Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Связывание когезина Saccharomyces cerevisiae с хроматином
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Связывание когезина Saccharomyces cerevisiae с хроматином"
Направахрукописи
КАГАНСКИЙ Александр Маркович
СВЯЗЫВАНИЕ КОГЕЗИНА ШЛССИЛЕОМУСЕШ СЕЕЕУШЛЕ С ХРОМАТИНОМ
03.00.03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
коншшый!
ЭКЗЕМПЛЯР |
Работа выполнена в Национальном институте здоровья ребенка и развития человека, Бетезда (США), и Петербургском институте ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН..
Научный руководитель: кандидат биологических наук
Струнников Александр Владимирович.
Консультант; доктор биологических наук, профессор
Ланцов Владислав Александрович.
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Подгорная Ольга Игоревна,
доктор биологических наук, профессор Перевозчиков Андрей Петрович.
Ведущая организация: Биолого-почвенный факультет
Санкт-Петербургского государственного университета.
Защита состоится «23» апреля 2004 г.
на заседании диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, дом 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.
Автореферат разослан «22» марта 2004 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук
И.И. Марахова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Клетки всех эукариотических организмов, включая дрожжи 8асскагатусе5 свт1з1ав и человека, наследуют генетическую информацию в виде ДНК, которая уложена в ДНК-белковый комплекс - хромосому. Для воспроизведения точных копий своего генома, в процессе митоза или мейоза, клетке необходимо правильным образом разделить каждую удвоившуюся хромосому на две хроматиды, чтобы дочерняя клетка получила одну из них. Недостаток или избыток числа хроматид приводит, как правило, к дестабилизации генома и гибели клетки. Так, человеческие эмбрионы с неправильным хромосомным набором в большинстве случаев погибают, а в немногих случаях их выживания у новорожденных наблюдаются серьезные дефекты. Нарушения хромосомного набора в клетках взрослого человека часто являются причиной злокачественных новообразований (JaЦepaШ & а1. 2001).
История изучения молекулярных основ процесса, получившего название «когезия сестринских хроматид», насчитывает немногим более пяти лет, с тех пор, когда было доказано, что хроматиды остаются сцепленными друг с другом с момента их синтеза до расхождения при помощи специализированного белкового комлекса - когезина. Именно механизм когезии лежит в основе хорошо известного (по данным микроскопии) распределения хромосом в центре митотического веретена, ориентации сестринских кинетохоров к противоположным полюсам веретена и последующего одновременного расхождения хроматид (Tanaka а а1. 2000, Toyoda а а1. 2002).
Установление когезии ограничено исключительно временем репликации хроматина и непосредственным образом зависит от сборки когезина, состоящего из четырех субъединиц: Smcl, Smc3, Mcdl/Sccl/Rad21 и Scc3/SA1,2 (Losadaefa/. 1998;^^ а а1. 1999,'Uhlmann & а1. 1998). Данные, полученные к настоящему моменту, свидетельствуют о том, что новообразовавшиеся хроматиды могут удерживаться вместе либо за счет ДНК-связывающей активности когезина (Akhmedov & а1. 1998, Шгам 2000), либо за счет физического удержания хроматид внутри кольца, образуемого субъединицами когезина (Haermg & а1. 2002).
В настоящий момент молекулярный механизм установления когезии практически не изучен. Центральным вопросом является то, каким образом когезин физически взаимодействует с хромосомой, а также чем обусловлена пространственная, и временная специфичность этого взаимодействия т гта. Принимая во внимание тот факт, что когезин связывается с хромосомами в локусах с различной структурой, включая такие, как эухроматин и гетерохроматин, центромерные области и места двунитевых разрывов, для исследования функции когезина необходимо разработать экспериментальные системы, моделирующие КРГ6ДИТО -»/у
Представленная работа посвящена исслац^иНЯЮШЮНАЛЬЯ^ЙЬгаия
3 | БИБЛИОТЕКА ^ |
когезина с хроматином в различных экспериментальных условиях.
Цели и задачи исследования
Целью данного исследования было выделение четырехсубъединичного когезина из Saccharomyces cerevisiae и установление его субстратной специфичности. Для ее достижения были поставлены следующие задачи.
1. Определить особенности связывания когезина с хромосомами. S. cerevisiae in vivo.
2. Клонировать, экспрессировать и очистить рекомбинантный когезин S. cerevisiae.
3. Охарактеризовать ДНК-связывающую активность когезина in vitro.
4. Охарактеризовать хроматин-связывающую активность когезина in vitro.
5. Определить факторы, влияющие на взаимодействие когезина с хроматином in vitro.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Активный рекомбинантный комплекс когезин дрожжей S. cerevisiae может быть выделен из клеток насекомых.
2. Взаимодействие рекомбинантного когезина хроматином in vitro является специфическим и характеризуется высокой аффинностью.
3. Взаимодействие когезина с хроматином происходит не через хвостовые домены гистонов и не через межнуклеосомную (линкерную) ДНК.
Научная новизна
В ходе работы очищен дрожжевой комплекс когезин, состоящий из рекомбинантных белков Smclp, Smc3p, Mcdlp и Scc3p. Впервые был выделен гомогенный рекомбинантный когезин в составе четырех субъединиц. Показано специфическое взаимодействие когезина с хроматином in vivo и in vitro с высокой аффинностью. На основании анализа этого взаимодействия сделан вывод о том, что для взаимодействия когезина с хроматином не существенны хвостовые домены гистонов и меж-нуклеосомная (линкерная) ДНК. Кроме того, доказано, что для связывания с хроматином недостаточно димера Smclp/Smc3p, а необходимы еще белки Mcdlp и Scc3p. На основании этого предложен механизм установления когезином когезии сестринских хроматид зан счет сборки когезина и взаимодействия с хроматином в сайтах когезии.
Теоретическое и практическое значение работы
В результате настоящей работы доказано специфическое взаимодействие когезина S. cerevisiae с хроматином и показано, что для этого взаимодействия хвостовые домены гистонов не являются необходимыми. До сих пор имеется мало данных, о механизме установления когезии при помощи когезина и о факторах, регулирующих этот процесс. Данные результаты, свидетельствуют о том, что одним из таких факторов является хроматин. Дальнейшее изучение взаимодействия когезина с хроматином позволит понять, каким образом осуществляется и
поддерживается когезия сестринсхих хроматид, и выявить новые компоненты, участвующие в этом процессе. Установлено, что для связывания хроматина существенны не только SMC белки когезина, но и белки Mcdlp и Scc3. Это подтверждает одну из альтернативных моделей функционирования когезина (Gruber et al. 2003, Haering et al. 2002), согласно которой когезин охватывает сестринские хроматиды. Таким образом, разработанные методы выделения когезина позволят изучать процесс когезии сестринских хроматид in vitro.
В процессе работы использованы нетривиальные
экспериментальные подходы: удаление хвостовых доменов гистонов из хроматина, изготовление и использование' нестандартных аффинных носителей, метод защиты ДНК от действия эндонуклеаз и другие. Метод торможения в геле (ретардация) адаптирован для изучения связывания когезина с хроматином in vitro.
Апробация работы
По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 5 тезисов.
Результаты работы докладывались на конференциях «Eucaryotic Replication» (Ла Хойя; США, 2000), « Yeast Genetics and Molecular Biology» (Сиэтл, США, 2000), конференции американского общества биологии клетки (Вашингтон, США; 2001), конференции «Cold Spring Harbor Yeast Cell Biology Meeting» (Колд Спринг Харбор, США, 2002), школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003), ежегодной конференции докладов, молодых ученых Отдела молекулярной и радиационной биофизики ПИЯФ им. Б.П. Константинова РАН (Гатчина, 2003) и международном» симпозиуме «Transregio 5» (Мюнхен, 2003). Устные доклады на конференции молодых ученых Отдела молекулярной и радиационной биофизики ПИЯФ, а также школе-конференции молодых ученых «Биология - наука. XXI века» были удостоены первой и второй премий, соответственно.
Объем и структура диссертации
Диссертационная, работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной' части, включающей методы и результаты исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 155 публикаций. Работа изложена на 92 страницах машинописного текста и иллюстрирована 14 рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Манипуляции с клетками дрожжей. Для выращивания дрожжей на чашках и в жидких культурах использовали стандартные условия (Kagansky et al. 2000b). Для очистки хроматина дрожжей использовали культуру дрожжей штамма BY4733bp3 (МАТа his3-A200 Ieu2-A0 metl5-A0 trpl-АбЗ игаЗ-АО pep4::HIS3 barl-A::LEU2 SCC3:12His:3HA::URA3) объемом 2л (30°С; YEPD; Хроматин выделяли и обрабатывали
микрококковой нуклеазой в соответствии с измененным методом (Loo et al.
1994).
Очистка рекомбииантных белков. Для реконструкции когезина из рекомбинантных белков Smclp, Smc3p, Scc3p и Mcdlp дрожжей соответствующие гены клонировали в экспрессионных векторах, как в полноразмерной форме, так и с добавлением к 5'-концам этих генов полигистидинового тракта (polyhistidine tag) (в дальнейшем, 6xHis). Эти измененные последовательности успешно прошли проверку в дрожжах на предмет способности функционально замещать гены дикого типа: измененные гены были интегрированы в соответствующие этим генам локусы, что в каждом случае привело к нарушению последовательности гена дикого типа (Каганский et al. 2004). Для получения рекомбинантных бакуловирусов использовали систему Bac-to-Bac (Gibco); высокий титр каждого из вирусов получили, используя клетки насекомых Sf9 (Invitrogen), среду Ultimate Insect (Invitrogen), содержащую 10% бычьей сыворотки (Gibco), 100 мг/л L-глутамина и 10 мг/л гентамицина сульфата (Gibco). Для экспрессии рекомбинантных белков использовали клетки насекомых High Five, среду Ultimate Insect, содержащую 100 мг/л L-глутамина и 10 мг/л гентамицина сульфата. 20 чашек Петри (диаметр 150 мм) с клетками High Five при плотности посева 1х106 1/см2 инфицировали одновременно четырьмя бакуловирусами, экспрессирующими 6xHis-Smc3p, Smc3p, Scc3p и Mcdlp. Экспрессию проводили 48 часов при 27°С. Собранные клетки промывали и вскрывали в буфере с применением гомогенизатора
Даунса (Dounce). Фракцию растворимого белка, полученную путем осветления клеточного экстракта в ультрацентрифуге Beckmann (ротор 60 Ti, 100,000g, 30 мин, +4°С), инкубировали в присутствии аффинного носителя Ni-NTA Superflow (Qiagen) в течение 2 часов в буфере ЕВХ2оо, содержащим 5 мМ имидазол. После этого, носитель переносили в колонку и промывали буфером ЕВХгкъ содержащим 20 мМ имидазол. Элюцию проводили буфером ЕВХгоо. содержащим 250 мМ имидазол. Для дальнейшей очистки рекомбинантного когезина применяли метод гель-фильтрации на колонке Superose 6 HR10/30 (Amersham-Pharmacia) с использованием оборудования АКТА FPLC (Amersham-Pharmacia) (Каганский et al. 2004). Детекцию белка во фракциях проводили методами SDS-ПААГ и иммуноблоттинга с использованием антител против белков когезина. Очистку гетеродимера 6xHis-Smcl::Smc3 проводили с использованием аффинной хроматографии и гель-фильтрации, аналогично очистке рекомбинантного когезина.
