Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сульфатвосстанавливающие бактерии заводняемых нефтяных пластов Апшеронского полуострова

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Сульфатвосстанавливающие бактерии заводняемых нефтяных пластов Апшеронского полуострова"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 579. 26. 266: 579. 3

ГАЛУШКО Александр Сергеевич

Сульфатвосстанавлквающие бактерии заводняемых нефтяных пластов Апшеронекого полуострова

Специальность 03. 00. 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990

Работа выполнена в Институте микробиологии АН СССР

Научные руководители: доктор биологических наук, член-корреспондент АН СССР |с. И. Кузнецов , кандидат биологических наук Б. П. Розанова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. М. Горленко,

кандидат биологических наук А. Я. Образцова Ведущэе учреждение: Институт озероведения АН СССР

Защита Диссертации состоится "(Äl' ... _1990г.

в sf часов на заседании специализированного совета Д. 002.64.01 в Институте микробиологии АН СССР по адресу: 117312, г. Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР.

Автореферат разослан n/0,_JrCj± ;Й90г.

Ученый секретарь специ зированного совета, к.

JL Е. Никитин

Актуальность проблемы. Распространение сульфатвосстанавли-ваюшцх бактерий в пластовых водах нефтяных месторождениях установлено еще в тридцатых годах (Гинзбург-Карагичева,1926; Bastin, 1926). До последнего времени оставалось не ясным, какие продукты используют сульфатвосстанавливающие бактерии в заводняемых нефтяных пластах. Одной из гипотез, объясняющей развитие этих микроорганизмов в рассматриваемых экосистемах, служило предположение, согласно которому сульфатвосстанавливавющие микроорганизмы окисляют промежуточные продукты, возникающие в процессах аэробного разложения нефти (Кузнецова,Ли,1964; Кузнецова,Горленко, 1965; Горленко,Кузнецова,1966). Эта гипотеза получила научное обоснование: в пластовых экспериментах по активации пластовой микрофлоры и лабораторных опытах по микробиологическому окислению углеводородов было выяснено, что такими продуктами могут служить жирные кислоты (Беляев с соавт. ,1982; Иванов с соавт. ,1985; Hazina et al. ,1985). В настоящее время известно большое количество сульфатвосстанавливающих бактерий, разлагающих жирные кислоты (Widdel,1988). Однако, до 80-х годов в нефтяных пластах в основном изучали распространение и видовой состав сульфатвосстанавли-вающих бактерий, учитываемых на среде с лактатом. Эти микроорганизмы, как правило, не способны окислять жирные кислоты. Таким образом, с научной стороны актуальными являлись исследования, связанные с поиском и выявлением закономерностей распространения бактерий, восстанавливающих сульфат за счет разложения жирных кислот.

Изучение трофических цепей окисления углеводородов, состава сообщества сульфатвосстанавливающих бактерий нефтяных месторождений актуально в связи с решением ряда практических проблем, включающих разработку и применение микробиологических методов увеличения нефтеотдачи нефтяных пластов, борьбы с коррозией нефтепромыслового оборудования и др.

Цели и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению сульфатвосстанавливающих бактерий заводняемых нефтяных коллекторов Апшеронского полуострова, их роли в трофической цепи аэробно-анаэробного окисления органического вещества.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем. 1.

- г -

Изучить численность сульфатвосстанавливающих бактерий, окисляющих лактат и жирные кислоты, а также определить скорость развития процессов сульфатредукции в разных участках заводняемых нефтяных пластов. Исследовать возможность развития сульфатредукции за счет окисления органических веществ, присутствующих в сборных нефтепромысловых водах. 2. Выделить чистые культуры сульфатвос-станавливающих бактерий разных метаболических типов из пластовых вод нефтяных месторождений Бакинского района Апшеронского полуострова; исследовать морфологию и физиолого-биохимические свойства, способствующие их распространению в нефтяных пластах. 3. В лабораторных экспериментах выявить возможность образования сероводорода при окислении метана сообществом метанотрофных и сульфатвосстанавливающих бактерий. .

Научная новизна работы. Изучено распространение сульфатвосстанавливающих бактерий, способных окислять жирные кислоты, в заводняемых нефтяных пластах Апшеронского полуострова. Исследуемые микроорганизмы поступали в коллекторы с сборными нефтепромысловыми водами и были приурочены к областям распространения последних в пластах. Показано, что одним из источников органического вещества, окисляемого в нефтяных пластах изученных месторождений в сульфидогенных процессах, являются соединения, содержащиеся в сборных нефтепромысловых водах (в том числе соединения нефтяного происхождения).

■ Сульфатеосстанавливающие бактерии нефтяных пластов Апшеронского полуострова,- окисляющие низшие жирные кислоты, представлены различными родами. Три изученные культуры принадлежали к родам 0ези1ГоЬи1Ьиз, 0ези1ГогтсгоЬшт и ОезиИ^оЬасЬег шт; охарактеризованы их физиолого-биохимические свойства. Два штамма описаны как новые виды 0ези1ГописгоЫит арзЬегопиш ер. поу. и ОеэиНЪЬас^егШт се^гпсит эр. поу.

В лабораторных экспериментах выявлено образование сероводорода при окислении метана в градиенте Е1ч ассоциациями метанотрофных и сульфатвосстанавливающих бактерий.

Практическая ценность исследования. 1. Результаты исследований распространения и активности сульфатвосстанавливающих бактерий позволили оценить микробиологическую обстановку участков нефтяных пластов, выбранных для проведения экспериментов по уве-

личению нефтеотдачи с применением микробиологического метода. 2. Выделенные чистые культуры сульфатвосстанавливающих бактерий рекомендованы для оценки активности реагентов, применяемых для подавления бактериальной сульфатредукции в нефтяных пластах. 3. Результаты, касающиеся развития микробиологических сукцессий с участием метанотрофных бактерий необходимо учитывать при разработке новых вариантов микробиологического метода повышения нефтеотдачи пластов.

Апробация работы. Материалы диссертации сообщены на конференциях молодых ученых (г. Москва,МГУ, 1988; г. Баку,АН АзССР, 1988), на девятом международном симпозиуме по биогеохимии окружающей среды (г. Москва,1989) и на симпозиуме европейской федерации микробиологических обществ (г. Марсель,Франция, 1989).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 8 статьях и тезисах.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 151 страницах машинописного текста и включают 26 таблиц, 14 рисунков. Список литературы содержит 250 наименований работ.

Место проведения работы. Работа выполнена в Институте микробиологии АН СССР в лаборатории микробной биогеохимии (зав. отделом - академик АН СССР Иванов М. В.).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы полевых исследований. Объектами изучения служили заводняемые нефтяные месторождения Бакинского района Апшеронского полуострова, залегающие в продуктивной толще третичных отложений.

Пробы нагнетаемых вод отбирали на распределительных станциях непосредственно перед нагнетанием их в пласты, пластовых -из пробоотборных кранов скважин с помощью насосного метода.

Eh и pH в изучаемых водах определяли стандартными методами (Резников с соавт. ,1970; Романенко,Кузнецов,1974). Содержание ацетата, этанола анализировали с помощью газового хроматографа (Cochrane,1975); концентрацию кислорода, растворенного в водах, исследовали с помощью обратного иодометрического титрования, мо-

дифицированного для анализа в присутствии органического вещества и восстановителей (Резников с соавт, ,1970). Определение других газов (водорода и метана) осуществляли газохроматографическим способом. Колориметрическими способами выявляли формиат (Lang, Lang,1972) и сероводород (Cline,1969).

Количественный учет углеводородокисляющих микроорганизмов проводили методом предельных разведений на модифицированной среде Раймонда с нефтью или гексадеканом (Розанова,Назина,1982); сбраживающих углеводы - на агаризованной глюкозо-пептонной среде (Назина с соавт. ,1988). Культивирование метанотрофных бактерий осуществляли на среде П согласно рекомендациям Е Ф. Гальченко (Гальченко с соавт.,1986). . Сульфатвосстанавливающие бактерии выявляли методом посева на среды с лактатом, формиатом, бутиратом и пропионатом, которые вносили в концентрации 1,5 г/л. Минеральной основой сред служил солевой раствор, предложенный Ф. Видде-лем и Н. Пфеннигом (среда ЕЛ). Увеличение концентрации сероводорода в ней служило критерием роста микроорганизмов.

Интенсивность бактериального восстановления сульфата в изолированных пробах изучаемых вод определяли радиоизотопным методом (Иванов,1956; Романенко,Кузнецов,1974). Скорость окисления

* 14

метана анализировали, применяя • СН4 (Беляев с соавт. ,1975; Аб-рамочкина с соавт. ,1987).

Методы лабораторных исследований. Приготовление сред, выделение и культивирование сульфатвосстанавливающих бактерий осуществляли согласно принципам работы с анаэробными микроорганизмами (Hungate, 1969) и рекомендациям®. Видделя (1980). Чистые культуры микроорганизмов получали путем многократных пересевов колоний, вырастающих в толще агаризованных питательных сред БП, на соответстующие жидкие. Чистоту культур контролировали с помощью микроскопирования и посевами на среды для аэробных и анаэробных гетеротрофных бактерий. .

Морфологию микроорганизмов изучали в световом микроскопе "Reichert” с фазово-контрастным устройством и в злекронном микроскопе JEM-100. Препараты для микроскопии готовили общепринятыми методами.

Выделение ДНК из бактерий осуществляли по методу Д. Марму-ра (1961). Содержание ГЦ определяли по температуре плавления ДНК

- 5 -

с помощью спектрофотометра "Beckman".

В экспериментах по совместному культивированию метанотроф-ных и сульфатвосстанавливающих бактерий создавали градиент Eh способом, предложенным X Ципионка и соавт. (1985). Для этого готовили суспензии сульфатвосстанавливающих бактерий, отмытых от культуральной среды в восстановленной дитионитом агаризованной минеральной среде ВП, содержащей резазурин (1 мг/л). Подготовленные суспензии помещали в пробирки для культивирования мета-нотрофных бактерий со стеклянными колпачками. На поверхность среды помещали метанотрофных бактерий. Пробирки помещали в атмосферу метана и воздуха. Через некоторое время определяли послойное содержание сероводорода и формиата в агаре. Контролями ■ служили варианты опытов, где присутствовали либо метанотрофные, либо сульфатвосстанавливающе микроорганизмы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Экология сульфатвосстанавливающих бактерий заводняемых нефтяных месторождений Апшеронского полуострова

В последние десятилетия нефтяные месторождения Апшеронского полуострова заводняют сборными нефтепромысловыми водами. В связи с этим в настоящей работе предпринята попытка изучения сульфатвосстанавливающих бактерий этих вод и возможность влияния органических веществ, содержащихся в них, на сульфидогенные процессы в пластах. Нами были исследованы заводняемые сборными нефтепромысловыми водами месторождения Лок-Батан, Сабунчи и Бинага-ды Бакинского района Апшеронского полуострова.

В сборных нефтепромысловых водах присутствовали органические соединения, разлагаемые как непосредственно в процессах сульфатредукции, так и в аэробно-анаэробных сукцессионных сульфидогенных процессах. Особенностью этих вод являлось наличие значительных количеств продуктов нефтяного происхождения (нафтеновых кислот).

Закачиваемые воды содержали сообщества микроорганизмов, способных преобразовывать углеводороды и метан с образованием сероводорода. В составе сульфатвосстанавливающей микрофлоры присутствовали бактерии, учитываемые на средах с низшими жирными

- б -

кислотами (табл. 1). Количество последних было на один-три порядка меньшим, чем учитываемых на среде с лактатом.

Таблица 1. Сульфатвосстанавливаклцие бактерии эакачи-' ваемых вод Апшеронских месторождений

'Месторождение ! Численность сульфатвосстанавливающих

^ ! бактерий (кл/мл), использующих

' I-----------------------------------------------

! лактат I бутират I ацетат ! формиат

Лок-Батан 103 102 10 -

Сабунчи 104 104 ,102 104

Бинагады 105 102 102 103

Для изучения возможности развития сульфидогенных процессов за счет окисления органических веществ, содержащихся в закачиваемых водах, были проведены опыты со сборными нефтепромысловыми водами. Через 1,5 месяца инкубации изолированных проб этих вод было отмечено полное потребление растворенного в них кислорода и накопление 39,2 - 130,5 мг/л сероводорода (табл. 2). Это свидетельствовало о возможности осуществления последовательных бактериальных аэробно-анаэробных сульфидогенных процессов только за счет трансформации органических веществ исследованных вод. Внесение в пробы гексадекана, нефти или метана вызывало увеличение выделения сероводорода по отношению к контролю (вода без добавок) на 14 - 61, 10 - 49 и 5 - 56 мг/л.

Таблица 2. Образование сероводорода в изолированных пробах нагнетаемых вод разных месторождений Апшерона

Месторож- !, Содержание ! Образование сероводорода в воде, мг/л

дения I Оо, !------------

! I без I + I + I +

I т/м | добавок I метан ! гексадекан I нефть

Лок-Батан 7,0 39,2 43,6 64,5 57,2

Сабунчи 12,5 130,5 186,5 191,2 179,2

Бинагады 6,5 51,1 57,6 65,4 62,0

* - пробы инкубировали в темноте при 30°С в течение 45 суток.

В таблице приведены средние значения двух измерений.

Таким образом, сборные нефтепромысловые воды содержали ор-

ганические вещества, разложение которых в пластах может вносить вклад в сульфидогенные процессы. Необходимо отметить также влияние метана на образование сероводорода микрофлорой этих вод.

Обнаружена связь активности микробиологических сульфидогенных процессов в колоннах нагнетательных скважин, заполненных сборными нефтепромысловыми водами, с длительностью заводнения месторождений Сабунчи и Бинагады (табл. 3). Первое месторождение заводняли с начала восьмидесятых, последнее - с тридцатых годов.

