Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Суммарная оценка генотоксического действия антропогенных факторов на ряд растений в условиях города Еревана

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Суммарная оценка генотоксического действия антропогенных факторов на ряд растений в условиях города Еревана"

ЕРЕВАНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ДЖИГАРДЖЯН ЭММА МАРАТОВНА

СУММАРНАЯ ОЦЕНКА ГЕНОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ АНТРОПОГЕННЫХ ФАКТОРОВ НА РЯД РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ ГОРОДА ЕРЕВАНА

03.00.15 - Генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван-1990

Работа выполнена на кафедре генетики и цитология биологического факультета Ереванского государственного университета

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, доцент Е.Г.СШОНЯН

кандидат биологических наук, ст.н.сотр. В.С.ЛОГОСЯН

доктор биологических наук, профессор Б.А.АВАКЯН

кандидат биологических наук, науч.сотр. Р.С.КАГРАМАНЯН

Ведущее убеждение - Научно-исследовательский институт виноградарства, виноделия и плодоводства МСХ Республики Армения

на заседании специализированного совета К 055.01.04 по генетике при Ереванском государственнш университете по адресу: г.Ереван, ул. Чаренца, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЕГУ. Автореферат разослан " 29 " декабря 1990 г.

Ученый секретарь

Завита.состоится " 30 " января 1991 г. в "14 " час

специализированного совета, кандидат биологических наук

Э.Г.ШТНЕЦЯН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОШ

Актуальность проблемы. Оценка и предупреждение генетических последствий мутагенного действия загрязнителей 01фужающей среды относится к числу важнейших задач современной генетики. Необходимым условием для их успешного решения является разработка и обоснование основных критериев оценки генетической опасности вредных воздействий окружающей среды и принципов их контроля.

Систематическое исследование растительных клеток, включая учет изменений, происходящих в их генетическом аппарате, стало одним из наиболее распространенных методических подходов для выявления генотоксического действия факторов 01фужавдей среды. При этом все большую актуальность приобретает разработка чувствительных тест-систем с целью суммарной оценки генетического риска ксенобиотиков (Соколовский и соавт., 1982).

Применение новых тест-объектов, необходимо как для оценки суммарной мутагенной активности атмосферного воздуха, так и получения информации о сравнительной опасности мутагенов. Это позволит подойти к проблеме выявления индивидуальной чувствительности растительных организмов к действию мутагенных факторов окружающей среды.

В настоящей работе предложены разные методические подходы для выявления мутагенной активности загрязнителей окружающей среды с использованием различных чувствительных тест-объектов - винограда, традесканции и лука.

Цель и задачи исследования.Целью данной работы явилось комплексное изучение и суммарная оценка генотоксичности промышленных и транспортных загрязнителей атмосферного воздуха с применением чувствительных растительных тест-объектов.

Исходя из поставленной цели, сформулированы следующие задачи:

1. Изучение действия факторов окружающей среды йа нескольких растительных объектах, в населенных пунктах, расположенных на различных расстояниях от химических производств.

2. Оценка различных морфогенетических и цитологических параметров у двух сортов винограда, для определения фертильности и процесса развития репродуктивных органов.

3. Изучение генотоксичности производственных и автотранспортных загрязнителей атмосферы с применением тест-системы волосков тычиночных нитей (ВТН) традесканции клона 02.

4. Цитогенетичвский анализ действия промышленных загрязнителей атмосферы в меристаматических клетках лука репчатого (^ . ¿ера ).

Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работа впервые предпринята попытка суммарной оценки мутагенной активности атмосферных загрязнителей в некоторых населенных пунктах г.Еревана, находящихся в районах химических производств и интенсивного движения автотранспорта с применением ряда растительных тест-объектов.

Для сравнительного изучения генетических эффектов действия атмосферных загрязнителей, впервые проведено комплексное исследование с использованием как традиционных методов прямого учета мутаций ( традесканция, лук репчатый), так и косвенных показателей мутагенного действия к которым, в частности, относится тест на определение стерильности пыльцы винограда.

Проведенные цитологический и цитогенетический анализы выявили максимальный мутагенный аффект атмосферных загрязнителей при непрерывном действии химического производства в пунктах, расположенных вблизи предприятий на высоте 3 метров.

Выявлено, что атмосферные загрязнители химического производства и автотранспорта в значительной мере повышают частоту точковых мутаций, хромосомных аберраций и вызывают стерильность пыльцевых зерен.

Продемонстрирована связь ряда показателей генотоксичности производственных и автотранспортных загрязнителей атмосферы, подавляющих жизнеспособность соматических клеток и приводящих к РЯДУ морфологических изменений в Генеративной сфере растений.

Учитывая полученные данные, рекомендуется использовать систему ВТН традесканции клона 02, а также сухие семена А1 . сера в качестве высокочувствительных биоиндикаторных тест-систем для выявления мутаций и обладающих рядом ценных свойств: хорошей воспроизводимостью данных, простой методикой учета мутаций, возможностью их использования для контроля загрязнения атмосферного воздуха как в районах химических производств, так и автотранспортных магистралей.

Апробация работы.Основные материалу диссертации докладывались и обсуждались на заседании секции "Генетические аспекты проблемы ".Человек и биосфера" МНТС ГКНТ (Орджоникидзе, 1986); на У съезде армянского отделения ВОГиС им. Н.И.Вавилова (Ереван,1987);

на У съезде ВОГиС им. Н.И.Вавилова (Москва, 1987); на Международном симпозиуме "Работы по изучению атмосферного пограничного слоя в городских условиях; загрязнение атмосферы". (Ереван, 1988); на XI Международном симпозиуме эмбриологов (Ленинград, 1990); на Ш Всесоюзной конференции по генетике и цитологии мейоза (Новосибирск, 1990).

Публикации.Полученные результаты исследований, представленные в диссертационной работе, изложены в II печатных.работах.

Структура и объем работы.Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов экспериментов, обсуждения, общего заключения, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на 135 страницах машинописи, содержит 10 рисунков и 25 таблиц. Список литературы включает 130 наименований, из них 60 работ опубликованных в отечественной печати.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования служили три объекта:

1. Два местных сорта винограда - Арарати (Ачабаш) и Мсхали. Анализировали по 1000 свежих пыльцевых зерен каждого сорта из 19 пунктов исследования в 3-х повторностях, в течение трех лет. Всего в работе подсчитано 315000 пыльцевых зерен. Препараты готовили ацетокарминовым методом и методом Шардакова.

Изучение развития репродуктивных органов винограда проводили на более чем 700 препаратах. Материал фиксировался по методу Навашина и Бродского. Окраска постоянных препаратов производилась железным гематоксилином по Гейденгайну.

Объем IIIOO пыльцевых зерен определяли методом, предложенным Выгодским (1976).

Контролем служили те же сорта винограда, произрастащие на территории экспериментальной базы НИИВВиП (К-западный) и соответствующие сорта из совхоза Дзорахпюр Абовянского района (К-восточ-ный).

2. В качестве второго объекта исследований использовали природный межвидовой гибрид, гетерозиготный по окраске цветка, клон 02 традесканции. Культивирование растений проводилось согласно методике, разработанной в Брукхэйвенской Национальной лаборатории (США). Клон 02 традесканции любезно предоставлен нам доктором биологических наук З.А.Шевченко.

В ходе эксперимента подсчитывали количество волосков в каждой

нити и учитывали имеющиеся мутационные изменения у растений, выращиваемых в населенных пунктах, находящихся на разных расстояниях от химического производства (варианты - "I", "2"; "I", "Я", "Ш"), на разных высотах от поверхности земли (варианты - "А", "В", "С"), в районах с перегруженным автомобильным транспортом (варианты - "3", "4") и на остановках (варианты - "1-1" - центр города, "2-К" - северная зона, "З-Ч" - восточная зона).

В качестве контроля использованы растения, выращенные в контролируемых тепличных условиях, отдаленных от предприятий на расстоянии км.

Воего в работе проанализировано свыше 400 тысяч тычиночных волосков. Для каждого варианта эксперимента рассчитывали выборочную среднюю и ее ошибку. Сравнение экспериментальных данных с контролем проводилось по методу сравнения выборочных долей с нор- малязацией по Фишеру.

3. Третьим объектом исследования служили воздушно-сухие семена А1. сера , которые в течение 1,5-2 месяцев хранили в пунктах исследований и в контрольной зоне, находящейся на расстоянии II км от предприятий. По истечении срока экспозиции семена проращивали и фиксировали. Препараты для ана- телофазного анализа готовили по общепринятому методу (Паушева, 1980). При регистрации цитогенетических повреждений учитывали хромосомные мосты, парные и одиночные фрагменты, опережающие и отстающие хромосомы.

В ходе работы проанализировано 9878 ана- телофаз. Варианты исследований соответствуют вариантам традесканции клона 02.

Данные опытов были подвергнуты статистической обработке по общепринятой методике (Плохинский, 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. ОЦЕНКА ИНФОРМАТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ И ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ДВУХ СОРТОВ ВИНОГРАДА

Виноград, является древнейшей культурой, широко распространенной в Армении. Он повсеместно возделывается на территории города Еревана и произрастает вблизи производственных предприятий и автотранспортных коммуникаций города. Имеются данные о чувствительности культуры к неблагоприятным внешним условиям, что выражается в повышении стерильности ее репродуктивных органов, и

в первую очередь, в стерильности мужской генеративной сферы (Макаров-Кожухов, 1959; Мальтабар и соавт., 1968; Тадда, 1968; Си-монян и соавт., 1985).

В настоящей работе виноград был использован в качестве тест-объекта для оценки мутагенного влияния промышленных и транспортных загрязнителей атмосферы.

1.1. Изучение фертильности и объема пыльцевых зерен двух сортов винограда, в различных зонах города Еревана. Известно, что загрязнение окружающей среды может повлиять на рост, развитие и размножение растений. Особенно сильно оно действует на половой аппарат растений, поэтому в последнее время все больше возрастает интерес ученых к изучению пыльцы в норме и в эксперименте, к пыльцевому анализу. Исследованиями ряда ученых установлено, что изменение внешних условий влияет на процессы самостерильности и самофертильности.

Данные, полученные при анализе сорта Арарати показывают, что в некоторых районах г.Еревана стерильность пыльцы винограда стойко сохраняется (пункт 35) и составляет по годам исследования соответственно 37,25+1,24$ (1-ый год); 37,87+0,88$ (2-ой год) и 40,0+0,83$ (3-ий год) и в пункте 30 - 28,53+0,85$, 27,53+0,81$.

Аналогичные исследования нами проводились на сорте Мсхалд. Данные за указанные годы позволяют предположить, что этот сорт является более чувствительным к неблагоприятным внешним условиям.

Согласно полученным результатам можно заключить, что ,в некоторых, районах города значительно падает процент фертильности пыльцевых зерен.

Параллельно в тех же условиях определяли объем пыльцевых зерен исследованных сортов винограда.

1.2. Выявление действия загрязнителей атмосферного воздуха на жизнеспособность пыльцы в населенных пунктах близ химического производства/ В данной серии опытов-изучалось действие загрязнителей воздуха на жизнеспособность пыльцы винограда из двух участков города (точки "I" и "2"), находящихся в наиболее загрязненном юго-западном районе, где размещены такие производственные объединения, как НПО "Наирит", "Яоливинилацетат", завод железобетонных конструкций, завод химреактивов, ТЭЦ, механические предприятия и др. Выбросы указанных производств содержат большое количество вредных веществ. В точках исследования отмечалось скуд-

нов цветение винограда с относительно малым количеством пыльцы с низкой жизнеспособностью.

Результаты анализа показали, что наибольший процент стерильной пыльцы в точке "2" равен 68,0+0,86, а в точке "I" -44,04+0,90$ (рис. I).

Рис. I. Частота жизнеспособности пыльцы двух сортов винограда. Обозначения: а - сорт Мсхали в пунктах исследования близ химических предприятий; б - сорт Арарати, пункты с перегруженным автотранспортом.

Высокий процент стерильности пыльцы свидетельствует о действии разных химических, токсических веществ и климатических факторов.

1.3. Выявление действия загрязнителей атмосферного воздуха на жизнеспособность пыльцы винограда, растущего в населенных пунктах с перегруженным автомобильным транспортом. Жизнеспособность пыльцы сорта Арарати, собранный в период бурного цветения винограда анализировали в двух точках города ("3" и "4").

Полученные данные свидетельствуют о повышении процента стерильности пыльцевых зерен, собранных с северного района ("3"), равную 18,33+0,70$, а у собранных с восточного района ("4") -41,4+0,11% по сравнению с пыльцой растений юго-западного района ("I"), где процент стерильности равен 44,04+0,90 у сорта Мсхали, считающегося более чувствительным к действию мутагенных факторов.

Процент стерильности пыльцы в разных пыльниках одного и того же растения может различаться в сравнении с контролем. Это было показано при анализе пыльцы 14 сортов винограда,имеющих различную давность происхождения (Симонян и соавт., 1985). Наблюдается разнокачественность пыльцевых зерен, встречается пыльца крупных, мелких и средних размеров. Стерильные пыльцевые зерна, как правило, сморщенные, мелкие, без содержимого.

Нами проводилось исследование развития завязей и семяпочек у двух сортов (Арарати и Мсхали), произрастающих на территории крупного производственного объединения. На ранней стадии эмбриогенеза в завязях изучаемых сортов наряду с нормально развитыми, обнаружено немало недоразвитых, дефективных или вовсе дегенерировавших семяпочек. Среди нарушений в развитии семяпочек отмечены также зародышевые мешки, не содержащие элементов (в юго-западных точках 3, 5, 7 и в северной точке 21).

На более поздних стадиях эмбриогенеза обнаружены также дегенерировавшие семяпочки и зародышевые мешки без элементов (точки 3, 20). Из данных исследований можно заключить, что характерной особенностью сорта Арарати является более высокая устойчивость и фертильность репродуктивных органов. У сорта Мсхали более выражены процессы нарушений и дегенераодй.

Результаты исследований по изучению эмбриогенеза у двух обоеполых сортов винограда, несмотря на значительные аномалии, заключающиеся в дегенерации яйцевого аппарата, эндосперма, раннем отмирании зародышевых мешков, отсутствии зародыша, а также в дегенерации самих семяпочек и завязей показывают, что такие отклонения, возможно, являются результатом как нарушения хода эмбриогенеза из-за неблагоприятных условий внешней среды, так и других причин, связанных с длительным вегетативным размножением отобранных форм, которое привело к подавлению половой сфе-' ры культурного винограда, что и проявляется в эмбриогенезе изучаемых сортоб. Эти нарушения более усугубляются в районах наиболее загрязненных выбросами промышленных предприятий (юго-западный, южный) и автомобильного транспорта (северный, восточный).. .

2. СУММАРНАЯ ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ АТМОСФЕРНОГО ВОЗДУХА С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ВТН ТРА-• ДЕСКАНЦИИ КЛОНА 02

В последние годы в токсикологической генетике в качестве индикатора мутагенной активности загрязнителей атмосферного воздуха на разных производственных предприятиях применяется тест-система ВТН гетерозиготных по опаске цветка клонов традесканции ( lower , 1980; bower , I98I;Scheirer et al.,1981).

. Данная тест-система использована для выяснения следующих вопросов: I - оценка генотоксичности загрязнителей воздуха в населенных пунктах близ химического производства; 2 - анализ соматических мутаций у растений традесканции, установленных в населенных пунктах, находящихся на разных расстояниях от химических предприятий и в зависимости от их уровня над поверхностью земли; '3 - мутагенное действие атмосферных загрязнителей в районах с перегруженным автомобильным транспортом; 4 - действие загрязнителей атмосферы на выживаемость и морфологические изменения в ВТН традесканции.

2.1. Оценка генотоксичности загрязнителей воздуха в населенных пунктах близ химического производства. В наших экспериментах, генетическая оценка загрязнителей атмосферного воздуха основана на выявлении соматических мутаций у традесканции клона 02. В основном учитывались мутационные события, приводящие к появлению розовой окраски клеток ВТН (розовые или рецессивные мутации) и события, приводящие к образованию бесцветных клеток (бесцветные или генетически неопределенные мутации). Обнаружена прямая зависимость между повышением частот рецессивных мутационных событий и степенью загрязненности атмосферного воздуха выбросами промышленных комплексов. Наибольшая частота рецессивных соматических мутаций отмечена в районе, где находятся химические предприятия. Здесь частота рецессивных мутационных событий у клона 02 традесканции превышает значения, полученные в контроле в 8,5 раз (рис. 2), В точке "2" отмечается резкое повышение генетически неопределенных мутационных событий в 9,8 раз превышающих контроль, а в точке "I" отмечено превышение в 6,9 раз. Высокий уровень генетически неопределенных мутационных событий отмечается во всех вариантах, однако их частота особенно увеличивается в летний период, когда температура воздуха, по сравнению с другими месяцами,

0.60-| 0.50-

I

ьсследо£ани&

пг/штьг

АС 1

г /< -г 2

Рис. 2. Частота рецессивных (а) и генетически неопределенных (б) мутационных событий в ВТН традесканции в населенных пунктах близ химических производств.

повышается на Ю-15°С.

Результаты, полученные как вблизи химических производств, так и при отдалении от них на 1,5-2 км, свидетельствуют о достоверном мутагенном эффекте атмосферных загрязнителей на уровне соматических мутаций (р <0,001), включающих как рецессивные, так и генетически неопределенные мутационные события.

Ломимо повышения частоты соматических мутаций, в волосках тычиночных нитей традесканции отмечается резкое изменение расположения мутационных событий. Так, например,' у контрольных растений, в 13Ш рецессивные мутационные события в основном имеют терминальное расположение и лишь частично (0,0005$) субтерминальное, а генетически неопределенные события только терминальное расположение. Однако у растений традесканции, находящихся в исследуемых пунктах расширяется спектр* расположения как рецессивных, так и генетически неопределенных мутационных событий. Этот спектр наиболее разнообразен у растений, находящихся в точке "I", где отмечено 5 типов расположения рецессивных и 7 типов генетически неопределенных мутационных событий (рис. 3). Кроме того, у этих растений на одном волоске сочетаются рецессивные и генетически неопределенные мутационные события, что характерно только для этой точки исследования. Помимо этого, здесь выявлен вы-

о.оа-

/< 7 1? АГ ? 2

Рис. 3. Спектр расположения рецессивных (а) и генетически неопределенных (б) мутационных событий в ВТН традесканции в населенных пунктах близ химических производств.

Обозначения:!. ]- терминальное,ДНЯ - субтерминальное, центрическое, ЕН53- сУббазальное. базальное,

ГСС^ - волоски с множественными событиями; - события охватывающие целый волосок.

сокий процент ВТН со множественными мутационными событиями, составляющий четвертую часть всех мутантных волосков.

2.2. Анализ соматических мутаций у растений традесканции клона 02, установленных в населенных пунктах, находящихся на разных расстояниях от химических предприятий и в зависимости от уровня над поверхностью земли. Анализ соматических мутаций в ВТН традесканции проведен в юго-западной части города Еревана. Анализировали следующие, варианты: "I" - населенный пункт, расположенный от химического предприятия на расстоянии 1000 метров и на высоте 3 метров от поверхности земли; вариант "П" - населенный пункт, расположенный от химического предприятия на расстоянии 1000 м, на высоте 6м; вариант "Ш" - населенный пункт, расположенный от химического предприятия на расстоянии 1300 м, на высоте 6 м от поверхности земли.

Полученные данные свидетельствуют о высокой вариабельности частот мутаций, происходящих во всех трех пунктах. Обнаружено, что во "П"-ом варианте при непрерывном действии газообразных за- '

грязнителей частота рецессивных мутационных событий в ВТН традесканции повышена по сравнению со спонтанным уровнем в 6,5 раз. По мере удаления растений от источника загрязнения, процент рецессивных мутаций у них снижается. Это особенно четко заметно в остальных опытных вариантах.

Результаты анализа варианта "Ш", при наибольшем отдалении от источника загрязнения, частота появления рецессивных событий превышает контроль в 3,5 раза, т.е. в два раза меньше', чем в варианте "I" (рис. 4).

А' I II III К I II III **

Рис. 4. Частота рецессивных (а) и генетически неопределенных (б) мутационных событий в . ВТН традесканции под воздействием атмосферных загрязнителей юго-западной зоны города

Спектр расположения рецессивных мутационных событий при действии газообразных загрязнителей весьма разнообразен. В тычиночных волосках выявлены пять типов комбинации расположения их на одном волоске: терминальное, субтерминальное, центрическое, суб-базальное, а также волоски только с розовыми клетками. •

В пунктах, расположенных вблизи химического производства были обнаружены эолоски со всеми типами расположений мутационных событий с преобладанием субтерминального, превышающего терминальное и суббазальное расположение в 2-3 раза. На этом же расстоянии от химического производства, вблизи поверхности земли (вариант "I") были обнаружены полностью мутантные волоски с розовыми клетками, процент которых составил 0,006.

В варианте "Ш", при наибольшем отдалении от источника загрязнения отмечается высокий процент субтерминального расположения

/о

0,50-

г

I

0,40-

рецессивных мутаций, составляющий 0,090 как и в варианте "I", но в отличие от изученных вариантов в данном случае снижен процент расположения суббазальных и центрических мутаций.

Следует отметить, что полностью мутантные волоски с розовыми .клетками отмечены только в варианте "I" и не были обнаружены в вариантех "Я" и "Ш".

В зоне жилого массива, расположенного на расстоянии около километра от химических предприятий, кроме рецессивных мутаций заметно повышается также частота генетически неопределенных мутационных событий, процент которых особенно повышается в пунктах "I" и "Д", равноудаленных от предприятий, но расположенных на разных высотах от поверхности земли. Однако, как показывают данные, максимальной частоты они достигают в первом пункте, находящемся близко к поверхности земли, где их частота в 3,9 раза превышает спонтанный уровень и в 2,2 раза - уровень бесцветных мутационных событий второго пункта, расположенного на высоте 6 м от поверхности земли (рис. 4). В зоне, отдаленной от источника загрязнения на 'расстоянии 1300 м (вариант "Ш"), частота генетически неопределенных мутаций частично падает и превышает контроль лишь в 1,4 раза.

Таким образом, результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о высокой мутагенной активности выбросов в атмосферный воздух комплекса загрязнителей от адпных химических производств.

В следующей серии экспериментов, растения были размещены на расстоянии 1,5-2 км от комплекса химических предприятий, в южном направлении города на разных высотах. Эти варианты условно обозначены как: "А" -5 м, "В" - 13 м, "С" - 32 м от поверхности земли. В этот период в комплексе производственных загрязнителей количество хлоропрена превышало норму в несколько раз (норма -0,001-0,005 иг/и3). Это явилось причиной повышения частоты соматических мутаций, причем'максимальная частота рецессивных мутаций отмечена в варианте "В", а генетически неопределенных - в варианте "А" (рис.5). Весьма разнообразен и спектр расположения этих мутационных событий. Наиболее часто во всех вариантах, включая и контроль, клетки с рецессивными мутациями располагаются в терминальной и субтерминальной частях волоска. Для вариантов "А" и "В" характерно наличие событий,охватывающих целый волосок. Очень редким является базальное расположение, зафиксированное только в варианте "В" -0,0117/5. Более широкий спектр расположения указан-

/о

1,10 1.00-0.300,800.70 0.600.500.400.30 0,20 0.10-

Л

I

/7

V

к л & а /с л & с Рис. 5. Частота рецессивных (а) и генетически неопределенных (б) мутационных событий в

ВТН традесканции под воздействием атмосферных загрязнителей южной зоны города.

ных мутантных сегментов наблюдается в июне.

Яо всем вариантам исследования получены статистически достоверные различия (р< 0,001).

2.3. Мутагенное действие атмосферных загрязнителей в районах с перегруженным автомобильным транспортом и на остановках. В данной работе продукты выхлопных газов не рассматриваются изолированно, гак как они являются одним из многочисленных источников загрязнения города.

Дается суммарная оценка загрязнения воздуха в разных районах города - северном и восточном, то есть в точках "3" и "4й, расположенных в местах с перегруженным автомобильным транспортом и находящихся на дальнем расстоянии от химического производства.

Значения частот спонтанных соматических мутаций у растений < традесканции, служащих контролем для этих точек, не превышают

i

%

0.50 0.400.30

о.го-0.10-

I

I

/о

0.090.0&0.070.060.050.040.050.020,01-

Птя

я

ЛГ

Рис. 6.

3 1

ЛГ 3 V

Частота (I) и спектр расположения (2) рецессивных (а) и генетически неопределенных (б) мутеционных событий в ВТН традесканции, в населенных пунктах с перегруженным автомобильным транспортом.

0,03$. Однако результаты эксперимента показали, что процент рецессивных соматических мутаций в северной зоне ("3") составляет 0,157| (р<0,001), а в восточной ("4") -0,116$ (р«сО,001)(рис.6). Если судить по показателю рецессивных мутационных событий в этих пунктах отмечено превышение контрольного уровня соответственно в 6,5 и 4,8 раз. По этим данным восточная зона является менее загрязненной.

Спектр расположения генетически неопределенных мутационных событий более разнообразен.

Параллельно проведен анализ соматических мутаций для оценки действия выхлопных газов автотранспорта в течение разных месяцев на ВТН традесканции, размещенной на остановках.

Установлено, что наиболее высокий процент рецессивных мутационных событий, обнаружен в точке "З-Ч" восточной зоны в первый месяц исследования равный 1,1341$ и в точке "2-х-{" северной зоны в жаркий июльский месяц - 0,794$. Данные спектрального анализа расположения мутационных событий показали их широкое разнообразие по

месяцам, когда встречаются все типы их расположения кроме базаль-ного. Во всех пунктах исследования преобладает терминальный и субтерминальный тип расположения событий. Во все периоды исследования выявлены полностью мутантные волоски, а также всевозможные чередования в ВТН розовых,.бесцветных и голубых клеток.

Необходимо отметить, что в начале весны, в точке "1-Л" (центральная часть города) генетически неопределенные мутации составляли 2,9681$, с последующим спадом до 1,2370$ в мае и резким пиком в конце июня и в начале июля. Отмечается также их максимум в 3-ий месяц исследования - 3,6599$.

В точке "З-Ч" наибольший процент генетически неопределенных событий отмечен в конце периода исследования - 1,0971$ и в мае, т.е. во второй месяц исследования - 0,8269$.

2.4. Действие загрязнителей атмосферы на выживаемость и морфологические изменения ВТН и цветков традесканции. С помощью тест-системы ВТН традесканции, 1фоме выявления соматических мутаций, можно определить и жизнеспособность волосков. Невыжившими, или карликовыми, считаются волоски содержащие менее 12 клеток (Сперроу и соавт.,1977).

Для выяснения действия загрязнителей атмосферы на процесс жизнеспособности чувствительных клеток ВТН и выявления различных изменений как в них, так и в цветках был прослежен рост ВТН и все морфологические нарушения у растений,расположенных в изучаемых пункуах.

Подобный анализ ВТН выявил, что в населенных пунктах близ крупного химического производства возрастает процент образования невыживших волосков по сравнению с контролем. Наибольшее количество невыживших (карликовых) волосков отмечено в точке "1п,что почти в 2 раза превышает данные, полученные при анализе в точке "2" (табл. I).

В указанных пунктах отмечено образование разветвленных волосков тычиночных нитей. Их количество в точке "I" составляет 0,056+0,020$ (р<0,001), а в точке "2" - 0,046+0,020$ (р<;0,001).

Помимо этого, у растений, произрастающих в исследуемых районах, прослеживаются такие нарушения, как образование тычиночных нитей без волосков, пыльников без пыльцы, в некоторых случаях -срастание тычиночных нитей с завязью, изменение числа лепестков в цветке, образование уродливых цветков, уменьшение числа тычинок.

Таблица I

Типы морфологических изменений в ВТН традесканции под воздействием химических и транспортных загрязнителей

Варианты опытов Общее число анализированных волосков Разветвленные волоски невыжившие волоски

(пункты) % + т. Р % + т. Р

п^н "2"

"3"

»4"

Химические загрязнители

13305 0,056+0,020 =0,001 0,211+0,040 ^0,001

11038 0,046+0,020 <0,001 0,127+0,033 <0,001

Автотранспортные загрязнители

12175 0,272+0,047 <0,001 0,132+0,033 <0,001

12101 0,017+0,012 <0,001 0,356+0,054 <0,001

Подобные явления отмечены и при изучении действия автотранспортных загрязнителей в пунктах "3" и "4", где наблюдалось резкое уменьшение числа клеток в невыживших волосках, содержащих I, 2 или 4 клетки. В местах с перегруженным автомобильным транспортом число разветвленных и невыживших волосков составляет 0,272+0,047, а в пункте "4" наивысший процент невыживлих волосков 0,353+0,054 (р<0,001) (табл. I).

3. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСШ АНАЛИЗ ДЕЙСТВИЯ АТМОСФЕРНЫХ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ НА СЕМЕНА АЬЪЮТ СЕГРА

Для наиболее полного представления о мутагенном эффекте загрязнителей атмосферы выбросами химических предприятий, применена тест-система с использованием классического цитогенетического объекта, репчатого лука ( А1. сера ). С этой целью воздушно-сухие семена подвергались действию загрязнителей в течение определенного периода (30-10 дней), после чего проводился патогенетический анализ меристематических клеток корешков.

3.1. Действие производственных загрязнителей атмосферы на семена лука (А1. сера ).находящиеся в населенных пунктах близ химических предприятий. Анализ данных показал, что во всех изучаемых пунктах процент хромосомных аберраций превышал спонтанный уровень в 4-7 раз. Наиболее часто отмечаются аберрации хромосом типа делецяй (одиночные и парные фрагменты). Спонтанный уровень

аберраций составляет 2,8+0,55$ (табл 2).

Таблица 2

Частота хромосомных аберраций у А1. сера в пунктах исследования юго-западной зоны города

Количество 1н анализиров. § 2 ана-я я телофаз л н со о РЧ

Абер- Делеции Транслокации рации ——————————————————

хро- одиночн. парн. одиночн.одиноч. одиноч. моеом фрагм. фрагм. мпо_ мост с мост с

одним парным фрагм. фрагм.

$+т. %±Н1 %±иг %±т.

Контр. 899 2,8+ 0,6+ 0,6+ 1,6+ - -

0,55 0,25 0,25 0,42

II £1! 486 21,4+ 6,9+ 5,2+ 5,5+ 3,2+ 0,6+

1,86 1,15 1,00 1,03 0,79 0,25

"П" 571 15,6+ 3,8+ 1.4+ 4,3+ 1,2+ 4,9+

1,51 0,80 0,49 0,84 0,45 0,90

"Ш" 574 11,4+ 3,1+ ' 3,4+ 3,4+ 0,1+ 1.4+

1,32 0,72 0,75 0,75 0,13 0,49

В пункте "I" процент делеций с одиночным фрагментом составляет 5,9+1,15$, что превышает контрольный уровень в 11,5 раз. Процент одиночных фрагментов в клетках корешков растений, произрастающих на расстоянии 1000 м, но на высоте 6м- составляет 3,8+ 0,801, что в 6,1 раз превышает спонтанный уровень. Количество одиночных мостов с одним фрагментом в варианте "ПГ составляет 0,1+0,13$.

При анафазном анализе в ходе эксперимента были обнаружены такие хромосомные нарушения, как отстающие и опережающие хромосомы, а также мультиполярность-и редко встречающиеся фрагментированные хромосомы (табл. 3). Частота их во всех вариантах превосходит контроль в 4,9 - 6,5 раз.

3<2. Цитогенетический анализ генотоксических агентов загрязнителей воздуха на семена А1 . сера размещенные на разных высотах от поверхности земли. Выявлено, что во всех опытных вариантах, наблюдается повышение частоты хромосомных аберраций и нарушений по сравнению с контролем. Здесь также обнаружены хромосомные аберрации двух типов - делеции и асимметричные транслокации.

Таблица 3

Частота и спектр хромосомных нарушений у Д1 . сера в пунктах исследования юго-западной зоны города

Количество Наруше- Типы хромосомных нарушений_

§я Опережаю-Отстаю- Мультшо-Фрагмен-

£*§ ана-^ хромое. ^ вде дярные тирован.

телофаз % ±(л % % % %

Контр. 899 5,8+ 4,2+ 1,6+ - -

0,78 0,66 0,42

и ^п 486 38,1+ 14,7+ 12,6+ 10,7+ 0,1+

2,20 1,60 1,50 1,40 0,24

"Л" 571 30,6+ 14,6+ 7,3+ 8,7+ -

1,93~ 1,47 1,08 1,18 -

"Ш" 574 28,7+ 10,5+ 10,9+ 6,3+ -

1,88~ 1,28 1,30 1,01

Делении с большей частотой встречаются на наименьшей высоте (вариант "А") - 5,0+0,50$ и 3,5+0,421 (табл. 4). С повышением высо-

Таблица 4

Частота хромосомных аберраций у А1. сера в пунктах южной зоны города

н

0} со яз

н а ав

со о рр

Количество анализированных ана-телофаз

Аберрации хромосом

Делеции

Транслокации

одиночные фрагмен-

аарные фраг-

одиночн. мосты с одним фрагм.

% ± т.

+ иг % ± т. % ±пг.

одиночн. мосты с парным фрагм.

% ±т.

Контр. 2002 4,8+ 2,6+ 1,0+ 0,3+ 0,6+

0,48 0,35 0,22 0,17 0,17

"А" 1935 15,0+ 5,0+ 3,5+ 2,5+ 4,0+

о,зГ 0,50 0,42 0,35 0,44

"В" 1956 11,9+ 3,8+ 3,6+ 2,2+ 2,3+

0,73 0,43 0,42 0,33 0,34

"С" 1455 10,3+ 2,8+ 3,0+ 1.0+ 3,5+

0,14 0,43 , 0,44 0,26 0,48

ты их количество уменьшается. Подобная закономерность отмечается и при анализе транслокационных изменений. Здесь, как и в предыдущем опыте, в зависимости от высоты изменяется и количество отстающих и опережающих хромосом. Максимальное их количество выявляется в варианте "В" - 7,8+0,41$.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное нами исследование на основе оценки мутагенных эффектов загрязнителей атмосферного воздуха у растений показало возможность и целесообразность применения комплекса растительных тест-систем.

В качестве индикатора для оценки мутагенной активности атмосферного воздуха использовались три объекта: чувствительный клон 02 традесканции, репчатый лук (А1. сера ) и многолетнее растение виноград ( V . у!п!Гега ).

При планировании экспериментов учитывали сезонность, количество выбросов предприятий, а также метеорологические условия.

Согласно результатам экспериментов, система ВТН традесканции клона 02 позволяет улавливать динамику активности мутагенных веществ атмосферного воздуха, дает возможность прямого учета мутаций и может быть чувствительной тест-системой для генетического мониторинга.

Впервые примененный тест на определение процента стерильности пыльцы растений винограда, оказался менее чувствительным и является косвенным показателем мутагенного действия, так как нарушение процесса.образования пыльцевых зерен является следствием генетических, физиологических и биохимических процессов.

В качестве третьего объекта взяты сухие семена 11 .сера для изучения мутагенной активности промышленных загрязнителей среды с учетом частот аберраций хромосом в меристематических клетках.

Загрязняющие воздух вещества взаимодействуют между собой и с компонентами атмосферы, образуя вторичные продукты, которые усложняют состав атмосферных примесей и часто повышают их токсичность для организмов. Поэтому нами дается суммарная оценка загрязнителей атмосферы. Выявлено, что наибольшая частота рецессивных мутаций отмечается в юго-западной зоне города, где размещен ряд химических предприятий. В этой же зоне отмечается наибольший процент стерильной пыльцы. В данной зоне в точке "I", находящейся

ближе к источнику загрязнения, отмечается самый большой процент рецессивных мутационных событий - 0,203+0,040$ и 44,04+0,90$ стерильной пыльцы. У растений традесканции в этой точке наблюдались также различные уродства цветков и ВТН, такие как срастание тычиночных нитей с завязью, отсутствие пыльников, наличие четвертого лепестка и др. У винограда происходило в больших количествах осыпание цветков и высыхание соцветий. В этой точке обнаружено 0,056+0,020^ разветвленных и 0,211+0,040$ невыживших волосков традесканции.

В точке "2" юго-западной зоны, наиболее отдаленной от источника загрязнения, число рецессивных мутаций превышает спонтанный уровень в 5,3 раз, а в точке "I", контроль превышен в 8,5 раз. Однако здесь отмечается большой процент стерильной пыльцы винограда (66,0+0,86$).

У растений традесканции наблюдалось образование также большого количества генетически неопределенных мутационных событий, превышающих контроль в 9,8 раз, а в точке "I" отмечено превышение в 6,8 раз.

Таким образом, в юго-западной зоне города по спектру расположения ыутантных сегментов выявлено преобладание розовых сегментов с терминальным расположением, в сравнении с волосками с множественными событиями. Такая закономерность прослеживается на обеих исследованных территориях. В спектре расположения генетически неопределенных мутационных событий в точке "I" преобладают волоски с множественными событиями, причем отмечается сочетание гигантских бесцветных клеток с розовыми, а в точке "2" -волоски с суббазальным расположением мутационных событий.

Интересно отметить, что в местах с перегруженным автомобильным транспортом (варианты "3" и "4") в спектре расположения рецессивных мутационных событий также преобладают волоски с терминальным расположением мутантных сегментов. Как уже отмечалось, в северной зоне ("3") и в восточной ("4") в суше мутагенных факторов, преобладают факторы, действующие на рост и развитие ВТН традесканции и приводящие к морфологическим изменениям. В этой зоне число разветвленных и невыживших волосков достигает максимума. Особенно четко в точке "4", к концу опыта почти в 2,5 раза увеличивается количество волосков с рецессивными мутационными событиями. Такого явления не наблюдалось в точке "3". Необходимо отметить,- что точка "4" больше перегружена дизельным транспор-

том, а точка "3" легковым. Во всех районах к концу опыта отмечается увеличение количества генетически неопределенных мутационных событий, что, возможно, связано с повышением температуры.

В северной зоне у винограда стерильные пыльцевые зерна достигают 18,3+0,70$, а в восточной - 41,4+0,11%. Это сравнительно высокие показатели стерильности, если учесть, что в юго-западной зоне ("I") отмечено 44,04+0,90$ стерильной пыльцы, хотя там использовалась пыльца более чувствительного сорта Мсхали, по сравнению с сортом Арарати, о чем свидетельствуют показатели контроля. Показано, что пыльца винограда является достаточно устойчивой к генотоксикантам.

Таким образом, при сравнении изученных тест-объектов Trade а-cantia и v . vinifera наблюдается неоднозначная реакция на внешние условия, что подтверждается литературными данными. Образование стерильных пыльцевых зерен служит косвенным показателем генотоксических эффектов, о чем свидетельствуют также выявленные у винограда различные аномалии, заключающиеся в дегенерации яйцевого аппарата, эндосперма, отсутствии зародыша, раннем отмирании зародышевых мешков, дегенерации самих семяпочек и завязей.

Оценка генотоксичности промышленных загрязнителей атмосферного воздуха в жилом массиве, на расстоянии от I до 1,5 км от крупных химических производств, проведена при сравнении Trades -cantia и Al . сера . Цитогенетический анализ позволил выявить индивидуальные различия этих объектов под действием мутагенных факторов внешней среды.

Следует отметить, что состав и распределение загрязнителей в воздухе неоднородны. Частота рецессивных и генетически неопределенных мутационных событий, в жаркие летние месяцы на меньшей высоте увеличивается, и, наоборот, отмечается их некоторое уменьшение на большей высоте от поверхности земли.

Установлено, что метод анализа аберраций хромосом в клетках Al . сера может также с успехом применяться не только для определения мутагенности отдельных компонентов воздуха ( Grant , 1982), но и для суммарной оценки мутагенной активности загрязнителей химического производства. С помощью цитогенетичес-кого анализа установлено, что во всех опытных вариантах, по сравнению с контролем повышена как частота хромосомных аберраций, так и хромосомных нарушений.

ВЫВОДЫ

1. Проведено комплексное исследование суммарного генотоксического эффекта при действии промышленных и автотранспортных загрязнителей атмосферы в населенных пунктах г.Еревана, на разных растительных объектах: на волосках тычиночных нитей клона 02 традесканции, в сухих семенах А1 . сера и на пыльце винограда для анализа частоты соматических мутаций, хромосомных аберраций и гаметоцидного действия изученных факторов.

2. Выявлено, что атмосферные загрязнители как химического производства, так и автотранспорта в значительной мере (в пунктах вблизи химического производства превосходя контроль в 5,3 -8,5 раз, вблизи автотранспортных коммуникаций в 2,5 раза) повышают частоты соматических мутаций у клона 02 традесканции, хромосомных аберраций у репчатого лука и стерильность пыльцевых зерен винограда.

3. По суммарной оценке генотоксического действия атмосферных загрязнителей, максимальных эффект отмечен в юго-западной зоне города, насыщенной химическими предприятиями, где наблюдается и резкое повышение частоты рецессивных и генетически неопределенных мутационных событий в ВТН традесканции и увеличение стерильности пыльцевых зерен винограда.

4. При анализе в клетках £1 . сера установлено повышение частоты хромосомных аберраций по сравнению с контролем (р«сО,01).Максимальное их количество выявляется в районах химических предприятий при хранении семян на высоте 3 метров от поверхности земли.

5. Выявлена зависимость индукции соматических мутаций у традесканции от условий ее культивирования. В летние месяцы на меньшей высоте от поверхности земли увеличивается частота рецессивных и генетически неопределенных мутационных событий, и, наоборот, на большей высоте от поверхности земли и при более низких температурах частота уменьшается, превосходя контроль в 1,4-3,5 раз.

6. Обнаружено, что атмосферные загрязнители химических про- -изводств и автотранспорта помимо генотоксического действия сильно влияют и на физиологические и морфологические процессы ВТН и цветков традесканции, а также на генеративную сферу винограда.У растений, растущих в юго-западном, южном, восточном и северном районах города образуются невыжившие (карликовые) ВТН и их раз-

ветвления, изменения числа тычинок и лепестков цветка традесканции, а также различные аномалии в эмбриогенезе винограда,, приводящие к осыпанию цветков и высыханию соцветий.

7. Использованный комплекс тест-объектов обладает хорошей воспроизводимостью на основе простых методик учета и может быть рекомендован для суммарной оценки генотоксического действия загрязнителей атмосферного воздуха, включая химические производства и интенсивное движение автотранспорта. .

Основные положения диссертации опыбликованы в работах:

1. О стерильности пыльцы некоторых сортов винограда// Ученые записки ЕГУ.- 1985.- № 3 (160).- C.I07-II0 (совм. с Е.Г.Симонян).

2. О некоторых аномалиях в формировании завязи и семяпочек винограда// Ученые записки ЕГУ.- 1986.-й I (161).- С. II9-I22 (совм. с Е.Г.Симонян).

3. Определение стерильности и фертильности пыльцевых зерен винограда, возделываемых в разных зонах г.Еревана//Тезисы докл. засед.сенц.ген.асп. пробл."Человек и биосфера" МНТС ГКНТ.-Орджо-накидзе, 1986.- С. 116 (совм. с Е.Г.Симонян).

4. Изучение действия экологических факторов на объем пыльцевых зерен винограда ( v . vinifera )// Тезисы докл. У съезда арм. отдел. ВОГиС им. Н.И.Вавилова.-Ереван, 1987.- С. 63 (совм. с Е.Г.Симонян).

5. Воздействие экологических факторов на стерильность пыльцы винограда ( т . vinifera )//Тезисы докл.У съезда ВОГиС им. Н.И.Вавилова.-Москва,1987.- С. 259-260 (совм. с Е.Г.Симонян).

6. Генотоксическое действие загрязнителей атмосферы на высших растениях// Тезисы докл.Международного симпоз..Ереван,1987.-С. 70-71 (совм. с В.С.Погосян, Е.Г.Симонян, Э.А.Агаджанян).

7. Выявление действия загрязнителей атмосферного воздуха с применением растительных тест-объектов //Вопросы биологии. Межвузовский сборн. науч.тр., Ереван, 1987.- Вып.5.- С. 49-59 (совм.

с Е.Г.Симонян, В.С.Погосян, А.О.Суджян).

8. Некоторые нарушения в развитии семяпочек винограда, связанные с воздействием различных условий //Тезисы XI Международного симпоз. эмбриологов, Ленинград.- 1990.- С. 208 (совм. с Е.Г.Симонян).

9. Некоторые нарушения в процессе мейоза винограда, связанные с воздействием различных условий// Известия СО АН СССР.-сер.

биол.науки.- Вып.2.- 1990,- С. 33-34 (совы, с Е.Г.Симонян).

10. Некоторые нарушения в развитии семяпочек винограда, связанные с воздействием различных условий// Сборн. докл. XI Международного симпоз., Ленинград.- 1990 (совм. с Е.Г.Симонян) (в печати).

11. Оценка генотоксического действия антропогенных факторов на растениях в городских условиях // Цитология и генетика.-1991 (совм. с Е.Г.Симонян, В.С.Погосян, Р.М.Арутюняном) (в печати).

Сдано в производство 4.01.1990г. Бум. 60x84- печ. 1,5 листа Заказ I Тираж 100

Цех "Ротапринт" Ереванского госуниверситета. Ереван, ул. Мравяна й I.