Эксперименты по связыванию когезина с хроматином. Типичный эксперимент по связыванию когезина с хроматином представлял собой реакцию, в которой 5 нг препарата когезина (20-50нг в отдельно оговоренных случаях) инкубировали с 1 нг динуклеосомы (1,000 расп/мин) в буфере ЕХ (20мМ Hepes-KOH, 1 мМ ДТТ, 10 мМ MgCI2, 1 мМ АТФ, 100 мМ NaCl, 5% глицерин, 0.1 мМ БСА) в присутствии или без конкурентной ДНК. Объем стандартной реакции сооставлял 12.5 мкл. После инкубации
(20 мин при +23*С) такую реакцию наносили на 0.8%-ный агарозный гель и вели элекрофоретическое разделение при 15 В/см в течение 120 мин в буфере О.ЗхТБЭ (27 мМ Трис-борат, 0.6 мМ ЭДТА, рН 8.0 ) при +4'С. Гель фиксировали, высушивали и проявляли с помощью оборудования Phosphorimager. Для оценки размера комплексов, образующихся в результате описанной реакции, использовали маркер хроматина, который был приготовлен посредством дотирования очищенных динуклеосом (10 нг) с помощью Т4 ДНК лигазы (New England Biolabs) в течение 15 мин при +23 *С. После инкубации 20 мин при +23'С проводили электрофоретическое разделение и детекцию продуктов реакции» как описано ранее. Для экспериментов с разрушением хроматин-связывающей активности когезина при помощи обработки сепаразой. использовали экспрессионную конструкцию, в которой белок Esplp (сепараза S. cerevisiae) объединили с доменами CBD (домен связывания с хитином) и FLAG (конструкция была получена от Франка Ульманна (F. Uhlmann)). Данная конструкция была экспрессирована в штамме S. cerevisiae 4363 (F. Uhlmann), трансформированном плазмидой рОС69 (получена от Орны Коэн-Фикс (О. Cohen-Fix)), контролирующей экспрессию Pdslp с помощью промотора GAL, после чего белок Esplp очищали, как было описано ранее (Uhlmann et ah 2000). После связывания когезина с хроматином (см. выше, этот пункт) реакции переносили в пробирки, содержащие 10 мкл хитинового носителя с иммобилизованным на нем белком Espl (или контрольным препаратом), промытого предварительно буфером EX. Полученные взвеси инкубировали с помешиванием (30 мин при + 30вС). Затем носитель осаждали, и супернатанты наносили на 0.8%-ный агарозный гель и анализировали, как описано выше. Контроль расщепления белка Mcdl проводили с помощью иммуноблоттинга. Для проверки доступности линкерной ДНК в комплексах ДНК-когезин, для эндонуклеазной атаки подбирали концентрации рестриктазы EcoRI и микрококковой нуклеазы, позволяющие визуализировать как исходные молекулы ДНК, так и продукты разрезания. К комплексам когезина (комплексы формировались в насыщающей по отношению к хроматину концентрации, 20 нг когезина с 1 нг динуклеосомы) с хроматином добавляли экзонуклеазу (либо 3 ед. EcoRJ, либо 10 ед. микрококковой нуклеазы) в тотальном объеме 15 мкл и инкубировали в буфере ЕХ, содержащем 4 мМ СаС12 (5 мин при +23'С). Реакции останавливали добавлением 10 мМ ЭДТА; ДНК экстрагировали фенолом и электрофоретически разделяли в 5%-ном ПААГ в буфере 0.5хТБЭ с последующим авторадиографическим исследованием.
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Исследование структуры сайтов когезии in vivo
Путь к выяснению механизмов, с помощью которых устанавливается когезия сестринских хроматид, - изучение когезина в естественных условиях, т.е. в сайтах когезии. Для этого необходимо знать, что представляют собой эти сайты. Местоположения сайтов когезии на каждой из хромосом в дрожжах (и, несомненно, во всех эукариотических организмах) остаются неизменными при делении клетки (Blat et al. 1999, Tanaka et al. 1999), поэтому не вызывает сомнений, что сайты когезии распределены не случайно. Протяженность участка ДНК, занимаемого когезином in vivo, точно не определена, так как соответствующие эксперименты по иммунопреципитации хроматина (СЫР) дали противоречивые результаты. Согласно наиболее точным данным, размер сайтов когезии, расположенных на плечах хромосом, не превышает 1 тпн (Megee et al. 1999, Tanaka et al. 1999). Для воспроизведения реакции когезии in vitro необходимо знать размер минимального участка хромосомы, связываемого когезином, так как работа с фрагментами ДНК
А ипМсс11р r-1
11 12 13 14 EU 16 17 18 19 20 и. +
Smclp
Smc3p Í ' " ' l? * * ' * "" i i 0«>C5
Hmolp .-..И»*'®»*»»—•« ¿2¡SW¡»<®
Рис. 1. Выделение когезина из клеток дрожжей.
Панель А. Хроматин, выделенный из штамма дрожжей BY4733bp3 и подвергнутый расщеплению микрококковой нуклеазой. После экстракции при помощи фенола ДНК, полученную из обработанного хроматина, электрофоретическн разделяли в 1.5%-ном агарозном геле. Символы, условно предствляющие одну и две нуклеосомы, указывают на размер ДИК (150 нп и 300 нп, соответственно).
Панель Б. Анализ фракций, полученных в процессе центрифугирования в градиенте сахарозы обработанных микрококковой нуклеазой ядер, с помощью иммуноблоттиига с использованием антител против Smclp, Smc3p и Hmolp. Фракцию №15 градиента сахарозы (слева) использовали для иммуно-аффннной очистки когезина с помощью антител против белка Mcdlp (справа). Выявление белка Hmolp указывает на присутствие хроматина. Дорожки «-» и «+» представляют, соответственно, фракции белков, не связавшихся и связавшихся с иммуно-аффииным носителем. Символы, условно предствляющие одну и две нуклеосомы (внизу), указывают на размер фрагментов хроматина в соответствующих фракциях градиента.
Мы экспериментально определили минимальный участок хромосомы, достаточный для связывания когезина, выделяя когезин из дрожжей так, чтобы при наиболее полной энзиматической фрагментации хроматина не
нарушать взаимодействий «белок-белок» и «белок-ДНК». Для этого мы обработали хроматин микрококковой нуклеазой в мягких условиях и очистили полученные нуклеопротеиновые комплексы с использованием градиентного центрифугирования и иммуноаффинной хроматографии (см. Материалы и Методы). Поскольку обработку микрококковой нуклеазой проводили до насыщения, хроматин был представлен почти исключительно в виде фрагментов, содержащих одну или две нуклеосомы (рис. 1А). Мы проанализировали полученные фракции на содержание в них ДНК, когезина и белка Hmolp, использованного в качестве белкового маркера хроматина.
Как показывают результаты иммуноблота (рис. 1Б), когезин седиментирует вместе с более тяжелыми фрагментами хроматина, содержащими белок Hmolp, который неизменно связан с линкерными участками ДНК. Результаты иммуноаффинной очистки (рис. 1Б), свидетельствуют в пользу того, что когезин связан с фрагментами хроматина размерами не более двух нуклеосом, включающими в себя примерно 400 пн ДНК. Эту оценку для сайта когезии мы впоследствии использовали для выбора размера субстратов для реакций связывания in vitro.
2. Взаимодействие когезина с ДНК н хроматином in vitro
Препаративное выделение когезина из клеток дрожжей не эффективно, так как было выяснено, что активный когезин трудно отделить от хроматина. Кроме того, количество получаемого из дрожжей когезина оказалось недостаточным для исследования ферментативной активности этого комплекса. Поэтому для решения поставленных задач было необходимо выделить четырехсубъединичный когезин в рекомбинантной форме. Для этого использовали систему супер-экспрессии белков в клетках насекомых (см. Материалы и Методы), которая позволяет получить в рекомбинантной форме как отдельные белки, так и многосубъединичные комплексы.
Сначала определяли условия для максимальной экспрессии белка для каждого из бакуловирусов (рис. 2А). Затем эти белки экспрессировали совместно путем инфицирования культуры клеток насекомых четырьмя соответствующими бакуловирусами одновременно, в результате чего происходила сборка рекомбинантного когезина в клетках насекомых, который затем был выделен из клеточного экстракта (рис. 2Б). Белок Mcdlp при экспрессии в клетках насекомых оказывался полностью нерастворимым, тогда как в случае экспрессии всех четырех субъединиц комплекса около трети общего количества белка Mcdlp оказалась в растворимой фракции, что свидетельствовало в пользу того, что в результате совместной экспрессии рекомбинантных белков, каждый из них принимал естественную конформацию необходимую для сборки комплекса (Kagansky et al. 2000a). Полученный препарат содержал все четыре субъединицы комплекса в соотношении 1:1:1:1, как показывают данные
Рис. 2. Суперэкспрессия субъединиц когезина и очистка рекомбинантного когезина из клеток насекомых.
Панель А. Экспрессия белков £xII-Smclp, Smc3p, Scc3p и Medíр в клетках High Five. Звездочками показаны позиции рекомбинантных белков на соответствующих дорожках электрофореза (клеточные экстракты, окраска с помощью кумасси).
Панель Б. Этапы очистки рекомбинантного когезина. Стехиометрическое соотношение белков в комплексе можно оценить после аффинной очистки (дорожка «1», разделение проводили в градиентном геле 3-8%, окраска - кумасси): позиции четырех рекомбинантных белков когезина отмечены звездочками. Препарат когезина, дополнительно очищенный с помощью гель-фильтрации на колонке Superóse 6 (дорожка «2», разделение проводили в градиентном геле 4-12%, окраску — кумасси), тестировали на присутствие в нем всех четырех субъединиц методом иммуно-блоттинга с соответствующими антителами.
Ранее было показано, что когезин человека имеет неспецифическую ДНК-связывающую активность in vitro (Losada et al. 2001). Мы исследовали взаимодействие рекомбинантного когезина дрожжей с различными последовательностями ДНК (рис. ЗА). Для этого использовали четыре последовательности из генома S. cerevisiae, для которых ранее был установлен факт наличия или отсутствия взаимодействия с когезином in vivo. К сожалению, достоверно этот факт к настоящему моменту установлен только для нескольких сайтов (Tanaka et al. 1999). Для исследования соответствующих последовательностей (далее называемых сайтами) использовали метод ретардации в геле. Рекомбинантный когезин дрожжей проявляет ДНК-связывающую активность, что соответствует полученным раннее данным (Kagansky et al. 2002, Losada et al. 2001). Однако, судя по устойчивости к титрованию конкурентной ДНК в этих экспериментах все четыре сайта взаимодействовали с когезином с приблизительно одинаковой эффективностью (рис. ЗА). Исходя из различного статуса этих четырех последовательностей in v/vo (Tanaka et al. 1999), этот результат был неожиданным. Действительно, согласно
полученным ранее данным, количество когезина, связанного с каждой из четырех последовательностей в составе хромосомы существенно различается (Tanaka et al. 1999). Инкубация каждой из проб в присутствии рекомбинантного когезина не приводила к появлению новых компактных зон в ретардационной картине, что свидетельствовало о том, что образующиеся белок-ДНКовые комплексы не имели строго определенного размера (рис. ЗА).
Т.е., по всей видимости, in vitro когезин не образует стехиометрического комплекса с ДНК. Особенности подвижности комплексов когезин::ДНК (отражаемые различиями в ретардационной картине (рис. ЗА)), по-видимому, объясняются различным относительным содержанием AT в исследуемых фрагментах ДНК (не показано, см. далее). Так как эти комплексы когезина с ДНК были чувствительны к добавлению неспецифической конкурентной ДНК поли(дИдЦ) (рис. ЗА), был сделан вывод об отсутствии у наблюдаемого взаимодействия специфичности по отношению к последовательности ДНК. Таким образом, несмотря на несомненное наличие ДНК-связывающей активности у исследуемого нами комплекса, эта активность не определяется последовательностью ДНК.
Полученные данные свидетельствуют, что когезин не обладает специфичностью по отношению к последовательности ДНК-субстрата: четыре различных последовательности ДНК из генома дрожжей, часть из которых является сайтами связывания когезина in vivo, связывались когезином с одинаковой аффинностью, без специфичности в отношении последовательности ДНК (рис. ЗА). Для того, чтобы определить, существенен ли для когезина нуклеотидный состав ДНК-субстрата, мы использовали различные двунитевые гомополимеры. Этот эксперимент имел целью выяснить, какой полинуклеотид является лучшим конкурентом в реакции связывания когезина с хроматином (точнее, динуклеосомой). Ретардационная картина (рис. ЗБ) показала, что поли(дАдТ) обладает наиболее высокой способностью вытеснять хроматин из комплексов с когезином, а поли(дГдЦ) - наиболее низкой. Это согласуется с имеющимися в литературе данными (Tanaka et al. 1999), свидетельствующими, что сайты когезии сестринских хроматид представлены в ДНК преимущественно АТ-богатыми последовательностями. Таким образом, судя по низкой аффинности взаимодействия когезин:: ДНК и дисперсной ретардационной картине (рис. ЗА и рис. ЗБ), ДНК не является естественным субстратом для когезина. Однако различная способность ДНК с разным нуклеотидным составом конкурировать за связывание с когезином (рис. ЗБ) указывает, что на формирование сайта когезии in vivo может оказывать влияние относительное содержание нуклеотидов дАдТ в последовательности ДНК хромосомы.
Рис. 3. Влияние последовательности ДНК на связывание с когезином и на образование нуклеосомной структуры.
Панель А. Анализ связывания когезииа с четырьмя различными мечеными 32Р фрагментами ДНК (в равных количествах), представляющими последовательности с различным статусом в отношении когезии (определенным при помощи ChIP) in vivo, методом ретардации (торможения) в 0.8%-ном агарозном геле. В качестве конкурентной ДНК использовали поли(дЩЦ). Последовательности были условно разделены и связи со статусом когезии in vivo на «+» (сильный сигнал ChIP),«+/-» (слабый сигнал СЫР) и «-» (нет сигнала СЫР).
Панель Б. Исследование способности ДНК различного состава конкурировать с меченой >2Р динуклеосочой (использованной в качестве радиоактивной пробы для ретардации) за связывание с когезином. Конкурентную ДНК (гомополимеры дАдТ, дГдЦ, дНдЦ или 2x5S ДНК - «гетеро») брали в количестве от 3 до 30 раз большем такового в составе меченной динуклеосомы.
Панель В. Позиционирование нуклеосоч фрагментами ДНК (1-4, см. панель А), представляющими последовательности с различным статусом в отношении когезии in vivo. Хроматин собирали на меченых "Р фрагментах ДНК, после чего разделяли в 5% ПААГ.
Полученные результаты предполагают, что образование сайтов когезии регулируется in vivo не столько самой ДНК, сколько дополнительными факторами, отсутствовавшими в нашем эксперименте in vitro (рис. ЗА).
12
Одним из факторов, который может влиять на формирование сайтов когезии, является сам хроматин (Bernard et al. 2001, Tanaka et al. 1999). Как было показано в наших экспериментах, когезин дрожжей соочищается в комплексе с хроматином (рис. 1А). Ранее было продемонстрировано, что, по крайней мере, в околоцентромерных областях, как раз там, где наблюдается наибольшая плотность сайтов когезии, когезин должен связываться с участками хромосомы, представленными хроматином с упорядоченной структурой (Bloom et al. 1982). Кроме того, недавно было показано, что связывание когезина с хромосомой во многом зависит от целостности гетерохроматина, то есть от компактного хроматина с упорядоченной нуклеосомной структурой (Bernard et al. 2001, Donze et al. 1999, Laloraya et al. 2000, Nonaka et al. 2002). Последовательность ДНК, в частности, сказывается и на том, каким образом будет осуществляться распределение нуклеосом на данной ДНК. В связи с этим, мы изучали способность выбранных нами фрагментов ДНК, использованных ранее для исследования ДНК-связывающей активности когезина (рис. ЗА) образовывать хроматин с упорядоченной определенным образом структурой. Дело в том, что в то время как in vitro одни последовательности ДНК образуют нуклеосомную структуру, в которой позиции октамеров гистонов имеют случайное распределение, другие позиционируют нуклеосомы определенным образом, характерным для данной ДНК. Было обнаружено, что истинные сайты когезии (т.е. последовательности, с которыми когезин связан in vivo), условно названные CEN4, DMC1 ргох. и DMC1 dist., при реконструкции на их базе нуклеосомной структуры приводили к позиционированию определенным образом нуклеосом и пар нуклеосом, судя по появлению выраженных дискретных зон в ретардационной картине (рис. ЗВ). Напротив, тот же эксперимент с сайтом, где когезия отсутствует (JFAUrt не выявляет преимущественных позиций нуклеосом (рис. ЗВ). Исходя из вышесказанного, можно предположить, что когезин может распознавать позиционированные нуклеосомы в сайтах когезии как субстрат для связывания.
Основываясь на полученных данных, свидетельствующих о том, что ДНК сама по себе не несет достаточно информации для того, чтобы регулировать связывание когезина с хромосомой (рис. ЗА), мы исследовали взаимодействие когезина с хроматином in vitro. Для этого использовали последовательность гена 5S rRNA из X. borealis, хорошая способность которой позиционировать нуклеосому описана ранее (Ghidelli et al. 2001, Ura et al. 1995). Эта последовательность была использована для получения фрагмента хроматина с двумя позиционированными нуклеосомами (далее динуклеосома), который был использован в качестве модельного субстрата в экспериментах по связыванию когезина с хроматином. Выбор динуклеосомы в качестве субстрата обусловлен, с одной стороны, ее подобием минимальному фрагменту хроматина (из-за наличия двух
нуклеосом, отделенных друг от друга линкерной ДНК), а с другой стороны, полученной нами ранее оценкой размера минимального сайта когезии (ДНК, соответствующая двум нуклеосомам). Динуклеосому (Рис. 4А) получили, используя фрагмент ДНК длиной 394 п.н. и очистили с использованием градиента сахарозы. Мы провели повторную очистку рекомбинантного когезина и протестировали фракции последнего этапа хроматографии в реакции связывания с динуклеосомой. Профиль активности в этой реакции повторяет профиль выхода четырехсубъединичного когезина (Рис. 4Б, фракция 10). Примечательно, что активность проявляли только фракции, содержащие все четыре рекомбинантных белка (Рис. ЗБ), что говорит о том, что в данной реакции принимает участие только полностью собранный комплекс (Kagansky et al. 2001). В низкомолекулярных фракциях, не содержащих белков когезина, также присутствует активность, приводящая к изменению подвижности динуклеосомы в геле (Рис. 4Б, фракции 14-18). Сдвиг в подвижности меченой пробы в этом случае отличался от такового для фракций, содержащих когезин. Вероятно, активность низкомолекулярных фракций ассоциирована с хроматин-связывающими белками из клеток, использовавшихся для экспрессии рекомбинантного комплекса. Повторное хроматографическое разделение с большим разрешением (Рис. 4В) показало, что активность ассоциирована с максимумом количества каждого из четырех белков когезина, причем в процессе очистки в препарате уменьшалось относительное содержание Scc3p. Это находится в соответствии с результатами очистки когезина из S. pombe (Tomonaga et al. 2000) и, по-видимому, может быть объяснено слабым
Чтобы понять, каким образом может происходить взаимодействие когезина с хроматином, было необходимо охарактеризовать реакцию связывания когезина с фрагментом хроматина in vitro. Исследовали три аспекта этой реакции: (1) формируется ли стехиометрический комплекс между рекомбинантным комплексом (комплексами) и дшгуклеосомой (динуклеосомами); (2) есть ли влияние АТФ и каково оно и (3) важно ли для исследуемой реакции взаимодействие с хвостами гистонов и/или линкерной ДНК.
В экспериментах по связыванию когезина с ДНК (Рис. ЗА) титрование конкурентной ДНК свидетельствовало об отсутствии образования стехиометрического комплекса ДНК-когезин, что согласуется с полученными ранее данными о связывании ДНК когезином из клеток человека (Losada et al. 2001). Для исследования возможной стехиометрии связывания когезина с динуклеосомой путем подбора концентраций было выбрано соотношение белка и фрагментов хроматина (см. Материалы и Методы), при котором ретардационная картина стабильно демонстрировала образование специфического комплекса
когезин::динуклеосома (рис. 5А, дорожки 3,4,5). Этот комплекс мигрировал в геле медленнее, чем две динуклеосомы (рис. 5А, хроматиновый маркер).
А
Hindlll
20 пн
EcoRI
Notl
В
6xH-Smc1p 1
Smc3p -•о-—н
Scc3p
Mcdlp —------ 1
- 'I *
ТьлЯ'%
- »т-
Б 6xH-Smc1p
Smc3p> Scc3p Mcdlp- --- r ___».. J -
*
- éfk
• " « Щф- t * o, 4 * * J
№ фракции 2 4 6 8 10 12 14 161« 20 •■f
j- Esplp - +
•1
Рис. 4. Связывание рекомбннантного когезина с хроматином.
Панель А. Схема организации динуклеосомы, использованной в экспериментах по связыванию с хроматином. Позиции нуклеосом были описаны ранее (Ura etaL 1995).
Панель Б. Хроматин-связывающая активность соочищается вместе с четырехсубьединичным рекомбннантным когезином. Сверху - фракции после очистки когезина с помощью гель-фильтрации (на колонке Superóse 6), разделенные в SDS-ПААГ (окраска — кумасси). Внизу — анализ хроматнн-связывающей активности в соответствующих фракциях метолом ретардации меченого фрагмента хроматина (динуклеосомы). Фракция, содержащая наибольшую хроматин-связывающую активность, отмечена звездочкой.
Панель В. Пик хроматнн-связывающей активности мигрирует через гель-фильтрационную колонку вместе с пиком белков когезина бхП-SmcIp, Smc3p, Scc3p и Mcdlp. Присутствие белков во фракциях определяли методом нммуноблоттинга с антителами против каждого из белков (сверху). Хроматин-связывающую активность регистрировали методом ретардации меченной ИР динуклеосомы.
Панель Г: Связывание когезина с хроматином разрушается сепаразой (белок Esplp). Хроматин-связывающую активность регистрировали методом ретардации меченого ИР фрагмента хроматина (динуклеосомы). Дорожки помечены знаком «-» или «+» в зависимости от отсутствия или присутствия в смеси белка Esplp.
Это соответствует примерно 500-кратному молярному избытку конкурентной ДНК, по сравнению с ДНК, содержащейся в радиоактивной
пробе, связанной с когезином. Дискретная зона в ретардационной картине в противовес размытому характеру сдвига пробы свидетельствует о наличии некоторой преимущественной стехиометрии связывания когезина с хроматином, а высокая устойчивость к вытеснению фрагментов хроматина «голой» ДНК позволяет предположить, что хроматин является преимущественным субстратом по сравнению с ДНК.
Объяснить это можно тем, что один когезин объединяет два фрагмента хроматина. Действительно, масса рекомбинантного когезина приблизительно равна 450 кД, что, согласно грубой оценке, существенно больше массы одной нуклеосомы (270 кД) и заметно меньше массы динуклеосомы (550 кД). Наблюдаемое взаимодействие между когезином и динуклеосомой проявило необычайную устойчивость по отношению к титрованию конкурентной ДНК (рис. 5А, дорожки 4 и 5), концентрация которой превышала в 30 раз концентрацию динуклеосомы. Так как в нашем модельном фрагменте хроматина часть ДНК не связана с гистоновым октамером (рис. 4А), связывание когезина с этими участками может приводить к образованию разных по размеру нуклеопротеиновых комплексов, наряду со стехиометрическими комплексами когезин::динуклеосома, что снижает четкость ретардационной картины (рис. 5А, дорожка 2). Сигнал от этого «фонового» связывания пропадает при добавлении достаточного количества конкурентной ДНК (рис. 5А, дорожка 5). Вторую дискретную зону (отмечена на Рис. 5А полым кружком), возможно, представляющую собой димер стехиометрического комплекса когезин::динуклеосома, не удавалось наблюдать в каждом эксперименте, поэтому ее дальнейшее изучение было отложено (Kagansky etal. 2002).
Удаление из реакционной смеси АТФ оказалось не существенным для реакции связывания когезина с хроматином (рис. 5А, дорожки 9-11), несмотря на наличие в структуре Smclp и Smc3p АТФазных доменов (Hirano 2002). Однако этот результат находится в соответствии с гипотезой, что связывание и/или гидролиз АТФ необходимы для правильной сборки когезина, но не для его функционирования (Hirano et al. 2001). В нашем случае сборка когезина протекала в клетках High Five в присутствии физиологической концентрации АТФ.
Далее мы исследовали возможное взаимодействие когезина с хвостами гистонов. В динуклеосоме два гистоновых октамера экспонируют 16 хвостов, что обеспечивает поверхность для связывания хроматин-связывающих белков и комплексов, значительно превышающую поверхность коровой частицы (Luger et al. 1997). Т.о. когезин может узнавать и связывать хвостовые домены гистонов. Косвенным указанием на возможность такого связывания является тот факт, что у высших эукариот и S. pombe когезин взаимодействует с гетерохроматином, и это взаимодействие зависит от метилирования хвоста гистона НЗ (Hakimi et al. 2002, Nonaka et al. 2002). Для экспериментальной проверки этой гипотезы мы очистили индивидуально NH2-XBOCTbI четырех гистонов нуклеосомы и изучали связывание рекомбинантного когезина с носителями, на которых были иммобилизованы эти хвосты, согласно описанной в литературе методике (Nemergut et al. 2001). Судя по тому, что количество связавшегося на каждом носителе когезина не превышает количество когезина, связавшегося на носителе с иммобилизованным контрольным
пептидом GST (рис. 5Б), когезин не проявляет специфического взаимодействия с хвостами гистонов (Kagansky et al. 2004). Для более глубокого выяснения возможного влияния хвостов гистонов на связывание когезина и хроматина, а также вклада в это связывание СООН-доменов гистонов, мы получили и очистили динуклеосому, обработанную трипсином (далее бесхвостая динуклеосома), для удаления доменов. Представленные данные (рис. 5А, дорожки 6, 7 и 8) свидетельствуют о том, что отсутствие концевых доменов не меняло хроматин-связывающей активности когезина, но уменьшало размер специфического комплекса когезин: :хроматин (Kagansky et al. 2003, Kagansky et al. 2004). На основе этого результата мы выдвинули гипотезу, что роль хроматина может состоять в ограничении подвижности когезина на ДНК после того как связывание произошло. Мы проверили, не является ли линкерная ДНК мишенью для когезина. Как оказалось, доступность рестрикционного сайта EcoRI, находящегося в линкерной ДНК (рис. 4А), а также доступность ДНК динуклеосомы в комплексе когезин::динуклеосома для расщепления микрококковой эндонуклеазой не изменены по сравнению с несвязанной динуклеосомой (рис. 5В). Это свидетельствует о том, что связывание когезина с линкерной ДНК, если и имеет место, то не является достаточно стабильным, чтобы препятствовать доступу других ДНК-связывающих белков.
Вместе с предыдущими результатами эти эксперименты привели нас к выводу, что когезин связывается с хроматином независимо от хвостов гистонов. Привлечение когезина в гетерохроматин, как было показано ранее (Bernard et al. 2001, Nonaka et al. 2002), зависит от модификаций хвостов гистонов, однако, механизм образования сайтов когезии в эухроматине (а именно таковыми являются большинство сайтов в S. cerevisiae) неизвестен. Представленные эксперименты свидетельствуют о том, что для самого акта связывания когезина с хроматином хвосты гистонов, вероятно, не играют существенной роли. Регуляция этого связывания в хроматине с различной структурой, по-видимому, происходит за счет дополнительных факторов когезии.
3. Исследование вклада субьеднниц когезина в установление когезии
Для дальнейшего выяснения обстоятельств образования сайтов когезии следовало понять, является ли способность связывать хроматин свойством полноразмерного четырехсубъединичного когезина, или же за посадку на хромосому отвечает какая-то часть комплекса. Прежде всего, было решено проверить гипотезу о наличии хроматин-связывающей активности у гетеродимера Smclp-Smc3p, пребывающего в хроматине на всем протяжении клеточного цикла. Данная гипотеза является вполне правомочной, поскольку белки SMC являются ключевым компонентом различных комплексов, участвующих в метаболизме хромосом (Hirano
2002). Эксперименты с клетками дрожжей показали, что белки Smclp и Smc3p не поддаются разделению биохимическими методами, не разрушающими третичную структуру этих белков. Это обстоятельство, скорее всего, объясняется тем, что, как показал рентгено-структурный анализ, эти протяженные белковые молекулы переплетены между собой наподобие двойной спирали (Haermg & а1. 2002). Поэтому, мы исследовали комплекс Smclp-Smc3p как единое целое на предмет связывания с хроматином. Гетеродимер, образованный рекомбинантными белками Smclp и Smc3p, был очищен до гомогенности согласно процедуре, полностью аналогичной очистке рекомбинантного когезина (см. Материалы и Методы). В отличие от когезина, гетеродимер Smclp-Smc3p не формирует специфического комплекса с хроматином, демонстрируя лишь незначительное нестехиометрическое связывание (рис. 6 А) (Kagansky е( а1. 2004).
Рис. 6. Для связывания с хроматином необходим четырехсубъединичный комплекс.
Панель А: Сравнительный анализ связывания с хроматином рекомбинантного когезина (5 иг) и рекомбинантного гетеролимера Smclp/Smc3p (10 нг). Гетеродимер 6x11-Smclp/Smc3p был суперэкспрессирован в клетках High Five и очишен до гомогенности (см. Материалы и Методы). В качестве конкурентной ДНК использовали фрагмент 2i5S> в количестве от 1 до 30 раз превосходящем количество ДНК в составе меченного 12Р фрагмента хроматина.
Панель Б: Динамика присутствия белков когезина Smclp и Mcdlp в полном экстракте клеток дрожжей и в составе растворенного когезина на протяжении от фазы G1 до G2 (см. Материалы и Методы). Как тотальные количества обоих белков, так и их растворимые (ИП) фракции имеют максимумы в ранней S-фазе (точка 30 мин). К концу S-фазы (точка 65 мин, за 20 мни до анафазы) в растворенной фазе практически отсутствует белок Mcdp. В то же время относительное количество белка Smclp возрастает, несмотря на падение уровня тотального белка Smclp. Все относительные величины нормированы для учета максимальных уровней белков в S-фазе. Кривая построена методом интерполяции.
Этот эксперимент показывает, что для связывания с хроматином необходим четырехсубъединичный комплекс, что соответствует данным in vivo. То обстоятельство, что комплекс Smclp-Smc3p, в отличие от комплекса Smclp-Smc3p-Mcdlp-Scc3p, не обладал хроматин-связывающей активностью, дополнительно подтверждает, что наблюдаемая в случае
когезина активность действительно принадлежит четырехсубъединичному рекомбинантному комплексу, так как оба сравниваемых белковых комплекса были очищены в ходе одинаковой процедуры (Kagansky et al. 2003).
Хотя белок Smclp связан с хроматином на всем протяжении клеточного цикла (Ciosk et al. 2000), когезия сестринских хроматид может быть сформирована только в S-фазе (Uhlmann et al. 1998), когда экспрессируются Mcdlp и Scc3p. Это предполагает, что Smclp вместе с Smc3p в отсутствие двух других субъединиц когезина не могут связать между собой сестринские хроматиды. Это предположение подтверждается данными, полученными in vitro (рис. 6А). Важно было также убедиться, что белки, индуцируемые в S-фазе, в действительности являются фактором, определяющим способность когезина к связыванию с хроматином и, соответственно, определяющим установление когезии в клетках S. cerevisiae. Исследование динамики связывания субъединиц когезина с хроматином путем прямого измерения уровней белка в хроматине (Liang et al 1997)не дало воспроизводимых результатов, что связано с техническими трудностями данного анализа. Поэтому, анализировали общие количества белка в клетках и сравнивали их с уровнями растворенного белка, комплементарными уровням белка в хроматине (рис. 6Б). Регистрировали количества белков Smclp и Mcdlp как в полном клеточном экстракте, так и в растворенной (не связанной с хроматином) форме (см. Материалы и Методы). Анализ экспериментальных данных (рис. 6Б) показал, что к моменту полного исчезновения растворенного Mcdlp (а следовательно, и растворенного полноразмерного когезина из четырех субъединиц), в поздней S-фазе фракция растворенного Smclp начинает возрастать, несмотря на снижение общей концентрации Smclp в клетке (рис. 6Б). Это можно объяснить тем, что в отсутствие растворенного Mcdlp (в результате полного связывания последнего с хроматином и снижения экспрессии) белки SMC больше не могут связывать хроматин. Этот результат свидетельствует о том, что различия в способности связывать хроматин между четырехсубъединичным когезином и гетеродимером Smclp-Smc3p in vitro хорошо согласуется с динамикой связывания с хроматином белков когезина во время установления когезии in vivo (рис. 6Б).
Следующей задачей было установить, не определяется ли способность когезина связывать хроматин особой хроматин-связывающей активностью белков Scc3p и Mcdlp. Для этого необходимо было получить достаточное количество каждого из этих белков. Наши попытки очистить эти белки из дрожжей не увенчались успехом (данные не приведены), что связано, скорее всего, с высокой скоростью деградации Scc3p и Mcdlp в экстрактах клеток дрожжей. Как уже отмечалось, рекомбинантный Mcdlp не растворим в буферах, не разрушающих третичную структуру белка, как при выделении из клеток насекомых, так и при экспрессии в клетках Е. coli. Поэтому для выяснения роли этого белка в когезии должен быть избран
другой подход. Для выделения рекомбинантного Scc3p мы использовали метод, аналогичный процедуре выделения рекомбинантного когезина из клеток насекомых (см. Материалы и Методы). Эксперимент по связыванию Scc3p с хроматином, поставленный в тех же условиях, что и для полноразмерного комплекса, показал, что Scc3p не обладает заметной хроматин-связывающей активностью (данные не приведены). Таким образом, можно заключить, что для посадки на хроматин и, по-видимому, для образования сайта когезии сестринских хроматид важно присутствие в составе когезина всех четырех белков этого комплекса.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Процесс когезии сестринских хроматид необходим клетке для обеспечения правильного расхождения хромосом (Guacci et al. 1997, Michaelis et al. 1997). Этот процесс представляет собой удержание вместе каждой из пар сестринских хроматид и зависит от функции белкового комплекса когезина (Losada et al. 1998, Michaelis et al. 1997). Когезия непременно возникает во время репликации ДНК, когда происходит сборка когезина из четырех субъединиц (Losada et al. 1998, Toth et al. 1999, Uhlmann et al. 1998). В пекарских дрожжах S. cerevisiae когезин представлен белками Smclp (Guacci et al. 1993), Smc3p, Scc3p (Toth et al. 1999) и Mcdlp/Scclp (Guacci et al. 1997, Michaelis et al. 1997). В каждом эукариотическом организме, где исследовали когезин, включая человека, были обнаружены четыре белка, подобные (по крайней мере, по своей первичной структуре) Smclp, Smc3p, Scc3p и Mcdlp и составляющие когезин (Darwiche et al. 1999, Losada et al. 1998, Sumara et al. 2000, Tomonaga et al. 2000). Когезин физически препятствует расхождению хроматид, предположительно удерживая их вместе в ряде специальных локусов (сайтов когезии), расположенных вдоль каждой хромосомы на расстоянии около 10 т.п.н. (Blat et al. 1999). Хотя главной функцией когезина является контроль над расхождением хромосом в митозе и мейозе, большое количество данных указывает на участие когезина во множестве других процессов в клетке. Среди них индукция клеточного ответа на повреждения ДНК, репарация двунитевых разрывов в ДНК, структурная реорганизация хроматина и зависимые от нее клеточные процессы (Каганский et al. 2002).
Несмотря на множество процессов, в которых принимает участие когезин в клетке, молекулярные механизмы функционирования когезина изучены весьма поверхностно. В частности, одним из главных остается вопрос о том, каким образом этот комплекс взаимодействует с хромосомой в сайтах когезии. Недавние эксперименты, призванные пролить свет на механизм установления когезии, привели к двум противоречащим друг другу гипотезам. Так, на основании анализа ДНК-связывающей активности когезина из клеток человека и данных микроскопии была предложена модель,в которой белки Smclp и Smc3p образуют «мостики» между
хроматидами, связываясь непосредственно с молекулами ДНК в сайте когезии (Losada et al. 2000, Losada et al. 2001). Согласно второй гипотезе, белки Smclp и Smc3p удерживают хроматины не за счет взаимодействия с ДНК или хроматином, а образуя своеобразное «кольцо» вокруг хроматид в сайте когезии (Gruber et al. 2003, Haering et al 2002). В обоих случаях предполагается, что роль двух других субъединиц, белков Mcdlp и Scc3p, состоит в изменении активности и (или) топологии димера из белков SMC, что приводит сначала к установлению когезии (Ivanov et al 2002, Losada et al 2001), а затем к ее разрушению в анафазе (Toth et al. 1999). Однако физиологическая значимость наблюдаемого in vitro взаимодействия с ДНК белков SMC (Akhmedov et al 1998) так же,как и когезина из клеток человека (Losada et al. 2001), сомнительна. Действительно, когезкн в этих экспериментах не образует с ДНК комплексов с определенной стехиометрией вне зависимости от последовательности выбранной ДНК (Losada et al 2001). Последняя из предложенных моделей (Haering et al 2002), согласно которой сестринские хроматины располагаются в просвете образующего «кольцо» когезина, не принимает во внимание взаимодействия когезина с хромосомой. Однако,в отсутствие физического контакта между когезином и хотя бы одной из хроматид, тяжело объяснить, каким образом сайты когезии формируются в строго определенных локусах на протяжении всей хромосомы. Кроме того, экспериментальные данные свидетельствуют в пользу того, что in vivo когезин неотделим от хроматина (Ciosk et al. 2000, Toth et al 1999), причем, даже при тотальной фрагментации хроматина (рис. 1А).
До сих пор не были идентифицированы белковые факторы, активность которых бы обеспечивала сборку, посадку или активацию когезина в сайтах когезии. Таким образом, ни одна из моделей не учитывает формирование и поддержание сайтов когезии в естественных условиях, т.е. при упаковке ДНК в нуклеопротеиновый филамент - хроматин. При этом в последние годы все больше данных указывает на необходимость рассматривать когезин не только как компонент структуры хроматина, но и как фактор, активно влияющий на изменения этой структуры. Так было показано, что когезин взаимодействует с модифицирующим структуру хроматина комплексом Mi-2 (NuRD) (Hakimi et al 2002), белками типа HP1, являющимися структурными составляющими хроматина (Bernard et al 2001, Nonaka et al 2002), а также белками хроматина с еще не охарактеризованными функциями (Ciosk et al 2000, Hartman et al 2000, Panizza et al 2000). Однако, как таковое, взаимодействие когезина с хроматином остается неизученным. В связи с этим невозможно ответить на фундаментальный вопрос об образовании и структуре сайтов когезии сестринских хроматид. Согласно данным, представленным в этой работе, связывание когезина с хроматином ведет к образованию комплексов с определенной стехиометрией (рис. 7Б), в отличие от случая связывания когезина с «голой» ДНК (рис. 7А). Оценка размеров когезина позволяет
сделать вывод о том, что в просвете когезина может уместиться несколько хроматиновых волокон (Anderson et al. 2002, Haering et al. 2002). С биологической точки зрения естественно предположить, что максимальное число волокон - два (в соответствии с тем, что когезин должен удерживать две | сестринские хроматиды)._
А f
Рис. 7. Различные варианты образования сайта когезии в результате связывания когезина с ДНК и хроматином
Панель А. Гипотетический механизм неспецифического связывания когезина с «голой» ДНК, наблюдаемого In vitro. Схема структуры когезина приведена в соответствии с имеющимися данными (Anderson etaL 2002, Haering etaL 2002). Димер Smclp/Smc3p выделен светло-серым, белок Mcdlp - темно-серым, белок Scc3p-пунктироч, а ДНК и нуклеосомы — черным цветом.
Панель Б. Гипотетический механизм связывания когезина с динуклеосомой, в соответствии с полученными данными in vitro (Рис. 5А).
Панель В. Предполагаемый механизм формирования сайта когезии in vivo. Показана упрощенная динамика сборки когезина в хроматине на этапе от ранней S-фазы до G2/M. Формирование активного сайта когезии предположительно зависит от присутствия всех четырех субъеднниц когезина и двух нитей хроматина.
Полученные в настоящей работе результаты хорошо согласуются с этим, если сравнивать подвижность комплексов когезин: динуклеосома с маркером, представляющим собой фрагменты хроматина, отличающиеся между собой на две нуклеосомы (рис. 5А). Комплекс, образованный двумя динуклеосомами и когезином, имел бы большую подвижность, чем две динуклеосомы, но меньшую, чем три, что, вероятно, и отражает результат, полученный нами (рис. 5А). Следовательно, можно предположить, что образование активного сайта когезии (т. е. участка, где две сестринские хроматиды скреплены друг с другом при помощи когезина) напрямую зависит от соседства двух хроматиновых волокон, доступных для действия когезина. При этом данные, свидетельствующие об отсутствии стехиометрии у связывания когезином ДНК (Losada et al. 2001) (рис. ЗА), получают логичное объяснение. Из-за того, что диаметр "голой " ДНК значительно меньше диаметра хроматинового волокна, в просвете когезина может задерживаться большое количество молекул ДНК за счет относительно более слабого взаимодействия, что приводит к образованию агрегатов с большим различием в подвижности (рис. ЗА и 7А). В случае взаимодействия с двумя хроматиновыми волокнами, когезин жестко
связывается единственно возможным образом, что и приводит к образованию специфического комплекса.
Несколько неожиданным можно считать одинаковый характер взаимодействия когезина с фрагментами ДНК, образующими сайты когезии in vivo и с ДНК, достоверно не контактирующими с когезином в клетке (рис. ЗА). Это указывает на то, что для образования сайтов когезии последовательность ДНК не является определяющей. Этот результат не удивителен в свете ранее полученных данных, ведь проанализированные сайты когезии на хромосомах S. cerevisiae не содержат каких-либо общих специфических последовательностей (Blat et al. 1999, Tanaka et al. 1999). Единственное, что объединяет идентифицированные сайты когезии, это повышенное относительное содержание пар А-Т. В экспериментах, представленных в настоящей работе, этот феномен получил подтверждение в упрощенной системе in vitro (рис. ЗБ). Эти данные позволяют предположить, что в образование сайтов когезии вносит некоторый вклад нуклеотидный состав в том или ином хромосомном локусе. Например, повышенная аффинность когезина к (А-Т)-богатым областям может помогать когезину найти нужный район хроматина для последующего специфического связывания, за которое ответственны факторы, не зависящие от последовательности ДНК. Впрочем, эта гипотеза достаточно сложна для проверки.
К исследованию упорядоченного хроматина, как субстрата для когезина, нас подтолкнуло интересное свойство различных последовательностей ДНК с разной эффективностью позиционировать нуклеосомы. Известно, что общим свойством хромосомных локусов, содержащих сайты когезии у S. cerevisiae, является упорядоченная структура хроматина. Это справедливо для центромерных областей (Bloom et al. 1982, Tanaka et al. 1999), рДНК (Chipev et al. 1992, Laloraya et al. 2000) и локуса HMR (Cheng et al. 1998, Donze et al. 1999). Простой эксперимент in vitro, приведенный в этой работе (рис. ЗВ), предполагает, что способность ДНК определенным образом упорядочивать хроматин может быть одним из факторов, регулирующих образование сайта когезии в том или ином локусе.
Одним из важнейших направлений для дальнейших исследований является подробное описание связывания когезина с хроматином, что потребует привлечения рентгено-структурного анализа. Первичный анализ некоторых аспектов этого взаимодействия, приведенный в данной работе, показал, что это взаимодействие не зависит от линкерной ДНК, а также хвостов гистонов ядра нуклеосомы. Первый факт являлся ожидаемым, в силу отсутствия специфического взаимодействия когезина с ДНК (см. выше). Второй результат, при ближайшем рассмотрении, также не представляется удивительным. В самом деле, сайты когезии присутствуют во множестве локусов по всей длине каждой хромосомы (Blat et a/., 1999, Tanaka et al, 1999), причем эти локусы должны различаться по таким
характеристикам, как активность транскрипции генов данного локуса, что неразрывно связано со статусом модификации хвостов гистонов (Turner, 2002). Поэтому логичным представляется отсутствие регуляции связывания когезина с хроматином через хвостовые домены ядра нуклеосомы. Таким образом, предлагаемая гипотеза о взаимодействии когезина с ядром нуклеосомы хорошо согласуется с универсальностью основной функции когезина по обеспечению когезии сестринских хроматид. Однако хотя связывание когезина с хроматином не зависит от присутствия немодифицированных хвостов коровых гистонов, изучение возможного влияния различных модификаций хвостов гистонов на аффинность когезина по отношению к хроматину представляет интересную задачу для дальнейших исследований.
Изучение динамики связывания субъединиц когезина с хроматином (рис. 6Б), а также данные in vitro (рис. 6А), полученные в этой работе, свидетельствуют о том, что основная функция белков SMC когезина по обеспечению когезии на этапе от S-фазы до рубежа анафазы не только зависит от наличия в ядре двух других субъединиц, но также требует сборки когезина на хроматине в S-фазе. Полученные результаты (рис. 6А-В) подтверждают модель, согласно которой, для установления и поддержания когезии когезин в составе четырех субъединиц должен охватывать хроматиды в целостное «кольцо» (Gruber et ah 2003, Haering et al. 2002). Однако жесткое связывание с хроматином in vivo и in vitro (рис. 1 A, 5А), обнаруженное в настоящей работе, позволяет модифицировать эту модель (рис. 7В). Важным дополнением к представлению о механизме установления когезии является плотный контакт, образуемый четырехсубъединичным когезином с хроматином в S-фазе. Дальнейшие исследования должны быть направлены на выяснение того, каким образом структура хроматина регулирует этот механизм.
ВЫВОДЫ
1. Когезин имеет высоко-аффинное сродство к хроматину.
2. Активный когезин S. cerevisiae, состоящий из рекомбинантных белков Smclp, Smc3p, Scc3p и Mcdlp, может быть выделен и очищен из клеток насекомых.
3. Рекомбинантный когезин образует с фрагментом хроматина специфический комплекс in vitro.
4. Рекомбинантный когезин не образует специфических комплексов с ДНК in vitro, но имеет повышенное сродство к АТ-богатой ДНК.
5. Для взаимодействия рекомбинантного когезина с фрагментом хроматина in vitro недостаточно гетеродимера белков Smclp и Smc3p.
6. Взаимодействие рекомбинантного когезина с фрагментом хроматина in vitro не зависит от линкерной ДНК, а также от хвостовых доменов коровых гистонов.
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Kagansky A., Freeman L., Lukyanov D., and Strunnikov A. Histone-tail independent chromatin-binding activity of recombinant cohesin holocomplex // J Biol Chem. 2004 Jan 30; 279(5): p. 3382.
2. Каганский A.M., Струнников A.B. // Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня. 2002. С.-Петербург: ПИЯФ РАН. С. 185,
3. Каганский A.M., Струнников А.В. Новый белковый комплекс (мейкогезин), регулирующий когезию сестринских хроматид в мейозе у Saccharomyces cerevisiae II Доклады РАН. 2004; 394 (3). С. 414.
4. Kagansky A., Strunnikov A. Purification ofS. cerevisiae mitotic and meiotic recombinant cohesin complexes // Eucaryotic Replication Meeting, La Jolla, 2000: p. 77.
5. Kagansky A., Strunnikov A. Directed Mutagenesis of a Cohesin Subunit in Saccharomyces cerevisiae, II Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, Seattle, 2000: p. 169. (http://www.veastgenome.org/veastOO/abshtml/363.htmn
6. Kagansky A., Strunnikov A. In vitro characterization ofS. cerevisiae cohesin complex. // ASCB Meeting, Washington, 2001: p. 239.
7. Kagansky A., Lukyanov D., Strunnikov A. S. cerevisiae recombinant cohesin complex binds to chromatin with high affinity in vitro II Cold Spring Harbor Yeast Cell Biology Meeting, Cold Spring Harbor, 2002: p. 78.
8. Kagansky A., Lukyanov D., Strunnikov A. Chromatin is a preferred substrate for cohesin binding independently of histone tails // Transregio 5 Symposium, Munchen, 2003: p. 35.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Akhmedov A.T., С. Frei, M. Tsai-PJlugfelder et al., 1998. Structural maintenance of chromosomes protein C-terminal domains bind preferentially to DNA with secondary structure. J Biol Chem. 273(37): p. 24088-94.
Anderson D.E., A. Losada, H.P. Erickson et al., 2002. Condensin and cohesin display different arm
conformations with characteristic hinge angles. J Cell Biol. 156(3): p. 419-24. Bernard P., J.F. Kfaure, J.F. Partridge et al., 2001. Requirement of heterochromatin for cohesion at
centromeres. Science. 294(5551): p. 2539^2. Blat Y. and N. Kleckner, 1999. Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with
differential regulation along arms versus the centric region. Cell. 98(2): p. 249-59. Bloom K.S. and J. Carbon, 1982. Yeast centromere DNA is in a unique and highly ordered structure
in chromosomes and small circular minichromosomes. Cell. 29(2): p. 305-17. Cheng Т.Н., Y.C. Li, and М.Я Gartenberg, 1998. Persistence of an alternate chromatin structure at
silenced loci in the absence of silencers. Proc Natl Acad Sci U S A. 95(10): p. 5521-6. Chipev C.C. and A. P. Wolffe, 1992. Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and
somatic 5S rRNA genes in vivo. Mol Cell Biol. 12(1): p. 45-55. Ciosk A, M. Shirayama, A. Shevchenko et al, 2000. Cohesin's binding to chromosomes depends on
a separate complex consisting of Scc2 and Scc4 proteins. Mol Cell. 5(2): p. 243-54. Darwiche N.. L.A. Freeman, and A. Strunnikov, 1999. Characterization of the components of the
putative mammalian sister chromatid cohesion complex. Gene. 233(1-2): p. 39-47. Donze D., C.R. Adams, J. Rine et aL, 1999. The boundaries of the silenced HMR domain in
Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 13(6): p. 698-708. Georgel P.T., T. Tsuktyama, and C. Wu, 1997. Role of histone tails in nucleosome remodeling by Drosophila NURF. EmboJ. 16(15): p. 4717-26.
Chidelh S, D Donze, N Dhillon et al, 2001 Sir2p exists in two nucleosome-bmding complexes
with distinct deacetylase activities EmboJ 20(16) p 4522-35 Gruber S,CH Haering, and K Nasmyth, 2003 Chromosomal cohesm forms a ring. Cell 112(6) p 765-77
Cuacct V, A Yamamoto, A Slrunntkov et al, 1993 Structure and function of chromosomes in
mitosis of budding yeast Cold Spring Harb Symp Quant Biol 58(p 677-85 Guacci V, D Koshland, and A Strunmkov, 1997 A direct link between sister chromatid cohesion and chromosome condensation revealed through the analysis of MCD1 in S cerevisiae Cell 91(1) p 47-57
Haering CH,J Lowe, A Hochwagen et al, 2002 Molecular architecture of SMC proteins and the
yeast cohesin complex. Mol Cell 9(4) p 773-88 Hakimi MA , DA Bochar, JA Schmiesing et al, 2002 A chromatin remodelling complex that
loads cohesin onto human chromosomes Nature 418(6901) p 994-8 Hartman T, K Stead, D Koshland et al, 2000 Pds5p is an essential chromosomal protein required for both sister chromatid cohesion and condensation in Saccharomyces cerevisiae J Cell Biol 151(3) p 613-26
Hirano M, DE Anderson, H P Erickson et al, 2001 Bimodal activation of SMC ATPase by intra-
and inter-molecular interactions EMBOJ 20(12) p 3238-3250 Hirano T, 2000 Chromosome cohesion, condensation, and separation Annu Rev Biochem 69(p 115-44
Hirano T, 2002 The ABCs of SMC proteins two-armed ATPases for chromosome condensation,
cohesion, and repair Genes Dev 16(4) p 399-414 Ishu K, G Arib, C Lm et al, 2002 Chromatin boundaries in budding yeast the nuclear pore
connectioa Cell 109(5) p 551-62 Ivanov D, A Schleiffer, F Eisenhaber et al, 2002 Ecol is a novel acetyltransferase that can
acetylate proteins involved in cohesion Curr Biol 12(4) p 323-8 Jallepalh P V and C Lengauer, 2001 Chromosome segregation and cancer cutting through the
mystery Nat Rev Cancer 1(2) p 109-17 Kagansky A and A Strunmkov 2000a. Purification of S cerevisiae mitotic and meiotic recombinant
cohesin complexes in 1st Eucaryotic replication meeting abstracts, La Jolla (USA) p77 Kagansky A and A Strunmkov 2000b Directed Mutagenesis of a Cohesin Subunit in Saccharomyces cerevisiae in Yeast genetics and molecular biology meeting abstracts, Seattle (USA) p 169
Kagansky A and A Strunmkov 2001 In vitro characterization of S cerevisiae
cohesin complex in 41 th ASCB meeting abstracts, Washington (USA) p 239 Kagansky A, D Lukyanov, and A Strunmkov 2002 5 cerevisiae recombinant cohesin complex binds to chromatin with high affinity m vitro in Yeast cell biology meeting abstracts, Cold Spring Harbor (USA) p 78 Kagansky A, D Lukyanov, L Freeman et al 2003 Chromatin is a preferred substrate for cohesin binding independently of histone tails in Transregio 5 Symposium abstracts, München (Germany) p 35
Kagansky A , L Freeman, D Lukyanov et al, 2004 Histone Tail-independent Chromatin Binding
Activity of Recombinant Cohesin Holocomplex. J Biol Chem 279(5) p 3382-8 Kim JS ,TB Krasieva, V LaMorte et al, 2002a. Specific recruitment of human cohesin to laser-
induced DNA damage J Biol Chem 277(47) p 45149-53 Kim ST, B Xu, and MB Kastan, 2002b Involvement of the cohesin protein, Smcl, in Atm-
dependent and independent responses to DNA damage Genes Dev 16(5) p 560-70 Laloraya S, V Guacci, and D Koshland, 2000 Chromosomal addresses of the cohesin component
Mcdlp J Cell Biol 151(5) p 1047-56 Liang C andB Stillman, 1997 Persistent initiation of DNA replication and chromatin-bound MCM
proteins during the cell cycle in cdc6 mutants Genes Dev 11(24) p 3375-86 Loo S and J Rine, 1994 Silencers and domains of generalized repression. Science 264(5166) p 1768-71
Losada A, M Hirano, and T Hirano, 1998 Identification of Xenopus SMC protein complexes required for sister chromatid cohesion. Genes Dev 12(13) p 1986-97
Отпечатано в типографии ПИЯФ РАН
188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 100, тир. 100, уч-изд. л. 1; 25.02.2004 г.
ft-- 6598
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каганский, Александр Маркович
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Цели и задачи исследования
Основные положения, выносимые на защиту
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Биологическая роль когезии сестринских хроматид
2. Молекулярная природа когезии сестринских хроматид
2.1. Введение
2.2. Когезин: структура комплекса и механизм действия
2.3. Дополнительные факторы когезии в митотическом цикле
2.4. Когезия в мейозе
3. Регуляция когезии при сегрегации хромосом
4. Структура сайтов когезии
5. Открытые вопросы в когезии 26 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Стандартные методы
2. Манипуляции с клетками дрожжей
3. Антитела
4. Очистка рекомбинантных белков
5. Метод торможения фрагментов ДНК в геле (ретардация)
6. Сборка хроматина in vitro
7. Эксперименты по связыванию когезина с хроматином
8. Прочие эксперименты in vitro 40 РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Функциональная характеризация когезина
1.1. Исследование структуры сайтов когезии in vivo
1.2. Взаимодействие когезина с ДНК и хроматином in vitro
1.3. Исследование вклада составляющих когезина в установление когезии:
2. Исследование структурно-функциональных взаимоотношений белков, участвующих в когезии сестринских хроматид
2.1. Сайт-направленный мутагенез белка Med 1 р
2.2. Изучение роли белка Pds5p в когсзии
2.3. Изучение роли белка Ecolp в когезии 3. Мейотический вариант когезина ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ Благодарности
Введение Диссертация по биологии, на тему "Связывание когезина Saccharomyces cerevisiae с хроматином"
Клетки всех эукариотических организмов, включая Saccharomyces cerevisiae и человека, наследуют генетическую информацию на ДНК, которая уложена в ДНК-белковый комплекс - хромосому. Для воспроизведения точных копий своего генома, в процессе митоза или мейоза, клетке необходимо правильным образом разделить каждую редуплицировавшуюся хромосому на две хроматиды, чтобы дочерняя клетка получила одну из них. Недостаток или избыток числа хроматид приводит, соответственно, к гибели или дестабилизации генома. Так, человеческие эмбрионы с неправильным хромосомным набором в большинстве случаев погибают, а в случае их выживания приводят к серьезным дефектам у новорожденных. Подобные же нарушения в клетках взрослого человека часто являются причиной злокачественных новообразований (Jallepalli et al. 2001).
История изучения процесса, получившего название «когезия сестринских хроматид» насчитывает немногим более пяти лет, когда было доказано, что хроматиды остаются сцепленными друг с другом при помощи специализированного белкового комлекса, когезина, с момента их синтеза до расхождения. Именно механизм когезии лежит в основе хорошо известного (по' данным микроскопии) распределения хромосом в центре митотического веретена и последующего одновременного расхождения хромосом к противоположным полюсам (Tanaka et al. 2000, Toyoda et al. 2002).
Установление когезии происходит строго во время репликации и непосредственным образом зависит от формирования когезина, состоящего из четырех субъединиц : Smcl; Smc3; Mcdl/Sccl/Rad21 и Scc3/SA1,2 (Losada et al. 1998, Toth et al. 1999, Uhlmann et al.
1998). Данные, полученные к настоящему моменту, свидетельствуют о том, что образовавшиеся при этом хроматиды могут удерживаться вместе либо за счет ДНК-связывающей активности когезина (Akhmedov et al. 1998, Hirano 2000), либо за счет удержания хроматид внутри кольца, образуемого субъединицами когезина (Haering et al. 2002).
Хотя главная функция когезина состоит в обеспечении правильной сегрегации хромосом, он, по-видимому, принимает участие в других важных процессах в клетке и играет роль в структурной организации хроматина. Кроме того, он принимает участие в ответе клетки на повреждение ДНК (Kim et al. 2002а, Kim et al. 2002b, Yazdi et al. 2002), в репарации двунитевых разрывов (Pasierbek et al. 2001, Sjogren et al. 2001, Walowsky et al.
1999) и регуляции образования гетерохроматипа (Donze et al. 1999, Ishii et al. 2002, Nonaka et al. 2002). При этом, в силу того, что когезин был до сих пор практически не охарактеризован с точки зрения его ферментативной активности, остается неизвестным, заложена ли многофункциональность когезина в его способности «скреплять» хроматиды, или же у данного комплекса много различных молекулярных функций.
Хотя центральная роль в обеспечении когезии сестринских хроматид отводится когезину, этот процесс зависит от ряда других белковых факторов, многие из которых остается к настоящему моменту плохо изученными. К их числу относятся белки Pds5p и Ecolp, роль которых в когезии, а также взаимоотношения с когезином, до сих пор не известны.
В настоящий момент молекулярный механизм установления когезии практически не изучен. Центральным вопросом здесь является то, каким образом когезин физически взаимодействует с хромосомой, а также, чем обусловлена пространственная и временная специфичность этого взаимодействия in vivo. Принимая во внимание тот факт, что когезин связывается с хромосомами в локусах с различной структурой, включая такие как эу- и гетерохроматин, центромерные области и двунитевые разрывы хромосом, для исследования функции когезина, необходимо разработать экспериментальные системы, моделирующие когезию in vitro.
Представленная работа посвящена исследованию молекулярных механизмов когезии сестринских хроматид в различных условиях. Главной целью данного исследования было выделить четырехсубъединичный когезин из S. cerevisiae и установить его субстратную специфичность.
Задачи исследования Целью данного исследования было выделение четырехсубъединичного когезина из Saccheromyces cerevisiae и установление его субстратной специфичности. Для ее достижения были поставлены следующие задачи
1. Определить особенности связывания когезина с хромосомами S. cerevisiae in vivo.
2. Клонировать, экспрессировать и очистить рекомбинантный когезин S. cerevisiae.
3. Охарактеризовать ДНК-связывающую активность когезина in vitro.
4. Охарактеризовать хроматин-связывающую активность когезина in vitro.
5. Определить факторы, влияющие на взаимодействие когезина с хроматином in vitro.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Активный рекомбинантный комплекс когезин дрожжей S. cerevisiae может быть выделен из клеток насекомых.
2. Взаимодействие рекомбинантного когезина хроматином in vitro является специфическим и характеризуется высокой аффинностью.
3. Взаимодействие когезина с хроматином происходит не через хвостовые домены гистонов и не через межнуклеосомную (линкерную) ДНК.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Каганский, Александр Маркович
выводы
1.Когезин дрожжей S. cerevisiae имеет высоко-аффинное сродство к хроматину.
2.Активный когезин S. cerevisiae, состоящий из рекомбинантных белков Smclp, Smc3p, Scc3p и Mcdlp, может быть выделен и очищен из клеток насекомых.
3.Рекомбинантный когезин образует с фрагментом хроматина специфический комплекс in vitro.
4.Рекомбинантный когезин не образует специфических комплексов с ДНК, но имеет повышенное сродство к АТ-богатой ДНК.
5.Для взаимодействия когезина с фрагментом хроматина in vitro не достаточно гетеродимера белков Smclp и Smc3p.
6.Взаимодействие рекомбинантного когезина с фрагментом хроматина не зависит от линкериой ДНК, а также от хвостовых доменов коровых гистонов.
Благодарности
Автор благодарен Дмитрию Байтину, Юрию Килю и Эстебану Баллестар (Estebari Ballestar) за обучение некоторым экспериментальным методам на начальном этапе настоящей работы. Автор искренне признателен Лите Фриман (Lita Freeman), Йоши Адзума (Yoshi Azuma) и Дмитрию Гущину за содействие в экспериментальной работе и ценные советы. Хотелось бы также поблагодарить Эрин Шлаг (Erin Schlag) за помощь в сиквенировании образцов ДНК, а также Карла By (Carl Wu), Питера Джонса (Peter Johnes) и Стефана Дмитрова за предоставленные материалы. Особую признательность автор выражает Дмитрию Лукьянову за активное участие в экспериментах и обсуждении результатов.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каганский, Александр Маркович, Санкт-Петербург
1. Agarwal, R. and О. Cohen-Fix. 2001. Pdsl is a novel substrate of Cdc28. in Yeast cell biology meeting abstracts.
2. Cold Spring Harbor Laboratory.
3. Akhmedov, A.T., C. Frei, M. Tsai-PJlugfelder, et al., 1998. Structural maintenance of chromosomes protein C-terminal domains bind preferentially to DNA with secondary structure. J Biol Chem. 273(37): p. 24088-94.
4. Alexandru, G., F. Uhlmann, K. Mechtler, et al., 2001. Phosphorylation of the cohesin subunit Sccl by Polo/Cdc5 kinase regulates sister chromatid separation in yeast. Cell. 105(4): p. 459-72.
5. Amon, A., U. Surana, I. Muroff, et al., 1992. Regulation of p34CDC28 tyrosine phosphorylation is not required for entry into mitosis in S. cerevisiae. Nature. 355(6358): p. 368-71.
6. Anderson, D.E., A. Losada, H.P. Erickson, et al., 2002. Condensin and cohesin display different arm conformations with characteristic hinge angles. J Cell Biol. 156(3): p. 419-24.
7. Bachant, J., A. Alcasabas, Y. Blat, et al., 2002. The SUMO-1 isopeptidase Smt4 is linked tocentromeric cohesion through SUMO-1 modification of DNA topoisomerase II. Mol Cell. 9(6): p. 1169-82.
8. Bernard, P., J.F. Maure, J.F. Partridge, et al., 2001. Requirement of heterochromatin for cohesion at centromeres. Science. 294(5551): p. 2539-42.
9. Bernard, P. and R. Allshire, 2002. Centromeres become unstuck without heterochromatin. Trends Cell Biol. 12(9): p. 419-24.
10. Birkenbihl, R.P. andS. Subramani, 1992. Cloning and characterization of rad21 an essential gene of Schizosaccharomycespombe involved in DNA double-strand-break repair. Nucleic Acids Res. 20(24): p. 6605-11.
11. Blat, Y. andN. Kleckner, 1999. Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region. Cell. 98(2): p. 249-59.
12. Bloom, K.S. and J. Carbon, 1982. Yeast centromere DNA is in a unique and highly orderedstructure in chromosomes and small circular minichromosomes. Cell. 29(2): p. 305-17.
13. Buonomo, S.B., R.K. Clyne, J. Fuchs, et al., 2000. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103(3): p. 387-98.
14. Chandler, S.P., D. Guschin, N. Landsberger, et al., 1999. The methyl-CpG binding transcriptional repressor MeCP2 stably associates with nucleosomal DNA. Biochemistry. 38(22): p. 700818.
15. Cheng, Т.Н., Y.C. Li, and M.R. Gartenberg, 1998. Persistence of an alternate chromatin structure at silenced loci in the absence of silencers. Proc Natl Acad Sci USA. 95(10): p. 5521-6.
16. Chipev, C.C. and A.P. Wolffe, 1992. Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and somatic 5S rRNA genes in vivo. Mol Cell Biol. 12(1): p. 45-55.
17. Ciosk, R., M. Shirayama, A. Shevchenko, et al., 2000. Cohesin's binding to chromosomes depends on a separate complex consisting of Scc2 and Scc4 proteins. Mol Cell. 5(2): p. 243-54.
18. Cohen-Fix, O., J.M. Peters, M.W. Kirschner, et al., 1996. Anaphase initiation in Saccharomycescerevisiae is controlled by the APC-dependent degradation of the anaphase inhibitor Pdsl p. Genes Dev. 10(24): p. 3081-93.
19. Comings, D.E., 1966. Centromere: absence of DNA replication during chromatid separation in human fibroblasts. Science. 154(755): p. 1463-1464.
20. Dohmen, R.J., P. Wu, and A. Varshavsky, 1994. Heat-inducible degron: a method for constructing temperature-sensitive mutants. Science. 263(5151): p. 1273-6.
21. Donze, D„ C.R. Adams, J. Rine, et al., 1999. The boundaries of the silenced HMR domain in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 13(6): p. 698-708.
22. Freeman, L„ L. Aragon-Alcaide, and A. Strunnikov, 2000. The condensin complex governschromosome condensation and mitotic transmission of rDNA. J Cell Biol. 149(4): p. 81124.
23. Funabiki, H„ I. Hagan, S. Uzawa, et al, 1993. Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast. J Cell Biol. 121(5): p. 961-76.
24. Funabiki, H., H. Yamano, K. Kumada, et al., 1996. Cut2 proteolysis required for sister-chromatid seperation in fission yeast. Nature. 381(6581): p. 438-41.
25. Georgel, P.T., T. Tsukiyama, andC. Wu, 1997. Role of histone tails in nucleosome remodeling by Drosophila NURF. EmboJ. 16(15): p. 4717-26.
26. Ghidelli, S., D. Donze, N. Dhillon, et al., 2001. Sir2p exists in two nucleosome-binding complexes with distinct deacetylase activities. Embo J. 20(16): p. 4522-35.
27. Goh, P.Y. and J. V. Kilmartin, 1993. NDC10: a gene involved in chromosome segregation in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 121(3): p. 503-12.
28. Goldstein, L.S., 1980. Mechanisms of chromosome orientation revealed by two meiotic mutants in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 78(1): p. 79-111.
29. Goshima, G. andM. Yanagida, 2000. Establishing biorientation occurs with precocious separation of the sister kinetochores, but not the arms, in the early spindle of budding yeast. Cell. 100(6): p. 619-33.
30. Gregson, H.C., J.A. Schmiesing, J.S. Kim, et al., 2001. A potential role for human cohesin in mitotic spindle aster assembly. J Biol Chem. 276(50): p. 47575-82.
31. Gruber, S., C.H. Haering, andK. Nasmyth, 2003. Chromosomal cohesin forms a ring. Cell. 112(6): p. 765-77.
32. Guacci, V., A. Yamamoto, A. Strunnikov, et al., 1993. Structure and function of chromosomes in mitosis of budding yeast. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 58(p. 677-85.
33. Guacci, V., E. Hogan, and D. Koshland, 1994. Chromosome condensation and sister chromatid pairing in budding yeast. J Cell Biol. 125(3): p. 517-30.
34. Guacci, V., D. Koshland, and A. Strunnikov, 1997. A direct link between sister chromatid cohesion and chromosome condensation revealed through the analysis of MCD1 in S. cerevisiae. Cell. 91(1): p. 47-57.
35. Haering, C.H., J. Lowe, A. Hochwagen, et al., 2002. Molecular architecture of SMC proteins and the yeast cohesin complex. Mol Cell. 9(4): p. 773-88.
36. Hakimi, M.A., D.A. Bochar, J.A. Schmiesing, et al., 2002. A chromatin remodelling complex that loads cohesin onto human chromosomes. Nature. 418(6901): p. 994-8.
37. Hanna, J.S., E.S. Kroll, V. Lundblad, et al., 2001. Saccharomyces cerevisiae CTF18 and CTF4 are required for sister chromatid cohesion. Mol Cell Biol. 21(9): p. 3144-58.
38. Hartman, Т., К. Stead, D. Koshland, et al., 2000. Pds5p is an essential chromosomal proteinrequired for both sister chromatid cohesion and condensation in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 151(3): p. 613-26.
39. Hartsuiker, E., E. Vaessen, A.M. Carr, et al., 2001. Fission yeast Rad50 stimulates sister chromatid recombination and links cohesion with repair. Embo J. 20(23): p. 6660-71.
40. Hauf S., I.C. Waizenegger, andJ.M. Peters, 2001. Cohesin cleavage by separase required for anaphase and cytokinesis in human cells. Science. 293(5533): p. 1320-3.
41. He, X., S. Asthana, and P.K. Sorger, 2000. Transient sister chromatid separation and elastic deformation of chromosomes during mitosis in budding yeast Cell. 101(7): p. 763-75.
42. Hirano, M„ D.E. Anderson, H.P. Erickson, et al., 2001. Bimodal activation of SMC ATPase by intra- and inter-molecular interactions. EMBO J. 20(12): p. 3238-3250.
43. Hirano, Т., 2000. Chromosome cohesion, condensation, and separation. Annu Rev Biochem. 69(p. 115-44.
44. Hirano, Т., 2002. The ABCs of SMC proteins: two-armed ATPases for chromosome condensation, cohesion, and repair. Genes Dev. 16(4): p. 399-414.
45. Jallepalli, P. V. and C. Lengauer, 2001. Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery. Nat Rev Cancer. 1(2): p. 109-17.
46. Jensen, S., M. Segal, D.J. Clarke, et al., 2001. A novel role of the budding yeast separin Espl in anaphase spindle elongation: evidence that proper spindle association of Espl is regulated by Pdsl. J Cell Biol. 152(1): p. 27-40.
47. Jessberger, R., 2002. The many functions of SMC proteins in chromosome dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 3(10): p. 767-78.
48. Kagansky, A. and A. Strunnikov. 2000a. Purification of S. cerevisiae mitotic and meiotic recombinant cohesin complexes, in 1st Eucaryotic replication meeting abstracts1.Jolla, CA USA.
49. Kagansky, A. and A. Strunnikov. 2000b. Directed Mutagenesis of a Cohesin Subunit in
50. Saccharomyces cerevisiae. in Yeast genetics and molecular biology meeting abstracts1. Seattle.
51. Kagansky, A. and A. Strunnikov. 2001 .In vitro characterization ofS. cerevisiaecohesin complex, in 41th ASCB meeting abstracts.1. Washington.
52. Kagansky, A., D. Lukyanov, and A. Strunnikov. 2002. S. cerevisiae recombinant cohesin complex binds to chromatin with high affinity in vitro, in Yeast cell biology meeting abstracts.
53. Cold Spring Harbor Laboratory.
54. Kagansky, A., D. Lukyanov, L. Freeman, et al. 2003. Chromatin is a preferred substrate for cohesin binding independently ofhistone tails, in Transregio 5 Symposium abstracts1. Munchen.
55. Kagansky, A., L. Freeman, D. Lukyanov, et al., 2004. Histone Tail-independent Chromatin Binding Activity of Recombinant Cohesin Holocomplex. J Biol Chem. 279(5): p. 3382-8.
56. Kerrebrock, A.W., D.P. Moore, J.S. Wu, et al., 1995. Mei-S332, a Drosophila protein required for sister-chromatid cohesion, can localize to meiotic centromere regions. Cell. 83(2): p. 24756.
57. Kim, J.S., T.B. Krasieva, V. LaMorte, et al., 2002a. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J Biol Chem. 277(47): p. 45149-53.
58. Kim, S.T., B. Xu, and M.B. Kastan, 2002b. Involvement of the cohesin protein, Smcl, in Atm-dependent and independent responses to DNA damage. Genes Dev. 16(5): p. 560-70.
59. Kitajima, T.S., S. Yokobayashi, M. Yamamoto, et al., 2003. Distinct cohesin complexes organize meiotic chromosome domains. Science. 300(5622): p. 1152-5.
60. Koshland, D. and L.H. Hartwell, 1987. The structure of sister minichromosome DNA before anaphase in Saceharomyces cerevisiae. Science. 238(4834): p. 1713-6.
61. Kumada, К., T. Nakamura, К Nagao, et al., 1998. Cutl is loaded onto the spindle by binding to
62. Madril, A.C., R.E. Johnson, M.T. Washington, et al., 2001. Fidelity and damage bypass ability of Schizosaccharomycespombe Esol protein, comprised of DNA polymerase eta and sister chromatid cohesion protein Ctf7. J Biol Chem. 276(46): p. 42857-62.
63. Mayer, M.L., S.P. Gygi, R. Aebersold, et al., 2001. Identification of RFC(Ctfl8p, CtfSp, Dcclp): an alternative RFC complex required for sister chromatid cohesion in S. cerevisiae. Mol Cell. 7(5): p. 959-970.
64. McNeill, P.A. and M. W. Berns, 1981. Chromosome behavior after laser microirradiation of a single kinetochorc in mitotic PtK2 cells. J Cell Biol. 88(3): p. 543-53.
65. Megee, P.C., C. Mistrot, V. Guacci, et al., 1999. The centromeric sister chromatid cohesion site directs Mcdlp binding to adjacent sequences. Mol Cell. 4(3): p. 445-50.
66. Met, J., X. Huang, and P. Zhang, 2001. Securin is not required for cellular viability, but is required for normal growth of mouse embryonic fibroblasts. Curr Biol. 11(15): p. 1197-1201.
67. Melby, Т.Е., C.N. Ciampaglio, G. Briscoe, et al., 1998. The symmetrical structure of structural maintenance of chromosomes (SMC) and MukB proteins: long, antiparallel coiled coils, folded at a flexible hinge. J Cell Biol. 142(6): p. 1595-604.
68. Meluh, P.B. and A. V. Strunnikov, 2002. Beyond the ABCs of CKC and SCC. Do centromeres orchestrate sister chromatid cohesion or vice versa? Eur J Biochem. 269(9): p. 2300-14.
69. Mercier, R., D. Vezon, E. Bullier, et al., 2001. SWITCH1 (SWI1): a novel protein required for the establishment of sister chromatid cohesion and for bivalent formation at meiosis. Genes Dev. 15(14): p. 1859-71.
70. Michaelis, C„ R. Ciosk, and K. Nasmyth, 1997. Cohesins: chromosomal proteins that prevent premature separation of sister chromatids. Cell. 91(1): p. 35-45.
71. Miyazaki, W.Y. andT.L. Orr-Weaver, 1994. Sister-chromatid cohesion in mitosis and meiosis. Annu Rev Genet. 28(p. 167-87.
72. Moore, D.P. andO.-W. T.L., 1998. Chromosome segregation during meiosis: building an unambivalent bivalent. Curr Top Dev Biol. 37(p. 263-99.
73. Mumberg, D„ R. Muller, andM. Funk, 1995. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156(1): p. 119-22.
74. Murray, A.W. andJ.W. Szostak, 1985. Chromosome segregation in mitosis and meiosis. Annu Rev Cell Biol. 1 (p. 289-315.
75. Nasmyth, K., J.M. Peters, and F. Uhlmann, 2000. Splitting the chromosome: cutting the ties that bind sister chromatids. Science. 288(5470): p. 1379-85.
76. Nemergut, M.E., C.A. Mizzen, T. Stukenberg, et al., 2001. Chromatin docking and exchangeactivity enhancement of RCC1 by histones H2A and H2B. Science. 292(5521): p. 1540-3.
77. Nicklas, R.B. and S.C. Ward, 1994. Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension. J Cell Biol. 126(5): p. 1241-1253.
78. Nonaka, N. T. Kitajima, S. Yokobayashi, et al., 2002. Recruitment of cohesin to heterochromatic regions by Swi6/HPl in fission yeast Nat Cell Biol. 4(1): p. 89-93.
79. Panizza, S., T. Tanaka, A. Hochwagen, et al., 2000. Pds5 cooperates with cohesin in maintaining sister chromatid cohesion. Curr Biol. 10(24): p. 1557-64.
80. Partridge, J.F., K.S. Scott, A.J. Bannister, et al., 2002. cis-acting DNA from fission yeastcentromeres mediates histone H3 methylation and recruitment of silencing factors and cohesin to an ectopic site. Curr Biol. 12(19): p. 1652-60.
81. Pasierbek, P., M. Jantsch, M. Melcher, et al., 2001. A Caenorhabditis elegans cohesion proteinwith functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes Dev. 15(11): p. 134960.
82. Pati, D., N. Zhang, andS.E. Plon, 2002. Linking sister chromatid cohesion and apoptosis: role of Rad21. Mol Cell Biol. 22(23): p. 8267-77.
83. Pearson, C.G., P.S. Maddox, E.D. Salmon, et al., 2001. Budding yeast chromosome structure and dynamics during mitosis. J Cell Biol. 152(6): p. 1255-66.
84. Prieto, I., J.A. Suja, N. Pezzi, et al., 2001. Mammalian STAG3 is a cohesin specific to sister chromatid arms in meiosis I. Nat Cell Biol. 3(8): p. 761-6.
85. Rao, H., F. Uhlmann, K. Nasmyth, et al., 2001. Degradation of a cohesin subunit by the N-end rule pathway is essential for chromosome stability. Nature. 410(6831): p. 955-9.
86. Richards, E.J. and S.C. Elgin, 2002. Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects. Cell. 108(4): p. 489-500.
87. Rieder, C.L. and R.E. Palazzo, 1992. Colcemid and the mitotic cycle. J Cell Sci. 102(3): p. 387392.
88. Saez, С., M.A. Japon, F. Ramos-Morales, et al., 1999. hpttg is over-expressed in pituitary adenomas and other primary epithelial neoplasias. Oncogene. 18(39): p. 5473-5476.
89. Saitoh, S., A. Chabes, W.H. McDonald, et al, 2002. Cid 13 is a cytoplasmic poly(A) polymerase that regulates ribonucleotide reductase mRNA. Cell. 109(5): p. 563-73.
90. Schleiffer, A., S. Kaitna, S. Maurer-Stroh, et al., 2003. Kleisins: a superfamily of bacterial and eukaryotic SMC protein partners. Mol Cell. 11(3): p. 571-5.
91. Shonn, M.A., R. McCarroll, and A.W. Murray, 2002. Spol3 protects meiotic cohesin at centromeres in meiosis I. Genes Dev. 16(13): p. 1659-71.
92. Simon, R.H., R.D. Camerini-Otero, and G. Felsenfeld, 1978. An octamcr of histones 113 and H4 forms a compact complex with DNA of nucleosome size. Nucleic Acids Res. 5(12): p. 4805-18.
93. Sjogren, C. and K. Nasmyth, 2001. Sister chromatid cohesion is required for postreplicative double-strand break repair in Saccharomyces cerevisiae. Curr Biol. 11(12): p. 991-5.
94. Sonoda, E., T. Matsusaka, C. Morrison, et al., 2001. See 1/Rad21/Mcdl is required for sisterchromatid cohesion and kinetochore function in vertebrate cells. Dev Cell. 1(6): p. 759-70.
95. Stegmeier, F„ R. Visintin, and A. Amon, 2002. Separase, Polo Kinase, the Kinetochore Protein SIkl9, and Spol2 Function in a Network that Controls Cdcl4 Localization during Early Anaphase. Cell. 108(2): p. 207-20.
96. Stemmann, О., H. Zou, S.A. Gerber, et al., 2001. Dual inhibition of sister chromatid separation at metaphase. Cell. 107(6): p. 715-26.
97. Straight, A.F., A.S. Belmont, C.C. Robinett, et al., 1996. GFP tagging of budding yeastchromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Curr Biol. 6(12): p. 1599-608.
98. Stralmann, R. and C.F. Lehncr, 1996. Separation of sister chromatids in mitosis requires the
99. Drosophila pimples product, a protein degraded after the metaphase/anaphase transition. Cell. 84(1): p. 25-35.
100. Strauss, F. and A. Varshavsky, 1984. A protein binds to a satellite DNA repeat at three specificsites that would be brought into mutual proximity by DNA folding in the nucleosome. Cell. 37(3): p. 889-901.
101. Sullivan, M., C. Lehane, and F. Uhlmann, 2001. Orchestrating anaphase and mitotic exit: separase cleavage and localization of Slkl9. Nat Cell Biol. 3(9): p. 771-777.
102. Sumara, /., E. Vorlaufer, C. Gieffers, et al., 2000. Characterization of vertebrate cohesin complexes and their regulation in prophase. J Cell Biol. 151(4): p. 749-62.
103. Sumara, I., E. Vorlaufer, P.T. Stukenberg, et al., 2002. The dissociation of cohesin fromchromosomes in prophase is regulated by Polo-like kinase. Mol Cell. 9(3): p. 515-25.
104. Sumner, A.T., 1991. Scanning electron microscopy of mammalian chromosomes from prophase to telophase. Chromosoma. 100(6): p. 410-8.
105. Tanaka, K., Z Hao, M. Kai, et al., 2001. Establishment and maintenance of sister chromatid cohesion in fission yeast by a unique mechanism. EMBO J. 20(20): p. 5779-5790.
106. Tanaka, Т., M.P. Cosma, K. Wirth, et al., 1999. Identification of cohesin association sites at centromeres and along chromosome arms. Cell. 98(6): p. 847-58.
107. Tanaka, Т., J. Fuchs, J. Loidl, et al., 2000. Cohesin ensures bipolar attachment of microtubules to sister centromeres and resists their precocious separation. Nat Cell Biol. 2(8): p. 492-9.
108. Tomonaga, Т., К. Nagao, Y. Kawasaki, et al., 2000. Characterization of fission yeast cohesin:essential anaphase proteolysis of Rad21 phosphorylated in the S phase. Genes Dev. 14(21): p. 2757-70.
109. Toth, A., R. Ciosk, F. Uhlmann, et al., 1999. Yeast cohesin complex requires a conserved protein, Ecolp(Ctf7), to establish cohesion between sister chromatids during DNA replication. Genes Dev. 13(3): p. 320-33.
110. Towbin, //., T. Staehelin, and J. Gordon, 1979. Elcctrophoretic transfer of proteins frompolyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA. 76(9): p. 4350-4.
111. Toyoda, Y„ К. Furuya, G. Goshima, et al., 2002. Requirement of chromatid cohesion proteinsrad21/sccl and mis4/scc2 for normal spindle-kinctochore interaction in fission yeast Curr Biol. 12(5): p. 347-58.
112. Turner, B.M., 2002. Cellular memory and the histonc code. Cell. 111(3): p. 285-91.
113. Uhlmann, F. andK. Nasmyth, 1998. Cohesion between sister chromatids must be established during DNA replication. Curr Biol. 8(20): p. 1095-101.
114. Uhlmann, F., F. Lottspeich, and K. Nasmyth, 1999. Sister-chromatid separation at anaphase onset promoted by cleavage of the cohesin subunit Sccl. Nature. 400(6739): p. 37-42.
115. Uhlmann, F., D. Wernic, M.A. Poupart, et al., 2000. Cleavage of cohesin by the CD clan protease separin triggers anaphase in yeast Cell. 103(3): p. 375-86.
116. Waizenegger, I.C., S. Hauf, A. Meinke, et al., 2000. Two distinct pathways remove mammalian cohesin from chromosome arms in prophase and from centromeres in anaphase. Cell. 103(3): p. 399-410.
117. Walowsky, C., D.J. Fitzhugh, LB. Castano, et al., 1999. The topoisomerase-related function gene TRF4 affects cellular sensitivity to the antitumor agent camptothecin. J Biol Chem. 274(11): p. 7302-8.
118. Wang, Z, LB. Castano, A. De Las Penas, et al., 2000. Pol kappa: A DNA polymerase required for sister chromatid cohesion. Science. 289(5480): p. 774-9.
119. Watanabe, Y., S. Yokobayashi, M. Yamamoto, et al., 2001. Pre-meiotic S phase is linked toreductional chromosome segregation and recombination. Nature. 409(6818): p. 359-63.
120. Yamamoto, A., V. Guacci, and D. Koshland, 1996. Pdslp, an inhibitor of anaphase in buddingyeast, plays a critical role in the APC and checkpoint pathway(s). J Cell Biol. 133(1): p. 99 110.
121. Yazdi, P.T., Y. Wang, S. Zhao, et al., 2002. SMC1 is a downstream effector in the ATM/NBS1 branch of the human S-phase checkpoint Genes Dev. 16(5): p. 571-82.
122. Zachariae, W. andK. Nasmyth, 1999. Whose end is destruction: cell division and the anaphase-promoting complex. Genes Dev. 13(16): p. 2039-2058.
123. Zheng, L., Y. Chen, andW.H. Lee, 1999. Hcclp, an evolutionarily conserved coiled-coil protein, modulates chromosome segregation through interaction with SMC proteins. Mol Cell Biol. 19(8): p. 5417-5428.
124. Zheng, L., Y. Chen, D.J. Riley, et al., 2000. Retinoblastoma protein enhances the fidelity of chromosome segregation mediated by hsHeclp. Mol Cell Biol. 20(10): p. 3529-3537.
125. Zou, H, T.J. McGarry, T. Bernal, et al., 1999. Identification of a vertebrate sister-chromatidseparation inhibitor involved in transformation and tumorigenesis. Science. 285(5426): p. 418-22.
126. Каганский, A.M. andA.B. Струнников. 2002. Механизмы когезии сестринских хроматид. in Бреслеровские Чтения. С.-Петербург: ПНЯФ РАН.
127. Каганский, A.M. andA.B. Струнников, 2004. Новый белковый комплекс (мейотическийкогезин), регулирующий когезию сестринских хроматид в мейозе у Saccharomyces cerevisiae. Доклады РАН. Биология, 3): р. 394.
-
Каганский, Александр Маркович
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2004
-
ВАК 03.00.03
- Цис- и транс-действующие факторы, контролирующие экспрессию гена SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae
- Исследование роли конденсинов в формировании высших уровней организации хроматина и структурно-функциональной организации ядрышка
- Топология компонентов конденсинового комплекса в оогенезе шпорцевой лягушки Xenopus Laevis и морского ежа Paracentrotus Lividus
- Организация генов, кодирующих белки семейства SMC у обыкновенной полевки Microtus arvalis
- Механизмы формирования внутреннего центромерного домена кинетохора позвоночных животных
