D., Korber D., James G. Biofilms, the customized microniche. Minireview. // Jo urn. Bacteriol. 1994. V. 176 (8). P. 2137-2142.

70. Cypionka H., Pfennig N. Growth yields of Desulfotomaculum oricntis with hydrogen in chemostate culture. // Arch. Microbiol. 1986. V. 143. P. 396-399.

71. Sl.Daumas S., Cord-Ruwisch R., Garcia J.L Desulfotomaculum geothermicum sp. nov., a thermophilic, fatty acid-degrading, sulfate-reducing bacterium isolated with H2 from geothermal ground water. // Antonie van Leeuwenhoek. 1988. V. 54. P. 165-178.

72. Davis J.B. Petroleum Microbiology. Elsevier Publ. Co. Amsterdam-London-N.Y. 1967. 604 p.

73. De Ley J. Cattoir H., reynaerts A. The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates. // Eur. J. Biochem. 1970. V. 12. P. 133-142.

74. Donnenberg S., Kroder M., et al. Oxydation of H2, organic compounds and inorganic compounds coupled to reduction of O2 or nitate by sulfate-reducing bacteria. // Arch. Microbiol. 1992. V. 158. P. 93-99.

75. Doolittle R.F. Similar amino acid sequences chance or common ancestry ? // Science. 1981. V. 214. P. 149-159.

76. Edwards U., Rogall T., Bloeker IL, Ende M.D., Boeettge E.C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA //Nucl. Acids Res. 1989. V.17. P.7843-7853.

77. Fardeau M.L., Olliver B., Patel B.K.C. et al. Isolation and characterization of thermophilic sulfate-reducing bacterium, Desulfotomaculum thermosapovorans sp. nov. // Int. Joum. Syst. Bacteriol. 1995. V. 45. (2). P. 218-221.

78. Fardeau M.L., Ollivier B., Patel B.K.C., Dwivedi P., Ragot M., Garcia J.-L. Isolation and characterization of a thermophilic sulfate-reducing bacterium, Desulfotomaculum thermosapovorans sp. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. V. 45. P. 218-221.

79. Finster K., Liesack W., Tindali B.J. Desulfospira joergensenii, gen. nov., sp. nov., a new sulfate-reducing bacterium isolateg from marine surface sediment. // System. Appl. Microbiol. 1997. V. 20. P. 201-208.

80. Finster K., Liesack W., Thamdrup B. Elemental sulfur and thiosulfate disproportionation by Desulfocapsa sulfoexigenes sp. nov., a new anaerobic bacterium isolated from marine surface sediment. // Appl. and Env. Microbiol. 1998. V. 64(1). P. 119-125.

81. Galinski E.A. and Trüper H.G. Microbial behavior in salt stress ecosystems. // FEMS. 1994. V. 15. P. 95-101.

82. Gorris L.G.M., Voet A.C.W.A., van de Drift C. Structural characteristics of methanogenic cofactors in the non-methanogenic archaebacterium Archaeoglobus fulgidus // BioFactors. 1991. V. 3. P. 29-35.

83. Hamilton W. A. Biofilms: microbial interactions and metabolic activities. // Ecology of Microbiol. Communities, (ed. Feetcher et al., 1987). Cambrige Int. Press. P. 361-385.

84. Hamme J.D.V., Singh A., Ward O.P. Recent Advances in Petroleum Microbiology. // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2003. V. 67 (4). P. 503-549.

85. Hansen T.A. Metabolism of sulfate-reducing prokaryotes. // Antonie van Leeuwenhoek. 1994. V.66. P. 165-185.

86. Hungate R.E. A roll tube method for the cultivation of strict anaerobes. In: Methods in microbiology (Ed. Norris J.L., Ribbons D.W.). 1969. V. 36, P. 117-132. Academic Press, New York.

87. Harmsen H.J., Van Kuijk B.L., et al. Syntrophobacter fumaroxidans sp. nov., a syntrophic propionate-degrading sulfate-reducing bacterium. // Int. Journ. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 1383-1387.

88. Hatchikian E.C., Zeikus J.G. Characterization of a new type of dissimilatory sulfite reductase present in Thermodesulfobacterium commune II J. Bacteriol. 1983. V. 153. P. 1211-1220.

