Свойства неточной ДНК-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариот

Макарова, Алена Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Свойства неточной ДНК-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариот
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Свойства неточной ДНК-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариот"

С) ! , На правах рукописи

макарова алена владимировна

свойства неточной днк-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариот

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

ииС3400254

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2009

003480254

Работа была выполнена в Лаборатории репликации и репарации генома Учреждеш Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН (Россия, Москва), также Лаборатории молекулярных механизмов мутагенеза Медицинского цент] Университета Небраски (Омаха, США).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Л.В, Генинг ИМГ РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор A.C. Миронов ФГУП «ГосНИИгенетика»

доктор биологических наук, профессор B.C. Михайлов

217.013.01 при ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт генетики селекции промышленных микроорганизмов" по адресу: 117545, г.Москва, 1-й Дорожны проезд, 1. Факс: (495)315-05-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУП "ГосНИИ генетика"

ИБР РАН

Ведущая организация:

Биолого-почвенный факультет СПбГУ

Защита состоится " ¡0 "

1009 г. в 1400 на заседании Диссертационного совета

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Воюшина Т.Л.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. ДНК живых организмов повреждается под действием разнообразных эндогенных и экзогенных факторов. Эти модификации ДНК вызывают мутации, остановку репликации, гибель клеток, играя важную роль в онкогенезе, старении и других патологических процессах. В конце XX в. были открыты специализированные ДНК-полимеразы, основной функцией которых является участие в репликации и репарации поврежденной ДНК. Однако из-за открытого каталитического центра, приспособленного к синтезу на матрице с поврежденными основаниями, специализированные ДНК-полимеразы часто ошибаются па неповрежденной матрице. Такие полимеразы, подавляющее большинство которых относится к Y-семейству ДНК-полимераз, были названы склонными к ошибкам. Их участие в репликации строго регулируется.

Изучение биохимических свойств и особенностей регуляции активности специализированных ДНК-полимераз относится к числу наиболее актуальных направлений современной молекулярной биологии. Нормальное функционирование этих ферментов в клетках препятствует процессам мутагенеза и канцерогенеза. Большинство из склонных к ошибкам ДНК-полимераз эукариот остаются не достаточно изучены. К их числу относится ДНК-полимераза йота (Pol г), открытая в 2000 r [Tissier А. et. al., 2000; Zhang Y. et. al„ 2000].

Pol i человека является самой неточной ДНК-полимеразой из всех известных и характеризуется необычными свойствами in vitro благодаря особому строению активного центра фермента [Johnson R.E. et. al., 2006]. В тоже время, фермент дрозофилы по свойствам почти ничем не отличается от своего паралога ДНК-полимеразы эта (Pol ri) и не демонстрирует такой высокой склонности к ошибкам [Ishikawa I. et. al., 2001].

Имеются многочисленные литературные данные о связи нарушения регуляции активности Pol i с развитием злокачественных новообразований у человека и мыши. Однако, функции Pol i остаются не известны. Данные об экспрессии этого фермента в организме животных малочисленны. Не изучен филогенез Pol i и свойства фермента у позвоночных животных разных таксономических групп. Ограничен круг модельных объектов для изучения Pol \.

уровню регуляции. В связи с чем актуальной задачей является поиск методов, позволяющих

изучать специализированные ДНК-полимеразы в условиях, приближенных к реальному биохимическому окружению в клетках. Одним из таких подходов может являться тестирование биохимической активности ДНК-полимераз в экстрактах клеток, содержащих суммарный набор ферментов метаболизма нуклеиновых кислот. Уникальная способность Pol i встраивать преимущественно дГТФ напротив тимина матрицы («дГТФ-Т» активность) может давать возможность специфичного определения продуктов реакции этой ДНК-полимеразы [Генинг Л.В. с соавт., 2004].

Изучение активности и биохимических свойств Pol i в экстрактах клеток эукариот является актуальным и фундаментально значимым для понимания молекулярно-биологических процессов, лежащих в основе поддержания стабильности генома, механизмов канцерогенеза и старения.

Цель настоящей работы заключалась в изучении активности склонной к ошибкам Pol \ в экстрактах клеток эукариот. В ходе исследования были поставлены следующие задачи:

• провести оценку биохимической активности рекомбинантной Pol i человека в экстрактах клеток Saccharomyces cerevisiae;

• охарактеризовать «дГТФ-Т» активность Pol i в органах и тканях инбредных линий домовой мыши (Mus musculus) с аллелью Pol i дикого типа и дефектами гена Pol i;

• провести сравнительный филогенетический анализ Pol i и исследовать «дГТФ-Т» активность в организме позвоночных животных разных таксонов;

• определить влияние ряда эволюционно полиморфных и консервативных замен аминокислот, а также делеций на биохимическую активность Pol i человека.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые проведено исследование склонной к ошибкам Pol i с применением методики тестирования активности ДНК-полимеразы непосредственно в экстрактах клеток эукариот. Впервые охарактеризована активность Pol i в организме M. musculus. В работе показано отсутствие активности Pol i у мышей линии 129/J, несущих нонсенс мутацию во втором экзоне гена POLI. Установлено, что в организме мышей линии 129/J мРНК Pol i претерпевает альтернативный сплайсинг по второму экзону с сохранением рамки считывания, однако образующийся в ходе трансляции укороченный фермент не обладает ДНК-полимеразной активностью. Работа представляет собой первое филогенетическое исследование Pol \ позвоночных животных. Обнаружено, что активность Pol \ по встраиванию dGTP напротив Т матрицы обнаруживается в организме млекопитающих, но отсутствует у других классов

позвоночных животных. Установлена связь между появлением «дГТФ-Т» активности Pol i у млекопитающих с заменой Leu62Ile активного центра фермента. В работе впервые получены и описаны свойства ряда мутантных форм Pol i человека, несущих замены эволюционно полиморфных и консервативных аминокислот, а также делецию второго экзона ДНК-полимеразы.

Данные об активности Pol 1 в организме домовой мыши и изменении биохимических свойств фермента в филогенезе важны для поиска биологической функции Pol i. Информация о биохимических свойствах мутантных форм Pol i человека расширяет представление о структуре активного центра фермента и механизме катализа ДНК-полимеразной реакции.

Предложенная система экспресс-тестирования активности Pol i в экстрактах клеток S. cerevisiae может быть использована для изучения свойств полиморфных форм Pol i и других высокоошибочных ДНК-полимераз. Методика тестирования активности Pol г в экстрактах клеток животных представляет практический интерес для изучения активности Pol i в организме человека в норме и при различных патологиях, в частности при изучении и комплексной диагностике злокачественных новообразований. Тестирование «дГТФ-Т» активности Pol i в опухолях глаза апробируется у пациентов Офтальмологической клинической больницы Департамента здравоохранения г. Москвы.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи и 5 - материалы симпозиумов и конференций.

Основные положения работы были представлены автором на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), Российско-Европейском симпозиуме по репарации ДНК и эпигенетической регуляции стабильности генома (Санкт-Петербург, Россия, 2008), конференции Американского общества микробиологии «Мутагенез и репарация ДНК: от молекулярной структуры к болезни человека» (Вистлер, Канада, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, Россия, 2009).

Диссертационная работа была апробирована на совместных семинарах Сектора развития методов молекулярной генетики Института молекулярной генетики РАН и Лаборатории биохимии Института биологии развития РАН (Москва, 03.08.2008), семинарах Медицинского центра Университета Небраски (Омаха, США, 07.01.2009 и 24.03.2009) и семинарах Института молекулярной генетики РАН.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста, содержат 15 рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 244 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Конструирование дрожжевых продуцентов Pol i человека дикого типа и мутантных

форм фермента

В работе использовался химически синтезированный ген ДНК-полимеразы, нуклеотидная последовательность которого была оптимизирована с учетом частоты встречаемости дрожжевых кодонов - POLISc. Плазмида, несущая структурную часть POLISc (pESC-POLISc-URA), была любезно предоставлена проф. Ю.И. Павловым.

В качестве вектора для клонирования амплифицированного в ходе ПЦР фрагмента POLISc использовали плазмиду pRS424-GAL-GST-TRP [Fortune J.M. et. al., 2006]. Плазмида имела в своем составе селективные маркеры AmpR и TRP1, последовательность гена глутатион-8-трансферазы (GST) и индуцибельный химерный промотор GAL1-GALIO. ПЦР-фрагмент встраивали в состав pRS424-GAL-GST-TRP в рамку считывания с последовательностью гена GST по участкам расщепления рестриктаз Clal - Sal I. Сайты узнавания были предусмотрены в составе олигонуклеотидных праймеров для ПЦР. Согласно данным литературы N-концевое слияние Pol i с GST не оказывает влияния на биохимические свойства фермента [Haracska L. et. al., 2003]. Для получения штаммов-продуцентов в настоящей работе была использована также плазмида pESC-GAL-MYC-POLISc-URA, сконструированная ранее в лаборатории проф. Ю.И. Павлова. В данной конструкции ген POLISc был слит в рамке считывания с последовательностью, кодирующей пептид-эпитоп с-тус на N-конце (myc-Pol i) и находился под GAL1-GAL10 промотором.

Мутантные формы Pol i человека (Pol i Ш1, Pol t E,26A/D,27\ p0l i 2""n"1, Pol i 42>-71s\ слитые с GST, были получены в конструкции pRS424-GAL-GST-POLISc-TPR при помощи сайт-направленного мутагенеза.

В качестве реципиентного штамма был использован штамм S. cerevisiae BJ 2168 {МАТа, ura3-52, trpl-289,1еи2-3, 112 prbl-1122, prcl-407, pep4-3), особенностью которого является выключение 3 дрожжевых протеаз [Bylund G. et. al, 2006].

2. Продукция, выделение и тестирование активности Pol i человека дикого типа и

мутантных форм фермента

Экспрессию рекомбинантных ДНК-полимераз в дрожжевых клетках В J 2168 проводили согласно Bylund G. с соавт. [2006], индукцию осуществляли внесением в среду культивирования 2 % галактозы. Выделение рекомбинантной Pol i человека дикого типа и ферментативно активных мутантных форм Pol i L621, Pol i E126A/Dl27A и р0; ( 42b715"d, слитых на N-конце с GST, было осуществлено при помощи аффинной хроматографии с сорбентом GSH-сефарозой.

Для измерения ДНК-полимеразной активности очищенных ферментных препаратов, а также оценки эффективности включения дАТФ и дГТФ, реакции синтеза ДНК проводили в присутствие 20 пМ меченного олигонуклеотидного субстрата (матрица 1), 0,05-1000 цМ дНТФ и 1-2,6 пМ фермента в течение 2.5-5 мин. ДНК-полимеразную активность оценивали по степени утилизации праймера по формуле: РгЕХт = ~ х 100% /Рг +1. Где Рг - количество не использованного в ходе реакции праймера, X - общее количество включенных во время реакции нуклеотидов 2 = Aa+Ac+2Ba+2Bg+3C+...13M;A, В, С, D, ... М- количество 18,19, 20, 21, ... 30 -членных продуктов реакции соответственно, коэффициенты А и 0 - отражают количество включенного дАТФ или дГТФ в 18 и 19 положения субстрата. Расчеты производились с помощью программы ImageQuant 5.2.

3. Тестирование «дГТФ-Т» активности Pol I в экстрактах клеток эукариот

Для тестирования биохимической активности Pol i в экстрактах эукариотических клеток использовали модифицированную методику Генинга Л.В. с соавт. [2004], основанную на уникальной способности этой ДНК-полимеразы преимущественно встраивать дГТФ напротив тимина матрицы. Принцип метода показан на рис.1.

Экстракты клеток дрожжей или клеток органов и тканей животных использовались в качестве ферментных препаратов при проведении ДНК-полимеразной реакции с меченым олигонуклеотидным субстратом в присутствие различных сочетаний 1 мМ дНТФ. В качестве матрицы для субстрата использовали два олигонуклеотида длиной 30 оснований: матрица 1 и матрица 2. Использование матрицы сиквенс-контекста 1 для тестирования эффективности включения нуклеотидов Pol l (очищенный ферментный препарат) напротив тимина описано в работе Zhang Y. с соавт. [2000]. Нуклеотидная последовательность матрицы 2 аналогична матрице 1, однако в 19 положении матрицы 2 вместо гуанина находится цитозин.

После электрофоретического разделения продуктов реакции наличие

активности Pol i определяли по присутствию двух радиоактивных полос, соответствующих двум 18-членным олигонуклеотидам со встроенным напротив тимина аденином или гуанином на 3"-конце и характеризующихся разной электрофоретической подвижностью. Более подвижная нижняя полоса отражает количество олигонуклеотида с Зч-концевым аденином, а верхняя - количество менее подвижного специфического продукта синтеза Pol l, у которого в 18-м положении произошло включение дГТФ («дГТФ-Т» активность). После включения дГТФ напротив тимина матрицы фермент в ряде случаев не способен продолжать синтез ДНК. Свойство Pol г получило название «Т-стоп» [Zhang Y. et. al., 2000].

Рис. 1. Принцип тестирования «дГТФ-Т» активности Pol i в экстрактах эукариотических клеток. ДНЬС-полимеразную реакцию осуществляли с I меченым олигонуклеотидным субстратом (содержащим матрицу 1) в присутствие 1 | мМ дАТФ и дГТФ и последующим

электрофоретическим разделением j

продуктов реакции. Наличие «дГТФ-Т» активности определяли по появлению дополнительной электофоретической полосы, соответствующей включенному гуанину напротив тимина матрицы в 18-м положении олигонуклеотидного

субстрата. Внизу рисунка: слева -экстракт семенника мыши лини 129/J, несущей нонсенс-мутацию во втором экзоне гена Pol l (мутация нарушает синтез полноразмерного фермента); справа - экстракт семенника мыши линии СЗН/Sn с геном Pol i дикого типа.

