Свободнорадикальное окисление липидов в биологических и модельных системах в норме и в патологии

Закарян, Армен Егорович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Свободнорадикальное окисление липидов в биологических и модельных системах в норме и в патологии
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Свободнорадикальное окисление липидов в биологических и модельных системах в норме и в патологии"

ЕРЕВАНСКИЙ « ГОСЙ'ДАРСТВЕНШЙ УНИВЕРСИТЕТ < ^ На правах рукописи

V ^

ЗАКАРЯН АРМЕН ЕГОРОВИЧ

СВОБОДНОРАЛШАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ И МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ В НОРМЕ И В ПАТОЛОГИИ

03.00.02 - Биофизика

Диссертация на соискание'ученой степени доктора биологических наук в виде научного доклада

ЕРЕВАН - 1995

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета ЕГУ. .

Официальные оппоненты: член-корреспондент IIAÏÏ РА, доктор б.н,

профессор Оганесян Спартак Сарибекович

доктор биологических наук, профессор Агадаанов Михаил Иосифович

доктор биологических наук; Бадштян Сергей Апотович

Ведущая организация: Институт молекулярной биология HAH

Республики Армения

Зацпт'а состоится " О»? июня 1995 г. в " t?r" часов на заседании специализированного совета по защите диссертаций К 005.01.CS при биологическом факультете Ереванского государственного унпзерситага С 375049, Ереван, ул. Алека Ману-кяна I, Ереванский госуниверситет, биологический факультет,

1 кафедра боихямгл ).

С диссертацией мозно ознакомиться б библиотеке, универ- . ситета.0 Диссертация в.вида научного доклада разослана

¡¿ая 1995г. •

Ученый секретарь специализированного

Совета, кандидат биологических паук Ананян Л.Г.

I. ОНЦЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PAEOTU ■ ■

I.I. Актуал1.ность_^аботы. Важной проблемой современной биофизики является изучение свободнорадпкальной природа окислительных процессов, протекающих'в липидах и липидсодеркалих структурах биологических систем в норме и в патологических условиях. Изучения спонтанной хемилюминесиениип (СХЛ) биосубст-ратои дали возможность разработать десятки хешшглинесвентянх (XJI) методов исследования в этой области (Тарусов Е.К. и сотр., I96I-I973; Эмануэль Н.Ы. и сотр., 1976; Бурлакова Е.Е. и сотр., 1973-1975; Владимиров Ю.А. и сотр., I96C-I965; IS77-I9S9; Еу- • равлев А.И. и соавт., 1970-1988;"Весаловский S.A., 1990 я ДР.). Эти работы позволяют рассматривать процессы светового излучения биологических объектов на основе представлений квантовой химии и теории свободнорадикалънкх пепных реакций. В этих и во • многих других работах было установлено, что интенсивность Х£ может измениться с развитием различных патологических процессов и воздействием на организм ряда экстремальных факторов ок-руасающей среды (Тарусов'Б.Н."и -соавт., 'I967-IS73; Владп^гроЗ •-Ю.А.'и сотр., 1979,1903,1985; Галеев Ф.С., 1965; Тес'елю::г D.O. и др., 1990 и др.)'. Это означает, что уровень XI биологпчес-" ких систем является'отражением физико-химических к биохи:.:нче- . сках процессов, протекающих в организме, и ыокет слуи.тъ крз- . териём для их опенки.

Однако в большинстве случаев ьсе эта работы были выполнены на гоглогенатах, что, на наш взгляд, заметно ограничивало ■ возможности ХЛ методов исследований. С этой точки зрения наиболее удобной в качестве объекта исследования,является кровь, которая как внутренняя среда наиболее полно отрагяет.сдвиги в тканях и органах при различных-нарушениях и воздействиях. В отличие от гомогенатов,.пробы крови отличаются более стабильными свойствами и устойчивостью во времени. И, наконец, пробы крови для исследования мокно брать в небольшх количествах от доноров или больных (или от экспериментальных тавотных); что дает возможность проследить за происходящий! процессами. Поэтому в последующие работах, после открытия сверхслабого свечения сыворотки (плазмы) крсаи (Закарян А.Е., Гарусоз Б.Н., IS57) основные работа по изучению патологических процессов проводилась

, ' • . ' ■ ч

! "" • :.. ' • '

на сыворотке или плазме крови (Барабой В.Л.,'1986, 1990; Шерст-кев Ы.П.'ИДр., 1985; Владимиров Ю.А. и сотр., 1983-1987; Те-селкин И.О. ц др., 1990 и др.).

3 настоящее время большое распространение б научно-исследовательских лабораториях и клинической практике получил метод ■ ХЛ как для изучения патологических процессов, так л'для созда-- нпд биофизических диагностических методов Закарян А.Е., Тару- -соз Б.К., I97C;' дуравлев А.И., 1983, 1985; Куликова Л.А. и др., ISS3; Белых В.Б., 1984; Сологубова Т.И., 1986 и др.). Установлена зависимость интенсивности СП сыворотки крови человека от степени'воспаления в легши: (Бондарев И.М. и др., 1971; Кули-коз B.D. и др., 1971). Изучалась М сыворотки крови в присуг-

■ ствип иншшатора (Ге^+) болышх в хирургической клинике (Вла-диулров Ю.А. и др., 1974; Куравлев AilU, 1975), синоротигкрови больных: атеросклерозом (Куликов B.ÍO., 1974; 11уравлев А.И., 1974; Барабой В.А. и др., 1979). Появились работы, показываю- • сие иелесообразность использования показателей ХЛ свойств сыво-ротки'кроЕи í¡ контроле за эффективностью стационарного лечения (Чеботарев Е.Е., 1978; Серкиз Я.И. и др., 1984 и др.).

В этом контексте особое внимание заслуживают работы, пос- ' вяленные изучению опухолевообразовательного процесса, в которых изучались антиокислительнал активность (АОА) биолипидов различных тканей и органов в процессе злокачественного новооб- . . разовакля (Тарусов Б.II. и др., 1966-1973), физико-химические

особенности липидов тканей животных при химическом каниероге-• незе (Бобр В.М. и др., 1970), особенности кинетики окисления ■ липидов при раке (Бузас С.К. и др., 1970), физико-химические "

■ критерии при малнгнизации (Еурлакова Е.Б., 1970-1975), распределение АОА е различных клеточных rf/ракшшх при Е-авиташнозо " у крыс (Ломсадзе Б.А., 1970), исследование•АО. свойства фобфо-липидэв при индуцированном раке (Есакова Т.Д. и др., 1970). В" последующа работах различными исследователями было установлено такке и изменение свечения сыворотки крови'в'зависимости'от' развития злокачественного процесса (Закарян А.Е.,'Торусов Б.Н., 1970; Цуравлев А.И., 1975; Шулкая Е.И., 1979 и др.). -

Среда работ по изучению ХЛ биологических объектов зиачи-

■ тельное место занимает изучение первичных радиобиологических процессов и юс залитшх механизмов (Бурдин К.С., 1970; Сапекин-ский И.И., 1972, IS8I и др.)'. В этих и в раде других исследова-

о .

ний била установлена прямая связь менду интенсивностью л." ^зу-лаемых объектов. и развитием лучевого поражения. Ка параметр 10" • били также тестированы различные ингибиторы и защитные о;г радиации вещества.

Очевидно, что ХЛ процессы протекают в липидноп пазе клеток и биологических кидкостеп, следовательно, перекпсцое окисление липидов (ПОЛ), которое лежит в основе ХЛ, мо>.:ет осуществляться на уровне свободных и связаных липидов. В качестве свободных, липидов условно можно • рассматривать и липопротенны крови и биологических жидкостей, Истинно связанные лппнды - -матрикс биомембран, Отскда и большой интерес к использования информационной возможности ХЛ при изучении биологически. мембран. Роль этих мембран общеизвестна, их линиды непосредственно и постоянно соприкасаются с молекулярным кислородом, растгсрен-пим 1сак в межклеточной,-так и во внутриклеточной .^¡дкости. В этих щцкостях постоянно присутствуют такх'.е йога металлов переменной валентности, катализирующие ПОЛ в направлении деструкции" биомембран. Однако в' норшльных условиях -пропесс ПОЛ регулируется присутствием в мембранах ¡гирорастворшах антискснгла-тое - токоферолов, убпхпнонов'и др;, сдерЕинакззс свободнсра-дикальные (СР) процессы. Приоритетными в изучении ХЛ'блсмемб-рац являются' широко известные работы Владпщрова Ю.А. с сотрудниками (1973-1979, '1982-1988) и других1 авторов (Ломсадзе Б.А., 1970; Гукасова В.Н., 1977, 1991 и др.). К сожалении:,, все эти исследования били посвящены внутршшеточгшм мймбраш1ы:л структурам. Практически не" было работ в направлении изучения плазматических и ядерных мембран, вааная биологическая роль которых не вызывает сомнений. -

Большой интерес представляет изучение ХЛ модельных-систем 1 с помощью индуцированной ХЛ, которое дает возможность исследовать механизма СХЛ и ПОЛ и экспресс-методом тестировать различные ингибиторы, антпоксцданты и ишшпаторы свободнораллкаль-ных процессов. С их помощью мокно, например, изучать белск-лн-пидное взаимодействие и его роль в СХЛ и ПОЛ биологических г.:ем— бран.

Таким образом, в настоящее время накоплен больпой научный материал по изучению ПОЛ и ХЛ различных биологических объектов и структур, и основной вывод, который можно сделать, заклвда-

! ' ■■

етсд в том, что изучение ПОЛ и параметров ХЛ дает возможность олекпть состояние организма с точки зрения нарушения равновесия ПОЛ ЕД.0 (биоантиокенданты). На основании полученных данных по XI, считается возможным применение метода ХЛ дал изучения динамики развития ряда патологических процессов в организме, проследить за эффективностью лечения различных заболеваний, контролировать экстремальные и экологические воздействия на киво" организм и для диагностических лелей.

. 1.2. Дель_д_задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование ХЛ и ПОЛ сыворотки и плазмы крови человека л кпвотных, плазматических мембран (ИМ), ядерных мембран (ЯМ) печена крыс и некоторых модельных систем, отражающих об-цне принципа ХЛ и ПОЛ биообъектов по схеме: лигшд-липопротеид-биомембрана. Б этой связи били поставлены следующие задачи исследования:

1. Обнаружение СХЛ сыворотки (плазш) крови и изучение ее природы, температурной зависимости и действии кислорода, анти-оксидаятови прооксидантов на свечения.

2. Изучение динамики изменений СХЛ сыворотки (плазш) кро-. ви при злокачественном процессе, лучевом поражении и периодической болезни.

• 3. Изучение антлокцелительной способности сыворотки крови при патологических наруиениях в организме.

4.> Обнаружение и изучение СХЛ и ПОЛ плазматических и ядерных мембран при различных температурных условиях, в присутствии

• кислорода, антпоксидантов, ионов железа и биологически активных веществ (гидрокортизона и-17-^ эстрадиола). ■■

5. Изучение липщпшх, белок-липидных и других модельных систем с помощью индуцированной ХЛ для выяснения природы и механизмов .СХЛ. биологических.объектов.

1.3. Научная новизна работа. Впервые обнаружена СХЛ сиво-' ротки (плазмы) крови, изучены ее природа и температурные характеристики. Показано, что СХЛ сыворотки крови обусловлена липид-ныыл компонентами сыворотки и имеет свободнорадикальиый харак- ' тер.- Установлено, что при злокачественном роотс уровень СХЛ сыворотки крови уменьшается, тогда как при лучевом поранении И" периодической болезни - увеличивается. Выявлена АОА способность «¿воротки крови и ее увеличение 'При злокачественном процессе.

Установлено, что это связано с нарушением стационарного раек -вссия ПОЛНЕЛО в организме.

Вперше обнаружена и изучена СХЛ плазматических и ядерных мембран. Полученн температурит! зависимости этого стечения, ¿¡у-. явлен фазовый переход в области температура 42-43°С. Установлено, что СХЛ отих мшбрашшзс структур обуслоьлпна сгободнора-дшеалышм окислением липздое мембран. Изучено действие адрена- ■ _ лина и 17-6 эстрад,иола на СХЛ плазматических и ядерных ¡/ембран в опитах 1п о и. VIV I о . Обнаруг.ено наличие серопчэй зависимости действия 17- эстрадиола на СХЛ и ПОЛ ядернлх ме \й-ран. Выявлена роль белков в биологических объектах в процессе СХЛ в качестве вторичных эеттеров.

■ Создан усовершенствованный комплекс установки для регпрт- ■ рапии сверхслабых свечений с принципиально новыми разработанными наш электронным! блоками и устройством,для беэградиент-.ного нагрева исследуемого образца. . ■

1.4. Научная и Драктидсс}?ая_исиность. Разработанные методы и подходы могут быть использованы при исследовании ряда па-. • тологических процессов живых организмов, при возлейств:п: разт' личных, экстремальных, в том числе и.экологических, иактороз ка„ организм и при изучении дипаглшш биологических изменении, в основе которых лежат свободнорадикашше цепнкс окисления лнпл--^ дов и липидсодеркащпх биоструктур, Полученные в результате про-' веденных исследований экспериментальные данные раскрывает нгко-. торце стороны в понимании механизмов ряда процессов, являг.цпх-.'--ся причиной разшшш патологии в организме. Уровень интеис/Л'ЛЮ-сти ХЛ в динамики кизнодолтодыюсти, лоаполлшиЙ ошлшь соото-: яние и степень смешения равновесия ПОЛНЕЛО, монет быть рас-', смотрен как объективный и чувствительный показатель состояния организма. Разработанные метода и подходи могут быть использованы для окппресс-тестпровки многих биологически активных веществ и медицинских препаратов, в том числе рапюм!ш;етпков, радиопротекторов, фармакологических веществ и рагчичных актпокса-дантоп и прооксидантов. Полученная СХЛ ин^ормаь ;я монет иметь '. значительную научную и ]шшпчоскую ишшооть и ]!,' сочетании с

< 1

другими клиническими показателями мокет являтьо ким тестом. Многие из указанных положений подтв

кои и в настоящее время успешно применяются р различных лабораториях России

1 днагностичес-¿ряйекы практп-

' .ториях России (например: кафедра биофизики Второго Московского-, мед!ш::нского института им. Пирогова; лаборатория Каменской В.П. Новосибирского государственного медицинского института; научно-/ исследовательский институт по биологическим испытаниям химических соединений и другие), о чем свидетельствуют многочисленные ссылки на наши публикации по данной теме. ■

1.5. Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на: I. Всесоюзном симпозиуме "Физико-химиче-

о'. екпе основы авторегу.чяшш в клетках", Москва, 1965; 2. Всесоюз-° ном симпозиуме "Физико-химические механизмы злокачественного роста',' Москва, 1967; 3. Конференции "Московских испытателей ■ природа, 'секция биофизика", Москва, 1969; 4. Ш республиканской научной сессии по вопросам биофизики, Ереван, 1970; 5. Всесоюзном 1У симпозиуме "Сверхслабые свечения в медицине и сельском хозяйстве", Москва, 1971; 6. Республиканской конференции молодых физиков Армении, Нор-Акберд, 1973; 7. Всесоюзном симпозиу-. ме "Биофизические свойства крови", Саранск, 1975; 8. П конференции молодых ученых Ереванского физического института, Нор-Амберд, 1975; 9. Ш Республиканской сессии по вопросам биофизики, Ереван, 1982; 10. Ш Республиканской конференции "Достижения физико-химической биологии и биотехнологии и пути их внед-. ; рения", Ереван, 1989; II. I научно-практическом съезде медиков Армении, Ереван, 1991; 12. У съезде Армянского физиологического общества, Ереван, 1994.