89. Hatchikian E.C., Papavassilion P., Bianco P., Haladijian J. Characterization of cytochrome C3 from the thermophilic sulfate reducer, Thermodesulfobacterium commune //J. Bacteriol. 1984. V. 159. P. 1040-1046.

90. Hattori S., Y. Kamagata, et al. Thermoacetogenium phaeum gen. nov., sp. nov., a strictly anaerobic, thermophilic, syntrophic acetate-oxidizing bacterium. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 1601-1609.

91. Isaksen M.F., Bak F., J0rgencen B.B. // FEMS Microbiology Ecology, 1994. 14 (1), P. 1.

92. Jackson B.E., Mclnerney M. J. Thiosulfate disproportionate by Desulfotomaculum thermobenzoicum. II Appl. and Env. Microbiol. 2000. V. 66 (8). P. 3650-3653.

93. Janssen P.H., Schumann A., Bak F., Liesack W. Disproportionation of inorganic sulfur compounds by the sulfate-reducing bacterium Desulfocapsa thiozimogenes gen. nov., sp. nov. //Arch. Microbiol. 1996. V. 166. P. 184-192.

94. Karnauchow T.M., Koval S.F., and K.F. Jarrel. Isolation and characterization of three thermophilic anaerobes from a St. Luciae Hot Spring. // Syst. Appl. Microbiol. 1992. V. 15. P. 296-310.

95. Kashefi K., Lovley D.R. Extending the upper temperature limit for life. // Science. 2003. V.301 (15), p.934.

96. Klcmps R., Cypionka F., Widdel F., Pfennig N. Growth with hydrogen, and further physiological characteristics of Desulfotomaculum species. // Arch. Microbiol. 1985. V. 143. P. 203-208.

97. Konopka A., Schnur M. Effect of light intensity on macromolecular synthezys in cyanobacteria. // Microb. Ecol. 1980. V. 6. P. 291-301.

98. Krekeler D., Sigalevich P. et al. A sulfate-reducing bacterium from the oxic layer of microbial mat from Solar Lake (Sinai), Desulfovibrio oxyclinae sp. nov. // Arch. Microbiol. 1997. V. 167.P. 369-375.

99. Kuever J., Rainey F.A. and Widdel F. Family Desulfohalobiaceae fam. nov. In Bergey's manual of systematic bacteriology, 2nd edn, Vol. 2. Edited by G.M. Garrity. New York: Springer (in press).

100. Kuever J., Rainey F.A., Hippe H. Description of Desulfotomaculum sp. Groll as Desulfotomaculum gibsoniae sp. nov. //Int. Journ. System. Bact. 1999. V. 49. P. 18011808.

101. Madigan M. T. and Oren A. Thermophilic and Halophilic extremophiles. // Current Opinion in Microbiology. 1999. V. 2. P. 265-269.

102. Magot M., B. Ollivier & B.K.C. Patel Microbiology of petroleum reservoirs. // Antonie van Leewenhoek. 2000.V. 77. P. 103-116.

103. Magot M. Similar bacteria in remote oil fields. Scientific correspondence. // Nature, 1996. V. 379(22). P. 681.

104. Marmur J. A procedure for the isolation of dezoxyribonucleic acid from microorganisms.//J. Mol. Biol. 1961. V. 3. P. 208-218.

105. Min H. and Zinder S.H. Isolation and characterization of a thermophilic sulfate-reducing bacterium Desulfotomaculum thermoacetoxidans sp. nov. // Arch. Microbiol. 1990. 153. P. 399-404.133.134.135.136137.138,139,140141142143,144145

106. Microbial problems in the offshore oil industry. (Ed. Hill E.C., Shennan J.L., Watkinson R.J.) The Inctitute of Petroleum, London. 1986. 271 p.

107. Muller V. Energy conservation in acetogenic bacteria. // Appl. Env. Micribiol. 2003. V. 69. (1). P. 6345-6353.

108. Nazina T.N., Xue Y.-F., Wang X.-Y., Belyaev S.S., and Ivanov M.V. Microorganisms of the high-temperature Liaohe oil field of China and their potential for MEOR. // Resource & Environ. Biotechnol. 2000 a. V. 3. P. 109-120.

109. Nilsen R.K., Beeder J., Thorstenson T., Torsvik T. Distribution of thermophilic marine sulfate reducer isolated from a North Sea oil field waters and oil reservoirs // Appl. Env. Microbiol. 1996. V. 62. P. 1793-1798.

110. Nilsen R.K., Torsvik T., Lien T. Desulfotomaculum thermocisternum sp. nov., a sulfate-reducer isolated from a hot North Sea oil reservoir. // Int. Journ. Syst. Bacteriol., Apr. 1996. P. 397-402.146.147.148.149.150.151,152.153,154,155.156,157.158,159,

111. Olivier B., Hatchikian C. et al. Dcsulfohalobium reibaense gen. nov., sp. nov., a halophilic sulfate-reducing bacterium from sediments of a Hypersaline Lake in Senegal. // Int. Journ. System. Bact. 1991. V. 41. Yss. 1.

112. Ollivier B., Gaumette P. ct al. Anaerobic bacteria from hypersaline environments. // Microbiological. Reviews. 1994. P. 27-38.

113. Orcn A. Bioenergetic aspects of halophilism. // Microbiology and Molecular biology Reviews. 1999. P.334-348.

114. Pikuta E., Lysenko A. et al. Desulfotomaculum alkaliphilum sp. nov., a new alkaliphilic, moderately thermophilic sulfate-reducing bacterium. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 25-33.

115. Postgate J.R. Nitrogen fixation by sporulation sulfate-reducing bacteria including rumen strain //J. Gen. Microbiol. 1970. V. 63 (1). P. 137-139.

116. Rabus R., Hansen T., Widdel F. Dissimilatory sulfate-and sulfur reducing prokaryotes. // The Prokaryotes. Chapnum 274.2004. Springer-Verlag N.Y., LLC. (in press).

117. Rees G.N., Grassia G.S., Sheehy A.J., Dwivedi P.P., and Petel B.K.C. Desulfacinum infernum gen. nov, sp. nov., a thermophilic sulfate-reducing bacterium from a petroleum reservoir. // Int. Journ. Syst. Bacteriol., Jan. 1995. P. 85-89.

118. Reichenbecher W., Shink B. Desulfovibrio inopinatus, sp. nov., a new sulfate-reducing-bacterium that degrades hydroxyhydroqinone (1,2,4,-trihydroxybenzene). // Arch. Micribiol.1997. V. 168. P. 338-344.

119. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque strain in electron microscopy. // J. Cell. Biol. 1963. V. 17. P. 208-212.

120. Roznes J.T., Torsvik T., Lien T. Spore-forming thermophilic sulfate-reducing bacteria isolated from North Sea field waters // Appl. Environ. Microbiol. 1991a. V. 57. P. 23022307.

121. Rozanova E., Rzajeva F., Ismailov N.M., Ivanova A. E., Ivanov M.V. Proc. Of the conference on microbiology in the oil industry and lubricayion 10-12 sept. 1991. Sopron (BMP). P. 211-215.

122. Ryter A., Kellenberger E. Etude au microscope electronique de plasmas contenant de l'acide desoxyribonucleique. // Z. Nature forsh. 1958. V. 13. P. 579-605.

123. Shauder R., Eikmans B., Thauer R. K., et al. Acetate oxidation to CO2 in anaerobic bacteria via a novel pathway not involving reactions of the citric acid cycle. // Arch. Microbiol. 1986. V. 145 (2). P. 162-172.

124. Shink B., Thiemann V. et al. Desulfotignum phosphitoxidans sp. nov., a now marine sulfate reducer that oxidizes phosphite to phosphate. // Arch. Microbiol. 2002. V. 177. P. 381-391.

125. Sievert S.M. and Kuever J. Desulfacinum hydrothermale sp. nov., a thermophilic, sulfate-redusing bacterium from geothermally heated sediments near Milos Island (Greece). // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 1239-1246.

126. Sleytr U., Adam H., Klaushofer H. Die feinstruktur der zellwand und cytoplasmamembran von Clostridium nigrificans, dargenstellt mit hilfe der cefrieratz-und ultra dunnschnittechnik // Arch. Microbiol. 1969. V. 66 (1). P. 40-58.

127. Spormann A.M., Thauer R.K. Anaerobic acetate oxidation to CO2 by Desulfotomaculum acetoxidans. Demonstration of enzymes required for the operation of an oxidative acetil

128. CoA / carbon monoxide dehydrogenase parthway. // Arch. Microbiol. 1988. V. 150. P. 374-380.

129. Stakebrandt E., Schumann P., Hippe H., Schiiler E. Reclassification of Desulfotomaculum auripigmentum as Desulfosporosinus auripigmenti corrig., comb, nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1439-1443.

130. Stctter K.O., Huber R., Blochl E., Kurr M. et al., Hyperthermophilic archaca are thriving in deep Nopth Sea and Alaskan oil reservoirs. // Nature (London). V. 365. P. 743-745.

131. Stetter K.O., Hoffmann A. & Huber R. Microorganisms adapted to high temperature environments. // In: Guerrero R. & Pedros-Alio C. (Ed) Trends in Microbial Ecology. 1993a. Spanish Society for Microbiology. P. 25-28.

132. Stetter K.O., Huber R., Blochl E., Kurr M. et al. Hyperthermophilic archae are thriving in deep North sea and Alaskan oil reservoirs // Nature. 1993. V. 365. P. 743-754.

133. Takashi, Suzuki K. et al. Caldivirga maquilinensis gen. nov., sp. nov., a new genus of rod-shaped crenarchaeote isolated from a hot spring in the Philippines. // Int. Journ. Syst. Bacterid. 1999. V. 49. P. 1157-1163.

134. Tanaka K., Stackebrandt E. et al. Desulfovirga adipica gen. nov., sp. nov., an adipate-degrading, gram-negative, sulfate-reducing bacterium. // Int. Journ. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 639-644.

135. Tanner R.S., Udegbunam E.O., Mclncrncy M.J., Knapp R.M. //Geomicrobiol. J. 1991. V. 9. P. 169-195.

136. Targy-Jacquenod C., Magot M. et al. Desulfotomaculum halophilum sp. nov., a halophilic sulfate-reducing bactcrium isolated from oil production facilities. // Int. Journ. System. Bact. 1998. V. 48. P. 333-338.

137. Targy-Jacquenod C., Magot M. et al. Desulfovibrio gabonensis sp. nov., a new moderately halophilic sulfate-reducing bactcrium isolated from an oil pipeline. // Int. Journ. System. Bact. 1996. V. 46 (3). P. 710-715.

138. Tasaki M., Kamagata Y., Nakamura K., Mikami E. Isolation and characterization of a thermophilic benzoate-degrading, sul fate-reducing bacterium, Desulfotomaculum thermobenzoicum sp. no v. //Arch. Microbiol. 1991. V. 155. P. 348-352.

139. Tasaki M., Kamagata Y., Nakamura K., Mikami E. Utilization of metoxylated benzoates and formation of intermediates by Desulfotomaculum thermobenzoicum in the presence or absence of sulfate //Arch. Microbiol. 1992. V. 157. P. 209-212.

140. Tebo B. M., Obraztsova A.Y. Sulfate-reducing bacterium grows with Cr (VI), U (VI), Mn (IV), and Fe (III) as electron acceptors. // FEMS Microbiology Letters. 1998. V. 162. P. 193-198.

141. Thauer R.K. Citric-acid cycle, 50 years on modifications and alternativa parthwayin anaerobic bacteria. // Eur. J. Biochem. 1988. Vol. 176. P. 479-508.

142. Thauer R.K., Möller Zinkhan D., and Spormann A.M. Biochemistry of acetate catabolism in anaerobic chemotrophic bacteria. // Ann. Rev. Microbiol. 1989. Vol.43. P. 43-67.

143. Trinkerl M., Breunig A., Shauder R., König H. Desulfovibrio termitidis sp. nov., a carbogydrate-degradind sulfate-reducing bacterium from the hindgut of a termite. // System. Appl. Microbiol. 1990. V. 13. P. 372-377.

144. Trüper H.G., Schlegel H.G. Sulfur metabolism in Thiorhodaceae. I. Quantitative measurements in growing cells of Cromatium okenii. // Antonie van Leeuwenhoek. 1964. V. 30. P. 225-238.

145. Trüpper H.G. //J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. Vol. 5. P. 927

146. Van de Peer Y., De Wächter R. TREECON for Windows: a softwar packade for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft windows environment. Comput. Applic. Biosci. 1994. V. 10. P. 569-570.

147. Werkman C.H., Weawer H.J. Studies in the bacteriology of sulfur stinker spoilage of canned sweet corn. // Jowa State Coll. J. Sci. 1927. V. 2. P. 57-67.

148. Widdel F. Anaerober abbau von fettsauren und benzoesaure durch neu isolierte arten sulfat-reduzierender bakterien. Thesis. Gottingen, 1980. P. 29-150.

149. Widdel F. and Pfennig N. Sporulation and further nutritional characteristics of Desulfotomacul um acetoxidans. //Arch. Microbiol. 1981. V.129. P. 401-402.

150. Widdel F. Microbiology and ecology of sulfate- and sulfur-reducing bacteria. In: Biology of Anaerobic Microorganisms (Ed. A.J.B. Zehnder). A wiley interscience publicatin / John Wiley & Sons 1987.

151. Widdel F. The genus Desulfotomaculum. In: Balows A., Truper H.G., Dworkin M., Harder W., Schleifer K.II. (eds.) The prokaryotes, 2nd edn., 1992. V. 1. Springer, New York Berlin Heidelberg. P. 1792-1799.

152. Widdel F. Microbiology and ecology of sulfate- and sulfur-reducing bacteria. In: Biology of Anaerobic Microorganisms. Zehnder A.J.B (eds.). 1987. N.Y. etc. j w and s. P.469-585.

153. Widdel F., Hansen T.A. The dissimilatory sulfate- and sulfur-redusing bacteria. The prokaryotes. 1992. (2 nd ed) V. 1. P. 583-624. Springer-verlag. New York Inc. (Ed. Balows A., Triipper H.G., Dworkin M., et al.).

154. Widdel F., Pfennifg N. Isolation of new sulfate-reducing bacteria enriched with acetate from saline environments. Description of Desulfobacter postgatei gen. nov., sp. nov. // Arch. Microbiol. 1981. V. 129. P. 395-400.

155. Widdel F., Pfennig N. A new anaerobic, sporing, acetate-oxidizing, sulfate-reducing bacterium, Desulfotomaculum (emend.) acetoxidans II Arch. Microbiol. 1977. V. 112. № l.P. 119-122.

156. Widdel F., Phcnnig N. Dissimilatory sulfate- or sulfurreducing bacteria // Bergey's Manual of systematic bacteriology (IX ed.) Baltimore: William & Wilkins, 1984. P. 1200-1202.

157. Wood H.G., Rogsdale S.W., and. Pezacka E. The acetyl-CoA pathway of autotrophic growth. // FEMS Microbiol. Rev. 1986.V. 39. P. 345-362.

158. Zeikus J.G., Dawson M.A., et al. Microbial ecology of volcanic sulfidogenesis: isolation and characterization of Thermodesulfobacterium commune gen. nov. sp. nov. // J. Gen. Microbiology. 1983. V. 129. P. 1159-1169.

159. Zellner G., Stakebrandt E., Knelfel H. at al., Isolation and characterization of a thermophilic, sulfate-reducing arhaebacterium, Archaeoglobus fulgidus strain Z. // Syst. Appl. Microbiol. 1989. V.l 1. P. 151-160.

160. Zhilina T.N., Zavarzin G.A. Desulfonalronovibrio hydrogenovorans gen. nov., sp. nov., an alkalophilic, sulfate-reducing bacterium. // Int. Journ. Syst. Bact. 1997. V. 47 (1). P. 144-149.

Информация о работе

Белякова, Елена Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Таксономия и метаболизм новых термофильных и галофильной сульфатвосстанавливающих бактерий, выделенных из месторождений углеводородов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы