Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства никотиновых холинорецепторов нейронов подслизистого сплетения морской свинки

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Свойства никотиновых холинорецепторов нейронов подслизистого сплетения морской свинки"

РГ8 ОД

Академія Наук України Інститут фізіології їм. О. О. Богомольця

На правах рукопису

МЕЛІЩУК Олексій Ігорович

УДК 611.839.3:612.822

ВЛАСТИВОСТІ НІКОТИНОВИХ ХОЛІНОРЕЦЕПТОРІВ НЕЙРОНІВ ПІДСЛИЗОВОГО СПЛЕТІННЯ МОРСЬКОЇ свинки

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук

Київ

- 1993

Робота виконана в Інституті фізіологи їм. 0. 0. Богомольця АН України

Офіційні опоненти: зав. кафедрою біології медицинського Університету їм. 0. 0. Богомольця, професор Романенко 0. В.; зав. лабораторією, доктор біологічних наук,

Кононенко М. і.

Провідна організація: інститут фізіологи при державному

університеті їм. Т. Г. Шевченко

Захист відбудеться 24 листопада 1993 р. о 14 годині .на

засіданні спеціалізованої ради Д-01В.15.01 при Інституті фізіології 1н. 0. 0. Богомольця АН України за адресою:

252024, КиІв-24, вул. БОГОМОЛЬЦЯ, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту

фізіології їм. 0. 0. Богомольця АН України. '

Автореферат розісланий *_____» ______________ 1993 р.

Вчений секретар спеціалізованої ради доктор біологічних наук

3. 0. Сорокіна-МарІна

Загальна характеристика роботи

Нікотинові холінорецептори (НХР) с одним з найбільш поширених в організмі та найбільш досліджених видів хеморецепторів, які беруть участь у швидкій синаптичній передачі. Існує багато типів цих рецепторів - на сьогодні відоно 8 а-суб'одиниць (одна м'язова та сім нейрональних) та 4 /3-суб’ одиниці (одна м’язова та три

нейрональних), (Скок и соавт. , 1987; Colquhoun et al., 1987; Rôle,

1992). Типи НХР відрізняються по їх чутливості до дії хімічних сполук - агоністів та антагоністів ацетилхоліну. кінетичним властивостям, наявністю або відсутністю ефекту «випрямлення:», десенситизаці І та 1н. Так, наприклад, тубокурарін є міорелаксант, а мекаміламін та гексамєтоній відбірково блокують гангліонарну передачу у порівнянні з нервово-м'язовою (Triggle, Triggle, 1976). а-токсіни спецефічно блокують холінорецептори скелетних м’язів ( Changeux et al., 1970), але не впливають на нейрональні НХР (Магазаник и соавт., 1974; Chiappinelli et al, 1981). Майже усі типи нейрональних НХР виявляють ефект випрямлення - дуже сильне зменшення загальної нікотинової провідності у діапазоні потенціалів від 0 до 50-60 мВ, в той час, коли у м' язових НХР цей ефект відсутні й.

З попередніх робіт (Hirst, McKirdy, 1975; Surprenant, 1984) відомо, що НХР беруть участь у швидкій збуджуючій синаптичній передачі в нейронах підслизового сплетіння (ПС) тонкої кишки морської свинки. Але властивості саме НХР не було досліджено.

Мета та завдання дослідження;

У зв’язку з вишевикладеним метою поданої работи було докладне електрофізіологічне вивчення властивостей нікотинових

холінорецепторів нейронів підслизового сплетіння тонкої кишки морської свинки, зокрема їх десенситизац11 та впливу на них блокаторів синаптичної передачі.

Головні завдання :

1. Вивчити механізми активації НХР нейронів підслизового сплетіння ацетилхоліном, селективність Іонного каналу ремептора, вплив мембранного потенціалу та дози ацетилхоліну на час видкритого стану Іонного капала рецептора.

2. Вивчити механізми десенситизац11 ацетилхол1 нового струну та генерації слідового струму.

З

3. Дослідити механізми блокування І1ХР класичним:; гангліоблокаторами та ніорелаксантами.

Наукова новизна отринанкх результатів:

В нейронах підслизового сплетіння тонкої кишки норської свинки за допомогою методу локальної фіксації мембранного потенціалу на цілій клітині вперше докладно вивчені струми, які викликає Іонофоретична аплікація ацетилхоліну, а також механізми їх блокування класичнинн гангліоблокаторами гексаметонієм та триметафаном та міорелаксантаки тубокурарином,

длгі дро-(?-єритроі дином та деканетонієм. Знайдено додаткове місце зв' язування ацетилхоліну, локалізоване поза Іонним каналом НХР. Приєднання ацетилхоліну до цього місця зв'язування призводить до десенситизаціІ рецептора, при виході з якої рецептор переходить у стан з відкритим Іонним каналом. Вперше для нейрональних НХР знайдено «слідовий струн», який виникає у момент закінчення аплікації ацетилхоліну як наслідок дисоціації ацетилхоліну від додаткового місця зв' язування. .

Практичне значення роботи:

Результати дослідів становлять Інтерес для біофизиків фізіологів та фармакологів, оскільки дають нову Інформацію про молекулярні механізми роботи іонного каналу НХР нового об'скту -нервової клітини підслизового сплетіння, які с основой міжнейронної передачі , 1 можуть бути використані як основа при дослідженні

механізмів дії фармакологічних препаратів, які застосовуються при лікуванні розладів діяльності шлунково-кишкового тракту.

Апробація роботи. .

Результати досліджень, наведених в дисертаційній роботі було повідомлено на наукових семінарах відділу фізіології вегетативної нервової системи Інституту с; І г: І ологі І їм. о. 0. Богомольця АН України, загальноінститутському семінарі Інституту фізіології їм.

0.0. Богомольця АН України, та на міжнародній науковій конференції «КаліЕЕі канали та нейрональні механізми» (1931р. Париж) ("European Neuroscience Conference "K+char.nels and neuronal mechanisms"" (1991, Paris)).

Об'gm та структура дисертації.

Робота викладена на 105 сторінках машинописного тексту та складається з вступу, чотирьох розділів, висновків та

каналу НХР було застосовано метод аналізу кінетики релаксацій АХ-струму у відповідь на зміщення мембраного потенціалу. Цей нетод полягає у тому, що під час піку АХ-струму потенціал мембрани зміщують стрибком з одного рівня до Іншого. Потім, з цього струну віднімають струм, записаний у тих самих умовах, але у відсутності АХ. Таким чином отримуємо АХ-струм, який складається з омічного компоненту, пов'язаного із зміною е. р. с. , та саме релаксації АХ-струму, яка пов'язана Із зміною стану іоного каналу, що відбувається за експоненціальним законом. Разрахунки показали (Adams, 1975а, 1977 a,b; Sakraann, 1975), що постійна часу

релаксацій відповідає уявній постійній часу відкритого стану Іоного каналу.

Сигнал з виходу схеми реєстрації подавався на самописець або на вхід багатоканального Інтерфейсу, що дозволяло вводити його у комп'ютер безпосередньо під час реєстрації. Накопичування та обробку даних робили за допомогою стандартного пакету програм pCLAMP -5.5. Малюнки та графіки робили у програмах 'Jsigmaplo" та "Coplot". .

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Струми, що викликалися аплікацією ацетилхоліну.

У нейронах підслизового сплетіння Іонофоретична аплікація ацетилхоліну викликала швидконарастаючий вхідний струм (АХ-струм), який був пов'язаний Із збільшенням провідності мембрани для катіонів. Максимальна амплітуда струму при мембранному потенціалі -50 мВ досягала З НА, але у більшості випадків була біля 1 НА. Час наростастання до піку становив 0, 1-0,2 с. У відповідь на тривалу аплікацію АХ спостерігалися струми трьох типів: 1) після наростання струм досягав плато 1 залишався на цьому рівні (мал. la). Такі відповіді спостерігалися у 47. нейронів, шо мали швидкий АХ-струм. 2) відповіді Із швидкою десенсит1зац1 сю - після досягнення піку амплітуда АХ-струму зменшувалася до 0 на протязі 0,3-1 с 1 присутності АХ (45‘/. нейронів, мал. їв). 3) Третій тип відповідей (507.) також характеризувався швидкою десенс 1 т изац 1 сю, ало після досягнення піку амплітуда АХ-струму зменшувалася до рівня 5-207. від максимуму 1 знов зростала після закінчення аплікації (мал. 1 б). По

XVT / oo

AX 5,5c

AX 12c

в

AX 2c

0.2 мл

Мал. 1

О мВ — -50 мВ

ЛХ

■ 0 мВ -Г)0 мН

пЛ

Тривалість аплікаи.іі, с Мал. ‘Л

зростання амплітуди струму після закінчення аплікації є слідовим струмом (СС) (Vlachova et al., 1987). •

Для усіх трьох типів відповідей вольт-амперна характеристика, дозозалежність та чутливість до антагоністів були однакові.

Приблизно у 10% досліджених нейронів аплікація АХ не викликала швидкого вхідного струму, що, мабуть, означає відсутність НХР в цих нейронах. ймовірно, що це так звані АН нейрони, в яких за літературними даними були відсутні синаптичні входи (Surprenant, 1984). Інколи в цих нейронах спостерігався повільний вихідний струм, який був пов'язаний з активацією мускаринових

холінорецепторів. Пєрфузія розчином атропіну 1 мкН повністю блокувала цей струм.

Потенціало- та дозозалежність АХ-струм1в.

Потенціалозалежність АХ-струму досліджували як у стаціонарних умовах, так 1 за допомогою методу релаксацій. Останній нетод дозволяє значно розширити діапазон досліджуваних потенціалів.

Обидва методи дали однакові результати.

В області негативних менбранних потенціалів АХ-струм мав вхідний напрямок 1 його амплітуда лінійно залежала від потенціалу мембрани. В області позитивних потенціалів при потенціалах від 0-10 мВ до 50-60 мВ амплітуда АХ-струму майже дорівнювала нулю та не залежала від потенціалу. Це так званий ефект "випрямлення",

властивий багатьом типам нейрональних НХР (Selyanko et al., 1979;

Mathie et al., 1987), крім НХР деяких центральних нейронів. Вилучення катіонів Саг* та Мдг* Із зовнішньокл 1 тинного розчину 1 Мд2* Із внутрішньоклітинного не впливало на ефект випрямлення. Заміна внутрішньоклітинного Na+ на К+ або Сз+ також не впливала на цей ефект. Потенціал реверсії АХ-струму становить 19+6 мВ, (п-10). Б±1, (п-12) та 2,811,1, (п*4) для головних внутрішньоклітинних

катіонів К+, Иа+ та Cs+, відповідно. Розрахунок відносних

провідностей для цих катіонів показав, що врни приблизно рівні.

Релаксації АХ-струму викликали зміщенням некбраного потенціалу від рівня +20 мВ, коли АХ-струн відсутній або майже відсутній через ефект випрямлення, до потрібного рівня у час, відповідний до максимуму АХ-струму. Завдяки ефекту випрямлення, отриманий АХ-струм був "чистою" релаксацією, тобто омічний конпононт АХ-струму був

майже або повністю відсутній. Потенціалозалежність амплітуди релаксацій АХ-струму було досліджено у діапазоні від -140 до 140 мВ. Як 1 в стаціонарних умовах, потенціалозалежність амплітуди релаксацій в області негативних потенціалів була лінійною. В діапазоні потенціалів від 0 до 50-60 мВ амплітуда АХ-струму була дуже близькою до 0. Застосування методу релаксацій дозволило встановити, що при потенціалах більш позитивних, ніж 60 мВ амплітуда АХ-струму лінійно залежіть від потенціалу.

Залежність амплітуди АХ-струму від дози АХ досліджували як у стаціонарних умовах, так 1 за допомогою методу релаксацій. Обидва ці методи дали аналогічні результати. Метод Юнофоретичної аплікації не дозволяє точно розрахувати концентрацію АХ біля клітини. Але встановлено, що концентрація АХ біля клітини прямо пропорційна 1онофоретичному струну.

Із збільшенням концентрації АХ амплітуда АХ-струму зростає, досягас піку 1 потім зменшується, мабуть, через блокування відкритого іонного каналу НХР ацетилхоліном (Ogden, Colquhoun, 1985, Colquhoun, Ogden, 1984, 1988).

Аналіз кінетики релаксацій дозволив встановити уявний час відкритого стану іонного каналу НХР (УЧ), а також його залежність від дози АХ та потенціалу мембрани. В поданій роботі було ■ встановлено, що із збільшенням концентрації АХ УЧ зменшується, що співпадає з теоретичними розрахунками. Згідно послідовній ноделі середній уявний час відкритого стану Іоного каналу може бути знайден з рівняння т-1/( a^+iJ^JA)п), яке при [А] 0 спрощується до тк-1/ак. Таким чином було встановлено нижню межу (тому, що концентрація АХ [А] не дорівнювала нулю) середнього уявного часу відкритого стану Іоного каналу, яка при потенціалі мембрани -60 мВ дорівнює 9,3±1,0 мс (п-23).

Залежність УЧ від потенціалу досліджували в умовах аплікації мінімальної дози АХ. Відомо, що з гиперполярізац1 сю мембрани тривалість відкритого стану збільшується (Derkach et al., 1987;

Mathie et al., 1990). В поданій роботі було знайдено, що мінімальне значення УЧ спостерігається при потенціалах мембрани, що становлять область випрямлення. Із гіперполярізацією мембрани УЧ збільшується. Максимальна зміна'УЧ .спостерігається при потенціалах від 20 до -20 мВ, а е-кратній зміні УЧ відповідає гиперполярізац1 я мембрани на 15

мВ. Тана сильна залежність УЧ від потенціалу пояснює наявність області випрямлення на потенціалозалежності АХ-струму. По мірі деполяризації ■ мембрани за область випрямлення УЧ зростає. Ми порівняли потенціалозалежність УЧ из потенціалозалежністю відносної нікотинової провідності мембрани. Отримані результати дозволяють зробити висновок, що у нейронах підслизового сплетіння тонкої кишки морської свинки потенціалозалежність АХ-струму обумовлена потенціалозалежністю УЧ.

Слідовий струм

Приблизно у половині нейронів, що мали НХР, спостерігався слідовий струм. Особливість цього струму полягає у тому, що він виникає у відповідь не на початок аплікації АХ, а на II припинення. Раніше аналогічний струм спостерігали лише в кількох работах для м'язових НХР (Асіагаз, 1975с) та глутаматних роцепторів (Уіасіїоуа еЬ аі., 1987).

Аплікація АХ приззодила до виникнення швкдконарастаючого вхідного струму, який починав зменшуватися через о,3-0,5 с після початку аплікації. Ступінь та крутизна спаду збільшувалися по мірі зростання Дози агоністу 1 при дозах АХ, більших за насичуючи амплітуда відповіді через 2 с після початку аплікації становила 10-30У від пікового значення. В момент припинення аплікації виникав слідовий струм (СС), також вхідного напрямку, тривалістю 3-8 с. Аплікація карбахоліну викликала такий самий СС, як 1 аплікація АХ.

Для з'ясування природи СС було перевірено кілька можливостей: активація мускарино'вих ХР (МХР), кальці йкерованих калієвих, кат 1оннесеиективних або хлорних каналів, що могли б активуватися внаслідок входу Іонів кальція через канал НХР (Verni.no еі. аі. , 1992). Експерименти показали, що блокатор НХР атропін (ІнкМ), заміна Іонів калія Іонами натрію у внутрішньо- та зовніщньоклітинному розчинах не впливали на форму та потенціал реверсії СС. Вилучення Із зовнішньоклітинного розчину Іонів кальцію, присутність у внутрішньоклітинному розчині холатора Іонів хальцію ЕСТА (10 мМ, О мМ Са2*) та заміна Іонів хлору іонами глюконату також не призвели до зміни СС та його потенціалу реверсії. Це дозволяє нам виключити можливість активації як МХР,

так 1 кальційкерованих провідностей. Таким чинок, можна зробити виснивок, шо СС с безпосереднім результатом активації НХР. Це також підтверджується тик, що СС супроводжується збільшенням провідності мембрани та ефективно блокується гексонієм у тому ж діапазоні концентрацій (1-5ккМ), що I головка відповідь на АХ.

Спад АХ-струму 1 появу СС можна пояснити двома головними причинами: 1)десенситизація НХР, з якої рецептор повертається у

стан з відкритим Іоним каналом, та, 2) блокування відкритого Юного каналу НХР ацетилхоліном з подальшою його деблокадою після закінчення аплікації.

• Той факт, що швидкість спаду АХ-струму зростає Із збільшенням

концентрації АХ, а після припинення аплікації з'являється слідовий струм, повинно означати наявність в рецепторі додаткового місця за' язку ацетилхоліну. Внаслідок того, що цей ефект розвивається, коли концентрація АХ досягає насичуючої або перевищує II, спорідненість цього місця зв'язку до АХ повинна бути меншою, ніж спорідненість впізнаючого центру НХР. Приєднання АХ до цього місця зв'язку призводить до закриття каналу, а дисоціація - до повторного відкриття. Якщо це додаткове місце зв'язку локалізовано у Іонному каналі НХР, то СС пов' язан Із блокуванням відкритого Іонного каналу. А якщо це місце зв'язку локалізовано поза Іоннин каналом, то це десенситизаці я. Наведені нижче результати дозволяють стверджувати, що в основі СС полягає десенситізація НХР, з якої рецептор переходить у стан Із відкритим Іонним каналом.

Аплікація АХ тривалістю 0,1с викликала відповідь максимальної амплітуди 1 тривалістю спада біля 1 с. При подовженні аплікації АХ-струн починав спадати ще у присутності АХ, а тривалість спаду збільшувалася. Коли тривалість аплікації перевищувала Д с з'являвся другий пік АХ-струму - СС. СС залишався при подовженні аплікації до 152 с, при цьому амплітуда АХ-':т)-уму У момент припинення аплікації становила 5-10'/. від пікової. Одночасно, із подовженням аплікації амплітуда СС зменшувалася (мал. 3).

Амплітуда АХ-струму у момент припинений аплікації зменшується якщо гіперполярізація мембрани перевищує -40 мВ. Це пов' язано Із зменшенням відносної нікотинової провідності мембрани під час аплікації АХ, тобто ця провідність через 2 с після початку аплікації набагато менша ніж на піці АХ-струму. Після припинення

аплікації відносна нікотинова провідність поступово зростає 1. на максимумі СС досягає свого значення на піці АХ-струму. Таке зменшення провідності Із гіперполярізацією мембрани характерно, для блоку відкритого Іонного каналу НХР ацетилхоліном. Але треба зазначити, що наявність спаду АХ-струму 1 СС но залежить від мембранного потенціалу 1 спостерігається при деполяр1зац1 І до О мВ, коли блок відкритого каналу повністю відсутній (Colquhoun, Ogden, 1984).

Для того,' щоб перевірити, як залежить форма АХ-струму від потенціалу мембрани, ми міняли стрибком мембраний потенціал від підтримуваного потенціалу 0 мВ до -50 мВ -у різні моменти часу відносно початку аплікації. Якщо стрибок потенціалу відбувався до початку аплікації, ми мали звичайний АХ-струм 1 СС (мал. 2, ліворуч). Коли стрибок потенціалу відбувався після початку аплікації, то в Інтервалі часу від початку аплікації до стрибка потенціалу АХ-струм дорівнював нулю внаслідок ефекту випрямлення та близкості потенціалу мембрани до потенціалу реверсії АХ-струму. У цей час, коли потенціал мембрани О мВ, ймовірність іонного каналу НХР бути відкритим у десятки разів нижче ніж при потенціалі -50 нВ (Mathie et al., 1990). Якщо спад АХ-струму пов' язан Із блокуванням відкритого Іонного каналу, то внаслідок того, що канал може бути заблокован лише після того, як він відкриється, амплітуда піку АХ-струму., викликаного стрибком мембраного потенціалу під час аплікації АХ (мал. 2, праворуч)повинна дорівнювати піковому значенню АХ-струму, викликаного аплікацією АХ при -50 МВ (мал. 2, ліворуч), незалежно від того, у який час після початку аплікації відбувається стрибок потеїщіалу. Але пікове значення АХ-сгруну, викликаного стрибком мембраного потеїщіалу під час аплікації АХ, співпадало із значенням АХ-струму, викликаного при -50 мВ, у відповідний момент часу писля початку аплікації (мал. 2). Таким чином. це означає, що генерація СС не залежить від менбраного потенціалу 1 його механізмом не є блокування відкритого іонного каналу НХР. А це у свою чергу означає, що додаткове місце зв'язку АХ локалізовано поза Іонним каналом НХР.

Якщо на піці СС прикласти ще одну аплікацію, таку саму як 1 перша, то замість збільшення, вхідного струму спостерігається його різке зменшення. Після припинення лругої аплікації генерується СС,

але моншої амплітуди. У міру того, як зростає Інтервал між першою та яругою аплікаціями, амплітуда другого АХ-струму підновлюється.

Лпя порівняння в поданій роботі було досліджено швидкість відновлення другого АХ-струму у нейронах, що не мали СС. В результаті цього дослідження було встановлено, що швидкість відновлення другої відповіді в 2-3 рази більше у нейронах що мали СС, ніж у тих, що не його мали.

Таким чином, з вищенаведених фактів можна зробити висновок, що в тих нейронах, які мають СС, НХР можуть перебувати у двох станах /гесенситизац II. Перший стан десенситизаці І пов'язан Із додатковим місцем зв'язку АХ 1 доказом його наявності с СС. Наявність другого стану десенситизаціІ підтверджується тим, що при збільшенні тривалості аплікації зменшується амплітуда СС. Це означає, що кожну одиницю часу деяка частина НХР переходить у стан десенситизац11, з якого після усунення АХ рецептор переходить у неактивований стан (так би мовити «звичайна» десенситизац1 я. властива багатьом типам рецепторів). Шо до НХР нейронів, які не мали СС, то вони можуть мати один або кілька станів десенситизаці!, які відрізняються своєю кінетикою.

Дія класичних гангліоблокаторів та міорелаксант 1 в.

Для з'ясування місця НХР нейронів підслизового сплетіння серед НХР Інших об'єктів було досліджено дію на АХ струм класичних гангліоблокатор1 в гексамєтоннию 1 триметафану, а також міорелаксанті в тубокурарину, ді гі дро-/3- ері трої ді ну (ДГрЕ) та дикамстонію. .

дію гексамстонію було досліджено у діапазоні концентрацій від 1 до 10 мкН. (концентрація половинного пригнічення) для

гексамстонію при мембраному потенціалі становить 3 мкМ. Блокуюча дія гексамстонію посилювалась Із гіпернолярізаціею мембрани 1 повністю зникала при деполяр і ;?,ц 11 мембрани до -20-0 мВ. У той самий час ступінь блоку не залежала від дози АХ, тобто, дія гексамстонію була неконкурентною. Крім цього, було встановлено, що гексамстоній (3-10 мкМ) значно прискорює релаксації АХ-струму та викликає появу зворотньої релаксації. Така поведінка релаксацій

АХ-струму у присутності гексамєтонію с характерною ознакою блоку відкритого Іонного каналу 1ІХР (Asher et al., 1979; Colquhoun, Hawkes, 1983). Разом Із неконкурпнтністю та потонц1алозалежніств блокуючої дії, ці результати дозволяють вважати гексамстоні ;і блокатором відкритого Іонного каналу НХР нейронів підслизового сплетіння. Такі сані результати (ECto біля ЮмкМ) були отримані у дослідах по впливу гексамєтонію на деполярізацію, викликану АХ в тих самих нейронах (Vanner & Surprenant, 1990).

За механізмом своєї дії на багатьох досліджоних об'єктах гексамстоній є каналоблокатор, але ефектнішість цієї дії дуже залежить від об' єкта. Ближче за всіх до НХР нейронів ПС с НХР нейронів парасимпатичних гангліїв - EC^q 2-5 мкМ, (Asher et al., 1979). Далі йдуть нейрони синпатичних гангліїв - ECrQ біля !30мкМ (Скок и др. , 1П87). Найменш чутливі до гексаметонію е НХР кінцевої

платівки жаби - 1 мКоль (Adams et al., 1991).

На відміну від гєксаистонію дія триметафану (3-ЮмкМ) не залежала від потеїшіалу мембрани. Крім того, тримєтафан ніяк не впливав на кінетику релаксацій АХ-струму, а лише пригнічував їх амплітуду. При дослідженні впливу триметафану на дозозалежн1сть АХ-струму спостерігалося паралельне зрушення кривої « доза-ефект» уздовж осі концентрацій. Таке зрушення свідчить про то, шо ступінь блоку АХ-струму зменшується з підвищенням концентрації АХ, тобто АХ витискує тримотафан з його місця зв'язку з рецептором. Такті чином, на НХР нейронів ПС тринетафан с суто конкурентним блокатором. Не співпадає з літературними даними по Іншим об' сктам, де триметафан також с конкурентний блокатором. Ефективність триметафану на НХР нейронів ПС (ECcq 3' мкМ) співпадає з його ефективністю як на нейронах симпатичних - 1 мкМ, ( Бобрииев, Скок, 1987). так Î

парасимпатичних гангліїв - 2,5 мкМ (Asher et al., 1979).

il 1 орелаксанти тубокурарин 1 ПГ(2Е були менш ефективними блокатсранк, ніж гоксамєтоній и тринетафан. їх блокуючи дія не залежала від потенціалу мембрани-у діапазоні концентрацій 10-30 мкМ для тубокураріну та ЗО мкМ для ДГ/ЗЕ. ^с50 тубокураріну

становить 10 мкН, а для ЛГ/ЗЕ - ЗО мкМ. Аналогічна величина була отримана для тубокураріну - 17 мкН при дослідженні його впливу на

деполярізацію, викликану АХ (Vanner, Surprenant, 1990). У порівнянні з. іншими об'єктами НХР нзйронів ПС менш чутливі до них

блокаторів. Так, ЕС5о тубокураріну для кінцевої платівки жаби було

0,4 мкМ (Colquhoun et al., 1979), а для НХР нейронів парасимпатичного ганглію - 5мкН (Asher et al., 1979). Аналог тубокураріну дг/ЗЕ був також більш ефективним на м'язових НХР (Ской, 1987).

Цікавою особливістю НХР нейронів ПС є їх висока чутливість до міорелаксанту декамстонію. ЕС5о декамстонію становила 1S мкМ при мембранному потенціалі -50 мВ. Ступінь блоку сильно залежала від

потенціалу мембрани - якщо у присутності 20 мкМ декамстонію при

мембранному потенціалі -10 мВ блок АХ-струму майже відсутній, то

при.-50 мВ амплітуда АХ-струму у 3.5 рази менше ніж у контролі. Крім цього, ступінь блоку не залежала від дози АХ, ідо з урахуванням потенціалозалежності означає каналоблокуючий механізм блоку декамстонію. На Інших об' сктах декамстоній також с каналоблокатор з тісю самою або трохи меншою ефективністю. Ес50 ИХР кінцевої

платівки становить 25 мкі-і (Adarcs, Sakmann, 1978b), а дли НХР

нейронів парасимпатичного ганглію - 50мкМ (Asher et al., 1979). Крім цього, на відміну від НХР кінцевої платівки (Adams, Sakmann, 1978b), на нейронах ПС декамстоній не мас властивостей часткового агоністу. .

Таким чином, за свосю чутливістю до блокаторів НХР нейронів ПС більш за все походять на НХР нейронів парасимпатичних гангліїв.

ВИСНОВКИ

1. За допомогою метода «patch-clamp» в конфігурації ціла клітина вперше вивчено електрофізиологічні характеристики нікотинових холінорецепторів нейронів підслизового сплетіння тонкої кишки морської свинки.

2. Показано, що іонофоретична аплікація ацетилхоліну викликає в ц 1 х нейронах відповіді трьох типів - без десенситизаціІ, із швидкою десенситизацісю та відповідь Із швидкою десенситизацісю, яка супроводжувалася слідовим струмом.

3. Висловлено припущення щодо наявності додаткового місця зв'язування ацетилхоліну. локалізованого поза іонним каналом нікотинового хол 1норецептору. Приєднання ацетилхоліну до цього місця призводить до десенситизапі І рецептора, при виході з якої

рецептор переходить у стан з зідкритин Іонним каналом.

4. Вперше для нейрональних холінорецепторіп знайдено слідовий струм, який виникає у момент припинення аплікації ацетилхоліну 1 викликаний дисоціацією ацетилхоліну від додаткового місця зв' язування.

3. Для всіх трьох типів відповідей показано, що амплітуда ацвтилхолінового струну в області негативних потенціалів лінійно залежить від кенбраного потенціалу, а при потенціалах від 0 до 50 мВ близька до нуля. Знайдено, що це пов'язано Із зменшенням уявної тривалості відкритого стану Іоного каналу.

6. Показано, що проникність Іонного каналу нікотинового холінорецептору майже однакова для катіонів калію, натрію та цезію. Потенціал реверсії ацетилхолінового струму дорівнює в середньому 6±1 мВ (па12).

7. Аналіз кінетики релаксацій ацетилхолінового струму, що

віникають у відповідь на стрибок потенціалу, показав, що середня тривалість відкритого стану Іонного каналу збільшується Із

Пперполярізацією мембрани 1 зменшується Із збільшенням дози ацетилхоліну. При потенціалі мембрани -60 мВ 1 температурі 20°С середня тривалість відкритого стану Іонного каналу дорівнює 9,3±1,0 мс (п-12). Максимальна залежність тривалості відкритого стану

Іонного каналу від потенціалу мембрани спостерігається при потенціалах від 20 до -20 мВ 1 відповідає е-кратному II збільшенню при гіперполярізаціІ мембрани на 15 мВ (п-8).

3. Знайдено, що класичні ганг1облокатори гексамєтоній та триметафан мають відповідно каналоблокуючий та конкурентний

механізми дії на нікотинові холінорецептори нейронів підслизового сплетіння. ЕС5о для обох блокаторів при потенціалі мембрани -50 нВ дорівнюють близько 3 мкМ. Міорелаксант тубокурарин та його похідне дигидро-(3-еритро1 дин є блокаторами з потенц 1 алонезалежнимн механізмами дії 1 мають ЕС5о відповідно 10 1 ЗО мкМ. В той самий

час міорелаксант декамєтоній є блокатором відкритого Іонного каналу, з ЕС^ при потенціалі мембрани -50 мВ 15 мкМ, яке значно зменшується із гіперполярізацісю мембрани.

9. Таким чином, за Іонною селективністю канала, потенціало- та дозозалежністю нікотинові холінорецептори нейронів підслизового сплетіння близьки до нікотинових холінорецепторів нейронів

окстрануральних вегетативних гангліїв. За наявністю слідового струну ці рецептори с унікальними соред нейрональних нікотинових холінорецептор1d. тоді як за сбоіни фармакологічним профілем вони близькі до нікотинових холінорецепторів нейронів парасимпатичних гангл і 1 в.

Список опублікованих робіт за теною дисертації:

1. V. A. Derkach, D. Е. Kurenny, А. I. Melishchuk, А. А. Selyanko, V. I. Skok. Role of disulphide bonds in birst-like activity of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat sympathetic neurones//J.Physiology (London).-1991.-44 0.-P.1-15.

2. А. И. Мелщун, В. А. Деркач, В. И. Скок. Следовой ток в нейронах подслизистого сплетения морской свинки//Нейрофизиология. -1993. - 1( N4) . - С. 291-296.

Ротоїш'літ її.чет птут; "Укоспеи:онт.' чпdo гт" Бак. У 1580 т:;о.ГС I9S3 г.