1.6. Структура диссертации. Диссертация изложена в виде 'научного доклада.

2. ЭКСПЕР1 МЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Мэто£ические_подходы_и^1лет^лы, В основе выбора основных методов исследования были положены такие подходы, кото- ■ рые позволил;! провести эксперимента, по возможности, на живых объектах, по крайней мере, на ингактных биопробах. В ряде случаев при изучении динамики экспериментального процесса кровь брали из одного и того же животного. Помимо того, что эксперименты. проводились на группах животных, опытные образцы, полученные из кавдого из них, также подвергались повторному исследованию. Ло ходу экспериментов контролировали возраст., пол и вес гивотного и, по возможности, рацион их.питания". Вое это

позволило довести до минимума статистические разбросы и повысить уровень достоверности полученных результатов. '

Основным методом исследования был ныбран метод СХЛ, который, на наш взгляд, наиболее отвечал вышеуказанным подходам. После того, как в 1961 году было обнаружено явление СХЛ орга- . нов и тканей животных, были созданы лабораторные установки для его изучения (Тарусов Б.Н. и др., 1961). Затем, в сеязи с выявлением широких прикладных возможностей ХЛ, во многих научных центрах (Москва, Киев, Рига и др.) и за рубежом ( 1КВ VV0Li.dc - Швейцария, Франция, вгРКТЬСМ-ь - &РГ и др.) были разработаны и серийно выпущены ХД установки. Однако метрологическое' обеспечение установок и, что немаловажно, их Недоступность ограничили их широкое применение. Поэтов, как правило, подобные установки конструируются и собираются в соответствующих лабораториях.

При проведении наших экспериментов мы собрали 4 установки, которые были модифицированы в направлении- улучшения чув- " ствительности, повышения стабильности и надежности этих приборов.

В наших поисках особое место было отведено гыбору малоау-мяших, высокочувствительных фотоэлектронных умножителей (ОЗУ), работающих без охлаждения в жидком азоте (ОЭУ-42Е, £37-135, . ■ ФЭУ-140). На базе ФЭУ-140 г>и сконструировали квантометрическуа установку, в которой использовались созданные наш усилители и другие радиоэлектронные узлы в сочетании со стандартными приборами промышленного выпуска (Закарян А.Е. и др.. 1990)..Установка была обеспечепа автоматической электронной регулировкой температуры в измерительной ячейке с точностью +0,2-0,3°Са имела возможность изучения электрохемплюминесиенипи (ЭХЛ), СХЛ и фосфоресценции. Основным параметром ХЛ являлась ее интенспз-ность, которую регистрировали как в режиме счета КЕантэз, так и при постоянной записи сигнала на самопишущем приборе.(КСП-4).

. Лля выделения оптического сигнала на фоне шумов все данные, полученные, как минимум, из 10 измерений, подвергались статистической обработке, что заключалось в нахождении сродней (М), ее стандартного отклонения (т.), квадратичного разброса (о) и ах' опенки по критерию Стьвдента. Предложенная установка при нормальном подборе режима работы, по .нашим данным, имела более ! • '

чем в 2 газа чувствительности по сравнению с известными апологами. ,

При исследованиях были такке применены: метод ЭПГ', метода ультраиентрпфугкровапия, фракционирование на ионнообменных ко- ' донках (модифицированные нами), метод химического определения ПОЛ по количеству малонового диальдепща (МДА), методы определения маркерных ферментов мембран, метод искусственных мемб-ган (ELM), метод микрогельэлектрофореза, флуоресцентные и дру-' гие методы.

2.2. Объекты исследования. В исследованиях были использованы сыворотка и плазма крови людей и белых лабораторных крыс, печень и мозг крысы и полученные из них различные меточные ■ структуры, в том числе МП и ЯМ. В экспериментах использовались такге различные химические препараты местного и зарубежного производства.'

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И IDC ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Споитанная^сеАщлшгаесиени^ S ь^П злокачеств^еннсгл ¿осте. Метаболическое свечение биологические объектов, как теперь установлено, - это одно из проявле-, кий перекпеного езободнорадикального окисления органических ве-. . цеетз, презде всего липидое.'ЧЗ точки зрения практического ис-• ■ пользования метода СХЯ наибольшие удобства в качестве объекта исследования представляет кровь. Учитывая и ее важную роль как глазного связующего звена перераспределения основных метаболических продуктов, значит и носителя информации об изменениях метаболизма при различных нарушениях, нами впервые был» обнаружено и изучено сверхслабое свечение сыворотки плазмы крови человека и глвотных. Было установлено, что сыворотка и плазма крови указанных объектов обладают почти одинаковой СХЯ при данной температуре измерения (табл.1), а СХЛ цельной крови не была обнаружена. Нагрев сыворотки и плазмы крови'сопровождался усилением СХЛ.

Температурная -крииая СХЛ сыворотки кропи носит олпюшй ха- . рактер с переломом в. области 50-55°С (рис.1). Наличие переход- ного участка на температурной кривой определяется, очевидно, конформалионными переходами субстрата и сменой процессов с раз-

личными константами скоростей многокомпонентной реакпии ^»нагреве.

Таблица I •■ Температурная зависимость СХЛ сыворотки и плазмы крови, имп/10 сек

' Объект 1 'исследования' 40° Темп е_р а 45° \ 50° | 1 ■ .г_У_Р«аА С°__ 55° [ 60° ; 65° '

сыворотка , 'контрольных 1крыс 50+10 120+20 1 1 | 184+30 | 218±32 1 | 370±40 ! 420±43 |

1 1 1

'плазма I (контрольных I ¡крыс | | т 53+12 125+23 1 180+20' 1 ~ 220+31 \ 375+39 I____ 1 | 410+4С

1 сыворотка 1 1 здоровых 1 1 людей , 1------г 1 плазма | 1 здоровых | 1 людей | 60+16 60+12 130+25 135+26 ' 200+32' 1 ~ | 1----11 | 1 183+30, 1 " | 252+33 260+30 | 340+42 1---- 1. 1 315+39 1 430+46 ' . 1 1----- ! 395+40 . [ 1 |

Анализ температурной кривой в аррениусовых координатах позволил установить, что в СХЛ сыворотки крови свободных липи-*. дов и липопротеидов отличаются разным выходом СХЛ и заметным повышением <3ю (выше 50°С), что, возможно, связано с лопату- .. рашен липопротеидов. Это подтверждается тем, что после кипя- • чеиия сыворотки в течение 3-5 минут перегиб на температуркой кривой сглаулвается, и зависимость принимает прямолинейный ха- • рактер. Значение с? )0 (2,6+2,7) указывает на неферментатпзкый, характер СХЛ реакции. Усиление этой реакции, в первую очередь,-связано с уменьшением активашюнного барьера и, следовательно, активированием процессов, приводящих к образованию свободных радикалов. Расчет энергии активации с помощью равнения Арре-ниуса (типа ,£¡,1 =.?м-То ~ ) показат, что ее среднее

значение - Ес1) 13,6+3,1 ккал/моль - соответствует приведенным положениям. После появления свободных белковых структур ■

в сыворотке при нагревании выше указанных темпоратур'^ .белки, * ■ 'ч

по всей вероятности, играют роль' эмитеров для усиления СХЛ, Это подтверждается нашими данными, согласно которым при добавке белков на олеиновую кислоту наблюдается усиление ХД в двухфазной липид-белковой системе."

-Цоо

-30

-500

10 15 ?0 СЧ.ТКИ ,

Рис,1; А. .Температурная зависимость СХЛ сыворотки крови ' здоровых людей (0), интактных животных (л) и раковых больных (0 - лиыфогрануломатоз, А -рак молочной келезы). ;

Б. Дпкашка изменения СХЛ при злокачественном процессе у крыс (0 - карпинома Уокера,А -саркома-45 и 0- асиитиая опухоль ОЯ. ' • I - контрольная сыворотка.

- £ця изучения роли О2 в процессе генерации СХЛ нами проводилось удаление^кислорода из сыворотки путем откачки на форвакууме (Р=5*10~^ш рт.ст.), что приводило к резкому снижению СХЛ. Полного прекращения.СХЛ не наблюдалось ни сразу поело откачки, ни после хрипения образна в герметической шоието. Продувание образца очищенным азотом в течение 30 минут также не привело к полному прекращению Уалг что связано, вероятно, с остаточным С>2 в образцах. Атмосфера чистого 0%, достигнутая продуванием очищенного 02, способствовала увеличению ХЛ сиво-

13 :

» :

ротки более чем в 2 раза, которая тлела прямолинейный характер зависимости от времени продувания и концентрации (по соот- . : ношению 02/ч 2) кислорода. При повторном продувании, СП сыво- | ротки усиливалась, что указывает на накопление продуктов, имевших более высокие квантовые выхода для высвечивания. Аналогичные данные впоследствии били получены в работах (Луравлев А.Н., 1975, Серкиз и др., 1984 и др.). Влияние клслородк на СХЛ сыворотки осуществляется, в первую очередь, на уровне ПОЛ ; за счет увеличения в окислительных CP реакциях.

Чтобы показать неферментативный характер регистрируемого ; наш свечения, мы использовали ионы металлов (За2+, "Sq^, !

и ), а также дыхательный яд - kc/v , угнетаксие или ка- '

тализирущие ряд ферментативных реакций. Добавленные к сыв^-ротке крови, они но приводили к заметному изменения C7JI в ус- а ловиях наших экспериментов. Для установления возможного температурного оптимума и функционирования разнообразных ферментных; . систем эти эксперименты проводились е широком температурном ' диапазоне (от 20 до 50°С, с интервалом-в 3°С). Все полученные-данные указывают на нефермеитатиЕНый характёр свечения сыво--' ротки, что говорит в пользу предположения многих авторов (ЗЛа-димиров Ю.А. к др.-, 1979; Журавлев А.И. п др., 1985; Тарусоз. • i Б.Н.- и др., 1957). - j

Для исследования свободнорадикальной природы СХЛ были ис-. .' S пользованы соответствушие ингибиторы («А. -нафтол, кони. . :'¡

5'10~%, и ci. -токоферол, кони. 10~3МК Присутствие в сыворот-: .! ке этих ингибиторов привело к "угнетению СХЛ (рис.2, Б).

Совокупность этих данных позволяет заключить, что стптлу-ляция свечения связана с появлением в' исследуемом образпе воз-буквенных молекул и частш, дезактивация которых приводит к • •.,•■! высвечиванию кванта света по схеме: ,• . ]

Р» + + . • * I'

Цри этом, иш'ибитор мояет взять на себя энергию возбужденных : частиы и молекул и излучать ее в виде тепла: >

Р + AI —> Р [Ai;p_» Р + Alo + Q (хал/'коль) ¡ Эти схемы соответствуют известным представлениям (Васильев '

Р.Ф., 1963-1965 и др.). i . . j,

Использование различных методов (адсорбционная хромато- ¡ '

графил на ионообменных смолах - Дауэкс 50x4 100/200, 50x8 100/200, ультраиентриЗугирование в поле градиенте сахарозы -¿Ип«о/пом=1 В=4477 об/мин, § =125490, в теч, 120 мин - по-казачо, что СХЛ сыворотки едови как у человека, 'так и у" животные обусловлена, в первую очередь, легкими, лилндными и дкпкдеодершпими фракциями;

Зго

)№ О

• • 1

Зоо -

¿ГО

Г« •

,5, — 0

|о ?0 з МиЦ'Лм

Рисг2? А;*-- СИ сыворотки крови , и гомогената печени крыс при Е-авитаминозе (текп'.изм. 60°С)'. I - сыворотка крови контрольных животных, 2 - то ; ке для авитаминозных крыс, 3 - то же после введе-• \ , ни животным <ч -токоферола, 4 -' гомогенат печени Е-авптаминознкх крыс.

Б. В'шянио <4 -токоферола на СХЛ сыгоропцг црови крысы (I) и олеиновой кислоты (2).

I на рисунках - интенсивность СХЛ'(имп/Ю сек).

Таким образом, в этих экспериментах впервые была установлена способность сыворотки крови на СХЛ и ее зависимость от ' температуры, присутствия кислорода и антиоксидантов. Показано, что основную роль.в этих процессах, сопровождаотихся свечением,, кгразт липиды. Хотя не исключается и возможность участия ' . белков, входящих в состав лалопрогеидных комплексов сыворотки'.' На основании данных рада экспериментов предполагается, что СЗШ сыворотки крови носит неферментативный характер, в основе '

ее лежат СР окислительные процессы л сгюбодшгх к связанны/ ,:::-пиднпх структурах сыпоротки.

С иелт установления роли белкол

Г'у

"ОООТКХ

чалпиь ицдушроиаиная ХИ при ксллнатной томпоратуро, ::оско:"? при этом, как будет показано кикс. на модельных системах, б о;, могут выступать ула кале осношшо эштоун сиочон::ь. Скслер::;//. ты с Н202 проводили путем дистантного добавления мл Н202 па 3 мл сыворотки. Свежесть Н.,02 контролировала';:. Фонометрическим методом. Расчет еьетосумщ проводили по площади под кривой, т.е. ) сН ■

13 минуты

/МИНУТЫ

Рис.3. А. Кинетика Н202-7Л сыворотки крови здоровых лвдоГ; (I) и больных раком нелудка (2).

Б. Кривые ФХЛ сыворотки крови здоровых людей (I.) и больных раком (2).

I на рисунках - интенсивность Цо0о-Хл (А) н ОХЯ (Б) в относительных единицах (имп/Ю сек).

В итоге (рис.З, А, кр.1) били зарегистрированы амп-нтуда быстрой вспышки, которая снижалась экспонегшиально з течение первых 3-4 ш, фаза медленного-снияения свечения с переходом на стационарный уровень' в течение более чем на 30-40 мин. Это свечение также ингибировалось ингибиторами СР реакция, Н^ш-е фракции ультраиентрифугата с Н202 давали ХП, выход кртороГ; с'у-

иественно не отличался от свечения верхних фраютий. Свободные белки с Ho0g такке давали П, кинетика которой не отличалась от кинетики XJI сиворотки. По такой нее схеме была изучена ФХЛ сыворотки крови. В опытах было показано, что сыворотка, облученная полным УС^светом лампы ПРК-4, дает ФХЛ, кинетика которой выражается начачьной попишкой (после прекращения облучения), фмий экспоне!Шпалыюго снижения ее интенсивности, которая через 810 минут переходит на относительно стационарный уровень (рис. 3, Б, кр.1). По кинетическим формам кривой ФХЛ можно видеть схожесть с ХП, индуцированной Н2О2.

Аналогичную картину можно наблюдать при изучении ЭХЛ сыворотки. Однако в этом случае, в зависимости от условии опыта, (электролит, форма и размеры платиповых электродов, сила тока, концентрация добавленной сыворотки), которые подбираются экспериментально, сигнат ЭХЛ после добавки испытуемого образна монет либо усиливаться, либо уменьшаться.

Црц анализе, как наших, так и литературных данных мокло констатировать следующее:

1. Индуцированная XII сложных систем может-отражать общую картину СХЛ данной системы.

2. 3 случае слокных (липид-белкових) систем в механизме СХЛ основную роль, в индуцировании свободнорадикального процесса играют липиды (ПОЛ)', а белки - вторичных эмитерои.

3. В механизме индуцированного свечения (оХЛ, ЭХЛ, HpOg-ХЛ) сложных систем главную роль энергопоставщика в реашиях изучения играют белки, возбувденние частицы которых, в данном случае, уже' утилизируются на вторичных эмитерах-липидных молекул.

4. При липид-белок взаимодействиях данные СХЛ и индуцированной ХЛ могут быть использованы при изучении биологических мембранных структур.

Таким образом, в процессе спонтанного свечения сыворотки крови основной вклад в свободнорадикальные окислительные процессы вносят липиды и нирные кислоты, как свободные, так и связанные. Наличие белков, особенно лилопротеидов, может играть . существенную роль в реакциях СХЛ, о чем свидетельствуют наши данные, полученные при денатурации белков сыеоротки. Существует гипотеза' (Конев C.B., 1965) о том, что суммарная ХЛ связана

с триплетныгл возбувденным состоянием триптофана - белка лисд-протеидов. Однако это, по всей вероятности, может относиться-, к ОХЛ. И здесь, очевидно, пукаю учитывать тот -"акт, что при облучении (особошю УФ-смотпп) II нроиссс в ключа' П я И ик?н:::!ыг: • (¿01«ы кислорода, частично пояпллкинео;! н момент облучения, ч'го доказано снсктроскопнчся^юш методом (пернатый ¡i.A., 157k:j.

Механизм индуцированной ХЛ имеет более сложный характер . и не может быть интерпретирован однозначно. К сожалению, такой подход при объяснении механизмов GXJ1 а индуцированной ХЛ не всегда учитывается ( S Xai ¿/)s>: i j e ' of, 1978, I960). Нам кажется, что вышеприведенные доводы могут быть полезны в поисках механизмов индуцированного свечения, что в свою очередь может существенно увеличить объем полученной информации. ■

Итак, очевидно, что CXI сыворотки кроьи является результатом свободнорадикального перекисного окисления липкдных - структур, где белки могут играть лишь роль вторичных эмитероэ. Вероятно, этим можно объяснить неполную адекватность результа-' тов, полученных методами ХЛ и ПОЛ (по определению ЦДЛ). Несмотря па некоторое расхождение в частных механизмах C7JI, 7JI и .реакции ПОЛ, в общих чертах они'отражают основные процессы, < связанные с СХЛ сыворотки крови. Пали данные наглядно показывают на возможность и целесообразность применения методов ХЛ/ позволяющих инструментальным способом улавливать, качественно^ •и количествеино4оценить разнообразные изменения метаболпческо-' го характера в организме, а также изучить воздействие разных факторов, приводящих к нарушению этих обменных реакций.

Злокачественный процесс с этих позиций'рассматривается как частный случай метаболической патологии. Было установлено, что при росте раковых опухолей в организме изменяется га?нове-сие антиоксидантов, вследствие чего общий уровень окислитель^-' них процессов подавляется (Гарусов Б.Н. п др., 1957). Поскольку транспорт ЕЛО может осуществляться кровью, мы. сочли-целесо-образным использовать СХИ сыворотки крови для установления связи между АОА и актом свечения в биологически субстратах при злокачественном росте.

По этому поводу небезынтересно отметить, что в свое врег^я Гурвичем и его сотрудниками была обнаружена способность крозп давать слабое излучение в УФ-области светового спектра, а-так-

i " ...

ik а

; |

t •

; I

хе факт изменение его интенсивности при раке; Согласно этим данным, в крови раковых больных появляется т.н. "раковый суши-тель" (1^'рзич А.Г., 1947). Однако в связи с отсутствием в то время точных регистрационных методов для изучения слабого из- . лучения подобные работы были прекращены. Они вновь появились в 70-х годах, после известных работ Тарусова Б.Н. и сотрудников в области сверхслабого свечения живых объектов в видимой области светового спектра, что не имело ничего общего с мито-генетическим излучением.

Дпя изучения СХЛ сыворотки при злокачественном росте в наапх опытах крысам прививали различные опухолевые штаммы и изучали СХЛ сыворотки при широком диапазоне температур (40— 65°С). В этих опытах было установлено, что при злокачественном процессе интенсивность'СХЛ сыворотки заметно пошшена по сравнению с контролем (рис.1, А). Цроме того, на температурной кривой не наблюдается перелом в области температуры 50- -55°С. Цри изучении динамики изменения свечения в различные сроки опухолеобразовандя было показано, что, начиная с 5-6 ' дня после трансплантации опухолей, уровень СХЛ начинает сни-' каться и уже в конце 3 недели обычно доходит до минимума (рис.1,-Б).

'Цри изучении СХЛ сыворотки крови здоровых людей-доноров (38)(Из НИИ Гематологии г. Москвы) и онкологических больных (130) с .различной локализацией злокачественных опухолей (полученных из Онкологического центра г. Москвы) результаты были сходны с результатами опытов на экспериментальных животных, а именно, уровень СХЛ сыворотки крови онкологических больных оказался заметно нике, чем у здоровых людей (табл.2).

Известно, что прививаемые опухоли в качестве экспериментальной модели имеют как преимущества (стабильный клеточный состав и природу, синхронное развитие процесса малигнизашш и др.), так и недостатки, вырагсашиеся, особенно, в невозможности проследить за первым этапом развития процесса. Поэтому часть опытов были проведены с помощью химической индукции канцероге- ' неза. Ддя этого 2-3 месячным белым крысам вводили (как внутримышечно, так и в хвостовую вену) канцерогены из ряда полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) с расчетом 2,5-3,5 иг/кг веса швотного с 3-х кратной инъекцией интервалом в 7

дней;' В этом случае у животных в течение 1,5-2 месяца, как пра--вило, развивалась опухоль. ПАУ растворяли либо в "сверхрастворителе" (диметилформамид ДОЗА), либо в оливковом масле. В качестве контроля на канцерогенность ПАУ были взяты антрацен или пирен.

Таблша 2

Изменение СХЯ (имп/Ю сек) сыворотки крови онкологических больных с различной локализацией опухолей

f Объект 1 (исследования 1 I _ J

40 60+16

Темпе_рат yj? ах х, С " 45° "!" 50° "Г 55° "! 60е"

" 65° 1

' I

|Сыворотка I .здоровых

¡людей j

I-------'

,Рак желудка 1

130+25 | 200+32 I _

252+33 I 340+42

430+46 1 I

----i

270+3? |

- - - Н

250+36 i I 1.

Г - I

I-------1

|Рак молочной I

^елезы

50+18 47+19

90+18 | 140+26

160+30 1 230+25

85+26 I 130+26

170+27 ;

220+27

----1----

60+28 I 100+26

|Лим1юграну-.ломатоз I I-------1

36+17 48+16 47+18

130+25 , 180+30

200+38

'Миолемная " 'болезнь

76+18 I 125+29

146+29 I 210+28 1

230+38 |

1Рак

1яичников

80+18 I 137+27

165+29 i 230+28 i 240+37

Результаты, приведенные в табл.3, показывают, что еще до появления соответствующее опухолей (обычно, более чем-2 меся-!ца) CXI сыворотки крови понижается в коние первого месяца,что явно указываем на процесс малигнизации в скрытой фазе, когда , трудно идентифицировагь растущие опухоли. Это снижение, по нажигал наблюдениям, может продолжаться более, чем 5 месяцев, в" зависимости от продолжительности жизни ншвотного-опухоленоси-теля; Изменение уровня СХЛ-сыворотки не было отмечено в опытах с антраценом и пиреном.

В этих экспериментах было показано, что после однократного введения суммарного количества канцерогена в период индук-

или процесса малигнизации, начиная с первых дней СХЛ сыворотки (1: измерения 50°С) интенсифицируется с максимумом на 5-6 день затем спадется и в конпе первого месяца становится достоверно шиле контроля (табл.3), приобретая максимальное значения снижения СХЛ в период выраженного образования опухоли (через 4-5 месяцев). Но нсий вероятности, п начгш.ном периоде после введения канцерогены взаимодействуют с тканями организма по простому химическому механизму, приводящему к промеку- ' точным процессам, предопределяющим дальнейшее развитие опухоли, '

Таблица 3

Изменение интенсивности СХЛ (имп/10 сек) сыворотки крови крыс при химическом канцерогенезе " ' " Г " • ' (Ч- измерения 50°С) - - . ■

,1руппа животных

'Сроки после введения_ка!щерогепаА месяцы__{

.1.

«Контроль I 305+28 I 310+30 ' 310+27 1 320+31 330+40

1_______•_ I__I _!_ ' _ I _ !_ _

1 ' ' . ' I I

280+20 ■ 250+21 245+30 I 220+25 180+23

- | I | -1-1

(--------,---------1---------,----1

9,10-дпметил- . I 290+29 ( 270+2? , 260+30 , 25?+28 1230+23 ,

1,2-бензантрацен ( I | 1

11,2,5,6-Д.1ЕА.

|1,2-дибром- I 300+35 ! ч280+31 1 265+37 I 263+32 240+29

£штрапен

(Антрацен

1 380+24 ' 320+30 ! 307+26 ! 300+33 '385+31 / I " I ~ I " I - I -

Дтя частичной проверки этого предположения опыты проводились в условиях '¡.-а » добавляя ряд канцерогенов сы-Еоротки крови контрольных животных. При этом наблюдалась вспышка ХЛ, которая со временем экспоненциально уменьшалась. Величина этой зспыпки,к скорость ее затухания для разных ПАУ была не'одинакова, и на ХЛ меньше всех воздействовали антрллен . (табл.4).

На'основании полученных данных мокно заключить, что кан-перогены вначале вступают в реакцию с клеточными компонента- '

ш, модифицируя их, а последние запускают механизм индукции канцерогенеза.

Таблица 4

Изменение интенсивности СХЛ (имп/Ю сек) сыворотки крови при добавлении некоторых ПАУ ( "Ъ измерения 20°С)

Углеводорода

Время,

мин

0,6 |

2 ! 3 ! 4

6 ' 7 - —4- - -

Диметил-формамид

20СЦ-451170+40 1130+401100+401 70+25« 60+251 50+20, 50+20 -1 - |- | - I ~ | "I ~ 1

20-ме- 13001100670+50 ¡640+50,600+551500+50|410+40'270+40| 220+40 тил хол-антрен

1,2-ди-

бром-

аатрален

| ! « . ; ' 4704-601450+50 ,420+401380+401320+50 '270+401260+401130+40

I ." I• " I -

9,10-ди-

метил

1,2-бенз-|

антрацен -----

1,2,5,6-

дибенз-антрацен

500+70'470+50 1400+50,370+50'290+50 '250+50!ЗЗО+501 200+35 - | - I - ~ I - I " I; " 1

I I 1 I I !

480+60'440+50 '410+45|390+45|370+47 (340+501290+60, 260+40 ~ 1 ~ I ■ "" I ~ . |"| I."

■I-

|Антрацен I_____

300+501280+45<240+47 210+40 200+45 ¡190+47:190+50, 150+50 " I "I "I ~ • "I 7! ~

Та1сим образом, разштю злокичостисшюго процесса, кшс у крыс, гак и у человека сопровождается существенным и прогрессирующим снижением интенсивности СП сыворотки крови, по крайней мере, до терминальной стадии развития опухолей. Такое снижение СХЛ сыворотки крови, как будет показано нихе,.связано с нарушением пула антиоксидантов в организме.

3.2. Исследование_антиога1слительной_активности сыво^от-ки_крови_при_злокачественном росте. В известных работах" Тару-сова Б.Н. и сотрудников. (Тарусов Б.Н., 1965; Иванов II.il. и др., 1Э66 и др.) методом ХЛ было установлено, что некоторые щрорастворимыэ продукта, полученные.из печени а рада других

органов, способны ингибцровать СХЛ гомогенатов и липвдов и обладают АО активностью. Бурлакова Е.Б. и др. (1973) показа, ли, что при развитии прививаемых опухолей изменяется АОА ли- . пцдов печени. Есакова Т.В. и Тарусов Б.Н. (1970) подтвердили, что в процессе развития рака повышается АОА структурных к свободных липндов, независимо от вида канцерогенеза.' . » Исходя из .этих дашшх, в последующих экспериментах ш ■ , изучали АОА сыворотки крови методом ингибирования ЭХЛ, разработан нам в нашей лаборатории. Чувствительность метода превышала чувствительность биохимических методов на 2-3 порядка. Для этого после разгонки сыворотки на разработанной нага ионообменной .(разделяющаяся на 10 частей) колонке полученные фракции в количестве 0,2 мл вводили в ЭХЛ ячейку, где с постоянной скоростью происходило анодное окисление растворов тирозина и /v/q4sOv • сопровождающее ЭХИ. Об АОА - кандэй фракции судили по отношению интенсивности ЭХЛ в стационарной фазе (1о) к интенсивности ЭХЛ (Ij) после добавле-. KHf? исследуемой фракции. Опыты для изучения ингибировашш ЭХЛ сыворотки": или плазмы крови при злокачественном росте проводили на белых беспородных крысах (самцах). Контролем служили те ке крысы, которым в дальнейшем прививали аспит-ную опухоль-ОН. Суммарные результаты этих опытов показали, что АОА сыворотки распределена, в основном, в 3-й (более 7Q£) фракции и меньше в других фракциях сыворотки (рис.4,А).

Далее было показано, что в 3-х фракциях содержание ли"' пвдов значительно больше. После прививки асиитной опухоли наблюдалось суммарное повышение АО активности, которое дос-

• тпгает гдксп1.:ума на 4-7 день после прививки опухоли. Эти данные ставят под сомнение вопросы о появлении при злокаче-

• ствонком росте специфического тушителя крови (Гурвич А.Б. и ¿р., 1947) или специфических фракций, тушащих ЭХЛ (Петрусе-зпч ¡u.U. и др., 1965). Нам кажется, что тушащее вещество в игроком спектре содержится в плазме крови и имеет липидную природу. Цри росте опухоли нарушается равновесие ЮЛ;?ЕА0 а ■ сторону увеличения АОА, и англоксиданты перераспределяются

,е организме Через русло крови. Было сделано предполокение, ' что в качестве природных антиоксидантов могут служить, в первую очередь, 2-токоферолы (витамина Е).

• о

„ О ' •

О .

/ Л 4

-1-р-г

й, Ч 5"

Рис.4, А. Ингибирование ЭХП фракцией сыворотки крови

крыс при росте асыитной опухоли ОЯ. I - интактные крысы, 2 - после обработки сыворотки дрови контрольных животных кристаллическим витамином' А; 3 - 4(5) день прививки опухоли ОЯ.

4, Б. Изменение АОА фракций сыворотки крови крыс при Еавитаминозе (2) и при внутримышечном введении ^ -токоферола (I). 3 - контроль. На оси абслисс - номера фракций, на оси ординат -АОА одщшии.

Наши исследования в этом направлении частично подтвердили это мнение. При изучении этого вопроса животные содержа- 1 лись на специальной диете без витамина Е в течение 5-6 месяцев. Сыворотка крови Е-авигаминозных крыс обладала более выраженной СХП по сравнению с контролем (на 35-40$). После внутримышечного введения химически чистого -токоферола в количестве 20 мг на 100 г веса сыворотку (или печень) исследовали через 6 часов. Данные по СХП сыворотки и гомогената печени (рис.2, А) показали, что после введения Ч -токоферола интенсивность свечения снижается. В некоторых случаях па-

дение интенсивности СХЛ может достигнуть контроля (в зависимости от дозы сС -токоферола) и даже становится ниже контроля. Эти данные были подтверждены в опытах Ln v4ixo с контрольной сывороткой крови и олеиновой кислотой (рис.2, Б).

Далее сыворотку Е-авитаминозных крыс и крыс с введенным -токоферолом разгоняли на ионообменной колонке и исследо-Еачи АОА отдельных фракций (рис;4, Б). Было установлено,что АОА сыворотки крови Е-авитаминозных крыс существенно снижается в 3-ей фракции. После введения Ч -токоферола АОА именно 3-ей фракции повышается, не достигая контроля.

Туруфанов А.В. (1959), Штрауб В. (1965) и др. показали, что витамин А является противодействующим веществом липидных ч антиоксвдантов (антагонистом), присутствие его может нейтрализовать действие последних. Также считается, что А и Е витаминные системы взаимосвязаны, и токоферолы защищают каротины и липиды от перекисного окисления. В наших опытах с кристаллическим витамином А наблюдалось уменьшение АОА 3-ей фракции-сыворотки после ее обработки витамином А (рис.4, А). Обработка сыворотки раковых животных с асиитной опухолью ОЯ также привела к уменьшению АОА 3-ей фракции. АОА сыворотки в наших опытах снижалась и при добавлении в. диету витамина А и увеличении"в корме продуктов с повышением содержания каротинов.

Аналогичные результаты были получены в опытах, в которых сыворотку ультрацентрифугировали в поле градиента сахарозы и наиболее повышенную АОА обнаружили в поверхностной фракции ультраиентрифугата (рис.5, А). Црп дальнейшем фракционировании этой фракшш на' ионообменной колонке основная доля антиоксвдантов также приходилась на первые фракции колоночной хроматографии. В этих фракциях, в основном, выделяются липиды, фосфолипиды и липвд-содеркаше компоненты сыворотки, входяаие в'состав липопротеидных комплексов, обладающих АО свойствами. Как известно, 3 -липопротеид с мол. весом 3,2х 1(Р и удельным TjocoM 1,035 содержит 75% липидоп; н том числе, холестерин-эстерохолестерин, триглицериды и т.д. Мы предполагаем, что в наших опытах в верхней фракции ультраиентрифугата содержатся, в основном, эти компоненты сыворотки, предоп- • ределяшие основную АОА, подтверждением чего может служить изменение АОА при денатурации этой фракции на ЭХЛ. В опытах

с животными, которым была привита Саркома-45, АОА сыворотки изменялась именно в указанных фракциях.

з,в 1,0

Ь Г».

о —_ А— ¿ — Л-Г

Д—д-

"Т-1-1-1-1-1-1-1—у

1 * 3 Ч Л" 6 > .ъ

тЬ

Рис.5. А. АОА сывороточной фракции ультраце'нтрифугата посл§ ' разложения'на ионообменной колонке (контрольная сыворотка). Кривые соответствуют первой, второй и третьей фракциям ультраиентрифугата.

Б, Изменение АОА сыворотки в первых фракциях ультра- а• центрифуга-га. I - интактные крысы, 2 - Е-авитами-ноэные, 3 - опухолевые крысы, 4 - после внутримы- ■«' шечного введения -токоферола, 5 - сыворотка ]Ц)ови от больных белокровием, 6 - сыворотка крови .. здоровых людей.

Наконец, в завершающих опытах этих экспериментов проводилось изучение АОА отдельных фосфолипидов и общих липвдов при злокачественном росте (рис.6, А и 6, Б), в которых показали, что изменение АОА происходит, в основном, в фосфолипид-ных фракциях сыворотки крови, исследуемых объектов.

Таким образом, в этих сериях работ нами было установлено,' что при злокачественном росте в организме происходит серьезное нарушение равновесия ПОЛ^ЕАО, за счет количественного и качественного изменения лшшдных структур и эйдогенных антиок-

1А-

гЪ

А Л

гЬ

113 4 5 6

3.01.01,0-

з ч

Рис. 6. АОА в липвдных фракциях сыворотки крови.

I - общие липиды сыворотки опухолевых животных, (асиитная опухоль 0Я), 2 - общие липиды контрольных животных, 3 - фосфолипиды сыворотки крови раковых животных, 4 - фосфолипиды сыворотки контроль' • ных животных, 5 - фосфолипиды сыворотки здоровых людей, 6 - фосфолипиды сыворотки онкологических ' 4' больных (рак молочной железы).

Б, Динамика изменения АОА общих липидов сыворотки крови при развитии опухоли Уокера - 5,10,15 и 20 дни (1-4) после прививки опухоли. 5 - контроль.

сидантов. Все эти изменения хорошо отражаются на показателе способности сыворотки крови ингибировать ЗХЛ.

3.3. Спонт&нная_и_шущ11 ирманнал хешлошнесыеншя сыво-' £отки крови при°дщгкх_латологических состояниях. В ряде работ было показано, что при развитии некоторых форм патологии, например, при лучевом поражении (или воспалительных процессах) окислительные реакши в липидах или липид-содернсаших структу-

pax могут активироваться (Тарусов Б.Н. и сотр., 1967-1977; Попов Г.А., 1965).

Более того, Ломсадзе Б.А. и Тарусов Б.Н. (1970) выдвинули гшютезу о едином механизме лучевого и химического канцерогенеза. Отсюда - большой интерес к изучению СП сыворотки крови при лучевом поражении, которое шлос-т большое радиобиа- • . логическое значение.

В наших опытах крысы (самцы) облучались рентгеновыми лучами на установке РТУ-200-20-3 (РУН-II) с использованием-алюминиевого фильтра (толщ. I мм), по одному в специальных камерах со свободным доступом воздуха. Были использованы дозы 850 р, при которой животные погибали на 10 день после облучения, и 1500 р, после чего гибель животных наступала на 3 день. При изучении СХП сыворотки кроеи облученных животных (рис.7, А) оказалось, что после облучения дозой 850 р интенсивность СХЛ выше, по сравнению с контролем, и максимум свечения наблю- • дается на 6 сутки после облучения, после чего уровень СХЛ сыворотки снижается. Доза 1500 р вызывала более резкое усиление уровня СХП сыворотки, максимум которой совпадал со сроком гибели (на 3-4 сутки) животного. 'В экспериментах с индуцированным свечением результаты были идентичными. Эти данные подтвердились и в опытах In V i.-t_x о , когда сыворотку облучали дОза-о ми 50,100,150 Кр на установке ГУТ-С0-400 гамма-лучами. Ив этом случае была показана прямая зависимость между интенсивностью СП и дозой облучения. •

Эти результаты не противоречат классическим данным, со-' гласно которым, при действии радиации,, помимо прямого радиоли- ? за воды, происходит окисление липидов, особенно в .мембранных • структурах клетки (Козлов Ю.П. и др., 1972, Бурлакова Е.Б., 1975 и др.). Для подтверждения этого, нами были исследованы общие лплиды из мембран эритроцитов интактных и облученных ' крыс. На этих препаратах было показано, что количество ¡.RAI увеличивается, его максимум приходится на 7 ден:, после облучения 850 р, а динамика его изменения полностью сводится с динамикой СХЛ сыворотки облученных крыс (рис.7, А, кр. 4). Кроме того, из этих липидов получали искусственные бислойные мембраны (ЕЛМ) и изучали их некоторые параметры (электропроводность,

потенциал разрыва и время жизни БЛМ). Оказалось, что эти параметры сильно отличаются доя контрольных и опытных образцов. После облучения электропроводность увеличивается более чем на 2 порядка (от 1*Ю9 до 6,6*Ю-6 ом--'-), потенциал разрыва падает более чем на 60£, и время жизни БЛМ уменьшается. Как правило, такие изменения параметров БЛМ характерны1 для окисления лппидов (Ивков В.Г., Берестовский Г.Н., 1982). Эти данные прямо свидетельствуют о возможной связи СХЛ сыворотки крови с из-

. менением липидов в'мембранных структурах клетки, в данном случае, при облучении.

Рис.7, А. СХЛ сыворотки крови облученных животных (теш. изм. 60°С). I - контроль, 2 и 3 - сыворотка крови облучаемых животных дозами 850 (2) и . 1500 р (3),-4 - изменение ВДА сыворотки крови • после облучения крыс дозой 850 р.

•Б. Температурная зависимость СХЛ сыворотки крови .больных ПБ (2) и здоровых людей (3), 4 - действие -нафтола на СХЛ сыворотки крови больных ДБ. I - фон установки.

Другим примером нарушения метаболизма в организме служат

различные воспалительные процессы, ХЛ исследование которых в - • настоящее время широко проводится (Сологубова Т.И., 1986; Бе- ■ лых В.Б., 1984; Владимиров Ю.А. и сотрудники, I975-I99Ü и др.). Однако в этом отношении интересно было исследование СХЛ сиво- . ротки крови при периодической болезни, часто называемой армянской. Предпосылкой этих исследований явились данные, согласно • которым у этих больных повышается количество МДА. в плазме кро- * ви и снижается активность глютатион-редуктазы и концентрации с*. -токоферола (Назаретян Э.Е. и др., 1990,1993).

В этом плане наш изучалась СХЛ и индуцированная ХЛ сыворотка крови (или плазмы) доноров (15) и больных ПБ. Под наблю- . дением находились 23 больных в возрасте от 17 до 38 лет (мук- . чины - 14, женщины - 9). У 8 больных кровь брали во время приступа, у остальных - вне приступа. Измерение СХЛ сыворотки проводили при 39°С и в интервале 40-55°С. СХЛ регистрировалась, начиная с 39-40°С, и при дальнейшем повышении температуры ин- ' тенсивность увеличивалась с несущественным переломом в области 45-50°С. На рис.7, Б можно видеть заметное повышение уров-,ня свечения сыворотки крови у больных ПБ (кр.З), по сравнению с сывороткой здоровых людей (кр.2), которое ингибируется в присутствии 5•Ю-^ «ч -нафтола. Эти данные указывают на ПОЛ липидов сыворотки, которое интенсифицируется при ПБ. Такое-' а предположение имеется в литературе (Назаретян Э.Е. и др.,1990-' 1991).

ФХЛ сыворотки крови больных ПБ изучали при ее облучении полным светом УФ лампы ПРК-4 в течение 5 минут. И в этих опытах наблюдался повышенный уровень ФХЛ.сыворотки крови больных ПБ (рис.8, А, кр.3-5, отдельные опыты). Аналогичные эксперименты проводили и при изучении ЭХЛ сыворотки крови. Для этого использовали с,» /л раствор KCl в качестве электролита и платиновые электроды (^ =1 мм), расстояние между которыми составляло I см. На стационарном уровне ЭХЛ KCl добавляли 0,2 юг сыворотки, разбавленную в 10 раз электролитом ячейки. На рис.8, Б для наглядности приведены ЭХЛ отдельных проб сыворотки.

Как видно из приведенного материала, ЭХЛ дчя сыворотки крови ПБ всегда была выше, чем у здоровых людей. Большей интен-. сивностью ЭХЛ обладали пробы сыворотки крови, взятые во время приступа. Очевидно, что, исходя из этих данных, можно, предполо-i

жить, что при развитии ПБ ХЛ сыворотки крови увеличивается из-за нарушения равновесия ПОЛ^ЕАО в организме больного в сторону ПОЛ. Эти данные, в делом, согласуются с данными, полученными биохимическими методами (Акопян Г.С., 1992; Назаретян Э.Е., и'др., 1993).

Рис.8, А. ФХЛ сыворотки 'крови: I - фон установки, 2 - сыворотка крови здоровых людей и 3-5 - ФХЯ сыворотки ' крови отдельных больных ПБ.

Б. ЭХЛ сыворотки ировц: I - фон установки, 2 - сыворотка крови здоровых людей й 3 - сыворотка крови отдельных больных ПБ.

. . ' Анализ суммарных экспериментальных данных, полученных на- ми с помощью различных методов и подходов исследования, позволяет сделать вполне определенные заключения о наличии сушест-венных нарушений свободно-радикальных окислительных процессов, особенно в липидах и лшщдсодержаших структурах при патологических состояниях организма. Наиболее важный вывод, пожалуй, состоит а том, что указанные процессы вполне определенно огра-ааются на -СХЛ и индуцированной Ж сыворотки крови в. виде изме-

пения ее интенсивности и АО способности. Особу» роль, в регу-- • ляши постоянства ПОЛ и ХЛ в сыворотке крови (и в организме в пелом) играют, как показал/; наши исследования; системы регуляции процесса ПОЛ - эндогенные антиоксиданты. Очевидно, что уровень СХЛ, отражающий изменение ПОЛ при различных нарушениях, является биологически весьма важной характеристикой ' 1 для понимания процессов регуляции и механизма ПОЛ и может иметь отношение к системе регуляции гомеостаза в целом.

Полученные нами данные вполне согласуются с литературнj-ми (Журавлев А.И. и др., 1965-1985; Бурлакова Е.Б. и сотр., 1967-1975; Ломсадзе Б.А. и др., 1967-1970 и др.). Изменения липидов и фосфолипидов при злокачественном росте наблюдались также во многих ранних работах ( р>голк L., 1943; л\ottLs 13» 1966; Si ein £ , e-fc cii 1965 и др.).

Таким образом, впервые открытую нами СХЛ сыворотки крови можно считать одним из критериев, отражающих многие метаболические процессы, несущих информацию об уровне окислительных процессов в липидных и липидсодержащих структурах, в том чис-. ■ ле и в биологических мембранах. В связи с этим, СХЛ может являться показателем для оценки физиологического и патологического состояния организма. Анализируя полученные результаты, можно констатировать, что изменения параметров СХЛ сыворотки крови'как в норме, так и в патологии имеют общую закономер- ' ность. Изменение уровня СХЛ сыворотки прежде всего обуслоЕле- ,/ но нарушением равновесного баланса ЕЛО. СХЛ сыворотки крови, отражающая эти изменения, несет определенную информацию й может явиться критерием для оценки физиологического состояния ор-^ ганизма и в сочетании с другими клиническими данными может быть использована для прогностических л диагностических целей. В то же время нельзя не отметить, что эта информация не является специфичной и имеет скорее всего исследовательское значение для выявления природы и механизмов различных биологических' процессов.

В перспективе, не исключена возможность повышения специфичности СХЛ - информации с помощью разработки !более точных подходов, чувствительных, специальных методов, дозволяющих расширить спектр параметров исследования ХЛ.

• • . 32

3.4. Хемшюшнесиениия и пеЕею1сное_ок11сление_.лип^Дов_плаз-гатпческж_11_я2е£нт_ме1лбраЕ^ Основные липидные сдвиги, в том числе и ПОЛ, в организме при различных физиологических нарушениях могут быть отражением процессов, происходящих в мембранных структурах. Установлено, что ПОЯ биологических мембран сопровождается ХЛ (Владимиров Ю.А., 1969-1973,1977,1987; Мерзляк М.Н. и др., 1975 и др.), и это может быть одним из основных подходов для изучения различных мембранных процессов. Как в указанных, так и во мнопцс других работах в основном изучали • мндросомачьные, митохондриалыше и другие мембранные структуры. Однако в литературе практически отсутствовали данные по ХЛ плазматических и ядерных мембран (ПМ, ЯМ) клеток, большая роль которых общеизвестна. Поэтому в этой части работы нами исследовались ПМ и ЯМ методом ХЛ и ПОЛ.

Выделение ПМ проводилось по методу лЛсц^ь-» V, {■ «Л (1973), а ЯМ - методом в Л с £ £ I е< о-Е (1966) из печени дрыс. Химическое определение одного из конечных продуктов ПОЛ-мадоноЕого диальдегида (МДА) - по описанию с,*, с ^ сг-, (1978).

а. Исследование_плазштических мембран. СХЛ ПМ (60000) изучали в фосфатном буфере (рН 7,45 в объеме 3 мл (белок 700- ' 730 мг/ш) при 39°С и в широком интервале температур (40-60°С).

По нажим данным, влияние температуры на СХЯ ПМ описывает-'ся почти прямой зависхшостыо (рис.12). Однако в интервале 42-45°С наблюдается перелом на температурной кривой. Определение

- ^-д для СХЛ ПМ показало, что коэффициент Вант-Гоффа равен 2,6*-.2,7. Денатурация теплом привела к усилению СХЛ ПМ и сглаживанию КР1ПЮЙ температурной зависимости. Мы полагаем, что при этом одновременно происходит и окисление мембранных липидов и белок-липидных связей с последующим нарушением мембранной структуры, тем самым и ее функций, о чем свидетельствуют наши данные по изучению реконструкции ЕЛМ с помощью препаратов ПМ, обладающих повышенной активностью л^"1", К+ (АТФ-азы) (рис.9). В этих опытах регистрировались проводящие каналы в ЕЛМ в присутствии на-тизяых ИГЛ. После денатурации ПМ теплом дискретная проводимость исчезла, хотя общая увеличивалась, возможно; за счет взаимодействия ЕЛМ с окисленными липидами (рис.9, Б).

■ Также было залечено, что СХЛ растет и после диализа ПМ, что-, по всей_вероятности, связано с удалением из системы различных ионов, о чем свидетельствует усиление СХЛ после добавле-

ния на ПГЛ раствора ЭДГА. СХЛ угнеталась от добавления на дуализированные Ш Ca2+,fAn2+, Ft2+ (kohij. ICT2M). Очевидно, что эти ионы в данных концентрациях могут действовать как антиокислители и стабилизировать информацию ПМ. Обратная картина наблюдается при добавлении к препаратам ПМ ганглиозидов, имеших липидную природу и усиливающих GUI более чем в 2,5 раза. Все наблюдаемые эффекты, возможно, связаны как с конформашоннымк переходами ПМ, так и с изменением условий окисления мембранных ли-пидов при указанных воздействиях.

помощью препаратов ГОЛ.

А - нативные и Б - денатурированные мембраны.

В пользу этого свидетельствуют наш данные, полученные при изучении взаимодействия препаратов ПГЛ с флуоресцентным зондом АНС (1-анилинонафталин-8-сульфат) и с красителями эозин-ЕА и родамин 62. В этих опытах было установлено, что присутствие ведет к усилению ФЛ системы ПМ-АНСГ, Ганглиозида (100 мкг/мл)

(

также увеличивают интенсивность ФЛ, почти не влгшя на максимум 6Е АНС" (рис.10).

Рис.10. и Б^. Взаимодействие ганглнозидов с препаратами Ш в трис-ампнометан-НС1 буфере, рН 7;2 (А-]-) и в 50$ растворе даФ-диметилформамид (В^). _ - АНСГ-Ш,

----:—- АНСГ-ПМ в присутствии ганглнозидов (100 мкг/мл)

А2 и В2. Действие ПМ препаратов на'флуоресценцию эозина ЕА (А2) и родамином 6Я (В2).

---- свободный краситель

-- краситель-ПМ.

В этих экспериментах 4>Л исследуемых систем изменялась и от воздействия тепла, мочевины и от рН среда). Ми полагаем, что все полученные данные почти однозначно говорят о конформаыион-ных переходах в ИЛ при различных воздействиях, которые достаточно хорошо отражаются и на показателях СХЛ'ПМ. Эти данные соответствуют литературным (Кузьмина Е.И. и др., 1990; Варабой В.А., 1990; Козлов Ю.П. и др., 1972) и позволяют нам указать на возможность использования СХЕ метода для изучения конформа-ционных и фазовых переходов в липид-белковых структурах.

Таким образом, анализируя данные этих экспериментов, в первую очередь можно обнаружить связь показателя СХЛ с физико-химическим состоянием ГОЛ. По нашим некоторым даннш, котсрие не приводятся в данной работе (по действию ряда биологически' . активных веществ па ПМ), есть основание считать, что СХЛ ШЛ достаточно хорошо отражает и их многие функциональные аспекты.

б. Исследование_я^е£ных_мембран. В этих сериях экспериментов нами впервые была зарегистрирована СХЛ ЯМ (ВакаряН А.Е. и др., 1989), что впоследствии было подтверждено японскими авторами 6 «I «.+ «А 1991). Проводилось сравнительное изучение и СХЛ'некоторых фракций гомогенатов печени и мозга крысы (табл.5).

Таблица 5

Интенсивность СХЛ (имп/10 сек) некоторых фракций печени и мозга

Объект1 Супер-| Ядра 1 ЯМ верный Мито- Супер- | Синапто- 1

натант 1 матрико хонд- натант | сомы |

¡Параметр , гомог.- 1 ; 1 рии гомог. 1

печени ! I , мозга I 1

----

кони, белка мг/мл I СХЛ ими.-1с 10-12 5,5—7| 1 3,5 | 2,5 | 6,5 2,5 1 1 1,5-2,5 | 1

800+60 145+16Ц50+20, 86+16 12400+110 1290+95'2200+15' ! ___~ 1 _ ~___

схл - 80 24 | 40 | 35 1 45 515 ПО | 1

белок 1 I 1 1

Как следует из приведенных данных, есть существенная разница между интенсивностью СХЛ различных фракций на мг .белка образца. Из этих данных видно, что супернатант гомогената мозга, имеет более высокую интенсивность СХЛ, чем супернатант гомогената печени, что, наверное, обусловлено как высоким содержанием фосфолипидов; так и высоким уровнем аэробного-метаболизма в мозгу (Кагава Я., 1985). Супернатант гомогената печени, содержащий. суммарную фраки.™ микросом и митохондрий, а также свободных липидов, обладает интенсивностью свечения 80 имп/сек мг белка. Эта характерная интенсивность СХЛ супернатанта была наибольшей, по сравнению с таковой у ядер - 24+3 ,имп/сек мг белка, ) ' •, •

ядерных мембран - 40+4 ими/сек мг белка и ядерного матрикса -34+4 имп/сек мг белка. Такие различия СХД субклеточных фракций, как мы полагаем, связаны не только с разным количеством связанного липвда с мг белка в образцах, но и с известными различиями качественного состава липидов этих фракций.

Рис.II. Зависимость СХЛ ЯМ и ПМ от температуры.'I - СХЛ ЯМ, 2 - СХЛ ПМ и -3 - денатурированная ПМ. Б. Температурная зависимость СХЛ ЯМ в аррениусовых координатах.

Цри изучении температурной зависимости СХЛ Щ от 25 до • 60°С была.получена сходная картина со свечением ПМ (рис.II,А). II здесь в области температуры 42-43°С наблюдался перелом на температурной кривой и опять с последующим ускорением реакции СХЛ до 60°С. В аррениусовых координатах In.T-1/RT кривая зависимости JLii..X от I/T (к) I03 действительно имеет выраженный перегиб в вышеуказанной области (42-43) температур (рис.II,Б).

Полученные нами данные о температурной зависимости СХЛ ядерных мембран в целом согласуются с литературными относительно других клеточных структур и цельных гомогенатов (Тарусов Б.Н. и др., 1967, 1973; Scot R- ti <\<Р; 1991). Мы предпола-. гаем, что.некоторый спад интенсивности СХЛ ЯМ и ПМ в области

42-43°С можно объяснить резким изменением компактности Мембранных структур с последующим переходом в полное расплавленное состояние, когда лшшды более доступны к окислению, о чем свидетельствует дальнейшее ускорение ХЯ реакшы. Такое объяснение' подтверждается тем, что (¿а:)опий переход но наблюдается при СХЛ свободных липмдов, денатурированных ГИЛ и липопрот^кдов. Это в равной мере может относиться и к температурной зависимости СХЛ липопротеидов сыворотки крови. Однако мы душем, что помимо фазового перехода в мембранных структурах с повышением температуры происходит и денатурация белковых компонентов мембран, о чем свидетельствуют наши данные по изучению реконструкции ЕШ интактными и денатурированными препаратами мембран. Расчет . энергии активации из графика в Дррениусовых координатах для свободнорадшсалышх ыепных реакций при ПОЛ ЯЛ без прооксидан-тов показал, что ниже и зыпе фазового перехода значение этого показателя составляет 19,05 и 42,64 ккал/моль соответственно. Нами были подсчитаны и значения1коэффициента Вант-Гоффа (с?1в) для пределов температур 25-60°С. Так, фю =2607 в интервале . 30-40°С и 51в — 1,66 в интервале 40-50°С. Полученные значения также могут указывать на наличие физического процесса, лежащего в основе XI.

В опытах с кислородом была показана интенсификация СХЛ Ш в присутствии кислорода. Так, если в контроле интенсивность све- ■ чения составляла 150 имп/сек, го при продувании через суспензию ЯМ 100%-го кислорода количество импульсов доходило до 1200 имп/сек. Отмена продуваемого кислорода азотом приводила к резкому тушению ХЛ. Полученные результаты хорошо согласуются с данными работы ( £<:о{- ц. <<г «я-? 1991)..-

В экспериментах по изучению действия ангиоксидантов на СХЛ Ш выяснилось, что введение в суспензию Ш ^ -нафтола приводит к снижению интенсивности свечения ЯЫ в зависимости от * концентрации ингибитора (рис.12, А). Аналогичные'результаты . были получены и к опытах с .-токоферолом.

Таким образом, ЛМ и ГОЛ обладают способностью спонтанного свечения, что связано со свободно-радикальным окислением их лп-пидных компонентов. При анализе полученных данных и сопоставлении с литературными данными, можно предполагать', что биоантпок-сиданты достаточно, универсально защищают биомембраны'от ПОЛ.

Естественно, что не менее важную роль в процессе СХЛ биомембран играют и белки. Как будет показано дальше, при изучении модельных систем полученные суммарные результаты указывают на связь XI в цепочке Лишщ-Липопротеиц-Еиомембрана, существующих на разных уровнях структурной организации. Поэтому, возможно, что кроме классического подхода к антиоксидантам (лшшдпой шш иной природы), липиды мембран защищены от ПОЛ вторичным'механизмом - гидрофобными участками белка в лнпидном бислое. Предполагается, что они поддерживают структуру липидов по типу двусторонней обратной связи, триггером которой могут являться структурные изменения любого из мембранных компонентов.

'в. ПсследоБание_перекисного_ою1сленпя_л^ бран. Изучение перекисного окпслення липидов в различных фракциях печени крыс мы провели и химическим методом, следя за накоплением одного из продуктов ПОЛ - малонового диальдегида (ЦДА). Пнкубаши различных фракций, выделенных из мозга и печени крысы при 39°С' аэробно в среде 50 мМ Трис-НС1 буфера рН 7,6 без прооксидангов, приводила к накоплению ЩА. Сравнение началь-' них количеств МДА в супернатантах гомогенатов мозга и печени обнаружило одинаковое количество МДА (154 нМ/мг белка и 105 нМ/мг белка). Однако при последующей инкубации при 39°С в течение 60 млн количество ВДА в супернатанте гомогената мозга увеличивается в 4-5 раз, составляя 70+8 шд/мг'белка, а в супернатанте гомогената печени - 40+7 нМ/мг белка. .Было установлено, ■что в мембране нервных клеток уровень накопления МДА больше, чем в клетках печени. В то же время, во фракциях одного и того же органа - печени оказалось, что скорость накопления МДА в мпкросомах и ядерных мембранах была значительно ниже (0,1нМ/мг белкачшн); чем в супернатанте гомогената'печени-(0,5 нМ/мг белка'шн). Этот факт можно считать естественным, если учитывать, что липиды в микросомах находятся в структурированном упорядоченном состоянии, по' сравнению с супернатантом, где более высоко содержание свободных липидов, легче подвергающихся окислению. Так, .процесс СХЛ отражает реакцию рекомбинации (дис-пропоршюнированкя) Р0£ радикалов, а при дальнейшем окислении перекисей образуется ВДА, естественно, что между этими процессами мы наблюдали параллелизм с теш же количественными и временными, характеристиками.

Изучение ПОЛ в ядерных мембранах было проведено при индуцировании процесса различными системами: без присутствия про-оксидантов (нативная система) и при индуцировании ПОЛ Ге+ -ас-корбатом и ИАДФН-АДФ-Ге+2. Выяснилось, что цельные ядра и ядерные мембраны печени крыс подвергаются ПОЛ по двум путям -неферментативному и ферментативному. Неферментативная система инициации ПОЛ (Ге+2-аскорбат) для обоих субстратов: ядер и ядерных мембран - является более эффективной и приводит к большему накоплению МДА, чем ферментативная. Это также указывает на неферментативнуй природу СХЛ липидсодержащих биосистем.Кро-" ме того, стало ясно, что в последующем при изучении ПОЛ и ХЛ следует воспользоваться только Ге+2-аскорба? инициирующей системой, имея в виду ее большую эффективность.

Таким образом, процессы, лежащие в основе СХЛ, являются окислительными с образованием перекисей, так как они зависят от наличия кислорода и приводят к образованию одного из продуктов перекисного окисления липидов - малонового.диальдегида.

■ . • г. Хемилюшнесиеншя ядерных мемб£ан,_пнд;^гщо ванная железом. Ускоряющее действие металлических катализаторов на окисление -липидов связано с их способностью вступать в реакции с образованием СР. Наиболее- активными катализаторами являются'те,, которые окисляются по одноэлектронному механизм

В первом приближении активность катализатора связана с его окислительно-восстановительным потенциалом.- Известно, что ионы железа, в зависимости от их концентрации, могут инициировать либо ипгибировать реакции ХЛ, в частности в суспензиях митохондрий (Владимиров Ю.Л., 1985). При изучении взаимодействия с Ш мы сопоставили результаты параллельного иослодо-, вапия Ге2+-ипдушфйвашюго ИОЛ в ЯМ, полученные методом непре-' рывной регистрации, с результатами, полученными ХЛ методом, и методом химического определения ВДА и концентраты ферроионов (рис.12 Б).

Полученные результаты выявили сложный характер кинетики ХЛ ЯМ, который в основных черт£1Х соотиогстшгал кинетике изменения интенсивности ЮЛ по показателю ОДА. Как и в работе ^счеЦтчхеу ^ч<А,1986), мы также наолюдачи. наличие на крипой ХЛ 4 стадий г-, быстрая вспышка ХЛ, латентный период, медленная

вспышка и фаза стационарного свечения. Кривая накопления МДА также имеет ступенчатый характер. Начальный прирост МДЛ после введения Ге^+, очевидно, связан с ускорением разложения липид-1щх перекисей, содержащихся в Ш, и совпадает с фазой быстрой вспышки ХЛ. В течение латентного периода после,дней количество МДА не меняется. Дальнейшее развитие медленной вспышки ХЛ сопровождается второй ступенью накопления МДА с переходбм на стабильный уровень, соответствующий стационарной фазе ХЛ. При сопоставлении кинетических характеристик ХЛ и ПОЛ можно заметить, что развитие медленной вспышки ХЛ и основное накопление продуктов ПОЛ возникают после снижения концентрации Ге^+ до некоторой величины,'условно названной критической концентрацией Ге^+Х (Владимиров Ю.А., 1972, 1986). Важным параметром, характеризующим роль в мембранной системе, является количество при увеличении которого реакции обрыва цепей на начинают преобладать над реакциями с участием Ге2+, приводящим к образованию новых радикалов. Вследствие этого, кинетика ЮЛ при добавлении железа в концентрациях выше критической отличается на. личпем латентного периода в развитии РООН-зависимого окисления лппидов. Указанные параметры изучались в зависимости от начальной концентрации добавленного Ге^"1".- Оказалось, что эта зависимость почти линейна, а точка переселения этой кривой с осью абсцисс соответствует величине Ге^4* (около 40 мкМ), ниже которой латентный период отсутствует, а медленная вспышка сливает. ся с быстрой. При начальных концентрациях выше 40 мкМ амплитуда медленной вспышки остается почти постоянной и-практически отсутствует при более низких пичалышх концентрациях. Перегиб максимального накопления МДА. также был отмечен при начальной концентрации близкой 40 мкМ. Таким образом, все три при-

веденные зависимости указывают на одинаковую величину Ге Зти результаты дают возможность определить концентрацию Ге2+ без измерения кинетики накопления МДА.

Анализируя полученные данные,нетрудно заметить, что кинетика ХЛ дает общую картину'"протекания процесса Ге -индуцированного ПОЛ в ЯМ и позволяет в реальном масштабе времени про- ■ следить процесс СР окисления липидов и липидсодержащих структур. Поскольку основное накопление МДА приходится на медленную фазу ХЛ и приостанавливается после ее завершения, следователь-

Рис; 12. А. Влияние оС -нафтола-на CXJI ЯМ (3 мг/мл по белку).

Теш.измерения 39°С (цифры у кривых - конпентра-■ Ш1я ci. -нафтола в М). Б. Кинетика яелезоиндуиированной ХЛ ЯМ, накопления МДА. и окисления Ге (стрелкой указан момент введения 40 мкМ Ге2+).

но, при отборе проб.для определения МДА необходимо учитывать кинетическую фазу ХЛ и начальную концентрацию Ге2+, что.'к сожалению, не всегда соблюдается ( Вис. к «-'О- е<- 1983» Mlhetti. Cr- с. t 1989). Механизм каталитической актиннорта Iионов железа в этих реакциях может быть связан, по крайней мере, следующими типами реакций: .

1. Прямое взаимодействие иона металла с кислородом

Ион радихсал'О^, присоединял протон, легко переходит в радикал Н0£, который может инициировать цепь автоокисления.

2. Активация восстановления гидроперекисей в системе: .

Mc"+,V коои-ä*/bl4h"M,4"+"0H + K<V

Распад гидроперекисей происходит быстро с последующим образованием активных продуктов. Не исключено и образование комплекса металла с Og с дальнейшим образованием радикала Цо\ Эти рассуждения вписываются в общую картину: катализа металлами, и такой подход применялся в ранних исследованиях (Цг<Л /А, 1961; Козлов Ю.П. и др.,.1972 и ДР.).

д. Влияние гоЕмонов^на ПОЛ В экспериментах с ИМ мы уже наблюдали снижение уровня СХЛ при введении животным гидрокортизона п инсулина. Такие данные были получены и в работах других автороЕ при исследовании СХЛ сыворотки крови . (Серкиз Я.Н.; 1984). В других работах ( /ликКсч L^-C. С ^ »

1966; ei О?, 1987; ЭД^С к., e-f «ni , I9B6 и др.)

была замечена- способность стероидных гормонов влиять на процесс ПОЛ по-разному. В опытах Lb v'Lvtf и {.n v<-fc4. о изучались: прямое влияние на ыепное окисление ( SagLoKo к-1 e+'c\-f , 1987); на окислительно-восстановительные процессы,-ведущие к • изменению антиоксидантов•(Онисьёв Б.Н., 1989); действие на проницаемость мембран (Денисов Ю.П., 1974)' и др. Была" выдвинута гипотеза об участии стероидов в"регуляции ПОЛ в мембранах митохондрий (Владимиров Ю.А. и др., 1973). В этих и в других аналогичных работах практически не исследовалась ЯМ, что послужило основанием для наших дальнейших исследований.

Проведенные-нами в этом плане исследования показали, что введение 17- fi эстрадиола (близко к физиологическим дозам) крысам за 4 часа до забоя отражается на СХЛ ЯМ и на количестве î.iUA ЯМ, и при этом наблюдается сезонная зависимость этих изменений (рис.13, А и Б).

В осенних экспериментах (октябрь-декабрь) было замечено усиление СХЛ ЯМ, матрикса ЯМ и супернатантов гомогената печени и мозга. В весенних экспериментах (рис.13, А) эстрадиол не толь-•ко не увеличивает уровень ХЛ, но и, наоборот, заметно снижает ее интенсивность. Только СХЛ супернатанта мозга в наших опытах в эти сезоны не изменяется (общие наблюдения по 3 осенним и ве-,'сенним сезонам)/

Параллельно было показано, что АОА ЯЛ неодинаково осенью и EècHoft. Если в первом случае препарата, выделенные из интакт-ных животных, снижали амплитуду медленной вспышки ХЛ желточных липопротёидов .в 2 раза, то во втором - в 1,3 раза. Подобные

9 оо бои

э&о

Р1

А <Зоо Ьво Зм

хи

Рис.13. Интенсивность СХЛ (I, шп/сек) различных фракций, гомогената печени и мозга крысы в контроле (а ) и при воздействии 17- 0 эстрадиола (си ) в весен- . ний (Л) и осенний (Б)"сезоны.

данные в осенний сезон были получены вышеупомянуты;."! автора'/..-:, которым! одновременно изучалось и действие витамина Е. Нал: кажется, что сезонное проявление изменений ПОЛ и ХЛ можно объяснить с точки зрения'адаптационных механизмов, в основе кото- ■,• рых, в частности, лежат качественные и количественные изменения лигшдных апгиоксидантов. На это указывают и данные (Гевэрт-. кян Э.С. и др., 1986, 1907; Бурлакова Е.Б., 1969), свидетель- ' ¡ствуюшие о том, что изменение антиокислительной активности ли-пидов мембран взаимосвязано с изменением не только состава,но и количества фосфолипидов. По всей вероятности, весной, когда пул антиоксидантов в организме истощен, вводимые животным стероиды используются скорее как химические вещества АО природы, нежели как активаторы генома.

Установлено, что в отличие от эстрадиола ¡эффектор гппофи-зарно-адреналовой системы - гидрокортизон оказывает угнетающее действие на свечение ЯМ. Снижение СХЛ сывороткл крови при введении, крысам гидрокортизона было отмечено в работах (Серкиз

fi.И. и др., 1986). -Имеющиесл в литературе данные, полученные в модельных условиях, подтверждают тормозящее действие гидрокортизона на ХЛ и ПОЛ (Денисов Ю.П., 1974 и др.). Из этого следует, что активация гипойизарио-а'фепаловой системы регуляции ' гомеоетаза имеет защнтно-адаптаиионное значение, обеспечивающее снижение интенсивности ПОЛ и ХЛ.

Поскольку введение этих гормонов отчетливо влияет на ХЛ ЯГЛ, особый интерес представляло выяснить, какое -влияние на этот показатель оказывает типичная сгресс-реакшя, развивающаяся в отзет на пшоксический стресс. Лпя этого изучение изменений уровня СХЛ и ПОЛ ЯМ проводили после баро;самерной гипок-с;:н, соответствуете:! высота» 2500 л 8000 м. Еарокамерные раз-дра^ешш достигаюсь с помощью барокамеры Разрежение, соответствующее высотам 2500 и 8000 м над уровнем моря, достигалось в течение 4-8 минут. При этих степенях раз- • генешш крысы выдерживались 2 час (при 2500 м) и 15 мин (при ÊCC0 м), после чего производился "спуск" и декашггаиия животных. Данные, приведенные на рис.15, свидетельствуют о значительном увеличении СХЛ как супернатантов гомогената,-так и ЯМ па "высоте" 8D00 м. Это увеличение сравнительно ниже на "высоте" 2500 м. Одновременно значительно увеличивается и интенсивность ПОЛ. Так::е результаты были получены и в других работах. (Еабаян С.Б., 1286, 1990). Таким образом, было показано, что з механизмах развития гипоксического стресса важную роль игра--.е? усиление перекпсиого окисления мембранных липидов, которое при определенной степени активации и накопления иерекисных радикалои можот иоропооти отрасе-еиндром из звона адаптации в звена повреждения. Сдерживающим фактором этих процессов является пул эндогенных антиоксидантов (Бурлакова Е.Б., '1978,1983; Меерсон O.S., 1984).

3.5. Исследозание_хемгажганеспешш

Условия протекать иеферментативных СР процессов в би'осис-■ темах существенно отличаются от условий реакции окисления био-..молекул в модельных системах. Тем не менее, изучение этих систем^ привело к выяснению основных механизмов ХЛ в целом для химических а 'биологических процессов (Васильев В.Ф. и др.,1965).

Swnatant HH (8000 n)

300 250 200 ISO 100 50 0

Inp./Sec.

шшш

Control

Exptr.

□Iter»3»

"ipematant Ж-2. <6000 ti>

400 TO 200 J00 -0

hp.'S«.

ПЯЮМСЯЕШПЯТОП

Control

Exp*r.

ОЙ»ег«9в •

ж. (eooo я)

,Imp./Sec.

□Rverag?

Control Euper. I

Рио.14. СХЛ различных фракций гомогената печени 1фыс после барокакерной адаптации ("выоота" 8С00 ] 0» ..

Liu считаем, что изучение ХЛ в модельных системах дает вонмож- Д кость реконструировать основные показатели и закономерности ХЛ проноссов И1вых объектов, что может существенно повысить '. возможности интерпретации результатов, полученных на более \ сложных объектах.

Во-первых, дчя понимания роли белков в ХЛ процессах биологических объектов - п сыворотке крорп и в мембранных структурах га исследовали, в частности, модель водно-белково-липид-ной систем. Дчя этого на раствор белка (или нескольких белков) наслапвачи олеиновую кислоту. На границе этих фаз образуется пленка, толглша которой зависит от количества добавленной оле-иноеой.кислоты. Вначале регистрировалась ХЛ этой системы при температуре 30°С, которая по интенсивности была близка к спе-чен:н> ОК. В дальнейшем при данной температуре ХЛ усиливалась и через 2 часа перешла в фазу насыщения, превышая начальное свечение более чем в 2 раза. В это время наблюдалось постепенное увеличение мутности системы и исчезновение фаз. При замене" раствора белков сывороткой крови получили идентичные результаты. Температурная кривая (20-70°С) до 60°С была почти прямолинейной, после чего были замечены переходи, сложность которых зависела от взятой системы. Мы считаем, что в этих опытах, в первом приближении, нагл удалось .иллюстрировать участие белков . в СХЛ биологических систем.

Впоследствии аналогичные данные были получены другими ав- • • горами (Медведев В.М. и др., 1982; Журавлев А.Н. и ДР., 1983). Не останавливаясь на подробностях »тих экспериментов, отметим, что теыператз'рная зависимость свечения дпухфазной системы -водный раствор белка и олеиновая кислота, сыворотка крови и олеиновая кислота - имеет сплошную картину, особенно при относительно высоких значениях температур, что можно объяснить индивидуальными свойствами белковых компонентов системы.

Определенный интерес представлял и вопрос относительно взаимодействия канцерогенов с биологическими объектами. На примере сыворотки крови, нагл, как было показано Еыше, уже удалось показать наличие такого взаимодействия. Однако при изучении физико-химических аспектов канцерогенеза важно было выяснить воз- ' мозность взаимодействия.канцерогенов с белками прямым методом ХЛ, индуцированной HgOg. Для этого исследуемую смесь канлероге-

hod в кони. 5*10~3М (в растворителе Jjj.iSA) и белков в кони. 0,5$, дистантно добавляли необходимое количесвт IL^O^, а зат^м регистрировали ХЛ с постоянной записью. Было обнаружено, что ПЛУ при взаимодействии с И0Э,, лолст вспышку УЛ, интенсивность

«V С

которой сштаптся экспоненциально. В присутствии бплкоя Х.1 ха-. рактприо изменяется для каниир1. гглншх i: »г-каипорг.гоиних ПЛУ. При этом, величина иптогралтлюй интенсивности 7JI нах'дптся в обратной зависимости ит канцерогенной актиг.тсти ис!:ытуе:л;х ПАУ. Для определения взаимодействия ПАУ с белками нами бати выбраны три из них - антрацен в качестве некакиер'генного вещества, дибензантрапен (ЛБА) с относительно слабой канцерогенной активностью и ДМЕА как сильный канцероген. Поскольку все используемые белки дают ХЛ с I^Og, взаимодействие белка с канцерогеном определяли по К = I^f + K)/lj" + 1]с> К. был принят как коэффициент взаимодействия. Приведенные в таблице 6 данные показывают, что при взаимодействии с I^Og ХЛ белков неодинакова. В присутствии ПАУ уровень ХЛ меняется. Пб значению К видно,, что испытуемые -ПАУ неодинаково реагируют с разными белками. Только в смеси альбумина с ДВА, антраценом и гистоноыс ДЕА Ка 1,0, во всех остальных случаях К 1,0, т.е. присутствие канцерогена приводит к уменьшению интенсивности ХЛ, которая коррелирует с канцерогенной активностью ПАУ (с некоторыми исключениями). Эти эффекты, как видим, сходны с данными, полученными нами при изучении СХЛ сыворотки а присутствии разных ПАУ. Очевидно, что результаты, полученные на модельных системах разной сложности, в целом отражают картину основных процессов, пр-,ис- ' ходящих на меточном уровни. Эти результаты согласуются с данными, которые были получены методом ЭПР ( H« L de ? в «.к* vcv-, Qi л.С , 1956; Je, et с/ с Z Р., et ¿)>f, I960), согласно которым в ' аналогичных реакциях показано наличие взаимодействия канцерогенов с белками с образованием свободных радикалов.

IIa основании этих и других литературных данных,мы предполагаем, что с помощью такого подхода при изучении какцерстенно-сти различных соединений можно получить ли:иь предварительные характеристики, что немаловажно, поскольку с помощью такого экспресс-теста можно изучить не только канцерогенные вещества, но и ингибиторы, радиозащитных, антиокекдантных и др. биологачес-ки ваяных; соединений (Эмануел Н.М., 1970, 1976;Е>урдйн К.С'., .1976 il др.).

Поскольку d некоторых наших экспериментах мы изучали и ■?ХЯ сыворотки крови и полученные результаты трактовались с позиции ФХЛ белков, считали целесообразным отдельно изучить этот вопрос в модельных системах. С этой целью исследовали СХЛ различных белков, особенно САЧ, в различных условиях рП и экепозшкшх облучения полным -УС?-с лотом ртутной лампы ПРК-4. Были получены кинетические кривые ФХЛ растворов САМ при рН 7 = и 9,5. Процесс затухания 0X71, как было показано, в обои слу-^ чаях имеет друхстадийпый характер. После перпого быстрого затухания (до S0 сек) следует более медленный спад ФХЛ с соот-' ' ' ветствужигл константами скоростей, которые зависят от значения рН. По углу наклона полученных ароморфозов были определе-. ны константы скоростей снижения начальной интенсивности ФХЛ. Сна составляют К = 3,15*Ю~4 сек-1 и 1'9 5 =2,1*Ю-4 сек-1.

полагаем, что это связано с конфомаиионнш! переходом в молекуле САЧ и разрушением остатков триптофана. Мы изучали и спскт тры флуоресценции САЧ в идентичных условиях. При длине волны "X =290 нм, где поглощают,преимущественно, трпптофанплы, интен-• спвность и положение максимума ФЛ в указанных значениях рН не ' изменялись. Однако после облучения УФ-светоы и в зависимости от дозы облучения интенсивность ФЛ падает, и максимум смещается э коротковолновую область. При 30 мин облучении этот'сдвиг составляет 12-14 им (рН 7) и 8-10 нм (рН 9,5). Были определены константы скоростей фотораспада трнптойапплов для медленных состазлягдих: К? = З'Ю"4 сек-1 и Kg 5 = 2* КГ4 сек"1, что близко г: значениям соответствующих констант для ФХЛ, что подтверждает сгязь ФХЛ с фотглизом трпптофановых остатков в белках при УФ-сблучении. Аналогичные результаты были получены и при изучении трппепка, пепсина, аргиназы, лакгатдегидрогеназы и других белков. На ФХЛ белков влияла их денатурация теплом, при кото-".рой наблюдалось уменьшение константы скорости снижения интенсивности. -нафтол не приводил к полному исчезновению ФХЛ, а продувка 0% образца не сопровождалась заметным усилением ,-ФХЛ реакций. Эт;г факты дают основание считать, что, тем не менее, есть существенное различие между ФХЛ отдельных белкоЕ и , - сложных систем (сыворотки). Ясно, что во Етором случае большой вклад в .этот процесс могут внести продукты ПОЛ (кетоны, альдегиды-и др.)-, которые yse при х^- 250 нм-могут поглотать УФ-

Таблица 6

Интегральная интенсивность хемилюминесиеншш (I) и коэффициент взаимодействия (К) полиниклических углеводов с белками

Интенсивность хемилюминеслен-.ции(1) в относительных единицах и коэСои-пиент взаимодействия (К)

Гистон

РНКаза

Трипсин Альбумин

ДНКаза иротампк-,сульфат

11,5 0,7 15,5 0,7 11,5 0,7. 35,6 1,0 2'9,5 2,3 76,2 3,5

1дба~21,1;

=1,32

(ДБА+белок)

ДОБА+белок

36,50 1,25 1,100 0,040

46,60 4,60 0,250 0,С22

чантрацен+белок)

36,80

2,65

17,00 2,31 11,50 0,70 82,20 4,59 32,8 0,65 73,6 4,2

1 0,460 0,065 ' 0,310 0,022 1,450 0,080 0,65 0,013 С,75 0,063 1ШЕА=165; =1.32

28,00 2,80 40,60 1,50 87,6С 5,20 47,50 5,19 88,90 3,60

0,160 0,024 0,220 0,010 0,440 0,020 0,24 С,СЗС 0,37 0,013

^нтраиен^6'6; 1-68

21,90 1,68 27,60 1,90 69,50 2,60 34,10 2,^0 55,ЗС 1,65

«Э

0,990 0,070 0,5900,040 0,740 0,050 1,120 0,045 0,61 С,060 0,540 0,014

лучи за счет образовавшихся диеновых, трпеновых связей (Владимиров 1С1.А. и да., 1989). Все это дает основание считать, что при изучении £ХД сыворотки крови, несмотря на явную билтжую ■ природу £П, суцеотвенную роль играют и лшгадн, и их промену-TO'ii'.ne ¡>озоукдешше продукты. Возможно, ото п яиляетоя связующим звеном между CXJI п ФХЛ сыворотки, подтверждающим мысль о том, что в этом случае липиды, ненасыщенные жирные кислоты и их конъмГированние системы могут являться эмитерами ФХЛ.

В мембранах и других биологических системах антиокоидан-ты существуют в двух формах: окисленной (хинонной) и восстано-.пленной (фенл~ьной). Из них только фенольные формы, имеюише свободные гидроксильные группы, могут активно взаимодействовать о F0*. .Переход между этими формами происходит в ходе реакции ПОЛ. Следовательно, вещества, способные восстанавливать хннон-нке фо£!ми природных антиоксидантов, будут увеличивать общую АСА системы, являясь синергптамл природных АО. Как правило, . роль спнергитов выполняют вещества, имеющие возможность легко переходить.из одной формы в другую. Наряду с этим, при пзуче-н;::; модельных систем, особенно их 0XJI, важно учитывать роль активных форм кислорода, которые могут появляться и при окислении некоторых субстратов молекулярным кислородом ферментативным путем ( bitij r. 44 л-Е » 1964; Rc\jAtop«\icvr» к. ei- <?)-£■ 1964), например,

ксантин + 20о .ксантилокоцраза^, шч#1{_та + 2-oi

к.,

Hai: .кажется, что эта модель достаточно хорошо момст иллюстрировать переход хпнонов в гыдрохпноны на примере окисления п восстановления Sffi'Hg ионами железа при фотоокислении, тем более этот процесс имеет прямое отношение к механизму XI и ПОЛ. Кроме того, эта модель имеет отношение и к механизму биолюмиаес-. иениии- через известную люшйеррин-лшийеразнуго систему, основным компонентом которой является ФЖ'Е,.

При изучении ФХЛ Ciffi'Hg обнаружили, что действие ионов , • Ге + и Ге°+ на 5ХЯ <ЖЖ при pH 7,2 неоднозначно. При их добавлении до обручения ЗМН лампой ПРК-4 Ге2+ приводит к увеличению ФХЛ -более чем в три раза, тогда_как Ге°+ не действует на нее.

-нафтол- полностью тормозит ФХй при концентрациях 5*Ю~3М. Продувание-атмосферного кислорода через систему сопровождался

усилением ФХЛ, что может свидетельствовать об увеличении активных форм кислорода, особенно *02.

Анализ этих данных позволяет считать, что ФШ при облучении переходит в семихинонную форму через одноступенчатый про-тонообменный механизм реакции:

-ё, -н+

ШН'Но < I ®И'Н ^ +е, +Н+

-ё, -н4;

1 аш* +ё, +Н+

Эти пропессы могут быть сопряжены:..

• -ё ■

Ге2+ %==± Ге3+ +ё

Поскольку при УФ-облучении ФМН и при других .воздействиях (например, при пропускании кислорода через систему) в пропессах . имеется возможность образования-*02, то восстановление Ге3* может осуществляться и другим путем:

Ге3+ + «Од -» Ге2+ + 02

Эта реакция является достаточно универсальной для ХЛ многих биологических объектов, в которых, как правило, присутствуют ионы железа и кислорода. Из них ионы железа в больших концентрациях выступают как антиокоидапты.

Этот вопрос ми изучали и методом ЭПР (РЭ-1201, моди¿или-: рованный в лаборатории космической биологии МГУ) при облуче-' нии образца непосредственно в резонаторе (плоская кварцевая кювета, I мл) фокусированным светом лампы ДСШ-1000, X > 365 с конечной концентрацией ФМН II в этсм случае по--

ны и Ге3+ взаимодействовали с ФШ по-разно:.ту (рис.15, А). Как по величине сигнала ЭПР, так и по величине полуширины максимального наклона (л Н) взашодействие Ге3* сильнее, чем с

■ что подтверждает справедливость вшесриведенного объяснения.

Существенным оказался и тот факт, что присутствие ионов

! * '

А Н-201С

хс

Рас. 15. ЭПР спектры свободного, радикала 5Ш в присутствии различных металлов.I - контроль, 2 - АШ + Ге2+, . , 3 - £ЛН + Ге3"1".

,Б. Действие Ге3*" и некоторых белков на ЭПР спектр СШ. I - контроль, 2 - ШИ + трипсин, 3 - СМИ + пепсин;, 4 - СШ«+ трипсин + Ге , 5 - ШН + пепсин + Ге3*.

железа по-разному влияет на взаимодействие белков с 5?¿H (рис. 15, Б). Если трипсин и пепсин почти одинаково сникалг сигнал ЭПР ФМН, то Ге в комбинации с трипсином сильно снижает ЭПР сигнал, тогда как в отдельности .не влияет на него. Из этих результатов очевидно, что белки могут участвовать в CP процессах, следовательно, они могут и реагировать с радикалами при ХЛ реакциях, выступая в роли вторичнцх эмитероз свечения.

Таким образом, на приведенном в данной работе экспериментальном материале удалось показать широкие возможности хемшш-минесиентных исследований для изучения биологических систем. В случае регистрации спонтанного свечения (СХЛ) биопроб получается информация, минимально искаженная в процессе самого исследования, и, очевидно, достаточно адекватно монет отражать процессы, протекающие в исследуемой биологической системе. Как показано на полученном экспериментальном и клиническом материале, в норме и при злокачественных новообразованиях определение' интенсивности СХЛ сыворотки крови и ее АОА, особенно-, в динамике, позволяет улавливать достаточно тонкие и быстрые . изменения этого показателя под влиянием экзогенного введения или эндогенного выброса АО веществ, регулирующих в тканях организма интенсивность ПОЛ и обусловленного ¿пл СХЛ. Отнзситель-. ное усиление СХЛ при лучевом поражении и воспалительных процессах (например, ПБ) также обусловлено нарушением динамического равновесия ПОЛ БАО за счет изменения пула антиоксидан-тов, особенно Ч, -токоферола,в организме.

Основным субстратом, на котором-развертывается процесс НОЛ, являются биологические мембраны, среди которых ванное значение имеет и ядерная. Изменения интенсивности ПОЛ :: ХЛ ¡ сыворотки имеют, вероятно, отраженный характер, усредненный по отношению к сдвигам, происходящим в отдельных органах и мембранных структурах их тканей. Поэтому полученные результаты по изучению ЯМ и ядерного матрнкса, как нам кажется, могут иллюстрировать возможности Х)1 для обнаружения изменения структуры и функции мембран и, вследствие этого, более или менее значительные нарушения жизнедеятельности тканей, органов а организма в целом.

По нашим представлениям, промежуточным звеном-кевду био-

логическими жидкостями (сыворотка или плазма крови) и биомембраной монет являться двухфазная модельная система: олеиновая кислота-белок или олеиновая кислота-сыворотка крови, отражающая систему липпд-липопрогеид-биомембрана. При изучении такой ■ модели нам удалось показать существенную роль белков в механизме хемплюминесиеншш. С помощью изучения модельных систем и разных вариантов ХЛ метода, основанных на усилении естественного сигнала свеченая мы показали наличие адекватности в полученных результатах.

Итак, в норме процесс свободнорадикального ПОЛ удерживается на"стационарном уровне, благодаря функции БАО систем организма, реализующейся на субклеточном (биомембраны),, клеточ-. ном, тканевом, органном уровнях и на уровне цельного организма. В норме существует, следовательно, равновесие ПОЛ БАО, обеспечивающее оптимальную жизнедеятельность на фоне минимальной интенсивности ПОЛ..

' Впервые открытое нами сверхслабое свечение сыворотки (плазмы) крови (Закарян А.Е., Тарусов Б.Н., 1966, 1967) и спонтанная хемллкшяесцениия плазматических и ядерных мембран (Закарян А.Е. и др., 1989) могут считаться одним из критериев, отражающих многие метаболические процессы, протекающие по сво-боднорадикальному механизму в липидах и липидсодержащих'структурах, в том числе и в биологических мембранах.

• Выдвигается гипотеза о функциональном значении СХЛ кванта, быполняющго роль триггера для регуляции некоторых тонких" клеточных процессов. Она основывается на предположении о том, что квант СХЛ может при расстояниях, близких к химическим спя-гям, поглощаться соответствующими хромофорами (флавины, убихи-' ноны и т.д.), переводя их в возбужденное состояние. Последние могут способствовать запуску других более высокоэнергетических процессов. Следовательно, параметры СХЛ и индуцированной ХЯ могут рассматриваться как источник уникальной информации и как объективный показатель для Оценки физиологического и патологи-_ ческого состояния организма. В сочетании с другими клиническими данными, они могут-быть использованы для прогностических и диагностических лелей; - ,

выводи

1. В данной работе исследовано свободнорадикальное.переписное окисление липидов и липвдсодернашнх структур от уровня-моделей до уровня биологических систем. Изучена спонтанная и инлуиированная хемилшиньсшпшин бслок-лшпинюй системы, сыво-. ротки (плазмы) крови, плазматических и ядерных мембран. Установлены кинетические, температурные и концентрационные закономерности переписного окисления липидов в указанных система-'. Выявлена прямая связь между параметрами хемилюминеспенпии, пе-рекисного окисления свободных и структурных липидов и прпсут- . ствием'эндогенных и-экзогенных антиоксвдантов.

2. Установлено, что спонтанная хемилюминеснишия исследованных систем является результатом свободнорадикальных окислительных процессов, происходящие в липидных, липопротеидных -л ~ мембранных структурах с'обшшгмеханизмом свободнорадакальногэ' ; перокисного окисления липидов. Выявлено, что уровень хемпл^.а-несиешши биологических систем отражает интенсивность метаболических процессов организма и может измениться при патологи-1 ческих'нарушениях. ,

3. Показано, что интенсивность спонтанной и индуцированной хемилюминесиениии сыворотки крови человека и животных (бег} лые крысы) подавляется при наличии у них злокачественных опу--' холей и усиливается при лучевом поражении и воспалительных процессах (периодическая болезнь), по сравнению со здеровы/.- ' организмом. Установлено, что эти изменения связаны с нарушением раиновесия эндогенных липидных антиоксидантов, суммарная . активность которых повышается в сыворотке крови при злокачественном росте и снижается при лучевом поражении и периодической болезни.

4. Впервые нами обнаружено сверхслабое спонтанное свечение препаратов плазматических и ядерных мембран и ядерного ; матрикса клеток печени крыс. Установлена темпе^турная зависимость спонтанной хсмнлюшшесиешши двухфазно I ,'истомч люи-. ■ новая шюлота-болок и указанных мембранных структур. Она имеет двухступенчатый характер с точкой перегиба ;;лд мембранных

структур при 42~43°С, что связано о фазовым переходом лшщдов

' ' '

мембранного бпслоя, а также с возможной денатурацией их белковых компонентов. Такие переходы обнаружены и для сыворотки кро-' ви (50-55°С), и для двухфазной бедок-липидной системы (60-65°С);

5. Установлена зависимость интенсивности хемилюминесиен- ■ еип исследуемых систем от воздействия кислорода, антиоксидан-тов и ионов железа. Показано, что процесс перекисного окисления липидов и спонтанная хемилюмине спешил ядерных мембран изменяются при взаимодействии In v v в некоторых биологически активных соединений. Выявлен сезонный характер влияния 17-

эсградпола на спонтанную хемилюминесиеншпо и скорость пере- . кнсного окисления липидоз ядерных мембран и ядерного матрик-са. Предлагается гипотеза о возможном существовании связи гормональной регуляшш адаптационных процессов со свободноради-кальным окислением липидов в тканях организма.-

■6. Выявлено, что в механизме спонтанной хсмилюминеспен-дии' слоеных биологических систем свой вклад как вторичные эми-теры могут внести, кроме липидов, и белки. При индуцированной • хег.глюмпнеспенпии биосистем роль вторичных эмитеров могут играть липидп. Показано, что модельные системы в общих чертах " отражают оснозные закономерности хемилюминесиеншщ биологических объектов, хотя могут иметь свои частные механизмы. На основании изучения модельных систем, можно не только выявить природу и механизмы свободнорадикальных реакций в биологических объектах, но и раскрыть механизмы действия экстремальных _ факторов, в том числе химически активных веществ, на кипой ор-ганиз

7. Совокупность данных экспериментальных исследований и результатов изучения сгободнорадикального цепного окисления липидов и лилидсодержащих биологических структур дает возможность с новой позиции подойти к оценке биологической роли сво-беднорэдккальго окисления липидов и липидных структур и сформулировать положение о свободнорадикальной патологии. При этом перекиское цепное окисление липидов является неспецифическим •звоном и отражается в виде реакции хемилюминесиенции. Пред-, ставяение о свободнорадикальных процессах как о молекулярном " механизме развития патологии и других физиологических сдвигов можно рассматривать как рабочую гипотезу, поддающуюся- экспери-

"ментачьному анализу и опытной проверке.

8. Показано, что регистрация хешлюминесцениии биологических систем может рассматриваться как источник уникальной информации о протекающих в них метаболических процессах, как объективный и очень чувствительный показатель степени смещения равновесия ПОЛ ЕЛО. Такая информация может тлеть значительную научную и клиническую ценность при изучении механизмов нарушения физиологического состояния организма. Измерение хемилюминесиентных эффектов может служить дополнительным диагностическим тестом для различных заболеваний, особенно в ранних стадах их развития.

СПИСОК РАБОТ, ОПУШКОВАШШХ ПО ТЕЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Закарлн А.Е., Тарусов Б.Н. Изучение сьерхслабого свечения плазмы крови при злокачественном росте. Бгофпзика, 12, 567-568, 1967. • ■ .

2. Закарян А.Е., Тарусов Б.Н. Исследование актиохлслл-тельной активности фракций сыворотки крови ингибированием хе-" шлюмийесиеныии при'малигнпзаиий.'Биофизика, 12, 739-741,1967.'

3. Закарян A.B., Тарусов Б.Н. Ингибирование хемилюмине-сце!шии плазмой крови при злокачественном росте. Биофизика,. . • II, 919-1968.

4. Закарян А.Е., Тарусов Б.Н. Исследование сверхслабого свечения больных раком. Бгол. МОИП, 1969. ' -

5. Закарян А.Е., Кочур H.A., Тарусов Б.Н.-Изменение кнги-бирующей активности сыворотки кропи у Е-апнтамлиозиых и гииер-витаминозпых крис; Кн.:"Физико-химичсские тхатзт злокачественного роста". М;: 'Изд-во 1Д01Ш; 96-98, 1970. '

6. Закарян А.Е., Кочур H.A., Тарусов Б.Н. Сверхслабая хе^-ми.шошнесиенция сыворотки крови онкологических больных.'¡Ch.: •,

. "Физико-химические'механизмы злокачественного роста". М.: Изд. МОИП, 99-103, 1970.'

7. Закарян А.Е., Тарусов Б.Н. Сверхслабое свечение сыворотки крови при развитии злокачественных опухолей. Кн.: ко-химические ■ механизмы, злокачественного роста". М.: Изд.М0ПП, 103-106, 1970. • ••

8. Закарян А'.Е., Акопян Т.Н. О хемилшинейпенппи ряда кан-

церогенных веществ и их взаимодействии с некоторыми биополимерам:;. Вторая научная сессия по вопросам молекулярной биологии и биофизики. Тез.докл. Ереван, 1970, с.17.

9. Бакарян А.Е. Исследование индуцированной хемшшмине-сиенции соединений белкового ряда при окислительных процес-' сах;' "Сверхслабые свечения л'медицине и сельском хозяйские", Тез.докл. с.15, Москва, 1971.

10. Закарян А.Е. Хемилшлнесценшш полициклических углеводородов и ее изменения от некоторых биосубстратов. "Сверхслабое свечение в медицине и сельском хозяйстве". Тез.докл., с.15-16, Москва, .1971. ' "

XI, Закарян AJE., Акопян Т.Н., Паносян Г.А. Определение • взаимодействия полишислнческгас углеводородов с болгсами методом хемплюминесиердши. Биофизика; 5 , 769-774, 1972.

12. Закарян А;Е,, Геворкян М.Л. Хешлюшнеспенция некоторых гемопротепдоЕ, возникающая при их окислений перекисью водорода, к действие ингибиторов на это свечение. "Биойнтиокис-лителп и регуляп'ия окислительных процессов в клетке". Тез. докл.,'с.38, Москва, 1972. • ■■

13. Саркисян К.П., Геворкян М.Л., Закарян А.Е. О хемилю-' шаеспенппи, возникающей при взаимодействии гемоглобина с перекисью водорода. Тез.докл.республиканской конференции молодых физиков Армении,'Изд.АН АрмССР; Ереван, 1973.

14. Геворкян М.Л.,'Закарян А.Е., ДавтянМ.А. О фотохеми-лшшесненши аргиназы. БЕА, 9-, 44-49, 1974.

15. Закарян А.Е., Тнраыуян С.Г. Действие аденинсодерка-

ШХ' СООД;111й!ШЙ ЦП ('ЮТОХОМПЛЮМШЮСИегШШО фЛйШШОИуКЛеОТПДа.

Тез.докл.11 конференции Ереванского физического института, с.68, 1975.

16. Закарян А.Е., Тирапуян С.Г., Паносян Г.А. О взаимоде ствип индуцированного свободного радикала флавиннононуклеот! -да с ионами металлов переменной валентности. KLl.;9, 1975.

17. Сакйрян А.Е., Гевбрйян М.Л., Тираиуян С.Г., Гонян С Карагулян Э.А., Паносян Г.А. Исследование хемилюшнесыенции гемоглобина и соиолизатоп эритроцитов кропи при изаимодейст

'вии с ILp , Тез.докл.симпозиума "Биофизические свойства аде ви", Саранск, IS75.' • • ' • ■

18. Закдрян А.Е., Авакян А.Б., Паносян Г.А. О взаимоде}

ствии препаратов плазматических мембран с красителями эозином ЕА,' родамин ом БК. -Б2А, I¡¿, 65-69, 1976.

19. Геворкян М.Л., Закарян А.Е., Демин Ю.1.1. К вопросу о фотохемилюминеспениии белков. Ученые записки ЕГУ, 1,78-63, 1976. '

20. Закарян А.Е., Секоян Э.С., .Егиазарян А.Р. Исследование взаимодействия флуоресцентного зонда 1-ан:1лпнонафталнн-8- , сульфоната с препаратами плазматических мембран. БЕА, 5, 527532, 1978. : \

21. Закарян А.Е., Геворкян М.Л. Исследование хемллкмпге-сценпии-системы гемоглобпн-Н^Ог,. Биофизика, 3,564-568, 1579,

22. Закарян А.Е., Мхитарян А.Г; Спонтанная хе;л^:-::.г.не-сцешшя плазматических мембран. Тез.докл.на конферешппГВю-люминеспеншш". Ивано-Франко, 1981.

23. Закарян А.Е. Информационные возможности хем^лгмине-сценпип при изучении биологических процессов. Тез.докл.конференции "Биолюминесценция". Ивано-Франко, 1961., • '

24. Закарян а.е., Мхитарян А.Г. Выделение субъединиц

К (АТФ-азы) методом препаративного электрофореза е полиакрлл-. амидном геле. Тез.докл. 3 республиканской научной сессии по1 вопросам биофизики,'78, Ереван, 1982.

25. Геворкян М.Л., Закарян А.Е. Фотохемилюмикзсиенлпя растворов белков при длительном облучении ультрафиолетовым ^ светом. • Е?2А( 65-70, 1985.

26. Геворкян М.Л., Закарян А.Е. Влияние химической мо;д- ^ фшсашш -бромсукпинамидом на сенсибилизированную фотохеми- , люмипесисншш растворов аргиназы. Ученые записки ЕГУ, I,' 98103, 1985. ' • .

27. Закарян А.Е., Погосян Г.А. Модификация бислойных фос-фолипидпых мембран'прополисом.■ БКА, 6, 77-82, 1985.

28. Закарян А.Е. Исследование сиерхслабой спонтанной хе-милюмннесыениин плазматических мембран в присутствии'аденнд-циклэргичоских соединений. 3 республиканская конференция "Достижения физико-химической биологии ¡г биотехнологии ц пути

их внедрения". Тез¿докл. Ереван,•1989.

• ' 29. Закарян А.Е., Погосян Г.А., Цагшсян А'.Р., Товдасян Н.С. Спонтанная хемилюминесиенция клеточных структур после действия 17- эстрадиола. 3 республиканская конференшя ''До-

стпгення фпзико-хпмической биологии и биотехнологии и пути их внедрения". Тез.докл. Ереван, 1989;

30. Закарян А.Е., Цагикян А.Р. Модифицирование фосфоли-пндных бислс^иых мембран под влиянием мшсросомальной фракции почечных клеток. Тез.докл.3 республиканской конференции "Достижения физико-х;м!ческой биологии и биотехнологии и пут их внедренля". Ереван; 1989.

31. Закарян А.Е., Цаглкян А.Р., Погосян Г.А. Установка для регистрации сверхслабой хег.ашоминесцениии биологических объектов. ЕНА, I, 51-54, 1990. ' '

32. Закарян А.Е., Погосян Г.А., Цагикян А.Р. Проводимость бислойных фосфолипидных Мембран в присутствии мицросом

, KVATw-азнои активностью. Ученые записки ЕГУ, I, 99103, 1991.

' ' 33. Закарян А.Е., Погосян Г.А., Цагикян А.Р., Паносян Г.А. Спонтанная хемплюмпнесценния ядерных мембран печепн крый при действии эстрадиола и гидрокортизона. ЕКА,'3, 1991. '

34.- Гукасян Т.Е., Гонян С.А., Закарян А.Е., Паносян Г.А. Исследование светопндуцировагшых изменений электрзкинетичес-кого потенциала хлоропластов. EZA,•I; 19-24, 1992;

35. Закарян А.Е., Назгретян Э.Е., Акопян Г.С.; Саркисян . А.Р. Изучение хешлюмпнесиеншт плазм крови человека при периодической болезни. I научно-практический съезд медиков Армении. Тез.докл., Ереван, 1991. 1 • '

36. Закарян А.Е., Назаретлн D.E., Акопян Г.С. Интенсивность хег.п:лг:л!нсснен1шп плазмы крови у больных периодической болезнью. Ж.Экспериментальная и клиническая медицина, 1-2, 66-6S, Ереван, 1993." ■• '

37. Закарян А.Е., Погосян Г.А. Сезонная зависимость воздействия 17-ß зстрадиола на хемилюминесыекшю ядерных мембран

клеток"печени вдыс. Тез.докл.5 съезда Арм.физиолог.общ-ва, Ереван, 1994.

Qf. S^JiiJT

Ï2plu»bfr iqlnruMtiub <ut^te^uupiabfr ¿gknja^frp frpun¿n

Sufupjub UpSkb Ъ%ПП1>

I ,1[ кЬишраЬш^шЬ U. «Aifjir frb ^miful^up^kpn t«/ ifrffrt^kpfr

и^иш loi» f fr í^u ¿uj fr Ь 9fufri}ugnnfp bngjujnnf U т/Ш/fn — Щ-frujnuS¡ , , ♦

*3 . tt jf^te _ pfrntfriКи

Xjk рЦш j и t¡ui i ui¿¡vmi*uhfp !/iitT'lm* t uipjwb ufrin ^l^fr , ^fr^fr^-u^fr-«Z^nif iuJ t^^"¿¿ир^Г fr t g fr и* nu¡ ^im^íTimíp fr It. I^nftfr^rn^m

jfrb ßuriuibpii к p fr jkSn itffrbku gkhg fruj fr U. ifraffrlbkp fr Vf un ¡uM^fr— lfj"imj{Л +k(iljufrr¡iaj frb Ifufryu/ifiaii n tu o tJlii*ufrpn ub g "I6*—

pn i_n^frut{iMb iqpngkubkgfr «"ufi/utui^ * l^tfiir lu^nu« i^ulf i/t ¿ ifrnpi t 4¿ ir [¡Ьг^^шЬпкР fUI gUÍ<UIJ (rtir £ tuifutlfJMp^hpri Lif Lfr^frl^ Ь rfr

^kplfUfr'îul«/^^ t^ufriaftTuh II u^uui n.iMi}frl^uiiMjfrb Wkfrati fr^tfbkp fr Jfr¿¡4,

frb^hu la L n J.U я íi/biaufrpk ¿ qpubg fnifrnfr,n n ¿utpnpuit^ Xikpfr, íunu^uj/tutj frb i¡_íuu¡l>M*f fr f ujMfi(»4r puQub tnrit°k.

pjtob II nprt£ ¿¿ir Ьиирш Ь\а t^ui 1/ ut^utfri¿ bjfiipypfr шц^г} к g n i&j ub b"*-Jt t T^'t» T tikbuu fubwlftMb twiSut^upikpfr j к tí* n LJ frbk lj ¡ kb.. g frmb mpwiMgn Lif t Qp^tübfr^Jfr tfrq_frn ¡_n^frul^ub ¡¿friul^g I |

U. t^kbr}wbfrbkpfr lapjub и fr£n tt^fr rt tun ц/Ьши frpn L&jt»V Ê/igi/шЬи í^

i¿ír¿ t» np ^uprtpml¡_ " inn Lgjbkpfr цир^ш g Stab pbpisgfn uf¿«ií|/i flr_ tfn Ljn íiffrbku gkbgfrmj fr frbinkbufriln n il/p fc, Off

t/j f> tu frt¿whr¡n n kp fr ^ui/uLui^ ¿1 Lr}4iat¿tMAui[ip % u¿n ц/ /^iif'a«

^uÊjtfltfuié fc, л ^ miuijifuibuii¿<i pi^utb t ip^tMbfritfn 41/ ífr^ifriuj frb ,

ufrlfr'&bpfr i i/uLfUi/y iflnl^n^kpn t_fr ¿uit/u ifrntfrnfr/п t.Pjñ t,bbkpfii¿g &k p*»

tjtejn ii/u к p ¡^mjbnpkb t¿i*wupt¿rt nf kV *r*»ppkp

(ЛШ tflllt ¡_Ш prt pUH/in p frm V к p П ,.1/ t^^frb frt^Ull^Ulb К fr^ubt^n iPj n ib\j к p fr ЬоЁ^т

,bti^uili ufriuinpngifiub U. ipubg tftfr" lmn^-friJtJ fr "i**puMpubSmb Ьы^ииплt [Jnuifui Г Llf t t¿ /1 If Ш nAtr}frljl» l^iaj frb M¡Ш^п ^n^frw fr ^

puipkpju i t Ршдш 4tajui>¿k i t t^npfr^uif3wriuibf9bkpfr p? ^t* frl*j frb I ju fr— ' tjugJuib ^.npêpbpwgfr ifrntfrnfrtn ' ß tvi/i/vui," ■ ¿/i к . ^fripni^np— ,

uifrt^nîéfr "ilkgn uíijui/p L. кЪ/Зшцр^я tW t »^T ^»pkpb^gfr i^up^un¿npiSuib Sbupuit¿np ^njn ißjti t ; ^

I/in utgi¿uk uipijn i.bfbkpp lf*pntktr frU^ki ^fririMl^bf mj If—. ¡

Информация о работе

Закарян, Армен Егорович
доктора биологических наук
Ереван, 1995
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы