Свободнорадикальные механизмы в развитии лекарственной резистентности опухолевых клеток

Соломка, Виктория Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Свободнорадикальные механизмы в развитии лекарственной резистентности опухолевых клеток
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Свободнорадикальные механизмы в развитии лекарственной резистентности опухолевых клеток"

На правах рукописи

Соломка Виктория Сергеевна

СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ В РАЗВИТИИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

03.00.02 - биофизика 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2005

Работа выполнена в Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН

Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор А. Н. Саприн

кандидат биологических наук Е. В. Калинина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Г. В. Максимов

доктор биологических наук, профессор В. В. Поройков

Ведущая организация: Институт химической физики

им. Н. Н. Семенова РАН

Защита состоится «.„¿^» 2005 г. в ■// часов на за-

седании диссертационного совета Д 002.252.01 при Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН

Автореферат разослан .2005

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Л А- Радкевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Одним из наиболее значительных ограничений эффективности химиотерапии опухолей является развитие резистентности опухолевых клеток одновременно к целому ряду химиотера-певтических препаратов с разным типом структуры и механизмом действия, получившее название множественной лекарственной резистентности-сти (МЛР) [Biedler J.L., Riehm H., 1970]. Различают врожденный и приобретенный типы МЛР, обладающие природно приобретенным и свойственным всей клеточной популяции, либо возникающим в результате длительной экспозиции, естественной селекции и адаптивных изменений к действию химиотерапевтического препарата характером резистентности [Pastan I., Gottesman M.M., 1987; Ford J.M., Hait W.N., 1990]. В настоящее время установлено существование нескольких различных механизмов, участвующих в формировании МЛР, включая повышенную экспрессию ряда трансмембранных транспортеров (Р-гп, MRP, LRP, BCRP), повышение уровня системы детоксикации, в значительной степени связанной с ростом экспрессии глутатион^-трансфераз, снижение экспрессии и активности топоизомеразы II, изменение экспрессии генов, контролирующих апоптоз, что связано с отменой генетически программированной гибели клеток [Hayes J.D. et al., 1990; Доненко Ф.В. и др., 1991; Cole S.P. et ah, 1992; Кор-nin B.P. et al., 1992; Gottesman M., Pastan I., 1993; Саприн А.Н. и др., 1996; Dive С, 1997; O'Connor P.M. et al., 1997; Владимирская Е.Б. и др., 1998; Гринчук Т.М. и др., 1998; Ставровская А.А., 2000; Сергеев П.В. и др., 2002; Богуш Т.А. и др., 2003; Штиль А.А., 2003].

Вместе с тем, свободнорадикальные механизмы развития МЛР остаются малоизученными [Doroshow J.H., 1986; Sinha B.K. et al., 1986; Pelicano H. et al., 2003], хотя хорошо известно, что действие химиотерапевти-ческих агентов, обладающих прооксидантным эффектом, как правило, связано с развитием резистентности в опухолевых клетках [Halliwell В., Gut-teridge J.M., 1989]. Особый интерес этот вопрос приобретает и в связи с тем, что согласно свободнорадикальной теории химического канцерогенеза образование свободнорадикальных интермедиатов канцерогенов является фактором как инициации, так и промоции злокачественной трансформации клеток, процессов инвазии и метастазирования посредством влияния на активацию онкогенов и нестабильность генома [Эмануэль Н.М., 1982; Salim A.S., 1993; Wiseman H. et al., 1996; На Н.С. et al., 2000]. Кроме того, активные формы кислорода (АФК) оказывают влияние на уровень транскрипции целого ряда факторов, принимающих участие в процессе формирования МЛУ, в том числе белков семейства Вс1-2, контролирующих развитие программируемой клеточной гибели [Reed J.C., 1995, 1997]. Поэтому исследование взаимосвязи формирования лекарственной резистентности, состояния клеточного редокс-статуса и уровня свободноради-кальных процессов несомненно имеет актуальное значение.

Цель исследования. Целью настоящей работы являлось изучение роли свободнорадикальных процессов в формировании лекарственной резистентности клеток эритролейкемии человека К562 к противоопухолевому препарату доксорубицину.

Задачи исследования:

- оценить уровень образования АФК и характер его изменения в процессе роста степени резистентности;

- исследовать изменение состояния ряда ключевых флавопротеинов, участвующих в метаболической активации доксорубицина, в процессе развития резистентности;

- оценить уровни свободных радикалов и негемового железа при формировании лекарственной резистентности опухолевых клеток;

- исследовать роль антиоксидантных и ГБН-зависимых ферментов, изменение экспрессии генов Ьс1-2 и bах в процессе развития резистентности к доксорубицину;

- оценить характер редокс-зависимых корреляционных связей, образующихся при формировании резистентности.

Научная новизна работы.

1. Впервые установлено, что развитие резистентности клеток эритролей-кемии человека К562 к противоопухолевому препарату доксорубицину, обладающему прооксидантным действием, связано с изменением клеточного редокс-статуса, что характеризуется высокой корреляционной связью роста степени резистентности со следующими факторами:

- уровнем снижения внутриклеточной продукции АФК

- ростом активности антиоксидантных (Си^п-супероксиддисмутазы, Мп-супероксиддисмутазы) и глутатион-зависимых (глутатионпероксидазы, глутатион^-трансферазы, глутатионредуктазы) ферментов;

- ростом внутриклеточного содержания глутатиона;

- снижением АФК-продуцирующей активности ксантиноксидазы.

2. Впервые показано, что развитие резистентности к доксорубицину в клетках К562 сопровождается скоординированным изменением и после-дуюшим снижением активности НАДН-дегидрогеназы и НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1, обладающих разным типом метаболической активации доксорубицина.

3. Впервые обнаружено, что формирование резистентности клеток К562 к доксорубицину связано с супрессией свободнорадикальных процессов и внутриклеточного пула свободного и связанного негемового железа.

4. Впервые показано, что развитие резистентности клеток К562 к доксору-бицину может происходить при одновременной активации транскрипции гена Ьс1-2 и росте внутриклеточного уровня белка Вс1-2 и, напротив, супрессии транскрипции гена Ьах.

Практическая значимость.

Полученные данные вносят существенный вклад в развитие представлений о редокс-зависимом типе механизма формирования лекарствен-

ной резистентности опухолевых клеток гемопоэтического ряда. Установленный характер изменения соотношения АФК-продуцирующих и катализирующих ферментных систем и ключевых транскрипционных факторов Вс1-2 семейства в ходе развития резистентности опухолевых клеток может быть рекомендован в качестве прогностического фактора для разработки определенных схем комбинированной терапии, позволяющей усиливать направленный цитотоксический противоопухолевый эффект путем оптимизации сочетания доз базового прооксидантного противоопухолевого препарата со временем введения и типом препаратов, корректирующих состояние антиоксидантной и детоксицирующей систем.

Положения, выносимые на защиту:

1. Формирование резистентности клеток эритролейкемии человека К562 к противоопухолевому препарату доксорубицину приводит к снижению внутриклеточного уровня АФК, характеризующееся обратной сильной корреляционной связью с ростом степени резистентности.

2. Снижение и скоординированное изменение активности флавопротеинов (ксантиноксидазы, НАДН-дегидрогеназы, НАД(Ф)Н-хиноноксидоредук-тазы 1), вносящих значительный вклад в метаболическую активацию доксорубицина, в значительной степени определяют супрессию образования АФК в процессе развития резистентности клеток К562.

3. Развитие резистентности клеток К562 к доксорубицину связано с подавлением свободнорадикальных процессов и снижением внутриклеточного уровня свободного и связанного негемового железа.

4. Рост активности антиоксидантных (Cu,Zn- супероксиддисмутазы, Мп-супероксиддисмутазы) и TSH-зависимых (глутатионпероксидазы, глута-тион^-трансферазы, глутатионредуктазы) ферментов, а также внутриклеточного содержания TSH в процессе развития резистентности клеток К562 образует дополнительный блок, препятствующий образованию АФК.

5. Усиление процессов детоксикации, связанных с ростом содержания rSH и активностей TSH-зависимых ферментов, образует обратную сильную корреляционную связь со снижением процессов перекисного окисления липидов в процессе развития резистентности клеток К562.

6. Развитие резистентности клеток К562 к доксорубицину может сопровождаться супрессией транскрипции гена Ьах и, напротив, активацией экспрессии гена bcl-2.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на следующих конференциях: Национальной научно-практической конференции с международным участием "Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека" (Смоленск, 2001); VI Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2002); Международном симпозиуме "Reactive oxygen and nitrogen species: diagnostic, preventive and therapeutic values" (Санкт-Петербург, 2002); XIth Meeting of the Society for Free Radical Research International (Париж, Франция, 2002); III Симпозиуме "Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей" (Москва,

2002); Международной конференции "Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health" (Смоленск, 2003); Научно-практической конференции "Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины" (Москва, 2003); III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); 38th Annual Meeting of the European Society for Clinical Investigation (Utrecht, the Netherlands, 2004); IV Симпозиуме "Биологические основы терапии онкологических заболеваний" (Москва, 2004).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 12 печатных работах.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 165 страницах, и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования, заключения, выводов и списка литературы, включающего 41 отечественных и 280 зарубежных источников. Диссертация содержит 26 рисунков и 6 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Культура клеток. Условия культивирования. Клеточная линия -К652 эритролейкемии человека была любезно предоставлена Институтом Цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки культивировали в виде суспензии в среде RPMI 1640 (Sigma) с добавлением 10% термоинактивирован-ной эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco BRL), 2мМ L-глутамина, 100 Ел/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СОг. Резистентность клеток К562 к доксору-бицину (сублинии K562/DOX], K562/DOX2, К562/ЕЮХз) достигалась путём ступенчатого повышения концентрации цитостатика в культуральной среде.

Оценка цитотоксичности. Для определения пролиферативной активности и выживаемости клеток использовали метод, основанный на восстановлении 1-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида, -МТТ-тест (Mosmann Т., 1983).

Уровень образования Н2О2 оценивали с использованием 2',7'-дихлорфлуоресцеиндиацетата (DCFDA) по флуоресценции 2,7-дихлор-флуоресцеина возбуждения - 488 нм и эмиссии - 530 нм), образующегося в результате действия клеточных ацетоэстераз и окисления эндоген-нойН202 (LeBel СР. et al., 1992; Konorev Е.А et al., 1999).

Уровень образования 0¿ оценивали по флуоресценции этидия (А, возбуждения - 488 нм, X эмиссии - 600 нм), образующегося в результате окисления дигидроэтидия при действии CV и флуоресцирующего после интер-каляции в ДНК (Benov L. et al., 1998).

Люминол-зависимая хемилюменисценция. Возможность активации в клетках ФМА (форбол-12-миристат-13-ацетат)- и зимозан-индуцируемого окислительного взрыва оценивали с помощью хемилюминесценции с использованием люминесцентного зонда люминола на сцинтилляционном

счетчике фотонов MARK-II (Nuclear Chicago, США). Измерения проводили в среде культивирования.

ЭПР-спектроскопия. Регистрацию спектров ЭПР проводили на спектрометре Х-диапозона ECS-106 «Bruken с использованием замороженных при -196°С клеток и амплитуде модуляции 0,5 мТл, мощности СВЧ = 20 мВт. Спектры ЭПР нитрозильных комплексов негемового железа (g = 2,03) регистрировали после предварительной инкубации резистентных и чувствительных клеток с 10 мМ нитрозоглутатионом в течение 5 мин и последующего замораживания при -196°С. Для регистрации спектров ЭПР негемового связанного железа (g = 4,3) использовали метод предварительного "искусственного старения" клеток посредством двухкратного размораживания - замораживания.

Активности ферментов определяли спектрофотометрически:

- активность Си^п-супероксиддисмутазы(Си^п-СОД) - по восстановлению цитохрома с в системе ксантин-ксантиоксидаза (McCord J.M., Fri-dovich I., 1969);

- активность Мп-супероксиддисмутазы (Мп-СОД) - по скорости восстановления цитохрома с в системе ксантин-ксантиноксидаза в присутствии 1мМ цианида натрия (McCord J.M., Fridovich I., 1969);

- активность каталазы — по убыли Н2О2 (Aebi H. et al., 1969);

- активность глутатионпероксидазы (ГПО) - по скорости окисления НАДФН, используя в качестве субстратов гидроперекись кумола и Н2О2 (Paglia D.F., Valentine W.N., 1967);

- активность глутатион^-трансферазы (TST) - по образованию продукта реакции TSH с субстратом 1-хлор-2,4-динитробензолом (Habin W.H. etal., 1974);

- активность глутатионредуктазы (ГР) - по убыли НАДФН в присутствии субстрата ГSSГ (Carlberg I., Mannervik В., 1975);

- активность ксантиноксидазы - по образованию мочевой кислоты (Hunt J.,MasseyV., 1992);

- активность НАДН-дегидрогеназы — по восстановлению цитохрома с (Mahler H.R., 1955);

- активность НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 оценивали, используя в качестве субстрата менадион дисульфат (Ernster L., 1967).

Концентрацию белка определяли по методу Lowry (Lowry et al.,

1951).

Содержание глутатиона (FSH) оценивали по восстановлению 5,5-дитионитробензойной кислоты в присутствии глутатиоредуктазы (Ti-etze F., 1969).

Содержание малонового диальдегида (МДА) оценивали по уровню ТБК-активных продуктов (Ohkawa H. et al., 1979).

Внутриклеточный уровень Bcl-2 оценивали с помощью метода Вес-терн-блоттинга (Towbin H. et al., 1979), используя моноклональные антитела (Bcl-2-100; Sigma) и вторичные антитела к IgG мыши, конъюгированные

с пероксидазой хрена (Институт вирусологии РАМН).

Уровня транскрипции генов bcl-2 и bах оценивали методом полиме-разной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR) (Chomczynski Р, Sacchi N., 1987), используя праймеры для bcl-2: прямой - 5'-aga tgt сса gcc age tgc acc-3', обратный 5'-ggct g ttg act tea ctt gtg-3', длина продукта -391 пар оснований; bax: прямой - 5'-gag cag ate atg aag acaggg-3', обратный - 5'-tgg caa agt aga aaa ggg cga-3', длина продукта - 300 пар оснований.

Для статистической оценки результатов исследований использовали t - критерий Стьюдента. При оценки корреляционных связей использовали регрессионный анализ, коэффициенты линейной корреляции Пирсона и ранговой корреляции Спирмена (Гланц С, 1999) с применением компьютерных пакетов программ Sigma Plot, Statistica, Biostat.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Изменение уровня AФК в процессе развития резистентности клеток K562 к DOX.

В ходе развития резистентности к доксорубицину (DOX) клеток эритролейкимии человека К562 были получены сублинии клеток с 3 степенями резистентности: K562/DOXi, K562/DOX2, K562/DOX3 (с IC50 3,1;

6,4; 8,1 мкМ соответственно).

Кривые выживаемости линий чувствительных клеток К562 (ICjo 0,043 мкМ) и с разной степенью резистентности к DOX, полученные с использованием МТТ-теста через 72 часа инкубации клеток с препаратом, приведены на рис. 1.

120

0 -р-1-1-т-1-1-1-г

0 0,035 0.07 0,15 0,3 0,6 1,25 2,5 5 Доксорубицин, мкг/мл

Рис. 1. Исследование устойчивости чувствительных и с разной степенью резистентности клеток К562 к доксорубицину с помощью ММТ-теста.

Рис. 2. Изменение уровня образования Н2О2 в клетках К562 в ходе развития резистентности к доксорубицину.

*р < 0,05 - уровень достоверно значимых различий по отношению к клеткам К562/8.

Рис. 3. Уровень образования Ог'в чувствительных и резистентных клетках К562.

уровень достоверно значимых различий по отношению к клеткам К562/8.

В ходе анализа полученных сублиний клеток показано, что развитие резистентности приводит к супрессии внутриклеточного уровня образования Н2О2 (рис. 2), который достоверно снижается по мере повышения степени резистентности.

Аналогично, существенная супрессия генерации уровня супероксид аниона установлена для всех трех сублиний резистентных клеток с максимально выраженным снижением его уровня в резистентных клетках

К562ЛХ)Х3 (рис. 3).

Изменение генерации АФК в резистентных клетках было показано также с помощью хемилюминесценции. Анализ хемилюминесценции чувствительных и резистентных клеток (сублиния клеток с ис-

пользованием люминесцентного зонда люминола позволил выявить активацию чувствительных клеток в присутствии ФМА (рис. 4, А), что, вероятно, в определенной степени может объясняться индуцирующим действием ФМА на систему генерации О21 (Zhao B.L. et al., 1996). Напротив, как видно из кинетических кривых хемилюминесценции в отличие от чувствительных клеток, для которых внесение ФМА в среду культивирования вызывало существенное повышение интенсивности хемилюминесценции с последующей не мгновенной релаксацией, присутствие ФМА не вызывало активации хемилюминесценции резистентных клеток (рис. 4,

Б).

Рис. 4. Люминол-зависимая хемилюминесценция в присутствии ФМА (10 нМ) А - чувствительных (K562/S) и Б - резистентных (К562ЛЭОХз) клеток.

При оценке изменения способности клеток К562ДХЖ к генерации Ог1 при формировании резистентности к БОХ использована экстремально высокая концентрация последнего (8 мкг/мл), практически в 4 раза превышающая уровень 1Сзо (1,9 мкг/мл) для клеток К562/ООХ|, что, как предполагалось, могло бы способствовать развитию высокого уровня окислитель-

ного стресса как в чувствительных, так и в резистентных клетках. После внесения DOX в культуральную среду установлено значительное повышение как для K562/S, так и K562/DOXi клеток уровня флуоресценции этидия (рис. 5), образующегося в результате взаимодействия Ог:с дигидроэтидием (Benov L. et al., 1998). Наблюдаемый прирост образования О21 в резистентных клетках в 2,7 раза ниже, чем в чувствительных, что свидетельствует о высоком уровне защитных систем резистентных клеток, препятствующих развитию окислительного стресса, вызываемого DOX, что, по-видимому, включает наряду с другими факторами формирования лекарственной устойчивости таких, как Р-гп, MRP, контролирующих концентрацию DOX и его метаболитов в клетке (Morris D.I. et al., 1991; O'Brien M. et al., 2000), изменение уровня ферментативных систем, генерирующих АФК и обеспечивающих антиоксидантную защиту.

а б в г

Рис. 5. Образование супероксид аниона в чувствительных ^562^) и резистентных (К562/ЕЮХ1) клетках соответственно до (а, в) и после (б, г) внесения в культуральную среду Б ОХ (8 мкг/мл).

*р < 0,05 - уровень достоверно значимых различий по отношению к К562/8 клеткам (б); "р < 0,05 - уровень достоверно значимых различий по отношению к К562ЛЮХ1 клеткам (г).

Супрессия внутриклеточного уровня АФК в ходе развития резистентности клеток К562 к DOX в определенной степени может быть обусловлена изменением каталитической активности ряда флавопротеинов, способных инициировать редокс-активацию DOX. DOX-зависимая генерация АФК осуществляется за счет редокс-цикла хинона:

- О*

семихинонный свободнорадикальный интермедиат

За счет одноэлектронного восстановления хинона в структуре БОХ, катализируемого рядом флавопротеинов, в том числе митохондриальной НАДН-дегидрогеназой (Doroshow Т.Н., 1983) и микросомальной НАДФН-цитохром Р-450-редуктазой (БасИиг ^Я. е1 а1., 1979), образуется семихи-нонный свободный радикал, который восстанавливает кислород в анаэробных условиях до супероксид аниона с последующей его неферментативной или ферментативной (в присутствии СОД) дисмутацией до Н2О2 и/или образованием в присутствии двухвалентных ионов металлов (Бе2*, Си2+, Хх?*) высокореакционных 'ОН радикалов (^д = 1x10'9 сек), с деструктивным действием которых на нуклеиновые кислоты, белки и липиды связан, в частности, противоопухолевый эффект БОХ (Doroshow 1.Н., 1986).

В ходе развития резистентности к БОХ в клетках К562 наблюдается значительный рост активности НАДН-дегидрогеназы с максимумом для сублинии клеток К562/1ЮХ2 (таблица 1). В то же время дальнейшее развитие резистентности приводит к резкому снижению активности фермента -как установлено для клеток сублинии

Таблица 1.

Изменение активности ферментов, катализирующих одно- и двухэлек-тронное восстановление доксорубицина в процессе развития резистентности клеток К562.

Тип клеток НАДН-дегидрогеназа нмоль/мин.мг НАД(Ф)Н-хиноноксидо-редуктаза1 нмоль/мин.мг Ксантин-оксидаза нмоль/мин.мг

K562/S 25 ±3 123 ± 12 3,13 + 0,25

K562/DOX : 37 + 3 171+9* 2,01 ±0,27*

K562/DOX 2 56 ±6* 234± 16* 1,01 ± 0,38*

К562/ШХ3 9 ±2* 61 ± 11* 1,35 + 0,24*

*р < 0,05 - уровень достоверно значимых различий по отношению к чувствительным клеткам K562/S.

Аналогичный с повышением активности НАДН-дегидрогеназы рост активности НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1, осуществляющей двух-электронное восстановление хинонов с образованием гидрохинона, что может усиливать процесс детоксикации интермедиатов DOX с образованием неактивных глюкуронидов и сульфатов, легко элиминирующихся из клетки (Lind С, 1985; Thomas DJ. et al., 1990), и позволяет снизить образование семихинонных радикалов. Напротив, для ксантиноксидазы, катализирующей восстановление смешанного типа (Nakamura M., Yamazaki I., 1973), развитие резистентности к DOX связано с постепенным значительным снижением ферментативной активности, что может приводить к заметному уменьшению доли образования Of, не только вследствие снижения процесса генерации семихинонных свободных радикалов, но и, по

всей видимости, в результате снижения образования в процессе катаболизма пуриновых оснований до мочевой кислоты, катализируемом ксанти-ноксидазой (РгИвов С.А., 2000). В отличие от НАДН-дегидрогеназы и НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 достоверно значимое снижение ксан-тиноксидазы установлено для линий клеток всех трех степеней резистентности.

Изменение активностей ферментов, связанных с процессом восстановления хинона в структуре БОХ с последующим его редокс-циклом, приводящем к образованию АФК (Ог\ Н2О2), в ходе развития клеточной резистентности к БОХ происходило на фоне практически неизменного уровня МДА, оцененного как ТБК-активные продукты [Владимиров Ю.А., Арчаков А.К., 1972] в клетках К562/ООХ] И К562/1ЮХ2 с последующим резким снижением в клетках К562ЛЮХз (рис. 6), что вероятно, в значительной степени может быть обусловлено характером изменения активностей исследуемых флавопротеинов.

1062/00X1 К562/РОХ2 К562/1ЮХЗ

Рис. 6. Уровень МДА (ТБК-активных продуктов) в чувствительных (К562/8) и резистентных клетках (К562/ШХ,, К562/ООХ2, К562/ШХ3).

*р < 0,05 - уровень достоверно значимых различий по отношению к чувствительным клеткам К562/8.

Исследование свободныхрадикалов и парамагнитных центров не-гемового железа в чувствительных и резистентных к доксорубицину клетках К562.

С использованием ЭПР-спектроскопии было проведено сравнительное исследование уровней свободных радикалов и парамагнитных центров негемового железа в чувствительных и резистентных к БОХ клетках К562. В культуре чувствительных клеток К562/8, выращенных в отсутствие БОХ, зарегистрирован синглетный сигнал свободных радикалов семихи-нонного типа с g-фактором = 2,006 (рис. 7, а, б) с шириной линии 6,3 э. В

тоже время в резистентных клетках К562^0Х при тех же условиях наблюдалось резкое снижение сигнала такого типа (рис. 7, в, г).

| Е = 2,006

Рис. 7. ЭПР спектры чувствительных клеток К562/5 (а и б) и резистентных (в и г) К562^0Х3 в среде инкубации. а -14,4 млн. клеток, усиление 105, накопление 2 раза. б - 3 млн клеток, усиление 105, накопление 4 раза. в -14,4 млн клеток, усиление 5х105, накопление 2 раза. г - 3 млн клеток, усиление 5х105, накопление 8 раз.

Механизмом снижения генерации свободных радикалов, по всей видимости, является снижение активности флавопротеинов, катализирующих одноэлектронное восстановление хинонных структур.

Развитие резистентности клеток К562 к доксорубицину приводит к существенному изменению содержания негемового железа. При использовании ловушки свободного негемового железа - нитрозоглутатиона установлено существенное снижение интенсивности сигнала с g-фактором 2,03 в резистентных клетках К562/Е)ОХз по сравнению с чувствительными (рис. 8).

Оценка негемового железа в высокоспиновом состоянии (8 = 5/2), в окисленной форме (Ре3+), дающего сигнал ЭПР с g = 4,3 (Ингрэм Д., 1972), оказалось возможной только при использовании метода «искусственного старения» клеток (хранения клеток в течение 3 дней без нормального дыхания, при X = +8°С), что позволило зарегистрировать появление более высокого уровня сигнала ЭПР с g = 4,3 в чувствительных клетках по сравнению с резистентными клетками К562ЛЮХз (рис. 9). В силу того, что сигнал ЭПР с g = 4,3 является суперпозицией сигналов ЭПР нескольких типов

ззо

_х__I

340 тТ

парамагнитных центров, его появление может отражать процессы перераспределения трехвалентного парамагнитного ^ = 5/2) железа в системе его депонирования (ферритин) и транспорта.

I_I_I-1-1-1

3200 3300 3400 шТ

Рис. 8. Спектры ЭПР нитрозильных комплексов негемового железа в чувствительных (а) и резистентных К562/ЕЮХз (б) клетках; а и б - 8 млн клеток, усиление - 105.

| 8 = 4,3

I-1-1-1_1111

1400 1500 1600 1700 тТ

Рис. 9. Спектры ЭПР связанного негемового железа = 4,3) в чувствительных Х562^ (а) и резистентных (б) К562/ООХэ клетках после "искуст-венного старения"; а и б - 8 млн клеток, усиление - 105.

Полученные данные можно интерпретировать как появление снижения свободного (лабильного) и связанного железа в клетках в ходе формирования резистентности клеток К562 к DOX, что составляет часть адаптивного процесса, развивающегося в ответ на прооксидантное действие DOX и приводящего к снижению риска развития Fe - зависимых деструктивных процессов в клетках.

Изменение активности антиоксидантных и ГSH-зсвисимък ферментов, уровня экспрессии генов Ьс1-2 и Ъах при формировании ле-карственнойрезистентности клетокК562к доксорубицину.

Анализ состояния антиоксидантной системы клеток К562 позволил установить, что развитие резистентности к DOX приводит к изменению уровня активности основных антиоксидантных ферментов - СОД и катала-зы (таблица 2).

Таблица 2.

Активности Си^п-СОД и каталазы в клетках К562 в процессе формирования резистентности к доксорубицину.

Типы клеток

К562/Я К562ЮОХ, К562/ГОХ2 К562/ШХ3

Си^п-СОД Ед/мг 10,1 ±0,64 13,1 ± 1,02' 14,8 ±1,40* 22,3 ±1,61"

Катал аза ммоль/мин.мг 12,9 ±1,01 16,8 ± 1,19* 14,8 ±1,42 11,1 ±1,76

*р < 0,05; **р < 0,001 - уровень достоверно значимых различий по отношению к клеткам

Как видно из таблицы 2, активность каталазы в ходе повышения степени резистентности изменяется нелинейно, возрастая в клетках К562ЯЮХ1 и затем снижаясь до контрольного уровня в клетках К562ЛЮХ3. Напротив, активность Си,2п-С0Д постепенно возрастает, достигая в клетках К562/1ЮХз максимального уровня. При этом наблюдается более выраженный, чем для Си,2п-СОД, рост активности Mn-СОД (рис. 10).

I I I

Рис. 10. Изменение активности Mn-СОД в процессе развития резистентности к БОХ в К562 клетках.

*р < 0,05 - уровень достоверно значимых различий по отношению к клеткам Е562/5.

Существенным вкладом в развитие антиоксидантного ответа можно считать повышение содержания ГSH и активностей ГSH-зависимых ферментов (ГПО, ^^ ГР), уровень которых в процессе роста резистентности существенно повышался (таблица 3).

Таблица 3.

Содержание ГSH и активности ГSH-зависимых ферментов в чувствительных (Е562/5) и резистентных (K562/DOX) клетках.

Типы клеток

К562/8 К562ЛХ>Х, К562/БОХ3 К562ЛЮХ3

ГБН нмоль/мг 37 ±5,2 5514,5* 48,913,2* 65,814,9*

ГПО нмоль/мин.мг субстраты: н2о2 гидроперекись кумола 5,3110,68 3,1010,48 7,9610,51* 5,2710,58* 8,9610,39* 6,4210,45* 10,2110,42* 8,2410,61*

ГОТ нмоль/мин.мг 13,611,6 28,611,9** 34,513,1** 46,112,8**

ГР нмоль/мин.мг 1,4710,28 2,3710,26* 2,4610, 2,6010,25*

*р < 0,05; "р < 0,001 - уровень достоверно значимых различий по отношению к клеткам К562/5.

Повышение уровня TSH обеспечивает рост его реализации и как ловушки свободнорадикальных продуктов, и как субстрата для ГПО и TST. В свою очередь повышение активности ГР в ходе развития резистентности свидетельствует об усилении процесса восстановления TSH из его окисленной формы rSSr.

Оценка уровня экспрессии генов bcl-2 и Ьах в чувствительных и резистентных клетках позволила установить рост уровня мРНК для bcl-2 в K562/DOX3 клетках (рис. 11, А). Напротив, развитие резистентности к DOX приводит к резкому снижению уровня мРНК Ьах, уровень которой практически не детектировался в резистентных клетках. Использование Вестерн блоттинга позволило установить, что формирование резистентности сопровождается существенным ростом уровня белка Bcl-2 (рис. 11, Б). Bcl-2 и Вах - белки семейства Bcl-2, контролирующие развитие апоптоза, обладающие антиапоптотическим и проапоптотическим действием соответственно (Reed J.C., 1997). Установлено, что повышение экспрессии гена bcl-2 и, напротив, супрессия гена Ьах может вносить существенный вклад в формирование МЛР (Campos L. et al., 1993; McCurrach M.E., 1997).

Рис. 11. Экспрессия генов bcl-2 и Ьах в чувствительных (K562/S) и резистентных (К562/ЮОХз) клетках: А - уровень мРНК bcl-2 и Ьах, оцененные с помощью метода RT-PCR; Б - уровень белка Bcl-2, оцененный с помощью метода Вестерн блоттинга.

Полученные результаты интересны в связи с данными, свидетельствующими о способности Bcl-2 вызывать снижение генерации АФК и уровня перекисного окисления липидов (Kane D.J. et al., 1993; Hockenbery D.M. et al., 1993).

Оценка корреляционных связей в процессе развития резистентности к BOXв К562 клетках.

В анализе корреляционных связей между исследуемыми параметрами и степенью резистентности к DOX клеток К562 использована оценка коэффициентов корреляции Пирсона и Спирмена. Такой выбор сделан, исходя из небольшого числа наблюдений сравниваемых пар признаков и недостаточной информации о характере их распределения. Поэтому коэффициент линейной корреляции Пирсона, используемый для описания линейной связи количественных признаков, оценивался наряду с коэффициентом ранговой корреляции Спирмена, как непараметрическим методом, не требующим нормального типа распределения [Гланц С, 1999].

Установлено, что развитие резистентности клеток К562 к DOX характеризуется достоверной обратной сильной корреляцией с уровнем АФК (Н2О2, 02:) и достоверной прямой сильной корреляцией с активностью ферментов Сu,Zn-СОД, Mn-СОД, ЮТ, ГР, ГПО и содержанием ^ (таблица 4).

Таблица 4.

Редокс-зависимая корреляция в процессе формирования резистентности к доксорубицину в клетках К562.

1СМ

Коэффициент корреляции

по Пирсону по Спирмену

г Р г8 ■ Р

АФК (Н202) -0,93 р < 0,001 -0,90 р < 0,001

АФК(02:) -0,82 р < 0,001 -0,86 р < 0,001

Ксантин-оксидаза -0,90 р <0,001 -0,82 р< 0,001

НАДН-де-гидрогеназа -0,06 р = 0,86 -0,19 р = 0,95

НАД(Ф)Н-хиноноксидо-редуктаза 1 0,08 р = 0,80 0,19 р = 0,55

Си,гп-СОД 0,88 р <0,001 0,95 р< 0,001

Мп-СОД 0,96 р < 0,001 0,95 р < 0,001

Катал аза -0,25 р = 0,42 -0,28 р = 0,38

ГБН 0,77 р = 0,003 0,80 р = 0,002

ГР 0,82 р = 0,001 0,76 р < 0,05

ГПО 0,96 р < 0,001 0,96 р < 0,001

ГБТ 0,93 р <0,001 0,93 р < 0,001

Отсутствие достоверных корреляционных связей между НАДН-дегидрогеназой и НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазой 1 с одной стороны и степенью резистентности с другой может объясняться нелинейным характером изменения активностей этих ферментов в процессе формирования резистентности к DOX. Напротив, между собой изменение активностей НАДН-дегидрогеназы и НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 характеризуется возникновением достоверной прямой сильной корреляционной связи (г = 0,94, р < 0,001 ПО Пирсону; Гя = 0,88, р < 0,001 по Спирмену) (рис. 12), что может свидетельствовать в пользу развития в резистентных клетках согласованных компенсаторных механизмов, направленных на снижение продукции АФК и риска развития окислительного стресса, связанного с ростом концентраций DOX при формировании клеточной резистентности.

