Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Связь процесса окисления восстановленных серных соединений с особенностями функционирования дыхательной цепи Beggiatoa leptomitiformis и Macromonas biounctata

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Связь процесса окисления восстановленных серных соединений с особенностями функционирования дыхательной цепи Beggiatoa leptomitiformis и Macromonas biounctata"

п а иг р

академия наук ссср институт шсробколош

11а правах рукописи УДК 579.822.24.21.

ЧЕКАНОЗА Юлия Александровна

Связь процесса окисления восстановленных серных соединений с особенностями функционирования дыхательной цепи Веее1а1:оа 1ер^шШ.1огт18 И Масготопаз Ырипс^аЪа

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

\

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ч

N

Москва - 1991

ч

Работа выполнена в Институте микробиологии АН СССР

Научный руководитель: доктор биологических наук Г.А.Дубинина

Официальные оппоненты: член-корреснондентчАН СССР профессор Е.Н.Кондратьева, 4

кандидат биологических наук А.В.Яебеданскнй

Ведущее учреждение: Институт биохшкй и физиологии микроорганизмов АН СССР

Залдата.диссертации состоится " —-1991 г.

в № часов яа заседании специализированного совета Д.СЮ2.64.01 в Институте микробиологии АЕ СССР по адресу: 117312, г. Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корпус 2.

С диссертацией кояяо ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР.

Автореферат разослан "/£" 1990 Г<

Ученый секретарь специализированного совета, к.б.н. Л.Е.Никитин

j -;, ;. i

...... . \ ВВЕДЕНИЕ

ïi'.CCttpTT ?.£»! )

Актуальность проблемы. Окислительная часть круговорота сера

2

в природе включает стадии превращения отБдэ so^, которые могут протекать в зависимости от условий, как чисто химически, так и с участием микроорганизмов.

Способность к окислению восстановленных соединений серы присуща широкому кругу микроорганизмов разных физиологических и таксономических групп. Среда хемотрофных сероокислотцих организмов груша бесцветных серобактерий привлекает внимание микробиологов с давнего времени. Бесцветные серобактерии -являются важными компонентами биоценозов преснозодных и морских местообитаний, характеризующихся присутствием сероводорода. Однако вопрос о путях метаболизма большинства известных бесцветных серобактерий остается слабо изученным. Недостаток знаний о путях метаболизма серы не позволяет подойти к оценке роля бесцветных серобактерий в круговороте серы в природе, хотя их высокая численность в -определенных экологических яяшах предполагает активное участие в указанных процессах.

Таким образом, для выяснения роли бесцветных серобактерий в цикле серы в природных биоценозах необходимо детальное знание биохимии и физиологии микроорганизмов, осуществляющих эти реакции. ...

Состояние вопроса, цели и задачи. Представители группы бесцветных серобактерий в настоящее время изучены слабо. В особенности это касается вопросов, связанных с их серным метабо-члизмоьг. Наряду со способностью некоторых морских штаммов Beggia-toa к литоавтотрофш за счет окисления соединений серы (Kelson, Jannascîi, 1983; Nelson, étal, 1989), для ряда нитчатых И одноклеточных бесцветных серобактерий установлено участие серных соединений в детоксикации продуктов аэробного метаболизма (Burton, Korita, 1964; Дубинина, Грабов кч, 1983, 1984; Грабович, 1984).

Целью настоящей работы было изучение физиолого-биохимичес-них процессов, связанных с окислением восстановленных соединений серы у представителей бесцветных серобактерий Beggiatoa lepto-

mitiforais И Kacromonas btpunctata. Образование перекиси водорода и ее участие в окислении восстановленных серных соединений у этих микроорганизмов было установлено ранее (Dubinins, 1981; Грабозич, 1984), но детально этот вопрос не исследовался.

Конкретные задачи настоящей работы состояли в следующем:

I. Определение условий и интенсивности процесса образования ftj02 у исследуемых серобактерий,

• 2. Установление связи образования Hg02 с функционированием дыхательной цепи.

3. Выяснение связи процесса образования продуктов неполного восстановления кислорода с окислением восстановленных серных • соединений.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые у бесцветных серобактерий B.leptomitiformis И K.bipuactata ВНЯС-нены механизм, услозия и интенсивность процесса образования перекиси водорода. Образование I^Og yB.leptomitiforais происходит на урозне хинонового участка флавопротеидного сегаента . НАДН-дегидрогеназы. Установлено, что накопление Н?^ и 02- у . B.leptooitiformisEn.bipunctata происходит В периплазме И инвагинатах цитоплазматической мембраны, что у бактериальных клеток обнаружено впервые. Показано, что окисление сульфида у B.leptomitiformis связано с функционированием электронтранс-портной цепи лишь косвенно, за счет взаимодействия с продуктами. неполного восстановления кислорода, образующимися в дыхательной цепи, и не сопряжено с энергетическим метаболизмом. Впервые получены качественные и количественные характеристики цитохромного участка дыхательной цепи M.bipunctats. Исследована химическая природа внутриклеточных кристаллических включений, характерных для группы одноклеточных бесцветных серобактерий. Они представляй? собой полифосфат кальция.

Практическая ценность исследования. Полученные результаты расширяют представления о физиолого-биохимических особенностях бесцветных серобактерий. Детальное знание физиологии и серного метаболизма вазно для понимания роли этих микроорганизмов в глобальном биогеохимическом цикле серы. Полученные в работе результаты могут быть использованы при чтении курсов лекций по

микробиология з университетах," а такяе учреждениями, в ко торах проводятся исследования физиологии микроорганизмов цикла сера.

Апробация: работы. Материалы диссертации доложены на совместном заседании лабораторий: биогеотехнологии металлов, цитологии микроорганизмов, экологии и геохимической деятельности микро- организмов ИНМИ АН СССР, 1990.

Публикации. По материалам диссертация опубликовано 3 статьи и 2 статьи сданы в печать.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, восьми глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 323 страницах машинописного текста, включая 12 таблиц и 17 рисунков. Список литературы содержит 200 наименований работ.

Место проведения работы. Работа проведена в Институте микробиологии АН СССР в лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов (заведующий лабораторией - доктор биологических наук В.М.Горленко).

ОБЪЕКТЫ И МЕГОДа ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы культуры бесцветных серобактерий B.leptomitiformis штамм ВКМ I3S5,' Macrooonas bipunctata штатл.1 ВКМ 1366 ИМаогошоааз bipunctata штамм Д-407. B.leptomitiforais выращивали на среде, предложенной Г.А.Дубининой, следующего состава (в г/л): тхатио^ _ 0,620; NagHPO^ _ 0,125; СаС12 _ 0,03; \HgCX2 - 0,05; NaHCOj -0,125; KCl _ 0,125; NagSO^ - 0,500; ацетат Na - 1,0; вода дистиллированная - I л. Для культивирования М-bipunctata использовали среду Дубикиной-Грабович (Дубинина, Грабович, 1984)i В зависимости от экспериментальных задач в качества источника восстановленной серы использовали тиосульфат натрия либо свежеприготовленную суспензию ?es . Для создания мпкрсаэробяых условий культивирования в.leptomitiforais использовали газовую смесь- следующего состава (в %): С02 - X; аргон -79; воздух - 20. Концентрация кислорода в смеси составляла 4/5.

Морфэлогкю клеток, выращенных в различных условиях, иссле довали в микроскопе "Ни-2" фирмы "Цейсс" с фазово-контрастным устройством. Ультратонкую структуру бактерий исследовали в трансмиссионном электронном микроскопе ¿тем-100 на срезах, изго товленных ПО методу Ритер-Келенбергер (Kyter, Kelleaberger, 1958). Внутриклеточную элементную серу надрезах выявляли в реакции cAsN03 (Sdietsinsky et al., IS72). Капсулы клеток окраши вали рутением красным (Luit 1971). Идентификацию внутриклеточ шх гранул, имеадих кристаллическую структуру, проводили с помощью рентгеношазового анализа сухой биомассы клеток с использованием рентгеновской камеры фирмы " Guinier vievir " (Голландия). Инфракрасные спектры клеток, содержащих эти включения снимали на спектрофотометре " Speoord-75" ( behz, 1971).

Дяя цитохимического обнаружения HgOg в кленах использова Лй метод Грахама-Карнозского Graham > Kamovslcy » 1966). Выявле ние супероксиднкх радикалов в клетках бактерий осуществляли по методу Новякова-Дэвиса ( Novicoff, Davis, 1972). В обоих случая в качестве субстрата использовали 3,3'- дааминобензидан.

Биомассу бактерий определяли в зависимости от целей работ одним из указанных методов: по количеству белка методом Брэд-аорда ■( Bradford, 1976); по оптической плотности культуральной жидкости; по сухому весу клеток.

Бесклеточнне экстракты получали озвучиванием клеточных суспензий в течение 3-5 мин дробно на дезинтеграторе "mse-100" (Англия) при 22кГц в ледяной бане. В некоторых случаях для pas рушения клеток применяли пресс Френча. Для получения растворимой и мембранной франций клеточного экстракта последний центр! йугировали 2,5 ч при 144000 xg на ультрацентрифуге К-32 (СССР]

Состав цитохромов определяли методом дифференциальной спектроскопии на приборе 'ïye-Unicun -I8CÛ" (Англия) (carver, Jones, 1975). Состав и количество генов цитохромов определяли в пиридиновых экстрактах целых клеток ( Peterson, 1970).

Оксвдазнув активность в суспензиях клеток и экстрактах определяли колориметрически с тетраыетилпарафенилендаамином на спектрофотометре " Specol" fcrurtsuk , biu , 1983).

Определение активности дыхания суспензий цроводкяи двумя

катодами: полярографически с использованием платиново-серебря-ного электрода типа Кларка на по ляро графе LP-? (Чехо-Словакия); манометрически в аппарате Варбурга.

Скорость образования перекиси водорода суспензиями клеток измеряли по степени падения люминесценции скшолетина на хемо-лшиномегре "Hitachi" (Япония) при длине волны возбуждения -365 т, испускания - 462 КМ (Marler, Van Vaalen, 1965).

Определение H2s проводили методом иодометрического титрования (Резников и др., 1963).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ I. Характеристика цитохромного участка дыхательных цепей B.leptomitiforrais И K.bipimctata

Известно, что образование Hg02 у многих микроорганизмов связано со своеобразием строения'дыхательной цепи, и прежде всего - отсутствием цитохромов или низкой активностью цитохромного участка (Whittenburiг 1964; Van Denmark, 1967). Исследование цитохромного состава указанных серобактерий было вызвано интересом к их наличию, качественному и количественному составу в связи с вопросом об образовании HgOg.

Суспензии И экстракты B.leptinitifornis я M.bipunctata с высокой скоростью окисляли искусственный донор электронов ТОЩ. Эти данные свидетельствовали о наличии в клетках изучаемых бактерий мембран связанного высокопотенциального цитохрома тина с, функционирующего в комплексе с активной дитохромоксидазой.

Методы дифференциальной спектроскопии позволили установить наличие в клетках в. leptomitiformisцитохромов w8> и «и-тохромоксидазы типа 0. В клетках M.bipunctata обнаружена цито-хронн ъ^-у , с-и цитохромоксядаза типа 0. При атом в обоих случаях цитохром с обнаруживался в растворимой фракции клеточного экстракта и обладал способностью связывать СО. Мы рассматриваем переход цитохрома с в растворимую Фракцию, как следствие "жесткого" способа разрушения клеток, а способность связывать СО - с потерей наивности в процессе выделения из мембран (Гельман. 1972).

Количество гемов цитохромов У B.leptomitiXormis и K.bipuni tata сравнимо с таковым многих гетеротрофных аэробных бактерий Оно незначительно меняется при переходе культуры из экспонен- . цкальной в стационарную фазу роста в сторону увеличения количества цитохро?.:оз Ь- и с-тяпа, что характерно для многих микроорганизмов. N

Возраст культуры, а такке наличие или отсутствие в среде культивирования восстановленных серных соединений в виде тио-. сульфата не сказывались на качественном составе цитохромов и на их распределении по фракциям клеточного экстракта исследуемых серобактерий.

Данные, по качественному и количественному составу цитохро М03 B.leptomitiXormis и N.bipunctata не ПОЗВОЛЯЮТ СДелаТЬ ВЫВО

дов о существовании особенностей в строении цятохромкого участ ка дыхательных цепей данных бактерий в связи со способностью к образованию ими перекиси водорода.

2. Механизм, условия и интенсивность процесса образования перекиси водорода у B.leptomitiformis и M.bipunctata

Установлено, что образование ^^ у исследуемых серобакте рпй вдет с высокой скоростью. В культуральнуы среду выделяется лишь незначительное количество HgOg - не более 15-20$ от образовавшейся в огоытой суспензии клеток. Введение перед определе няем в реакционную смесь с суспензией клеток лоурилсульйата натрия, приводящего к нарушению целостности клеточной стенки, ка порядок увеличивало содержание Hg02 в реакционной смеси, что свидетельствует о преимущественно внутриклеточном накоплении HgOg. Скорость образования HgOg в значительной степени определяется рядом факторов, прансде всего - возрастом культурь степенью аэрацет среды и окисляемыми органическими вещества».«!. У в.leptomitiforáis максимальная величина образования Н^з характерна для клеток поздней экспоненциальной и стационарной саз роста (рис.1). В этих фазах роста отмечался самый высокий процент стимуляции образования HjOg органическими веществами -

Ряс. I. Влияние органических веществ и фазы роста культуры на скорость образования в суспензия клеток

В.1ер-(;о11П.1;1]Го:гт.з.

1 - экспоненциальная фаза роста;

П - поздняя экспоненциальная фаза роста; Ш - стационарная £аза роста; 1У - поздняя стационарная фаза роста. Чч X - контроль - без добавок;

2 - Яа28205;

3 - ацетат;

4 - ацетат"+ На^О^;

5 - малат;

6 - сухцянат.

от ISO до 170%. Скорость образования rkjOg клетками из стационарной фазы роста в присутствии ацетата составляла 19,5 шоль/шн* мг белка. Это означает, что потребленного клетками кислорода

?кс. 2. Влияние степени аэрации среды на скорость образования в суспензии клеток в.1ер^п^1£огш1з.

I - культура выращена в аэробных условиях:

а инкубация в течение I ч перед определением в

иякроаэробных условиях; б - инкубация в течение I ч перед определением в аэробных условиях.

П - культура выращена в микроаэробных условиях:

а - инкубация в течение I ч перед определением в

ыякроаэробяых условиях; б - инкубация в течение I ч перед определением в аэробных условиях.

1 - контроль без добавок; 2 - ацетат; 3 - ыалат. Культура из поздней экспоненциальной фазы роста.

восстанавливается ДР Стимулирование малатом было незна-

чительно меньше и составляло 18,4 нмоль/мян*мг бежа. При этом 41$> потребленного клетками кислорода восстанавливается до ^С^. При эндогенном дыхании образование ^С^ клетками из стационарной фазы роста происходило со скоростью 11,9 ниоль/мия.мг белка, что составляет 59/5 от потребленного кислорода. Пируват, стимулирующий потребление кислорода клетками В.1ер-бошЛ;1:Гогпи.з, не вызывал стимуляции образования по сравнения с эндогенным

1 3 5 6 7

I

¡1

Ш

Рис. 3.Влияние органических веществ и йазы роста культуры на скорость образования 1^2 в суспензии м.Ырипс^аЪа.

I - экспоненциальная газа роста; П - поздняя экспоненциальная фаза роста; Ш"- стационарная фаза роста.

1 - контроль - без добавок;

2 - Иа23205;

3 - ацетат;

4 - ацетат +

5 - малат;

6 - сунцянат;

7 - пируват.

дыханием. Это связано с тем, что пирузат химически разлагает Н2С>2. образующуюся при его окислении (1°" е'ь а1 ., 1968).

Введение в реакционную смесь с суспензией тиосульфата вместе с используемым органическим субстратом снижало накопле-4-4ние в среднем на 40% (рис.1).

Независимо от кислородного решила, используемого для культивирования данного микроорганизма, скорость генерации в "аэробных условиях более чем в 2 раза выше таковой в микроаэробных условиях. Перенос выращенной аэробно культуры в микроаэробные условия: заметно сникал скорость генерации ею Н2О2 (рис.2).

Таким образом, опека кислородного рек шла, независимо от условий выращивания культуры, приводит к изменению скорости образования

й^в клетках в.1ер-Ьовп.1;1Гогш1й пропорционально степени аэрации среда.

Основная продукция Н2О2 у Масготопаэ приурочена к стационарной фазе роста (рис.3). Максимальная скорость образования Н2О2 в этой фазе роста отмечается при добавлении к суспензии ацетата и сукцината и достигает 4,4 нмоль/мин*мг белка. Введение в суспензию тиосульфата вместе с используемым органическим субстратом,- так ге, как у в.1ерЪоа^1Гогш!е приводило к заметному сняненига накопления ^С^. Интенсивность образования ^>2 суспензией клеток к.ъ1рипсъаъа значительно ниже по сравнению с таковой у ВЛер^шдЛиГогпаз. Это связано с действием каталазы, слабая активность которой показана в клетках масгогсопаз (Грабо-вяч и др., 1988).

Лдя резения вопроса о том, каким образом образование связано с функционированием дыхательной цепи был применен ингп-блторный анализ. В таблице I приведены результаты опытов по азиянию специфических ингибиторов дыхательной цепи на процессы генерации 1^02, поглощение кислорода и оксидазную активность в,1ер1;о;ш.1;±£ог1м.з. Цианид и азид в концентрации 1*10"% полностью блокировали цитохром с-оксидазяый комплекс, в то время кал-поглощение кислорода, клетками составляло 29,7$ и 47,9% соответственно. При этом цианид и азид в данной концентрации не влияли на скорость образования Приведенные результаты свидетельствуют об отсутствии связи процесса образования 1^02 с функционированием цитохром с-оксидазного комплекса. Антими-цин А - ингибитор участка цитохром ъ. - цитохром с не оказывал влияния ни на скорость потребления 0£, ни на продукцию ^С^. Последнее может быть связано либо с затрудненным проникновением данного ингибитора в метку, либо с наличием антшиция-А нечувствительных компонентов в дыхательной цепи (зиегке, 1980). Образование 1^2 специфически блокируется амиталом и ротеноном в концентрации Это позволяет сделать вывод о том, что

местом образования в дыхательной цепи в.1ер1;отз.1;1:Согт1з является убихиноновнй участок флавопротеидного сегмента НАДН-дегядрогеназы, чувствительный, как известно (р^еэке. 1930), к амиталу и ротенону.

Таблица I. Сравнительное действие ингибиторов на скорость потребления кислорода, образования перекиси водорода, окисления сульфида и цитохром с -окся-дазную активность в суспензии клеток В.1е?1;ош.'1;11огт18.

Интенсивность процессов, 7° от контроля

Ингибиторы Концентрация .•Скорость :потребле-: ния : 02 .•Скорость гобразова-: ния : HgOg .•Скорость :окисления : s/s¿ .•Цитохром : с-оксида-:зная активность

Контроль -без ингибитора 100 100 100 100

Аштал vierta 22,5-27 6,5 0-10

0 0 0

Ротенон 5-10"% 100 104 100

Г10-3М 66,6 29,7 25

Антимицин А 50 мкг/мл 100 101 112

100_ мкг/мл 89 98 -

КС1Т 1'10~5М - 100 . 100 57

5-Ю_5М - 100 100 17

i-io-4m . 29,7 91-98 100 1,5

5'IO-4I,1 14 35 30 0,5

I*I0~^M 0 7 0 0

На'Г, 5'IÜ_5M 80 100 100 20

I'I0-4M 49,7 100 100 3

5'I0-% 20 81 73 0

I'I0_3M 0 9 0 0

3. Связь процессов окисления сульфида и образования перекиси водорода у вЛер-ьотИгИоии-з

Установлено, что окисление восстановленных серных соеди- ■ нений в суспензиях клеток в.1ерЪош11;±1:огт18 и M.bipunctata на сопровождалось увеличением скорости поглощения кислорода на фоне как эндогенного, так и стимулируемого субстратом дыхания. Более того, высокие концентрации сульфида и сульфита подавляют дыхание клеток. Полученные результаты служат аргументом в пользу отсутствия в клетках данных серобактерий механизм сопряжения окисления серных соединений с функционированием дыхательной цепи.

На рис. 4 представлены данные по окислению сульфида отмытой суспензией клеток в.Хер-Ьош^Хогвйв в аэробных условиях. Они показывают, что скорость окисления сульфида зависит от возраста культуры и наличия органического окисляемого субстрата. Максимальный уровень окисления сульфида отмечен в суспензии, приготовленной из клеток стационарной фазы роста культуры. Внесение ацетата стимулировало процесс в 1,4 раза. Следует отметить, что в микроаэробных условиях культура в.1ерЪотгЬ1-гогт^Б окисляет сульфид с низкой скоростью, накапливая в клетках лшгь единичные капли серы.

В таблице I приведены данные по сравнительному действию ингибиторов дыхательной цепи на интенсивность процессов потребления кислорода, образования перекиси водорода, окисления сульфида и оксидазнув активность клеток в-Хер-Ьотх-ыгогш-з Обнаружено, что процессы образования перекиси водорода и окисления сульфида специфически блокируются амиталом и роте-ноном в концентрации 1'10~%. Аятимяцин А вызывал незначительную стимуляцию окисления сульфида, не влияя при этом на даха-ние и на образование Я&^ВД и аЗЕ® в концентрациях до ГЮ~% не инхибировали окисления сульфида и образования ^92, в то время, как интенсивность дыхания составляла 29,7 и 47,9/5 соответственно. При этом активность цдтохроы с -оксидазного комплекса была полностью подавлена. Повышение концентрации

о

указанных ингибиторов до I* 10 ¡Д .блокировало все исследуемые

Рис. 4. Окисление сульфида в суспензии клеток влер-ьопил^гоггав.

• -клетки из поздаей экспоненциальной фазы роста;

--- клетки из стационарной фазы роста;

о - без добавок; х - ацетат.

процессы. Исходя из приведенных данных можно заключить, что окисление сульфида в.1ер-Ьо!!1:.1:а:Согя1з не связано с функционированием цитохромного участка дыхательной цепи и, соответственно, с энергетическим метаболизмом. Отсутствие другого пути получения энергии - при субстратном фосфорилированпи для В.ХерЪоштгогяиз было показано ранее (Грабович, 1984).

Подавление интенсивности окисления сульфида ингибиторами \дыхательной цепи вызвано воздействием последних на скорость образования Как известно, реакция химического взаимо-

действия между перекисью водорода и сульфидом в слабощелочной среде характеризуется следующей стехиометрией (Иамб и др. ,1958):

н2з + н2о2 - Б0 + 2Н2О Таким образом, для разложения I моля перекиси водорода требуется эквимоляряое количество сульфида. Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствует о том, что количество окисляющегося клетками влер^пплигогплз сульфида практически эквимолярно

Таблица 2. Интенсивность процессов образования перекиси

водорода и окисления сульфида в суспензии клеток в.з.ер'ЬотЗ.'ЬИГоглаБ в зависимости от возраста культуры.

Возраст культуры

Экспоненциальная фаза

Стационарная фаза

Органический субстрат

Скорость обра-

без добавок ацетат

без добавок ацетат

белка

'мг

4,82 8,14

11,9 19,5

Скорость окисления Б/Б 7

ШОЛЬ-МИН .МГ

белка

5,0 9,6

10,0 21,0

количеству образующейся перекиси водорода.

Таким образом, окисление серных соединений в.1ер1;отгЫ-Гоги1з связано с электронтрашшоргной цепью лишь косвенно, за счет взаимодействия с образующейся при ее функциони-

ровании.

3. Цитохимическая локализация продуктов неполного восстановления кислорода и элементной серы В клетках M.ъipunctata Е В.1ер^шгЬ1:Согпиз.

Поскольку нами бнло показано, что накопление образованной Н2О2 в клетках исследуемых серобактерий происходит преимущественно внутриклеточно, представлялось ваяскым выяснение вопроса о локализации в клетках продуктов неполного восстановления кислорода и элементной серн, откладываемой внутриклеточно при наличии серных .соединений.

Локализация 1^2* При проведении специфической реакции с З.З'-дааминобензидином (ДДБ) в периплазматическом пространстве клеток Масготопаз можно наблюдать электронноплотные глобулы диаметром от 29 до 200 нм. Их расположение, количество и размеры значительно варьируют. В контрольных вариантах,

предварительно обработанных каталазой и пируватом для удаления окрашенные глобулы в периплазматическом пространстве отсутствуют, так ке как и в контрольных клетках, не обработанных ДАБ. В инвагинатах цитоплазматической мембраны в.1ер^тл.'Ы-Гогтаз "Такке выявлены электронно плотные продукты окисленного ДАБ. Скопления, состоящие из мелких гранул, тлеют неправильную форму и диффузно распределяются по системе инвагияат и в периплазме. В контрольных вариантах инваглнаты чистые, не заполненные окисленным продуктом.

Выявление проводили в клетках, из которых И2Р2 пРеД~ варительно удаляли химическим путем. При цитохимической окраске клеток м.ъхршкЛайа продукт окисления ДАБ супероксидными радикалами выявляется в отличие от ДАБ, окисленного в виде мелкозернистых, плотно прилегающих друг к другу-гранул» Они расположены преимущественно на внешней стороне цитоплазматической мембраны и в незначительной степени - в периплазме. В контрольных клетках, обработанных сульфитом для удаления 0£ и пируватом и каталазой для удаления ПРОДУ^ окисления ДА.Б отсутствует. При проведении реакции в условиях, позволяющих выявить локализацию 0%, в клетках влер^та^гогпаз обнаружены мелкие, плотно прилегающие друг к другу темные гранулы, распределенные по всем слоям клеточной стенки. В контрольных клетках, из которых 0£ предварительно удаляли, окислений ДАБ не накапливается. Одним из контролен служили препараты клеток, которые не подвергали контрастированию цитратом свинца. Просмотр их под электронным микроскопом выявил ту же картину V отложения окисленного ДАБ в клетках, что и в вышеприведенных опытах. Таким образом, накопление продуктов неполного восстановления кислорода происходит у исследуемых серобактерий в периплазме и инвагинатах цитоплазматической мембраны.

Установлено, что образование глобул элементной серы в клетках м.ЪаршкЛа-Ьа д в. 1ер^тгЬ1хотпав также происходят в периплазме и инвагинатах цитоплазматической мембраны. Данные цитохимических исследований свидетельствуют о существовании пространственной взаимосвязи процессов накопления ^^ и образования серы и согласуется с наличием перекисного механизма

окисления серных соединений у многих нитчатых и одноклеточных бесцветных серобактерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью настоящей работы было изучение вопроса о путях и условиях процесса образования у представителей нитчатых И одноклеточных серобактерий B.leptomitiformisи К.Ъ¿punctata и его связи с окислением серных соединений.

В результате исследований установлено, что образование EjOg у B.leptomitiformis и M.bipunctata вдет С ВЫСОКОЙ скоростью и у Beggiatoa Б отдельных случаях монет достигать 59% от скорости потребления кислорода. У Macromonas интенсивность накопления Н2О2 менее выражена, что обусловлено наличием в клетках каталазы. Установлено, что образование f^Og у B.leptomitiformis происходит на амитал- и ротенон-чувствительном хиноновом участке флазоцротеидкого сегмента НАДД-дегидрогена-зы. Образование HgC^ на этом участке можно рассматривать, как обычное явление при функционировании дыхательной цепи. Обнаружение не избыточных количеств 2i как правило, отмечается в случае дисбаланса в работе ее отдельных участков, при недостатке либо избытке доноров или акцепторов электронов (pridovich, IS79). Имеются данные, что НАДН-дегидрогеназная активность исследуемого штамма B.leptomitiformis на порядок ниже таковой у других микроорганизмов, при этом установлена.ее высокая чувствительность к HgOg (Пидуненко и др., 1988). Для многих микроорганизмов также показана инактивация SH -содержащих ферментов, в особенности дегидрогеназ, продуктами неполного восстановления кислорода (Morris , 1975; Hoffmann et al, 1979). Это, в свою очередь, приводит к дальнейшему увеличению дисбаланса в активности ферментов на разных участках дыхательной цепи. На основании этих данных можно предполагать, что именно эти причины обуславливают избыточную генерацию продуктов неполного восстановления кислорода на начальном участке дыхательной цепи.

Рядом независимых методоз наш показано, что основное

накопление образующихся ftj и особенно l^C^ yB.ieptonitiformis и м.bipunctata происходят в периплазме и инвагинатах цитоплазма-тической мембраны. Поэтому добавление каталазы в среду культивирования данных микроорганизмов не всегда приводит к желаемому результату из-за трудности ее проникновения в клетку. Введение каталазы в среду способствует удалении лишь внеклеточной , составляющей не более 15-20% от общего пула.

В отличие от большинства известных аэробных бактерий у Maoromonas активность каталазы на порядок ниже, а у Beggiatoa полностью отсутствует (Грабович и др., 1988). При этом ранее установлено, что функцию ангиоксидаятов у исследуемых бактерий выполняют восстановленные соединения серы ( Dubinins, I98I, Грабович,.1984), Действительно, внесение тиосульфата в суспензии клеток на 40% сникало скорость накопления ими перекиси водорода. Процессы окисления серных соединений и образования HgOg данными серобактериями максимально проявляются в клетках стационарной фазы роста, т.е. непропорционально ростовым процессам. С помощью ингибиторного анализа нами установлено, что окисление сульфида в.leptoEitiforrais не связано с функционированием ци-тохрошого участка дыхательной цепи и, соответственно, с получением энергии за счет окислительного фо сформирования. Количество окисленного сульфида практически эквиколяряо количеству

, образующейся при дыхании. Рассмотрение данных ингибиторного анализа приводит к выводу, что подавление интенсивности окисления сульфида ингибиторами дыхательной цепи вызвано воздействием последних на скорость образования HgOg. Следовательно, Окисление сульфида у B.leptomitiformis связано с электронтранспортной цепью лишь косвенно, за счет взаимодействия с продуктами неполного восстановления кислорода, образующимися при ее функционирований.

Поскольку местообитания в.leptomitiforrais в природе характеризуются неравновесными условитли среды -и постоянной сменой кислородного режима, ванным представлялось выяснение • вопроса, каким образом сказывается изменение концентрации ки- . слорода на скорости образования

В заключение необходимо отметить, что наличие.рассмотренных выше особенностей в функционировании дыхательной цепи в. 1ер-ьопп-ЪИогпаБ позволяет с точки зрения физиологии интерпретировать экологию этих бентосных организмов. Из полученных данных следует, что наиболее оптимальными для существования этих бактерий являются микроаэробше условия и, следовательно, Вее51а-ьоа мояно. отнести к микроаэрофильным организмам. Усиление аэрации сразу оказывает неблагоприятное воздействие на клетки вследствие усиления генерации В лабораторных условиях это сопровождается лизисом клеток и быстрой гибелью культуры в отсутствие экзогенных антиоксидантов.

ВЫВОДЫ

1. Впервые у бесцветных серобактерий в.1ер^тгЬа.£огп1Б и M.ъipшlctata выяснены механизм, условия и интенсивность процесса образования Е>02. Образование 1^02 у в.1ер-Ьош3.1;:1.£огш.з происходит в дыхательной цепи на уровне хинонового участка флазопротеидаого се плен та НАДН-дегждрогеназы. Скорость образования в а-Э-Р^ных условиях может достигать до 59^ от скорости потребления кислорода. Смена кислородного реяима среды приводит к резкому изменению скорости образования 1^02 в клетках в. 1ер1;оЕ2.1;:иогп1а8, пропорционально концентрации кислорода.

2. Цитохромные участки электронтранспортных цепей в.1ер1;о-тИ^огпаз я И-МрипсЪа1а содержат цитохромы Ьс<-„ И с .

557 Е с55° соответственно, и цитохромоксидазу типа 0. .. Окисление сульфида У влер1;от1-ыгогт1з не сопрякено с функционированием цитохромного участка дыхательной цепи.

3. Показано, что окисление сульфида у в.1ер^т11;±:£огш.а связано с функционированием электронтрачспортной цепи лишь косвенно, за счет взаимодействия с продуктами неполного восстановления кислорода, образующимися в дыхательной цепи, и не сопряжено с энергетическим метаболизмом.

4. Установлено, что накопление продуктов неполного восстановления кислорода, у В.1ер-Ьот:Л1Гогш.з и М.МрипгЪаЪа происходит в периплазме и инвагинатах цктоплазматической

мембраны, что для бактериальных клеток показано впервые. Получены доказательства пространственной взаимосвязи процессоз накопления и с образованием элементной серы данными серобактериями.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Дубинина Г.А., Грабович М.Ю., Чурикова В.З., Пашков А.Н., Чеканоза Ю.А., Жещева Н.В. Образование перекиси водорода Веед^аЪоа 1ер1:отИ;1Гогв18 // 1&КробИОЛОГИЯ.-1990, -Т. 59. -Вып.3. -С.425-430.

2. Чеканова Й.А., Дубинина-Г.А. Особенности ультраструктурной организации Масгошопаз Мриа^аЪа// Микробиология.-

1990.-Т.59.-Вып.5.-С.837-842.

3. Чеканова Ю.А., Дубинина Г.А. Цитохиническая локализация перекиси водорода и супероксидного радикала в клетках бесцветных серобактерий.// Микробиология.-I990.-T.59.-Вып.5.-С.856-862.

4. Чеканова Ю.А., Дубинина Г.А. Механизм й интенсивность процесса образования перекиси водорода у бесцветных серобактерий// Микробиология.- 1991.- Т.60.-В печати.

5. Чеканова Ю.А., Дубинина Г.А. Изучение состава дыхательных цепей некоторых бесцветных серобактерий// Микробиология.-

1991,- Т.60,- В печати.