В колоннах остановленных на одни сутки нагнетательных скважин Сабунчинского месторождения сохранились аэробные условия. Присутствие метана и водорода не обнаружено. Количество сульфатвос-станавливающих бактерий практически не отличалось от численности их в нагнетаемой воде. В колоннах нагнетательных скважин месторождения Бинагады обнаружена иная ситуация (табл. 3): через сутки после прекращения нагнетания, в воде появляется сероводород в количестве 9-11 мг/л, следовые количества водорода и метана. -Несмотря на то, что численность сульфатвосстанавливающей микрофлоры осталась такой же, как в нагнетаемой воде, скорость восстановления сульфата была очень высокой и достигала 2,8 - 8,0 мг 5/л в сутки. Это составило 28 - 78 % от обнаруженных концентраций сероводорода и свидетельствовало о том, что он был образован на месте.

При исследовании призабойных зон нагнетательных скважин месторождения Лок-Батан обнаружена разнообразная микрофлора, участвующая в окислении нефти и ее продуктов (табл. 4). Несмотря на значительные колебания Ей исследованных вод, сульфатвосста-навливающие бактерии присутствовали во всех пробах. Максимальные их количества, составляющие 104- Ю5 кл/ мл, были определены на среде с лактатом. Численность микроорганизмов, способных окислять жирные кислоты, варьировала от 0 до 104 кл/мл.

нк участках пластов, где проникновение закачиваемых вод было ограниченным, сульфатвосстанавливающая микрофлора в основном была представлена бактериями, учитываемыми на среде с лактатом (табл. 5). Для вод этих участков характерна низкая скорость сульфатредукции. ,

Во всех проанализированных пробах пластовых вод Бинагадин-ского месторождения, где закачиваемые воды в значительной степе-

Таблица 3. Экологические условия, микрофлора и интенсивность сульфатредукции в

воде из колонн нагнетательных скважин месторождений Сабунчи и Бинагады

1 Мине-1 ? I ! Н? и I Количество бактерий (кл/мл) !Интен-

Месторождение,!рали-!502,1НрБ,! !------------------------------------------!сивность

!за- ! I I СН4, !углево-!сбражи-!сульфатвосстанавливающих1 сульфат-скважины !ция, ir/л !мг/л! 1дород- !вавдих 1на средах с ' !редук-

! г/л 1 ! ! ка- !окисля-! глюкозу!------------------*------!ции,

! ! I ! чест- !юших ! !лак-!бути-!ацета-!форми-!мкг S/л

l.t I ! венно I I !та- !ратом!том !атом f в

! ! ! I ! ! !том ! ! 1 !сутки

Сабунчи

998 35 0,21 0 0 105 105 ю4 103 10 103 -

1594 37 0,0 0 0 105 104 ю4 ю5 един. 105 -

969 32 0,28 0 0 105 103 103 един. 0 10 -

Бинагады

2656

2652

1832

19 0,37 9

20 0,54 10

19 0,55 11

н2,сн4

н2,сн4

10ч

10Е

10S

10е

10

104

10й

105

105

10°

104

102

ю2 103 3270

10 +* 2756

10 + 7990

Н

* - присутствие бактерий в пробах определили качественно, посевом 1 мл пробы;

Таблица 4. Численность сульфатвосстанавливаюцих бактерий в воде из призабойных зон нагнетательных скважин

! ? I Численность бактерий в 1 мл

Пробы I ЕЬ, I Н-Б, I-------------------------------------------------

I 1 Iуглево-1сбраш- ! сульфатвосстанавливающих

! мв ! мг/л I дородо-! вающих !на средах с

I ! !кисля- !глюкозу !---------------------------

! ! !ющих ! !лак- ! бути-1 пропио-1 аце-

! ! 1 ! I татом! ратом! натом 1татом

1240а +110 0 106 К* О ) сл ю5 ю3 ь-ь О ) СО 10

12406 +100 0 105 10°* ю4 ю2 10^ 0

8986 -80 20 103 ю2 ю4 ю4 ю4 10'

2696 -185 238 102 ю2 ю5 103 ю2 0

а - вода с перфораций скважины;

б - из призабойной зоны.

ни заместили пластовые, присутствовал сероводород в количествах обратно пропорциальных содержанию сульфата и составлявших 12 -489 мг/л (табл. 5). Результаты учета сульфатвосстанавливающей микрофлоры на средах с лактатом и ацетатом подтвердили вывод о том, что в заводняемых длительное время нефтяных пластах Апше-ронского полуострова бактерии, способные окислять жирные кислоты, могут иметь численность равную (и даже большую), чем количество микроорганизмов, учитываемых на среде с лактатом (Магш'а еЬ а1. ,1985). Содержание последних в исследованных водах состав-

р о ■ '

ляло 10 - 10 кл/мл, в то время как численность бактерий, спо-собнйх окислять ацетат, достигала 104 кл/мл (табл. 5). Следует отметить, что высокое содержание сероводорода в пластовых водах не всегда соответствовало интенсивно протекающим процессам сулъ-фатредукции (табл. 5 и 6). Так, сероводород, обнаруженный в водах, извлеченных из скважин 1024* 2484 и 2486, был принесен из зон с активным сульфидогенезом.

Таким образом, можно заключить, что в исследованных нами нефтяных месторождениях широко распространены сульфатвосстанав-ливающие бактерии, учитываемые на среде с лактатом. Микроорганизмы, способные окислять жирные кислоты, распространены на отдельных участках, характеризующихся присутствием большой доли закачиваемых вод (или длительным воздействием заводнения).

Таблица 5. Химический состав, Eh и микрофлора вод, извлекаемых из добывающих скважин месторождения Лок-Батан х

1Ыине-1 ! 5» 1/ > Количество бактерий (кл/мл)

Скважины !рали-1 Eh, lS07,IHpS,l--------------------------------------------------

!за- ! ! ! 1углево-1сбражи-1 сульфатвосстанавливагощих

1ция, I мв ! мг/л! мг/л! дород- 1 вагащих !на средах с

* ! г/л I ! I 1 окисля-! глюкозу!-

! ! ! 1 Тпцих ! I лакта-!бути-!ацета-1форми-

I I 11! ! !том 1ратом!том !атом

! ! ! 1 Г I I ! ! !

1024 27 -210. л 368 _ 10 • един. 0 един. 10 22

891 26 + 20 io 0 103 10? 104 един. 0 ю2 24

478 26 + 20 5 0 0- 0 ' 0 0 0 0 19

1226 25 - 25 675 0 10 10 102 10 един. 10 -

1155 25 + 10 93 0 10 0 102 0 един. един. -

125 32 +110 242 0 един. един. 104 един. • 0 -

1230 37 - 58 ✓ 0 0 102 103 един. един. - 6

. 12-41 28 - 165 0 103 10 ' 104 един. един. - 3

671 30 +180 247 0 един. 103 105. •102 10 10 - 4

170 47 - 170 0 - - - 0 - -

84 ,38 +100 384 0 - - 103 ' - 0 - -

Интенсивность сульфат-редукции, мкг S/л в

пределы 25 - +180- 5- 0- о п -е .. о

колебаний 37 -210 675 . 368 0-10d О-Ю^ 0т10° 0-10 0-10 0-10* 3-24

- и -

Таблица' 6. Сульфатвосстанавливающие бактерии вод, извлекаемых из добывающих скважин Бинагадинского месторождения .

! ! 0.1 ! Численность микроорганизмов!Интенсив-

Скважины! Eh,!S0¿,!НоЗ,! (кл/мл) на средах с . !ность

1 ! . ! 1! мв !мг-/л!мг/л! ! 1 ! ! ! .! ! ! лактатом ! 1 ■ ! ацетатом --! сульфат! редукции, !мг S/л ! в йутки

703 -30 2100 12 103 104 3,680

2484 -425 21 486 102 104 0,072

2486 -285 12 4£0 103 104 ч . 0,175

1 »

2. Сульфатвосстацавливающие бактерии, выделенные из нефтяных пластов Апщеронского полуострова

■При изучении видового состава и физиологических особенностей сульфатвосстанавливающих микроорганизмов заводняемых нефтяных пластов Апшеронского полуострова нами-были исследованы три чистые культуры этих бактерий. Первая из них - штамм ч1105 - выделена из синтрофной анаэробной бактериальной ассоциации, восстанавливающей сульфат при окислении ацетата (Розанова,Назица, 1981,1985). Две другие культуры - штаммы 480 и 1832 - были выделены нами из пластовых вод изученных месторождений на средах с бутиратом и пропионатом. Морфолого-физиологические свойства изученных бактерий представлены в таблице 7.

\ Культура 1105.представлена палочковидными клетками, несущими полярно распол9*енный жгутик. Бактерия не окисляла ацетат и другие -жирные кислоты, но использовала лактат, пируват, малат, фумарат и этанол, осуществляя окисление указанных субстратов до ацетата. Кроме того, бактерия окисляла водород и формиат. В отсутствие сульфата микроорганизм сбраживал пируват и фумарат. Акцепторами электронов могли служить сульфит, тиосульфат и элементная сера, но^не нитраты. Диспропорционирование соединений серы (сульфита и тиосульфата) на средах с лактатом или ацетатом не было оЬнаружено. Совокупность признаков - палочковидная форма клеток, присутствие десульфорубидина, неполное окисление субстратов, состав оснований в ДНК позволило описать культуру 1105

Таблица 7. Свойства сульфатвосстанавливающих бактерий нефтяных месторождений Апшеронского полуострова

! 0ези1ГогтисгоЫшп ! 0ези1ГоЬасЬе- I 0ези1ГоЬи1Ьиз Признаки ! арзЬегопит ! г!ит сеЬогисит I ргорюгнсиэ

! штамм 1105 1 штамм 480 ! штамм 1832

Морфология палочковидные палочковидные овальные

Размеры, 1,4 - 2,9 0,8 - 1,2 2,'0 - 2,3

мкм X X X

0,7 - 0,9 1,8 - 2,7 к-ь 0 1

Сульфитре- дуктаза ДР1 2 H. 0. Н. 0.

ГЦ, мол. % 52,0 59.0 - 60.0 Н. 0.

Цитохромы Ь,с Ь,с н. о.

Окисление до ацетата и до COg и HgO до ацетата и

субстратов Используют в процессе сульфатредукции: со2 со2

лактат + + +

жирные кислоты С1 СГ с1б О СО

спирты с2- с4 С2

бензоат - + . -

кетоны - + -

1 - десульфорубидин;

2 - не определяли.

как штамм нового вида 0ези1ГоШсгоЫшп арзЬегопит эр. поу.

Клетки культуры 1832 имели овальную форму. В процессе сульфатредукции микроорганизм окислял пропионат, лактат, пиру-ват и этанол. Окисление указанных субстратов сопровождалось образованием ацетата и углекислого газа. Помимо сульфата, акцепторами электронов служили тиосульфат и сульфит. Способность к се-роредукции и диспропорционированию соединений серы у исследуемого микроорганизма не обнаружена на средах с пропионатом и ацетатом. На основании использования определенного спектра субстра-

тов, их неполного окисления и отсутствию в клетках десульфовирй-дина исследованные бактерии классифицированы как штамм 1832 известного вида Desulfobulbus propionicus.

Культура 480 представлена неподвижными овальными и короткими палочковидными клетками. В начале стационарной стадии роста культуры на среде с бутиратом или валератом в клетках обнаружены одно-два включения, содержащие запасные вещества. За счет восстановления сульфата бактерии окисляли лактат, пируват, бензоат, этанол, пропанол, бутанол, формиат, ацетат, пропионат, бутират, валерат и другие насыщенные жирные кислоты до пальмитата. Кроме того, исследуемая культура использовала кетоны, а именно ацетон и метилэтилкетон. Присутствие в среде ацетона в количестве 3,5 г/л не ингибировало развитие.микроорганизмов, а оптимальными концентрациями, способствующими наиболее высокой скорости образования сероводорода были - 0,9 -'2,8 г/л. Микроорганизм полностью окислял лактат до углекислого газа и воды. Однако, при использовании 1 ’мМ бутирата бактерия выделяла в среду около 1 мМ ацетата. Это характерно для некоторых сульфатвосстанавливающих микроорганизмов, способных полностью окислять органические субстраты (Schauder et al. ,1986). Помимо сульфата, бактерия при окислении бутирата и лактата в качестве акцепторов электронов использовала элементную серу и тиосульфат.

Другие сульфатвосстанавливающие бактерии, выделенные из месторождений Апшеронского полуострова (Desulfovibrio desulfu-ricans штамм 2198, Dv. africanus штамм 2372, Dmm. apsheronum штамм 1105 и Dbs. pi'opionicus штамм 1832) не окисляли кетоны.

Обнаруженные отличия культуры 480 от известных сульфатвосстанавливающих бактерий, заключающиеся в палочковидной форме клеток, спектре используемых субстратов, отсутствии десульфови-ридина и высоком содержании ГЦ в ДНК позволили считать штамм 480 самостоятельным видом рода Desulfobacterium - Dbm. cetonicum sp. nov.

Все выделенные культуры сульфатвосстанавливающих бактерий росли в пределах температур от 4° до 37°С с оптимумом при 30°С. Культуры обладали одинаковой чувствительностью по отношению к содержанию в среде NaCl: росли в диапазоне концентраций от О до 50 - 80 г/л NaCl, с оптимумом при 10 г/л. Это свидетельствовало

- 14 - ,

о приспособленности выделенных культур к пластовым водам месторождений, имеющих минерализацию 20 - 40 г/л и температуру 30°С. Свойства выделенных культур подтвердили вывод о распространении сульфатвосстанавливающих бактерий разных метаболических типов в заводняемых нефтяных месторождениях Апшеронского полуострова.

3. Образование сероводорода сульфатвосстанавливающими бактериями в ассоциациях с метанокисляющими

Для решения четвертой задачи нами было изучено образование сероводорода сульфатвосстанавливающими бактериями при окислении соединений, образуемых метанотрофными микроорганизмами.

В экспериментах использовали микроорганизмы из коллекции

В. Ф. Гальченко (ИНМИ АН СССР): Methylosinus trichosporíum штамм 44, Methylobacter chroococcum штамм 44, Methylococcus capsulatus штамм 93. В качестве анаэробных компонентов ассоциаций испольао-вали Dv. desulfuricans штамм 2198 (из коллекции Е. П. Розановой), а также Dmm. apsheronum штамм 1105 и Dbm. cetonicum штамм 480, описанные в настоящей работе. .

Было выявлено, что Dv. desulfuricans способен использовать компоненты биомассы метанотрофных бактерий. После инокулирования восстановленной культуральной жидкости №. trichosporíum и МЬ. chroococcum суспензией клеток Dv. desulfuricans прирост сероводорода составил 17-35 мг/л. Увеличение..выделения сероводорода после внесения в среды формиата свидетельствовало о том, что развитие сульфатвосстанавливающих бактерий в этом случае было лимитировано доступным донором электронов.

При выращивании всех указанных метанотрофных микроорганизмов в условиях избытка кислорода выделение в среду промежуточных продуктов окисления метана не обнаружено. Однако, при развитии Vb. trichosporíum в условиях избытка метана и постепенного потребления кислорода вплоть до полного его исчезновения (исходное соотношение СН4/0г> колебалось в пределах 1,2 - 2,0), в культуральной жидкости этого микроорганизма был выявлен формиат в количестве 13 - 50 мг/л (табл. 8). Образование формиата было зафиксировано также при выращивании Мз. trichosporíum и Me. capsulatus на поверхности агаризованной среды. В этом случае формиат диффундировал в толшу среды. Культура Mb. chroococcum во всех

Таблица 8. Образование формиата Мз. ЬгЮЬозроп ит при росте в условиях лимитирования кислородом

Пов- I' Исходное ! СН/ ! тор- І содержа- ! ность! ние СНЛ в I !

л4

газовой

фазе,

мг

Оо

Потреб-

ленный

сн4,

мг

Образо- ! Количество ! СН4 пере! шедшего в , формиат, % } от потреб-| ленного

вание

форми-

ата,

мг

1 25,6 1,5 1,5 0,59 0,13 3,0

2 22,5 1,2 0,8 0,75 0,47 20,4

3 33,0 2,2 0,9 -- 0.50 19,3

4 29,0 • 1,6 1.3 1,02 0,13 3,5

5 31,6 2,0 0,7 0,40 0,28 13,9 .

среднее значение 28,3 • 1,7 1,0 0,69 0,30 12,0

перечисленных опытах не выделяла в среду формиат или метанол.

Эксперименты по инкубированию метанотрофных и сульфатвосс-танавливающих бактерий в градиенте Е1т показали, что при совместном культивировании №з. 1Пс1тозрогшт или Мс. сарзи1а1:.из и указанных сульфатвоестанавливающих бактерий, в слое среды под зоной роста метанотрофных бактерий образовь1валось 17 - 20 мг/л сероводорода (рис. 1). В аналогичных опытах с МЬ. сЬгоососсит сульфат-восстанавливающие бактерии сероводород не образовывали.

Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о том, что отдельные метанотрофные микроорганизмы, развиваясь в условиях с пониженным содержанием кислорода, способны осуществлять трофические связи с сульфатвосстанавливающими бактериями (рис. 2).

Эти процессы могут происходить в призабойных зонах нагнетательных скважин нефтяных пластов, где в составе пластовых газов обычно присутствует метан, происходят процессы современного метаногенеза (Беляев с соавт. ,1982; Иванов с соавт. ,1985; МагНча а1. ,1985) и куда закачивают воды, содержащие метанотрофные бактерии.(Борзенков с соавт. ,1988). Ограниченное поступление кислорода с нагнетаемой водой в пласт создает условия, способствующие образованию формиата отдельными метанотрофными микроорга-

содержание сероводорода, мг/л Рис. 1. Образование Н23 при совместном культивировании

сульфатвосстанавливающих и метанокисляющих бактерий., Ось ординат - расстояние от зоны роста метанокисляющих бактерий.

1 - Бу. с1ези1ГиПсапз и Мз. tгichospoгium•,

2 - Шэт. сеЬоШсит

а - без метанотрофных бактерий; б - + Мэ. и-ЮйозрогШт; в - + Мз. сарзи1аЬиБ.

А - зона роста метанотрофных бактерий;

Б - зона выделения Н?Б сульфатвосстанавливаодими бактериями.

Рис. 2. Микробиологическая сульфидогенная трансформация СН4 с участием метанотрофных и сульфатвосстанавливающих бактерий. А - аэробная; Б - анаэробная зоны.

низмами. Развитие последних в пласте было продемонстрировано нами на примере одной нагнетательной скважины Локбатанского месторождения. В пробах воды, извлеченных из призабойной зоны этой

О

скважины присутствовали метанотрофные бактерии в количестве 10 кл/мл, а скорость окисления метана составляла 0,45 мкл СН4/л в. сутки.

В Ы В . О Д Ы

1. Сборные нефтепромысловые воды, закачиваемые в нефтяные пласты Апшеронского полуострова, содержат органические вещества, включающие продукты нефтяного происхождения. Сообщества микроорганизмов нагнетаемых вод, имеющие в своем составе аэробные и анаэробные бактерии, окисляли эти органические вещества с образованием сероводорода.

2. Показано закономерное распространение в заводняемых коллекторах сульфатвосстанавливающих бактерий, окисляющих низшие жирные кислоты. Источником поступления в коллекторы этих бактерий являются закачиваемые воды. Максимальные количества микроорганизмов, достигающие 104 кл/мл, были приурочены к областям распространения в пластах закачиваемых вод.

Интенсивность процессов сульфатредукции в изолированных пробах пластовых вод варьировала в пределах от 10 до 8000 мкг З/л в сутки. Наибольшая скорость восстановления сульфата наблюдалась в анаэробных участках пластов, где были распространены закачиваемые воды.

3. Из пластовых вод исследованных месторождений выделены культуры сульфатвосстанавливающих бактерий, отнесенные к 0ези1-ГоЬи1Ьиз ргоргогисиз, 0ези1Гош1сгоЬшт арБЬегопшп Бр. поу. и 0ези1ГоЬас1епит се1огпсит зр. поу. Микроорганизмы принадлежали к разным метаболическим типам, различались набором используемых органических веществ и характером их окисления. Впервые из нефтяного пласта выделен микроорганизм, способный окислять обширный круг органических субстратов, включающий жирные и ароматические кислоты, кетоны и спирты.

4. В лабораторных экспериментах покааан новый путь бактериального образования сероводорода в процессах двухступенчатой

- 18 - . трансформации метана ассоциациями метанотрофных и еульфатвос-етанавливакицих микроорганизмов, развивающихся в градиенте Eh.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Галушко A.C. Образование сероводорода Desulfovibrio de-sulfurioans в ассоциации с метанокисляющими бактериями //Микробиология. -1987. -Т. 56. -Вып. 4. -С. 691-693.

2. Розанова Е. П , Галушко А. С. Образование формиата Methy-losinus trichosporium и использование его Desulfovibrio desulfu-ricaiis //Микробиология. -1987. -Т. 56. -Вып. 5. -С. 886-887.

3. Розанова E. IL .Назина Т. а .Галушко A.C. Выделение нового рода еульфатвоестанавливаюших бактерий и описание нового вида этого рода Desulfomicrobium apsheronum gen. nov. sp. nov. //Микробиология. -1988. -T. 57. -Вып. 4. -C. 634-641.

4. Галушко A. C. , Иванова A. E. Сульфатвосстанавливающие бактерии, распространенные в нефтяных пластах Апшерона //Тр. конф. мол. ученых. -Тез. докл. -Баку. -1988. -С. 59.

5. Галушко А. С. , Иванова А. Е. Окисление метана в призабойной зоне нагнетательной скважины нефтяного пласта Апшерона // Микробиология. -1989. -Т. 58. -Вып. 2. -С. 348-349.

6. Розанова Е. П .'Галушко А. С. Микрофлора воды бактериальных фильтров призабойных зон нагнетательных скважин нефтяного пласта при застойном режиме //Микробиология. -1989. -Т. 58. -Вып. 4. -

С. 653-657.

7. Розанова Е. И , Назина Т. Н., Галушко А. С., Иванова А. Е. Сульфидогенные процессы в заводняемых нефтяных пластах // 9-й Международный симпозиум биогеохимии окружающей среды. Тез. докл. -Москва. -1989. -С. 190.

8. Rozai.ova Е. P. .Galushko A. S. , Nazi na Т. N. Acetate decomposing sulfidogenic syntrophic association //FEMS Symposium "Microbiology and biochemistry of Strict Anaerobes Involved in Interspeeies Hydrogen Transfer". -Marseille,France. -1989. -P. 85.