300

0-1-,-,---1---1-,

0 10 20 М 40 50 60 70

Активность НАЦН-дегидрогеназы, нмоль/минЛлг

Рис. 12. Корреляция активностей НАДН-дегидрогеназы и НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 в процессе развития резистентности клеток К562 К БОХ.

[~~] - корреляция по Пирсону; В - корреляция по Спирмену.

Вместе с тем высокий уровень корреляционной связи как ГSH

(г = - 0,69, р = 0,01 по Пирсону; = - 0,64, р = 0,03 по Спирмену), так ГБТ (г = - 0,65, р = 0,02 по Пирсону; г5 = - 0,63, р = 0,03 по Спирмену) и ГПО (г = - 0,63, р = 0,03 по Пирсону; г5 = - 0,55, р = 0,06 по Спирмену) с. уровнем

ТБК-активных продуктов (МДА) свидетельствует о развитии значительного вклада ГSH-зависимых процессов в блокирование активации перекисно-го окисления в процессе формирования резистентности.

Таким образом, с учетом выше изложенного можно сделать вывод о существенном вкладе свободнорадикальных процессов в формировании резистентности клеток К562 к DOX. Установленные связи свидетельствуют о снижении процессов, приводящих к образованию АФК, и о развитии

адаптивного антиоксидантного ответа в процессе формирования лекарственной резистентности.

ВЫВОДЫ.

1. Установлено, что развитие резистентности к доксорубицину клеток эритролейкемии человека К562 связано с изменением клеточного ре-докс-статуса и приводит к снижению внутриклеточного уровня АФК, характеризующееся обратной сильной корреляционной связью со степенью резистентное™.

2. Показано, что снижение образования АФК в резистентных клетках в значительной степени обусловлено снижением и скоординированным изменением соотношения активности флавопротеинов, играющих существенную роль в метаболической активации доксорубицина - ксантинок-сидазы, НАДН-дегидрогеназы, НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1.

3. Установлено, что развитие резистентности к доксорубицину в клетках К562 связано с супрессией свободнорадикальных процессов и снижением внутриклеточного уровня свободного и связанного негемового железа.

4. Показано, что дополнительным блоком, препятствующим образованию АФК в ходе формирования резистентности клеток К562, является рост активности антиоксидантных (Cu,Zn-COД, Mn-СОД) и ГSH-зависимых (ГПО, ЮТ, ГР) ферментов, а также внутриклеточного содержания ТОЙ

5. Снижение процессов перекисного окисления липидов характеризуется обратной сильной корреляционной связью с уровнем системы детокси-кации, определяемым ростом содержания ГSH и активности зависимых ферментов в процессе развития резистентности клеток К562.

6. Показано, что супрессия транскрипции гена bах и активация экспрессии гена Ьй-2 связаны с процессом формирования резистентности клеток К562 к доксорубицину.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Kalinina E., Novichkova M., Scherbak N.P., Solomka V., Saprin A.N. GSH-dependent redox regulation and antioxidant enzymes in the formation of resistance to doxorubicin in K562 human erythroleukemia cells // Adv. Exp. Med. Biol., 2001, vol. 500, p. 241-244.

2. Калинина Е.В., Саприн А.Н., Соломка B.C., Щербак Н.П., Чермных Н.С., Пирузян Л.А. Роль антиоксидантного статуса и редокс-зависимой регуляции в формировании резистентности клеток К562 эритролейкемии человека к доксорубицину // Тез. Национальной научно-практической конференции с международным участием "Свободные радикалы, анти-оксиданты и болезни человека", Смоленск, 2001, с. 277-278.

3. Соломка B.C., Калинина Е.В., Щербак Н.П., Чермных Н.С., Саприн А.Н. Роль антиоксидантного статуса клеток эритролейкемии человека К562 в процессе формирования резистентности к доксорубицину //Тезисы VI Международной конференции "Биоантиоксидант", Москва, 2002, с. 544545.

4. Kalinina E., Solomka V., Saprin A.N. Redox-dependent changes of cellular signaling during development of resistance of human erythroleukemia K562/DOX cells // Abstracts ofXIth Meeting of the Society for Free Radical Research International "Role of free radicals, oxidants and antioxidants, in molecular and cell biology and life processes. New development and techniques", Paris, France, Free Radic. Biol. Med., 2002, vol. 33, 67-69.

5. Kalinina E., Saprin A.N., Solomka V., Scherbak N.P. A rice of adaptive antioxidant response and changes of redox-dependent signaling during development of resistance of human erythroleukemia K562/DOX cells // Abstracts of International Symposium "Reactive oxygen and nitrogen species: diagnostic, preventive and therapeutic values", St. Petersburg, 2002, p. 153.

6. Калинина Е.В., Соломка B.C., Сереженков В.А., Саприн А.Н. Роль ре-докс-зависимых процессов в формировании лекарственной резистентности клеток эритролейкемии человека К562 // Материалы III симпозиума "Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей", Москва, Вопр. гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2002, т. 1, № 2, с. 99.

7. Калинина Е.В., Саприн А.Н., Соломка B.C., Щербак Н.П., Пирузян Л.А. Подавление образования перекиси водорода, кислородных и семихи-нонных радикалов в ходе формирования резистентности клеток К562 эритролейкемии человека к доксорубицину // Вопросы онкологии, 2003, т. 49, №3, с. 294-298.

8. Kalinina E.V., Solomka V.S., Chermnych N.S., Saprin A.N. Suppression of

production and regulation of ROS-dependent signaling in cancer cells during development of resistance to doxorubicin // Abstracts of Inter, conference "Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health", Smolensk, 2003, p. 98.

9. Соломка B.C., Калинина Е.В., Чермных Н.С., Сереженков ВА, Новиков К.Н., Саприн АН. Роль свободнорадикальных процессов в формировании резистентности клеток К562 эритролейкемии человека к доксоруби-цину // Тезисы Научно-практической конференции "Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины", Москва, 2003, с. 87.

10.Калинина Е.В., Соломка B.C., Чермных Н.С., Сереженков В.А., Новиков К.Н., Саприн АН., Пирузян ЛА Роль свободнорадикальных процессов в формировании резистентности опухолевых клеток к доксорубицину // Тезисы докладов III Съезда биофизиков России, Воронеж, 2004, с. 47.

11.Kalinina E., Solomka V., Saprin A.N., Serezhenkov VA, Terekhov S.M. Decrease of iron level as well as production of semiquinone free radicals, superoxide anion radicals and H2O2 in human erythroleukemia K562 cell upon development of resistance to doxorubicin // Abstracts of 38th Annual Meeting of the European Society for Clinical Investigation, Utrecht, Netherlands, Eur. J. Clin. Invest, 2004, vol. 34 (suppl. 1), p. 20-21.

12.Калинина Е.В., Соломка B.C., Сереженков В А, Саприн АН. Изменение соотношения ферментов редокс-активации доксорубицина, снижение генерации АФК и внутриклеточного уровня железа в процессе развития лекарственной резистентности клеток К562 эритролейкемии человека // Материалы IV симпозиума "Биологические основы терапии онкологических заболеваний", Москва, Вопр. гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2004, т. 3, № 4, с. 88.

Принято к исполнению 14/04/2005 Исполнено 15/04/2005

Заказ № 758 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat ru

^—V,

г V

Л Î-. к • t

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соломка, Виктория Сергеевна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Активные формы кислорода и их роль в биосистемах.

1.2. Антиоксидантная система.

1.2.1. Супероксиддисмутаза.

1.2.2. Каталаза.

1.2.3. Пероксидазы.

1.2.4. Низкомолекулярные антиоксиданты.

1.3. Активные формы кислорода и злокачественный рост.

1.4. Окислительный стресс и апоптоз.

1.5. Белки семейства Вс1-2.

1.6. Класс антрациклинов. Механизм прооксидантного действия в проявлении противоопухолевой активности.

1.6.1. Образование свободных радикалов.

1.6.2. Комплексы антрациклинов с металлами.

1.6.3. Образование свободных радикалов антрациклинов и их противоопухолевая активность.

1.7. Ферменты, участвующие в активации доксорубицина.

1.7.1. НАДН-дегидрогеназа.

1.7.2. НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктаза 1.

1.7.3. Ксантиноксидаза.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Культура клеток. Условия культивирования.

2.2. Схема разрушения клеток.

2.3. Оценка цитотоксичности.

2.4. Оценка уровня образования перекиси водорода (Н2О2).

2.5. Оценка уровня образования супероксид-анион-радикала (Ог*).

2.6. Измерение хемилюминесценции.

2.7. ЭПР-спектроскопия.

2.8. Определение активности Си,гп-супероксидцисмутазы.

2.9. Определение активности Мп-супероксиддисмутазы.

2.10. Определение активности каталазы.

2.11. Определение активности глутатионпероксидазы.

2.12. Определение активности глутатион-8-трансферазы.

2.13. Определение активности глутатионредуктазы.

2.14. Определение активности НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1.

2.15. Определение активности ксантиноксидазы.

2.16. Определение активности НАДН-дегидрогеназы.

2.17. Определение концентрации белка.

2.18. Определение содержания восстановленного глутатиона.

2.19. Определение содержания малонового диальдегида.

2.20. Оценка внутриклеточного уровня экспрессии Вс1с помощью метода Western blot.

2.21. Оценка уровня экспрессии генов bcl-2 и Ьах с помощью RT-PCR.

2.22. Методы статистического анализа.

Глава 3. Результаты исследования.

3.1. Изменение уровня АФК и активности АФК-продуцирующих ферментов в процессе развития лекарственной резистентности опухолевых клеток к доксорубицину.

3.2. Исследование свободных радикалов и парамагнитных центров негемового железа в чувствительных и резистентных к доксорубицину клетках К562.

3.2.1. Оценка уровня свободных радикалов.

3.2.2. Парамагнитные комплексы негемового железа.

3.3. Изменение активности антиоксидантных и ГБН-зависимых ферментов, уровня экспрессии генов bcl-2 и Ьах при формировании лекарственной устойчивости клеток К к доксорубицину.

3.4. Оценка корреляционных связей в процессе развития резистентности к DOX в клетках К562.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свободнорадикальные механизмы в развитии лекарственной резистентности опухолевых клеток"

Актуальность проблемы. Одним из наиболее значительных ограничений эффективности химиотерапии рака является развитие резистентности опухолевых клеток к одному или к целому ряду лекарственных препаратов с разным типом структуры и механизмом действия. Это явление получило название множественной лекарственной резистентности (MJIP) [69]. Различают врожденный и приобретенный типы MJIP, обладающие природно приобретенным и свойственным всей клеточной популяции, либо возникающим в результате длительной экспозиции, естественной селекции и адаптивных изменений к действию химиотерапевтического препарата характером резистентности [224, 126]. В настоящее время установлено существование нескольких различных механизмов, участвующих в формировании MJIP, включая повышенную экспрессию ряда трансмембранных транспортеров (Р-гп, MRP, LRP, BCRP), повышение уровня системы детоксикации, в значительной степени связанной с ростом экспрессии глутатион-Б-трансфераз, снижение экспрессии и активности топои-зомеразы II, изменение экспрессии генов, контролирующих апоптоз, что связано с отменой генетически программированной гибели клеток [4, 5, 12, 15, 17, 32, 33,36, 39, 94,106, 136, 140, 184, 237].

Вместе с тем, свободнорадикальные механизмы развития MJIP остаются малоизученными [113, 246, 280], хотя хорошо известно, что действие химиоте-рапевтических агентов, обладающих прооксидантным эффектом, как правило, связано с развитием резистентности в опухолевых клетках [127]. Особый интерес этот вопрос приобретает и в связи с тем, что согласно свободнорадикальной теории химического канцерогенеза образование свободнорадикальных интер-медиатов канцерогенов является фактором, как инициации, так и промоции злокачественной трансформации клеток, процессов инвазии и метастазирова-ния посредством влияния на активацию онкогенов и нестабильность генома [40, 146, 263, 309]. Кроме того, активные формы кислорода (АФК) оказывают влияние на уровень транскрипции целого ряда факторов, принимающих участие в процессе формирования MJIP, в том числе белков семейства Вс1-2, контролирующих развитие программируемой клеточной гибели [256, 257]. Поэтому исследование взаимосвязи формирования лекарственной резистентности, состояния клеточного редокс-статуса и уровня свободнорадикальных процессов, несомненно, имеет актуальное значение.

Задачи исследования:

- оценить уровень образования АФК и характер его изменения в процессе роста степени резистентности;

- исследовать изменение состояния ряда ключевых флавопротеинов, участвующих в метаболической активации доксорубицина, в процессе развития резистентности опухолевых клеток;

- оценить уровни свободных радикалов и негемового железа при формировании лекарственной резистентности;

- исследовать роль антиоксидантных и rSH-зависимых ферментов, изменение экспрессии генов bcl-2 и Ьах в процессе развития резистентности к доксорубицину;

- оценить характер редокс-зависимых корреляционных связей, образующихся при формировании резистентности.

Научная новизна работы. 1. Впервые установлено, что развитие резистентности клеток эритролейкемии человека К562 к противоопухолевому препарату доксорубицину, обладающему прооксидантным действием, связано с изменением клеточного редокс-статуса, что характеризуется высокой корреляционной связью роста степени резистентности со следующими факторами:

- уровнем снижения внутриклеточной продукции АФК (02\ Н202);

- ростом активности антиоксидантных (Си,2п-супероксиддисмутазы, Мп- су-пероксиддисмутазы) и глутатион-зависимых (глутатионпероксидазы, глута-тион-8-трансферазы, глутатионредуктазы) ферментов;

- ростом внутриклеточного содержания глутатиона;

- снижением АФК-продуцирующей активности ксантиноксидазы.

2. Впервые показано, что развитие резистентности к доксорубицину в клетках К562 сопровождается скоординированным изменением и последующим снижением активности НАДН-дегидрогеназы и НАД(Ф)Н-хиноноксидо-редуктазы 1, обладающих разным типом метаболической активации доксо-рубицина.

4. Впервые показано, что развитие резистентности клеток К562 к доксорубицину может происходить при одновременной активации транскрипции гена bcl-2 и росте внутриклеточного уровня белка Вс1-2 и, напротив, супрессии транскрипции гена Ьах.

Практическая значимость.

Полученные данные вносят существенный вклад в развитие представлений о редокс-зависимом типе механизма формирования лекарственной резистентности опухолевых клеток гемопоэтического ряда. Установленный характер изменения соотношения АФК-продуцирующих и катализирующих ферментных систем и ключевых транскрипционных факторов Вс1-2 семейства в ходе развития резистентности опухолевых клеток может быть рекомендован в качестве прогностического фактора для разработки определенных схем комбинированной терапии, позволяющей усиливать направленный цитотоксический противоопухолевый эффект путем оптимизации сочетания доз базового проок-сидантного противоопухолевого препарата со временем введения и типом препаратов, корректирующих состояние антиоксидантной и детоксицирующей систем.

Положения, выносимые на защиту:

2. Снижение и скоординированное изменение активности флавопротеинов (ксантиноксидазы, НАДН-дегидрогеназы, НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1), вносящих существенный вклад в метаболическую активацию доксоруби-цина, в значительной степени определяют супрессию образования АФК в процессе развития резистентности клеток К562.

4. Рост активности антиоксидантных (Cu,Zn- супероксиддисмутазы, Мп- су-пероксиддисмутазы) и rSH-зависимых (глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы, глутатионредуктазы) ферментов, а также внутриклеточного содержания TSH в процессе развития резистентности клеток К562 образует дополнительный блок, препятствующий образованию АФК.

5. Усиление процессов детоксикации, связанных с ростом содержания TSH и активностей rSH-зависимых ферментов, образует обратную сильную корреляционную связь со снижением процессов перекисного окисления в процессе развития резистентности клеток К562.

Москва, 2002); Международном симпозиуме "Reactive oxygen and nitrogen species: diagnostic, preventive and therapeutic values" (Санкт-Петербург, 2002); XIth Meeting of the Society for Free Radical Research International (Париж, Франция, 2002); III Симпозиуме "Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей" (Москва, 2002); Международной конференции "Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health" (Смоленск, 2003); Научно-практической конференции "Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины" (Москва, 2003); III Съезде биофизиков России tb

Воронеж, 2004); 38 Annual Meeting of the European Society for Clinical Investigation (Utrecht, the Netherlands, 2004); IV Симпозиуме "Биологические основы терапии онкологических заболеваний" (Москва, 2004).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 12 печатных работах.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 165 страницах, и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования, заключения, выводов и списка литературы, который включает 41 отечественных и 280 зарубежных источников. Диссертация содержит 26 рисунков и 6 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Соломка, Виктория Сергеевна

выводы.

1. Установлено, что развитие резистентности к доксорубицину клеток эритролейкемии человека К562 связано с изменением клеточного редокс-статуса и приводит к снижению внутриклеточного уровня АФК, характеризующееся обратной сильной корреляционной связью со степенью резистентности.

2. Показано, что снижение образования АФК в резистентных клетках в значительной степени обусловлено снижением и скоординированным изменением соотношения активности флавопротеинов, играющих существенную роль в метаболической активации доксорубицина - ксантиноксидазы, НАДН-дегидрогеназы, НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1.

4. Показано, что дополнительным блоком, препятствующим образованию АФК в ходе формирования резистентности клеток К562, является рост активности антиоксидантных (Cu,Zn-CO& Mn-СОД) и rSH-зависимых (ГПО, TST, ГР) ферментов, а также внутриклеточного содержания TSH.

5. Снижение процессов перекисного окисления липидов характеризуется обратной сильной корреляционной связью с уровнем системы детоксикации, определяемым ростом содержания TSH и активности rSH-зависимых ферментов в процессе развития резистентности клеток К562.

6. Показано, что супрессия транскрипции гена Ьах и активация экспрессии гена bcl-2 связаны с процессом формирования резистентности клеток К562 к доксорубицину.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Роль свободнорадикальных процессов в механизмах цитотоксического действия DOX считалась дискуссионной в течение целого ряда лет, однако, благодаря работам Doroshov J.H., Myers С.Е., в настоящее время считается бесспорным тот факт, что DOX связывается с ДНК, РНК, хроматином и клеточными мембранами, его противоопухолевое действие оказывается не только благодаря эффекту интеркаляции ДНК, ингибирующему действию на топоизомеразу II, обратную транскриптазу и РНК-полимеразу [93, 320], но и в результате образования свободнорадикальных продуктов и АФК, вызывающих разрывы нитей ДНК, деградацию дезоксирибозы и активацию перекисного окисления ли-пидов.

Образование АФК, играющих значительную роль в противоопухолевом действии DOX, осуществляется в результате редокс-цикла хинона в его структуре, при действии ряда флавопротеинов, НАДН-дегидрогеназы, ксантинокси-дазы, НАДФН-цитохром Р450-редуктазы, ферредоксинредуктазы, НАДН-цитохром Ь5 редуктазы [112]. Однако вклад свободнорадикальных процессов, вызываемых действием DOX, в формирование лекарственной резистентности, ограничивающей эффект противоопухолевой терапии, до сих пор оставался малоизученным. В этой связи исследования в данной области являются актуальными как в фундаментальном, так и в прикладном аспектах. В данной работе использованы клетки эритролейкемии человека К562. Кариотип клеток характеризуется наличием Филадельфийской хромосомы и ряда хромосомных аберраций. У клеток отсутствуют иммуноглобулины, они негативны в отношении герпес-подобных вирусов, малодифференцированы, образуют суспензию клеток и отличаются активным пролиферативным ростом без лаг-периода [15, 203]. Последний факт делает эту линию клеток привлекательной для работ с её клеточными культурами. Клетки К562 экспрессируют эмбриональный (с) и фе-тальный (у) глобины в небольшом количестве, при этом экспрессия гена (3глобина в неиндуцированных клетках отсутствует [90]. При стандартных условиях у клеток К562 практически отсутствует спонтанная дифференцировка, однако ряд соединений может вызывать эритроидную дифференцировку клеток К562. В этом случае деление клеток существенно замедляется и клетки начинают синтезировать гемоглобин.

В результате проведенного нами исследования установлено, что при развитии резистентности клеток К562 к DOX происходит существенное снижение продукции АФК, как 02\ так и Н2О2.

Характер снижения продукции АФК имеет вид прямой сильной корреляционной связи со степенью развития резистентности, клеток К562 к DOX что обусловлено изменением как каталитической активности флавопротеинов, участвующих в продукции АФК, и их соотношением с одной стороны, так и ростом уровня антиоксидантной системы - с другой.

Действительно, оценка изменения активностей НАДН-дегидрогеназы, ксантиноксидазы, катализирующих одноэлектронное восстановление, и НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1, осуществляющей двухэлектронное восстановление хинона в структуре DOX позволила установить нелинейный характер изменения НАДН-дегидрогеназы и НАД(Ф)Н-хинонооксидоредуктазы 1 и выраженный характер снижения активности ксантиноксидазы в процессе развития резистентности. При этом резистентные клетки К562/ООХз демонстрировали значительное снижение активности всех трех ферментов, тогда начало развития резистентности к DOX сопровождалось существенным расхождением в изменении их активности; значительное снижение активности ксантиноксидазы наблюдается при одновременном росте и затем резким снижением активностей НАДН-дегидрогеназы и НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1. Ксантиноксидаза обладает смешанным (одно- и двухэлектронным) типом восстановления хинона, на что влияют соотношение ксантина и НАДН в качестве субстратов, и тип акцептора электрона [232]. Установлено, что ксантиноксидаза может использовать в качестве акцептора электронов антрациклины, при этом процесс восстановления более эффективен в случае электронного донора - НАДН, чем при использовании ксантина. Напротив, в случае если акцептором электронов является кислород, то наиболее эффективным донором электронов является ксантин [243]. Восстановление антрациклинов ксантиноксидазой носит одноэлектрон-ный характер и приводит к образованию семихинонных свободных радикалов, что определяет существенный вклад ксантиноксидазы во внутриклеточную продукцию АФК, образующихся за счет редокс-цикла семихинона наряду с образованием 02г при катаболизме пуриновых оснований до мочевой кислоты. Наблюдаемое в процессе формирования резистентности к DOX снижение активности ксантиноксидазы, очевидно, следует рассматривать как значительный вклад в развитие клеточной устойчивости, что в большой степени связано со снижением риска развития окислительного стресса и является проявлением адаптационных процессов к цитотоксическому действию DOX.

Наряду с ксантиноксидазой одноэлектронное восстановление DOX, сопровождающееся образованием свободных радикалов, связанных с генерацией АФК (О21, Н202, "ОН) и с превращением в агликон в результате дегликозилиро-вания по С7-углероднму атому, катализирует митохондриальная НАДН-дегидрогеназа [107]. Вклад НАДН-дегидрогеназы в развитии окислительного стресса, вызываемого DOX, представляется значительным, так как DOX преимущественно аккумулируется в митохондриях, где его концентрация может на два порядка превышать концентрацию в культуральной среде [265], что может быть существенной причиной, вызывающей деполяризацию митохондриальной мембраны, падение трансмембранного потенциала с последующим развитием апоптоза под действием АФК [186]. В этой связи развитие супрессии НАДН-дегидрогеназы является значительным фактором в процессе формирования резистентности к DOX.

Полученные нами результаты подтверждаются данными Wong et al. [312], установили, что резистентность к DOX клеток чешуевидной саркомы человека А431 связана со снижением экспрессии субъединицы 3 НАДН-дегидрогеназы, что сопровождается подавлением образования АФК и развитием апоптоза при действии DOX.

Следует отметить, что изменение активности НАДН-дегидрогеназы в процессе повышения степени резистентности носит нелинейный характер: первоначальный рост сменяется значительным снижением активности фермента, что скоординированно с изменением активности НАД(Ф)Н-хиноноксидо-редуктазы 1. Разнонаправленность в изменении активности НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 при формировании резистентности к DOX установлена в ряде работ [48, 271]. Кроме того, показано, что при действии DOX наблюдается повышение активности НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 в клетках ЕМТ6 опухоли грудной железы мыши, в тоже время при действии на нормальные клетки костного мозга мыши такой эффект отсутствует, что демонстрирует способность DOX избирательно индуцировать НАД(Ф)Н-хиноноксидо-редуктазу 1 в опухолевых клетках [63]. Регуляция уровня экспрессии НАДФН-хиноноксидоредуктазы 1, связываемая также широким рядом соединений, в том числе полициклическими ароматическими углеводородами, азокрасителями, фенольными антиоксидантами, зависит от типа регуляции двух регуляторных участков в 5' фланкирующей области гена - соответственно ARE (EpRE) и XRE (AhRE), которые регулируются транскрипционными факторами, в том числе АР-1, Nrfl, Nrf2, Maf, Jun, Raf, а также МАР-киназами [259]. Противоопухолевый антибиотик митомицин С, метаболическая активация которого включает одно- и двухэлектронное восстановление и редокс-цикл с образованием сво-боднорадикальных продуктов и АФК, также вызывает индукцию НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 с участием транскрипционных факторов АР-1 и NF-кВ [314]. Отсутствие линейной взаимосвязи между активностью НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 и чувствительностью к хинонам у многих линей клеток [314] может объясняться своеобразием развития регуляторного ответа на цитотоксическое действие хинона, зависящее от силы и времени воздействия, и включаться в скоординированный эффект изменения экспрессии генов, определяющих уровень системы детоксикации и антиоксидантного ответа. Поэтому нелинейное изменение активности НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 в ходе развития резистентности к DOX, по-видимому, может быть проявлением подобного скоординированного механизма регуляции в развитии клеточной устойчивости. Следует отметить тот факт, что DOX является субстратом для НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 в цитозоле печени крыс [282], в то же время для очищенного из печени крыс Вастар фермента DOX не может служить субстратом [305]. Также двойственная оценка ферментативной активности НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 в отношении DOX является определенным препятствием в полной оценке вклада НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 в биологический эффект, оказываемый DOX. В любом случае следует, несомненно, отметить вклад НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 в развитие антиокси-дантного уровня защиты клетки в процессе формирования резистентности к DOX. При этом антиоксидантный эффект, который могла бы оказывать НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктаза 1 за счет снижения уровня DOX и его высо-кореакционноспособных интермедиатов, а также генерации в результате их ре-докс-цикла АФК, посредством способности дигидрохинонов образовывать неактивные глюкуронаты и конъюгаты с глутатионом, которые легко элиминируются из клеток, можно считать весьма условным, хотя такие метаболиты установлены для DOX [281, 289]. Более существенным следует, по-видимому, считать антиоксидантный эффект, который может оказываться НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазой 1 благодаря восстановлению эндогенных хинонов, в частности убихонона (коэнзима Q) в убихинол, что повышает защиту клеточных мембран от окислительного стресса [68], наряду с восстановлением а-токоферолхинона, образующегося вследствие пероксидации а-токоферола в а-токоферолгидрохинона [276]. Высокий уровень корреляции, установленный в данной работе между изменением уровня активностей НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 и НАДН-дегидрогеназы в процессе развития резистентности клеток К562 к DOX, может говорить в пользу скоординированного развития антиоксидантного эффекта НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 в ответ на высокий уровень генерации АФК, продуцируемый НАДФН-дегидрогеназой. В свою очередь, установленный факт снижения активности НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 в клетках MCF-7/DOX [169] как результат супрессии Ah рецептора, который контролирует экспрессию гена НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1, может быть определенной иллюстрацией возможного механизма и служить подтверждением полученных нами данных о существенном снижении активности этого фермента в ходе развития резистентности в клетках K562/DOX3, для которых характерно также значительное снижение других ферментов (ксантиноксидазы и НАДН-дегидрогеназы), участвующих в метаболической активации DOX. Резистентность клеток K562/DOX3 может рассматриваться как максимальная точка скоординированного изменения активности ферментов, связанных как с генерацией, так и катаболизмом АФК, что характеризуется минимальным эндогенным уровнем АФК и перекисного окисления липидов.

Известно, что DOX активирует перекисное окисление липидов мембран митохондрий, эндоплазматического ретикулума [172, 222]. При этом стоит отметить высокую корреляцию уровня МДА и активности НАДН-дегидрогеназы, что свидетельствует о значительном вкладе активности НАДН-дегидрогеназы в развитие перекисного окисления липидов. Поэтому следует еще раз подчеркнуть, что развитие супрессии активности этого фермента играет значимую роль в формировании резистентности клеток К562 к DOX. В активации перекисного окисления липидов при действии DOX значительную роль играют уровень образования семихинонных свободных радикалов, 02\ Н202, а также внутриклеточное содержание ионов Fe2+ и Си2+, где ионам Fe2+ отводится лидирующая роль.

В эритроидных клетка железо необходимо не только для синтеза гемоглобина, но и для осуществления целого ряда жизненно важных для клетки функций, включая перенос электронов и синтез ДНК. В частности, железо является кофактором для рибонуклеотидредуктазы, необходимой для синтеза ДНК [133]. В случае дефицита железа в клетке ингибируется как синтез ДНК, так и клеточное деление. Для раковых клеток характерно повышенное содержание железа, что связано с высоким уровнем пролиферации и характеризуется повышением уровня экспрессии TfR, служащего транспортом для железа в клетке [286]. Следует отметить, что для клеток эритролейкемии человека К562 характерен низкий уровень синтеза фетального и эмбрионального гемоглобина [123].

Действие DOX оказывает существенные изменения в гомеостазе железа в клетке, вызывая инактивацию IRP1 - железо-регуляторного белкя, сбалансировано контролирующего уровень синтеза TfR (Fe - транспортного белка) и ферритина (депо железа), посредством действия образующего при его метаболизме вторичного спирта доксорубицинола или АФК, образующихся в результате рецикла хинона в его структуре [78]. При этом действие доксорубицинола приводит к удалению иона железа из каталитического 4Fe - 4S кластера IRP1, супрес-сируя его активность как цитозольной аконитазы. В свою очередь АФК превращают такую форму IRP1, лишенную ферментативной активности, в «нуль» -форму белка, которая не способна ни связываться с мРНК трансферрина и ферритина, тем самым нарушая регуляцию трансляции соответствующих белков, ни приобретать вновь активность аконитазы [78]. Следует отметить, что при действии DOX наблюдается необратимая инактивация другого железо-регуляторного белка - IRP2, вызываемая в этом случае действием только АФК [78]. При этом, использование миметиков СОД или ГПО оказывают протекторное действие, защищая аконитазу от инактивации, вызываемой действием DOX [153].

Обнаруженное нами в резистентных к DOX клетках К562 снижение как

1 I свободного «лабильного» железа, так и связанного Fe (по всей видимости в виде комплексов с ферритином) при одновременном росте уровня антиокси-дантной ферментативной системы может расцениваться как скоординированное адаптивное изменение в ответ на деструктивное действие, вызываемое АФК и метаболитами (доксорубицинолом), генерируемыми DOX, и может рассматриваться как адаптивное снижение поступления железа в клетку, направленное, по-видимому, в свою очередь на снижение риска развития Fe2+-зависимых деструктивных процессов, инициируемых действием роста концентраций DOX в процессе формирования резистентности. Полученные данные согласуются с данными снижения практически в 2 раза уровня ферритина в K562/DOX клетках [212].

Снижение уровня сигнала ЭПР с g фактором 2,006 в резистентных клетках К562/ЭОХз по сравнению с чувствительными свидетельствует о снижении уровня семихинонных радикалов в результате развития резистентности к DOX, что, по-видимому, является следствием снижения активности определенных флавопротеинов, в частности, как нами установлено для этого уровня развития резистентности (IC50 = 3,7), ксантиноксидазы, а также возможно других флавопротеинов, которые не рассматривались в данной работе, но для которых установлен факт снижения активности при развитии резистентности к DOX, как например, НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы [220]. Факт снижения эндогенного уровня образования семихинонных радикалов наряду со снижением внутриклеточного уровня свободного железа и снижением активности ряда флавопротеинов, свидетельствует о развитии клеточной устойчивости к условиям перманентного окислительного стресса, вызываемыми нарастающими концентрациями DOX в процессе формирования и развития резистентности.

Как показано в ряде работ [89, 172, 268], действие DOX приводит к существенному снижению активности Си,2п-С0Д и Mn-СОД, каталазы, ГПО, ГР и содержания TSH, вызывая тем самым подавление антиоксидантной защиты клеток, что приводит к активации пероксидации белков, ДНК, липидов. В тоже время развитие резистентности к DOX, проходящее в условиях длительного окислительного стресса, сопровождается развитием адаптивного антиоксидант-ного ответа, что является не только следствием хронического окислительного стресса, но и условием развития клеточной резистентности, включает, как было установлено нами, существенный рост активности антиоксидантных ферментов.

Значительный рост активности CUjZn-СОД и Mn-СОД сопровождается существенным ростом активности ГПО, что создает благоприятные условия для сбалансированной утилизации образующихся 02: и Н202.

Следует отметить значительный вклад в катаболизм Н2О2 ГПО, уровень активности которой в ходе развития резистентности имеет более выраженный рост, в сравнении с активностью каталазы, обладающей более низкой специфичность по отношению к Н2О2, чем ГПО [19]. В свою очередь среди изоформ СОД особое внимание вызывает Мп-СОД вследствие высокого регуляторного действия АФК на уровень экспрессии её гена [306], а также ввиду локализации этого фермента в митохондриапьном матриксе, где наблюдается наиболее высокая концентрация DOX, при поступлении его в клетку [265]. Согласованность роста активностей Мп-СОД и ГПО создаёт условия, препятствующие опасности развития АФК-зависимого апоптоза, первоначальные этапы которого включают повышение проницаемости митохондриальной мембраны и выход цитохрома с в цитоплазму. Такой рост активностей антиоксидантных ферментов в резистентных клетках имеет существенное значение, так как для действия DOX характерно развитие Н2О2 - зависимого апоптоза [186]. Поэтому значительное повышение активностей Мп-СОД и ГПО может блокировать повышение продукции АФК, которое обусловлено ростом активности НАДН-дегидрогеназы, наблюдаемое в ходе развития резистентности в клетках K562/DOX( и K562/DOX2. В тоже время высокий уровень прямой корреляционной связи со степенью резистентности и обратной - с уровнем АФК подчеркивает значение вклада роста активностей Си^п-СОД, Мп-СОД и ГПО в развитие резистентности клеток К562 к DOX.

Аналогично, высокий уровень прямой корреляционной связи со степенью резистентности и обратной - с уровнем АФК характеризуется ростом активностей TST, ГР и содержанием TSH в процессе развития резистентности клеток К562, что указывает на наличие дополнительного вклада в развитие адаптивного антиоксидантного ответа.

Рост уровня TSH обеспечивает рост антиоксидантного статуса клеток и как «ловушка» свободных радикалов, и как субстрат для ГПО, а также для TST, изоформы которой обладают пероксидазной активностью [52, 283]. Рост активности TST дополняет активность ГПО, обладающей высокой специфичностью не только по отношению к Н2О2, но и к органическим гидроперекисям, в развитии блока действию окислительного стресса [79]. В свою очередь, изоформы TST избирательно активны по отношению к 4-гидроксинонаналям (|i класс), тогда как основные пропенали, в том числе гидроксипропенали ДНК, являются в основном субстратами для TSTP1-1 (п класс), являющейся доминантной изо-формой TST в клетках К562 [66, 292]. Следует отметить, что высокий уровень rST свидетельствует не только о существенном значении вклада фермента в формирование антиоксидантного ответа на длительную экспозицию клеток действию DOX, но в процессе детоксикации DOX, реактивные метаболиты которого возможно могут служить субстратами TST [205]. В пользу этого говорят данные об уменьшении процесса алкилирования ДНК в результате образования конъюгатов с TSH [281], которые выводятся с помощью трансмембранного насоса MRP, уровень которого сверхэкспрессируется при развитии резистентности к DOX [275].

Практически неизменный уровень перекисного окисления, оцениваемый по уровню ТБК-связанных продуктов, как уровень МДА в клетках K562/DOX| и K562/DOX2 по сравнению с чувствительными клетками, может объяснятся несбалансированным изменением активностей флавопротеинов, участвующих в метаболической активации DOX, с одной стороны, и существенным ростом активности антиоксидантных ферментов и rSH-зависимой системы, с другой стороны, что приводит к появлению кажущегося противоречия в наблюдаемом снижении уровня АФК при постоянном уровне МДА при данной степени (1С5о 1,9, 3,7) резистентности. Однако в случае одновременного снижения активностей всех исследуемых флавопротеинов (ксантиноксидазы, НАДН-дегидрогеназы, НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1) при росте антиоксидантной и детоксицирующей систем в клетках K562/DOX3 (IC50 4,7) наблюдается существенное снижение эндогенного уровня как АФК, так и МДА, что может служить иллюстрацией появления качественно нового уровня клеточной системы защиты в процессе формирования резистентности риску развития окислительного стресса, подготовленное предыдущими этапами изменения метабо-литного состояния клетки, связанного с регуляцией клеточного редокс-статуса.

Таким образом, с учетом всего выше изложенного можно сделать вывод о существенном вкладе свободнорадикальных процессов в формировании резистентности клеток К562 к DOX. Установленные связи свидетельствует о снижении процессов, приводящих к образованию АФК, и о развитии адаптивного антиоксидантного ответа в процессе формирования лекарственной резистентности.

Изменение уровня транскрипции генов bcl-2 и Ьах в ходе развития резистентности клеток клеток К562 к доксорубицину, как нами установлено, приводит к заметному росту уровня мРНК Bcl-2 и практически не детектируемому уровню мРНК Вах в клетках сублинии K562/DOX3 по сравнению с чувствительными клетками K562/S. При этом наблюдается существенное повышение внутриклеточного уровня белка Bcl-2. Такое изменение экспрессии гена транскрипции фактора bcl-2 может свидетельствовать в пользу повышения клеточной резистентности к риску развития апоптоза, что может быть в определенной степени связано с усилением уровня антиоксидантной защиты, так как Bcl-2 может вызывать снижение образования АФК и активации перекисного окисления липидов [158, 174]. Тот факт, что дефицитные по Bcl-2 мыши имеют ряд фенотипических изменений, связанных с хроническим окислительным стрессом, подтверждает роль Bcl-2 в регуляцию антиоксидантной защиты [302]. Локализация Bcl-2 на внешней поверхности внутриклеточных мембран (митохондрий, саркоплазматического ретикулума, ядра) [189], способность вызывать снижение уровня образования 02' и Н202 в митохондриях может в значительной степени объяснять антиапоптотический эффект Bcl-2, связанный с его влиянием на клеточный редокс-статус [188]. В тоже время взаимодействие цитоплаз-матического Вах, обладающего проапоптотической активностью, с мембранами митохондрий приводит к открытию мегаканала митохондрий, так называемой мегапоры или поры временной проницаемости (РТР, permeability transition роге), падению трансмембранного потенциала, увелечению трансмембранной проницаемости с последующим выходом цитохрома с из митохондрий, что связано с ранними событиями в развитии апоптоза [157, 209]. Напротив, антиапоп-тотический эффект Bcl-2 при нормальных физиологических значениях рН связан со способностью Bcl-2 полностью блокировать образование пор в митохондриях под действием Вах [55].

Сверхэкспрессия Bcl-2 во многих случаях может быть связана с лекарственной резистентностью и устойчивостью к действию ионизирующей радиации [218, 224, 269]. При этом развитие лекарственной резистентности может характеризоваться снижением экспрессии гена Ьах [217]. В этой связи полученные нами данные могут служить подтверждением того, что рост экспрессии гена bcl-2 и супрессия гена Ьах являются характеристикой развития лекарственной резистентности. Тот факт, что рост экспрессии гена bcl-2 происходит при одновременном значительном росте антиоксидантного статуса резистентных клеток, может в свою очередь служить подтверждением связи Bcl-2 и уровня антиокси-дантной защиты.

На основании полученных данных можно полагать, целесообразным использовать уровень корреляции 1С50 резистентности к DOX с уровнем активности ферментов, активирующих редокс-цикл DOX с образованием АФК, а также с уровнем активности антиоксидантных и rSH-зависимых ферментов в качестве оценки метаболитного профиля опухолевой клетки, характеризующего развитие лекарственной устойчивости к противоопухолевому агенту с проокси-дантным действием, а также в качестве базового подхода к созданию определенных рекомендаций с целью коррекции подбора лекарственных средств в комплексной противоопухолевой терапии, позволяющей улучшать эффективность химиотерапии путем оптимизации сочетания доз базового прооксидант-ного противоопухолевого препарата и временем его использования с другими препаратами, корректирующими состояние антиоксидантной и детоксицирую-щей систем с целью усиления цитотоксического противоопухолевого эффекта.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соломка, Виктория Сергеевна, Москва

1. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества.-Ленинград: Наука, 1985.

2. Ажипа Я.И. Медико-биологические аспекты применения метода электронного парамагнитного резонанса.-М: Наука, 1983.-528 с.

3. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов.-М.: Медицина, 1989.-368 с.

4. Богуш Т.А., Покатаев И.А., Тимофеева Н.В., Ожерельев А.С. Новый маркер мультилекарственной резистентности BCRP // Антибиот. хи-миотер.-2003.-Т. 48.-С. 33-41.

5. Бондарь Т.Н., Ланкин В.З., Антоновский В.Л. Восстановление органических гидроперекисей глутатионпероксидазой и глутатион-S-трансферазой: влияние структуры субстрата//Докл. АН СССР.-1989.-Т. 304.-№1.-С. 217-220.

6. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты // Успехи химии.- 1985.-Т. 54.- С. 1540-1558.

7. Виноградов А.Д., Гаврикова Э.В., Гривенникова В.Г. и др. Каталитические свойства митохондриальной НАДН: убихинон-оксидоредуктазы (комплекса I)//Биохимия.-1999.-Т. 64.-С. 174-193

8. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты // Вест. Росс. Акад. Мед. Наук.-1998.-№7.-С. 43-51.

9. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. и др. Свободные радикалы в живых клетках // Итоги науки и техники.- 1991 .-Т. 29.-250 с.

10. Владимиров Ю.А., Арчаков А.К. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах, -М.: Наука.-1972.-242.

11. Владимирская Е.Б., Кисляк Н.С., Румянцев Н.С. Причины и пути пре-одаления лекарственной резистентности при лейкозах и лимфомах у детей // Гематол. и трансфузиол.-1998.-Т. 43.-№ 6.-С.З-7.

12. Гланц С. Медико-биологическая статистика, "Практика", М.-1999.

13. Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. Митохондриальный комплекс I // Успехи биол. химии.-2003.-Т. 43.-С. 19-58

14. Дас Д.К., Молик Н. Превращение сигнала гибели в сигнал выживаемости при редокс-сигнализации // Биохимия.-2004.-Т. 69.-Вып. 1.-С. 16-24.

15. Доненко Ф.В., Ситдикова С.М., Мороз J1.B. Множественная лекарственная резистентность // Вопросы онкол.-1991.-Т. 37.-С. 780-788.

16. Захарова Н.В., Жарова Т.В. Кинетический механизм взаимодействия митохондриальной НАДН: убихинон-оксидоредуктазы с нуклеиновыми субстратами в трансгидрогеназной реакции // Биохимия.-2002.-Т. 67.-С. 1691-1701

17. Зенков Р.К., Ланкин В.З., Меныцикова У.Б. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты. -М.: МАИК Наука/Интерпериодика, 2001.-343 с.

18. Ингрэм В. Электронный парамагнитный резонанс в биологии.- М., Мир, 1972.- 296 с.

19. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных анти-оксидантов при окислительном стрессе // Успехи соврем, биологии.-1993.-Т. 113.-Вып. 4.-С. 456-470.

20. Колесниченко JI.C., Кулинский В.И. Глутатионтрансферазы // Успехи соврем. биол.-1989.-Т. 107,-Вып. 2.-С. 173-194.

21. Кулинский В.И, Колесниченко Л.С. Биологическая роль глутатиона // Успехи соврем. биол.-1990.-Т. 1 Ю.-Вып. 1.-С. 20-33.

22. Ларский Э.Г. Методы определения и метаболизма метабелковых комплексов // Итоги науки и техники. Сер. Биол. химия.-1990.-Т. 41.

23. Новиков B.C. (ред.) Программированная клеточная гибель. -СПб.: Наука, 1996.-276 с.

24. Пескин А.В. Взаимодействие активного кислорода с ДНК // Биохимия.-1997.-Т. 62.-Вып. 12.-С. 1571-1578.

25. Поберезкина Н.Б., Лосинская Л.Ф. Биологическая роль супероксиддис-мутазы // Укр. биохим. журн.-1989.-Т. 61.-№2.-С. 14-27.

26. Погорелов В.М., Козинец Г.И. // Гематология и трансфузиология.-1995.-Т. 40.-№ 50. С. 17-25.

27. Райлин Н.Т., Райхлин А.Н. Регуляция и проявление апоптоза в физиологических условиях и в опухолях // Вопр. онкол.-2002.-Т. 48.-№ 2.-С. 159-171.

28. Райхлин Н.Т., Смирнова Е.А., Перевощиков // Архив патологии.-1996.-№ 2.-С. 3-8.

29. Саприн А.Н., Калинина Е.В. Окислительный стресс и его роль в механизмах апоптоза и развития патологических процессов // Успехи биол. химии.-1999.-Т. 39.-С. 289-326.

30. Саприн А.Н., Калинина Е.В., Бабенко М.Д. Биохимические механизмы развития и регуляции мультилекарственной резистентности раковых клеток // Успехи биол. химии,-1996.-Т. 36.-С. 213-265.

31. Сергеев П.В., Семейкин А.В., Федотчева Т.А. и др. Стероидные гормоны как модуляторы состояния множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток // Вопросы биол. мед. фармацев. химии.-2002.-№3.-С. 10-17.

32. Скулачев В.П. Кислород и явление запрограммированной смерти.-М,-2000.-48 с.

33. Сладкова JT.B. Особенности апоптоза и его регуляции в различных опухолевых клетках человека: Дис.-М.-2002.-116с.

34. Ставровская А.А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток//Биохимия.-2000.-Т. 65.-С. 112-126.

35. Фильченков А.А. Современные представления о роли апоптоза в опухолевом росте и его значение для противоопухолевой терапии // Экспер. онкол.-1998.-Т. 20.-С. 259-270.

36. Храпова Н.Г. Кинетические характеристики токоферолов как регуляторов ПОЛ // Липиды: структура, биосинтез, превращение и функции.-М., 1997.-С. 157-170.

37. Штиль А.А. Развитие множественной лекарственной устойчивости как срочный ответ клетки на экзогенные воздействия // Биол. мембраны.-2003.-Т. 20.-С. 236-243.

38. Эмануэль Н.М. Физико-химия рака // Природа.-1982.-№ 1 .-С. 76-83.

39. Эмануэль Н.М., Ковецкий Р.Е„ Тарусов Б.Н., Сидорик Е.П. Биофизика рака.-Киев: Наук, думка., 1976,- 296 с.

40. Abdella B.R., Fisher J.A. chemical perspective on the anthracycline antitumor antibiotics // Environ Health Perspect.-1985.-VoI. 64.-P. 4-18.

41. Adams J.A., Cory S. The BcI-2 protein family: Arbiters of cell survival // Science.-1998.-Vol. 281.-P. 1322-1326.

42. Aebi H., Beutler E., Brewer G.J. et al. In: Biochemical methods in red cell genetics // Yunis J. J. Academic Press New York. 1969.- P. 255.

43. Afanas'ev I.B., Polozova N.I., Samokhvalov G.I. Investigation of the interaction of superoxide ion with adriamycin and the possible origin ofcardiotoxicity of the anthracycline anticancer antibiotics // Bioorg. Chem.-I980.-Vol. 9.-P. 434-439.

44. Akashi M., Hachiya M., Paquette R.L. et al. Irradiation increases manganese superoxide dismutase mRNA levels in human fibroblasts possible mechanisms for its accumulation // J. Biol. Chem.-1995.-Vol. 270.-P. 15864-15869.

45. Akman S.A., Forrest G., Chu F.F. et al. Antioxidant and xenobiotic-metabolizing enzyme gene expression in doxorubicin-resistant MCF-7 breast cancer cells // Cancer Res.-1990.-Vol. 50.-P. 1397-1402.

46. Amar M., Amit N., Huu T.P. et al. Production by К 562 cells of an inhibitor of adherence-related functions of human neutrophils // J Immunol.-1990.-Vol. 144.-P. 4749-4756.

47. Ames B.N., Shigenaga M.K., Hagen T.M. Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging // Proc Natl Acad Sci USA.-1993.-Vol. 90.-P. 7915-7922.

48. Anderson M.E. Glutathione: an overview of biosynthesis and modulation // Chem Biol Interact.-1998.-Vol. 111-112.-P. 1-14.

49. Anne A., Moiroux J. One electron and two-electron reductions of daunomicin//Nouv. J. Chim.-1985.-Vol. 9.-P. 83-889.

50. Anne A., Moiroux J. One-electron reduction of variously substituted an-thraquinones. Reactivity of the radical anions with oxygen in aprotic media // Nouv. J. Chim.-1984.-Vol. 8.-P. 259-266.

51. Antonsson В., Conti F., Ciavatta A. et al. Inhibition of Bax channel-forming activity by Bcl-2 // Science.-1997.-Vol. 277.-P. 370-372.

52. Bachur N.R., Cradock J.C. Daunomycin metabolism in rat tissue slices // J Pharmacol Exp Ther.-1970.-Vol. 175.-P. 331-337.

53. Bachur N.R., Gee M.V., Gordon S.L. Enzymatic activation of actinomycin D (ACTD) to free radical state // Proc. Amer. Assoc. Cancer Res.-1978.-Vol. 19.-P. 75.

