Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства и регуляция никотинат-фосфорибозилтрансферазы из BREVIBACTERIUM ANNONIAGENES АТСС 6872

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свойства и регуляция никотинат-фосфорибозилтрансферазы из BREVIBACTERIUM ANNONIAGENES АТСС 6872"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ.БИОХИМШ им. А.Н. БАХА

СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ НИКОТИНАТ-ФОСФОРШОЗШГГРАНСФЕРАЗЫ ИЗ ВШТВАаТШОПЧ мши&шз АТСС 6872

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

на правах рукописи

ДУЛЬЯНИНОВА НАТАЛЬЯ ГЕННАДЬЕВНА

МОСКВА - 1995

Работа выполнена в лаборатории витаминов к физиологически активных соединений Института биохимии им. А.Н. Баха Российской Академии Наук.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Я. Быховский, доктор биологических наук, профессор В.Ж. Цыренов. доктор биологических наук, профессор З.Г. Евстигнеева, кандидат биологических наук С.Э. Мансурова.

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Защита диссертации состоится

«30 -

199

г. в /О часов на заседании Специализированного Совета (К 002.96.01) по .присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2).

«

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский проспектт, 33, корп. I).

Автореферат разослан

1995 г.

Ученый сэретавь Специализированного Совэ111

.■А

тхг\\ет>г\т\

М.И. Молчанов

0Б1ЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы: Биосинтез НАД представляет собой важную научно-техническую проблему. Это обусловлено .тем, что указанное соединение имеет большие перспективы применения в биологических, биотехнологическкх и медицинских исследованиях, а также служит исходным соединением для получения НАДН и НАДО. Для промышленного* производства НАД в основном используют микробиологический метод.

Известно, что в клетках наряду с да гсоуо синтезом НАД, КОТОрЫЙ НЗЧКНЗВТСЯ С ЗСЯЗрЗГИНОЕОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ТрИПТОфЗНЗ , существует сэлвидзк путь, основанный на способности клеток утилизировать экзогенные предшественники для синтеза пиридиновых нуклеотидов. Именно эта способность клеток лежит в основе микробиологического получения коферментов, нуклеотидов и их производных штаммами-продуцентами, чем и объясняется интерес к данному процессу.

Одним из наиболее эффективных продуцентов НАД является микроорганизм Вгеи1Ъа^ег1ил1 яптогЛсщепез АТСО 6872, который осуществляет сверхсинтез НАД из экзогенных зденина и нккотината (или никотинамяда) по сэлеидк пути.

Однако, биотехнологический успех определяется не только наличием соответствующих штаммов—продуцентов и их

биосинтетической активностью, но и знанием биохимических

/

механизмов и систем их регуляции, которые определяют образование и накопление целевых продуктов. Зачастую же информация _о процессах, происходящих при микробиологическом синтезе, не всегда отвечает тому уровню, который необходим для осуществления хорошо контролируемого промышленного процесса. В связи с этим, проблема изучения регуляции активности ферментов, участвующих в сэлвидж пути синтеза НАД, становится особенно актуальной.

Важная роль в сэлвидж синтезе НАД отводится никотинат-фоефорибозилтрансферазе (НФРГазв), ферменту, наиболее чувствительному к регуляторным воздействиям. Катализируемая им реакция образования мононуклеотида никотиновой кислоты из никотината и ФРПФ является первой стадией в сэлвидж пути синтеза НАД и, как считают многие авторы, лимитирует скорость всего процесса. Поэтому изучение регуляции данного фермента является составной частью решения проблемы микробиологического способа получения НАД.

Цель и задачи исследования: Целью данной работы было изучение регуляции первого фермента пиридиновой ветви сэлвидж синтеза НАД - никотинат-фосфорибозилтрансферазы и определение ее значения в этом биосинтетическом пути. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

-выделить и очистить НФРТазу из В. ammonlagenea АТОС 6872; -изучить свойства фермента и получить его кинетические характеристики;

-исследовать ретроингибиругацее действие продуктов реакции; -изучить влияние конечных продуктов и промежуточных метаболитов синтеза НАД на активность фермента.

Научная новизна: Впервые была очищена никотинат-фосфорнОозилтрансфераза из В. amonlagBnea АТСС 6872, известного продуцента нуклеотидов широкого ряда. Изучены свойства и регуляция этого фермента и показано, что он является объектом ретроингибируицего действия конечного продукта и промежуточных метаболитов сэлвидж синтеза НАД.

Практическое значение работы: Полученные результаты не только вносят вклад в теорию сверхсинтеза, но и могут повлечь за собой разработку практических рекомендаций и новых подходов для

промышленной биотехнологии НАД и его производных.

Апробация работы: Основные результаты работа были доложены на научно-практической конференции "Экологические проблемы микробиологии и биотехнологии в Байкальском регионе" (Улан-Удэ, 1995), на Международном симпозиуме "Витамины и здоровье населения Беларуси и смежных регионов" (Гродно, 1ЭЭ5).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы и I принята к печати.

Структура и объем работы: Диссертационная работа состоит из ЕЕедения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, еыеодое и списка цитированной литературы. Работа изложена на стр. машинописного текста, иллюстрирована ^^ рисунками и ^

таблицами. Список цитированной литературы включает работ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования являлась грамположитэльная бактерия Вгеи1ЪааТег1ит силгапСодепез, выделенная в 1927 г. Культура была депонирована в коллекциях ряда стран: в США - под номером АТСС 6872, в Англии - СГС 2399, в Японии - 1ТО 12ЦТ2 и КГ 3454. С БО-х годов этот штамм стал классическим микроорганизмом при исследовании свэрхсинтеза нукдэотидов.

• Питательные среды и условия культивирования. Культура поддерживалась. на мясо-пептонном агаре и хранилась при температуре +5°С, пересев производили каждые 1,5-2 месяца. Среда для выращивания посевного материала-имела следующий состав (%): гдгибза --2; пептон — ' I; ферментативный гидролизат белково-витамшшого концентрата (ФБВК) - I; ЯаС1 - 0,3; биотин - 0,03 мг/мл; рН среды 7,2-7,4. Ферментацию проводили на среде

следушцего состава (%): -глюкоза -10; КИ?Р04 - I; KV4P04'3H00 -1,3; MgS04-4H20 - I; CaCIp - 0,01; ФЕВК - I; мочевина - 0,6; биотин - 0,03 мг/мл; рН среда 7,2-7,4. Глюкозу, мочевину и биотин стерилизовали отдельно в течение 30 мин при 0,5 атм.

Количество Екросшей биомассы определяли по оптической плотности при 660 нм на спектрофотометре СФ-26 (Nora et al, 1969).

Определение количества синтезированного НАД проводили ферментативным методом с алкогольдегидрогеназой (Кочетов, 1971).

Бескдеточный экстракт получали разрушением клеток на прессе с последующей экстракцией 0,05 М К-фосфатным буфером, рН 7,4 и центрифугированием при 20000 g в течение 20 мин.

Колоночную хроматографию проводили на колонках с DEAE-Sephacel (20x270 мм и 14x190 мм), BEAE-TOYOPEARL HW-65 (20x220 км) к Sephatiex G-150 (12x950 мм).

Активность НФРТазы определяли е инкубационной среде следующего состава (мкмоль/мл): трис-фосфатный буфер, рН 8,5 -50; АТФ, динатркевая соль - I; Mgpl0 ~ 10; ФРПФ, магниевая соль -0,5; /С14/НК (50 Кю/М) - 0,1. Общий объем реакционной смеси составлял 250 мкл. Реакцию инициировали добавлением 50 мкл ферментного препарата. Разделение продуктов реакции проводили на пластинках "Sllufol UV 254" (ЧСФР) в системе растворителей изомасляная кислота : ледяная уксусная кислота : I н водный аммиак (10:1:5). Об активности судили по переходу радиоактивной метки из [ ?4С.?-никотината в МННК. Радиоактивность просчитывали на жидкостном сцинтилляционном счетчике SL-4000 фирмы "Intertechnique" (Франция). За единицу активности фермента принимали количество мкмолей продукта реакции, образующихся за I мин.

Для определения концентрации мононуклеотида никотиновой кислоты использовали спектрофотометрический метод, учитывая, что

коэффициент молярной экстинкции раствора МННК (рН 7,0) при 275 нм, равен 4,3"103 [Дсп]а, 1971).

Определение молекулярной массы фермента • проводили методом гель-фильтрации на колонке с БерТюйех 0-150 (1000x12 мм) (.АхиЗгешз, 1964) и на пластинках с 10 % полиакриламидным гелем (ПААГ) в присутствии додецил-сульфата натрия (ОшМа, 1964).

Концентрацию белка определяли по метода (Iошгу э1 а.1, 1951).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ Микроорганизм В. аттоп1сщепез АТСС 6872, являющийся одним из наиболее эффективных продуцентов нуклеотидов, осуществляет сверхсинтез НАД из экзогенных предшественников ' аденина и никотината (или никотинамида) по сэлвидж пути или пути Прейса-Хандлера (Рге1зз, НалхПег, 1957) (рис. I).

Никотинат и аденин, под действием ферментов НФРТазы (КФ 2.4.2.11) и аденин-ФРТазы (КФ 2.4.2.7) взаимодействуют с фосфорибозилпирофосфатом (ФРПФ), в результате чего образуются

пап^рт^тт тттги-пгптптптэпЛ- тгт*(1 ял^гы / Л Л-П-^ТГ \ т * п тто иг.г.

(АМФ). Последний при участии фосфотрансфераз фосфорилируется до АТФ, который под действием пирофосфорилэзы (КФ 2.7'.7.8) вступает в реакцию с МННК с образованием дезамидоНАД. Амидированив этого соединения под действием НАД-синтетазы (КФ 6.3.5.1) приводит к образованию НАД, который с участием киназы (КФ 2.7.1.23) может фосфорилироваться до НАДФ. Тагам образом, в сэлвидя синтезе НАД задействованы шесть ферментов. Три из них участвуют в- адэнилатной ветви: аденин-фосфорибозилтрзнсфераза- (Ад-ФРТаза), аденилаткиназа и нуклеозиддифосфаткшаза; и три в пиридиновой ветви - НФРТаза, дез.амидоНАД-пирофосфорилазй и НАД-синтетаза (рис.1).

-7-глнжоза

рибозо-5-фосфат

аденин-

ФРПФ-

АМФ

I

АДФ

I

АТФ

никотинамид

никотинат

АТФ

МННК

АТФ дезамидоНАД

—-глутамин (М3)

НАД

АТФ

АТФ

НАДФ

Рис. I. Сэлвидж путь биосинтеза НАД.

Важная роль в сэлвидж синтезе НАД отводится никотинат-фосфорибозилтрансферазе, ферменту, который катализирует первую стадию в никотинатной ветви синтеза НАД:

НК + ФРПФ + АТФ

МННК + ФФ + АДФ + Фн

Анализ литературных данных показал, что НФРТаза является ферментом сэлвидж пути синтеза НАД, наиболее подверженным регуляторным воздействиям и, по мнению ряда авторов, лимитирует

скорость всего процесса. Для изучения регуляции НФРТазы у В. asmoniagenea ÁTGG 6872, продуцента НАД, данный фермент был выделен и очищен в 500 раз.

Все стадии выделения НФРТазы проводили при 4°С. Очистка фермента включала в себя получение бесклеточного экстракта, дробное высаливание сульфатом аммония от 40 до 65 % насыщения, положительную адсорбцию кальций-фосфатным гелем, кислотную обработку 8 н. уксусной кислотой до рН 5,0, ионообменную хроматографию на колонках с DEJE-Sephacel и DEAE-TOYOPEÁRL HW-65, а также гель-фильтрацию на Sephnúsx G-150. Результаты очистки приведены в таблице I.

Очищенный препарат фермента хранили при температуре 4° с в 0,05 М К-фосфатном буфере, рН 7,4 с добавлением сульфата аммония до 65%-ного насыщения. Препарат полностью сохранял активность в течение недели. Более длительное хранение в этих условиях приводило к заметной потере активности. Хранение очищенного препарата НФРТазы, обессоленного на Sepbadez G-25, в замороженном состоянии в течение трех месяцев приводило к потере не более 10% активности. Повторное размораживание на активности фермента не сказывалось.

Молекулярная . масса фермента, определенная методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС-Zía, составила 33,8 кД (рис. 2), а при определении методом гель-фильтрации - 36,3 кД. По молекулярной массе ШРТаза из В. csmoniagenea ATGG 6872 соответствовала ферментам из других микроорганизмов и подобно им являлась мономером.

Наш был проведен подбор оптимальных условий для определения активности фермента (рис. 3).

Зависимость скорости реакции от времени имела линейный

Таблица I

Очистка никотинат-фосфзрибозилтрансферазы из В. arnianiagenea АТСО 6872

Стадия очистки

Общий Общая Удельная Выход по Степень

белок, актив- актив- актив- очистки

мг ность, ность, ности,

Е-Ю-3 Е"10~3/мг %

I.Бесклеточный экстракт

2.40-65% высаливание (NH4)^04

3.Обработка каль-ции-фосфатным гелем

4.Кислотная обработка, рН 5.0

на

3530

1200

765

420

388,30 324,00

275,40 180,60

5.1-ая DEAE-Se-phacel хроматография

6.2-ая DEAE-Se-phacel хроматография

7. Хроматог]; ПЕЛЕ-2 Ш-65

8 .Гель-фильтрация на Sephadex G-150

68,50 26,78

0,11 0,27

0,36 0,43

72 112,32 1,56

13,70 53,57

100

84

71

46

29

18

1.0

2,5

3,9

14,2

17 94,35 5,55 24 50,5

124,5 487,0

я/

1,0

0,8 0,6 0,4

Еэлхи маркеры (кД):

1 - ферритин из селезенки

лошади (18,5);

2 - НФРТаза из В. ашоп1а-

geneэ (33,8);

3 - лактатдегидрогеназа из

печени быка (36);

4 - каталаза из печени быка

(60);

5 - бычий сыЕороточный

альбумин (67).

4,4 4,6 4,8 5,0 lg молекулярной массы

Рис.2. Определение молекулярной массы НФРТазы из В. атоп1а£ет1ез АТСС 6812 методом электрофорезе в ПААГ в присутствии ДЦС-Яа.

характер в пределах 30 мин инкубации (рис. ЗА).

Исследование влияния рН реакционной среды на синтез МННК показало, что фермент был активен в широком диапазоне значений рН от 7,0 до 9,0. Оптимальным значением рН было 8,5 (рис. 3 Б).

Зависимость скорости реакции от количества белка представлена на рис. 3 В, из которого видно, что линейный характер зависимости сохранялся в пределах от 0,02 до 0,2 мг/мл при инкубации в течение 20 мин.

Определение активности НФРТазы из В. алвпопКщепез проводили в присутствии АТФ в реакционной среде, поскольку нами было показано, что без АТФ фермент не проявлял активности. При увеличении

МННК, нм

МННК, нМ

20 30

Еремя, мин

7,0

8,0

9,0

рН

МННК, нМ

Рис. 3. Зависимость активности НФРТазы из В. ашоп1а§епеа ЛТОС 6872 от А - времени,

В — »эиоийитда т\Ц

В - концентрации белка.

концентрации АТФ в 10 раз (с

-Я —Л

140 до 140 Ы) стимулировался синтез МННК в 8,5 раз. Таким образом, было показано, что НФРТазу из В. атсШщепеа следует отнести к АТФ-ззеиси-

белок, мг/мл

мал ферментам, которые для проявления своей активности нуждаются в присутствии АТФ как обязательного кофактора или косубстрзта,

что свойственно большинству микробных НФРТзгз. При этом реакция

образования МННК сопряжена со стехиометрическим гидролизом АТФ.

Значение для АТФ, определенное в координатах

Лайнуивера-Берка, составило 1,54"Ю-4 M и не зависело от

—s -d.

концентрации субстратов в пределах I'IO - 1*10 M для БК и ПО-4 - 5"Ю-4 M для ФРПФ.

Нами было показано, что и другие нуклеозидтрифосфаты, кроме АТФ, могут выступать в роли эяергосопрягающего агента в МННК-образупцей реакции, хотя и с меньшей эффективностью (pic 4). Так, в присутствии ЦГФ активность фермента из В. œmontagenea АТОС 6872 составляла 80 % от активности, наблюдаемой в присутствии АТФ. Ку для ЦГФ была равна 1,98ТО-4 М. Остальные нуклеозидтрифосфаты ИТФ, УТФ и ГТФ, независимо от типа основания,

ÍT/mwIO*3 м-1

Рис. 4. Активность НФРТазы из В. ctmmcnlagenea АТСО 6872 в присутствии нуклеозидтрифосфатов (НТФ): ЦТФ (I), ИТФ (2), УТФ (3), ГТФ (4).

обладали еще меньшим сродством к ферменту и были менее эффективны в качестве кофактора. И^ для ИТФ, УТФ и ГТФ составили 2,86 "Ю-4 М, 3,47'Ю-4 М и 4,68"10-4 М, соответственно.

Таким образом, фермент проявлял наибольшее сродство к АТФ. Однако, с увеличением концентрации АТФ свыше I мМ наблюдалось субстратное ингибированиэ реакции. Константа ингибирования К, АТФ С^СТЗВЙ"2 ^, 5"ХО М СЛЗООЭ СуССТрЗТНОв ИКШОйрОЕЗНИб рЭЗКЦИИ также наблюдалось с увеличением концентрации ГТФ. Ингибируюций

I

эффэкт был выражен слабее и появлялся при более высоких, чем для АТФ, концентрациях эффектора (свыше 2 мМ).

Таким образом, было показано, что НФРТаза из В. аттоп1а-ger.es АТСО 6872 характеризуется низкой специфичностью по отношению к нуклеозидтрифосфатам, подобно своим АТФ-зависимым гомологам из других микроорганизмов (дрожжей, ВасШиз эиЬНИз, БаХтапвИа. 1урМтиг1ия1).

Возможно, такая неспецифичность по отношению к нуклеозидтрифосфатам, е той или иной степени демонстрируемая микробными НФРТазами, объясняется структурными особенностями

_постгзгг'о сгпггта г><п ттахтттчя пп>/-*т>п гЫлг^ляагтто И »*л тот/*'"' тто Ла тттго С

аХш ч_» ции^^/а ихич ^ ^^шиЛ^и ■ ши«/*>-/Л,у ии^ти ьу •

гурМтяитЬлп (единственного на сегодняшний день объекта, для которого расшифрована первичная структура НФЕГазы) идентифицирован лишь участок связывания фосфатных групп субстрата. Молекула НФРТазы, в отличив от большинства АТФ—утилизирующих ферментов, не имеет Еторого участка нуклеотид-связыЕзгадего центра, который участвует в связывании основания нуклеотида (V in.it зку, 1991).

Изучение зависимости скорости реакции от концентрации НК

— Л

ттптгооаттгч птп V тттта тзтгапттшопа пг\птатэт*1та П С'ТП И (тчт.тп Д

И^ЛЬ ииилид ^ А I , Ьь^ А А и 1 иишли —1 1*1 \ . и ,

табл. 2). Изменение концентрации ФРПФ в реакционной среде от

•ТоЛ V

Влияние метаболитов синтеза НАД на сродство к субсратам НФРТазы из В. атагЛсщепез (К."10 М)

субстраты

Н К ФРПФ А Т Ф

контроль 0,60 1,45 1,54

МННК 1,0 3,22 1,54

ФФ 0,60 3,13

тта гз о»гг*7тпЧ А ТТ 0,60 Т Л*. » т ЯЛ А , ^ ТЕ

НАД 0,60 1,45

6'10"5 М до 6Ч0-4 М и концентрации АТФ в реакционной смеси от 5"Ю-4 М до 2"Ю-3 М не оказывало влияния на сродство фермента к никотинату.

При исследовании зависимости скорости реакции от концентрации ФРПФ была определена Км для ФРПФ, которая равнялась 1,45"Ю-4 Ы (рис. 5 Б, табл. 2). Кроме того было показано, что увеличение концентрации никотиновой кислоты в два раза с 540 " до 1"Ю~4 М не оказывало влияния на для ФРПФ, но повышало максимальную скорость реакции на 20%. При увеличении концентрации ФРПФ еышз 6"Ю-4 М наблюдалось ингибироввние фермента субстратом. К^ для ФРПФ, полученная в координатах Диксона, составляла 1,7"10-3 М, что на порядок выше для ФРПФ "(табл. 2 и 3).

На очищенной НФРТазе из В. ашоп1сщепез АТСС 6872 было исследовано влияние конечных продуктов реакции на активность

Рис. 5. Влияние продуктов реакции на активность НФРТззы из В. amiontcLgenea. А - 1/V при изменении концентрации НК; Б - 1/V при изменении концентрации ФРПФ; В - 1/V при изменении концентрации АТФ. 1 - контроль, 2 - пирофосфат (О,Б мМ), 3 - МННК (0,Э мМ).

Ч--

Рис. 6. Влияние-НАД и двзамидоНАД на активность ШРТазы из В. аттоШа^епез. А - ?/V при изменении концентрации НК; Б - 1/7 при изменении концентрации ФРПФ; В - 1/7 при изменении концентрации АТФ. 1 - контроль, 2 - дезамидоНАД (1,0 мМ), 3'~ НАД (0,5 мМ).- с-

фармента. Нами была показано, что МННК оказывал ингибирущее действие на НФРТазу, снижая активность фермента на 24% при концентрации I мМ. При этом константа ингибирования составила

о

1,9"10 М. По отношению к никотиновой кислоте и ФРПФ МННК проявлял конкурентное ингибирование, снижая сродство фермента к данным субстратам. В присутствии МННК Км для никотината и ФРПФ возрастала с 0,60"М~4 М до Г10-4 М и с 1,45-10~4 М до 3,22-КГ4 М, соответственно (табл. 2). По отношению к АТФ МННК оказывал неконкурентный тип ингибирования (рис. 6, табл. 3). Низциноеьш

гтлтдоил ттгхста гттжтгпгртлгтошгтятт т* »дглхтпх^хгхт полттдп •тятггчтчдптят* тта ио -о тггла ттт*

на активность фермента.

Исследование влияния еще одного конечного продукта реакции на активность НФРТазн из В. ага710п1а§еп83 АТСО 6672 показало, что пирофосфат (ФФ) е концентрации I мМ ингибировал активность фермента на 40%. Константа ингибирования К{^ФФ равнялась 9"10~4 М Пирофосфат являлся конкурентным ингибитором по отношении к АТФ и ФРПФ (рис. 5). Его действие выражалось в снижении сродства фермента к субстратам. Так, под действием ФФ К^, для АТФ увеличивалась с 1,54'Ю"4 М до 3,13"Ю"4 М, а Н^, для ФРПФ с 1,45 "Ю~4 М до 2,52"Ю-4 М (табл. 2).

АДФ (в концентрации I мМ), который е случае сопряжения МННК-образукщей реакции с гидролизом АТФ является продуктом реакции, снижал активность фермента на 15%. АДФ действовал как конкурентный ингибитор по отношению к АТФ с . константой ингибирования 1,2"10 " М.. Нуклеозкддкфосфаты ГДФ, ИДФ, УДФ, ЦДФ и нуклеозидмонофосфатн АМФ, ГМФ, ИМФ, ВДФ и ТМФ в концентрации 1мМ практически не оказывали влияния на активность НФРТазы.

Наш также было проверено действие адениловых производных на активность фермента. Аденин, адэнозин, аденозин-5'-тетрафосфат и

Таблица 3

Ингибироваяие активности НФРТазы из В. amioniagenea метаболитам! сэлвидж синтеза НАД (Kf"IO ~3 М)

АТФ 9,5 МННК 1,9

АДФ 1,2 дезамидоНАД 1,1

ФРПФ Т 7 » • НАД л п ' и, <

ФФ 0,9

полиадениловая кислота не влияли на активность НФРТазы из В. ammonlagenea.

Ингибирование сверхсинтеза НАД конечными продуктами по принципу отрицательной обратной связи у В. аттоп1сщепеэ АТСС 6872 было установлено ранее (Баздырэва и др., 1990).; Было также показано, что точкой приложения ингибирующего действия НАД и НАДФ является один из ферментов аденилатной ветви сэлвидж пути синтеза НАД - аденилаткиназа (Тулохонова и др., 1993). Нами было установлено, что НФРТазз, первый фермент пиридиновой ветви, также является объектом ингиблрупцего действия НАД на сбой собственный синтез у данного штамма. Однако, в отличие от аденилаткиназы, НАДФ не оказывал влияния на активность НФРТазы, также как флавиновые моно- и динуклеотид.

Исследование влияния НАД на активность НФРТазы из В. ammontagenea показало, что он является более сильным ингибитором по сравнению с другими метаболитами ниацинового ряда (табл. 3). В концентации 0,5 мМ он снижал активность фермента почти на 30%, константа ингибирования составила 0,7-Ю-3 М. При этом НАД

дэйствовал как конкурентно-неконкурентный ингибитор по отношению к АТФ, увеличивая К^ до 2,50-I0~4 М (рис. 6, табл. 2). По отношению к другим субстратам ингибироЕание носило неконкурентный

VQTiDVT'öT)

ДезамидоНАД в меньшей степени влиял на активность фермента. Его констактз икгиОиров зкия составила X I * TQ М Ингийировзкив носило неконкурентный характер по отношению к НК, ФРПФ и АТФ (рис. 6, табл. 2).

Таким образом, НФРТаза является второй известной точкой приложения регроингибирующего действия НАД и его дезаминированного производного дезамидоНАД на свой синтез культурой В. аттогЛсщепеа ATGO 6872.

Анализ литературных данных показал, что активность НФРГазы, к настоящему времени выделенной как из разных животных тканей, так и из целого ряда микроорганизмов, таких как дрожжи, В. aubtiИз, S. typhtmurium и Е. coli, не подвергалась ингибирующему действию со стороны дезамидоНАД, НАД и НАДФ.

Возможно, строго ограниченное содержание пиридиновых коферментов, свойственное нормально развивающейся клетке, поддерживается за счет регуляции других ферментов этого биосинтетичвского пути. Полученные нами результаты по ретроинги-бированию активности НФРТазы из В. amontagenea можно объяснить особенностями метаболизма данного микроорганизма, способного к сверхсинтезу пиридиновых нуклеотидов.

Такая способность к повышенной продукции часто связана с несбалансированностью различных сторон деятельности, микробных клеток (биосинтез, деградация, экскреция). Наряду с этим возможна утрата или изменение механизмов контроля, ограничивающих нормальную клетку от перепроизводства метаболитов. Поэтому у

сверхпродуцента должна присутствовать особая система регуляции, которая нашла бы компромисс между подчинением всех метаболических процессов образованию определенного продукта и максимальной экономией вещества и энергии.

В заключении хотелось бы подчеркнуть, что данная работа является продолжением серии исследований, проводимых в Лаборатории витаминов и ФАС Института биохимии им. А.Н. Баха, и направленных на изучение регуляции ферментов сэлвидж пути синтеза НАД у микроорганизма В. ашюп.1<щегьеа АТСС 6872. На основании полученных на?® данных, можно заключить, что НФРТаза является одним из основных регулируемых ферментов этого биосинтетического пути.

Фермент подвержен субстратному ингбированиию, а также влиянию продуктов реакции по принципу отрицательной обратной связи. Активность НФРТазы ингибируется конечным продуктом синтеза НАД и его непосредственным предшественником - дезамидоНАД. Следует отметить, что в регуляции активности НФРТазы принимают участие не только промежуточные метаболиты пиридиновой ветви, но и интермедиаты аденилатной ветви сэлвидж синтеза НАД.

Фермент проявляет абсолютную зависимость от АТФ, который является действительным субстратом реакции. Внутриклеточный уровень АТФ осуществляет быстрый контроль за образованием пиридиновых нуклеотидоЕ, скэзыезя влияние на активность первого фермента этого биосинтетичвского пути.

Начиная с образования МННК, все три реакции пиридиновой ветви, завершающие эту биосинтетическую цепочку, а также последующая реакция фосфорилирования НАД до НАДФ, идут с участием АТФ. И поэтому, снижение скорости образования МННК в присутствии низких концентраций АТФ предотвращает энергоемкий процесс

накопления промежуточных метаболитов, синтез которых в клетке имеет смысл лишь в контексте образования НАД как целевого продукта.

Таким образом, существующий множественный контроль за активностью данного фермента, в котором участвуют практически все метаболиты сэлеидж пути синтеза НАД, подтверждает ключевую роль НФРТазы в сверхсинтезе пиридиновых нуклзотидов у данного штамма.

ВЫВОДЫ :

1. Из штамма-продуцента нуклеотидов В. arnioniagenea АТСС 6672,.который осуществляет сверхсинтез НАД по сэлвидж пути, выделен и очищен в 500 раз фермент никотинат-фосфорибозилтрансфераза (НФРТаза).

2. Определены основные кинетические характеристики НФРТазы (К^ для никотината, АТФ и ФРПФ) и показано, что НФРТаза из В. arnioniagenea АТСС 6872 является мономерным белком с молекулярной массой 33,8-36,3 кД.

3. Установлена абсолютная зависимость НФРТазы от АТФ, а также низкая нуклеотидная специфичность фермента, выражающаяся в способности проявлять активность с другими нуклеозидтрифосфатами. При этом сродство фермента к ним было значительно ниже, чем к АТФ.

4. Установлен характер ингибирования НФРТазы продуктами реакции: МННК, пирофосфатом и АДФ.

5. Показано, что НФРТаза из В. arnioniagenea ATGG 6872 подвергается ретроингибировзнию конечным продуктом и промежуточным метаболитом синтеза НАД, его дезамидированным производным - дезамидоНАД. НАДФ не окэзыезл влияния на активность НФРТазы из В. arnioniagenea АТСС 6872.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ангаев С.Б., Соктоэв С.А., Дульянинова Н.Г., Цыренов В.Я. Потребление глюкозы и синтез нуклеотидных соединений штаммом-продуцентом Corynebacterium amnonlagenea ВСТИ-404. Известия СО РАН, Сибирский биологический журнал, 1992, вып. 5, с. 19-23.

2. Баздырева Н.М., Подлепа Е.М., Дульянинова Н.Г., Еыховский В.Я. Получение пиридиновых нуклеотидов с использованием BrevibocterlvirL amaniagenea. - Тез. докл. научно-практической конференции "Экологические проблемы микробиологии и биотехнологии в Байкальском регионе", Улан-Удэ, 1995, с. 37-38.

3. Подлепа Е.М., Дульянинова Н.Г., Радина В.П., Быховский В.Я. Регуляция ферментов "сэлвидж" синтеза НАД у Erevibactertvm ammonlagenea АТСС 6872 - Тез. докл. Ме'ждунзродного симпозиума "Витамины и здоровье населения Беларуси и смежных регионов", Гродно, 1995, c.<3i\

4. Дульянинова Н.Г., Подлепа Е.М., Радина В.П., Быховский В.Я. Выделение, очистка и кинетические свойства никотинат-фосфорибозилтрансферазы из Brevtbacterlum csrmontagenea АТСС 6872. - Прикл. биохимия и микробиология, 1995, Т. 31, JS в, с.594-598.

5. Дульянинова Н.Г., Подлепа Е.М., Радина В.П., ЦыреноЕ В.Ж., Быховский В.Я. Регуляция никотинат-фосфорибозилтрансферазы из Breulbocterium ammonlagenea АТСС 6872. - Прикл. биохимия и микробиология, 1995, в печати.

■Т;:погрп5КЯ издательства M У

' II9899,Москва,Ленинские горы За к« s ^¿д