Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Суспензионная культура пшеницы (Triticum aestivum L.) и ее использование в генетико-селекционных исследованиях

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Суспензионная культура пшеницы (Triticum aestivum L.) и ее использование в генетико-селекционных исследованиях"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ Інститут фізіології рослин і генетики

^ л .

■ ^ Волощук Ганна Дмитрівна

№ УДК: 633.11:581.143.6:631.524-57.083

\ ^

СУСПЕНЗІЙНА КУЛЬТУРА ПШЕНИЦІ ТШТІСиМ АЕБТІУиМ Ь. ТА її ВИКОРИСТАННЯ В ГЕНЕТИКО-СЕЛЕКЦІЙНИХ ДОСЛІДЖЕННЯХ

03.00.12 - фізіологія рослин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ-2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Миронівському інституті пшениці ім.

В.М.Ремесла УААН.

Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук

ГІРКО Володимир Сергійович,

Миронівський інсппуг пшениці ім. В.М. Ремесла завідувач відділу біотехнології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник САРНАЦЬКА Вереса Василівна, Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, провідний науковий співробітник

кандидат біологічних наук ПАНЮТА Ольга Олександрівна Київський Національний університет ім. Тараса Шевченка, доцент

Провідна установа: Інститут клітинної біології та генетичної

інженерії НАН України, м. Київ

Захист відбудеться еУ ”^2000 р. о -/& годині на засіданні спеціалізованої ради Д 26.212.01 при Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (03022, Київ-22, вул. Васильківська, 31/17).

Автореферат розісланий “її” -ТУ 2000 р.

Вчений секретар ^-7 У*

спеціалізованої вченої ради Мордерер Є.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальність теми. Пшениця (Triticum aestivum L.) — найважливіша іродовольча культура для економіки України — як об’єкт біотехнологічних маніпуляцій вивчена недостатньо. Основна увага як вітчизняних, так і зарубіжних іослідників була приділена калусним культурам. Займаючи проміжне місце між салусними і протопластними культурами in vitro, суспензійна культура, з одного 5оку, має ряд переваг над калусними культурами, а з іншого — є джерелом іротопластів. Роботи, що стосуються суспензійної культури пшениці, носять іереважно фрагментарний чи феноменологічний характер. Тому детальне вивчення ;мов індукції і культивування суспензії пшениці як модельної системи, зокрема, іридатної для оцінки впливу різних стресових факторів, є актуальним.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась і рамках Державних комплексних науково-технічних програм: 1986-1990 pp. — D.CX.01 «Сельскохозяйственная биотехнология» (№ держреєстрації 0187.0028535); і 991 -1995 pp. — «Фундаментальні дослідження» (№ держреєстрації UA 01009537Р);

! 996-2000 pp. — «Теоретичні основи селекції і насінництва сільськогосподарських сультур» (№ держреєстрації 0197U019452)

Мета робот» — визначити і оптимізувати умови отримання суспензійної сультури пшениці, а також розробити методи оцінки селекційного матеріалу по зяду господарсько-корисних ознак з використанням суспензійної культури. Для іосягнення цієї мети необхідно було вирішити такі задачі:

І. Випробувати різні способи індукціїта підтримки суспензійної культури пшениці. !. Оптимізувати умови культивування гетерогенної суспензійної культури пшениці. !. Провести дослідження реалізації морфогенного потенціалу в гетерогенній суспензійній культурі.

І. Розробити критерії і методи оцінки генотипів на стійкість до сольового, іонного, осмотичного стресів та стійкість до грибних патогенів в модельних умовах. Об’єкт дослідження — культура in vitro пшениці.

7редмет дослідження —■ показники росту та розвитку суспензійної культури різних генотипів пшениці при різних умовах культивування.

Методи дослідження — методи культури in vitro, світлової мікроскопії, варіаційної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Удосконалено методи отримання ювгоживучих гетерогенних суспензійних культур пшениці з високою швидкістю >осту: оптимізовано умови ініціації та підтримки суспезійної культури за типом :кспланта, складом поживного середовища, періодом субкультивування, придатні іля різних генотипів. Вперше показана адекватність реакції гетерогенної

суспензійної культури пшениці як модельної системи на ряд біотичних (культуральн фільтрати грибних патогенів Fusarium graminearum, Pseudocercosporell; herpotrichoides, Septoria tritici) та абіотичних (сольовий, осмотичний та іонний стрес факторів. Встановлено, що найбільш придатним критерієм оцінки реакціїклітинни: культур є кількість життєздатних клітин в дисоційованій фракції гетерогенно суспензійної культури.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені методи оцінки генотипі пшениці на стійкість до фузаріозу колоса, септоріозу листя, церкоспорельознс кореневої гнилі, засолення, закислення та засухи в клітинних культурах можуть бут елементом як біотехнологічних, так і традиційних селекційних програм. Отримаї результати оформлені у вигляді брошури “Методические рекомендации п получению суспензионной культуры мягкой пшеницы и ее применению селекционно-генетических исследованиях in vitro” і можуть бути застосовані в робо: наукових та селекційних установ. За матеріалами роботи подані 2 заявки н винаходи.

Особистий внесок здобувана полягає в тому, що ним безпосередньо здійснен планування, підготовка та проведення лабораторних досліджень, проведено анал експериментальних даних, зроблено висновки. Персональний внесок здобувача проведенні дослідів та отриманні експериментального матеріалу складає не мена 80 %, а у наукових працях, що опубліковані в співавторстві — 40-70%.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались к Міжнародній конференції «Агробиотехнологии растений и животных» (29-30 ма 1997, Киев); IX International Congress on Plant Tissue and Cell Culture «Plai Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century» (Jerusalem, Israel, June 14-1' 1998); II International Symposium on Plant Biotechnology (4-8 October 1998, Kyiv); Міжнародній конференції «Використання сучасних молекулярно-генетичних біотехнологічних розробок в генетико-селекційних дослідженнях» (м. Одеса, 1998 Міжнародній конференції «Наукові основи стабілізації виробництва продуки рослинництва» (м. Харків, 1999).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 наукових праць. З них 6 стат« у провідних фахових виданнях.

Структура роботи. Дисертація містить список умовних скорочень, всту загальну характеристику роботи, огляд літератури за останні 40 років, опі матеріалів та методів дослідження, виклад результатів та їх обговорення (4 розділі-висновки, перелік посилань і 2 додатки. Робота викладена на 160 сторінк; машинопису, містить 25 рисунків і 16 таблиць в основній частині та 12 у додатка Список літератури налічує 295 посилань, в т.ч. 199 публікацій іноземними мовам

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В роботу включали 10 сортів озимої пшениці Triticum aestivum L. та гібриди F, і F2. Суспензійну культуру ініціювали з калусів, одержаних з незрілих зародків (1013 діб після цвітіння), а також з основ листків і кінчиків корінців асептично вирощених проростків та безпосередньо з незрілих зародків (1-2 мм) і незрілих суцвіть (5-30 мм) у середовищі MS (Murashige, Skoog, 1962) і SD (Sears, Deckard, 1982) з 2-5 мг/л 2,4-Д та 500 мг/л гідролізату казеїну, при ініціації з основ листків модифікованому по Fe-ЕДТА згідно з Мезенцевим і Костенком (1987), і культивували на качалці шейкерного типу (180 грш) в темряві при 26°С.

Подальше культивування утвореної гетерогенної суспензійної культури (ГСК), що містила поодинокі клітини і рихлі групи з 5-20 клітин (дисоційована фракція), а також дрібні і великі (до 2 мм) глобули (агрегована фракція), здійснювали двома способами. При першому — через 3 тижні після ініціації її фільтрували через тканинні фільтри. Агреговану фракцію відкидали, а дисоційовану культивували далі, додавши поживне середовище (1:1). Другий спосіб, описаний Negrutiu і Jacobs (1977) для Arabidopsis thaliana, протилежний першому: дисоційовану фракцію максимально декантували, а до агрегованого осаду додавали свіже поживне середовище і продовжували культивування. Першу заміну середовища проводили через 2-3 тижні після ініціації суспензії, потім — кожні 7-14 діб. Крім середовища MS, при цьому використовували середовища В5 (Gamborg et al., 1968), Masuda (Masuda et al., 1981), T (Dudits etal., 1975), SH (Schenk, Hildebrandt, 1972), AA (Toriyama, Hinata, 1985) з 5 мг/л 2,4-Д.

Під мікроскопом спостерігали морфологію клітин та клітинних агрегатів і визначали кількісні показники росту. Густину клітин в дисоційованій фракції визначали без мацерації з допомогою скляної камери (King, 1984). Загальну кількість клітин (N) обчислювали як добуток густини на об’єм дисоційованої фракції. Вміст білку в фільтрованій суспензійній культурі визначали методом Лоурі в модифікації Hartree (1972). Відносну життєздатність клітин (v) оцінювали по плазмолізу в гіперосмотичному розчині сахарози за Widholm (1972) і виражали як відношення кількості плазмолізованих клітин до загальної кількості клітин у полі зору. Кількість життєздатних клітин (Nv) обчислювали як добуток загальної кількості клітин на відносну життєздатність. Проводили також візуальний контроль росту і морфогенетичних реакцій в агрегованій фракції в рідкому середовищі і після висіву на агаризоване середовище MS в різних модифікаціях. Перші 7 діб після висівання чашки тримали в темряві, потім — в умовах 16-годинного фотоперіоду.

В дослідах, які моделюють вплив несприятливих абіотичних та біотичних факторів зовнішнього середовища, до основного середовища MS додавали 0,01-0,4

М №С1 (сольовий стрес); 5,10 і 20 % ПЕГ-6000 (осмотичний стрес); 0,4, 1,2 і 2 мМ А1-ЕДТА (іонний стрес), а також 2-50 % (об/об) культуральних фільтратів грибних патогенів Ривагіиш §гашіпеагит БсІшаЬе, Рзеибосегсозрогеїіа herpotгichoides Ргоп та ЗерЮгіа Ігіїісі ЯоЬ ех Оезш (вплив токсичних метаболітів при фузаріозі колоса, церкоспорельозній кореневій гнилі та септоріозі листя, відповідно). Як контроль брали середовище МБ без селективних агентів з відповідним рівнем 2,4-Д.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

ОТРИМАННЯ СУСПЕНЗІЙНОЇ КУЛЬТУРИ ПШЕНИЦІ

Після перенесення калусів у рідке рухоме середовище утворювалась гетерогенна суспензія, яка містила великі (до 2 мм) і дрібні (5-50 клітин) агрегати клітин та одиничні клітини паренхімного і меристематичного типу. Після перших 18 діб культивування суха маса гетерогенної суспензії зростала майже в 4 рази, густина клітин складала біля 100 тис. кл./мл. Це свідчить про задовільні умови культивування. Після фільтрації вихідної гетерогенної культури вміст білку через 6 діб зроставу 1,7 раза,через 10 діб — майже в 3 рази, надалі стабілізувався. Густина клітин в суспензії після фільтрування через 1 шар тканини зростала в 2,5 рази за 28 діб, а потім після розбавлення в 1,5 раза не змінювалась. Після фільтрування суспензії через 4 шари тканини спостерігали значне уповільнення росту густини клітин порівняно з суспензією, профільтрованою через один шар. При плейтінгу фільтрованої суспензії в таке ж по складу, як і рідке, агаризоване середовище через 1,5 місяці спостерігали появу невеликої кількості дрібних (до 2 мм в діаметрі) колоній, частина з них утворили калуси, які на середовищі для регенерації не проявляли жодних морфогенетичних реакцій. Отже, одержана фільтрована суспензійна культура підтримувала здатність до росту протягом обмеженого проміжку часу (до 30 діб), досягала недостатньо високої густини (менше 100 тис. кл./мл), не зберігала морфогенного потенціалу. Модифікації базового середовища МБ за вмістом гормонів (НОК, ІОК, БАП, зеатин), амінокислот (Ь-глутамін, Ь-аспарагін, Ь-пролін), співвідношенням нітратних та амонійних іонів не приводили до покращення параметрів суспензійної культури. Така суспензійна культура має обмежене використання в біохімічних та фізіологічних дослідженнях, але малопридатна для генетичних та селекційних досліджень в клітинній культурі.

Оскільки культивування дисоційованої фракції, отриманої після фільтрації, не давало бажаних результатів, було випробувано альтернативний спосіб: культивування агрегованої фракції. Заміна дисоційованої фракції свіжим середовищем викликала ріст агрегованої фракції і відновлення або навіть наростання густини в дисоційованій фракції — знову утворювалась гетерогенна культура.

Густина одиничних клітин в дисоційованій фракції ГСК протягом циклу :убкультивування зростає по Б-подібній кривій (рис. 1 .А), яку найбільш адекватно зписує модель Річардса (Я2 = 0,96-0,98 при р<0,001), але залежно від генотипу коефіцієнти моделі відрізняються. В кожному наступному циклі густина клітин зростає (рис. 1 .Б), після 6-9 циклів (в залежності від сорту) спостерігається насичення. Всі досліджувані генотипи хоч і відрізняються між собою, мають досить високі показники росту.

Час культивування, доби Fakta -о- 80117

Са8055

Рис. 1. Густина клітин в дисоційованій фракції суспензійної культури пшениці:

А — протягом двох суміжних циклів для сорту Миронівська 808; Б — в кінці кожного циклу культивування для різних сортів.

Отже, гетерогенна суспензійна культура, на відміну від фільтрованої, забезпечує швидке наростання біомаси, в тому числі високу густину одиничних клітин протягом багатьох циклів.

З метою вибору оптимального експланту для ініціації суспензійної культури пшениці, крім калусів, використовували незрілі суцвіття, незрілі зародки і фрагменти асептично вирощених проростків. Всі ці експланти містять меристематичні клітини і індукують суспензійну культуру з достатньо високою швидкістю росту. Найменші економічні затрати дає використання в якості експланта основ листків (leaf base) асептично вирощених проростків, які можна отримувати з сухого насіння незалежно від сезону на відміну від різного типу незрілих експлантів, які придатні тільки на певних стадіях розвитку донорної рослини. Використання калусів різного походження пов’язано з додатковими затратами.

З метою вибору оптимального середовища було випробувано 5 середовищ: Гамборга В5, Masuda, Т, SH, АА,які інші автори рекомендували для культивування

саме суспензій. Агреговану фракцію ГСК, ініційованої з основ листків сорту Балкан, розділяли на 6 рівних частин і культивували в 6 середовищах: МБ та 5 вищевказаних з 5 мг/л 2,4-Д. Через певні періоди проводили заміну дисоційованої фракції свіжим поживним середовищем і аналізували під мікроскопом як дисоційовану, так і агреговану фракції (табл. 1). За сумою всіх показників дані середовища можна розмістити в ряд в порядку зниження: М5>5Н>Мазисіа>Т>В5>АА. Середовище МБ було найбільше придатним, але 4 наступних також можуть бути використані для культивування суспензії. Виняток становило середовище АА — в ньому спостерігали сильний некроз клітин агрегованої фракції, що зумовлювало низьку густину і гірші показники одиничних клітин в дисоційованій фракції.

Таким чином, гетерогенна суспензійна культура пшениці при циклічній заміні дисоційованої фракції свіжим поживним середовищем підтримує здатність до росту протягом тривалого часу.

МОРФОГЕНЕТИЧНІ РЕАКЦІЇ В ГСК ПШЕНИЦІ

Оскільки основним регулятором росту, який забезпечував дедиференційованиЕ стан суспензійної культури, був аналог ауксину — 2,4-Д, а в калусних культурам для регенерації використовують середовища без гормонів або з низьким їх вмістом було досліджено вплив періодичної зміни вмісту 2,4-Д в середовищі культивування суспензійної культури. Середовище МБ в двох модифікаціях: з 5 мг/л 2,4-Д (МБ-5) без 2,4-Д (МБ-О) по черзі замінювали кожні 3 доби в одній групі зразків і кожні 1 діб — у другій. Досліди проводили на сортах з різною культурабельністю: Балкан і Миронівська 808.

В середовищі МБ-О в кінці кожного періоду в дисоційованій фракці: налічувалось в середньому в 1,5-2 рази менше клітин, ніж при культивуванні в се редовищі МБ-5, при цьому зростала частка клітин меристематичного типу (табл. 2) Ця залежність була більше вираженою в обох сортів у варіанті досліду Т = 7 діб. А ще чіткіше при повторному культивуванні агрегованої фракції ГСК сорту Балкаї в середовищі МБ-О (позначено Балкан* в табл. 2).

2,4-Д впливала також на стан агрегованої фракції. При короткочаснії відсутності 2,4-Д в середовищі (Т=3 доби) морфологічних змін, видимих неозбро єним оком і при мікроскопії давлених препаратів, не було виявлено, відбувалосі тільки наростання маси агрегованої фракції без ознак диференціювання. Тільки і кінці другого місяця при повторному культивуванні в середовищі МБ-О протягом : діб в агрегованій фракції обох сортів з’являлись одиничні ознаки ризогенезу В режимі Т = 7 діб вже після першого циклу культивування в середовищі МБ-О і агрегованій фракції сорту Балкан з’являлись численні кореневі примордії, а з частини зразків сорту Миронівська 808 почався інтенсивний ріст коренів, як

Таблиця 1.

Аналіз росту гетерогенної суспензійної культури пшениці сорту Балкан при

Се- редо- вище Пері- од куль- тиву- вання, доби Дисоційована фракція Агрегована фракція

Густина в кінці періоду, тис. кл./мл Середня швидкість росту, тис.кл./ мл/добу Частка дрібних і середніх клітин Життє- здат- ність* Стан ядер: чіткі дифуз- ні Морфо-ло-гія ** Серед- ня оцін- ка

М8 7 832,75. 118,96 0,54 + ч > д 3,9

14 1260,55 90,04 0,63 + ч > д 4,4 4,08

18 2004,86 111,38 0,55 ч > д 4,0

БН 7 786,72 112,39 0,47 ч~ ч = д 4,3

14 1021,13 72,94 0,43 +. ч >> д 3,5 3,95

- 18 1282,99 71,28 0,60 -І- ч » д 4,2

7 805,76 115,11 0,37 +. ч > д 3,6

Мази- 14 965,81 68,99 0,47 ч < д 4,0 4,00

<іа 18 1370,07 76,12 0,48 + ч < д 4,0

Т 7 565,10 80,73 0,44 4*- ч < д 2,9

14 743,66 53,12 0,50 + - ч > Д 4,2 3,71

18 1829,51 101,64 0,38 - ч > д 4,4

в5 7 993,24 141,89 0,36 + ч > д 2,4

14 1137,30 81,24 0,42 - ч > д 3,3 3,53

18 1896,50 105,36 0,28 — ч > д 4,3

АА 7 751,14 107,31 0,60 + ч < д 2,0

14 717,92 51,29 0,56 ... ч < д 2,5 2,30

18 46,14 2,56 0,20 ч << д повний некроз

ІІІР05 189,40 20,40 0,12 0,4

Примітки:

* + до 5% порожніх ** 1 - крихкі агрегати, що складаються з долгих і

клітин, уламків і т.п. крупних прозорих клітин;

+ - до 10 % - 2 - крихких агрегатів більше, ніж щільних;

- до 20 % - 3 - порівну;

— до 50 % - 4 - щільних глобул більше, ніж крихких агрегаті»;

—- до 75 % - 5 - щільні глобули (до 1 мм), що складаються

— більше 75 % - з дрібних клітин.

досягали 2 см в довжину. В культурі сорту Балкан ризогсисз починався толі, як частину агрегованої фракції було повторно залишено на 7 діб ц середовищі МЯ-О.

Вивчали також морфогснетичні реакції в глобулах агрегованої фракції ГСК сорту Балкан (культивованої в середовищах МБ, БИ, Маяисіа, Т, В5) після висіву на агаризовані середовища МЯ з 5 і 1 мг/л 2,4-Д,М8 з вітамінами по ЯіаЬа, 2 мг/л БАП і 0,5 мг/л ЮК і МБ без регуляторів росту з 10 % гомогенату незрілих зернівок. Через 2-3 місяці спостерігали помітний ріст, з’являлись корені і зелені крапки, траплялись ознаки некрозу. Найбільш придатним виявилось середовище з гомогенатом незрілих зернівок. З 5 рідких середовищ для культивування ГСК

Таблиця 2.

Кількість клітин в мліі.(і) та частка (2) клітин меристематичного типу в процентах від загальної кількості в дисоційованій фракції суспензійної культури пшениці в кінці періоду культивування_____________________________________

Сорт

Середовища

МЯ-5

МБ-О

\lS-5

МБ-О

М5-5 М5-0 МЯ-5 М5-0 МБ- 2,2 МБ-О МБ-1,5 МБ-О

Балкан

Мироніи-ська 808

З доби

5,34 2,22 5,40 3,02

26,3 12,3 54,3 51,2

1,70 0,65 1,04 1,25

10,7 1 1,5 30,7 17,3

7,41 2,64 7,16

20,8 53,6 51,4

1,44 0,92 1,50

24,5 18,4 48,3

3,82

60,0

1,24

50,1

9,58

20,9

2,52

19,4

5,17

65,0

1,50

63,3

10,71 5,52

74,8 96,0

2,97 1,30

24,0 68,3

Сорт

7 діб

мэ-г

МБ-О

М5-5

МБ-О

МЗ-5

М5-2

Балкан

Балкан* Мироніи-ська 808

6,50

45,6

2,17

19,3

3,57

63,2

1,49

25,0

12,50

16,2

1,51

16,3

8,07

68,1

1,10

67,0

12.05

12.5 МБ-О 95,5

1,53 13,0

7,44 28,2 2 1 0,82 18,5

ШІ*05для (1) = 0,34; ШР05для (2)=8,8

кращими виявились БН і Мавшіа, дещо гіршими — МБ і Т; середовище Гамборга В5 було найменш придатним для збереження морфогепного потенціалу.

Після висівання агрегованоїфракції ГСК сортів Балкан і Миронівська 808, які культивували почергово в середовищах М8-5 і МБ-О, на агаризовані середовища МЯ з підвищеним вмістом сахарози (60 г/л), зниженим вмістом 2,4-Д (0,1 і 0,5 мг/л), 0,5 мг/л зсатину і 1 мг/л АБК спостерігали ознаки некрозу різного ступеню, ризогенез та появу зелених крапок. Істотних відмінностей між сортами не виявлено. Морфогешшй потенціал краще зберігався при режимі заміни середовищ з періодом

З доби, що узгоджується з результатами спостережень за станом суспензійної культури в рідкому середовищі. Зсатин і АБК виявляли позитивний ефект у варіантах Т - 7 діб.

Отже, культивування гетерогенної суспензійної культури в середовищі без

2,4-Д супроводжується процесами диференціації клітин в поверхневих шарах агрегованої фракції і індукцією ризогенезу. Це характеризується уповільненням процесів розтягнення клітин і зміцненням міжклітинних зв’язків. Тому дисоційо-вана фракція відрізняється меншою густиною і збільшенням частки дрібних клітин меристематичного типу. Глобули агрегованої фракції, висіяні на агаризованс середовище, продовжують рости, в них спостерігається ризогенез і поява на світлі зелених крапок. Морфогспетичні реакції посилюються на середовищах з додаванням абсцизової кислоти, зеатину і природних фізіологічно активних речовин у виґляді гомогенату незрілих зернівок.

ДІЯ АБІОТИЧНИХ ФАКТОРІВ НА СУСПЕНЗІЙНУ КУЛЬТУРУ ПШЕНИЦІ

Введення в поживне середовище різних селективних агентів дає змогу вивчати їх дію на культуру на клітинному рівні, а при адекватності реакції з’являється можливість використовувати суспензійні культури як тест-систсму для оцінки генотипів на стійкість до несприятливих умов. Ріст гетерогенної суспензії можна характеризувати різними параметрами, що стосуються як агрегованої, так і дисоційованої фракції. Для агрегованої фракції визначали сиру масу і проводили візуальну оцінку стану (некроз і ризогенез). Для дисоційованої фракції визначали кількість клітин (N) та кількість життєздатних клітин (Nv) на одну клітинну популяцію в кінці періоду субкультивування. Показник сирої маси агрегованої фракції відзначався значною варіабельністю, тому його не використовували. Показники N і Nv вірогідно залежали від генотипу, тому в селективних середовищах їх виражали в процентах до контролю (pN та pNv).

Вплив засолення (NaCl) і експресні солестійкості. В дослідження включали сорти

3 різною польовою стійкістю до засолення: стійкий — Atlas 66 (США) і слабостійкі

— Миронівська 808 і Донська напівкарликова. Додавання NaCl в середовище викликало помітне пригнічення росту суспензійної культури у всіх сортів, однак кількісні відмінності свідчать про адекватність реакції сортів на клітинному і орга-нізменному рівні (рис. 2А). У дослідах з висхідними концентраціями NaCl: 0,01 - • 0,02 — 0,1 — 0,4 М найбільші відмінності між сортами спостерігали при дії високих концентрацій NaCl, зі збільшенням експозиції відмінності посилювались. 'Гак, через

4 тижні культивування в середовищі з 0,4 М NaCl співвідношення Nv0 4/Nvk для сортів складало: Atlas 66 — 0,64; Миронівська 808 — 0,25; Донська напівкарликова —

0,16, а через 6 тижнів —■ 0,34; 0,15 і 0,08, відповідно.

Експресія посухостійкості. Вивчали високостійкий до засухи сорт Саратовська 11, середньостійкий —Донська напівкарликова і слабостійкий сорт Бучани 22. Селективні середовища містили поліетиленгліколь ГІЕГ-6000. Спостерігається відповідність між стійкістю суспензійної культури до ПЕГ і польовою стійкістю сорту до засухи (рис. 2Б). З часом стійкість у культурі знижувалась у всіх сортів. Дисперсійний аналіз показав вірогідний вплив всіх факторів на кількість життєздатних клітин. При заміні селективного середовища (20 % ПЕГ, експозиція

— 4 тижні) на контрольне (відростання), спостерігали відновлення кількості життєздатних клітин (для сортів Саратовська 11, Донська напівкарликова і Бучани 22, відповідно, 276 %, 205 % і 122 % від початкової, тобто яку фіксували до переведення культур на селективні середовища).

Експресія стійкості до іонів алюмінію (кислотостійкості). Токсичний вплив закислення грунту проявляється через токсичну дію іонів алюмінію, які переходять у

pN, % до контролю

Рис. 2. Вилий абіотичних факторів на суспензійну культуру пшениці: А •—сольовий стрес (ИаСІ); Б ■ ■ осмотичний стрес (ПЕГ-6000); В — закислення (токсична дія іоній АР).

розчинну форму при низьких pH. Тому ці умови моделювали додаванням А1-ЕДТА при знижених pH середовища (4,5 проти 6,0-6,2 в контролі). Як високостійкий сорт брали Atlas 66, як слабостійкий —■ Миропівську 808. Ефект-дозові криві (рис. 2В) вказують на значну диференціацію даних сортів за цією ознакою. LDJ0 для сорту Миронівська 808 становила біля 0,4 мМ, тоді як для сорту Atlas 66 — більша від максимальної з використаних концентрацій (2 мМ).

Отже, створення в середовищі культивування сольового, осмотичного та іонного стресу викликає уповільненім росту ГСК. Як критерій оцінки реакції генотипів можна використовувати кількість життєздатних клітин у дисоційованій фракції. Більш чітку диференціацію спостерігали при високих концентраціях селективних агентів (0,1-0,4 М NaCl; 10-20% ПЕГ-6000; 1-2 мМ А1-ЕДТА) протягом 2-4 тижнів культ ивування. Використання зростаючих концентрацій дозволяє зберегти вищі показники росту суспензійної культур при високих концентраціях селективного агенту і в той же час ослабити вплив адаптаційних можливостей генотипів.

ДІЯ БІОТИЧНИХ ФАКТОРІВ НА СУСПЕНЗІЙНУ КУЛЬТУРУ ПШЕНИЦІ

Вивчали дію культуральпих фільтратів (КФ) фітопатогенних грибів Septoria tritici, Pscudocercosporella hcrpotrichoides та Fusarium graminearum на ГСК пшениці. Використовували сорти з контрастною стійкістю до септоріозу листя, церкоспо-

рельозної кореневої гнилі та фузаріозу колоса. В кінці періоду субкультивувашія (Т = 2 тижні) визначали кількість клітин в дисоційованій фракції (ІЧГ), відносну життєздатність (V) і кількість життєздатних клітин як добуток 1Чу. Для проведення дисперсійного аналізу дані були перетворені в Іод101Ч, і агсйіп(у|/2).

Дія КФ Беріогіа Ігкісі. Як стійкий брали сорт Ракна (Німеччина), нестійкий — Донську напівкарликову. В присутності КФ (5, 10 і 25 % (У/У)) спостерігали зниження показників росту: кількості клітин (И) і кількості життєздатних клітин (Ну). Показник відносної життєздатності (у) майже не змінювався. Тому зменшення №/ відбувалось за рахунок зменшення N. Такий вплив можна вважати скоріше цитостатичішм, ніж цитотоксичним. Ефект-експозиційні криві (рис. ЗА) вказують на сортоспецифічність реакції суспензійної культури на присутність КФ. Відмінності проявляються при всіх концентраціях і з часом посилюються. Коефіцієнти рівнянь лінійної регресії = ах + Ь та = ах + Ь (х - концентрація) теж вказують

на сортоспецифічність реакції, тобто лінії регресії для стійкого сорту мають менший нахил і здебільшого починаються вище.

Зміна показників росту для дисоційованої фракції в присутності КФ значною мірою пояснюється ризогенезом агрегованої фракції, тоді як у контролі вій був відсутній. Візуальна оцінка ризогенезу в балах показала його зростання зі

0 10 20 ЗО

Експозиція, тиж.

Концентрація КФ, %

-В—РаЮа -А— Донська н/к Рис. 3. Ефект-експозиційна крива дії КФ 8. Ігкісі в концентрації 10 % на відносну кількість життєздатних клітин в дисоційованій фракції гетерогенної суспензійної культури (А) та ефект-дозова крива дії КФ Б. ІгШсі на ризогеиез агрегованої фракції (Б).

збільшенням як концентрації, так і експозиції, причому в присутності 5-Ю % КФ реакція нестійкого сорту була більш вираженою (рис. ЗБ), що також може бути адекватним показником для оцінки стійкості генотипу. Після вилучення КФ з середовища показники росту стають вищими. Диференціація по сортах зберігається протягом перших двох тижнів.

Дій КФ РнсшІоссгсоирогсИа ЬсгроІгісЬоііІсь. Як стійкий брали сорт Яоагоп (Франція), нестійкий—Донську аанівкарликову. Додавання КФ Р. Ьегроігісіїоісіез (5,10 і 25 % (V/V)) викликало різке пригнічення росту. В агрегованій фракції було відмічено сильний некроз і ризогенез з частотою на рівні зразків з КФ Б. тисі, але меншою інтенсивністю росту коренів. При 25 % КФ ризогенез був слабшим, переважав некроз. Зменшення показника Мл/ відбувалось за рахунок зменшення як кількості клітин (>ї), так і відносної життєздатності (у), причому більше в останньому випадку. Такий вплив можна вважати скоріше цитотоксичним. Ефект-експо-зиційна залежність (рис. 4А) вказує па сортоспецифічність реакції ГСК на присутність ІСФ. Чіткіше відмінності проявляються при високій концентрації, але при збільшенні експозиції дещо зменшуються. Візуальна оцінка некрозу агрегованої фракції свідчить про його зростання при збільшенні концентрації КФ і експозиції, а також сортоспецифічність при низьких і середніх концентраціях. Рівень ризогенезу агрегованої фракції нестійкого сорту Донська нагіівкарликова був вищим при всіх

го

ю

со

(О

І

<ц

5

О.

Експозиція, тиж. -я-Яоагоп -о-Донська н/к

Концентрація КФ, %

♦-Ріоагоп 4 тиж. -и • Коагоп 6 тиж. д-Донська н/к4 тиж. -о- Донська н/к 6 тиж.

Рис. 4. Ефект-експозиційна крива дії КФ Р. ІіегроІгісЬоісіез в концентрації 10 % ш відносну кількість життєздатних клітин в дисоційованій фракції гетерогенної суспензійної культури(А) та ефект-дозова крива дії КФ Р. Ііегроіґісіїоісіез т ризогенез агрегованої фракції (Б).

концентраціях і експозиціях (рис. 4Б). Після вилучення ІСФ з середовища показник відносної життєздатності клітин досягає і навіть перепитує рівень контролю, що підтверджує переважно цитотоксичну дію КФ Р. ЬегроІгісЬоісісв. Диференціація по сортах (за показником N4?) зберігалась протягом всього часу спостережень.

Дія КФ Ічіяагіиш йгаіпіпеагигп. Використовували відносно стійкі до фузаріозу колоса сорти 80117 і Са 8055 (Китай) і нестійкий —• Донську напівкарликову. При додаванні КФ Р. granlinearum (2, 10 і 50 % (У/У)) спостерігали зміну всіх досліджуваних параметрів: N. V і ]Му. На рис. 5.Л показано сортоспсцифічпість впливу КФ Б. gramineaшm на показник ІЧу.

Зниження показника відбувалось одночасно як за рахунок зниження кількості клітин (14), так і відносної життєздатності (у), тобто КФ Р. graшmcarura має як цитостатичний, так і цитотоксичний вплив, причому останнє більш характерне для сприйнятливого сорту Донська напівкарликова. Цитотоксична дія КФ проявлялась також в некрозі агрегованої фракції, ця реакція теж є сортоспеци-фічною. Для КФ Р. gramineaгuш була характерна індукція ризогенсзу, при низьких концентраціях його рівень є адекватним показником стійкості генотипу (рис. 5Б). Слід зазначити, що істотним заходом при використанні КФ Р. ^гатіпсагідт для оцінки генотипів на стійкість до цього патогена є підвищення рівня 2,4-Д до 5 мг/л -- при нижчих концентраціях спостерігається бурхливий ризогеиез, який маскує

Експозиція, тиж -и-80117 -о-Донська н/к

5

ю- з

п

щ

X Щ й 2 со

й.

Концентрація КФ,%

380117 Ш Донська і і/к

Рис. 5. Ефект-експозиційна крива дії КФ Р. grammearum в концентрації 10 % на відносну кількість життєздатних клітин в дисоційованій фракції гетерогенної суспензійної культури(А) та ефект-дозова крива дії КФ Р. graminearum на ризогеиез агрегованої фракції (Б).

0

токсичний ефект. Це свідчить про те, що одним з механізмів взаємодії хазяїн-патоген в системі з F. grammearum є порушення гормонального балансу.

Таким чином, в ГСК пшениці при додаванні до середовища КФ S. tritici, P. herpo-trichoides і F. graminearum спостерігаються морфорегуляторний, цитостатичішй та цитотоксичний ефекти. Про це свідчать ризогенез та гемогенез агрегованої фракції (морфорегуляторний ефект); зменшення загальної кількості клітин у дисоційованій фракції (цитостатичішй ефект), некроз агрегованої фракції та зниження показника відносної життєздатності клітин дисоційованої фракції (цитотоксичний ефект). Більш вираженою в усіх відношеннях була реакція нестійкого сорту. Отже, ознака стійкості до септоріозу, церкоспорельозу та фузаріозу колоса на рівні цілої рослини може експресуватись в культурі in vitro на селективному фоні — в присутності токсичних метаболітів даних патогепів. Отримані результати свідчать про можливість використання токсичних метаболітів патогенів S. tritici, P. herpotrichoides та F. graminearum в культурах клітин і тканин для вивчення механізмів взаємодії хазяїн-патоген та розробки систем скрінінгу та відбору стійких варіантів.

ВИСНОВКИ

1. Гетерогенна суспензійна культура пшениці становить теоретичний інтерес

як адекватна модельна система для вивчення фізіолого-біохімічних механізмів стійкості до стресових факторів та практичну цінність як система оцінки та відбору стійких варіантів. ,

2. Гетерогенна суспсшійна культура пшениці при циклічній заміні дисоційованої фракції свіжим поживним середовищем підтримує здатність до росту протягом тривалого часу (більше року), досягає високої густини одиничних клітин (106 кл./мл).

3. Оптимальними умовами для одержання і підтримки гетерогенної суспензійної культури є такі: експлант для ініціації — основи листків асептично вирощених проростків та калуси з незрілих зародків; середовище для підтримки і росту — Мурасігс і Скуга, Шеика і Хільдебрандта; період заміни середовища (субкультиву-вання) —■ 7-14 діб. Такі умови культивування придатні для різних генотипів пшениці однак інтенсивність росту залежить від генотипу.

4. Для активного відокремлення клітин агрегованої фракції в рідке середовище необхідна присутність 2,4-Д, в цих умовах відбувається також розтягнення клітиі та їх вакуолізація. В безгормональному середовищі відшаровується менше клітин але з переважанням клітин меристематичного типу, а також відбувається дифе ренціація клітин в поверхневих шарах агрегованої фракції, що приводить до ризо генезу. Глобули агрегованої фракції після висіву на агаризоване або рідке се

. редовище з низьким вмістом 2,4-Д продовжують рости, для них характерний ризо генез і поява на світлі зелених крапок.

5. Для оцінки реакції генотипів на абіотичні та біотичні стресові умови оптимальним показником є кількість життєздатних клітин у дисоційованій фракції гетерогенної суспензійної культури.

6. Створення в середовищі культивування сольового, осмотичного та іонного стресу викликає пригнічення росту гетерогенної суспензійної культури. Для оцінки солестійкості, посухостійкості та стійкості до закислення середовище слід доповнити 0,1-0,4 М NaCl, 10- 20 % ПЕГ-6000 і 1-2 мМ А1-ЕДТА, відповідно. Експозиція

— 2-4 тижні.

7. В гетерогенній суспензійній культурі пшениці в присутності культуральних фільтратів Septoria tritici, Pseudocercosporella herpotrichoides і Fusarium graminearum спостерігаються морфорегуляторний, цитостатичнийта цитотоксичний ефекти. Про це свідчать ризогенез та гемогенез агрегованої фракції (морфорегуляторний ефект); зменшення загальної кількості клітин у дисоційованій фракції (цитостатичний ефект), некроз агрегованої фракції та зменшення показника відносної життєздатності клітин дисоційованої фракції (цитотоксичний ефект). Для оцінки стійкості до цих патогенів можна використовувати їх культуральні фільтратив концентрації 10-50 %. Оптимальна експозиція — 4 тижні. Додатковим показником стійкості генотипів до вказаних патогенів може служити рівень ризогенезу після 4 тижнів культивування в присутності 2-5 % КФ.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1 .Г ирко B.C., Волощук АД. Индукция и рост культуры клеток пшеницы в жидкой среде//Докл. ВАСХНИЛ.- 1990,- 9.- С. 4-Ю.

2.Гирко B.C., Волощук А.Д. Индукция и рост культуры клеток пшеницы в жидкой

среде // С.-х. биология,- 1991.- №. 5.- С. 61-66. .

3.Волощук А.Д. Влияние генотипа и среды культивирования на параметры суспензионной культуры пшеницы // Селекционные и агротехнические пути повышения урожайности зерновых колосовых культур,- Мироновка, 1992.- С. 79-91.

4.Созинов А.А., Гирко B.C., Волощук А.Д. Действие стрессовых факторов на суспензионную культуру пшеницы // Вісник аграрної науки.- 1994.- № 2,- С. 65-75.

5.Волощук А.Д. Морфогенетические процессы в суспензионной культуре пшеницы // Сб. науч. трудов Мироновского института пшеницы,- Киев: Урожай, 1995.- С. 58-74.

6.Волощук Г.Д., Волощук С.І., Гірко B.C. Вплив культуральних фільтратів деяких грибних патогенів на суспензійну культуру пшениці // Цитология и генетика.-1995,- 29, №4,- С. 70-77.

7.Волощук С.І., Волощук Г.Д., Гірко B.C. Створення вихідного матеріалу озимої

пшениці, стійкого до грибних патогенів, методами клітинної селекції // Захист рослин.- 1998.- № 8.- С. 4-5.

8.Волощук Г.Д. Оцінка стійкості пшениці до грибних патогенів в суспензійній культурі // Захист рослин.- 1998.- №11.- С. 10.

9. Волощук Г.Д., Волощук С.І., Гірко B.C. Використання клітинних культур пшениці для оцінки стійкості до стресових факторів // 36. наукових праць УААН «Наукові розробки і реалізація потенціалу сільськогосподарських культур».-К.: Аграрна наука.- 1999.- С. 59-64.

10.Волощук АД., Волощук С.И., Гирко B.C. Использование селективных сред как тест-системы для оценки генотипов пшеницы на устойчивость к патогенам Л Агробиотехнологии растений и животных. Тез. Докл. Междунар. конф.- Киев 1997,-С. 86.

11 .Волощук А Д., Волощук С.И., Г ирко B.C. Разработка методов оценки генотипої пшеницы на устойчивость к Fusarium graminearum в суспензионной культуре I, Там же.- С. 87.

12.Girko V.S.,Voloshchuk A.D., Voloshchuk S.I. Effects of biotic and abiotic factor: on wheat suspension culture // Abstr. IX Intern. Congr. Plant Tissue Cell Cult. Israel June 14-19, 1998,-P. 145.

13.Voloshchuk A.D., Voloshchuk S.I., Girko V.S. Study of effect of Fusariui graminearum cultural filtrate action on wheat suspension culture growth parameter: to estimate the resistance to this pathogen // Abstr. II Intern. Symp. Plant Biotechnol. 4-8 October 1998, Kyiv, Ukraine.- Kyiv, 1998.- P. 143.

14.Волощук Г.Д., Волощук C.I., Гірко B.C. Оцінка генотипів пшениці на стійкісті до біотичних і абіотичних факторів з використанням суспензійної культури І Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок; генетико-селекційних дослідженнях. 36. матер. II Міжнар. конф. (м. Одеса).- Київ Аграрна наука, 1998.- С. 21-22.

15. Волощук Г.Д., Волощук С.І., Гірко B.C. Дія культуральних фільтраті факультативних грибних патогенів на клітинні культури пшениці // Науков основи стабілізації виробництва продукції рослинництва. Тез. доп. Міжнар. кон4 (м. Харків).- Харків, 1999,- С. 239.

Волощук Г.Д. Суспензійна культура пшениці Triticum aestivurn L. та її використання в генетико-селекційннх дослідженнях.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 — фізіологія рослин. Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, 2000.

Дисертацію присвячено застосуванню методів біотехнології (культури in vitro) в фундаментальних і прикладних дослідженнях. Розроблено методи ініціації та підтримки довгоживучої гетерогенної суспензійної культури пшениці з високою швидкістю росту, яка може служити модельною системою для вивчення фізіолого-біохімічних механізмів стійкості до стресових факторів, а також для оцінки стійкості генотипів. Наведено результати індукції морфогенетичних процесів в гетерогенній суспензійній культурі. Вивчено ростові реакції суспензійної культури на додавання хлориду натрію, поліетиленгліколю, іонів алюмінію, а також культуральних фільтратів грибних патогенів Pseudocercosporella herpotrichoides, Septoria tritici та Fusarium graminearum. Встановлено сортоспецифічність таких реакцій, визначено умови адекватності та критерії оцінки стійкості до ряду біотичних та абіотичних стресових чинників у клітинних культурах. Оптимальним кількісним показником стійкості генотипу до таких факторів є кількість життєздатних клітин у дисоційованій фракції гетерогенної суспензійної культури.

Ключові слова: Triticum aestivurn L., суспензійна культура, біотичні та абіотичні фактори, стійкість.

АННОТАЦИЯ

Волощук А.Д. Суспензионная культура пшеницы (Triticum aestivurn L.) n ее использование в генетико-селекционных исследованиях.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по :пециальности 03.00.12 — физиология растений. Институт физиологии растений и 'енетики НАН Украины, Киев, 2000.

Диссертация посвящена применению методов биотехнологии (культуры in vitro) з фундаментальных и прикладных исследованиях. В результате проведенной работы 5ыли разработаны методы инициации и поддержания долгоживущей гетерогенной :успензионной культуры пшеницы с высокой скоростью роста, которая может :лужить модельной системой для изучения физиолого-биохимических механизмов остойчивости к стрессовым факторам.

Для инициации суспензионной культуры использовали каллусы, полученные із незрелых зародышей, которые переносили в жидкую перемешиваемую среду. Три этом образовывалась гетерогенная суспензия, содержащая одиночные клетки

і рыхлые группы из 5-20 клеток (диссоциированная фракция), а также мелкие и :рупные (до 2 мм) плотные глобулы (агрегированная фракция). Поскольку

культивирование диссоциированной фракции, которую отделяли путем фильтрования через ткань, показало ограниченные способности к росту в жидкой среде и проявлению морфогенного потенциала после плейтинга на агаризованные среды, был предложен альтернативный способ: культивирование агрегированной фракции. Замена диссоциированной фракции свежей средой вызывала рост агрегированной фракции и отслоение клеток в среду, так снова образовывалась гетерогенная суспензионная культура (ГСК). Субкультивирование ГСК производилось каждые 7-14 суток (цикл субкультивирования) путем замены диссоциированной фракции свежей питательной средой. Плотность клеток в диссоциированной фракции в течение одного цикла быстро возрастала по 8-образной кривой, в каждом последующем цикле плотность также превышала достигнутую ранее.

Среди всех испытанных источников для инициации ГСК (каллусные ткани, индуцированные из незрелых зародышей, непосредственно незрелые зародыши и незрелые соцветия, а также основания листа и кончики корешков асептически выращенных 7-суточных проростков) оптимальным типом экспланта являются основания листа проростков, которые сочетают способность индуцировать суспензию с достаточно высокой скоростью роста и возможность использования независимо от сезона. Среди испытанных 6 сред для поддержания ГСК: Мурасиге и Скуга, Шенка и Хильдебрандта, Гамборга В5, Дьюдитса (Т), Масуда, Торияма и Хината (АА) — все, кроме последней, оказались пригодными, оптимальной была среда Мурасиге и Скуга, дополненная 2-5 мг/л 2,4-Д. Такие условия культивирования обеспечивали для всех изучаемых генотипов способность к рост) в течение более года при высокой плотности клеток в конце цикла (106 кл./мл).

При периодическом чередовании сред, содержащих и не содержащих 2,4-Д обнаружено, что в безгормональной среде диссоциированная фракция отличаете; меньшей плотностью клеток, но увеличением доли клеток меристематического типа для агрегированной фракции характерна индукция ризогенеза. Глобуль агрегированной фракции после высева на агаризованные среды различного состав! демонстрировали рост, индукцию ризогенеза и появление на свету зеленых точек Наиболее интенсивно морфогенетические реакции отмечались на средах дополненных гомогенатом незрелых зерновок.

Добавление в питательную среду хлорида натрия (солевой стресс) полиэтиленгликоля (осмотический стресс), ионов алюминия (ионный стресс вызывало угнетение роста ГСК пшеницы. Адекватную реакцию контрастных п устойчивости к данным стрессам сортов наблюдали после 2-4 недел культивирования в присутствии 0,1-0,4 М ЫаС1, 10-20% ПЭГ-6000 и 1-2 м Г' А1-ЭДТА, соответственно.

19 ,

В средах, дополненных культуральными фильтратами (КФ) грибных патогенов Pseudocercosporella herpotrichoides, Septoria tritici и Fusarium graminearum (биотический стресс при поражении церкоспореллезной корневой гнилью, септориозом листья и фузариозом колоса, соответственно) наблюдали ризогенез и геммогенез агрегированной фракции (морфорегуляторный эффект), снижение плотности клеток в диссоциированной фракции (цитостатический эффект), некроз агрегированной фракции и снижение показателя относительной жизнеспособности клеток диссоциированной фракции (цитотоксический эффект). Реакция неустойчивого к данным патогенам генотипа во всех случаях была более выраженной. Показатель количества жизнеспособных клеток объединяет цитостатический и цитотоксический эффекты, а косвенно отражает и морфорегулятрный эффект, поэтому является наиболее адекватным.

Таким образом, ГСК пшеницы представляет теоретический интерес как модель для изучения физиолого-биохимических процессов и практическую ценность как система для оценки устойчивости генотипов.

Ключевые слова-. Triticum aestivum L., суспензионнная культура, биотические и абиотические факторы, устойчивость.

ABSTRACT

Voloshchuk H.D. Wheat (Triticum aestivum L.) suspension culture and its application in genetics and breeding.- Manuscript.

The thesis for Ph.D. degree on speciality 03.00.12 — plant physiology. Institute of Plant Physiology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

The Ph.D. thesis is devoted to the employment of biotechnology viz. in vitro culture methods in theoretical and applied researches. The methods of induction and maintenance of long-termed heterogenous wheat suspension culture with high growth rate have been developed. It can be used as model system for studing of physiological and biochemical mechanisms of stress-resistance as well as for screening of resistant genotypes. The results of morphogenetic process induction in the suspension culture are presented. The suspension culture’s growth responses to addition ofsodium chloride, polyethylene glycol, ions of aluminium, and cultural filtrates of fungal pathogenes Pseudocercosporella herpotrichoides, Septoria tritici and Fusarium graminearum are studied. Variety-specificity of these responses is ascertained, the condition of adequacy and evaluation criteria of a number of abiotic stress factor-tolerance and disease-resistance at cell culture level are revealed.The optimal quantitative index of resistance to abiotic and biotic factors is viable cell number in dissociated fraction of geterogenous suspension culture.

Key words: Triticum aestivum L., suspension culture, biotic and abiotic factors, tolerance.