54. Bachur N.R., Gordon S.L., Gee M.V. Anthracycline antibiotic augmentation of microsomal electron transport and free radical formation // Mol Pharmacol.- 1977.-Vol. 13.-P. 901-910.

55. Bachur N.R., Gordon S.L., Gee M.V., Коп H. NADPH cytochrome P-450 reductase activation of quinone anticancer agents to free radicals // Proc Natl Acad Sci U S A.-1979.-Vol. 76.-P. 954-957.

56. Bannister J.V., Thornalley P.J. The production of hydroxyl radicals by adri-amycin in red blood cells // FEBS Lett.-1983.-Vol. 157.-P. 170-172.

57. Barchielli G., Malatesta V., Penco S. et al. Influence of the chromophore on the anthracycline reductive deglycosidation catalyzed by rat liver microsomes // Proc. Amer. Assoc. Cancer Res.-1986.-Vol. 27.-P. 24.

58. Bates D.A. Evidence for the production of hydroxyl radicals from the adria-mycin semiquinone and H202 // FEBS Lett.-1982.-Vol. 136.-P. 89-94.

59. Begleiter A., Leith M.K. Induction of DT-diaphorase by doxorubicin and combination therapy with mitomycin С in vitro // Biochem Pharmacol. -1995.-Vol. 50.-P. 1281-1286.

60. Benov L., Sztejnberg L., Fridovich I. Critical evaluation of the use of hidro-ethidine as a measure of superoxide anion radical // Free Radic. Biol. Med.-1998.-Vol. 25.-P. 826-831.

61. Beraldo H., Garnier-Suillerot A., Tosi L., Lavelle F. Iron(III)-adriamycin and Iron(III)-daunorubicin complexes: physicochemical characteristics, interaction with DNA, and antitumor activity // Biochemistry.-1985.-Vol. 24.-P. 284-289.

62. Berlin V., Haseltine W.A. Reduction of adriamycin to a semiquinone-free radical by NADPH cytochrome P-450 reductase produces DNA cleavage in a reaction mediated by molecular oxygen // J Biol Chem.-1981.-Vol. 256.-P. 4747-4756.

63. Beyer R.E., Segura-Aguilar J., Di Bernardo S. et al. The role of DT-diaphorase in the maintenance of the reduced antioxidant form of coenzyme Q in membrane systems // Proc Natl Acad Sci U S A.-1996.-Vol. 93.-P. 2528-2532.

64. Biedler J.L., Riehm H. Cellular resistance to actinomycin D in Chinese hamster cells in vitro: cross-resistance, radioautographic, and cytogenetic studies // Cancer Res.-1970.-Vol. 30.-P. 1174-1184.

65. Bindokas V.P., Jordan J., Lee C.C., Miller R.J. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine // J Neurosci.-1996.-VoI. 16.-P. 1324-1336.

66. Bindoli A., Valente M., Cavallini L. Inhibition of lipid peroxidation by al-pha-tocopherolquinone and alpha-tocopherolhydroquinone // Biochem Int.-1985.-Vol. 10.-P. 753-761.

67. Bize I.B., Oberley L.W., Morris H.P. Superoxide dismutase and superoxide radical in Morris hepatomas // Cancer Res. 1980.-Vol. 40.-P. 3686-3693.

68. Bluhm A., Weinstein J., Sousa J. Free radicals in tobacco smoke // Nature.-1971.-Vol. 229.-P. 500-504.

69. Boise L.H., Gonzalez-Garcia M., Postema C.E. et al. bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death // Cell.-1993.-Vol. 74.-P. 597-608.

70. Boise L.H., Gottschalk A.R., Quintans J., Thompson C.B. Bcl-2 and Bcl-2-related proteins in apoptosis regulation // Curr Top Microbiol Immunol.-1995.-Vol. 200.-P. 107-121.

71. Borek С., Troll W. Modifiers of free radicals inhibit in vitro the oncogenic actions of x-rays, bleomycin, and the tumor promoter 12-0-tetradecanoylphorbol 13-acetate // Proc Natl Acad Sci U S A.-1983.-Vol. 80.-P. 1304-1307.

72. Borner C., Martinou I., Mattmann C. et al. The protein Bcl-2a does not require membrane attachment, but two conserved domains to suppress apop-tosis // J. Cell Biol.-1994.-Vol. 126.-P. 1059-1068.

73. Brazzolotto X., Andriollo M., Guiraud P. et al. Interactions between doxorubicin and the human iron regulatory system // Biochim Biophys Acta.-2003.-Vol. 1593.-P. 209-218.

74. Brigelius-Flohe R. Tissue-specific functions of individual glutathione peroxidases // Free Radic Biol Med.-1999.-Vol. 27.-P. 951-965.

75. Buttke T.M., Sandstrom P.A. Oxidative stress as a mediator of apoptpsis // Immunol. Today.-1994.-Vol. 15.-P. 7-10.

76. Cadenas E. Antioxidant and prooxidant functions of DT-diaphorase in quinone metabolism // Biochem Pharmacol.-1995.-Vol. 49.-P. 127-140.

77. Campos L., Rouault J.P., Sabido O. et al. High expression of bcl-2 protein in acute myeloid leukemia cells is associated with poor response to chemotherapy//Blood.-1993.-Vol. 81.-P. 3091-3096.

78. Carlberg I., Mannervik B. Purification and characterization of the flavoen-zyme glutathion reductase from rat liver // J. Biol. Chem.-1975.-Vol. 250.-P. 5475-5480.

79. Carmichael A.J., Mossoba M.M., Riesz P. Photogeneration of superoxide by adriamycin and daunomycin. An electron spin resonance and spin trapping study // FEBS Lett.-1983.-Vol. 164.-P. 401-405.

80. Cerutti P.A. Oxy-radicals and cancer // Lancet.-1994.-Vol. 344.-P. 862-863.

81. Cerutti P.A. Prooxidant states and tumor promotion // Science.-1985.-Vol. 227.-P. 375-381.

82. Chance В., Hollunger G. The interaction of energy and electron transfer reactions in mitochondria. III. Substrate requirements for pyridine nucleotide reduction in mitochondria//J Biol Chem.-1961.-Vol. 236.-P. 1555-1561

83. Chance В., Sies H., Boveris A. Hydroperoxide metabolism in mammalian organs // Physiol Rev.-1979.-Vol. 59.-P. 527-605

84. Chenais В., Andriollo M., Guiraud P. et al. Oxidative stress involvement in chemically induced differentiation of K562 cells // Free Radic Biol Med.-2000.-Vol. 28.-P. 18-27.

85. Cheng X.D., Hou C.H., Zhang X.J. et al. Effects of Huangqi (Hex) on inducing cell differentiation and cell death in K562 and HEL cells // Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai).-2004.-Vol. 36.-P. 211-217.

86. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal Biochem.-Vol. 1987.-162.-P. 156-159.

87. Chu F.-F., Doroshow J.H., Esworthy R.S. Expression, characterization, and tissue distribution of a new cellular selenium- dependent glutathione peroxidase, GSHPx-GI //J. Biol. Chem.-1993.-Vol. 268.-P. 2571-2576.

88. Chuang R.Y., Chuang L.F. Inhibition of chicken myeloblastosis RNA polymerase II activity by adriamycin // Biochemistry.-1979.-Vol. 18.-P. 20692073.

89. Cole S.P., Bhardwaj G., Gerlach J.H. et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line // Science.-1992.-Vol. 258.-P. 1650-1654.

90. Cui K., Lu A.Y., Yang C.S. Subunit functional studies of NAD(P)H:quinone oxidoreductase with a heterodimer approach // Proc Natl Acad Sci U S A.-1995.-Vol. 92.-P. 1043-1047.

91. Cunningham M.L., Lokesh B.R. Superoxide anion generated by potassium superoxide is cytotoxic and mutagenic to Chinese hamster ovary cells // Mu-tatRes.-1983.-Vol. 121.-P. 299-304.

92. Davies K.J., Doroshow J.H., Hochstein P. Mitochondrial NADH dehydro-genase-catalyzed oxygen radical production by adriamycin, and the relative inactivity of 5-iminodaunorubicin // FEBS Lett.-1983.-Vol. 153.-P. 227-230.

93. Davies K.J., Woolf N., Rowles P.M., Peper J. Morphology of the endothelium over atherosclerotic plaques in human coronary arteries // 1988.-Vol. 60.-P. 459-464.

94. Davies K.J.A. Intracellular proteolytic systems may function as secondary antioxidant defenses: a hypothesis // Free Radic. Biol. Med.-1986.-Vol. 2.-P. 115-173.

95. Davies K.J.A., Sevanian A., Muakkassah-Kelly S.F., Hochstein P. Uric acid-iron ion complexes: a new aspect of the antioxidant function of uric acid // Biochem. J.-1986.-Vol. 235.-P. 747-754.

96. Demant E.J. Transfer of ferritin-bound iron to adriamycin // FEBS Lett.-1984.-Vol. 176.-P. 97-100.

97. Demple В., Harrison L. Repair of oxidative damage to DNA: enzymology and biology// Annu Rev Biochem.-1994.-Vol. 63.-P. 915-948.

98. Desagher S., Osen-Sand A., Nichols A. et al. Bid-induced conformational charge of Bax is responsible for mitochondrial cytochrome с release during apoptosis//J. Cell Biol.-1999.-Vol. 144.-P. 891-901.

99. Dietrich M.F., Block J.B., Jawaid S. Characteristics and mechanisms of action of menadione (VK) inhibition of adriamycin (AD) mutagenicity (M) // Proc. Amer. Assoc. Cancer res.-1987.-Vol. 28.-P. 136.

100. DiMarco A., Gaetini M., Dorigotti L. et al. Studi sperimentali suirattivita" antineoplastica del neuovo antibiotico daunomycina // Tumori.-1963.-Vol. 49.-P. 203-217.

101. Dive C. Avoidance of apoptosis as a mechanism of drug resistance // J Intern Med Suppl.-1997.-Vol. 740.-P. 139-145.

102. Doroshow J.H. Anthracycline antibiotic-stimulated superoxide, hydrogen peroxide, and hydroxyl radical production by NADH dehydrogenase // Cancer Res.-1983.-Vol. 43.-P. 4543-4551.

103. Doroshow J.H. Effect of anthracycline antibiotics on oxygen radical formation in rat heart // Cancer Res.-1983.-Vol. 43.-P. 460-472.

104. Doroshow J.H. Oxygen radical-induced tumor cell killing by anticancer quinones: A common mechanism of cytotoxicity // Proc. Amer. Assoc. Cancer Res.-1985.-Vol. 26.-P. 225.

105. Doroshow J.H. Prevention of doxorubicin-induced killing of MCF-7 human breast cancer cells by oxygen radical scavengers and iron chelating agents // Biochem Biophys Res Commun.-1986.-Vol. 135.-P. 330-335.

106. Doroshow J.H. Role of hydrogen peroxide and hydroxyl radical formation in the killing of Ehrlich tumor cells by anticancer quinines // Proc Natl Acad Sci U S A.-1986.-Vol. 83.-P. 4514-4518.

107. Doroshow J.H., Akman S., Chu F.F., Esworthy S. Role of the glutathione-glutathione peroxidase cycle in the cytotoxicity of the anticancer quinines // Pharmacol Ther.-1990.-Vol. 47.-P. 359-370.

108. Dreher D., Junod A.F. Role of oxygen free radicals in cancer development // Eur J Cancer.-1996.-Vol. 32A.-P. 30-38.

109. Eaton J.W. Catalases and peroxidases and glutathione and hydrogen peroxide: Mysteries of the bestiary // J. Lab. Clin. Med.-1991.-Vol. 118.-P. 3-4.

110. Edlund A., Edlund Т., Hjalmarsson K. et al. A non- glucosylated extracellular superoxide dismutase variant // Biochem. J.-1992.-Vol. 288.-P. 451-456.

111. Eliot H., Gianni L., Myers C. Oxidative destruction of DNA by the adriamy-cin-iron complex // Biochemistry.-1984.-Vol. 23.-P. 928-936.

112. ErnsterL. DT-diaphorase//Methods Enzymol.-1967.-Vol. 10.-P. 309-317

113. Ernster L., Navazio F. Soluble diaphorase in animal tissues // Acta Chem. Scand.-1958.-VoI. 12.-P. 595-602

114. Fantine E.O., Garnier-Suillerot A. Interaction of 5-iminodaunorubicin with Fe(III) and with cardiolipin-containing vesicles // Biochim Biophys Acta.-1986.-Vol. 856.-P. 130-136.

115. Fearnley I.M., Walker J.E. Conservation of sequences of subunits of mitochondrial complex I and their relationships with other proteins // Biochim Biophys Acta.-1992.-Vol. 1140.-P. 105-134

116. Feig D.I., Reid T.M., Loeb L.A .Reactive oxygen species in tumorigenesis // Cancer Res.-1994.-Vol. 54.-P. 1890s-1894s.

117. Fenton H.J. Oxidation of tartaric acid in the presence of iron // J. Chem. Soc.-1894.-Vol. 65.-P. 899-910.

118. Fernandez-Pol J.A. Iron: possible cause of the G1 arrest induced in NRK cells by picolinic acid // Biochem Biophys Res Commun.-1977.-Vol. 78.-P. 136-143.

119. Flohe L., Gunzler W. Assays of glutathione peroxidase // Methods Enzymol.-1984.-Vol. 105.-P. 114-21.

120. Ford J.M., Hait W.N. Pharmacology of drugs that alter multidrug resistance in cancer // Pharmacol Rev.-1990.-Vol. 42.-P. 155-199

121. Free Radicals in Biology and Medicine // Eds. B. Halliwell, J.M. Gutteridge.-Oxford: Clarendon Press.-1989.-P. 150.

122. Fridovich I. Superoxide dismutases // Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol.-1974.-Vol.41.-P. 35-97

123. Fridovich I. Superoxide dismutases // J. Biol. Chem.-1989.-Vol. 264.-P. 7761-7764.

124. Fridovich I. Superoxide radical: an endogenous toxicant // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.-1983.-Vol. 23.-P. 239-257.

125. Fulda S., Scaffidi C., Pietsch T. et al. Activation of the CD95 (APO-l/Fas) pathway in drug- and gamma-irradiation-induced apoptosis of brain tumor cells // Cell Death Differ.-1998.-Vol. 5.-P. 884-893.

126. Furstenberger G., Sorg В., Marks F. Tumor promotion by phorbol esters in skin: evidence for a memory effect // Science.-1983.-Vol. 220.-P. 89-91.

127. Furukawa Т., Naitoh Y., Kohno H. et al. Iron deprivation decreases ribonucleotide reductase activity and DNA synthesis // Life Sci.-1992.-Vol. 50.-P. 2059-2065.

128. Galeotti Т., Borrello S., Masotti L. Oxy-radical source, scavenger systems and membrane damage in cancer cell // Oxygen radicals: Systemic Events and Disease Processes.-BasehKarger, 1990.-P. 129-148.

129. Galeotti Т., Masotti L., Borrello S., Casali E. Oxy-radical metabolism and control of tumour growth//Xenobiotica.-1991.-Vol. 21.-P. 1041-1051.

130. Glutathion S-transferases and drug resistance // Eds. Hayes J.D., Pickett C.B. Mantle T.J., Oxford: Taylor&Francis.-1990.-356 p.

131. Goormaghtigh E., Pollakis G., Ruysschaert J.M. Mitochondrial membrane modifications induced by adriamycin-mediated electron transport // Biochem Pharmacol.-1983.-Vol. 32.-P. 889-893

132. Gosalvez M. Carcinogenesis with the insecticide rotenone // Life Sci.-1983.-Vol. 32.-P. 809-816.

133. Gottesman M.M., Pastan I. Biochemistry of multidrug resistance mediated by the multidrug transporter // Annu Rev Biochem.-1993.-Vol. 62.-P. 385427.

134. Green D.R., Martin S.J. The killer and the executioner: how apoptosis controls malignancy // Current Opinion in Immunol.-1995.-Vol. 7.-P. 694-703.

135. Gutteridge J.M. Adriamycin-iron catalyzed phospolipid peroxidation: a reaction not involving reduced adriamycin or hydroxyl radicals // Biochem. Pharmacol.-1983.-Vol. 32.-P. 1949-1952.

136. Gutteridge J.M. Lipid peroxidation and possible hydroxyl radical formation stimulated by the self-reduction of a doxorubicin-iron (III) complex // Biochem Pharmacol.-1984.-Vol. 33.-P. 1725-1728.

137. Gutteridge J.M.C., Halliwell B. The measurement and mechanism of lipid peroxidation in biological systems // Trends Biochem. Sci.-1990.-Vol. 15.-P. 129-135.

138. Gutteridge J.M.C., Quinlan G.J. Antioxidant protection against organic and inorganic oxygen radicals by normal human plasma The important primary role for iron-binding and iron-oxidising proteins // Biochim. Biophys. Acta.-1992.-Vol. 1159.-P. 248-254.

139. На H.C., Thiagalingam A., Nelkin B.D., Casero R.A. Jr. Reactive oxygen species are critical for the growth and differentiation of medullary thyroid carcinoma cells // Clin Cancer Res.-2000.-Vol. 6.-P. 3783-3787.

140. Haber F., Weiss J.J. The catalytic decomposition of hydrogen peroxide by iron salts // Proc. R. Soc. Lond. Ser. A.-1934.-Vol. 147.-P. 332-351.

141. Habig W.H., Pabst M.J., Jakoby W.B. Glutathion-S-transferase. The first enzymatic step in mercapturic acid formation //J. Biol. Chem.-1974.-Vol. 249.-P. 7130-7139.

142. Haidle C.W., McKinney S.H. Adriamycin-mediated introduction of a limited number of single-strand breaks into supercoiled DNA // Cancer Biochem Biophys.-1986.-Vol. 8.-P. 327-335.

143. Hajos A.K., Winston G.W. Dinitropyrene nitroreductase activity of purified NAD(P)H-quinone oxidoreductase: role in rat liver cytosol and induction by Aroclor-1254 pretreatment // Carcinogenesis.-1991.-Vol. 12.-P. 697-702.

144. Hall A. //Leukemia.-1998.-Vol. 12.-P. 260.

145. Halliwell В. Free radicals, reactive oxygen species and human disease: a critical evaluation with special reference to atherosclerosis // Br. J. Exp. Pathol.-1989.-Vol. 70.-P. 737-757.

146. Halliwell В., Gutteridge J.M. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview // Methods Enzymol.-1990.-Vol. 186.-P. 1-85.

147. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Oxygen free radicals and iron in relation to biology and medicine: some problems and concepts // Arch. Biochem. Bio-phys.-1986.-Vol. 246.-P. 501-514.

148. Halliwell В., Vasil M., Grootveld M. The antioxidants of human extacellular fluids // Arch. Biochem. Biophys.-1990.-Vol. 280.-P. 1-8.

149. Harris E.D. Regulation of antioxidant enzymes // FASEB J.-1992.-Vol. 6.-P. 2675-2683.

150. Hennet Т., Bertoni G., Richter C., Peterhans E. Expression of BCL-2 protein enhances the survival of mouse fibrosarcoid cells in tumor necrosis factor-mediated cytotoxicity // Cancer Res.-1993.-Vol. 53.-P. 1456-1460.

151. Hockenbery D.M., Oltvai Z.N., Yin X.M. et al. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis // Cell.-1993.-Vol. 75.-P. 241-251.

152. Hommes F.A. The succinate-linked nicotinamide-adenine dinucleotide reduction in submitochondrial particles. I. kinetic studies of the reaction // Biochim Biophys Acta.-1963.-Vol. 77.-P. 173-182

153. Hornsby P.J., Crivello J.F. The role of lipid peroxidation and biological antioxidants in the function of the adrenal cortex. Part 2 // Mol Cell Endocrinol.-1983.-Vol. 30.-P. 123-147.

154. Houee-Levin C., Gardes-Albert Faraggi M., Klapper M. Pulse radiolysis study of daunorubicin redox cycles, reduction of eaq and COO" -free radicals //FEBS Lett.-1985.-Vol. 179.-46-50.

155. Houee-Levin C., Gardes-Albert M., Ferradini C. Reduction of daunorubicin aqueous solutions by COO* -free radicals. Reactions of reduced transients with H202 // FEBS Lett.-1984.-Vol. 173.-P. 27-30.

156. Hu Y., Benedict M.A., Wu D. et al. Bcl-xl interacts with Apaf-1 and inhibits Apaf-1-dependent caspase-9 activation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1998.-Vol. 95.-P. 4386-4391.

157. Huggins C. Experimental leukemia and mammary cancer.-University Chicago Press, Chicago.-1979.

158. Hunt J., Massey V. Purification and properties of milk xanthine dehydrogenase //J Biol Chem.-1992.-Vol. 267.-P. 21479-21485.

159. Hussain S.P., Aguilar F., Amstad P., Cerutti P. Oxy-radical induced mutagenesis of hotspot codons 248 and 249 of the human p53 gene // Oncogene.- 1994.-Vol. 9.-P. 2277-2281.

160. Hutchinson F. The distance that a radical formed by ionizing radiation can diffuse in a yeast cell // Radiation Res.-1957.-Vol. 7.-P. 473-483.

161. Inman R.S., Wessling-Resnick M. Characterization of transferrin-independent iron transport in K562 cells. Unique properties provide evidence for multiple pathways of iron uptake // J Biol Chem.-1993.-Vol. 268.-P. 8521-8528.

162. Ivy S.P., Tulpule A., Fairchild C.R. et al. Altered regulation of P-450IA1 expression in a multidrug-resistant MCF-7 human breast cancer cell line // J Biol Chem.-1988.-Vol. 263.-P. 19119-19125.

163. Jore D., Kaouadji M.N., Ferradini C. Vitamin E and correlated antioxidants: A y-radiolysis study // Antioxidants in Therapy and Preventive Medicine.-N.Y.: Plenum Press, 1990.-P. 151-154.

164. Julicher R.H., Sterrenberg L., Bast A. et al. The role of lipid peroxidation in acute doxorubicin-induced cardiotoxicity as studied in rat isolated heart // J Pharm Pharmacol.-1986.-Vol. 38.-P. 277-282.

165. Kalyanaraman В., Perez-Reyes E., Mason R.P. Spin-trapping and direct electron spin resonance investigations of the redox metabolism of quinone anticancer drugs // Biochim Biophys Acta.-1980.-Vol. 630.-P. 119-130.

166. Kane D.J., Sarafian T.A., Anton R. et al. Bcl-2 inhibition of neural death: decreased generation of reactive oxygen species // Science.-1993 .-Vol. 262.-P. 1274-1277.

167. Kaufmann S.H., Earnshaw W.C. Induction of apoptosis by cancer chemotherapy // Exp. Cell. Res.-2000.-Vol. 256.-P. 42-49.

168. Kearns P., Pieters R., Rottier M.M. Glutathione in childhood acute leukaemias // Adv Exp Med Biol.-1999.-Vol. 457.-P. 211-216.

169. Keller G.-A., Warner T.G., Steimer K.S., Hallewell R.A. Cu,Zn-superoxide dismutase is a peroxisomal enzyme in human fibroblasts and hepatoma cells //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1991.-Vol. 88.-P. 7381-7385.

170. Kennedy K.A., Siegfried J.M., Sartorelli A.C., Tritton T.R. Effects of an-thracyclines on oxygenated and hypoxic tumor cells // Cancer Res.-1983.-Vol. 43.-P. 54-59.

171. Kleyer D.L., Koch Т.Н. Mechanistic investigation of reduction of daunomy-cin and 7-deoxydaunomycinone with bi(3,5,5-trimethyl-2-oxomorpholin-3-yl //J. Amer. Chem. Soc.-1984.-Vol. 106.-P. 22380-2387.

172. Kobayashi Т., Saito N., Takemori N. et al. Ultrastructural localization of superoxide dismutase in human skin // Acta Derm. Venerol.-1993.-Vol. 73.-P. 41-45.

173. Kopnin B.P., Sokova O.I., Demidova N.S. Regularities of karyotypic evolution during stepwise amplification of genes determining drug resistance // Mutat Res.-1992.-Vol. 276.-P. 163-77.

174. Korsmeyer S.J., Shutter J.R., Veis D.J. et al. Bcl-2/Bax: a rheostat that regulates an antioxidant pathway and cell death // Semin. Cancer Biol.-1995.-Vol. 4.-№ 6.-P. 327-332.

175. Kotlyar A.B., Sled V.D., Burbaev D.S. et al. Coupling site I and the rote-none-sensitive ubisemiquinone in tightly coupled submitochondrial particles //FEBS Lett.-1990.-Vol. 264.-P. 17-20

176. Kowaltowski A.J., Fiskum G. Redox mechanisms of cytoprotection by Bcl-2 //Antioxid Redox Signal.-2005.-Vol. 7.-P. 508-514.

177. Krajewski S., Tanaka S., Takayama S. et al. Investigation of the subcellular distribution of the bcl-2 oncoprotein: residence in the nuclear envelope, endoplasmic reticulum, and outer mitochondrial membranes // Cancer Res.-1993.-Vol. 53.-P. 4701-4714.

178. Kroemer G., Petit P., Zamzani N. et al. The biochemistry of programmed cell death.//FASEB J.-1995.-Vol. 9.-№ 13.-P. 1277-1287.

179. Kuppusamy P., Zweier J.L. Characterization of free radical generation by xanthine oxidase. Evidence for hydroxyl radical generation // J Biol Chem.-1989.-Vol. 264.-P. 9880-9884.

180. Land E.J., Mukherjee Т., Swallow A.J., Bruce J.M. Possible intermediates in the action of adriamycin—a pulse radiolysis study // Br J Cancer.-1985.-Vol. 51.-P. 515-523.

181. LeBel C.P., Ischiropoulos H., Bondy S.C. Evaluation of the probe 2',7-dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress I I Chem Res Toxicol.-1992.- Vol. 5.-P. 227-231.

182. Leonard T.B., Dent J.G., Graichen M.E. Comparison of hepatic carcinogen initiation-promotion systems // Carcinogenesis.-1982.-Vol. 3.-P. 851-6.

183. Lesko S.A., Lorentzen R.J., Ts'o P.O. Role of superoxide in deoxyribonucleic acid strand scission // Biochemistry.-I980.-Vol. 19.-P. 3023-3028.

184. Levin M., Silber R., Israel M. et al. Protein-associated DNA breaks and DNA-protein cross-links caused by DNA nonbinding derivatives of adriamycin in L1210 cells // Cancer Res.-1981 .-Vol. 41 .-P. 1006-10.

185. Lind C. Formation of benzoa.pyrene-3,6-quinol mono- and diglucuronides in rat liver microsomes // Arch Biochem Biophys.-1985.-Vol. 240.-P. 226235.

186. Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA // Nature.-1993.-Vol. 362.-P. 709-715.

187. Lown J.W., Chen H.H. Electron paramagnetic resonance characterization and conformation of daunomycin semiquinone intermediate implicated in antracycline metabolism, cardiotoxicity and anticancer action // Cancer J. Chem.-1981.-Vol. 59.-P. 3212-3218.

188. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J Biol Chem.-1951.-Vol. 193.-P. 265-275.

189. Lozzio C.B., Lozzio B.B. Human chronic myelogenous leukemia cell-line with positive Philadelphia chromosome // Blood.-1975.-Vol. 45.-P. 321-334.

190. Ludwig C.U., Peng Y.M., Beaudry J.N., Salmon S.E. Cytotoxicity of mitomycin С on clonogenic human carcinoma cells is not enhanced by hipoxia // Cancer Chemother. Pharmacol.-1984.-Vol. 12.-P. 146-150.

191. Lutzky J., Astor M.B., Taub R.N. et al. Role of glutathione and dependent enzymes in anthracycline-resistant HL60/AR cells // Cancer Res.-1989.-Vol. 49.-P. 4120-4125.

192. Mahler H.R. DPNH cytochrome с reductase (animal) // Methods Enzymol.-1955.-Vol. 2.-P. 688-693.

193. Malatesta V., Penco S., Sacchi N. et al. Electrochemical deglycosidation of anthracyclines: stereoelectronic requirements // Can. J. Chem.-1984.-Vol. 62.-P. 2845-2850.

194. Maples K.R., Mason R.P. Free radical metabolite of uric acid // J Biol Chem.-198.-Vol. 263.-P. 1709-1712.

195. Marchetti P., Castedo M., Susin S.A. et al. Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis // J Exp Med.-1996.-Vol. 184.-P. 1155-1160.

196. Marklund S.L. Expression of extacellular superoxide dismutase by human cell lines // Biochem. J.-1990.-Vol. 266.-P. 213-219.

197. Marklund S.L. Extacellular superoxide dismutase in human tissues and human cell lines // J. Clin. Invest.-1984.-Vol. 74.-P. 1398-1403.

198. Martins E.A., Robalinho R.L., Meneghini R. Oxidative stress induces activation of a cytosolic protein responsible for control of iron uptake // Arch Biochem Biophys.-1995.-Vol. 316.-P. 128-134.

199. Mason R.P. Free radical metabolites of foreign compounds and their toxico-logical significance. In: Hodgson E., Bend J.R., Philpot R.M., eds. Reviews in biochemical toxicology (Part 1).-Amsterdam: Elsevier/North Holland, 1979.-P. 151-200.

200. Mattern M.R., Hariharan P.V., Cerutti P.A. Selective excision of gamma ray damaged thymine from the DNA of cultured mammalian cells // Biochim Biophys Acta.-1975.-Vol. 395.-P. 48-55.

201. May P.M., Williams G.K., Williams D.R. Solution chemistry studies of adriamycin-iron complexes present in vivo // Eur J Cancer.-I980.-Vol. 16.-P. 1275-1276.

202. McCord J.M., Fridovich I. Superoxide Dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein) // J. Bid. Chem.-1969.-Vol. 244.-P. 60496055.

203. McCurrach M.E., Connor T.M., Knudson C.M. et al. bax-defkiency promotes drug resistance and oncogenic transformation by attenuating p53-dependent apoptosis // Proc Natl Acad Sci U S A.-1997.-Vol. 94.-P. 23452349.

204. Mese H., Sasaki A., Alcalde R.E. et al. Regulation of apoptosis reduction in the cisplatin-resistant A431 cell line by Bcl-2 and CPP32 // Chemotherapy.-2000.-Vol. 46.-P. 69-76.

205. Michiels C., Remacle J. Use of the inhibition of enzymatic antioxidant systems in order to evaluate their physiological importance // Eur. J. Biochem.-1988.-Vol. 177.-P. 435-441.

206. Mimnaugh E.G., Dusre L., Atwell J., Myers C.E. Differential oxygen radical susceptibility of adriamycin-sensitive and -resistant MCF-7 human breast tumor cells//Cancer Res.-1989.-Vol. 49.-P. 8-15.

207. Mimnaugh E.G., Kennedy K.A., Trush M.A., Sinha B.K. Adriamycin-enhanced membrane lipid peroxidation in isolated rat nuclei // Cancer Res.-1985.-Vol.45.-P. 3296-3304.

208. Mimnaugh E.G., Trush M.A., Bhatnagar M., Gram Т.Е. Enhancement of reactive oxygen-dependent mitochondrial membrane lipid peroxidation by the anticancer drug adriamycin // Biochem Pharmacol.-1985.-Vol. 34.-P. 847856.

209. Misra H.P., Squatrito P.M. The role of superoxide anion in peroxidase-catalyzed chemiluminescence of luminol // Arch Biochem Biophys.-1982.-Vol.215.-P. 59-65.

210. Miyashita Т., Reed J.C. Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy-induced apoptosis in a human leukemia cell line // Blood.-1993.-Vol. 81.-P. 151-157.

211. Moriwaki Y., Yamamoto Т., Suda M. Purification and immunohistochemical tissue localization of human xanthine oxidase // Biochim Biophys Acta.-1993.-Vol. 1164.-P. 327-30.

212. Morris D.I., Speicher L.A., Ruoho A.E. et al. Interaction of forskolin with the P-glycoprotein multidrug transporter // Biochemistry.-1991.-Vol. 30.-P. 8371-8379.

213. Mosmann T. Rapid colormetic assay for cellular growth and survival: application h-proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Methods.-1983.-Vol. 65.-P. 55-63.

214. Muindi J., Sinha B.K., Gianni L., Myers C. Thiol-dependent DNA damage produced by anthracycline-iron complexes. The structure-activity relationships and molecular mechanisms // Mol Pharmacol.-1985.-Vol. 27.-P. 356365.

215. Muindi J.R., Sinha B.K., Gianni L., Myers C.E. Hydroxyl radical production and DNA damage induced by anthracycline-iron complex // FEBS Lett.-1984.-Vol. 172.-P. 226-230.

216. Munday R., Smith B.L., Munday C.M. Effect of inducers of DT-diaphorase on the toxicity of 2-methyl- and 2-hydroxy-l,4-naphthoquinone to rats // Chem Biol Interact.-1999.-Vol. 123.-P. 219-237.

217. Myers C.E., Muindi J.R., Zweier J., Sinha B.K. 5-Iminodaunomycin. An anthracycline with unique properties // J Biol Chem.-1987.-Vol. 262.-P. 11571-11577.

218. Nakamura M., Yamazaki I. One-electron transfer reactions in biochemical systems. VII. Two types of electron outlets in milk xanthine oxidase // Bio-chim Biophys Acta.-1973.-Vol. 327.-P. 247-256.

219. Nakamura Y., Gindhart T.D., Winterstein D. et al. Early superoxide dismu-tase-sensitive event promotes neoplastic transformation in mouse epidermal JB6 cells // Carcinogenesis.-1988.-Vol. 9.-P. 203-207.

220. Nakazawa H., Andrews P.A., Callery P.S., Bachur N.R. .Superoxide radical reactions with anthracycline antibiotics // Biochem Pharmacol.-1985.-Vol. 34.-P. 481-490.

221. O'Brien M., Kruh G.D., Tew K.D. The influence of coordinate overexpres-sion of glutathione phase II detoxification gene products on drug resistance // J Pharmacol Exp Ther.-2000.-Vol. 294.-P. 480-487.

222. Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction // Anal Biochem.-1979.-Vol. 95.-P. 351-358.

223. Oki Т., Matsuzawa Y., Yoshimoto A. et al. New antitumor antibiotics aclacinomycins A and В //J Antibiot (Tokyo).-1975.-Vol. 28.-P. 830-834.

224. Oltvai Z.N., Milliman C.L., Korsmeyer S.J. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death // Cell.-1993.-Vol. 74.-P. 609-619.

225. Pacella В., Meredith M., Meyrick В. et al. Extracellular oxidant stress converts xanthine dehydrogenase (XD) to xanthine oxidase (OX) in cultured bovine pulmonary artery endothelial cell (BPAEC) // Amer. Rev. Respir. Dis.-1988.-Vol. 137.-P. 84.

226. Paglia D.E., Valentine W.N. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase // J. Lab. Clin. Med.-1967.-Vol. 70-P. 158-169.

227. Pan S.S., Bachur N.R. Xanthine oxidase catalyzed reductive cleavage of anthracycline antibiotics and free radical formation // Mol Pharmacol.-1980.-Vol. 17.-P. 95-99.

228. Pastan I., Gottesman M. Multiple-drug resistance in human cancer // N Engl J Med.-1987.-Vol. 316.-P. 1388-1393.

229. Paur E., Youngman R.J., Lengfelder E., Elstner E.F. Mechanisms of adria-mycin-dependent oxygen activation catalyzed by NADPH-cytochrome с -(ferredoxin)-oxidoreductase // Z. Naturforsch.-1984.-Vol. 39c.-P. 261-267.

230. Pelicano H., Feng L., Zhou Y. et al. Inhibition of mitochondrial respiration: a novel strategy to enhance drug-induced apoptosis in human leukemia cells by a reactive oxygen species-mediated mechanism // J Biol Chem.-2003.-Vol. 278.-P. 37832-37839.

231. Peters J.H., Gordon G.R., Kashiwase D. et al. Redox activities of antitumor anthracyclines determined by microsomal oxygen consumption and assays for superoxide anion and hydroxyl radical generation // Biochem Pharmacol.-1986.-Vol. 35.-P. 1309-1323.

232. Pietronigro D.D., McGinness J.E., Koren M.J. et al. Spontaneous generation of adriamycin semiquinone radicals at physiologic pH // Physiol Chem Phys.-1979.-Vol. 11 .-P. 405-414.

233. Pitot H.C., Sirica A.E. The stages of initiation and promotion in hepatocar-cinogenesis // Biochim Biophys Acta.-1980.-Vol. 605.-P. 191-215.

234. Plunkett W. Apoptosis.-Oxford: CBC, 1995.-35p.

235. Pollakis G., Goormaghtigh E., Delmelle M. et al. Adriamycin and derivatives interaction with the mitochondrial membrane: 02 consumption and free radicals formation // Res Commun Chem Pathol Pharmacol.-1984.-Vol. 44.-P. 445-459.

236. Powis G. Free radical formation by antitumor quinones // Free Radic. Biol. Med.-1989.-Vol. 6.-P. 63-101

237. Pritsos C.A. Cellular distribution, metabolism and regulation of the xanthine oxidoreductase enzyme system // Chem Biol Interact.-2000.-Vol. 129.-P. 195-208.

238. Raes M., Michiels C., Remacle J. Comparative study of the enzymatic defense systems against oxygen- derived free radicals: the key role of glutathione peroxidase // Free Radic. Biol. Med.-1987.-Vol. 3.-P. 3-7.

239. Reddy J.K., Warren J.R., Reddy M.K., Lalwani N.D. Hepatic and renal effects of peroxisome proliferators: biological implications // Ann N Y Acad Sci.-1982.-Vol. 386.-P. 81-110.

240. Reed J.C. Bcl-2 family proteins: regulators of apoptosis and chemoresistance in hematologic malignancies // Semin Hematol.-1997.-Vol. 34.-P. 9-19.

241. Reed J.C. Bcl-2: prevention of apoptosis as a mechanism of drug resistance // Hematol Oncol Clin North Am.-1995.-Vol. 9.-P. 451-473.

242. Remacle J., Lambert D., Raes M. et al. Importance of various antioxidant enzymes for cell stability. Confrontation between theoretical and experimental date // Biochem. J.-1992.-Vol. 286.-P. 41-46.

243. Ross D., Kepa J.K., Winski S.L. et al. NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQOl): chemoprotection, bioactivation, gene regulation and genetic polymorphisms//Chem Biol Interact.-2000.-Vol. 129.-P. 77-97.

244. Rowley D.A., Halliwell B. DNA damage by superoxide-generating systems in relation to the mechanism of action of the anti-tumour antibiotic adriamy-cin // Biochim Biophys Acta.-1983.-Vol. 761.-P. 86-93.

245. Salim A.S. The permissive role of oxygen-derived free radicals in the development of colonic cancer in the rat. A new theory for carcinogenesis // Int J Cancer.-1993.-Vol. 53.-P. 1031-1035.

246. Salin M.L. Preparation of iron-containing superoxide dismutases from eu-karyotic organisms // Handbook of Methods for Oxygen Radical Research.-Boca Raton: CRC Press, 1986.-P. 9-13.

247. Sarvazyan N. Visualization of doxorubicin-induced oxidative stress in isolated cardiac myocytes // Am J Physiol.-1996.-Vol. 271.-P. H2079-H2085.

248. Sato S., Iwaizumi M., Handa K., Tamura Y. Electron spin resonance study on the mode of generation of free radicals of daunomycin, adriamycin, and carboquone in NAD(P)H-microsome system // Gann.-1977.-Vol. 68.-P. 603608.

249. Sattler M., Liang H., Nettesheim D. et al. Structure of Bcl-xL-Bak peptide complex: recognition between regulators of apoptosis // Science.-1997.-Vol. 275.-P. 983-986.

250. Sazuka Y., Tanizawa H., Takino Y. Effect of adriamycin on the activities of superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase in tissues of mice //Jpn J Cancer Res.-1989.-Vol. 80.-P. 89-94.

251. Scherr D.S., Vaughan E.D., Wei J. et al. BCL-2 and p53 expression in clinically localized prostate cancer predicts response to external beam radiotherapy // J Urol.-1999.-Vol. 162.-P. 12-16.

252. Scheulen M.E., Kappus H., Nienhaus A., Schmidt C.G. Covalent protein binding of reactive adriamycin metabolites in rat liver and rat heart microsomes //J Cancer Res Clin Oncol.-1982.-Vol. 103 .-P. 39-48.

253. Schisselbauer J.C., Crescimanno M., D'Alessandro N. et al. Glutathione, glutathione S-transferases, and related redox enzymes in Adriamycin-resistant cell lines with a multidrug resistant phenotype // Cancer Commun.-1989.-Vol. l.-P. 133-139.

254. Schwartz H.S., Paul B. Biotransformations of daunorubicin aglycones by rat liver microsomes // Cancer Res.-1984.-Vol. 44.-P. 2480-2484.

255. Sharov V.S., Kazamanov V.A., Vladimirov Y.A. Selective sensitization of chemiluminescence resulted from lipid and oxygen radical reactions // Free Radic Biol Med.-1989.-Vol. 7.-P. 237-242.

256. Shen H., Paul S., Breuninger L.M. et al. Cellular and in vitro transport of glutathione conjugates by MRP // Biochemistry.-1996.-Vol. 35.-P. 57195725.

257. Sies H. ed. // Oxidative Stress: Oxidant and Antioxidants. N.Y.: Academic Press.-1991.

258. Singh S.V., Brunnert S.R., Roberts В., Krishan A. Differential expression of glutathione S-transferase, glutathione peroxidase and glutathione reductase in normal and malignant human breast tissues // Cancer Lett.-1990.-Vol. 5l.-P. 43-48.

259. Sinha В.К. Binding specificity of chemically and enzymatically activated an-thracycline anticancer agents to nucleic acids // Chem Biol Interact.-1980.-Vol. 30.-P. 67-77.

260. Sinha B.K., Batist G., Cowan K.H., Myers C.E. Role of adriamycin-induced hydroxyl radical formation in tumor cell // Proc. Amer. Assoc. Cancer Res.-1987.-Vol. 28.-P. 268.

261. Sinha B.K., Gregory J.L. Role of one-electron and two-electron reduction products of adriamycin and daunomycin in deoxyribonucleic acid binding // Biochem Pharmacol.-1981.-Vol. 30.-P. 2626-2629.

262. Sinha B.K., Muindi J.R., Batist G., Myers C.E. Hydroxyl radicals formation and DNA damage by anthracycline antitumor drugs // Proc. Amer. Assoc. Cancer Res.-1985.-Vol. 26.-P. 225.

263. Strange R.C., Fryer A.A. The glutathione S-transferases: influence of polymorphism on cancer susceptibility // IARC Sci Publ.-1999 -148.-P. 231-249.

264. Sugioka K., Nakano H., Noguchi T. et al. Decomposition of unsaturated phospholipid by iron-ADP-adriamycin co-ordination complex // Biochem Biophys Res Commun.-1981.-Vol. 100.-P. 1251-1258.

265. Sugioka K., Nakano M. Mechanism of phospholipid peroxidation induced by ferric ion-ADP-adriamycin-co-ordination complex // Biochim Biophys Acta.-1982.-Vol. 713.-P. 333-343.

266. Sutherland R., Delia D., Schneider C. et al. Ubiquitous cell-surface glycoprotein on tumor cells is proliferation-associated receptor for transferrin // Proc Natl Acad Sci U S A.-1981.-Vol. 78.-P. 4515-4519.

267. Svingen B.A., Powis G. Pulse radiolysis studies of antitumor quinones: radical lifetimes, reactivity with oxygen, and one-electron reduction potentials // Arch Biochem Biophys.-1981.-Vol. 209.-P. 119-126.

268. Takahashi K., Avissar N., Whitin J., Cohen H. Purification and characterization of human plasma glutathione peroxidase: selenoprotein distinct from thedistinct from the known cellular enzyme // Arch. Biochem. Biophys.-1987.-Vol. 256.-P. 677-686.

269. Takanashi S., Bachur N.R. Adriamycin metabolism in man. Evidence from urinary metabolites // Drug Metab Dispos.-1976.-Vol. 4.-P. 79-87.

270. Taylor E.R., Hurrell F., Shannon R.J. Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation // J Biol Chem.-2003.-Vol. 278.-P. 19603-19610

271. Tew K.D., Monks A., Barone L. et al. Glutathione-associated enzymes in the human cell lines of the National Cancer Institute Drug Screening Program // Mol Pharmacol.-1996.-Vol. 50.-P. 149-159.

272. Thomas C.E., Aust S.D. Rat liver microsomal NADPH-dependent release of iron from ferritin and lipid peroxidation // Free Radic. Biol. Med.-1985.-Vol. l.-P. 293-300.

273. Thomas C.E., Aust S.D. Release of iron from ferritin by cardiotoxic anthracycline antibiotics // Arch Biochem Biophys.-1986.-Vol. 248.-P. 684-689.

274. Thomas D.J., Sadler A., Subrahmanyam V.V. et al. Bone marrow stromal cell bioactivation and detoxification of the benzene metabolite hydroquinone: comparison of macrophages and fibroblastoid cells // Mol Pharmacol.-1990.-Vol. 37.-P. 255-262.

275. Thor H., Smith M.T., Hartzell P. et al. The metabolism of menadione (2-methyl-l,4-naphthoquinone) by isolated hepatocytes. A study of the implications of oxidative stress in intact cells // J Biol Chem.-1982.-Vol. 257.-P. 12419-12425.

276. Thornalley P.J., Bannister W.H., Bannister J.V. Reduction of oxygen by NADH/NADH dehydrogenase in the presence of adriamycin // Free Radic Res Commun.-1986.-Vol. 2.-P. 163-171

277. Tietze F. Enzymetic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues // Anal. Biochem.-1969.-Vol. 27.-P. 502-522.

278. Torrielli M.V., Dianzani M.U. Free radical in inflammatory disease // Free Radical in Molecular Biology, Aging and Disease.-N.Y.: Raven Press.-1984.-P. 355-379.

279. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc Natl Acad Sci U S A.-1979.-Vol. 76.-P. 4350-4354.

280. Turrens J.F., Freeman B.A., Levitt J.G., Crapo J.D. The effect of hyperoxia on superoxide production by lung submitochondrial particles // Arch. Bio-chem. Biophys.-1982.-Vol. 217.-P. 401-440.

281. Veis D.J., Sorenson C.M., Shutter J.R., Korsmeyer S.J. Bcl-2-deficient mice demonstrate fulminant lymphoid apoptosis, polycystic kidneys, and hy-popigmented hair// Cell.-1993.-Vol. 75.-P. 229-240.

282. Walker J.E. The NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) of respiratory chains // Q. Rev. Biophys.-1992.-Vol. 25.-P. 253-324

283. Wallace K.B. Nonenzymatic oxygen activation and stimulation of lipid peroxidation by doxorubicin-copper // Toxicol Appl Pharmacol.-1986.-Vol. 86.-P. 69-79.

284. Wallin R. Adriamycin and DT-diaphorase // Cancer Lett.-1986.-Vol. 30.-P. 97-101.

285. Warner B.B., Stuart L., Gebb S., Wispe J.R. Redox regulation of manganese superoxide dismutase // Am J Physiol.-1996.-Vol. 271.-P. L150-L158.

286. Wendel A. Enzymes acting against reactive oxygen // Enzymes Tools and Targets.-Basel: Karger, 1988.-P. 161-167.

287. Winterbourn C.C., Gutteridge J.M., Halliwell B. Doxorubicin-dependent lipid peroxidation at low partial pressures of 02 // J Free Radic Biol Med.-1985.-Vol. l.-P. 43-49.

288. Wiseman H., Halliwell B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer // Biochem J.-1996.-Vol. 313.-P. 17-29

289. Wolfe J.T., Ross D., Cohen G.M. A role for metals and free radicals in the induction of apoptosis in thymocytes // FEBS Lett.-1994.-Vol. 35 l.-P. 58-62.

290. Wong G.H., Goeddel D.V. Fas antigen and p55 TNF receptor signal apoptosis through distinct patways // J. Immunol.-1994.-Vol. 152.-P. 1751-1755.

291. Wong T.W., Yu H.Y., Kong S.K. et al. The decrease of mitochondrial NADH dehydrogenease and drug induced apoptosis in doxorubicin resistant A431 cells // Life Sci.-2000.-Vol. 67.-P. 1111-1118.

292. Wood K.A., Youle R.J. Apoptosis and free radicals 11 Ann. N.Y. Acad. Sci.-1994.-Vol. 738.-P. 400-407.

293. Yim M.B., Chock P.B., Stadtman E.R. Enzyme function of copper, zinc superoxide dismutase as a free radical generator // J. Biol. Chem.-1993.-Vol. 268.-P. 4099-4105.

294. Youngman R.J., Elstner E.F. On the interaction of adriamycin with DNA: investigation of spectral changes // Arch Biochem Biophys.-1984.-Vol. 231.-P. 424-429.

295. Yu B.P. Cellular defenses against damage from reactive oxygen species // Physiol. Revs.-1994.-Vol. 74.-P. 139-162.

296. Zhao B.L., Wang J.C., Hou J.W., Xin W.J. Studies on nitric oxide free radicals generated from polymorphonuclear leukocytes (PMN) stimulated by phorbol myristate acetate (PMA) // Cell Biol Int.-1996.-Vol. 20.-P. 343-350.

297. Zou H., Li Y., Liu X., Wang X. An APAF-1 cytochrome с multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9 // J. Biol. Chem.-1999.-Vol. 274.-P. 11549-11556.

298. Zunino F., Capranico G. DNA topoisomerase II as the primary target of antitumor anthracyclines // Anticancer Drug Des.-1990.-Vol. 5.-P. 307-317.

299. Zweier J.L. Reduction of 0'2 by iron-adriamycin // J Biol Chem.-1984.-Vol. 259.-P. 6056-6058.

Информация о работе

Соломка, Виктория Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.02

Диссертация

Свободнорадикальные механизмы в развитии лекарственной резистентности опухолевых клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы