Т-лимфоциты в восстановлении воспроизводительной функции у коров после отела

Хлопонин, Всеволод Серафимович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Т-лимфоциты в восстановлении воспроизводительной функции у коров после отела
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Т-лимфоциты в восстановлении воспроизводительной функции у коров после отела"

На правах рукописи

Хлопонин Всеволод Серафимович

Т-лимфоциты в восстановлении воспроизводительной функции у коров после отела

Специальность 03.00.13 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п. Дубровицы, Московской области 2005 г.

Диссертационная работа выполнена на кафедре биологии воспроизведения, искусственного осеменения и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных Российской академии менеджмента в животноводстве (РАМЖ).

Научный руководитель: доктор биологических наук

РАДЧЕНКОВ Виктор Петрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

КЛИНСКИЙ Юрий Дмитриевич

кандидат биологических наук, доцент ЛОГИНОВ Игорь Андреевич

Ведущая организация: Московская государственная

академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина.

I«

Зашита состоится » ¿УЬгш^Ц 2005 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006. #13. 01 при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142132. Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы, ВГНИИЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНИИЖ. Автореферат разослан ^^р^Ы^ 2005 года

/Жйл^Р

Ученый секретарь диссертационного советО^/Т^ В.П.Губанова кандидат биологических наук чл^

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Увеличение продуктивности в молочном скотоводстве в значительной степени зависит от сокращения времени от отела до плодотворного осеменения. Удлинение сервис-периода часто обусловлено возникновением у коров в послеотельный период воспалительных процессов в половых путях. В этой форме нарушения репродуктивной функции значительный удельный вес принадлежит хроническим гнойно-катаральным эндометритам (Нежданов А.Г.. Иноземцев В.ГТ. 1996; Kask К. et al., 2003).

Несмотря на многообразие экзо- и эндогенных факторов, вызывающих увеличение сервис-периода у крупного рогатого скота, непосредственной их причиной является угнетение иммунной системы и в первую очередь местного иммунитета тканей половых путей. Подавление активности лимфоидной ткани матки снижает ее репаративную регенерацию и способствует колонизации ее условнопатогенной микрофлорой. Данная микрофлора, синтезируя факторы патогенности (эндо-, экзотоксины и др.), усиливает эту иммунодепрессию (Beadley K.W. et al., 2003; Dettellenx H.C et. al. 1995).

В настоящее время существует большое количество способов ликвидации воспаления и восстановления воспроизводительной функции у коров с хроническими гнойно-катаральными эндометритами. Большинство этих способов основано на применении антимикробных препаратов. Существенным недостатком их является высокая устойчивость к ним штаммов условнопатогенных микроорганизмов, а также их иммунодепрессивное действие (Dosogne Н. et al., 1998, Hoelen D. et al., 1997). В связи с этим наиболее перспективным направлением в профилактике и ликвидации эндометритов у коров считают разработку способов восстановления активности местного иммунитета тканей матки (Kummer V., et al., 1997).

РОС. HAU И-'.'¡1А ^нля

bii<-J-4,;f "Л \

ДО

клетках, их устойчивость к действию апоптогенных факторов и многие другие физиологические функции в организме, оказывающие непосредственное влияние на репаративные процессы в тканях (Miyamoto D. et а!.; 2000,; Suzuki Т. et al., 1995; Van Kampen C„ 1999).

Недавно было показано, что Т-лимфоциты осуществляют защиту не только от внутриклеточных патогенов, но у некоторых видов млекопитающих эти лимфоциты, сенсибилизированные к Ps. aeruginosa, в присутствии данного микроорганизма синтезируют бактерицидные лимфокины по отношению к широкому спектру условнопатогенных микроорганизмов, нередко выделяемых от коров с хроническим гнойно-катаральными эндометритом

Цель и задачи исследований. Целью данной работы было определение возможного существования у Т-лимфоцитов крупного рогатого скота прямой антибактериальной активности к внеклеточным патогенам; изучение иммунопротективной роли Т-лимфоцитов в восстановлении репродуктивной функции у коров после отела, а также выяснение возможности сокращения времени восстановления этой функции посредством активации местного иммунитета тканей матки.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1). Определить возможное существование у Т-лимфоцитов крупного рогатого скота прямой бактерицидной активности по отношению к внеклеточным патогенам. 2). Выяснить роль макрофагов в существовании этой возможной функции у Т-лимфоцитов крупного рогатого скота. 3). Изучить специфичность индукторного и эффекторного звеньев возможного вида иммунитета. 4). Определить конкретные механизмы возможной прямой Т-клеточной антимикробной активности. 5). Провести сравнительное изучение содержания Т-, В-лимфоцитов, Е-РОК и бактерицидной активности Т-клеток периферической крови здоровых коров и коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом. 6). Выявить возможность коррекции местного иммунитета лимфоидной ткани магки у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, с целью стимуляции его противовоспалительного и

репаративного эффекта 7) Сравнить эффективность обработки ИССП и левоэритроциклином коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом по времени прекращения воспалительного процесса, времени от начала лечения до плодотворного осеменения, а также по числу коров, ставших стельными от первого осеменения и за 90 суток. 8). Изучить численность Т-, В-лимфоцитов, Е-РОК, а также бактерицидную активность Т-клеток периферической крови коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом до и после обработки их ИССП.

Научная новизна. Впервые показано, что у крупного рогатого скота: Т-лимфоциты обладают прямой бактерицидной активностью по отношению к внеклеточным патогенам, которая усиливается после специфической ресенсибилизации; антимикробная функция Т-клеток возрастает в присутствии макрофагов; для активации этого вида иммунитета, в отличие от иммунитета к внутриклеточным патогенам, не требуется непосредственного контакта Т-клетки и макрофагов, он осуществляется синтезом макрофагами ИЛ-1; индукторное звено прямого антимикробного иммунитета является специфическим, тогда как эффекторное - неспсцифично и направлено против широкого спектра внеклеточных патогенов; цитотоксическое проявление этого вида иммунитета, в отличие от иммунитета к внутриклеточным патогенам, не требует обязательного контакта Т-лимфоцита и клетки-мишени, а опосредуется синтезом Т-клетками растворимых бактерицидных факторов; Т-лимфоциты способны оказывать прямое антимикробное действие на большинство условнопатогенных микроорганизмов, в том числе и Act. pyogenes, нередко обнаруживаемых в патологическом материале, полученном от коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом; у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, по сравнению со здоровыми коровами, отмечена тенденция снижения прямой бактерицидной активности Т-лимфоцитов периферической крови, а также внутрипопуляционное изменение среди них - снижение общей численности Т-клеток с одновременным увеличением количества Е-РОК; внутриматочная обработка ИССП, по сравнению с аналогичной обработкой

левоэритроциклином коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, оказала сильный противовоспалительный эффект, активировала репаративную регенерацию матки, повысила результативность от первого осеменения, за 90 суток и значительно укоротила период времени от начала лечения до плодотворного осеменения; более сильное протективное действие ИССП, по сравнению с левоэритроциклином, было связано с интенсивным изменением у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, местного и отчасти системного соотношения про- и противовоспалительных цитокинов. У коров, обработанных ИССП, в первые сутки после обработки происходило обострение воспалительного процесса, сопровождающееся увеличением выделения из матки гнойных масс, повышением температуры тела, снижением аппетита, суточного удоя, что было обусловлено действием прововоспапительных цитокинов. Стимуляция восстановления маточных структур после ликвидации воспалительного процесса была связана с активностью противовоспалительных цитокинов, индуцирующих анаболигические процессы в организме и обладающих антиапоптогенным действием; у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, после обработки ИССП, по сравнению с ее началом, отмечено увеличение бактерицидной активности Т-лимфоцитов периферической крови, а также общего их количества, происшедшие, главным образом, за счет возрастания Е-РОК.

Практическая значимость работы. Разработан метод определения прямого антимикробного иммунитета Т-лимфоцитов крупного рогатого скота по отношению к внеклеточным патогенам. Данный метод может бьггь использован в научных исследованиях по изучению этого вида иммунитета в норме и различных патологиях у животных. Определен новый подход в разработке методов иммуномодуляции местного иммунитета тканей матки, проявляющийся в активации антимикробного иммунитета (в том числе и Т-клеточного), а также в усилении репаративной регенерации тканей. Данная разработка может быть использована для дальнейшего совершенствования предложенного подхода иммунокоррекции местного иммунитета лимфоидных тканей матки.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на международной научно-практической конференции РАМЖ, п. Быково, 2003 и 2004 гг.; международной научно-практической конференции ВГНИИЖ, п. Дубровицы, 2004 г.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 7 печатных работах.

Объем работы. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, содержит 17 таблиц и 1 рисунок. Список литературы включает 196 источников, в том числе 176 иностранных.

Основные положения, выносимые на защиту: 1). Т-лимфоциты крупного рогатого скота, как и других видов млекопитающих, обладают прямой бактерицидной активностью к внеклеточным паразитам. Эта активность усиливается после специфической ресенсибилизации, а также в присутствии макрофагов Данное стимулирующее действие макрофагов обусловлено синтезом ими ИЛ-1. 2). Индуюорное звено прямого анiимикробного иммунитета Т-лимфоцитов носит специфический характер, тогда как эффекторное -неспецифично и проявляет бактерицидную активность к широкому спектру внеклеточных патогенов, в том числе и условнопатогенным микроорганизмам, нередко выделяемым из патологического материала, полученного от коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом. 3). Обработка коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, ИССП стимулирует активность местного иммунитета лимфоидных тканей матки, проявляющейся в ликвидации воспалительного процесса и усилении восстановления маточных структур. 4). Главное иммуномодулирующее действие ИССП связано с индукцией ЛПС клеточной стенки Ps. aeruginosa миграции фагоцитарных клеток и лимфоцитов в очаг воспаления и поочередная стимуляция местного и отчасти системного синтеза клетками иммунной системы (в первую очередь Т-

лимфоцитами) про- и противовоспалительных цитокинов, обеспечивающих антивоспалительное и репаративное действие в матке.

2. Материалы и методы исследований

Лабораторные исследования были проведены в Российской академии менеджмента в животноводстве МСХ РФ и НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН. Научно-производственные исследования были проведены в агрофирме "Повадинское" Домодедовского района Московской области. Всего в экспериментах было использовано 116 коров черно-пестрой породы.

Последовательность проведения экспериментов представлена на рис. 1.

Выделение общей популяции лейкоцитов периферической крови крупного рогатого скота осуществляли посредством гемолиза эритроцитов 0,83% раствором хлористого аммония, забуференного трис с ph-7,4 Субпопуляцию мононуклеарных клеток этой крови получали на градиенте плотности фикол-верографина (1,077).

Субпопуляции лимфоцитов, обогащенные Т-, или В-клетками получали посредством их разделения на поверхности пластика, нагруженного антителами к мембранным маркерам этих лимфоцитов соответственно-Thy и mlg (Мейсон Д И др., 1990). Количественное определение: Т-лимфоцитов в периферической крови осуществляли непрямым иммунофлуоресцентным методом с использованием кроличьей антисыворотки к Thy антигену (Young T.J., 1981); В-лимфоцитов в реакции комплементарного розеткообразования (ЕАС-РОК); Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD2 антиген, методом спонтанного розеткообразования (Соколовская И.И. и др., 1985).

В изучении прямой антимикробной активности Т-лимфоцитов (по Maerkham R.B. et al., 1985) использовали интактные либо ресенсибилизированные лимфоциты коров.

Схема исследований

Рис. 1. Изучение антибактериальной активности Т-лимфоцитов и восстановление воспроизводительной функции у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом после обработки ИССП, либо левоэритроциклином.

Ресенсибилизацию лимфоцитов осуществляли посредством инкубации с термоинактивированнной суспензией семи штаммов синегнойной палочки с наиболее распространенными в нашей стране серотипами. Эти штаммы были выделены сотрудниками лаборатории ожоговых инфекций НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи из 1522 клинических штаммов Ps. aeruginosa, полученных из разных регионов России (ТИССП-1). После завершения инкубации лимфоциты отмывали от бактерий и смешивали с равным объемом термоинактивированной суспензии Ps. aeruginosa штамма 1412, входящего в состав ТИССП-1 и имеющего серотип 03, инкубировали, затем лимфоциты вновь отмывали от микробных тел и вносили по 0,1 мл лимфоцитов (4х105 микр. тел/на лунку) в лунки микротитратора с макрофагами или без них, туда же приливали взвесь живых бактерий синегнойной палочки из расчета 1-2x102 клеток/лунку, инкубировали 4 часа при +37°С и 5% С02. Затем содержимое лунок осторожно ресуспендировали, отбирали пробы и высеивали на чашки Петри с мясопептидным агаром (МПА) По разнице числа колоний между контрольными и опытными пробами определяли степень бактерицидной активности лимфоцитов.

В эксперименте по определению специфичности индукторного звена синтеза Т-лимфоцитами крупного рогатого скота бактерицидных лимфокинов ресенсибилизацию лимфоцитов осуществляли термоинактивированной суспензией редковстречающегося штамма Ps. aeruginosa № 1874, Ом серотипа (коллекционный фонд лаборатории ожоговых инфекций НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) - ТИИСП-2. Контрольную группу лимфоцитов ресенсибилизировали ТИИСП-1. В обоих случаях в качестве живых клеток-мишеней использовали штамм 1418.

При изучении специфичности эффекторного звена антимикробной активности Т-лимфоцитов после совместного культивирования в течение трех часов при +37°С и 5% СО; рТ-клеток, макрофагов и микробных тел штамма 1418, собирали надосадочную жидкость, фильтровали ее через фильтр с порами 0,45 мк, разводили двукратно от Г1 до 1:8 и каждую пробу этих разведений

вносили по 0,1 мл в лунки микропланшета, содержащие взвесь микроорганизмов (1хЮ2 клеток на лунку) Staph, aureus, Е. coli. Act. pyogenes, Str. pyogenes, Рь. aeruginosa (Оц серотипа), полученные из коллекции лаборатории ожоговых инфекций НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи. Инкубировали 4 часа при +37°С и затем определяли степень бактерицидное™ Т-лимфокинов.

Эндогенную стимуляцию антимикробной активности Т-лимфоцитов у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом осуществляли посредством внутриматочного введения им инактивированной суспензии семи штаммов синегнойной палочки. Суспензию готовили по методу Мороз А.Ф. и др., 1981.

Научно-производственных опыты проводили на коровах с хроническим гнойно-катаральным эндометритом. Отдельно были отобраны две группы таких коров, инфицированных Act. pyogenes. Этот микроорганизм идентифицировали на селективной среде - МПА с 0,02% содержанием теллурита калия (Тенькова О.В.идр., 1991).

Животным опытных групп внутриматочно вводили четырехкратно с интервалом в 24 часа инактивированную суспензию штаммов синегнойной палочки из расчета 100 мл (108 микр. тел/мл) на одно введение, животным контрольных групп также внутриматочно по такой же схеме вводили левоэритроциклин.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Изучение in vitro у крупного рогатого скота Т-клеточного иммунитета по отношению к штаммам условнопатогенной микрофлоры 3.1.1. Прямое бактерицидное действие Т-клеток крупного рогатого скота по отношению к штаммам синегнойной палочки

Многочисленными исследователями было показано, что Т-лимфоциты крупного рогатого скота (как и других видов млекопитающих) осуществляют ведущую роль как в регуляции клеточного и гуморального иммунитета, так и в эффекторной функции иммунной системы - элиминации клеток, инфицированных внутриклеточными патогенами. В то же время у мышей была обнаружена неклассическая функция этих клеток, проявляющаяся в прямом бактерицидном действии их по отношению к штаммам условнопатогенной микрофлоры (Maerkham R.B et al., 1985). В связи с этим на первом этапе исследований изучали возможность наличия аналогичной функции у Т-клеток крупного рогатого скота.

В данном эксперименте использовали Т-лимфоциты, выделенные от клинически здоровых коров (сухостойный период). Так как монокины, синтезируемые макрофагами, способны в значительной степени усиливать как регуляторную, так и эффекторную функции Т-клеток, то в этом опыте также изучали возможность участия макрофагов в становлении прямой бактерицидной активности Т-лимфоцитов по отношению к одному из типичных представителей условнопатогенной микрофлоры - синегнойной палочке. Результаты этих исследований представлены в табл. 1.

Как видно из данных, представленных в табл. 1, Т-лимфоциты крупного рогатого скота обладают незначительной бактерицидной активностью по отношению к синегнойной папочке. В то же время наметилась тенденция возрастания этой активности в присутствии макрофагов.

Незначительное бактерицидное действие Т-лимфоцитов коров по отношению к синегнойной палочке, установленное в данном эксперименте, в отличие от выявленной ранее аналогичной функции у Т-клеток мышей Markham R. В. et al. (1985), по-видимому, обусловлена тем, что авторы в своих опытах

использовали Т-лимфоциты, выделенные от животных в период становления вторичного иммунного ответа к Ps. aeruginosa, то есть на стадии, близкой к максимальной сенсибилизации Т-клеток к антигенам этого микроорганизма.

Таблица 1

Прямая антибактериальная активность Т-клеток крупного рогатого

скота по отношению к синегнойной палочке

Группы, Мононуклеарные клетки Колонии Ps. aeruginosa

№ число % к контролю

1 Т-клетки 787,8 + 94,3 90,4

2 Т + макрофаги 570,8153,1* 65,5

3 Макрофаги 651,0 + 73,4 74,7

4 Среда 871,5+ 102,0 100,0

* Р< 0,05

Таким образом, вполне вероятно, что в нашем эксперименте инкубации Т-лимфоцитов с синегнойной палочкой недостаточно для интенсивной стимуляции прямой бактерицидной активности этих клеток. В то же время известно, что синегнойная палочка, как и большинство других условнопатогенных микроорганизмов, неотделима от среды обитания животных (Радченков В.П. и др., 1987), то есть взрослые животные, как правило, сенсибилизированы к представителям этой микрофлоры. Исходя из этого, в следующем эксперименте определяли влияние ресенсибилизации ТИССП-1 Т-лимфоцитов на их прямую антимикробную активность. В качестве клеток мишеней использовали штамм 1418 Результаты этих исследований представлены в табл. 2.

Как видно из данных, представленных в табл. 2, нрТ-клетки (как и в предыдущем эксперименте) практически не проявили антибактериальную активность к синегнойной палочке. В то же время они имели сенсибилизацию к этому микроорганизму, так как их ресенсиблизация ТИССП-1 индуцировала проявление этой активности, которая увеличилась по сравнению с контролем на статистически достоверную величину. Присутствие в культуре клеток

макрофагов повысило бактерицидную функцию рТ-клеток на еще большую величину.

Таблица 2

Влияние ресенсибилизации Т-клеток

Группы, Культура клеток Бактериальные колонии

№ число % к контролю

1 нрТ-клетки 845,8 ± 73,4 95,9

2 рТ-клетки 600,0 ± 43,2* 68,1

3 рТ-клетки + макрофаги 171,6 ±24,2" 19,5

4 Среда 881,6 ±96,6 100,0

* -Р<0,05; **-Р<0,01 Таким образом, результаты этого эксперимента показали, что Т-

лимфоциты крупного рогатого скота обладают прямой бактерицидной

активностью к штаммам синегнойной палочки. Эта активность значительно

увеличивается в присутствии макрофагов.

Известно, что макрофаги индуцируют Т-клеточный иммунитет (в том

числе и противоинфекционный) как посредством прямого контакта с Т-клетками

предшественниками ЦТЛ (презентация антигена), так и посредством синтеза

монокинов, главным образом ИЛ-1.

В связи с этим в следующем эксперименте изучали функцию макрофагов в

индукции антибактериального действия Т-лимфоцитов. Результаты этого

эксперимента представлены в табл. 3.

Как видно из данных, представленных в табл.3, антибактериальное

действие Т-лимфицитов в присутствии как макрофагов, так и монокинов, было

практически одинаково. Аналогичная активность Т-клеток была установлена и в

присутствии ИЛ-1 в дозе 5 ЕБ. Разница между 1, 2 и 4 группами была

статистически недостоверна.

Таким образом, усиление антимикробной активности Т-клеток обусловлено не прямым межклеточным взаимодействием, а синтезом макрофагами ИЛ-1.

Таблица 3

Функция макрофагов в становлении прямой бактерицидной ___ активности Т-клеток

Группы, Культура клеток Колонии синегнойной палочки

№ Число % к контролю

1 рТ-клетки + макрофаги 183,9 ±21,3* 21,3

2 рТ-клетки + монокины 220,4 ± 25,2* 25,5

3 рТ-клетки + ИЛ-1 (1ED) 467.2 ± 34.4* 54.1

4 рТ-клетки + ИЛ-1 (5ED) 276,8 ± 20,0* 32,1

5 Среда 863,4 ±98,1 100,0

* - Р < 0,05

Результаты вышеприведенных экспериментов показали, что Т-клетки крупного рогатого скота обладают прямой бактерицидной активностью по отношению к синегнойной палочке. Вместе с тем известно, что в использованном нами выделении мононуклеарных клеток на градиенте плотности фикол-верографина от 16 до 20% получаемых клеток составляют В-лимфоциты. Вполне вероятно, что в наших экспериментах антимикробное действие Т-лимфоцитов может быть частично обусловлено В-клетками.

В связи с этим в следующем эксперименте изучали антимикробную активность субпопуляций лимфоцитов, обогащенных Т- или В-клетками. Результаты эксперимента представлены в табл. 4.

Как видно из данных, представленных в табл. 4, гибель бактерий во второй и третьей группах была практически одинакова, следовательно, бактерицидная активность в данном случае обусловлена действием только макрофагов, В-лимфоциты в этом процессе практически не принимали никакого участия. Напротив, численность микробов в присутствии обогащенной субпопуляции рТ-клеток (1 группа) снизилась на статистически высокодостоверную величину по

сравнению с контролем, она была также значительно ниже, чем выживаемость синегнойной палочки во второй и третьей группах клеток (Р < 0,05).

Таблица 4

Антибактериальная активность субпопуляций лимфоцитов,

Группы, № Культура клеток Колонии Ps. aeruginosa

число % к контролю

1 рТ-клетки (обработка анти-^

сывороткой) 1- макрофаги 140 ±19,2* 29,5

2 рВ-клетки (обработка ТИу-антисы- 310,0 ±26,3 65,1

вороткой) + макрофаги

3 Макрофаги 326,0 ± 28,6 68,5

4 Среда (контроль) 476,4 ±33,1 100,0

* - Р < 0,05

Таким образом, результаты этого эксперимента показали, что ресенсибилизация лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота к синегнойной палочке индуцирует прямую бактерицидную активность Т-, а не В-клеток.

Известно, что классическая эффекторная функция цитотоксических Т-лимфоцитов осуществляется лишь в непосредственном контакте с клеткой мишенью В связи с этим в следующем эксперименте изучали механизм обнаруженного нами бактерицидного действия Т-лимфоцитов у крупного рогатого скота. Для этого лимфоциты культивировали с инактивированной суспензией синегнойной палочки, собирали надосадочную жидкость, очищали ее от клеток и микробов и добавляли к живой суспензии Ps. aeruginosa Результаты эксперимента представлены в табл.5.

Как видно из данных, представленных в табл.5, бактерицидная активность рТ-клеток и надосадочной жидкости была практически одинаковой (разница между группами статистически недостоверна), в тоже время разница в антимикробной активности между этими группами и контрольной группой была

статистически высокодостоверной (Р < 0,01). Следовательно, эффекторным звеном прямого антимикробного иммунитета Т-лимфоцигов крупного рогатого скота является не прямое взаимодействие этого лимфоцита с микробной клеткой, а синтез Т-клетками бактерицидных лимфокинов.

Таблица 5

Бактерицидное действие надосадочной жидкости рТ-клеток __в зависимости от степени её разбавления ___

Группы, № Факторы, индуцирующие бактерицидный эффект Колонии синегнойной палочки

число % к контролю

1 рТ-клетки + макрофаги 194,4 ±23,3* 19,9

Надосадочная жидкость

рТ-лимфоцитов в разведении:

2 1 : 1 222,8 ±19,7* - 22,8

3 1 :2 451,0 ±33,3* 46,1

4 1 :4 662,2 ± 49,2** 68,2

5 1 • 8 821,0 ±94,8 84,0

6 Среда (контроль) 977,4 ± 88,6 100,0

*- Р < 0,05 **- Р<0,01

Результаты экспериментов, представленные в этой главе, показали, что Т-клетки крупного рогатого скота, как и аналогичные лимфоциты мышей, обладают прямым антимикробным действием на внеклеточный патоген. Эта функция Т-клеток не связана с непосредственным их контактом с бактериями, а обусловлена синтезом ими бактерицидных цитокинов. Антибактериальное действие Т-лимфоцитов усиливается в присутствии мак-рофагов. Данная функция макрофагов опосредствуется через синтез ими ИЛ-1

3.1.2. Определение специфичности антимикробного Т-клеточного иммунитета по отношению к штаммам условнопатогенной микрофлоры

Известно, что классические регуляторные и эффекторные функции Т-лимфоцитов имеют специфический характер и рестриктированы по антигенам I или II классов главного локуса гистосовместимости. В то же время неклассический прямой антимикробный Т-клеточный иммунитет, установленный ранее у мышей, хотя также носит специфический характер сенсибилизации, но эффекторные цитокины этого вида иммунитета обладают неспецифической антимикробной активностью по отношению ко многим видам условнопатогенных микроорганизмов.

В связи с этим в следующем эксперименте у крупного рогатого скота изучали специфичность прямого антимикробного Т-клеточного иммунитета и возможное участие в этом процессе макрофагов.

Т-лимфоциты ресенсибилизировали ТИССП-1, либо ТИССП-2. В качестве клеток-мишеней использовали живые бактерии Оэ серотипа. Результаты эксперимента представлены в табл. 6.

Как видно из данных, представленных в табл. 6, во всех трех опытных группах произошло снижение числа бактериальных колоний, причем наибольшее их уменьшение произошло в первой группе. Во второй и третьей группах эта гибель микроорганизмов была практически одинаковой, то есть она была обусловлена лишь антибактериальной активностью макрофагов, но не Т-клеток.

Как показали результаты этого эксперимента, синтез бактерицидных цитокинов происходит лишь при совпадении серотипов, сенсибилизирующих и ресинсибилизирующих штаммов синегнойной палочки. Следовательно, проявление прямой бактерицидной активности у Т-лимфоцитов является строго специфическим. В отличие от Т-клеток у макрофагов этот процесс носит неспецифический характер.

Таблица 6

Специфичность синтеза бактерицидных цитокинов рТ-лимфоцитами

Груп- Рестиму- Серотип тер- Колонии синегнойной

па, ляция Культура клеток моинактиви- палочки

№ рованных число %

бяктепий к контролю

1 ТИССП-1 рТ-клетки + Оз 136,4±22,6 21.3

макрофаги

2 - макрофаги 03 311,9+25,0 48,7

3 ТИССП-2 рТ-клетки + Он 288,7+32,3 45,1

макрофаги

4 - Среда (контроль) 640,2+56,7 100,0

В следующем эксперименте изучали специфичность эффекторного звена прямой антибактериальной активности Т-лимфоцитов. Для этого рТ-клетки инкубировали с макрофагами и термоинактивированным штаммом 03 серотипа, собирали надосадочную жидкость, удаляли Т-клетки, добавляли эту жидкость к культуре штаммов Staph aureus, Е, Coli, Act. pyogenes, Str. pyogenes, Ps. aeruginosa (On серотипа), часто выделяемых от коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, и определяли бактериальную выживаемость. Результаты эксперимента представлены в табл. 7.

Как видно из данных, представленных в табл. 7, бактерицидные лимфокины, синтезируемые рТ-лимфоцитами, полностью подавляют рост Staph, aureus. Е. coli и значительно снизили рост Str. pyogenes, Act. pyogenes и Ps. aeruginosa (P<0,01).

Таким образом, результаты этого эксперимента указывают, что эффекторное звено прямой бактерицидной активности Т-лимфоцитов имеет неспецифический характер, так как рестимуляция штаммом одного вида бактерий вызывает гибель не только других штаммов этого вида, но и других видов и даже представителей других семейств условнопатогенных микроорганизмов.

Таблица 7

Специфичность бактерицидных лимфокинов рТ-лимфоцитов

Количество колоний микроорганизмов

Культу Staph, aureus Е. coli Act. pyogenes Str. pyogenes Ps. aeruginosa

ра клеток число % число % число % число % число %

Г-клетки + макрофа ги Среда 0** 0** 0** 0** 371,9 ±49,4** 37,7 179,6 ±36,8** 20 232,0 ±28,8** 28,8

899,6 ±60,6 100,0 737,6 ±98,8 100,0 986,9 ±49,4 100,0 898,8 ±78,8 100,0 828,8 ±40,0 100,0

Р<0,01

3.2. Клеточный иммунитет у клинически здоровых коров и коров с хроническим эндометритом

Известно, что клеточный иммунитет играет важную роль как в

антимикробном иммунитете, так и в регенерации поврежденных тканей.. Поэтому в следующем эксперименте (табл. 8) было изучено содержание Т- и В-лимфоцитов и Е-РОК в крови коров и коров опытной и контрольной групп.

Таблица 8

Содержание Т- и В-лимфоцитов и Е-РОК в периферической крови здоровых коров и коров с хроническим эндометритом

Лимфоциты от

животных

Здоровых С эндометритом

Т-клетки

Всего подсчитано лимфоцитов

число

2000 2000

из них Т-клетки

1349 1171

67,5± 14,4 58,5±15,6

Е-РОК

Всего подсчитано лимфоцитов

число

1000 1000

из них Е-РОК

130 207

13,0±10,6 20,7± 12,8

В-клетки

Всего подсчитано лимфоцитов

число

2000 2000

из них В-клетки

406 526

20,5±12,8 26,3+13,9

Как видно из данных, представленных в табл. 8, существенной разницы в содержании Т-, В-клеток и Е-РОК в периферической крови у здоровых коров и коров с хроническим эндометритом не обнаружено, хотя у коров с эндометритом и наметилась тенденция в сторону снижения численности Т-лимфоцитов с одновременным увеличением Е-РОК и В-лимфоцитов

.Также в следующем эксперименте при изучении прямой бактерицидной активности Т-клеток здоровых коров и коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом была установлена тенденция уменьшения антимикробной активности Т-клеток у животных второй группы по сравнению с первой. Схожесть в бактерицидной активности Т-клеток периферической крови здоровых и больных коров можег быть связана с тем, что относительно невысокая концентрация микробов в зоне воспаления недостаточна для интенсивной миграции к ней Т-лимфоцитов. Помимо этого известно, что живые бактерии синтезируют факторы, препятствующие адгезии их с клетками иммунной системы.

3.3. Влияние инактивированной суспензии синегнойной палочки на восстановление воспроизводительной функции у коров с хроническим эндометритом

Результаты экспериментов, проведенных выше, показали, что, с одной стороны, ресенсибилизация Т-клеток ТИССП-1 вызывает локальный синтез этими лимфоцитами бактерицидных лимфокинов широкого спектра действия, с другой стороны, данная суспензия стимулирует синтез макрофагами ИЛ-1, одного из ведущих цитокинов, регулирующих регенеративные процессы в организме. Также ранее было показано, что к месту нанесения ТИССП-1 усиливается приток лимфоцитов и фагоцитов (Мороз А.Ф. и др., 1981).

В связи с этим для определения возможности ликвидации воспалительного процесса и восстановления воспроизводительной функции у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом было испытано внутриматочное введение ТИССП-1 Так как в дополнительном эксперименте

было установлено, что большинство штаммов условнопатогенной микрофлоры, выделенных от коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, не были чувствительны к эритромицину и левомицетину, то животных контрольной группы обрабатывали левоэритроциклином. Результаты эксперимента представлены в табл. 9.

Таблица 9

Восстановление воспроизводительной функции у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом после обработки их ТИССП-1

либо левоэритроциклином

Время от начала Стало стельными

Обработка Чис- Время от лечения

ло отела до до при- Плодот- от первого 90 суток

ко- начала хода пер- ворное осеменения

ров лечения вой охоты осемене- чис- % чис- %

(сут.) (сут.) ние (сут.) ло ло

ТИССП-1 16 24,4 ± 1,6 22,0±3,5* 41,1+4,7** 9 56,3±0,4 14 87,5±8,3

Левоэритр 14 25,2±1,6 31,0±1,3* 59,0+6,5* 6 42,8.112,5 10 7!,4±12,1

циклин

* - Р < 0,05, ** - Р < 0,01

Как видно из данных, представленных в табл. 9, время от начала обработки до прихода первой охоты у коров опытной группы снизилось на статистически достоверную величину (Р < 0,05). Время от начала обработки до плодотворного осеменения также снизилось на статистически достоверную величину (Р < 0,01). Число коров, ставших стельными в первую охоту и в течение 90 суток, было выше в группе животных, обработанных ТИССП-1 по сравнению с коровами, обработанными левоэритроциклином. У животных, обработанных ТИССП-1, как правило, на вторые сутки после обработки наблюдали резкое усиление выделения гнойных масс, что свидетельствует об усилении фагоцитарной активности и переходе хронического воспаления в острое. Выделение гнойных масс у животных опытной группы прекращалось обычно на третьи сутки от начала лечения. У коров, обработанных левоэритроциклином, на вторые сутки

после начала лечения наблюдалось незначительное увеличение выделения гнойных масс, прекращение выделения которых происходило на 5-7 сутки после начала обработки.

В связи с тем, что по мнению многочисленных исследователей Act. pyogenes является ведущим микроорганизмом, вызывающим острые и хронические эндометриты, нами были отобраны две группы коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, от которых был выделен этот условнопатогенный микроорганизм Так как в специальном эксперименте нами было установлено, что восстановление воспроизводительной функции у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом было практически одинаково как после обработки ТИССП-1, так и суспензией, инактивированной экторицидом (менее трудоемким процессом), то в этом эксперименте животных опытной группы обрабатывали экторицид-инактивированной суспензией штаммов синегнойной палочки.

Результаты эксперимента представлены в табл. 10.

Таблица 10

Результативность обработки инактивированной суспензией синегнойной палочки либо левоэритроциклином коров, с эндометритом, вызванным Act.

pyogenes

Время от начала Стало стельными

Чис- Время обработки

ло от отела до прихода ДО от первого за 90 сут.

Обработка ко- до начала первой плодотвор- осеменения

ров обработ- охоты ного чис- % чис- %

ки (сут.) (сут.) осеменения (сут.) ло ло

ЭкИССП1 14 26,5±0,4 30,4±2,8** 42,6±5,2 7 50,0±13,3 12 85,8±9,3

Контроль 2 15 26,1±0,3 41,2±2,0** 54,4±4,8 6 40,1±12,6 11 73,3±11,4

т- "инактивация экторицидом ; ~ -обработка левоэритроциклином; ** - Р < 0,01

Как видно из данных, представленных в табл. 10, инактивированная суспензия штаммов синегнойной палочки является эффективным средством ликвидации воспалительного процесса и восстановления репродуктивной функции у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, вызванным Act. pyogenes. Эффективность обработки этим препаратом была выше, нежели результативность обработки левоэритроциклином.

В целях получения более достоверной информации по эффективности обработки инактивированной суспензией Ps. aeruginosa коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом был проведен научно-производственный V

эксперимент, результаты которого представлены в табл. 11

Как видно из данных, представленных в табл. 11, у коров, обработанных инактивированной суспензией штаммов синегнойной палочки, время от начала лечения до прихода первой охоты снизилось в среднем на 10 суток (при статистически достоверной разнице с контролем - Р < 0,01), число коров, ставших стельными в течение 90 суток, увеличилось по сравнению с контрольной группой на 17 суток (Р < 0,05).

Таблица 11

Восстановление воспроизводительной функции у коров с эндометритом, после обработки их инактивированной суспензией

синегнойной палочки либо левоэритроциклином

Время от начала Стало стельными

Чис- Время обработки

ло от отела ДО ДО от первого за 90 су г.

Обработка ко- до начала прихода плодотвор- осеменения

ров обработ- первой ного чис- % числ %

ки охоты осеменения ло о

(сут.) (сут.) (сут.)

Эк ИСП1 43 25,6±0,6 32,±0,8** 42,8±2,9** 23 53,5±7,6 39 90,7+4,4*

Контроль 2 38 25,9±0,6 42,(H3,3** 59,9±4,8** 16 42,1±8,0 23 71,1 ±7,4*

г- инактивация экторицидом; г-обработка левоэритроциклином

* -Р<0,05; **-Р<0,01

Таким образом, установлено, что инактивированная суспензия штаммов синегнойной палочки является эффективным средством ликвидации воспаления и восстановления воспроизводительной функции у коров с хроническим эндометритом.

3.4. Изменение клеточного иммунитета у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом до и после обработки их ИССП-1.

На первом этапе этих исследований изучали изменение прямой бактерицидной активности Т-клеток периферической крови коров до и после обработки их инактивированной суспензией Ps. aeruginosa. Результаты эксперимента представлены в табл. 12.

Таблица 12

Антимикробный Т-клеточный иммунитет у коров, с эндометритом, после

обработки их суспензией синегнойной палочки

Культура клеток Число колоний Act. pyogenes

до обработки после обработки

всего % к контролю всего % к контролю

Среда (контроль) 801,8±90,6 100,0 801,8±90,6 100,0

р7-клетки 706,4±64,0 1 88,1 535,2±47,3 66,7

рТ-клетки+макрофаги 409,8±40,1* 51,1 270,2±19,4* 33,7

* - Р < 0,05 ;1 - td = 2,15

Как видно из данных, представленных в табл. 12, восстановление маточных структур у коров после успешной ликвидации у них гнойно-катарального эндометрита сопровождалось возрастанием прямой бактерицидной активности Т-лимфоцитов (разница близка к статистически достоверной: 1(1 = 2,15), которая значительно возрастала в присутствии макрофагов.

В следующем эксперименте изучали содержание Т-, В-лимфоцитов и Е-РОК в периферической крови коров с эндометритом до и после обработки их инактивированной суспензией штаммов синегнойной палочки. В этом

эксперименте было установлено, что у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, после обработки их инактивированной суспензией штаммов синегнойной палочки наметилась тенденция увеличения в периферической крови количества лимфоцитов, преимущественно - Т, а также Е-РОК.

Таким образом, результаты этих экспериментов показали, что при ликвидации воспаления и стимуляции инволюции половых органов у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом после обработки их инактивированной суспензией Ps. aeruginosa происходит увеличение периферической крови количества Т-лимфоцитов и возрастает их антимикробная активность.

Выводы

1. В иммунитете к внеклеточным патогенам Т-лимфоциты крупного рогатого скота осуществляют не только регуляцию B-клеточного иммунитета, но и оказывают прямое бактерицидное действие на эти патогены.

2. B-лимфоциты крупного рогатого скота, в отличие от Т-лимфоцитов, не оказывают прямого антимикробного действия на внеклеточные патогены, то есть их функция в защите организма от этих патогенов обусловлена только антителогенезом.

3. Макрофаги усиливают прямую бактерицидную активность Т-клеток крупного рогатого скота по отношению к внеклеточным патогенам, но эта их модулирующая функция, как при индукции пролиферации антигенспецифических клонов ЦТЛ к внутриклеточным патогенам, не связана с презентацией антигена, а обусловлена лишь синтезом ИЛ-1.

4. Индукторное звено прямого антимикробного действия Т-лимфоцитов крупного рогатого скота на внеклеточные патогены, как и при формировании ЦТЛ к внутриклеточным патогенам, строго специфично. Напротив, эффекторное звено этого вида иммунитета, по сравнению с иммунитетом к внутриклеточным патогенам, не является специфичным.

5. Прямая бактерицидная функция Т-лимфоцитов крупного рогатого скота по отношению к внеклеточным патогенам, по сравнению с иммунитетом Т-

клеток к внутриклеточным патогенам, не требует прямого контакта Т-клетки и клеч ки-мишени, а опосредуется синтезом Т-лимфоцитами растворимых бактерицидных факторов.

6. У коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, по сравнению со здоровыми коровами, отмечается снижение в периферической крови общего количества Т-лимфоцитов, а также ослабление их прямой бактерицидной активности по отношению к внеклеточному патогену Ps. aeruginosa.

7. Внутриматочная обработка коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом ИССП, по сравнению с обработкой левоэритроциклином, была более эффективной. У коров, обработанных ИССП, по сравнению с коровами, обработанными левоэритроциклином, произошла более быстрая ликвидация воспалительного процесса в эндометрии, процесс инволюции матки завершился быстрее, результативность от первого осеменения и за 90 суток была выше (соответственно на 11% и 21%), а время от начала обработки до плодотворного осеменения короче на 17 суток

8. Обработка коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом ИССП по сравнению с обработкой левоэритроциклином уже на вторые сутки после ее начала резко увеличивала выделение из матки гнойных масс, которое нередко сопровождалось повышением температуры тела, снижением аппетита и суточного удоя. Эти внешние проявления острого воспаления исчезали к 3-4 суткам после обработки, что и стимулировало репаративную регенерацию в маточных структурах.

9. Обработка коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, ИССП, сопровождалась повышением содержания в периферической крови общего количества Т-лимфоцитов а также их субпопуляции, экспрессирующей CD2 антиген. Это увеличение общей численности Т-кпеток произошло, главным образом, за счет количественного роста CD2 Т-лимфоцитов.

10. Иммуномодулирующие свойства ИССП связаны с активацией ЛПС и иными бактериальными антигенами преимущественно местного, поочередного

синтеза лимфоцитами, главным образом Т, провоспалительных и противовоспалительных цитокинов.

Практические предложения

1. Рекомендовать научно-исследовательским учреждениям, занимающимся изучением причин нарушения воспроизводительной функции у коров после отела, а также способов их предупреждения, метод определения прямой антибактериальной активности Т-лимфоцитов по отношению к условнопатогенным микроорганизмам

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Радченков В П, Хлопонин B.C., Мороз А.Ф. Антибактериальная активность Т-лимфоцитов крупного рогатого скота по отношению к Pseudomonas aeruginosa // Доклады РАСХН. 2003, № 4, с.44-47.

2. Радченков В.П., Хлопонин B.C., Мороз А.Ф. Участие макрофагов в прямом антибактеральном иммунитете Т-лимфоцитов крупного рогатого скота к условнопатогенным бактериям. // Вестник РАСХН, 2004, № 4, с.80-82.

3. Радченков В.П , Хлопонин В С., Мороз А.Ф. Бактерицидная активность Т-лимфоцитов коров до и после лечения хронического эндометрита // С-х биология, 2004, № 4, с. 99-102.

4.Радченков В.П , Хлопонин B.C. Клеточные иммунные реакции у коров до и после лечения хронического гнойно-катарального эндометрита // Материалы международной научно-практической конференции «Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» -Быково. - 2003, с.56-57

5.Хлопонин B.C. Т-лимфоциты в восстановлении маточных структур у коров больных хроническим гнойно-катаральным эндометритом // Материалы международной научно-практической конференции «Повышение

конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» -Быково. - 2003, с 54-55.

6. Радченков В П., Хлопонин B.C. Прямая бактерицидная активность Т-лимфоцитов крупного рогатого скота к внеклеточным патогенам // Материалы юбилейной международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию академии «Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» - Быково. - 2004, с. 204-205.

7 Радченков В.П., Хлопонин B.C., Блюма С.Н. Т-лимфоциты в восстановлении воспроизводительной функции у коров // МсЙериалы международной научно-практической конференции «Прошлое, ьис/оящее и будущее зоотехнической науки». - Дубровицы - 2004, т 3, е.. 134-/38'

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл , Подольский р-н, п Дубровицы Тел (8 - 27)65-14-24,(8 - 27)65-14-07

Слано в набор 24 02 2005 Подписано в печать 25 02 2005 _Заказ Л» 5 Печ. л 1,2 Тираж 100 ~>ю_

РНБ Русский фонд

2005-4 45042

? ? f/AP 2135

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хлопонин, Всеволод Серафимович

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Функции и маркеры Т-лимфоцитов.

1.1.1. Иммунологическая толерантность к аутологичным антигенам.

1.1.2. а/р CD2+Т-лимфоциты в иммунобиологическом надзоре организма.

1.1.3. y/8CD2+ Т-клетки и их роль в иммунобиологическом надзоре.

1.1.4. Уникальная субпопуляция у/5 WC1 CD2 Т-лимфоцитов крупного рогатого скота.

1.2. Иммунные факторы в этиологии и патогенезе хронических эндометритов у крупного рогатого скота.

1.2.1. Иммунодепрессия в возникновении и развитии эндометрита у коров.

1.2.2. Клеточный иммунитет в этиологии и патогенезе эндометритов у коров.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Т-лимфоциты в восстановлении воспроизводительной функции у коров после отела"

Актуальность темы. Увеличение продуктивности в молочном скотоводстве в значительной степени зависит от сокращения времени от отела до плодотворного осеменения. Это удлинение сервис-периода часто обусловлено возникновением у коров в послеотельный период воспалительных процессов в половых путях. В этой форме нарушения репродуктивной функции значительный удельный вес принадлежит хроническим гнойно-катаральным эндометритам (8,99).

Несмотря на многообразие экзо- и эндогенных факторов, вызывающих увеличение сервис-периода у крупного рогатого скота, непосредственной их причиной, является угнетение иммунной системы и в первую очередь местного иммунитета тканей половых путей. Подавление активности лимфоидной ткани матки снижает ее репаративную регенерацию и способствует колонизации ее условнопатогенной микрофлорой. Данная микрофлора, синтезируя факторы патогенности (эндо-, экзотоксины и др.), усиливает эту иммунодепрессию (29, 190).

В настоящее время существует большое количество способов ликвидации воспаления и восстановления воспроизводительной функции у коров с хроническими гнойно-катаральными эндометритами. Большинство этих способов основано на применении антимикробных препаратов. Существенным недостатком их является высокая устойчивость к ним штаммов условнопатогенных микроорганизмов, а также их иммунодепрессивное действие (68, 84). В связи с этим наиболее перспективным направлением в профилактике и ликвидации эндометритов у коров считают разработку способов восстановления активности местного иммунитета тканей матки (79, 106).

Известно, что Т-лимфоциты осуществляют важную роль в регуляции практически всех звеньев иммунитета. В частности, они сами синтезируют и регулируют синтез другими клетками про- и противовоспалительных цитокинов. Соотношение этих цитокинов определяет направленность обменных процессов в клетках, их устойчивость к действию апоптогенных факторов и многие другие физиологические функции в организме, оказывающие непосредственное влияние на репаративные процессы в тканях (131, 168, 174).

Недавно было показано, что Т-лимфоциты некоторых видов млекопитающих оказывают антимикробное действие к Ps. aeruginosa (внеклеточный патоген) не только опосредованно через активацию и регуляцию антителогенеза, но и осуществляют прямое бактерицидное действие на штаммы этого микроорганизма. Важной особенностью этого иммунитета является специфичность его индукторного звена и неспецифичность - эффекторного. Так, ресенсибилизирующий штамм Ps. aeruginosa вызывает синтез Т-лимфоцитами бактерицидных факторов к широкому спектру штаммов не только других видов, но даже родов и семейств условнопатогенных микроорганизмов (122, 100).

Известно, что липолиполисахарид клеточной стенки синегнойной палочки (как и других грамотрицательных бактерий) является природным иммуномодулятором, способным оказывать существенное влияние на соотношение про- и противовоспалительных цитокинов (63, 181). Соотношение этих про- и противовоспалительных цитокинов определяет не только направленность иммунного ответа, но и интенсивность регенеративных процессов в тканях.

Таким образом, иммуномодулирующий препарат на основе инактивированных штаммов Ps. aeruginosa может стимулировать восстановление воспроизводительную функцию у коров после отела (в том числе и у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом) посредством активации местного иммунитета лимфоидной ткани матки, индуцирующего ликвидацию воспаления и стимулирующего репаративные процессы в маточных структурах.

Научная новизна. Впервые показано, что у крупного рогатого скота:

- Т-лимфоциты обладают прямой бактерицидной активностью по отношению к внеклеточным патогенам, которая усиливается после специфической ресенсибилизации;

- эта антимикробная функция Т-клеток возрастает в присутствии макрофагов;

- для активации этого вида иммунитета, в отличие от иммунитета к внутриклеточным патогенам, не требуется непосредственного контакта Т-клетки и макрофагов. Он осуществляется синтезом макрофагами ИЛ-1;

- индукторное звено прямого антимикробного иммунитета является специфическим, тогда как эффекторное - неспецифично и направлено против широкого спектра внеклеточных патогенов;

- цитотоксическое проявление этого вида иммунитета, в отличие от иммунитета к внутриклеточным патогенам, не требует обязательного контакта Т-лимфоцита и клетки-мишени, а опосредуется синтезом Т-клетками растворимых бактерицидных факторов;

- Т-лимфоциты способны оказывать прямое антимикробное действие на большинство условнопатогенных микроорганизмов, в том числе и Act. pyogenes, нередко обнаруживаемых в патологическом материале, полученном от коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом;

- у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, по сравнению со здоровыми коровами, отмечена тенденция снижения прямой бактерицидной активности Т-лимфоцитов периферической крови, а также внутрипопуляционное изменение среди них - снижение общей численности Т-клеток с одновременным увеличением количества Е-РОК;

- внутриматочная обработка ИССП, по сравнению с аналогичной обработкой левоэритроциклином коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, оказала сильный противовоспалительный эффект, сильнее активировала репаративную регенерацию матки, повысила результативность от первого осеменения, за 90 суток и значительно укоротила период времени от начала лечения до плодотворного осеменения;

- более сильное протективное действие ИССП, по сравнению с левоэритроциклином, было связано с интенсивным изменением у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, местного и отчасти системного соотношения про- и противовоспалительных цитокинов. У коров, обработанных ИССП, в первые сутки после обработки происходило обострение воспалительного процесса, сопровождающееся увеличением выделения из матки гнойных масс, повышением температуры тела, снижением аппетита, суточного удоя, что было обусловлено действием прововоспалительных цитокинов. Стимуляция восстановления маточных структур после ликвидации воспалительного процесса была связана с активностью противовоспалительных цитокинов, индуцирующих анаболитические процессы в организме и обладающих антиапоптогенным действием;

- у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, после обработки ИССП, по сравнению с ее началом, отмечено увеличение бактерицидной активности Т-лимфоцитов периферической крови, а также общего их количества, происшедшие, главным образом, за счет возрастания Е-РОК.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы было определение возможного существования у Т-лимфоцитов крупного рогатого скота прямой антибактериальной активности к внеклеточным патогенам; изучение иммунопротективной роли Т-лимфоцитов в восстановлении репродуктивной функции у коров после отела; а также выяснение возможности сокращения времени восстановления этой функции посредством активации местного иммунитета тканей матки.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Определить возможное существование у Т-лимфоцитов крупного рогатого скота прямой бактерицидной активности по отношению к внеклеточным патогенам.

1. Выяснить роль макрофагов в существовании этой возможной функции у Т-лимфоцитов крупного рогатого скота.

2. Изучить специфичность индукторного и эффекторного звеньев этого возможного вида иммунитета.

3. Определить конкретные механизмы этой возможной Т-клеточной антимикробной активности.

4. Провести сравнительное изучение содержания Т-, В-лимфоцитов, Е-РОК и бактерицидной активности Т-клеток периферической крови здоровых коров и коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом.

5. Выявить возможность коррекции местного иммунитета лимфоидной ткани матки у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, с целью стимуляции его противовоспалительного и репаративного эффекта.

6. Сравнить эффективность обработки ИССП и левоэритроциклином коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, по времени прекращения воспалительного процесса, времени от начала лечения до плодотворного осеменения, а также по числу коров, ставших стельными от первого осеменения и за 90 суток.

7. Изучить численность Т-, В-лимфоцитов, Е-РОК, а также бактерицидную активность Т-клеток периферической крови коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, до и после обработки их ИССП.

Практическая значимость работы. Разработан метод определения прямого антимикробного иммунитета Т-лимфоцитов крупного рогатого скота по отношению к внеклеточным патогенам, Данный метод может быть использован в научных исследованиях по изучению этого вида иммунитета в норме и различных патологиях у животных. Создан новый подход в разработке методов иммунодуляции местного иммунитета тканей матки, проявляющийся в активации антимикробного иммунитета (в том числе и Т-клеточного), а также в усилении репаративной регенерации в этих тканях. Данная разработка может быть использована для дальнейшего совершенствования предложенного подхода иммунокоррекции местного иммунитета лимфоидных тканей матки.

Основные положения, выносимые на защиту: Т-лимфоциты крупного рогатого скота, как и других видов млекопитающих, обладают прямой бактерицидной активностью к внеклеточным паразитам. Эта активность усиливается после специфической ресенсибилизации, а также в присутствии макрофагов. Данное стимулирующее действие макрофагов обусловлено синтезом ими ИЛ-1.

Индукторное звено прямого антимикробного иммунитета Т-лимфоцитов носит специфический характер, тогда как эффекторное -неспецифично и проявляет бактерицидную активность к широкому спектру внеклеточных патогенов, в том числе и условнопатогенным микроорганизмам, нередко выделяемым из патологического материала, полученного от коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом.

Обработка коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, ИССП стимулирует активность местного иммунитета лимфоидных тканей матки, проявляющейся в ликвидации воспалительного процесса и усилении восстановления маточных структур.

Главное иммуномодулирующее действие ИССП связано с индукцией ЛПС клеточной стенки Ps. aeruginosa миграции фагоцитарных клеток и лимфоцитов в очаг воспаления и поочередная стимуляция местного и отчасти системного синтеза клетками иммунной системы (в первую очередь Т-лимфоцитами) про- и противовоспалительных цитокинов, обеспечивающих антивоспалительное и репаративное действие в матке.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на международной научно-практической конференции ФГОУ РАМЖ «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», 2003 и 2004 гг., п. Быково Московской обл.; международной научно-практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки» ВГНИИЖ, п. Дубровицы, 2004 г.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 7 печатных работах.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Хлопонин, Всеволод Серафимович

Выводы

1. В иммунитете к внеклеточным патогенам Т-лимфоциты крупного рогатого скота осуществляют не только регуляцию В-клеточного иммунитета, но и оказывают прямое бактерицидное действие на эти патогены.

2. В-лимфоциты крупного рогатого скота, в отличие от Т-лимфоцитов, не оказывают прямого антимикробного действия на внеклеточные патогены, то есть их функция в защите организма от этих патогенов обусловлена только антителогенезом.

5. Прямая бактерицидная функция Т-лимфоцитов крупного рогатого скота по отношению к внеклеточным патогенам, по сравнению с иммунитетом Т-клеток к внутриклеточным патогенам, не требует прямого контакта Т-клетки и клетки-мишени, а опосредуется синтезом Т-лимфоцитами растворимых бактерицидных факторов.

9. Обработка коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, ИССП, сопровождалась повышением содержания в периферической крови общего количества Т-лимфоцитов а также их субпопуляции, экспрессирующей CD2 антиген. Это увеличение общей численности Т-клеток произошло, главным образом, за счет количественного роста CD2 Т-лимфоцитов.

10. Иммуномодулирующие свойства ИССП связаны с активацией ЛПС и иными бактериальными антигенами преимущественно местного, поочередного синтеза лимфоцитами, главным образом Т, провоспалительных и противовоспалительных цитокинов.

Практические предложения

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хлопонин, Всеволод Серафимович, п. Быково Моск. обл

1. Белоновская М.Ф., Скандарян С.Т., Телегин Т.Б. Цитохимические исследования крови коров с острым гнойно-катаральным эндометритом. // Вопр. физ-хим. биол. в веет., 1997, с. 19-22.

2. Ивановский А.Л. Новый пробиотик бактоцеллолактин при различных патологиях у животных. // Ветеринария, 1996, №11, с.84-85.

3. Кремлев Е.П., Бонакова Л.А., Ткаченко Ю.Г. Йодсодержащие препараты при эндометрите. // Ветеринария, 1985, №1, с.49-51.

4. Лучко М.А., Тенькова О.В. Патогенность и вирулентность Actinomyces pyogenes для белых мышей. // Тез. докл. IV Всесоюз. конф. «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов». М., 1991, с.88-89.

5. Макаренкова В.П., Кост Н.В. Щурин М.Р. Система дендритных клеток: роль в индукции иммунитета и в патогенезе инфекционных, аутоиммунных и онкологических заболеваний. // Иммунология, 2003, т.23, №2, с.68-76.

6. Мейсон Д., Пенхейн Д., Седжуик Д. Выделение различных субпопуляций лимфоцитов. В кн: «Лимфоциты. Методы». М. Мир, 1990, с. 69-95.

7. Мороз А.Ф., Анциферова Н.Г., Радкевич С.А. Получение и экспериментальное изучение поливалентной вакцины для профилактики инфекций, обусловленных синегнойной палочкой. Сообщение II. // ЖМЭИ, 1981, №10, с.73-80.

8. Нежданов А.Г. Иноземцев В.П. Акушерско- гинекологические болезни коров (диагностика и лечение). // Ветеринария, 1996, №9, с 9-15

9. Пащенков М.В. Пинегин Б.В. Роль дендритных клеток в регуляции иммунного ответа. // Иммунология, 2002, v23, №5, с.313-321.

10. Ю.Радченков В.П. Соколовская И.И. Розеткообразующие лимфоциты крупного рогатого скота и рациональные методы их выявления. // С-х биология, 1983, №12, с.87-91.

11. Радченков В.П., Литвинов И.С. Маркеры и функции крупного рогатого скота. // С-х биология, 1987, №12, с. 115-123.

12. Радченков В.П., Михайленко Е.В., Богданова Н.В., Турко Т.И. Повышение эмбриональной выживаемости у коров, иммунизированных спермиями быков. // Доклады РАСХН, 2000, №1, с.35-37.

13. Радченков В.П., Радкевич С.А. Литвинов И.С., Мороз А.Ф. Оценка этиологической роли синегнойной палочки в пренатальных потерях у крупного рогатого скота. // С-х биология, 1987, №1, с.91-96.

14. Соколовская И.И., Бронская А.В., Субботин А.Д., Ойвадис Р.Н., Радченков В.П., Абилов А.И., Соловьева Н.П., Таг Т.Н., Осадчук B.C., Федорова М.Е. Методические рекомендации по иммунологии воспроизведения. //Дубровицы, 1985, с.76.

15. Тенькова О.В., Иренков И.П., Лучко М.А., Методические указания по выделению и идентификации Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes при патологии репродуктивных органов у крупного рогатого скота. // Москва, 1991, с8.

16. Тришкина Е.Т., Галушко Л.Х., Микробный фактор в этиологии послеродового эндометрита. // Ветеринария, 1985, №11, с.52-53.

17. Фонталин Л.Н. Молекулярно-клеточные механизмы иммунологической толерантности. // М., Наука, 1994. с.104.

18. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах. // Иммунология, 1996, №6, с. 10-23.

19. Aksemgest S.P., Taverue М.А., Boosman R. Peripheral acute phase protein serum amyloid A concentration in plasma of cow and fetuses. // Amer. J. Vet. Res., 1993, v54, pp.164-167.

20. Amin J.D., Zaria C.T., Malgvi P.M. Vaginal aerobic bacterial flora of apparently healthy in various of reproductive cycle. // Bull. Anim. Healt. and Prod. Afr., 1996, v44, pp,15-18.

21. Arthur L.H., Nookes D.A., Pearson H. Vet. Reprod. Obset (theriogenology), London , 1982, v32, pp.501.

22. Asai K., Komine Y., Kozutsumi T. Predominant subpopulation of T-lymphocytes in mamary gland secretions during lactation. // Vet. Immunol., Immunopath., 2000, v73, pp.232-240.

23. Baldwin C.L., Sathiyaseclan Т., Rocci M. Rapid changes occur in the percentage of cirelanting bovine WC1+ у5 WC1+ Thl. // Res. Vet. Sci., 2000, v99, pp.175-180.

24. Banaroch P., Jilla M., Rapaso L. How MHC class II molecules reach the endocytic pathway.// EMBOI., 1995, vl4, pp,37-49.

25. Banchereaw J. Steinman K.M. Dendritic cell and control of immunity. // Nature, 1998, v392, pp.245-262.

26. Banderia A., Itohara S., Bonnevilly M. Extrathymic origin of intestinal intraepithelial lymphocytes bearing T-cell antigen receptor 70. // Proc. Natl. Acad., Sci. USA, 1991, v88, pp.43-56.

27. Beadley K.W., Gockel C.M. Regulation of innate and adoptive immunity by female sex hormones oestradiol and progesterone. // FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2003, v38, pp.13-22.

28. Bekana M., Jonsson P., Ekman T. Intrauterine bacteria finding in post partum cows with fetal membranes. // J. Vet. Med. Ser. A., 1994, v41, pp.663-670.

29. Bently L.A., Marinzza R.A. The structure of the T-cell antigen receptor. // Annu. Rev. Immunol., 1996, vl5, pp.563-590.

30. Bluestone J.A., Pardoll D., Sharrow S.O. Characterization of murine thymocytes with CD3-associated receptor structures. // Nature, 1987, v 326, pp.84-84.

31. Bochmer H., Aifantis J., Azonic O. Crucial function of the pre T-cell receptor (TCR) in TCR (3 allelic exclusion and a/(3 versus 7T lineage commitment. // Immunal Rev., 1998, vl65, pp.111-119.

32. Bois C.H.W. Uterine cultures and their interpretation. // In.: Current therapy in theriogenology. ( ed. Narrow D.A., Slander W.B.) CVS Press, 1986, pp.422-423.

33. Boismenu R., Hovaran W.L. Modulation of epithelial cell growth by intraepithelial 75 T-cell. // Science, 1994, v286, pp.1253-1255.

34. Boom W.H., Chervenak K.A. Role of the mononuclear phagocyte as antigen-presenting cell for human 76T-cells activated by live Mycobacterium tuberculosis. // Inf. Immunol., 1992, v60, pp.3480-3492.

35. Bounjellab N., Cha-Tang C., Li X. Interleukin 8 response by bovine mammary epithelial cells to lipopolysaceharide stimulation. // Amer. J. Vet. Res., 1998, v59, pp.1563-1567.

36. Brector C.D., Dinarillo E.A., Saper C.B. Interliukin-I immunoreactive innervation of human hyponalamus. // Science, 1988, v 240, № 4850, pp.321-324.

37. Brezlaff K.N. Results a clinical trial using chloramphenicol for treatment of retained fetal membranes in diary cows. // Proc. Theoriogenology, 1982, vl7, pp.72-76.

38. Britton A.C., Johnson W.H., Miller R.B. Ultra structural assessment of blastocyst recovered from cow with subclinical purulent endometritis. // Theoriogenology, 1988, v29, pp.671-680.

39. Brown W.C., Allison C. R-F., Ester D.M. Bovine type 1 and types 2 responses. //Vet. Immunol. Immunopath., 1998, v63, №1-2, pp.45-65.

40. Brown W.C.,., Rejman I.I., Chen H.T. Regulation of bovine IL-1 receptor. // Vet. Immunol., Immunophathol., 1998., v63, №1-2, pp. 25-29.

41. Bucy B.T., Panaskaltsis-Mortary A., Huang L. Heterogeneity of single cell cytokine gene expression in clonal T-cell population. // J. Exp. Med., 1994, vl80, pp. 1251-1262.

42. Cai T-L., Weston P.L., Lund L.A., Associated between neutrophil functions and per parturient discords in cows. // Am. Vet. Res., 1994, vl5, pp.934943.

43. Carr M.M., Howard C.J., Soop P. Expression on the poreine 78 lymphocytes of the phylogenetically conserved surface antigen previously restricted in expression to ruminant y<5 T-lymphocytes. // Immunology, 1994, v81, pp.36-40.

44. Chang T.L., Shea C.M., Urioste K. Heterogeneity of helper/inducter T-lymphocytes. Ill Responses of IL-2 and IL-4 producing (Thl and Th2) clones to antigen presented by different accessory cells. // J. of Immunol., 1990, vl45, pp.2803-2814.

45. Chang T.L., Wu T.S., Liao N-S. Production of IL-12 and IL-18 in human dendritic cells upon infection Listeria monocytogenes. // FEMS. Immunol., Med. Microbiol., 2003, v35, pp.255-262.

46. Chirto-Kown C.L., Knef B.J., Brown W.C. Interleukin-10 down regulates proliferation and expression of interleukin-2 receptor p55 chain and interferon-y but not interleukin-2 or interleukin-4 by parasite specific helper

47. T-cell clones obtain from chronically infected with Balesia bovis or fasciola hepatica. // Interferon Cytokine Res., 1995, vl5, pp.915-922.

48. Chn C-l, Chen S.S., Wu T.S. Kne S-C. Differentational effect of IL-2 and IL-15 on the death and survival of activated TCR уд + intestinal intraepitenal lymphocytes. // J. of Immunology, 1999, vl62, №4, pp. 1896-1903.

49. Clevers H., Alarcon В., Wileman T. The cell receptor/ CD complex: a dynamic protein ensemble. // Annu. Rev. Immunol., 1998, v 6, pp.629-662.

50. Clevers H., MacHung N.D., bensaid A. Identification of bovine surface antigen expressed in CD8" T-cell receptor 76 T-lymphocytes. // Eur.J. Immun., 1990, v20, pp.809-817.

51. Clevers H., Machung N.F., Bensaid S. Identification of bovine surface antigen unique expressed onCD4" CD8* T-cell receptor 76T lymphocytes. // Exp. J. Immunol., 1990, v20, pp.809-817.

52. Colb S.P., Watson E.D. Immunohistochemical study of immune cells in the bovine endometrium at different stages of estrus cycle. // Res. Vet. Sci., 1995, v59, pp.238-241.

53. Collins R.A., Sopp P., Lelder K.J Bovine yd TeR lymphocytes are stimulated to proliferate by antologus Thileria annulata infected cell in the presence of interleukin-2. // Scand. I. Immunol., 1986, v44, pp.444-452.

54. Crocer J., Sopp W.C., Pason K. Analysis of the yd T-cell restricted antigen WC1. // Vet. Immunol., Immunipath., 1991, v39, pp. 137-144.

55. David C. Les metrics chroniques de la vache laitiere: bilan bactoriologique. //Point. Vet., 1986, v99, pp.414-417.

56. Davis W.C., Davis J.E., Hamilton M.J. Use of monoclonal antibodies that specific for TCR. // Vet. Immunol., Immunopath., 1996, v52, pp.273-283.

57. Davis W.C., Hamilton M.J. Comparison of unique characteristics of immune system in different species of mammals. // Vet. Immunol., Immunopath., 1998, v63, №1-2, pp,7-13/

58. Davis W.C., Zuckermann F.A., Hamilton M.J. Use of monoclonal antibodies that recognize 75/null cell. // Vet. Immunol., Immunopaph., 1998, v60, pp.305-316.

59. Dayer J.M. Regnlation of JL -1/ TNF, their natural inhibitor and other cytokines inflammation/ // Immunologist., 1997, v5, №6, pp. 192-196.

60. De Kruff R.N., lien R., Umetsn D.T. Antigen-deriven but not lipopolysacecharde driven IL-12-production on macrophage regured triggering of CD40. //1, of Immunol., 1997, vl57, №1, pp.359-366.

61. Deep V.D., Parvizi N. Pregnancy stimulates secretions of adrenocorticotropin and nitric oxide from peripheral bovine lymphocytes. // Biol. Reprod., 2001, v64, pp. 242-243.

62. Deil F., Asherson L.I. IL-4 is essential for the systemic transfer of delayed hypersensitivity by T-cell lines. / Inf. Immunol., 1994, vl52, №6, pp.26982704.

63. Dettellenx J.C., Kehrli M.C., Stabel J.R. Study of immunological dysfunction in per parturient Holstein cattle selected for high and average milk production. // Vet. Immunol., immunopath., 1995, v3/4, pp.251-267.

64. Dosogne H., Burvenich C., Freedman A.F. Pregnancy associated glycoprotein and decreased polymorphnonuvclear leukocyte function in early post partum diary cows. // Vet. Immunol., Immunopath., 1999, v87, pp.47-54.

65. Dosogne H., Hoelen D., Lohus J. Effect of cepharin on the phagocytie and respiratory burst activity of neutrophil leucocytes bovine blood. // J. Vet. Pharmacol., Thearap., 1998, v21, pp.421-427.

66. Estes D.M., Brown W.C., Hirano A. C40 Ligand-dependent signaling of bovine /^-lymphocyte development and differentiation. // Vet. Immunol., Immunopaph., 1998, v68, №1-2, pp. 15-20.

67. Fearson D.T., Carter R.H. The CD 19 / TAPA-1 complex of/3-lymphocytes: linking natural to acquired immunity. // Annu. Rev. Immunol., 1995, vl3, pp.129-149.

68. Feruander F.A., Logan S.M., Lee S.M. Elevated levels of Legionella pneumophila stress protein Hsp60 early in infection on human monocytes and L 929 cell correlate with virulence. // Inf. Immunol., 1996, v64, pp.1968-1976.

69. Fikri Y., Nyabend J., Denis M. Purification and characterization of bovine WC1+ 76 T-lymphocytes from peripheral blood. //Vet. Res., 2000, v31, pp.229-239.

70. Flesh J., Harel W., Nelken D. Immunopontetiating effect on levamisole in prevention of bovine endometritis. // Vet. Rec., 1982, vl 11, pp.56-57.

71. Gilbert R.O., Grohn P.M., Miller Y.T. Effect of parity on periparturient nentrophil function in dairy cows. // Vet. Immunol., Immunopath., 1993, v36, pp.75-82.

72. Griffith T.S., Brunner S.M., Fletcher D.R. FAS ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege. // Science, 1995, v270, pp. 1189-1192.

73. Haeck J., Wagner H., Proliferative and cytolytic responses of human 78 T-cell display a distened specificity pattern. // J. of Immunol., 1994, v81, №4, pp.564-568.

74. Hartigan P.S. The role of uterine pathology in infertility in clinically normal dairy cows. // Animal health and machine milking (ed. О'Shea) Ireland, MRC, 1986, pp,37-53.

75. Harving S., Kokryakob V., Swiderek K. Protein-1 an exceptionally praline-rich antimicrobial peptid from porcine leucocytes. // FEBS Lett., 1995, v362, №1, pp.65-69.

76. Hassain A.M., Daniel R.C. Bovine endometritis: current and future alternative therapy. // J. Vet. Med. Ser, A, 1991, v38, pp.641-691.

77. Hein W., MacKey C.R. Prominence of yd T-cell in the ruminant immune system. //Immunol. Today, 1991, vl2, pp.30-34.

78. Hein W.R., Dudler L. TCR 7T cells are prominent in normal bovine skin and express a diverse receptor of antigen receptor. // Immunology, 1997, v91, pp.5 8-64.

79. Heyborne К., Fu Y-X., Nelson A. Recognition of trophoblasts by уд T-cells. // J.of Immunol., 1994, vl53, pp.2918-2928.

80. Hirano A., Wendy C., Trigona W. kinetics of expression and subset distribution of TNF super family member CD40 ligand and FAS on T-lymphocytes. // Vet. Immunol., Immunipath., 1998, v61, pp.251-263.

81. Hoelen D., Dosogne H., Heyneman R. Influence of antibodies on phagocytes and respiratory burst bovine polymorphnonuvclear leukocytes. // Eur. J. Pharmacol., 1997, v332, pp.289-297.

82. Hoelen D., Heyneman R., Burveneh C. Antibiotics commonly used to treatment mastitis and respiratory burst of bovine polymorphnonuvclear leukocytes. //J. Dairy Sci., 1998, v81, pp.403-411.

83. Horadagoda W.N., Knox K.M., Libbs H.A. Acuta phase protein in cattle. // Vet. Rec., 1999, vl44, pp.437-441.

84. Hosken N.A., Shibugna A., Heat A.W., Murpry K.M. The effect of antigen dose on CD4+ helper T-cell phenotype development in a T-cell receptor-alpha-beta-transgenic model. // J. Exp. Med., 1995, vl82, pp.1379-1384/

85. Howard C.J., Hope J.C. Dendric cells implication on function from of afferent lymph veiled cell. // Vet. Immunol., Immunopath., 2000, v77, №12. pp.11-13.

86. Jaines E.M., Kaufmann S.L. Activation of убТ-cell in primary immune response to Mycobacterium tuberculosis. // Science, 1989, v244, pp.713714.

87. Jensen E.R., Llass A.A., Clark W.R., Wing E.J. Fas (CD95)-dependent cell-mediated immunity to Listeria monocytogenes. // Inf., Immunol. 1998, v66, №9, pp.4143-4150.

88. Jerret J.V., McOrist S., Browning J.M. Diagnostic studies of the fetus placenta and maternal blood 265 bovine abortions. // Cornell. Veterin., 1984, v74, pp. 8-20/

89. Jnokuma H. Changes of peripheral blood lymphocyte subclasses of Japanese Black neuborn calves. // Anim. Sci. Technol., 1997, v68, pp.84-87.

90. Kabelits D. Function and specificity of human 76 positive T-cell. // Crit. Rev. Immunol., 1992, vl 1, №5, pp.281-303.

91. Kask K., kidahl H., Magnusson U., Uterine bacteriology, prostaglandin F2a metabolic and progesterone profiles, blood granulocyte function in post parturn cows. // Acta. Vet. Baltica, 2000, №3, pp. 22-30.

92. Kask K., Kindahl H., Lustafsson H. Bacteriological and histological investigation of the post partum bovine uterus in diary herds. // Acta. Vet. Scand., 1998, v39, pp.423-432/

93. Kask K., Kyrikin J., Lindjaru R. Assessment of early post partum reproductive performance in two high producing Estonian dairy herds. // Acta. Vet. Scand., 2003, v44, pp.131-134.

94. Kaufmann S.H., Immunity to intracellular bacteria. // Ann. Rev. Immunol., 1993, vl 1, pp.129-163.

95. Kimura K., Goff J.P., Kehri M.E. Phenotype analysis peripheral blood monouclear cells in periparturient dairy cows. // J. Dairy. Sci., 1999, v82, pp.3315-319.

96. Kirkham P.A., Takamatsu H., Growth arrest of 76 T-cell induced by monoclonal antibody against WC1. // Eur. J. Immunol., 1997, v27, pp.717725.

97. Knitter M.R., Liilow K., Seelig A., Howard J.C., MHS class to transporter associated with antigen processing. // J. of Immunology, 1998, vl61. №11, pp.5967-5977.

98. Komani-Komo M.W., Lracie J.A., Wei X.Y. Chemo attraction of human T-cell by IL-18. // Immunol. Lett. 2003, v87,№l-3, pp.106-107.

99. Kronenberg M. Antigens recognized by yST-cell // Curr. Opinion. Immunol., 1994, v6, №1, pp.64-71.

100. Kummer V., Lang P., Maskova I. Stimulation of cell defense mechanism of bovine endometrium by colonization with selected strains of lactobacilli. // Vet. Med., 1997, v42, pp.217-224.

101. Lalligam C.L., Coober B.L. Interleukin 8 on bovine neutrophil function in vitro. // Dairy Res. Rep., Gnelph., 1994, pp. 12-14.

102. Lan D.T. Taniguchi В., Makino S., Shirahaka T. Role of endogenous tumor necrosis factor alpha and gamma interferon in resistance to Corynobacterium psendotuberculosis- infection in mice. // Microb. Immunol., 1998, v42, №12, pp.863-870.

103. Larcia K.C., Degano M., Stanfield R.L. An a/(3 T-cell receptor structure at 2,5 A and its orientation in the TCK-MHC complex. // Science, 1996, v274, pp.209-219.

104. Larduno F.A., Larduno E., Hofmann P.S. Surface associated hsp-60 chaperon of Ligionella pnenmophila mediated invasion in Hella cell model. // Inf. Immunol., 1998, v66, №10, pp.4602-4610.

105. Lee C.S., Wooding F.B., Morgan I. Initiative analysis throughout pregnancy of intraepithelial large granular and no granular lymphocyte distribution in the synepitheliochoril placenta of the cow. // Placenta. 1997, vl8, pp.675-681.

106. Lenhov D.J., Wallnanes T.L., Blenstone J.A. CD26/b7 system of T-cell costimulation. // Ann. Rev. Immunol., 1996, vl4, pp.233-258.

107. Li L., Jell C., Beavo J.A. CD28 dependent induction of PDF7 reqnred for T-cell activation. // Science, 1999, v283, №5403, pp. 848-850.

108. Licence S.T., Davis W.C., Carr M.M. The behavior of monoclonal antibodies in first International pig Workship reacting with уб/null Tlymphocytes in the blood of SLAB/b line pig. // Vet. Immunol., Immunipath., 1995, v47, pp.253-271.

109. London C.A., Abbas A.K., Kelso A. Helper T-cell subsets: heterogeneity function and development. // Vet. Immunol., Immunopath., 1998, v63, №1-2, pp.37-42.

110. Lorivodsky M., Zenlak J., Orenstein H. TNF-o; messenger RNA and protein expression in the interoplacental unit mice with pregnancy loss. // J. Immunol., 1998, vl60, pp, 4280-4288.

111. Lronx H.A., Carra M., Bigler A., Ronsean M., CD+ T-cell subset inhibits antigen-specific T-cell responses and prevent colitis. // Nature, 1997, v 339, pp. 737-739.

112. Luler M.L., Lorham J.D., Mcley A.J., Genetic susceptibility to Leishmania: IL-12 responsivenes in Th-1 cell development. // Science, 1996, v271, pp.984-987/

113. Mackey C.R., Maddox J.F., Brandon M.R. Presence of (WT31) negative T-lymphocytes in normal blood and thymus. // Nature, 1986, v324, pp.268-270/

114. Marino M.W., Dunn A., Lracil D. Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice. // Proc. Natl. Acd. Sci. NSA, 1997, v94, pp.80938098.

115. Markham R.B., Loellner I., Rier L.B. In vitro T-cell-mediated killing of pseudomonas aeruginosa. I Evidence that a lymph king mediates killing //J of Immunol., 1985, v 134, №6, pp/4112-4117/

116. Maruo S., Oh-hora M., Ahu H-J., OnoS., Wysocka M. /З-cell regulate Cd-40 ligand-induced 11-12 production in antigen presenting cell (APS) during T-cell/APS interaction. //J. of Immunol., 1997, vl58, pp.120-126.

117. Mathy N.L., Wolker J., Lee R.P. Characterization of cytokine profiles and double-positive lymphocytes subpopulation in normal bovine lungs. // Amer. J. Vet. Res., 1997, v58, №9, pp.969-979.

118. McBide J.W., Covstvet R.F., Dietrich M.F. Memory and CD8+ are the predominant bovine bronchoalveolar lymphocyte phenotypes. // Vet. Immunol., Immunopath., 1997, v38, pp,55-62.

119. McClure J.J., Hein W.R., Dudler L.K. Ontogenety, morpholygy and tissue distribution of a unique subset CD" CD8' sheep T-lymphocytes. // Immunol. Cell. Boil., 1981, v67, pp.215-221.

120. McEvoy J.D., Pollock J.M. A preliminary study of peripheral lymphocyte function in cows with chronic endometritis. // Vet. Rec., 1994, vl34, pp.237-238.

121. Mclusen E., Fox M., Lec C.S. Activation of uterine intraepithelial TCK-positive lymphocytes during pregnancy. // Enr. J. Immunol., 1993, v23, pp.1112-1123.

122. Miller H.V., Kimsey P.B., Kendrik J.W. Endometritis of diary cattle: diagnosis, treatment and fertility.// Bovine Pract., 1980, vl5, pp.13-21.

123. Minju M., Matikainen S., Pironen V.J. Lactobacil and Streptococi induced interlrukin-12, interleukin -18, and gamma interferon production in human peripheral blood mononuclear cells. // Inf. Immunol., 1998, v66, №12, pp.6058-6062.

124. Miyamato D., Drius J., Okuda K. Is TNFa a trigger the ignition of endometrial PLF2a release at luteolysis in cattle. // Boil. Reprod., 2000, v62, pp.1109-1118.

125. Miyamoto S. Helper T-cell subsets: heterogeneity function and development. // Vet. Immunol., Immunopath., 1999, v64, №1-2, pp.31-39.

126. Moojen V., Koberts A.W., Carter L.K. Microbial of bovine abortion in Michigan. // Vet. Med. Small. Anim. Clin., 1983, v78, pp. 102-106.

127. Mosman T.R., Sad S. The expanding universe of T-cell subset Thl, Th2 and more. // Immunol. Today, 1996, vl7, pp.428-452.

128. Mwangi D.M., Mahan S.M., Nyanjui J.K. Immunization of cattle by infection with Cowdria ruminantium ebicits T-lymphocytes that recognize antologus infected endothelial cell and monocytes. // Inf. Immunol., 1998, v66, №5, pp. 1856-1860.

129. Nagavata H., Micono S., Takeda S. Assessment of nentrophil functions in the dairy cows during the perinatal period. // J. Vet. Med., 1998, v35, pp.741-751.

130. Ohga S., Yoshikava Y., Taheda K., Sequential appearance of 76-and сф-bearing T-cells in the peritoneal cavity during an i.p. infection with Listeria monocytogenes. // Eur. J. Immunol., 1990, v20, pp.533-565.

131. Olson D.M., Zakar Т., Mitchell B.F. Molecular aspects of placental and fetal membrane autacoids. // CRS Press, 1993, pp.55-95.

132. Olson J.O., Bretzlaff K.N., Ball L. The metritis-pyometra complex. // In.: Current therapy in theoriogenology (ed. Narrow D.A., Slander W.B.) CVS Press, 1986, pp.227-237.

133. Orris T.B., Mecathy S.A., Сатрапа M.A. Evidence of positive cross regulation on Thl by Th2 and antigen-presenting cell: effect on Thl induced by IL-4 andIL-12. // J. of Immunology, 199, vl64, №4, pp. 19991207.

134. Orriss T.B., McCarthy S.A., Morel B.F., Campana M.A. Crossregulation between Thelper cell (Th)l and Th2. Inhibition of Th2 proliferation by JNFy involves interference with IL-1. // J. of Immunol., 1997, vl58, №8 pp. 3666-3672.

135. Parr E.L., Parr M.B. Secretory immunoglobulin binding to bacteria in the mouse uterus after mating. // J. Reprod. Immunol., 1985, v8, pp.71-82.

136. Pollard J.W., Elain Y., Zhu L. Complexity in uterine macrophage responses to cytokines in mice. // Boil. Reprod., 1998, v58, pp. 1469-1475.

137. Poquent Y., Kroca M., Halaiy F. Expantion of vy9vb2 T-cells is triggred by francisella tularensis-derived phosphoantigens in tularemia but not after tularemia vaccination. // Inf. Immunol., 1998, v66, №5, pp.2107-2114.

138. Powderly W.L., Pier L.B., Markham R.B. In vitro T-cell mediated killing of pseudomonas aeruginosa. // I. of Immunol., 1986, vl36, №1, pp.299300.

139. Randall S., Oh D.V.M. The efficacy of uterine treatment with antimicrobial drugs. // In.: Current therapy in theriogenology. (ed. Narrow D.A., Slander W.B.) CVS Press, 1986, pp.39-42.

140. Regassa F., Noakes D.E. Acute phase protein response of ewes and the release of PGFM in relation to uterine involution and the presence of intrauterine bacteria. // Vet. Rec., 1999, vl44, pp.502-506.

141. Renjito X., Letellier C., Kiel L.M. Susceptibility of bovine antigen-presenting cells to infection by bovine herpesvirus 1 and in vitro presentation to T-cell- two independent events. // J. Virol., 1999, vl61, №11, pp.4840-4846.

142. Roberts S.J., Smith A.L., West A.B. T-cell o/jS and y/8 T-cell deficient mice display abnormal but distinct phenotypes toward a natural,widespread infection of intestinal epithelium. // Proc. Natl., Acad. Sci., USA., 1996 v93,pp.l774-l 1185.

143. Robertson S.A., Wegman T.L., Seamark R.F. Cytokines in gestation. // Crit. Rev. Immunol., 1994, vl4, pp.239-292.

144. Robrignes S.D., Palmer L.N., McElwain D.J. CD4+ T-helper lymphocytes responses against Balesia begemina rhoptry associatedprotein-1. // Inf. Immun., 1996, v64, pp.2079-2087/

145. Ryan A. Wagavata H.,Tokeda S. Assesmenet of neutrophil function in the dairy cows during the perinatal period.// J. Vet., Med., 1988, B35, pp. 741745

146. Ryan J.J., Mekeynold L.J., Keegan N., Wang L.U. Growth and gene expression are predominantly controlled by distinct regions on human 11-4 receptor. // Imminity, 1996, v4, pp. 122-132.

147. Schnlize Osthoff K., Ferrari D., Los M., Peter E. Apoptosis signaling by death receptors. // Eur. J. biochem., 1998, v254, pp.439-459.

148. Shafer-Weaver K.A., Corl C.M., Sordillo L.M. Shifts in bovine CD+4 subpopulations sussets milk and blood of periparturient cows. // Vet. Immunol., Immunopath., 1999, v69, №1, pp.23-32.

149. Shafer-Weaver K.A., Sordillo L.M. Bovino VD8+ suppressor lymphocytes after immune responsivness during post partum period. // Vet Immunol., Immunopath., 1997, v56, pp.53-64.

150. Sjoblom C., Wikland M., Robertson S.A. LM-CSF act independently of beta common subunit of CSF receptor to prevent inner cells mass apoptosis in human embryos. // Boil. Reprod., 2002, v67, pp.l817-1823.

151. Skinner J.G., Roberts L. Haptoglobine as indicator of infection in sheep. // Vet. Rec., 1994, vl34, pp.33-36.

152. Smyth A.J., Welsen M.D., Lirvin R.M., In vitro responsesiveness of y8 T-cell from Mycobacterium bovis infected cattle to mycobacterium antigens: predominant involvement of WC1+ cell. // Inf. Immunol., 2001, v69, pp.89-96.

153. Sone M. Investigation on control of bacteria in boar semen. // Jap. J. Anim. Reprod., 1990, v36, №5 pp.23-28.

154. Sordillo L.M., Pighetti L.M., Davis M.R. Enhanced production of TNF« during the perparturient period. // Vet. Immunol., 1995, v43, pp.263-270.

155. Splitter G. Cytokines: communication molecules that influence the process of disease. //Jap. Vet. Res., 1997, v45, №1, pp.3-12.

156. Splitter L.,Van Kampen., Mallard B.A. Effect peripartum stress and healt circulation bovine lymphocyte subsets.// Vet. Immunol., immunopath., 1997, v.59, pp.741-751

157. Stabo D.J. Dighe A.S., Lubler N. Regulation of interliuk (IL)-12 beta2 subunit expression in developing T-helper 1 and T-helper 2. // J. Exp. Med., 1997, vl85,pp,817-824.

158. Stenger S., Hanson R., Tetelbann P., Dewan P. An antimicrobial activity of cytolytic T-cell mediated by granulysin. // Science, 1998, v282, pp. 121125.

159. Subauste C.S., Chung J.L., Do D.S. Preferential activation and expansion of human peripherial blood убТ-cell in response to Toxoplasma gondii in vitro. //J. Uin. Invest., 1995, v96, pp.610-619.

160. Suda Т., Takahashi P., Lolstein P., Nagata N., Molecular cloning and expression of the Fas ligand a novel member of the tumor necrosis factor family. // Cell., 1993, v75, pp.1169-1182.

161. Suzuki Т., Hiromatsu K., Ando Y. Regulatory role of T-cells in uterine intraepithelial lymphocytes in maternal antifental immune response. // J. Immunol., 1995, vl54, pp.4476-4484.

162. Taams L.S. Evden W. Wanben H.M. Dose-dependent induction of distened anergic phenotype: multiple levels of T-cell anergy. // J. of Immunol., 1999, vl62, №4, pp.1975-1981.

163. Taylor B.C., Delligner J.D., Cullor J.S. Bovine milk lymphocytes display the phenotype of memory T-cell and are predominantly CD8. Cell. Immun., 1994, v 156, pp.245-253.

164. Tsukaquchi K., Balaji R., Boom W.H. CD4 d(i T-cell and 76 T-cell responses to Mycobacterium tuberculosis. // Inf. Immunol., 1995, vl54, pp. 1786-1796.

165. Ugahata H., Ogava A., Sanada Y. Peripartum changes in antibody production capabilities of lymphocytes from dairy cows. // Vet. Q., 1992, vl4, pp.39-40/

166. Van Kampen C., Mallard B.A. Effect peripartum stress and health circulating bovine lymphocyte subset. // Vet. Q.,1999, v 21 pp.79-91.

167. Van Rensen A.J., Pollen M.C. Vanels C.A. Antigenic T-cell activation suppress T-cell responses via the antigen presenting cell. // Eur.J Immunol., v28, pp. 2902-2905.

168. Vankayalapati R., Wizel В., Lakey D.L. T-cell enhance production of IL-18 by monocytes in response to an intracellular pathogen. // IJ. of Immunol., 2001, vl66, №11, pp.6749-6763.

169. Vassali P. The pathopyhisiol of tumor necrosis factor. // Annu. Rev. Immul., 1995, v362,№l, pp.411-432.

170. Walport M.J., Lachmann P.J. Complement. In.: Clinical aspects of Immunology (ed. Lachmann P J., Peters D.K.). // Oxford, Blackwell Press, 1993, pp.347-375.

171. Walvavens K., Wellemans V., Weynant V. Analysis of the antigen -specific IFN -7 producing T-cell subset in cattle experimentally infected with Mycobacterium bovis. // Vet. Immunol., Immunopath., 2002, v84, pp.29-41.

172. Wandi F., Allison J.P. Phenotypic analysis and 76T-cell receptor of murine T-cell associated with the vaginal epithelium. // J. of Immunol., 1991, vl47, pp.1173-1178.

173. Watson E.D., Stokes C.K., David J.S. Effect ovarian hormones on promotion of bactericidal activity by uterine secretions. // J. Reprod. Fertil., 1987, v79, pp.531-537.

174. Watson S.D. Opsoning ability of bovine uterine secretions during the estrus cycle. // Vet. Rec., 1985, vl 17, pp.274-275.

175. Watt E.R., Madruga C., Cluff E. Differential distribution of T-cell receptor lymphocyte subpopulations in blood and spleen of young and adult cattle. // Vet. Immunol., Immunopaph., 1994, v40, pp. 187-199.

176. Weynants V., Warlavens Т., Didembourg C. Inattentive assessment by flow cytometry of T-lymphocytes producing antigen specific 7-interferon in brucella immune cattle. // Vet. Immunol., Immunopath., 1998, v66. №34, pp.309-320.

177. Wu L.H., Liav M.H., Studies on summer infertility in dairy cows. // J. Chin. Soc. Vet. Sci., 1990, vl6, pp.71-76.

178. Yai J., Larenia M., Wegmann T.G. Cytoxity of tumor necrosis factor and gamma interferon against human placental tromphoblast. // Placenta, 1994, vl5,pp,819-827.

179. Yamada K., Nakao R., Sonaka R. Nutritional states of diary cows perciparturient complications and reproductive performance. // J. Japan Vet. Med. ASSN, 1994, v5, 322-326.

180. Young T. J. Identification of bovine T and B-lymphocytes subpopulation by immunofluorescence. // Amer. Vet. Res., 1981, V 42, № 5, pp. 755-757/

181. Yuade M.J., Roth J.A. Dual-color flow cytometric analysis of phenotype activation marker expression and proliferation of mitogen-stimulated bovine lymphocytes subset. // Vet. Immunol., Immunopath., 1999, v67, №1, pp.33-45.

182. Yunt J.S., Vassmer D., Fergason T.A., Miller L. FAS ligand is positioned in mouse uterns and placenta to prevent trafficking of activated leukocytes between the mother and the conceptus. // J. of Immunol., 1997, vl58, №9, pp.4122-4128.

183. Zimmormana H., Lehman M., Preiffer R. HCG of peripherial mononuclear cells during pregnancy. // Domestic. Anim. Endocrin., 1998., vl5, pp.377387.

Информация о работе

Хлопонин, Всеволод Серафимович
кандидата биологических наук
п. Быково Моск. обл, 2005
ВАК 03.00.13

Диссертация

Т-лимфоциты в восстановлении воспроизводительной функции у коров после отела - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Т-лимфоциты в восстановлении воспроизводительной функции у коров после отела ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Т-лимфоциты в восстановлении воспроизводительной функции у коров после отела"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хлопонин, Всеволод Серафимович

Введение Диссертация по биологии, на тему "Т-лимфоциты в восстановлении воспроизводительной функции у коров после отела"

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Хлопонин, Всеволод Серафимович

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хлопонин, Всеволод Серафимович, п. Быково Моск. обл

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Т-лимфоциты в восстановлении воспроизводительной функции у коров после отела
ВАК РФ 03.00.13, Физиология