Полуколичественный расчет активности Pol i в экстракте проводился тремя способами: по 1) (GA) - абсолютному значению включения дГТФ в 18-м положении олигонуклеотидного субстрата: Аа, 2) (Glg) - по проценту включения дГТФ в 18-м положении олигонуклеотидного субстрата относительно суммарного количества включенных в 18 положение нуклеотидов: А° х 100% / (Ал+Ас), 3) (G30) - по проценту

у.32р

---------

3' --------

dGTP

dATP

-GTT £ -CAATCTTA--------5'

-agaa -TCTTA.

-G

-tctta .

itp?5 И»

21 20 19

•Ä

18G

18A

высокоточный синтез

"дГТФ-Т" активность

включения дГТФ в 18-м и 19-м положениях олигонуклеотидного субстрата относительно суммарного количества всех включенных во время реакции нуклеотидов: Ас+Вс х 100% /I.

Общую ДНК-полимеразную активность экстракта оценивали по степени утилизации праймера: РгЕХт = I х 100% /Рг + I. Нормирование активности при расчетах осуществляли по концентрации суммарного растворимого белка в экстракте для клеток органов и тканей животных, или по уровню продукции ферментов в случае экстрактов клеток дрожжей-продуцентов. Расчеты производились с помощью программы ImageQuant 5.2.

4. Оценка генетического и транскрипционного межлинейного полиморфизма по второму экзопу гена Pot i мыши

Генотипирование 27 кодона осуществляли рестрикционным анализом ПЦР-фраментов с участка второго экзона гена Pol i как описано McDonald J.P. с соавт. [2003]. Наличие альтернативно сплайсированных форм по второму экзону Pol i определяли с помощью обратной транскрипции тотальной РНК с последующей ПЦР участка кДНК, содержащего второй экзон, по методике, предложенной Wang M. с соавт. [2004].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. «дГТФ-Т» активность в экстрактах клеток S. cerevisiae, продуцирующих склонную к

ошибкам Pol i человека

В качестве экстракта эукариотических клеток для тестирования активности рекомбинантной Pol i человека использовали пекарские дрожжи S. cerevisiae, у которых отсутствует встречающаяся у высших эукариот Pol t. Были получены штаммы S. cerevisiae -продуценты Pol i человека. Уровень продукции рекомбинантных ферментов в экстрактах клеток дрожжей, трансформированных плазмидами с геном POLI человека pRS424-GAL-GST-POLISc-TPR и pESC-GAL-MYC-POLISc-URA, или соответствующими векторами без вставок, был оценен при помощи иммуноблота (рис. 2А).

Высокий уровень продукции Pol i был достигнут при N-концевом слиянии соответствующего белка как с небольшим эпитопом с-тус (рис. 2А: дор. 5 и 6), так и с GST-белком массой 26,6 кДа (рис. 2А: дор. 3 и 4). Следует отметить негативное влияние GST на выход рекомбинантной Pol i в растворимую надосадочную фракцию при приготовлении клеточных лизатов, что может объясняться склонностью GST образовывать агрегаты. Положительный эффект слияния рекомбинантной Pol i с GST-белком заключался в увеличении стабильности фермента и ограничении его протеолиза.

ФРАКЦИИ

GST-вектор GST-Pol 1 myc-Pol t вектор

над- | . осад.1 исад- olSa. осад- ФРАКЦИИ о^Лосад' чад- осад, осад.

76 kDa - «=3 76 kDa —

38 kDa - 52 kDa- -

12 3 4 5 6 7 8

матрица 1 матрица 2

GST-Pol i myc-Pol i GST-вектор GST-Pol i GST-вектор

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

— —

- —

• —— - " «■«ММ»

2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 1314151617 18 19 20 2122 23 24 252627 28

21 20 19 18G 18А 17

Рис. 2. А. Продукция рекомбинантных GST-Pol i и туе-Pol i в штамме S. cerevisiae BJ 2168. Иммуноблот: иммуноокрашивание GST-Pol i при помощи первичных антител к GST; иммуно-окрашивание туе-Pol i при помощи первичных антител к с-тус;

Б. Анализ ДНК-полимеразной активности в экстрактах клеток S. cerevisiae, продуцирующих GST-Pol v, myc-Pol г и GST. Условия реакции: 0,15 mM Mn2+, 1 мМ каждого дНТФ. Сочетания дНТФ в реакционной смеси: 1 - все 4 дНТФ, 2 - дАТФ + дТТФ + дЦТФ, 3 -дАТФ + дГТФ, 4 - дАТФ, 5 - дГТФ. Дор. 1, 12 и 18 - отрицательный контроль без добавления клеточного экстакта.

Экстракты дрожжевых клеток, продуцирующих GST-Pol i, myc-Pol i или трансформированные вектором без вставки, были использованы для анализа ДНК-полимеразной активности в присутствие различных вариантов комбинаций дНТФ в эквимолярном соотношении (рис. 2Б). Общая ДНК-полимеразная активность экстрактов

дрожжей, продуцирующих Pol i (рис. 2Б: дор. 2-11), оцениваемая по степени утилизации 17-членного праймера, превосходила таковую у клеток, трансформированных GST-вектором без вставки (рис. 2Б: дор. 13-17). Высокая активность по встраиванию дГТФ напротив тимина матрицы, тестируемая по появлению характерных двойных полос в геле, была отмечена в образцах продуцентов Pol i при добавлении в реакционную смесь всех четырех дНТФ (рис. 2Б: дор. 2 и 7) или только дАТФ и дГТФ (рис. 2Б: дор. 4 и 9). Дополнительные полосы в 18-м положении субстрата не появлялись, если дГТФ не был добавлен в реакцию (рис. 2Б: дор. 3 и 8). Важно отметить, что «дГТФ-Т» активность, характерная для Pol i, отсутствовала в контрольном экстракте S. cerevisiae, экспрессирующем GST-белок (рис. 2Б: дор. 13 и 15). После включения дГТФ напротив тимина матрицы в случае экстрактов клеток-продуцентов Pol i синтез ДНК останавливается («Т-стоп»). По литературным данным «Т-стоп» является характерной особенностью биохимической активности очищенного препарата Pol i человека, варьирующей, однако, в зависимости от условий проведения эксперимента.

Специфичность тестирования «дГТФ-Т» активности Pol i в экстрактах эукариотических клеток может ограничиваться рядом факторов. Один из факторов -«механизм проскальзывания матрицы», или «транзиентный мисэлаймент», который может происходить в активном центре некоторых ДНК-полимераз [Kokoska R.J. et. al., 2002]. При «транзиентном мисэлайменте» в случае выпетливания ДНК-матрицы 1 возможно корректное включение дГТФ в 18-е положение праймера напротив 19-го цитозина матрицы. Данный продукт ДНК-полимеразной реакции будет не отличим на электрофореграмме от «дГТФ-Т»-продукта Pol i. Для оценки такой возможности тестирование «дГТФ-Т» активности было осуществлено в экстрактах продуцентов Pol i с использованием олигонуклеотидной матрицы другого сиквенс-контекста (матрицы 2), отличающейся от матрицы 1 заменой цитозина на гуанин в 19-м положении.

Результаты тестирования «дГТФ-Т» активности в экстрактах дрожжей, продуцирующих GST-Pol i или GST-белок на матрице 2 были схожи с результатами, полученными на матрице 1 (рис. 2Б: дор. 2-11 и 19-23). Следовательно, возможность «транзиентного мисэлаймента» на используемых субстратах в экстрактах клеток эукариот является маловероятной. Следует отметить, что на матрице 2 правило «Т-стоп» было выражено слабее (рис. 2Б: дор. 19). Большая часть продукта реакции со встроенным дГТФ напротив тимина в 18-м положении была использована в дальнейшем синтезе ДНК и продолжена до 19-го положения субстрата. Это согласуется с данными литературы,

согласно которым поведение Pol i в значительной степени определяется сиквенс-контекстом ДНК-матрицы.

Таким образом, анализ ДНК-полимеразной активности показал возможность специфической детекции активности Pol i в экстрактах эукариотических клеток, содержащих суммарных набор ферментов метаболизма нуклеиновых кислот. Важные характеристики биохимической активности рекомбинатной Pol i человека в экстрактах клеток S. cerevisiae схожи со свойствами очищенных ферментных препаратов Pol i человека и мыши [Frank E.G. et. al., 2007; Wang M. et. al., 2004; Zhang Y. et. al., 2000].

2. Анализ «дГТФ-Т» активности Pol l в организме позвоночных животных

2.1. Анализ «дГТФ-Т» активности Pol I в органах домовой мыши Решающая роль в регуляции работы ДНК-полимераз принадлежит пострансляционным механизмам регуляции, поэтому активность Pol i в клетках является более полной характеристикой экспрессии фермента, чем количественное определение соответствующей мРНК. В настоящей работе подход тестирования «дГТФ-Т» активности в экстрактах органов и тканей был использован для анализа экспрессии Pol i в организме позвоночных животных. ДНК-полимеразную реакцию осуществляли в присутствие ионов Mg2+ или Mn2+. Mg2+ является основным кофактором ДНК-полимеразной реакции для большинства ДНК-синтезирующих ферментов. Однако было показано, что активность чистого ферментного препарата Pol i существенно повышается в присутствие ионов Мп2+, тогда как большинство ДНК-полимераз демонстрируют снижение активности при замене ионов Mg2+ на катионы Мп2+ в реакционной смеси [Frank E.G. et. al., 2007].

При использовании ионов Mg2+ в качестве кофактора ДНК-полимеразной реакции «дГТФ-Т» активность четко детектировалась в организме взрослой мыши линии C57BL/6 только в семенниках и головном мозгу (рис. ЗВ: дор. 6-10 и 16-20; табл.1). Использование же ионов Мп2+ в качестве кофактора позволило детектировать варьирующую по интенсивности «дГТФ-Т» активность в практически во всех органах мыши. Наибольшая активность фермента характерна для экстрактов семенников, высокой активностью обладают экстракты яичников, головного мозга, почек, печени, селезенки и поджелудочной железы, следовая активность детектируется в экстрактах легких и сердца (рис. ЗА, табл.1).

Интересно отметить, что «дГТФ-Т» активность полностью отсутствовала в семенниках новорожденных животных, в то время как высокая активность в головном мозгу была характерна и для взрослых, и для новорожденных животных (табл. 1). Можно

предположить, что функция Pol I в семенниках связана с гаметогенезом, так как самые ранние процессы сперматогенеза у мыши начинаются с 4-х суток жизни (McLean J.D. et. al„ 2003].

экстракт головного мозга экстракт семенников

линия мышей 129/J C57BL/6 129/J C57BL/6

повторность (№ животного) 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 1 2 3 1 4 1 5 1 1 2 1 3 4 1 5

t so

18 A

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

129/J C57BL/6

_88 bp

_49 bp

— 39bp

сайт Taq I

Дикий тип: TCGTCGAGA Ser Ser Arg

129/J: TCGTAGAGA

Ser stop

И >> x

I I Se

I II Is

I8G 18A

3* 3

U St IIII °s

es sf- *2

18G 18A

3 4 5 6 7

C57BL/6

3 4 5 6 7

129/J

Рис, 3. А. Анализ ДНК-полимеразной активности в экстрактах клеток семенников и головного мозга инбредных линий домовой мыши 129/J и C57BL/6 (1 мМ дАТФ и дГТФ, 5 мМ

Mg2+);

Б. Генотипирование стоп-кодона во втором экзоне гена Pol l линий домовой мыши 129/J и C57BL/6 - рестрикционный анализ ПЦР-фраментов с участка второго экзона Pol l. Мутация сопровождается исчезновением сайта рестриктазы Taql;

В. Анализ ДНК-полимеразной активности в экстрактах клеток органов и тканей линии домовой мыши C57BL/6. Дор. 1 - контроль без добавления экстракта (1 мМ дАТФ и дГТФ; 0,2 мМ Мп2+);

Г. Анализ ДНК-полимеразной активности в экстрактах клеток органов и тканей инбредной линии домовой мыши 129/J. Дор. 1 - контроль без добавления экстракта (I мМ дАТФ и дГТФ; 0,2 мМ Мп2+).

Количество удобных биологических объектов для изучения Pol l ограничено. Животные с генотипом Pol I (нокаутом) не описаны в литературе. Но известно, что линия мышей 129/J несет гомозиготную нонсенс-мутацию во втором экзоне гена Pol i, при которой 27 сериновый кодон TCG замещается стоп-кодоном TAG. Мутация блокирует синтез полноразмерного фермента в семенниках животных [McDonald J.P. et. al., 2003]. Эксперименты, свидетельствующие об отсутствие фермента в других органах мышей 129-й линии в литературе не описаны.

Наличие стоп-кодона было подтверждено генотипированием для всех животных линии 129/J, использовавшихся в наших экспериментах (рис. ЗБ). Активность Pol V отсутствовала во всех проанализированных органах мышей 129-й линии в случае использования ионов Мп2+ в качестве кофактора (рис. ЗГ), что согласуется с данными литературы об отсутствии фермента в семенниках этих животных. Однако в случае использования ионов Mg2+ в головном мозгу мышей линии 129/J была отмечена следовая активность, подобная Pol i (рис. ЗА: дор. 1-5, табл. 1).

Табл. 1. «дГТФ-Т» активность в организме домовой мыши (среднее арифметрическое ± средняя ошибка среднего арифметрического).

линия кофактор «дГТФ-Т» активность семенник яичник | гол. мозг легкие печень почки сердце селезенка поджел. железа мышеч. ткань семенник новорожд. гол. мозг новорожд.

C57BL/6 + <2 S Ga 540±34 150±12 230116 30±7 140±8 210+15 62+14 78±15 80±11 15±4 не детек. 370+31

Gig 86±9 75±6 49+3 23±4 40+5 57±9 36+7 59+12 73±8 22±5 не детек. 65+9

129/J Ga не детектир. - -

G]8 не детектир. - -

C57BL/6 öß S Ga 230±11 170±9 100±6 10±2 9±1 11±2 не детектир. не детек. 220+12

G]8 54+4 46±3 35±4 9+2 11±1 12±1 не детектир. не детек. 53±4

129/J Ga не детектир 34+18 не детектир. - -

G,8 не детектир 16±8 не детектир. - -

Известно, что в легких мышей некоторых линий мРНК Pol l претерпевает альтернативный сплайсинг по второму экзону с сохранением рамки считывания [Wang M. et. al., 2004]. Поэтому нами была изучена возможность участия альтернативного сплайсинга по второму экзону в качестве механизма сохранения частичной ферментативной активности Pol l. РТ-ПЦР с использованием мРНК из разных органов мыши линии 129/J показал наличие мажорного продукта с молекулярным весом, соответствующим мРНК Pol 1 без второго экзона (рис. 4: дор. 1, 3, 5), и почти полное отсутствие данного транскрипта в семенниках мыши с геном дикого типа (рис. 4: дор. 7). Экзон является небольшим по размеру и содержит 42 аминокислотных остатка. 29 из которых входят в состав активного центра ДНК-полимеразы. В теории нельзя исключать полной потери активности Pol i с делецией второго экзона.

полноразмерный транскрипт Poli

ал&тернатпвно-сплайсированный транскрипт Pol \ делеция 2

экзона 123456789

Рис. 4. Альтернативный сплайсинг по второму экзону мРНК Pol i домовой мыши линии

129/J.

Свойства Pol i с делецией второго экзона будут рассмотрены в разделе 3.1.

2.2. Филогенетический анализ Pol i

Гены группы RAD30 кодируют ДНК-полимеразы, найденные только у эукариот. У человека обнаружены два представителя RAD30: RAD30A (Pol г)) и RAD30B (Pol i). Предполагается, что Pol \ произошла от Pol Т| за счет генетической дупликации [Vaísman А. et. al., 2002].

Анализ базы данных ГенБанк выявил высоко гомологичные Pol i человека транскрипты у млекопитающих, амфибий, рыб. насекомых и некоторых грибов, за исключением S. cerevisiae. При помощи пакета программ MEGA 3.1 был проведен

129/J

дикий тип

семенники : ■ _ мозг

+RT -RT ! +RT ! -RT

печень +RT i -RT

семенники ;

-RT I маркер

филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей мРНК Pol i у представителей разных таксономических групп эукариот. Филогенетическое древо представлено на рис. 5А.

0.009

0.038

0.005. Н. sapiens

0.045

0.044

¡•P. troglodytes M. mutatta В. taurus Е. cabattus M. musculus R. norvegicus M. domestica O. anatinus X. tropicalis D. rerio

■ N. vitripennis

■ D. melanogaster

- A. aegypti

■ A. clavatus

-N. fischeri

0,00 p-distance

н. sapiens

В. taurus

H. musculus

X. tropicalis

S. salar

D. melañogasceг

H. sapiens

В. taurus

M. musculus

X. tropicalis

s. salar

D. melanogaster

34 39

ivJvdldôfîaJve iv|vJl||f|a|ve IvJvDLCigFf AJvE iv|ldhdpfya|vE

ii |fdld[!fta|ye ii|i.dkd*fta|ve 214

59606264

** * *

МШШЕ0

lCvH|iri,Vy|||YEAmt#V l gväok y l '■• v iïxbyéaml |v

OOKv: "TCByeaRK; t."

Biiiiisi^iia

L|l||||lIv|i||vA|aLgv

307

343

¿штшшт

iGVFltlIIB SEEDSFKKC PHÏIP-L I l|

Isvrgilll Jeed|fkkc HU I

lil 11 SDEdSfKKC i||L|L|xfl

A'.-Tf KPÜ0Q |ded'|F||m 1F|L|L|I|

GBIfltRflH C!îbda|1|i |iai|vvl|

126127

ф Цс

Рис. 5. А. Филогенетический анализ Pol i: филогенетическая дистанция (p-distance) рассчитывалась как среднее число нуклеотидных замен на пару гомологичных сайтов сравниваемых нуклеотидных последовательностей:

Б. Выравнивание функционально значимых аминокислот активного центра Pol \ животных из разных таксономических групп; цвета аминокислотных остатков приведены в соответствие с общепринятыми обозначениями для пакета программ MEGA íhtTO://www.megasoftware.netAVebHelp/helr>file.htirQ.

Анализ показал, что филогенетические отношения последовательностей исследованных кластеров в основном соответствуют молекулярно-филогенетической классификации эукариот, но в тоже время есть и некоторые особенности. Филогенетическая дистанция, отражающая генетическое расстояние между нуклеотидными последовательностями мРНК Pol i, характеризуется незначительными величинами в пределах класса млекопитающих. Дивергенция между человеком и шимпанзе составляет всего 0,01 ± 0,0001, между человеком и мышью - 0,19 ± 0,01, между человеком и утконосом - 0,25 ± 0,01 нуклеотндных замен на пару гомологичных сайтов. Следовательно, Pol i является консервативным ферментом млекопитающих, что предполагает схожие биохимические свойства и функции фермента в пределах класса.

В тоже время, фермент менее консервативен в пределах класса насекомых. Дивергенция между Pol \ плодовой мушки дрозофилы и египетского комара из отряда двукрылых, достигает 0,43 ± 0,01, а средняя частота нуклеотидных замен на пару гомологичных сайтов для двукрылых и перепончатокрылых насекомых (паразитический наездник насония витрипенис) составляет более 50 %.

Из данных филогенетического анализа следует предположение о том, что свойства Pol i млекопитающих и насекомых могут заметно отличаться, т.к. филогенетическая дистанция между млекопитающими и насекомыми составляет более 0,5. Предположение согласуются биохимическими данными из литературы. Экзон-интронная организация генов Pol i (мышь) и POLI (человек) и свойства соответствующих ферментов имеют очень большое сходство [Wang M. et. al., 2004]. Однако, Pol i дрозофилы более схожа по своим свойствам с Pol Т| человека или дрожжей, нежели с человеческой Pol i. В отличие от Pol i человека, Pol l дрозофилы характеризуется меньшей частотой ошибок при синтезе ДНК и преимущественно встраивает напротив тимина матрицы канонический дАТФ [Ishikawa I. et. al., 2001].

Активность Pol i была протестирована в некоторых органах у нескольких видов млекопитающих. «дГТФ-Т» активность была детектирована в экстрактах семенников, головного мозга и печени крысы, семенников собаки, а также семенников и различных отделов головного мозга кролика (данные не представлены). Следовательно, у

проанализированных млекопитающих общая картина активности Pol I оказалась сходной. Однако, в экстрактах тканей представителей других классов позвоночных животных (рыб, амфибий, рептилий, птиц) «дГТФ-Т» активности Pol I обнаружено не было (данные не представлены). Таким образом, экстракты клеток тканей рыб, амфибий, пресмыкающихся и птиц не осуществляют тестируемое данным подходом включение дГТФ напротив Т матрицы.

Появление «дГТФ-Т» активности Pol I в организме млекопитающих может быть связано с особенностями структуры активного центра фермента, высокой стабильностью или особенностями регуляции активности Pol i. Сравнение аминокислотных последовательностей Pol i организмов разных таксономических групп (по базе данных ГенБанк) с данными рентгеноструктурного анализа Pol г человека из литературы, позволило предположить, что изменение свойств Pol i в процессе эволюции может быть связано, в частности, с заменой изолейцина на лейцин в положении 62 активного центра фермента (рис. 5Б).

Каталитический центр Pol I насекомых отличается от млекопитающих тремя заменами функционально значимых аминокислот (положения 214, 307 и 343). Замена одной функциональной значимой аминокислоты (положение 62) отличает Pol I млекопитающих от остальных позвоночных и беспозвоночных животных. Действительно, согласно недавно полученным данным рентгеноструктурного анализа Pol V человека Leu 62 вместе с Gin 59 стабилизируют дГТФ при его включении напротив тимина матрицы [Kirouac K.N. et. al., 2009].

3. Изучение свойств Pol i человека с делениями и заменами аминокислот, представляющих эволюционно- и транскрипционно-полиморфные формы фермента

С целью изучения функциональной значимости и влияния ряда делеций и замен аминокислот на биохимическую активность Pol i млекопитающих были определены свойства 4-х мутантых форм Pol i человека в ДНК-полимеразной реакции с использованием экстрактов клеток дрожжей-продуцентов и очищенных ферментных препаратов.

3.1. Оценка ДНК-полимеразной активности в экстрактах клеток S. cerevisiae, продуцирующих мутантные формы Pol i человека

Чтобы оценить влияние эволюционно полиморфной замены Leu62Ile на биохимические свойства Pol t млекопитающих была получена мутантная форма Pol i

человека с заменой Leu62Ile (Pol i L621). В качестве контроля была осуществлена двойная замена эволюционно консервативных аминокислот активного центра Pol i человека Aspl26Ala и Glul27Ala (Pol i E126A/D127A) (рис 6).

Для проверки гипотезы участия альтернативного сплайсинга в сохранении активности Pol i в организме мышей линии 129/J был получен вариант Pol i человека с делецией второго экзона, частично затрагивающей активный центр фермента (Pol 12exc,n~d). Также была сконструирована мутантная форма Pol i человека с интактным активным центром фермента, но несущая протяженную делецию С-концевого участка полимеразы (Pol i 421"715"d) (рИС. 6). Известно, что С-концевая область принимает участие в белок-белковых взаимодействиях и выполняет регуляторную функцию.

I Д. ладони (27-36,99-224) | Д. МИЗИНЦЭ (ПАД) (300-414)

□ Д. пальцев (37-98) ; РГР1 (420-427)

I Д. большого пальца (225-289) I UBM 1/2 (496-524 / 681-709)

делеция ам-т 421-715

poll421-715-dB_ „ , 2cxon-d Деления

Pol г г

2-го экзона „ , D126AÎ127A_..

Pol I ШМ I i

pollL621

Рис. 6. Схематическое изображение форм Pol i человека с делециями и заменами аминокислот, полученных при помощи сайт-направленного мутагенеза и использовавшихся в работе. Представлена доменная структура Pol i человека, где PIP 1 - домен, взаимодействующий с PCNA, UBM1/2 - убиквитин-связывающие мотивы 1 и 2.

Продукция мутантных форм Pol i, слитых с GST, была подтверждена иммуноблотом (рис. 7А). Результатом замены эволюционно консервативных аминокислот Asp 126 и Glu 127, участвующих в координации ионов металлов и переносе встраивающегося нуклеотида, на аланин стала почти полная потеря активности Pol i (рис. 7Б: дор. 6-9; табл. 2). Таким образом, Asp 126 и Glu 127 важны для обеспечения ДНК-полимеразной активности

фермента, что подтверждает предложенную модель организации активного центра Ро1 1 человека №г Б .Т. е!:. а!., 2004; Клгоиас К.И. е1. а1„ 2009].

GST-Poll

GST-вектор WT D126A/ К127А L621 2exon-d 421-715-d

150 kDa — 76 kDa —

38 kDa —

■ътрщшят

1 2 3 4 5 6

GST-Poh

WT D126A/IU27A 1.621 2cxon-d 421-715-d

Mn2+ Mg 2-У Mn 2+ i Mg 2+ Mn 2+ Mg 2+ Mn2+ Mg 2+ Mn2+ Mg2^

13 13 13 13 1 3 1 3 13 13 13 13

21 20 19

...............^ 18G

»i. .,«:,, ■■•*•> «к- ISA

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Рис. 7. А. Продукция рекомбинантных GST-Pol i E126A/D127A, GST-Pol i L621, GST-Pol i 2aon-d и GST-Pol i 421"715"d в штамме S. cerevisiae BJ 2168 (надосадочная фракция). Иммуноблот: иммуноокрашивание при помощи первичных антител к GST;

Б. Анализ ДНК-полимеразной активности в экстрактах клеток S. cerevisiae, продуцирующих GST-Pol 1 дикого типа (WT), GST-Pol iE126A/D127A, GST-Pol i U21, GST-Pol v 2cM"d, GST-Pol 142I"71M и GST (1 мМ каждого дНТФ. Сочетания дНТФ в реакционной смеси: 1 - все 4 дНТФ, 3 - дАТФ + дГТФ; 0,15 гаМ Мп2+ и 0,25 mM Mg 2+).

Замена эволюционно-полиморфной аминокислоты Leu 62 на Не, встречающаяся в активном центре фермента у амфибий и рыб, привела к снижению «дГТФ-Т» активности Pol i в экстракте дрожжевых клеток в 2,8-5,9 раз по сравнению с ферментом дикого типа в случае использования ионов Мп2+ в качестве кофактора реакции и в 7,2 раза при использовании ионов Mg2+. При этом общая ДНК-полимеразная активность экстракта клеток-продуцентов Pol i L621 упала в 2,1-2,3 раза (рис. 7Б: дор. 10-13; табл. 2). Следовательно, эволюционно-полиморфная замена L62I оказывает влияние на способность фермента к включению дГТФ напротив тимина матрицы и его общую ДНК-полимеразную активность.

Табл. 2. Активность мутантных форм рекомбинантной GST-Pol i в экстрактах клеток дрожжей-продуцентов (среднее арифметрическое ± средняя ошибка среднего арифметрического).

фермент кофактор Ргехт Ga G3o

1 3

GST-Pol i Mn2+ 76.4±9 6500+240 72901305 38.213,4

Mg2+ 37,4±3,1 640+32 830141 5,711,2

GST-Pol i E126A/D127A Mn2+ 18±1,9 126±18 217112 1.510,4

Mg2+ 13.6±2,2 - - -

GST-Pol iL621 Mn2+ 35,6±4 1095146 2600150 9,312

Mg2+ 16.2±2 - 11519 -

GST-Pol i 2exon-d Mn2+ 20±2,3 - - -

Mg2+ 14,9±1 - - -

GST-Poll421" 715-d Mn2+ 91,3111.5 68901370 6460186 49,4+5

Mg2+ 21+3,6 680175 1070193 1813,1

Свойства укороченного варианта Pol i 421 "715"d с интактным активным центром и делецией 294 аминокислот С-концевой области практически не отличались от свойств полноразмерного фермента дикого типа по включению дГТФ напротив тимина матрицы. Незначительно возрастала лишь дистрибутивность фермента. Однако, «дГТФ-Т» активность полностью отсутствовала в экстрактах клеток, экспрессирующих альтернативно-сплайсированный вариант Pol 12"on"d с делецией 42 аминокислот N-концевой области (рис. 7Б: дор. 14-17). Таким образом, очевидно, что второй экзон Pol i кодирует функционально важный для ДНК-полимеразной активности участок и потеря соответствующих аминокислот вследствие альтернативного сплайсинга приводит к полной утрате «дГТФ-Т» активности (и, вероятно, общей ДНК-полимеразной активности) фермента.

Схожие результаты по тестированию активности мутантных форм Pol i в экстрактах клеток-продуцентов были получены с использованием матрицы 2 (данные не представлены).

Таким образом, наличие следовой «дГТФ-Т» активности, подобной активности Pol i, обнаруженной в экстрактах головного мозга мышей линии 129/J при использовании ионов Mg2+ в качестве кофактора ДНК-полимеразной реакции, вероятно, не может являться следствием альтернативного сплайсинга Pol i по второму экзону, а обусловлено другими причинами. Можно предположить, «дГТФ-Т» активность в ряде случаев может являться продуктом синтеза других склонных к ошибкам ДНК-полимераз, более активных в присутствие Mg2+. Использование низких концентраций Мп2+ в качестве кофактора ДНК-полимеразной реакции является важным дополнительным фактором, повышающим чувствительность и специфичность «дГТФ-Т» теста.

3.2. Оценка ДНК-полимеразной активности очищенных ферментных препаратов мутантных форм Pol i человека

Варианты GST-Pol i E126A/D127A, GST-Pol i u'2] и GST-Pol i 421"715<1, обладающие активностью по результатам тестирования в экстрактах клеток S. cerevisiae, были выделены при помощи аффинной хроматографии (рис. 8А). Очищенные препараты GST-Pol i, GST-Pol i L62! и GST-Pol i 42,"715"d обладали высокой ДНК-полимеразной активностью. Следует отметить, что правило «Т-стоп» не было выражено (рис. 8Б и В), что отличается от данных литературы для очищенного ферментного препарата на данном субстрате [Zhang Y. et. al., 2000]. Причиной различия могут быть разные условия очистки ферментов и проведения ДНК-полимеразной реакции (в частности, использованием разных кофакторов).

Результаты, полученные при изучении свойств чистых ферментных препаратов GST-Pol i E126A/D127A и GST-Pol 1421"7I5"dj полностью совпали с данными по активности мутантных форм фермента в дрожжевых экстрактах. GST-Pol i Е12бА/Ш27А обладал следовой ДНК-полимеразной активностью (рис. 8Б: дор. 8), тогда как делеция С-концевой области Pol i не привела к значительному изменению свойств полимеразы (рис. 8Б: дор. 10).

Очищенный ферментный препарат мутантной формы GST-Pol i L621 демонстрировал сниженную ДНК-полимеразную активность по сравнению с ферментом дикого типа (рис. 8Б: дор. 9). Эффективность включения нуклеотидов варьировала в зависимости от типа и концентрации дНТФ. Включение дАТФ осуществлялось вариантом GST-Pol i1-621 в 0,3-0,5 раз менее эффективно в сравнении с ферментом дикого типа. Тогда как эффект снижения эффективности включения дГТФ в случае использования высоких концентраций (100-1000

цМ) достигал 2-5 раз (рис. 8В). Таким образом, замена 62 аминокислоты активного центра Pol i с Leu на Не оказывает влияние на свойства чистого фермента in vitro.

GST-Pol i

kDa

225 - -150

WT fs es 5 EÜ L621

GST-Pol t GST-Pol 1 + дрожжевой экстракт

отриц. контроль н ä -С Г" (N (N 5 5 L62I 421-715-d н i 1.621 421-715-d

102 76

GST-Pol iWT GST-Pol iL621

dATP dGTP dATP dGTP

b.oslo.i! i liolioolsoo o,osio,i|o,51 i ю iioolsooliooo 0,05] 0,11 1110 iioojsoo 0,0s! 0,1 10,5 1 I ! 10 iioolsooliooo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

-ш- GST-Pol iWT GST-Pol iW21

GST-Pol iWT -*- GST-Pol iL621

] dATP ] dGTP

Рис. 8. А. Очистка GST-Pol i Е126А/Ш27А, GST-Pol i L621 и GST-Pol i 42'"715^ при помощи аффинной хроматографии, окраска Кумасси;

Б. Анализ ДНК-полимеразной активности очищенных ферментных препаратов GST-Pol i дикого типа (WT), GST-Pol i Е12бА/Ш21А, GST-Pol i и GST-Pol i 42Ь71М в присутствии или отсутствии экстракта клеток дрожжей» (100 цМ каждого дНТФ, 2,6 пМ фермента, 0,15 шМ Мп2+, время реакции - 5 мин);

В. Включение дАТФ и дГТФ GST-Pol i человека дикого типа (WT) и GST-Pol г 1/121 (0,051000 цМ дНТФ, 1 пМ фермента, 0,15 тМ Мп2+, время реакции - 2,5 мин).

Возможно комплексное влияние данной аминокислотной замены на свойства Pol i, в частности стабильность фермента или его способность взаимодействовать с дополнительными факторами в клетке. Одновременное добавление в реакционную смесь экстракта клеток дрожжей, трансформированных вектором без вставки, в 2-2,5 раза усиливало отличие в общей ДНК-полимеразной активности между ферментом дикого типа и полиморфным вариантом GST-Pol iL621 (рис. 17Б: дор. 11-13).

Полученные результаты согласуются с предложенной моделью организации активного центра Pol i человека [Nair D.T. et. al., 2004; Kirouac K.N. et. al., 2009].

ВЫВОДЫ:

1. «дГТФ-Т» активность в изученных нами экстрактах тканей млекопитающих является активностью Pol i поскольку:

- «дГТФ-Т» активность отсутствует у мышей линии 129/J, несущих нонсенс мутацию во втором экзоне гена Pol;;

- особенности проявления «дГТФ-Т» активности в экстрактах органов млекопитающих схожи с «дГТФ-Т» активностью в экстрактах клеток дрожжей, продуцирующих рекомбинантную Pol i человека.

2. «дГТФ-Т» активность варьирует в различных органах мыши. Наибольшая «дГТФ-Т» активность фермента характерна для семенников, что может указывать на важную роль Pol i в гаметогенезе.

3. Филогенетическое исследование Pol i установило, что «дГТФ-Т» активность Pol i стабильно присутствует в экстрактах ряда органов млекопитающих и отсутствует в этих же органах у других классов позвоночных животных.

4. Анализ ДНК-полимеразной активности мутантных форм Pol i человека в экстрактах клеток S. cerevisiae, продуцирующих фермент, и очищенных ферментных препаратов показал, что:

замена эволюционно-консервативных аминокислот D126 и Е127 на аланин приводит к резкому снижению ДНК-полимеразной активности Pol i;

- удаление 421-715 аминокислот С-концевой области Pol i не вызывает значительного влиянии на ДНК-полимеразную активность Pol i;

- эволюционно-полиморфная замена Leu62Ile вызывает умеренное снижение общей ДНК-полимеразной и «дГТФ-Т» активностей Pol i.

5. В организме мышей линии 129/J мРНК Pol i претерпевает альтернативный сплайсинг по второму экзону с сохранением рамки считывания, однако укороченный фермент человека не обладает «дГТФ-Т» активностью. Это позволяет рассматривать линию мышей 129/J в качестве удобной модели для изучения функций Pol i в организме млекопитающих.

Результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Генинг Л.В., Макарова A.B., Малашенко A.M., Тарантул В.З. Фальшивая нота ДНК-полимеразы йота в ансамбле защитников генома млекопитающих// Биохимия. 2006. Т. 71. №2. С. 155-159.

2. Макарова A.B., Генинг JI.B., Тарантул В.З. Эволюция структуры и функции ДНК-полимеразы йота у эукариот // Биохимия. 2008. Т. 73. № 3. С. 426-433.

3. Макарова A.B., Генинг Л.В., Макарова И.В., Тарантул В.З. Активность склонной к ошибкам ДНК-полимеразы йота в разные периоды отногенеза домовой мыши Mus musculus II Онтогенез. 2008. T. 39. № 5. С. 367-373.

4. Генинг JI.B., Макарова A.B., Малашенко A.M., Тарантул В.З. Фальшивая нота ДНК-полимеразы йота в ансамбле защитников генома млекопитающих // Материалы VI Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток». Звенигород (Россия). 2005. С. 27-28.

5. Макарова A.B., Генинг JI.B., Макарова И.В., Тарантул В.З. Необычные свойства и интригующие функции ДНК-полимеразы йота млекопитающих // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск (Россия). 2008. С. 67.

6. Makarova A.V., Gening L.V., Makarova I.V., Tarantul V.Z. The error-prone activity of DNA-polymerase iota in phylo- and ontogenesis // The Russian-European Workshop on DNA repair and Epigenetic Regulation of Genome Stability. St. Petersburg (Russia). 2008. P. 67.

7. Makarova A.V., Gening L.V., Tarantul V.Z., Bessho Т., Pavlov Y.I. Inaccurate DNA synthesis by yeast whole cell extracts overproducing variants of human DNA-polymerase iota //

The 3rd ASM Conference on DNA Repair and Mutagenesis: from molecular structure to human disease. Whistler (Canada). 2009. P. 50-51.

8. Макарова A.B., Генинг Л.В., Тарантул B.3., Бешо Т., Павлов Ю.И. Функциональная значимость полиморфных замен аминокислот и укороченных вариантов Pol i человека // Материалы IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». Казань (Россия). 2009. С. 66.

МАКАРОВА АЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

СВОЙСТВА НЕТОЧНОЙ ДНК-ПОЛИМЕР АЗЫ ЙОТА В ЭКСТРАКТАХ КЛЕТОК ЭУКАРИОТ

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 01.10.2009г.

Усл.п.л. -1.5 Заказ №00457 Тираж: ЮОэкз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Макарова, Алена Владимировна

Список принятых сокращений

I. Введение

II. Обзор литературы

1. Роль специализированных ДНК-полимераз в поддержании постоянства генома, репарации и гипермутагенезе

1.1. Общая характеристика специализированных ДНК-полимераз

1.2. Специализированные ДНК-полимеразы как «защитники» генома живых организмов

1.3. Вовлечение специализированных ДНК-полимераз в гипермутагенез ДНК

1.4. Роль специализированных ДНК-полимераз в развитии онкологических заболеваний

1.5. Регуляция активности специализированных ДНК-полимераз в клетке

2. Необычные свойства и возможные функции ДНК-полимеразы йота (Pol i) млекопитающих

2.1. Биохимические свойства Pol t in vitro

2.2. Строение активного центра Pol i человека

2.3. Регуляция активности Pol i в клетке и организме

2.4. Поиск функций Pol i в организме млекопитающих 44 Ш. Материалы и методы

1. Список использованных ферментов, растворов и сред

2. Животные

3. Бактериальные штаммы

4. Синтетические олигонуклеотиды

5. Плазмидные векторы

6. Базовые методы молекулярного клонирования

6.1. Трансформация клеток Е. coli

6.2. Обработка ДНК рестриктазами

6.3. Лигирование

6.4. Препаративный электрофорез ДНК и выделение фрагментов для клонирования из геля

6.5. Сайт-направленный мутагенез

6.6. Анализ рекомбинантных и мутантных клонов

7. Методы продукции рекомбинантных белков млекопитающих в Saccharomyces cerevisiae

7.1. Экспрессионные вектора

7.2. Трансформация клеток S. cerevisiae

7.3. Продукция рекомбинантной Pol i в S. cerevisiae

8. Методы работы с нуклеиновыми кислотами

8.1. Выделение нуклеиновых кислот

8.2. Электрофорез нуклеиновых кислот

8.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР)

9. Методы работы с белками

9.1. Фракционирование и очистка белков

9.2. Иммуноблоттинг

10. Тестирование активности Pol i

10.1. Принцип тестирования «дГТФ-Т» активности в экстрактах клеток эукариот

10.2. Приготовление экстрактов клеток дрожжей

10.3. Приготовление экстрактов клеток тканей и органов животных

10.4. ДНК-полимеразная реакция с меченным олигонуклеотидным субстратом

11. Анализ нуклеотидных последовательностей

11.1. Поиск последовательностей в базах данных

11.2. Построение филогенетического древа

12. Методы статистической обработки результатов исследований

IV. Результаты и их обсуждение

1. «дГТФ-Т» активность в экстрактах клеток S. cerevisiae, продуцирующих склонную к ошибкам Pol i человека

2. Анализ «дГТФ-Т» активности Pol I в организме позвоночных животных

2.1. Анализ «дГТФ-Т» активности Pol i в органах домовой

3. Изучение свойств Pol г человека с делениями и заменами аминокислот, представляющих эволюционно- и транскрипционно-полиморфные формы фермента

3.1. Оценка ДНК-полимеразной активности экстрактов клеток S. cerevisiae, продуцирующих мутантные формы Pol i человека

3.2. Оценка ДНК-полимеразной активности очищенных ферментных препаратов мутантных форм Pol i человека

V. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свойства неточной ДНК-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариот"

Актуальность исследования. ДНК живых организмов повреждается под действием разнообразных эндогенных и экзогенных факторов. Модификации ДНК вызывают мутации, остановку репликации, гибель клеток, играя важную роль в онкогенезе, старении и других патологических процессах. В конце XX в. были открыты специализированные ДНК-полимеразы, основной функцией которых является участие в репликации и репарации поврежденной ДНК. Однако из-за открытого каталитического центра, приспособленного к синтезу на матрице с поврежденными основаниями, специализированные ДНК-полимеразы часто ошибаются на неповрежденной матрице. Такие полимеразы, подавляющее большинство которых относится к Y-семейству ДНК-полимер аз, были названы склонными к ошибкам.

Изучение биохимических свойств и особенностей регуляции активности специализированных ДНК-полимераз относится к числу наиболее актуальных направлений современной молекулярной биологии. Большинство из склонных к ошибкам ДНК-полимераз эукариот остаются не достаточно изучены. К их числу относится ДНК-полимераза йота (Pol t), открытая в 1999-2000 гг.

Pol i человека является самой неточной ДНК-полимеразой из всех известных и характеризуется необычными свойствами in vitro благодаря особому строению активного центра фермента [Johnson R.E. et. al., 2006]. В тоже время, фермент дрозофилы по свойствам почти ничем не отличается от своего паралога ДНК-полимеразы эта (Pol ц) и не демонстрирует такой высокой склонности к ошибкам [Ishikawa I. et. al., 2001].

Имеются многочисленные литературные данные о связи нарушения регуляции активности Pol i с развитием злокачественных новообразований у человека и мыши [Генинг JI.B. с соавт., 2006; Казаков А.А. с соавт., 2008; Dumstorf С.А. et. al., 2006; Lee G.H. et. al., 2003; Lee G.H. et. al., 2005; Ohkumo T. et. al., 2006; Wang M. et. al., 2004; Wang Y. et. al., 2007; Yang J. et. al., 2004]. Однако, функции Pol i в организме остаются не известны. Данные об экспрессии этого фермента в организме животных малочисленны. Не изучен филогенез Pol i и свойства фермента у позвоночных животных разных таксономических групп. Ограничен круг биологических модельных объектов для изучения Pol i.

Биохимической активности специализированных ДНК-полимераз посвящено большое количество работ, однако предметом изучения большинства из них являлись очищенные рекомбинантные ферменты in vitro. Решающая роль в регуляции активности склонных к ошибкам ДНК-полимераз в организме животных принадлежит посттрансляционному уровню регуляции. В связи с чем актуальной задачей является поиск модельных систем, позволяющих изучать специализированные ДНК-полимеразы в условиях, приближенных к реальному биохимическому окружению в клетках.

Одним из таких подходов является тестирование биохимической активности ДНК-полимераз в экстрактах клеток, содержащих суммарный набор ферментов метаболизма нуклеиновых кислот. Уникальная способность Pol i встраивать преимущественно дГТФ напротив тимина матрицы («дГТФ-Т» активность) дает возможность специфичного определения продуктов реакции этой ДНК-полимеразы [Генинг JI.B. с соавт., 2004].

Цель настоящей работы заключалась в изучении активности склонной к ошибкам Pol i в экстрактах клеток эукариот. В ходе исследования были поставлены следующие задачи:

• провести оценку биохимической активности рекомбинантной Pol i человека в экстрактах Saccharomyces cerevisiae;

• охарактеризовать «дГТФ-Т» активность Pol i в органах и тканях инбредных линий домовой мыши (Mus masculus) с аллелью Pol г дикого типа и дефектами гена Pol i;

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые проведено исследование склонной к ошибкам Pol i с применением методики тестирования активности ДНК-полимеразы непосредственно в экстрактах клеток эукариот. Впервые охарактеризована активность Pol i в организме М. musculus. В работе показано отсутствие активности Pol i у мышей линии 129/J, несущих нонсенс мутацию во втором экзоне гена POLL Установлено, что в организме мышей линии 129/J мРНК Pol i претерпевает альтернативный сплайсинг по второму экзону с сохранением рамки считывания, однако образующийся в ходе трансляции укороченный фермент не обладает ДНК-полимеразной активностью. Работа представляет собой первое филогенетическое исследование Pol i позвоночных животных. Обнаружено, что активность Pol i по встраиванию dGTP напротив Т матрицы обнаруживается в организме млекопитающих, но отсутствует у других классов позвоночных животных. Установлена связь между появлением «дГТФ-Т» активности Pol i у млекопитающих с заменой Leu62Ile активного центра фермента. В работе впервые получены и описаны свойства ряда мутантных форм Pol i человека, несущих замены эволюционно полиморфных и консервативных аминокислот, а также делецию второго экзона ДНК-полимеразы.

Данные об активности Pol i в организме домовой мыши и изменении биохимических свойств фермента в филогенезе важны для поиска биологической функции Pol i. Информация о биохимических свойствах мутантных форм Pol i человека расширяет представление о структуре активного центра фермента и механизме катализа ДНК-полимеразной реакции.

Предложенная система экспресс-тестирования активности Pol i в экстрактах клеток S. cerevisiae может быть использована для изучения свойств полиморфных форм Pol i и других высокоошибочных ДНК-полимераз. Методика тестирования активности Pol i в экстрактах клеток животных представляет практический интерес для изучения активности Pol i в организме человека в норме и при различных патологиях, в частности при изучении и комплексной диагностике злокачественных новообразований. Тестирование «дГТФ-Т» активности Pol i в опухолях глаза апробируется у пациентов Офтальмологической клинической больницы Департамента здравоохранения г. Москвы.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи и 5 — материалы симпозиумов и конференций.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Макарова, Алена Владимировна

ВЫВОДЫ:

1. «дГТФ-Т» активность в изученных нами экстрактах тканей млекопитающих является активностью Pol i поскольку:

- «дГТФ-Т» активность отсутствует у мышей линии 129/J, несущих нонсенс мутацию во втором экзоне гена Pol i;

- замена эволюционно-консервативных аминокислот D126 и Е127 на аланин приводит к резкому снижению ДНК-полимеразной активности Pol i;

5. В организме мышей линии 129/J мРНК Pol i претерпевает альтернативный сплайсинг по второму экзону с сохранением рамки считывания, однако укороченный фермент не обладает «дГТФ-Т» активностью. Это позволяет рассматривать линию мышей 129/J в качестве удобной модели для изучения функций Pol i в организме млекопитающих.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Макарова, Алена Владимировна, Москва

1. Гешшг Л.В., Петроченков А.Н., Решетняк А.Б., Андреева Л.Е., Тарантул В.З. Активность, характерная для ДНК-полимеразы йота, в экстрактах клеток из разных органов мыши // Биохимия.- 2004.- Т.69.-С.537-543

2. Генинг Л.В., Гришина Е.Е., Петроченков А.Н., Тарантул В.З. Ассоциация повышенной активности ДНК-полимеразы йота с развитием увеальной меланомы человека // Генетика.- 2006.- Т.42. С.98-103

3. Казаков А.А., Генинг Л.В., Гришина Е.Е., Петроченков А.Н., Тарантул В.З. Изменение баланса активности ДНК-полимераз в некоторых злокачественных опухолях // Медицинская генетика.- 2008.- Т.7.- С.32-39

4. Лакин Г.Ф. Биометрия.- М: Высшая школа.- 1990

5. Малашенко A.M., Бескова Т.Б., Померанцева М.Д., Рамайя Л.К. Сравнение трех инбредных линий мышей по общей и генетической радиочувствительности // Генетика животных.- 2003.- Т.39.- С. 12471251

6. Albertella M.R., Lau A., O'Connor M.J. The overexpression of specialized DNA polymerases in cancer // DNA Repair (Amst).- 2005.-V.4.-P.583-593

7. Andersen P.L., Xu F., Xiao W. Eukaiyotic DNA damage tolerance and translesion synthesis through covalent modifications of PCNA // Cell. Res.-2008.- V.18.- P. 162-173

8. Aoufouchi S., Flatter E., Dahan A., Faili A., Bertocci B. Two novel human and mouse DNA polymerase of the polX family // Nucleic Acids Res.- 2000.-V.28.- P.3684-3693

9. Bebenek К., Tissier A., Frank E.G., McDonald J.P., Prasad S., Wilson S.H., Woodgate R., Kunkel T.A. 5x-deoxyribose phosphate lyase activity of human DNA polymerase iota in vitro I I Science.- 2001.- V.291.- P.2156-2159

10. Bebenek K., Kunkel T.A. Functions of DNA polymerases // Adv. Protein. Chem.- 2004.- V.69.- P.137-165

11. Becherel O.J., Fuchs R.P. Mechanizm of DNA polymerase Il-mediated frameshift mutagenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2001.- V.98.- P.8566-8571

12. Berek C., Milstein C. The dynamic nature of the antibody repertoire // Immunol. Rev.- 1988.- V.105.- P.5-26

13. Bergoglio V., Pillaire M.J., Lacroix-Triki M., Raynaud-Messina В., Canitrot Y. Deregulated DNA polymerase beta induced chromosome instability and tumorigenesis // Cancer Res.- 2002,- V.62.- P.3511-3514

14. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding //Anal. Biochem.- 1976.- V.7.- P.248-254

15. Braithwaite E.K., Prasad R., Shock D.D., Hou E.W., Beard W.A., Wilson S.H. DNA polymerase lambda mediates a back-up base excision repair activity in extracts of mouse embryonic fibroblasts // J. Biol. Chem.- 2005.-V.280.- P.18469-18475

16. Bransteitter R, Pham P., Scharff M.D., Goodman M.F. Activation-induced cytidine deaminase deaminates deoxycytidine on single-stranded DNA but requires the action of Rnase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2003.- V.100.-P.4102-4107

17. Brondello J.M., Pillaire M.J., Rodriquez C., Gourraud P.A., Selves J., Cazaux C., Piette J. Novel evidences for a tumor suppressor role of Rev3, the catalytic subunit of Pol zeta// Oncogene.- 2008.- V.27.- P.6093-6101

18. Budd M.E., Campbell J.L. Purification and en2ymatic and functional characterization of DNA polymerase beta-like enzyme, POL4, expressed during yeast meiosis // Methods Enzymol.- 1995.- V.262.- P.108-130

19. Bylund G.O., Majka J., Burgers P.M. Overproduction and purification of RFC-related clamp loaders and PCNA-related clamps from Saccharomyces cerevisiae II Methods Enzymol.- 2006.- V.409.- P. 1-11

20. Burgers P.M. Overexpression of multisubunit replication factors in yeast // Methods.- 1999.- V.18.- P.349-355

21. Burgers P.M., Koonin E.V., Bruford E., Blanco L., Burtis K.C. Eukaryotic DNA polymerases: proposal for a revised nomenclature // Biol. Chem.-2001.- V.276.- P.43487-43490

22. Burr K.L., Velasco-Miguel S., Duvuri V.S., McDaniel L.D., Friedberg E.C., Dubrova Y.E. Elevated mutation rates in the germline of Pol kappa mutant male mice // DNA Repair- 2006.- V.5.- P.860-862

23. Busuttil R.A., Lin Q., Stambrook P.J., Kucherlapati R., Vijg J. Mutation frequencies and spectra in DNA polymerase eta-deficient mice // Cancer Res.-2008.- V.68.- P.2081-2084

24. Canitrot Y., Cazaux C., Frechet M., Bouayadi K., Lesca C. Overexpression of DNA polymerase beta in cells results in a mutator phenotype and a decreased sensitivity to anticancer drugs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1998.- V.95.- P.12586-12590

25. Celewicz L., Mayer M., Shetlar M.D. The photochemistry of thymidylyl-(3'-5')-5-methyl-2'-deoxycytidine in aqueous solution // Photochem. Photobiol.- 2005.- V.81.- P.404-418

26. Choi J.H., Besaratinia A., Lee D.H., Lee C.S., Pfeifer G.P. The role of DNA polymerase iota in UV mutational spectra // Mutat. Res.- 2006.-V.599.- P.58-65

27. Choi J:Y , Guengerich F.P: Kinetic evidence for inefficient and error-prone bypass across bulky N2-guanine DNA adducts by human DNA polymerasei// J. Biol; Ghem.- 2006.- V.281.- P. 12315-12324

28. Choi J.Y., Lim S., Eoff R.L., Guengerich F.P. Kinetic analysis of base-pairing preference for nucleotide incorporation opposite template pyrimidines by human DNA polymerase iota//J. Mol. Biol.-2009.-V.389.-P.264-274

29. Chiu R.K., Brun J., Ramaekers C., Theys J., Weng L., Lambin P., Gray D.A., Wouters B.G. Lysine 63-polyubiquitination guards against translesion synthesis-induced mutations//PLoS Genet.-2006.-V.2.-P. 116

30. Cleaver J.E. Common pathways for ultraviolet skin carcinogenesis in the: repair and replication defective groups of xeroderma pigmentosum // Dermatol. Science.- 2000.- V-.23;- P: 1-11

31. Collins N.S., Bliattacharyya S., Lahue R.S. Revl enhances CAG.CTG repeat stability in Saccharomyces cerevisiae II DNA Repair (Amst).- 2007.-V.6.- P.38-44 :

32. Conticello S.G., Pilpel Y., Glusman G., Fainzilber M. Position-specific codon conservation in gypervariable gene families // Trend. Genet.- 2000.-V. 16.-p. 57-79

33. Delbos F., De Smet A, FailijA., Aoufbuchi S., Weill J.C., Reynaud C.A. Contribution of DNA polymerase eta to immunoglobulin gene hypermutation in the mouse//J. Exp. Med.-2005,-V.201.-P.1191-1196

34. Dianov G.L., Prasad R., Wilson S-H., Bohr V.A. Role of DNA polymerase beta in the exision step of long patch mammalian: base exision repair // J; Biol. Chem.r 1999.r V.274.- P.13741-13743

35. Dionne I., Nookala R.K., Jackson S.P., Doherty A.J., Bell S.D. A heterotrimeric PCNA in the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus II Mol. Cell.- 2003.- V.l 1.- P.275-282

36. Dixon M J., Lahue R.S. Examining the potential role of DNA polymerases eta and zeta in triplet repeat instability in yeast // DNA Repair (Amst).- 2002.-V.I.- P.763-770

37. Dominguez O., Ruiz J.F., Lain De Lera Т., Garcia-Diaz M., Gonzalez M.A. DNA polymerase mu (pol rau), gomologous to TdT, could act as a DNA mutator in eukaiyotic cells // EMBO J.- 2000.- V.19.- P. 1731-1742

38. Dumstorf C.A., Clark A.B., Lin Q., Kissling G.E., Yuan Т., Kucherlapati R., McGregor W.G., Kunkel T.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2006.- V. 103.-P. 18083-18088

39. Esposito G., Godindagger I., Klein Y., Yaspo M.L., Cumano A., Rajewsky K. Disraption of the Rev-31 encoded catalytic subunit of polymerases zeta in mice results in early embryonic lethality // Curr. Biol.- 2000.- V.10.- РД221-1224

40. Faili A., Aoufouchi S., Flatter E., Gueranger Q., Reunaud C.A., Weill J.C. Induction of somatic hupermutation in immunoglobulin genes in depended on DNA polymerase iota // Nature.- 2002.- V.419.- P.944-947

41. Fortune J.M., Stith C.M., Kissling G.E., Burgers P.M., Kunkel T.A. RPA and PCNA suppress formation of large deletion errors by yeast DNA polymerase delta //Nucleic Acids Res.- 2006.- V.34.- P.4335-4341

42. Foster P.L. Adaptive mutation: Implications for evolution // BioEssays.2000,- V.22.- P. 1067-1074

43. Foster P.L. Stress-induced mutagenesis in bacteria // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.- 2007.- V.42.- P.373-397

44. Frank E.G., Tissier A., McDonald J.P., Rapic-Otrin V., Zeng X., Geahart P.J., Woodgate R Altered nucleotide misinsertion fidelity associated with poliota-dependent replication at the end of a DNA template // EMBO J.2001.- V.20.- P.2914-2922

45. Frank E.G., Woodgate R. Increased catalytic activity and altered fidelity of human DNA polymerase i in the presence of manganese // J. Biol. Chem.-2007.- V.282.- P.24689-24696

46. Friedberg E.C., Wagner R, Radman M. Specialized DNA polymerases, cellular survival, and the genesis of mutations // Science.- 2002.- V.296.-P.1627-1630

47. Friedberg E.C., Lehmann A.R., Fuchs R.P. Trading places: how do DNA polymerases switch during translesion DNA synthesis? // Mol. Cell.- 2005.-V.18.- P.499-505

48. Friedberg E.C., Aguilera A., Gellert M., Hanawalt P.C., Hays J.B., Lehmann A.R., Lindahl Т., Lowndes N., Sarasin A., Wood R.D. DNA repair: from molecular mechanism to human disease // DNA Repair (Amst).- 2006.- V.5.-P.986-996

49. Galhardo R.S., Hastings P J., Rosenberg S.M. Mutation as a stress response and the regulation of evolvability // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.- 2007.-V.42.- P.399-435

50. Gan G.N., Wittschieben J.P., Wittschieben В., Wood R.D. DNA polymerase zeta (pol zeta) in higher eukaryotes // Cell Res.- 2008.- V.18.- P. 174-183

51. Garcia-Diaz M., Dominguez O., Lopez-Fernandez L.A., de Lera L.T., Saniger M.L. DNA polymerase lambda, a novel eukaryotic DNA polymerase, with a potential role in meiosis // J. Mol. Biol.- 2000.- V.301.- P.851-867

52. Goodman M.F. Error-prone repair DNA polymerases in prokaryotes and eukaryotes // Biochemistry.- 2002.- V.71.- P.17-50

53. Gordon M.S., Kanegai C.M., Doerr J.R., Wall R. Somatic hypermutation of the В cell receptor genes B29 (Igbeta, CD79b) and mbl (Igalpha, CD79d) И Proc. Natl. Acad Sci. USA.- 2003.- V.100.- P.4126-4131

54. Grossmann K.F., Ward A.M., Moses R.E. Saccharomyces cerevisiae lacking Snml, Rev3 or Rad51 have a normal S phase but arrest permanently in G2 after cisplatin treatment // Mutat. Res.- 2000,- V.461.- P. 1-13

55. Guo D., Wu X., Rajpal D.K., Taylor J.S., Wang Z. Translesion synthesis by yeast DNA polymerase zeta from templates containing lesions of ultravioletradiation and acetylaminofluorene // Nucleic Acids Res.- 2001.- V.29.-P.2875-2883

56. Guo C., Fischhaber P.L., Luk-Paszyc M.J., Masuda Y., Zhou J., Kamiya K., Kisker C., Friedberg E.C. Mouse Revl protein interacts with multiple DNA polymerases involved in translesion DNA synthesis // EMBO J.- 2003.-V.22.- P.6621-6630

57. Guo C., Sonoda E., Tang T.S., Parker J.L., Bielen A.B., Takeda S., Ulrich H.D., Friedberg E.C. REV1 protein interacts with PCNA: significance of the REV1 BRCT domain in vitro and in vivo II Mol. Cell.- 2006.- V.23.- P.265-271

58. Haracska L., Johnson R.E., Unk I., Phillips B.B., Hurwitz J. Physical and functional interactions of human DNA polymerase eta with PCNA // Mol. Cell. Biol.- 2001.- V.21.- P.7199-7206

59. Haracska L., Johnson R.E., Unk I., Phillips B.B., Hurwitz J. Targeting of human DNA polymerase iota to the replication machinery via interaction with PCNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2001.- V.98.- P.14256-14261

60. Haracska L., Unk I., Johnson R.E., Phillips B.B., Hurwitz J. Stimulation of DNA synthesis activity of human DNA polymerase kappa by PCNA // Mol. Cell. Biol.- 2002.- V.22.- P.784-791

61. Haracska L., Prakash L., Prakash S. A mechanism for the exclusion of low-fidelity human Y-family DNA polymerases from base excision repair // Genes Dev.- 2003. V.17.- P.2777-2785

62. Haracska L., Achaiya N., Unk I., Johnson R.E., Hurwitz J., Prakash L., Prakash S. A single domain in human DNA polymerase iota mediates interaction with PCNA: implications for translesion DNA synthesis // Mol. Cell. Biol.- 2005.- V.25.- P. 1183-1190

63. Hinz J.M., Nham P.B., Salazar E.P., Thompson L.H. The Fanconi anemia pathway limits the severity of mutagenesis // DNA Repair (Amst).- 2006.-V.5.- P. 875-884

64. Heaney J.D., Nadeau J.H. Testicular germ cell tumors in mice: new ways to study a genetically complex trait // Methods Mol. Biol.- 2008.- V.450.- P. 211-231

65. Hoege C., Pfander В., Moldovan G.L., Pyrowolakis G., Jentsch S. RAD6-dependent DNA repair is linked to modification of PCNA by ubiquitin and SUMO //Nature.- 2002.- V.419.- P.135-141

66. Horton J.K., Srivastava D.K., Zmudzka B.Z., Wilson S.H. Strategic down-regulation of DNA polymerase beta by antisense RNA sensitizes mammalian cells to specific DNA damaging agents // Nucleic Acids Res.- 1995.- V.23.-P.3810-3815

67. Huang M.E., Rio A.G, Galibert M.D., Galibert F. Pol32, a subunit of Saccharomyces serevisiae DNA polymerese delta, suppresses genomic deletions and is involved in the mutagenic pypass pathway // Genetics.-2002.- V.160.- P. 1409-1422

68. Inoue K., Ogonuki N., Mochida K., Yamamoto Y., Takano K., Kohda Т., Ishino F., Ogura A. Effects of donor cell type and genotype on the efficiency of mouse somatic cell cloning // Biol. Reprod.- 2003.- V.69.- P. 1394-1400

69. Ishikawa Т., Uematsu N., Mizukoshi Т., Iwai S., Masutani C., Hanaoka F., Ueda R., Ohmori H., Todo T. Mutagenic and non-mutagenic bypass of DNA lesions by Drosophila DNA polymerases dpolii and dpoli // J. Biol. Chem.-2001.- V.276.- P. 15155-15163

70. Ito A., Koshikawa N., Mochizuki S., Omura K., Takenaga K. Hypoxia-inducible factor-1 mediates the expression of DNA polymerase iota in human tumor cells // Biochem. Biophys. Res. Commun.-2006.- V.351.- P.306-311

71. Jansen J.G., Langerak P., Tsaalbi-Shtylik A., van den Berk P., Jacobs H., de Wind N. Strand-biased defect in C/G transversions in hypermutating immunoglobulin genes in Revl-deficient mice // J. Exp. Med.- 2006.-V.203.-P.319-323

72. Jarosz D.F., Godoy V.G., Delaney J.C., Essigmann J.M., Walker G.C. A single amino acid governs enhanced activity of DinB DNA polymerases on damaged templates //Nature.- 2006.- V.439.- P.225-228

73. Johnson R.E., Washington M.T., Haracska L., Prakash S., Prakash L. Eukaiyotic polymerases iota and zeta act sequentially to bypass DNA lesions //Nature.- 2000.- V.406.- P.1015-1019

74. Johnson R.E., Washington M.T., Prakash S., Prakash L. Fidelity of human DNA polymerase eta // Mol. Biol.- 2000.- V.275.- P.7447-7450

75. Johnson R.E., Haracska L., Prakash S., Prakash L. Role of Hoogsteen edge hydrogen bonding at template purines in nucleotide incorporation by human DNA polymerase iota // Mol. Cell. Biol.- 2006.- V.26.- P.6435-6441

76. Kai M., Wang T.S. Checkpoint activation regulates mutagenic transletion synthesis // Genes Dev.- 2003.- V.17.- P.64-76

77. Kannouche P., Fernandez De Henestrosa A.R., Coull В., Vidal A.E., Gray C. Localization of DNA polymerases eta and iota to the replication machinery is tightly coordinated in human cells // EMBO J.- 2003.- V.22.-P.1223-1233

78. Kannouche P.L., Wing J., Lehmann A.R. Interaction of human DNA polymerase eta with monoubiquitinated PCNA: a possible mechanism for the polymerase switch in response to DNA damage // Mol. Cell.- 2004.- V.14.-P.491-500

79. Kato Т., Shinoura Y. Isolation and characterization of mutants of Escherichia coli deficient in induction of mutations by ultraviolet light // Mol. Gen. Genet.- 1977.- V.156.- P.121-131

80. Kawase E., Suemori H., Takahashi N., Okazaki K., Hashimoto K., Nakatsuji N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines // Int. J. Dev. Biol.- 1994.- V.38.- P.385-390

81. Kirouac K.N., Ling H. Structural basis of error-prone replication and stalling at a thymine base by human DNA polymerase i // EMBO J.- 2009.-V.28.- P.1644-1654

82. Kim S., Matsui K., Yamada M., Gruz P., Nohmi P. Roles of chromosomal and episomal dinB genes encoding DNA pol IV in targeted and untargeted mutagenesis in Escherichia coli // Mol. Genetics Genomics.- 2001.- V.266.-P.207-215

83. Kofoid E., Bergthorsson U., Slechta E.S., Roth J.R. Formation of an Fplasmid by recombination between imperfectly repeated chromosomal Rep sequences: a closer look at an old friend (F'(128)prolac) // Bacteriol.- 2003.-V.185.- P.660-663

84. Kokoska RJ., Bebenek K., Boudsocq F., Woodgate R., Kunkel T.A. Low fidelity DNA synthesis by а у family DNA polymerase due to misalignment in the active site // J. Biol. Chem.- 2002.- V.277.- P.19633-19638

85. Kulaeva O.I., Koonin E.V., McDonald J.P., Randall S.K., Rabinovich N., Connaughton J.F., Levine A.S., Woodgate R. Identification of a DinB/UmuC homolog in the archeon Sulfolobus solfataricus II Mutat. Res.- 1996.- V.357.-P.245-253

86. Kunkel T.A. Frameshift mutagenesis by eucaryotic DNA-polymerases in vitro //J. Biol. Chem.- 1986.-V.261.- P.13581-13587

87. Lang Т., Dalai S., Chikova A., DiMaio D., Sweasy J.B. The E295K DNA polymerase beta gastric cancer-associated variant interferes with base excision repair and induces cellular transformation // Mol. Cell. Biol.- 2007.-V.27.- P.5587-5596

88. Lawrence C.W., Christensen R. UV mutagenesis in radiation-sensitive strains of yeast // Genetics.- 1976.- V.82.- P.207-232

89. Lawrence C.W., Maher V.M. Mutagenesis in eukaiyotes dependent on DNA polymerase zeta and Revl // Philos. Trans. R. Soc. Lond. В Biol. Sci.-2001.- V.356.-P.41-46

90. Lawrence C.W. Cellular roles of DNA polymerase zeta and Revl protein // DNA Repair (Amst).- 2002.- V.I.- P.425-435

91. Lawrence C.W. Cellular functions of DNA polymerase zeta and Revl protein //Adv. Protein Chem.- 2004.- V.69. P. 167-203

92. Lee G.H., Matsushita H. Genetic linkage between Pol iota deficiency and increased susceptibility to lung tumors in mice // Cancer Sci.- 2005.- V.96.-P.256-259

93. Lehmann A.R., Niimi A., Ogi Т., Brown S., Sabbioneda S., Wing J.F., Kannouche P.L., Green C.M. Translesion synthesis: Y-family polymerases and the polymerase switch // DNA Repair.- 2007.- V.6.- P.891-899102. Lemme F., 2007

94. Lemontt J.F. Mutants of yeast defective in mutation induced by ultraviolet light // Genetics.- 1971.- V.68.- P.21-33

95. Lenne-Samuel N., Wagner J., Etienne H., Fuchs R.P. The processivity factor beta controls DNA polymerase IV traffic during spontaneous mutagenesis and transletion synthesis in vivo И EMBO Reports.- 2002.- V.3.-P.45-49

96. Li L., Zou L. Sensing, signaling, and responding to DNA damage: organization of the checkpoint pathways in mammalian cells // J. Cell. Biochem.- 2005.- V.94.- P.298-306

97. Li Z., Zhang H., McManus T.P., Mc-Cormick J.J., Lawrence C.W., Maher V.M. hREV3 is essential for error-prone translesion synthesis past UVor benzoa.pyrene diol epoxide-induced DNA lesions in human fibroblasts // Mutat. Res.- 2002.- V.510.- P.71-80

98. Lin X., Howell S.B. DNA mismatch repair and p53 function are major determinants of the rate of development of cisplatin resistance // Mol. Cancer Ther.- 2006.- V.5.- P.1239-1247

99. Lin X., Okuda Т., Trang J., Howell S.B. Human REV1 modulates the cytotoxicity and mutagenicity of cisplatin in human ovarian carcinoma cells // Mol. Pharmacol.- 2006.- V. 69.- P. 1748-1754

100. Lindahl Т., Barnes D.E. Repair of endogenious DNA damage // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol- 2000.- V.65.- P.127-133

101. Loeb L.A., Springgate C.E., Battula N. Errors in DNA replication as a basis of malignant changes // Cancer Res.- 1974.- V.34.- P.2311-2321

102. Maga G., Villani G., Ramadan K., Shevelev I., Le Gac N.T. Human DNA polymerase lambda functionally and physically interacts with proliferating cell nuclear antigen in normal and translesion DNA synthesis // J. Biol. Chem.-2002.- V.277.- P.48434-48440

103. Magni G. Origin and nature of spontaneous mutations in meiotic organizms.// J. Cell Сотр. Phylosophy.- 1964.- V.64.- P.165-172

104. Magni G., Von Borstel R. Different rates of spontaneous mutation during mitosis and meiosis in yeast // Genetics.- 1962.- V.47.- P. 1097-1108

105. Martomo S.A., Yang W.W., Vaisman A., Maas A., Yokoi M., Hoeijmakers J.H., Hanaoka F., Woodgate R., Gearhart P.J. Normal hypermutation in antibody genes from congenic mice defective for DNA polymerase iota // DNA Repair.- 2006.- V.5.- P.392-398

106. Masutani C., Kusumoto R., Yamada A., Dohmae N., Yokoi M. The XPV (xeroderma pigmentosum variant) gene encodes human DNA polymerase eta // Nature.- 1999.- V.399.- P.700-704

107. Masutani C., Kusumoto R., Iwai S., Hanaoka F. Mechanisms of accurate translesion synthesis by human DNA polymerase eta // EMBO J.- 2000.- V. 19.-P.3100-3109

108. Matsuda Т., Bebenek K., Masutani C., Hanaoka F., Kunkel T.A. Low fidelity DNA synthesis by human DNA polymerase eta // Nature.- 2000.-V.404.-P.1011-1013

109. Mayorov V.I., Rogozin I.B., Adkison L.R., Gearhart P.J. DNA polymerase eta contributes to strand bias of mutations of A versus T in immunoglobulin genes //J. Immunol.- 2005.- V.174.- P.7781-7786

110. McCulloch S.D., Kokoska R.J., Masutani C., Iwai S., Hanaoka F., Kunkel T.A. Preferential cis-syn thymine dimer bypass by DNA polymerase eta occurs with biased fidelity // Nature.- 2004.- V.428.- P.97-100

111. McDonald J.P., Rapic-Otrin V., Epstein J.A., Broughton B.C., Wang X. Novel human and mouse of Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase eta // Genomics.- 1999.- V.60.-P.20-30

112. McDonald J.P., Tissier A., Frank E.G., Iwai S., Hanaoka F., Woodgate R. DNA polymerase iota and related rad30-Iike enzymes // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci.- 2001.- V.356.- P.53-60

113. Mcllwraith M.J., Vaisman A., Liu Y., Fanning E., Woodgate R., West S.C. Human DNA polymerase eta promotes DNA synthesis from strand invasion intermediates of homologous recombination // Mol. Cell.- 2005.- V.20.-P.783-792

114. Mclntyre J., Podlaska A., Skoneczna A., Halas A., Sledziewska-Gojska E. Analysis of the spontaneous mutator phenotype associated with 20S proteasome deficiency in S. cerevisiae II Mutat. Res.- 2006.- V.593.- P.153163

115. McKenzie G.J., Lee P.L., Lombardo M.J., Hasting P.J., Rosenberg S.M. SOS mutator DNA polymerase IV functions in adaptive mutation and not adaptive amplification // Mol. Cell.- 2001.- V.7.- P.571-579

116. McLean D.J., Friel P.J., Johnston D.S. Characterization of spermatogonial stem cell maturation and differentiation in neonatal mice // Biol. Reprod.-2003.- V.69.- P.2085-2091

117. Mirchandani K.D., McCaffrey R.M., D'Andrea A.D. The Fanconi anemia core complex is required for efficient point mutagenesis and Revl foci assembly // DNA Repair (Amst).- 2008.- V.7.- P.902-911

118. Motegi A., Sood R., Moinova H., Markowitz S.D., Liu P.P., Myung K. Human SHPRH suppresses genomic instability through proliferating cell nuclear antigen polyubiquitination // J. Cell. Biol.- 2006.- V.175.- P.703-708

119. Murakumo Y., Ogura Y., Ishii H., Numata S., Ichihara M., Croce C.M., Fishel R., Takahashi M. Interactions in the error-prone postreplication repair proteins hREVl, hREV3, and hREV7 // J. Biol. Chem.- 2001.- V.276.-P.3 5644-35651

120. Muschen M., Re D., Jungnickel В., Diehl V., Rajewsky K., Kuppers R. Somatic mutationof the CD95 gene in human В cells as a side-effect of the germinal center reaction //J. Exp. Med.- 2000.- V.192.- P. 1833-1840

121. Nair D.T., Johnson R.E., Prakash S., Prakash L., Aggarwal A.K. Replication by human DNA polymerase-iota occurs by Hoogsteen base-pairing // Nature.- 2004.- V.430.- P.377-380

122. Nair D.T., Johnson R.E., Prakash L., Prakash S., Aggarwal A.K. Human DNA polymerase iota incorporates dCTP opposite template G via a G.C + Hoogsteen base pair // Structure.- 2005.- V.13.- P. 1569-1577

123. Nair D.T., Johnson R.E., Prakash L., Prakash S., Aggarwal A.K. Revl employs a novel mechanism of DNA synthesis using a protein template // Science.- 2005.- V.309.- P. 2219-2222

124. Nair D.T., Johnson R.E., Prakash L., Prakash S., Aggarwal A.K. An incoming nucleotide imposes an anti to syn conformational change on the templating purine in the human DNA polymerase-iota active site // Structure.- 2006.- V.14.- P.749-755

125. Nair D.T., Johnson R.E., Prakash L., Prakash S., Aggarwal A.K. Protein-template-directed synthesis across an acrolein-derived DNA adduct by yeast Revl DNA polymerase // Structure.- 2008,- V.16.- P. 239-245

126. Neeley W.L., Delaney S., Alekseyev Y.O., Jarosz D.F., Delaney J.C., Walker G.C., Essigmann J.M. DNA polymerase V allows bypass of toxic guanine oxidation products in vivo II J. Biol. Chem.- 2007.- V.282.- P.12741-12748

127. Nelson J.R., Lawrence C.W., Hinkle D.C. Thymine-thymine dimer bypass by yeast DNA polymerase zeta // Science.- 1996.- V.272.- P. 1646-1649

128. Niedzwiedz W., Mosedale G., Johnson M., Ong C.Y., Pace P., Patel K.J. The Fanconi anaemia gene FANCC promotes homologous recombination and error-prone DNA repair // Mol. Cell.- 2004.- V.l 5.- P. 607-620

129. Niimi N., Sugo N., Aratani Y., Gondo Y., Katsuki M., Koyama H. Decreased mutant frequency in embryonic brain of DNA polymerase beta null mice // Mutagenesis.- 2006.- V.21.- P.55-59.

130. Ogi Т., Kato T.J., Kato Т., Ohmori H. Mutation enhancement by DINB1, a mammalian gomologue of the Escherichia coli mutagenesis protein dinB // Genes Cells.- 1999.-V.4.- P.607-618

131. Ogi Т., Mimura J., Hikida M., Fujimoto H., Fujii-Kuriyama Y., Ohmori H. Expression of human and mouse genes encoding pol kappa: testis-specificdevelopmental regulation and AhR-dependent inducible transcription // Genes Cells.- 2001.- V.6.- P.943-953

132. Ogi Т., Shinkai Y., Tanaka K., Ohmori H. Pol kappa protects mammalian cells against the lethal and mutagenic effects of benzoa.pyrene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2002.- V.99.- P.15548-15553

133. Ogi Т., Kannouche P., Lehmann A.R. Localisation of human Y-family DNA polymerase kappa: relationship to PCNA foci // J. Cell. Sci.- 2005,-V.118.- P.129-136

134. Ogi Т., Lehmann A.R. The Y-family DNA polymerase kappa (pol kappa) functions in mammalian nucleotide-excision repair // Nat. Cell. Biol.- 2006.-V.8.- P.640-642

135. Ohashi E., Bebenek K.s Matsuda Т., Feaver W J., Gerlach V.L., Friedberg E.C., Ohmori H.s Kunkel T.A. Fidelity and processivity of DNA synthesis by DNA polymerase kappa, the product of the human DINB1 gene // Biol. Chem.- 2000.- V.275.- P.39678-39684

136. Ohashi E., Murakumo Y., Kanjo N., Akagi J., Masutani C., Hanaoka F., Ohmori H. Interaction of hREVl with three human Y-family DNA polymerases // Genes Cells.- 2004.- V.9.- P.523-531

137. Ohmori H., Hatada E., Qiao Y., Tsuji M., Fukuda R. DinP, a new gene in Escherichia coli, whose product shows similarities to UmuC and its homologues // Mutat. Res.- 1995.- V.347.- P.l-7

138. O-Wang J., Kajivara K., Kawamura K., Kimura M., Miyagishima H. An essential role of REV3 in mammalian cell survival: absence of REV3 inducedp53-independent embryonic death // Biochem. Biophys. Res. Commun.-2002.- V.293.- P.l 132-1137

139. O-Wang J., Kawamura M., Tada Y., Ohmori H., Kimura H. DNA polymerase kappa, implicated in spontaneous and DNA damage-induced mutagenesis, is overexpressed in lung cancer // Cancer Res.- 2001,- V.61.-P.5366-5369

140. Papadopoulo D., Guillouf C., Porfirio В., Moustacchi E. Decreased mutagenicity in Fanconi's anemia lymphoblasts following treatment with photoactivated psoralens // Prog. Clin. Biol. Res.- 1990.- V.340.- P.241-248

141. Pasqualucci L., Neumeister P., Goossens Т., Nanjangud G., Chagani R.S., Kuppers R., Dalla-Favera R. Hypermutation of multiple proto-oncogenes in B-cell diffuse large-cell lymphoma//Nature.- 2001.- V.412.- P.341-346

142. Permina E.A., Mironov A.A., Gelfand M.S. Damage-repair error-prone polymerases of eubacteria: association with mobile genome elements // Gene.- 2002.- V.293.- P. 133-140

143. Petta T.B., Nakajima S, Zlatanou A., Despras E., Couve-Privat S., Ishchenko A., Sarasin A., Yasui A., Kannouche P. Human DNA polymerase iota protects cells against oxidative stress // EMBO J.- 2008.- V.27.- P.2883-2895

144. Pfleger C.M., Salic A., Lee E., Kirschner M.W. Inhibition of Cdhl -APC by the MAD2-related protein MAD2L2: a novel mechanism for regulating Cdhl // Genes Dev.- 2001.- V.15.- P. 1759-1764

145. Plosky B.S., Woodgate R. Switching from high-fidelity replicases to low-fidelity lesion-bypass polymerases // Curr. Opin. Genet. Dev.- 2004.- V.14.-P.113-119

146. Plosky B.S., Vidal A., Fernandez de Henestrosa A.R., McLenigan M.P., McDonald J.P., Mead S., Woodgate R. Controlling the subcellularlocalization of DNA polymerases iota and eta via interactions with ubiquitin // EMBO J.- 2006.- V.25.- P.2847-2855

147. Poll E.H., Arwert F., Joenje H., Wanamarta A.H. Differential sensitivity of Fanconi anaemia lymphocytes to the clastogenic action of cis-diamminedichloroplatinum (П) and trans-diamminedichloroplatinum (П) // Hum. Genet.- 1985.- V.71.-P.206-210

148. Poltoratsky V., Woo C.J., Tippin В., Martin A., Goodman M.F., Scharff M.F. Expression of error-prone polymerases in BL2 cells activated for Ig somatic hypermutation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2001.- V.98.- P.7976-7981

149. Poltoratsky V., Horton K., Prasad R., Beard W.A., Woodgate R., Wilson S.H. Negligible impact of pol iota expression on the alkylation sensitivity of pol beta-deficient mouse fibroblast cells // DNA Repair.- 2008.- V.7.- P.830-833

150. Prakash S,, Johnson R.E., Prakash L. Eukaryotic translesion synthesis DNA polymerases: specificity of structure and function // Ann. Rev. Biochem.-2005.- V.74.- P.317-353

151. Qiu Z., Goodman M.F. The Escherichia coli polB locus is identical to dinA, the structural gene for DNA polymerase П. Characterization of pol II purified from a polB mutant // J. Biol. Chem.- 1997.- V.272.- P.8611-8617

152. Raji N.S., Krishna Т.Н., Rao K.S. DNA-polymerase alpha, beta, delta and epsilon activities in isolated neuronal and astroglial cell fractions from developing and aging rat cerebral cortex // Int. J. Dev. Neurosci.- 2002,-V.20.- P.491-496

153. Reuven N.B., Arad G., Maor-Shoshani A., Livneh Z. The mutagenesis protein UmuC is a DNA polymerase activated by UmuD', RecA, and SSB and is specialized for translesion replication // J. Biol. Chem.- 1999.- V.274.-P.31763-31766

154. Reynaud C.A., Garsia C., Hein W.R., Weill J.C. Hypermutation generating the sheep immunoglobulin repertoire is an' antigen-independent process // Cell.- 1995.-V.80.-P. 115-125

155. Rimkus C., Friederichs J., Rosenberg R., Holzmann В., Siewert J.R., Janssen K.P. Expression of the mitotic checkpoint gene MAD2L2 has prognostic significance in colon cancer // Int. J: Cancer.- 2007.- V.120.- P:207-211

156. Roche H., Gietz R.D., Kunz В A. Specificity of the yeast rev3A antimutator and REV3 dependency of the mutator resulting from a defect radlA in nucleotide excision repair // Genetics.- 1994.- V.137.- P.637-646

157. Roderick Т.Н. The response of twenty seven inbred strains of mice to daily doses of whole body X-irradiation // Radiation Research.- 1963.- V.20.-P.631-639

158. Rogozin I.B., Kolchanov N.A. Somatic hypermutagenesis in immunoglobulin genes. Influence of neighbouring base sequences on mutagenesis // Biochim. Biophys. Acta.- 1992.- V. 1171.- P. 11 -18

159. Ross A.L., Sale J.E. The catalytic activity of REVI is employed during immunoglobulin gene diversification in DT40 // Mol. Immunol.- 2006.- V.43.-P.1587-1594

160. Sabbioneda S., Bortolomai I., Giannattasio M., Plevani P., Muzi-Falconi M. Yeast Revl is cell cycle regulated, phosphorylated in response to DNA damage and its binding to chromosomes is dependent upon MEC1 // DNA Repair (Amst).- 2007.- V.6.- P.121-127

161. Sarasin A., Bounacer A., Lepage F., Schlumberger M., Suarez H.G. Mechanisms of mutagenesis in mammalian, cells. Application to human thyroid tumours // C. R. Acad. Sci. Ш,- 1999.- V.322.- P143-149

162. Schenten D., Gerlach V.L., Guo C., Velasco-Miguel S., Hladik C.L. DNApolymerase kappa deficiency does not affect somatic hypermutation in mice //i

163. Europ. J. Immunol.- 2002.- V.32.- P.3152-3160

164. Shen H.M., Peters A., Baron В., Zhu X.D., Storb U. Mutation of BCL-6 gene in normal В cells by the process of somatic hypermutation of Ig genes // Science.- 1998.- V.280.- P.l 750-1752

165. Shimizu Т., Azuma Т., Ishiguro M., Kanjo N., Yamada S., Ohmori H. Normal immunoglobulin gene somatic hypermutation in Pol kappa-Pol iota double-deficient mice // Immunol. Lett.-2005.- V.98.- P.259-264

166. Simpson E.M., binder C.C., Sargent E.E., Davisson M.T., Mobraaten L.E., Sharp J.J. Genetic variation among 129 substrains and its importance for targeted mutagenesis in mice//Nat. Genet.- 1997.-V. 16.-P. 19-27

167. Simhadri S., Kramata P., Zajc В., Sayer J:M., Jerina D.M, Hinkle D.C., Wei C.S. Benzoa.pyrene diol epoxide-deoxyguanosine adducts are accurately bypassed by yeast DNA polymerase zeta in vitro // Mutat. Res.-2002.-V.508.- P.137-145

168. Sobol R.W., Prasad R., Evensky A., Baker A., Yang X.P. The lyase activity of the DNA repair protein beta-polymerase protects from DNA-damage induced cytotoxicity // Nature.- 2000.- V.405.- P.807-810

169. Sobol R.W., Horton J.K., Kuhn R., Gu H., Singhal R.K., Prasad R., Rajewsky K., Wilson S.H. Requirement of mammalian DNA polymerase beta in base excision repair //Nature.- 1996.- V.379.- P. 183-186

170. Sobol R.W., Foley J.F., Nyska A., Davidson M.G., Wilson S.H. Regulated overexpression of DNA polymerase beta mediates early onset cataract in mice // DNA Repair.- 2003.- V.2.- P.609-622

171. Srivastava D.K., Husain I., Artcaga C.L., Wilson S.H. DNA polymerase beta expression differences in selected human tumors and cell lines // Carcinogenesis.- 1999.- V.20.- P.1049-1054

172. Steinborn G. Uvm mutants of Escherichia coli K12 deficient in UV mutagenesis. I. Isolation of itvm mutants and their phenolypical characterization in DNA repair and mutagenesis // Mol. Gen. Genet.- 1978.-V.165.- P.87-93

173. Stelter P., Ulrich H.D. Control of spontaneous and damage-induced mutagenesis by SUMO and ubiquitin conjugation // Nature.- 2003.- V.425.-P.188-191

174. Storer J.B. Acute responses to ionizing radiation.- In: Biology of the laboratory mouse // Ed. E. L. Green. New York: McGraw-Hill.- 1966.-P.427-446

175. Sugo N., Aratani Y., Nagashima Y., Kubota Y., Koyama H. Neonatal lethality with abnormal neurogenesis in mice deficient in DNA polymerase beta // EMBO J.- 2000.- V.19.- P.1397-1404

176. Suzuki N., Itoh S., Poon K., Masutani C., Hanaoka F., Ohmori H., Yoshizawa I., Shibutani S. Translesion synthesis past estrogen-derived DNA adducts by human DNA polymerases eta and kappa // Biochemistry.- 2004,-V.43.- P.6304-6311

177. Suzuki O., Matsuda J., Takano K., Yamamoto Y., Asano Т., Naiki M., Kusanagi M. Effect of genetic background on establishment of mouse embryonic stem cells // Exp. Anim.- 1999.- V.48.- P.213-216

178. Takenaka K., Ogi Т., Okada Т., Sonoda E., Guo C., Friedberg E.C., Takeda S. Involvement of vertebrate Pol kappa in translesion DNA synthesis across DNA monoalkylation damage // J. Biol. Chem.- 2006,- V.281.- P.2000-2004

179. Tang M., Shen X., Frank E.G., O'Donnell M., Woodgate R., Goodman M.F. UmuD'(2)C is an error-prone DNA polymerase, Escherichia coli pol V // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1999.- V.96.- P.8919-8924

180. Tissier A., McDonald J.P., Frank E.G., Woodgate R. Pol iota, a remarkably error-prone human DNA polymerase // Genes Dev.- 2000.- V.14.- P. 16421650

181. Tissier A., Frank E.G., McDonald J.P., Iwai S., Hanaoka F., Woodgate R. Misinsertion and bypass of thimine-thimine dimers by human DNA polymerase iota // EMBO J.- 2000.- V.19.- P.5259-5266

182. Tissier A., Kannouche P., Reck M.P., Lehmann A.R., Fuchs R.P., Cordonnier A. Co-localization in replication foci and interaction of human Y-family members, DNA polymerase pol eta and REV1 protein // DNA Repair (Amst).-2004.-V.3.-P. 1503-1514

183. Torgerson D.G., Kulathinal R.J., Singh R.S. Mammalian sperm proteins are rapidly evolving: evidence of positive selection in functionally diverse genes // Mol. Biol. Evol.- 2002.- P.1973-1980

184. Vaisman A., Frank E.G., McDonald J.P., Tissier A., Woodgate R. Pol iota-dependent lesion bypass in vitro II Mut. Res.- 2002.- V.510.- P.9-22

185. Vaisman A., Woodgate R. Unique misinsertion specificity of pol i my decrease the mutagenic potential of deaminated cytosines // EMBO J.- 2001.-V.20.- P.6520-6529

186. Vaisman A., Tissier A., Frank E.G., Goodman M.F., Woodgate R. Human DNA polymerase iota promiscuous mismatch extension // J. Biol. Chem.-2001.- V.276.- P.30615-30622

187. Vaisman A., Takasawa K., Iwai S., Woodgate R. DNA polymerase iota-dependent translesion replication of uracil containing cyclobutane pyrimidine dimmers // DNA Repair.- 2006.- V.5.- P.210-218

188. Vaisman A., Frank E.G., Iwai S., Ohashi E., Ohmori H., Hanaoka F., Woodgate R. Sequence context-dependent replication of DNA templates containing UV-induced lesions by human DNA polymerase iota // DNA Repair.- 2003.- V.2.- P.991-1006

189. Van Sloun P.P., Romeijn R.J., Ecken J.C. Molecular cloning, expression and chromosomal localization of the mouse Rev3 gene, encoding the catalytic subunit of polymerase zeta // Mutat. Rev.- 1999,- V.433.- P. 109-116

190. Vidal A.E., Kannouche P., Podust V.N., Yang W., Lehmann A.R., Woodgate R. Proliferating cell nuclear antigen dependent coordination of the biological functions of human DNA polimerase iota // J. Biochem.-2004.- V.279.- P.48360-48368

191. Wagner J., Gruz P., Kim S.P., Yamada M., Matsui K. The dinB gene encodes a novel E. coli DNA polymerase, DNA pol IV, involved in mutagenesis // Mol. Cell1999.- V.4.- P.281-286

192. Watanabe K., Tateishi S., Kawasuji M., Tsurimoto Т., Inoue H., Yamaizumi M. Radl8 guides pol eta to replication stalling sites through physical interaction and PCNA monoubiquitination // EMBO J.- 2004.-V.23.- P.3886-3 896

193. Waters L.S, Walker G.C. The critical mutagenic translesion DNA polymerase Revl is highly expressed during G(2)/M phase rather than S phase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2006.- V.103.- P.8971-8976

194. Waters L.S., Minesinger B.K., Wiltrout M.E., D'Souza S., Woodruff R.V., Walker G.C. Eukaryotic translesion polymerases and their roles and regulation in DNA damage tolerance // Microbiol. Mol. Biol. Rev.- 2009.-V.73.-P.134-154

195. Wilson S.H. Mammalian base excision repair and DNA polymerase beta // Mutat Res.- 1998.- V.407.- P.203-215

196. Wittschieben J., Shivji M.K., Lalani E., Jacobs M.A., Marini F. Disruption of the developmentally regulated Rev31 gene causes embryonic lethality // Curr.Biol.- 2000.- V.10.- P.1217-1220

197. Wolfe W.T., Johnson R.E., Minko I.G., Lloyd R.S., Prakash S., Prakash L. Replication past a trans-4-hydroxynonenal minor-groove adduct by the sequential action of human DNA polymerases i and к // Mol. Cell. Biol.-2006.- V.26.- P.381-386

198. Woodgate R., Ennis D.G. Levels of chromosomally encoded Umu proteins and requirements for in vivo UmuD cleavage // Mol. Gen. Genetics.- 1991.-V.229.- P. 10-16

199. Xiong Y., Steitz T.A. Mechanism of transfer RNA maturation by CCA-adding enzyme without using an oligonucleotide template // Nature.- 2004.-V.430.- P.640-645

200. Yamada A., Masutani C., Iwai S., Hanaoka F. Complementation of defective translation synthesis and UV light sensitivity in xeroderma pigmentosum variant cells by human and mouse DNA polymerase eta // Nucleic Acids Res.- 2000.- V.28.- P.2473-2480

201. Yang J., Zhiwen C.H., Liu Y., Hickey R.J., Malkas L.H. Altered DNA polymerase i expression in breast cancer cells leads to a reduction in DNA replication fidelity and a higher rate of mutagenesis // Cancer Res.- 2004.-V.64.- P.5597-5607

202. Yang W. Damage repair DNA polymerases Y // Cur. Opin. Struct. Biol.-2003.- V.13.- P.23-30

203. Yang W., Woodgate R. What a difference a decade makes: Insights into translesion DNA synthesis // PNAS.- 2007.- V.104.- P.15591-15598

204. Yuan В., Cao H., Jiang Y., Hong H., Wang Y. Efficient and accurate bypass of N2-(l-carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine by DinB DNA polymerase in vitro and in vivo II Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2008.- V.105.- P.8679-8684

205. Zan H., Komori A., Li Z.D., Cerutti A., Schaffer A. The translesion DNA polymerase zeta plays a major role in Ig and bcl-6 somatic hypermutation // Immunity.- 2001.- V.14.- P.643-653

206. Zhang Y., Yuan F., Wu X., Taylor J.S., Wang Z. Response of human DNA polymerase iota to DNA lesion // Nucleic Acids Res.- 2001,- V.29.- P.928-935

207. Zhang Y., Yuan F., Wu X., Wang Z. Preferential incorporation of G opposite template T by the low-fidelity human DNA polymerase iota // Mol. Cell. Biol.- 2000.- V.20.- P.7099-7108

208. Zhu F., Zhang M. DNA polymerase zeta: new insight into eukaryotic mutagenesis and mammalian embryonic development // World J. Gastroenterol.- 2003.- V.9.- P. 1165-1169

209. Zeng X., Winter D.B., Kasmer C., Kraemer K.H., Lehmann A.R., Gearhart P.J. DNA polymerase eta is an A-T mutator in somatic hypermutation of immunoglobulin variable genes // Nat. Immunol.- 2001- V.2.- P.537-541

Информация о работе

Макарова, Алена Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Свойства неточной ДНК-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариот - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы