Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АНАЭРОБНАЯ МИКРОФЛОРА ТЕРРИГЕННЫХ НЕФТЯНЫХ ПЛАСТОВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "АНАЭРОБНАЯ МИКРОФЛОРА ТЕРРИГЕННЫХ НЕФТЯНЫХ ПЛАСТОВ"

АКЛД9ШЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ ИИКРОЕИОШТИИ

,'/ <// V /О У/7 На правах рухопнож

. Г - ^т- (/?(/

НАЗИНА Тамара Николаевна

УДК 660.72:676.851

ЛШ.ЭР0ШАЯ МИКРОФЛОРА ШШШ НШТЯШ1 ПЛАСТОВ

Специальность 03.00.07 - шкродасиготяя

АВТОРЕФЕРАТ двсовртацщ* на соискание ученой степени кандидата бвологпвскнх наук

Москва - 1983

Работа выполнена е Институте микробиологии АН СССР

Научнкй руководитель: член-корреспондент АН СССР,

профессор С* И. Кузнецов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В, И, Дуда

доктор биологических наук, профессор Д.Г. Звягинцев

Ведущая организация - Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР

Защита состоится *Л/п пАЛ^ЯТУТ?с^у 19ВЗ г. в час. ¿Ояхя. на эаоеданяи специализированного совета Д 002.64.01 при Институте микробиологии АН СССР во адресу: 117312, г. Москва, В-312, проспект бО-летрт Октября, д. 7, корп, 2.

С диссертант^ ' „ а библиотеке Инотитута

микробиологии АН „

Автореферат разослав ' * 1983 г. Ученый секретарь

специализированного „ . ; " Л.Н. Москаленко

ВВВДЕНИБ

Актуатьнооть птюбденц. Познании закономерностей распространения анаэробншс микроорганизмов в разрабатываемых нефтяных коллекторах и факторов, обусловливающих их развитие, имеет большое теоретическое и практическое значение. В настоящее вреш детально исследована экологах и геохимическая деятельность в нефтяник пластах только сульфатвосстанавливакщих бактерий ( рвг±в , 1967; Розанова, Кузнецов, 1974). Показано» что необходимо предварительное окисление нефти углеводородокиеушкщиш бактериями; продукта их жизнедеятельности подвергаются анаэробному разложению сульфат-восстанавливающей микрофлорой с образованием сероводорода (Гор-ленко, КузнецоваГ 1966; .1оЪвою е. л* , 1979).

Микроорганизмы рада других физиологических групп, участвующих в преобразовании оргаюгческого вещества нефти с образованней метана, азота, углекислоты, оставались слабо изученными. Не проводилось массового обследования какого-либо нефтяного района с целью определения относительной заселенности различных участков пласта группам аэробных и анаэробных бактерий.

Дщг выяснения возможности применения микробиологического молода увеличения нефтеотдачи, требуется оценка реального соотно-ййнИя (икробкшюгических процессов и грувл микроорганизмов, осуществлявших их. Все это указывает на актуальность изучения апав-робкой микрофлоре терригенных нефтяных коллекторов,

Иель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению закономерностей распространения аназробьых микроорганизмов (сульфатвосстанавяивающнх, бродильных а ыетапобразуюцих бакте-■ри«) в пластовых водах» определенно роли указанных групп бактерий в процессе разрушения нефть, а такие Еыаснению возможности

современного Образования и'тптгп п пг^тпгиг иш , и' ¡ртЛГ'ТГгп ин-

*. зг^аз ей;;-::- ? ;

' ^ -->' ->'.«, Р.-*."- I

тенсишосттг этого процесса.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем.

1. Изучить закономерности распространения сульфатвосстанавли-ващих, бродильных и кетанобразуотих бактерий в различи их зонах заводняемого не$/гяного пласта.

2. Изолировать культуры сапфоорганизмов, преобладазацих в составе биоценоза анаэробно« зоки и провести их идентификацшо. Изучить шр;5олог1ш, ультратотсую структуру и физиологе-биохимические свойства вццеленнш: ;.::п:реоргашгл.юв. Выявить их физиологические особенности, способствуете распросгранению » условиях нефт/шого пласта.

3. Определить илтеис:тносгь микроб: ¡ологнче ского образования метана в пластовых водах нефтяного месторождения Еинагады.

4. В модельных окспзр'.ьментах установить возможность образования метана и водорода при разрушении различите типов нефти комплексом аэробных и анаэробна бактерий. Выяснить механизм прообразования нефти с выходом метана.

Научная нотгзпа работ». Впервые *;о;:аэана принципиальная возможность образован;»! молекулярного водорода и мотана из нефти в ходе аэробно-анаэробной микробиологической сукцессии. В пластовш: водах нефтяннх коллекторов Апшерона установлено существование современного процесса образования метана.

Впервые показано, что значительную часть микрофюрц пластовых вод, которая учитывается прямым гликроскопкческю 1 методом, составляли факультативно-анаэробные .сорннеподобные бактерии, отнесенные к Вг«ог±иа ги^васепе пот. оодЬ. Они спооМны развиваться за счет органического вещества, присутствующего в плао-то::оС поде в растворенном состояние.

4 ■

I,первое цеследозанг закономерности распространения и опредз-.

лено соотношение микроорганизмов нескольких физрологичес них групп а пластовых водах- Показано, что основная масса углеБОдо-родокксляищих бактерий находится в призабойных зонах нагнетательных скюдаш, куда проникает растворенный кислород. Анаэробные микроорганизмы (сульфат- и серовосстанавливаюцие, бродилыше и метанобразунцие бактерии) были распространены всюду на участках, затронутых влиянием заводнения.

Определено видовое разнообразие бактерий в нефтяных коллекторах Агаперонского полуострова. Из высокотемпературных плаотов Западной Сибири выделен и изучен новый подвад термофильных сульфатвосста-назливаюодх бактерий DusulfotomaculuM aigrifleaas шЬер. salinus , Впервые у сулыХатвосстанагшгоащих бактериК яоследо-ван процесс спорообразования и показано, что он протекает по механизму! описанному для бактерий рода Bacillus.

Практическая ценность исследования. Выявление факторов экологической обстановки, влияющих на образование мвтана микробной ассоциацией из нефтяных пластов, дало возможность на не^яных месторождениях Лпшерона отобрать участки с параметрами, удовлетворяющими проведению промыслового эксперимента по увеличению отдачи нефти с применением.микробиологического метода. Проведенные исследования позволшш разработать схему мероприятий ио частично:^ разрушению нефти с образованием метана, заключающуюся в аккшироЕшзги деятельности отдельных физиологических груш микроорганизмов в нефтяных пластах Апшеронского полуострова.

Адроба^ия шботц. Материалы диссертации были доложены на 711 республиканской конференции молодых ученых "Проблемы микробиологии и вирусологии", г. Рига, 1977 г.; на двух конференциях молодых ученых ШЫИ АН СССР, 1977 г.; на У1 съезде Всесоюзного маяро-бнологлчео^ого общества "На главных путях научно-технического нрогресся", г. Рига, 1980 г.

Публикации. Основные материал« диссертации опубликована в 14 статьях.

рбъем.,я структура таботы. Диссертация состоит из введений» б глав, заключения, выводов и списка литературу. Материалы изложены на 202 страницах машинописного текста, включая 29 таблиц, G схем и 22 рисунка. Список литературы содержит Э14 наименований работ - 121 ка русском и 193 на иностранных языках.

Место ттрог>впеш1я работы» Работа проводилась_в Институте микробиологии AU СССР в отделе геохимической деятельности дакроорга-низшв (заведующий отделом - член-корреспондент АН ccjp, профессор С.II, Кузнецов)* Палев:je и лабораторные работы в ряде случаев проводили совместно с Е.П. Розановой, Т.А. Пивоваровой, Т„ А, Калининской.

обшсш и 1.et0ej ::сстаоаш'И

Работа проводадгась па нефтяном г.эсторовдении Бинагады Arne райского полуострова, в котором запаси нефти в значительной степени били истощены. Для пополнения карпшы распространенна отдельных груш микроорганизмов таге:© били обследованы рад других месторождений Аптерона и Западной Сибири. Основное внимание öiuio уделено обнаружению и выделению тех физиологических групп микроорганизмов, которые по теоретическим предположениям шш участвовать Ь разрушении нефти в условиях заводняемых нефтяных коллекторов, 'Наин изучались закономерности распространения и проводился количественный учет углевод ородогчелявдих, сулвфатвосстанавяава* ыщих, бродильнпх л метанобразуЕщпх ¿актерий. Для выделения й культивирования сульфатво сс ганавл лвающнх бактерий применяли среды Постг€йта t Postgate ', 1966) и среду Ввдделя и Пфеннига (Widd»!» Pfennig , 1977), Кшппеегво бродильных бактерий определяли tío *

числу rasOBíK разрывов, ;браэуксгохся в среде о пептоном и тму*

4

козой, Метанобразуючше бактерии кулътиипровали в среде Эейку--оа ( Zeifcua , 1977) о ацетатом или л атмосфере Hg+COg. Дорп-док их численности устанавливали по приросту.метана в газовой фазе* Количество углеводородокисляющтх бактерий определяли посевом образцов пластовых вод на гиотвую минеральную среду. Бактерии выращивали в эксикаторах в парах нефти.

Куль ту рал ыше свойства и физиологические особенности выделенных бактерий выявляли при помощи общепринятых методик С sicer-»an , 1967), вдентификацюо осуществляла по Берги С Bergede llaXLUai , 1957, 1974),

Ультратонкую структуру бактерий изучали по методу Ритер-Кея.-денбергера С Rjter, Kelleniiexger, 1958). Наблюдения за дяпаш-KOf развития бродильии^ и метанобразувдлх бактерий вели по изменению состава газовой фазу. Водород, метан и углекислоту анализировали газохроштографическим методой на хроматографах XFCM-3 и ЛХМ-8 ЦЦ. ОЛщее содержание сульфидов и сероводорода определяли иодометрическим титрованием (Резников о соавт., 1970). Интенсивность микробиологического образования метана в пластовых водах определяли редиоизотопным методом по переходу 140 бикарбоната () и ацетата (Н314С-С00Н) в метан (Беляев, Ивалов, 1975; -Дауринавичус, Беляев, 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При изучении микрофлоры нефтяных месторождений ребота проводилась по двум направлениям: во-первых, непосредственно исследовали микроорганизмы, ветречающиеся в пластах, и выясняли уо-ловия их обитания, во-вторых, проводили лабораторные &кспери-мепты, позволяющие оценить участие различных груш игпероор-гаыиаиов в .процессе разрушения нефти. Основное внимание удв-лцяж анаэробным сульфатвоостанавливагщш, <Зродк.тьшдг и метан-

образукщим бактериям, по предположению участвующим в конечных этапах разложения нефти.

I. Распространение микроорганизмов в нефтяных пластах Алшерокского полуострова

Микробиологкческому анализу б:,ада подвергнуты более 60 проб пластовой воды, отобранных на нефтяных месторождениях Апшерока (Бинагада, Суразсаны, Сабунчп и Морская структура острова Песчаного) , а 10 проб - яз высокотемпературных пластов Западной Сибири* Нефтяные коллектора сложены песчаниками продуктивной толщи. Исследуете месторождения эксплуатировались о применением заводнения. Вследствие смешения с закачиваемой водой минерализация вод, кзвлекаешх из пласта) варьировала. *

Общее представление о заселенности экологической ниши микроорганизма!,® дает прямой счет. Результаты микроскопического вод-счета бактерий в водах подкирмакиъско¡1 сюиты месторождения Ьинагады приведены в табл. I. Данный участок пласта раекслагался на глубине 600-675 м, шнерализация вод колебалась около 45 г/л. Обща! численность микроорганизмов была наибольшей

п

в зоне нагнетательной сквааини 1832 и состаымла 2,59x10 кл/ад, на участках с эксплуатацпоннкме скважинами (2411, 6012, 2486, 6065) количество бактерий было на два порядка ниже: 3,3х105 -5,2x10^ кд/мл. Суммарная численность шшроорганизмов таких физиологических груш как сапрофита, сульфатиосстаиавлшзаицие, бродильные и мэтанобразуицие бактерия, определенная методом посева питательные среды, оказалась в 10-100 раз ниже, чем было показано прямым подсчетом на фильтрах (табл. I).

Поскольку на обычных питательных средах растет лишь часть микроорганизмов, учитываемых ершим подсчетом, ш определшш чяпгогагость бактерий, способных развиваться за'счет тех мини- ■

»сальных количеств сценического вещества, которые находятся а пластовой воде в растворенном состоянии. Окисленное оргатгчоо-кое вещество монет образовываться под воздействием углеводород-окксляших бактерий в местах проникновения кислорода в пласты (Горленко, Кузнецова, 1966} Розанова, 1978), Посев проб воды на простерилизованную пластовую воду из тех же скважин показал высокое содержание в них бактерий, развивающихся эа счет растворенного органического вещества (тайл. I). Численность этих бактеркй колебалась от сотен клеток до сотен тысяч клеток в I мл пробы и , как правило, на порядок превышала суммарное количество микроорганизмов, подсчитанное о применением питательных сред.

Таблица I, Численность микроорганизмов различных физиологических груш в водах нефтяного месторовдения Бинагады (нл/мл)

; Нефте-1Сапро-1Сульфат-»Бро-

сква-; окис- ;фнты ¡еосста- ,д;шь-

жины I ляюшие, ;навлива-)нне

{ | {ющие [

I ! . I !

I ! ! !

I_1 Г_Г

Метан-(Анаэроб-! Прямой обра- ¡ные бак-{ счет зую1див|Тврии,

¡растущие {на плас-, {товой во|

|я° I

вода Ю3 ю4 ю5 ю4 + н.о,

1032* ю3 ю4 Ю6 ■ ю2 ю2 н.о,

2411 0 0 ю3 :о ю3 ю4

6012 0 0 ю3 ю2 ю4 ю4

2486 - 0 ' 0 ю3 10 ю2 ю4

6065 ю4 хо хо3 ю2 ю3 ю5

9,0x10®

Й,59х107

3,5x10®

5,2х105

3,37x10®

3,5x10®

Примечание: к - нагнетательная скважина, остальные эксплуатационные скважины; н.о. - не определяла

При милроснопироваюга посевов на пластовой воде отмечено значительное морфологическое разнообразие микроорганизмов, показано широкое распространение анаэробных бактерий со скользящим типом движения.

Наряду с экологией анаэробних микроорганизмов мы исследовали распространение в нефтяных коллекторах углеводородокисляю-щих бактерий, являшихся первым звеном в цепа разрушения углеводородов.

X). Распространение утлеводородокисляицкх бактерий

Количественный учет углеводородокислякнцих бактерий был проведен в сема нагнета тел ьных и тридцати гидроддаемкчески связанных с ними эксплуатационных скважинах месторождения Банага-ды. Скважины, в которых анализировали микрофлору, располагались на участках пласта, как подвергавшихся заводнению, так и не затронутых им. Минерализация вод варьировала от 18,9 до 51,6 г/л. Численность углеводородокисляющих бактерий была наибольшей в пробах из нагнетательных скважин - 1,9х103- Х,6хХ05 нл/мл. По мере удаления от нагнетательной скважины количество этих бак-теркй снижалось (от 7,4хХ04 до 0, рис. Ха). В пластах, не подверженных влиянию заводнения, углеводородокисляющне бактерии отсутствовали (табл. 2, скв. 2430).

Возможным источником микроорганизмов являлась закачиваемая в пласты веда озера Бепкшор, содержащая бактерии, окисляющие нефть (8,6x10^ кл/мл), развивавдиеся на ША (X ,Эх103 кд/мл) к сульфатвосстаназяиваодие бак1,рии (90 кд/мл)(табл. 2).

Нами определена потенциальная способность микрофлоры, находящейся в естественной воде, окислять октадекан. Об использования 1-^^С-октадгканл судили по включению метки в биомассу бактерий (таЛя. 3).

Тайвща 2, Распространение бактерй в водах нефтяного месторождения Бинагадн

-,-г Коли- Шяиералн-! 2-Щ-, -:- м. т--------------------------- -----------------... I Количество йактешй в I ш пластовой вода

чество{ про<5 ! 1 1 зация, | г/л ! 1 I -кг/л ыг/л | углеводорэд-! окясдящих г {развяваедяхся 1 на ША ! I ]сульфатвосстанавлжваг- исбодъзугсто 'дактат { ацетат

* Нагнетательные скважины

3 . 24,3-42,5 136-2077 0 1,6х104-9,6х104 1,3х104-7,2х104 >-ю4-ю5

4 21,7-51,6 48-471 29-155 1,9хТС3-1,6х105 2,0х102-4,8х10£ >Ю4-Ю5

Эксплуатационные сквашшн

Кскв; 2430) 13 5 ' 18,9 60 23,2-50,5 0-1570 37,0-49,4 199-1693 0 0 32-505 0 4,0 - 7,4х103 88 -г^гхго2 0 4О-Ш03 17-2,6x10й хо3 0 103->Ю2 единщы-102 10' ->Ю3 единшда-102

10 26,9-45,8 22-2004 0 0 0 Я^-ТО5 едвнида-Ю2

5 29,2-51,4 35-579 14-389 0 0 Ю3-^5 едашщ-Ю4

I 50,0 3340 0 Закачиваемая вода оз. Еегошор а.бИО2 1,9x1с3 90 едшицв

Таблица 3. Потенциальная активность углеводородокиелявдих бактерий в пробах пластовых вод, экспонировавшихся о воздухом

rt i Радиоактивность биомассы i H-S,i Число клеток угле-

сква-| бактерий пз 10 мл пробы ! мг/л j водородокислнющих

хины i "mvai/i.aiH j от макси- i í бактерий в I мл

{_j мальвой |_I пластовой вода

935* 560000 100 0 14000

2165 19000 3,39 66,6 220

2488 6000 1,07 605,3 88

2372 2000 0,35 133,5 10

2538 0 0 21,4 0

к - нагнетательная скважина, остальные эксплуатационные

Из табжща ввдно, что участок, наиболее благоприятный для углеводородояисялицих бактерий, находится вблизи нагнетательной сква'мпш 935, куда проникает растворенный ккслород, Приэа-бойнад зона характеризуется также максимумом численности аэробных сапрофитных бактерий и обаеЯ численности южроорганизмов, определяемой микроскопическим методом ва фильтрах.

Из биоценоза, наиболее активно отделяющего нефть, были выделены в Чистую культуру Pseudomonaa putida, Р. сыогогь-pbte, Pseudomoaae зр.

2) Распространенно сульфатвосстанашЕивающпх бактерий

■¡ульфатвосстытавливаетсе бактерия, использующие лактат, об-Ha;i.4senu в сризабо&шх зонах нагветат&злных скважин, а также на .¡"частках о эксплуатационными скважина!.®, затронутых влиянием наводнения. Их присутствие показано в 35 образцах глдрокар-бонатяо-натркевых под, акехдах минерализацию 18-51 г/л, содерг j^ríjjiíx от 0 дс 605 ттг сероводорода в I л. Количество этих бак-

терпЗ колебалось от десятков кчеток до сотен тысяч клеток в I т. Накопление сероводорода в пластовых водах, достигающее 605 мг/л, свидетельствовало о значительном развитии процесса оульфатредукции (табл. 2). В пробах вод из участков пластов, куда закачиваемая вода не проникла, эти бактерии отсутствовали.

На рас. I а,б дано распространение сульфатвосстанааливаицшс и углеводородокисляюцих бактерий. Видно, что влияние закачивания воды на распространение микроорганизмов сказывалось не только в приэабойной зоне, но и распространялось по крайней мере на 200 м по радиусу от нагнетательной скваяияы Численность бактерий, восстанавливавших сульфаты, и углеводородокис-лявдих бактерий была максимальной в одном и том яе районе -скв. I, П, Ш, УЛ.

Впервые в пластовых водах нефтяных коллекторов наш обнаружены сульфатвосстанавяивающие бактерии, использующие ацетат (месторождения Бинагады и Сабунчи). Йх количество обычно было в 10-100 раз меньше численности сульфатвосстанавляважядах бактерий, развивающихся за счет лактата (табл. 2)

2) Распространение бродильных и метенобраэувдих бактерий

Бродильные микроорганизмы обнаружены в 29 и отсутствовали в 7 пробах гкдрокарбонатно-натриевых вод месторождений Бинагады и Сабунчи. Ыетаяобразугшща бактерии содержались в 33 и отсутствовали в 7 пробах вод месторождений Бннагады и Сураха-ны. Минерализация вод, в которых обнаружены метаногены, составляла 17-84 г/л, а концентрация сероводорода 0-585 мг/л, что свидетельствовало об их устойчивости к данным факторам экологической обстановки.

Метаиобразущие бактерии, как правило, встречались на участках, заселенных сульфатвосстанглшшающей и бродильной иккро-

II

а - © _X ( ( ^ \\ \ Ф| ^ ])© ] 1 %! / / ю4 V / 10" У -\ '/Ф ^ ) ])© ] ю5''' // / Ю4103' 10

» -север / ® \ 0 \ \ .у®) J \ © ] с ® / / / 104 '' / г ©\ /Г - /®) ) 3- ' ® / / / 102 '' / 10

Рас. I. Распространение микроорганизмов в водах подашрмакинской свиты гесторсадения Бинагадн а - углвводородокисляшие, б - сулъфатвосстанавливатоие,

0 - бродашше, г - метянойразугсаде бавтврии;

1 - нагнетательная, И+УП - эксплуатационные скважин п.

флорой (табл. I, рио. I (Иг). В прйэабойной .зоне нагнетательной скважины численность негалогенов была низка и не превышала сотен кд/мя, тогда как сулъфагвосс тана&^лвгххш. и бродильных бактерий содержалось 104-105 кд/мл. Количество анаэробных микроорганизмов различных физиологических групп бкло наибольший в районе расположения одних и тех же эксплуатационных сква-, кик - П,Ш,УЦ {рис. I <*-г).

Результаты определения интенсивности образования метана в пластовых водах месторождения Бинагады приведены в табл.4. Таблица 4. Интенсивность микробиологического образования метана в водах подкирмокинской свиты нефтяного месторождения Бинагады

снва-;ра- }мг/л : мг/л;мг/л ;тат,;яо где«. саг/л/^ттки жшш {ли- | | { ,ыг/л!тано~; нз^ ) из аде-1

{за- ! I I ) генов г СО, ! тата 1 СИЛ

ЦяЛ \ в1м£ 2 1 .1 4

I 1 1 \ 1 I : 1

936 26,9 253,0 9,5 6003,0 31,0 Ю3 . 0,290 0,0094 0,2994

2372 49,4 ПО,0 133,5 649,0 21,0 10 0,0893 0,0017 0,0915

6012 45,7 6,0 66,0 4272,0 41,0 Ю4 0,974 0,С006 0,9746 •

2486 45,6 56,0 177,0 4581,0 20,7 102 0,507 0,0016 0,5086

2538 30,6 37,0 29,9 4720,0 37,7 10 0*378 0,0017 0,3797

2411 46,7 73,0 309,3 4254,0 н.о. 103 0,0714 н.о.

Таким обрезом, современное образование метана наблюдается во всех исследованных пробах вод подкармакинской свиты месторождения Бинагады. Интенсивность этого процесса в различных участках нефтяного пласта варьировала и находилась в соответствии с численностью метанобрезукщих бактерий. В пробах основным источником метана (более 96;») служила углекислота и лишь 0,14-455 метана происходило из ацетата.

XX. Описание микроорганизмов, распространенных в месторождениях нефти а) Сульфатвосстанааливавною б астерии

Видовое разнообразие сульфггвосстанавливагацих бактерий в ноф'хяншс месторождениях Апиеропа изучалось рядом авторов (Розанова , Худякова, 1973,1974; Талибан, 1973). В пластах были обнаружены вибриоиднкв бактерии - Dosuliovibrio dnsulfuricaae, о. 'airicanus, D. de sulfuric an a subap. aesVuarii, D, vulgar-IB. Наличие указанных микроорганизмов в исследовашшс пробах было также подтверждено наш при мккроскоппровании единичных коло- ■ ний оульфатвоостанавлавашшх бактерий и их высеве на питательные среды. Кроме того, в месторождении Бинагоды били обнаружены мезофадьные палочковидные бесспоровые бактерии штамм ГЕ по морфо-физиологическим особенностям соответствующие ввделенно-му ваш новому виду D. taculatue (Розанова, Назииа, 1976). Чистые культура атак микроорганизмов имели размеры клеток 0,5-0,66x0,9-2^0 мкм, бактерии передвигались за счет одного полярного жгутика. В процесс сульфатредукции вовлекали лактат, плруват, малат. Бактерии обладали цитохромашг ь и о , деоуль-фовирадин отсутствовал. Обе культуры не утилизировали ацетат, пропионат, бутират.

* В данном месторождении' бшш обнаружены также иеэофаяьиые езорообразущие бактерия, принадлежащие к роду Deeuilotoaftcu-' , использушие лактат, шруват, этанол, но не ацетат. Из

шгаотовых вод была получена накопительная культура даловдовел-. них бактерий, осуществляющих восстановление сульфатов за счет ацетата. Культура не содержала спор и не сохраняла жизнеспособность ,пооле прогреванияJ По ряду свойств;бактерии отнесены х !>• пЦ, ^йЬ&аЪ* г ( Hlddol , Pfennig , ISBIa).

Из высокотемпературных нефтяных пластов Западной Сибири были ввдеяены чистые культуры термофальных саорообразующюс суль-фатвосстанавливаадих бактерий, представлсгшые двумя иташгамг - . 435 и 781. Клетки имели падочковидегув или лимоновцдну» форму, их размер составлял 0,9-1,3x2-5 ккм, двихетае осуществляли посредством деритряхиальнцх жгутиков. Вцц&яенные микроорганизмы била отнесены к Desulfo-tomaculum nigrifleans. Облигатное требование хлористого натрия для роста штам.-л 435 послужило основанием для его выделения в новую разновидность alerl-flcaae subep. ealinus (Назина, Розанова, 1978).

Впервые у сулъфатвосстаяавлквахщих бактерий наш был исследован процесс спорообразования (Назина, Пивоварова, 1978). Анализ ультратонких срезов доказал, что механизм спорообразования у Dm. nigrificanfl 435 и 781 был аналогичен таковсму у бакте- ~ рий рода Bacillus и соответствовал стадия« спорообразования, указанным ( Fits-James, louag, 1969).

б) Me танобразующие бактерии

Б клетках большинства метанобразуацих бактерий прпсутству- -ет фактор г^го » обусловливающий зеленовато-желтое свечение клеток, возбужденных светом о длине! волны 420 нм. Указанное ■ свойство позволяет обнаруживать ыетаногеяов в смешанных микробных популяциях (Doddema, Vogals , 1978). Исходя 23 ыор$ологшн светящихся бактерий нами была сделана предварительная идентификация метаногенов, обнаруженных в пластовых водах. -

Флуоресцирующие клетки, преобладающие в накопительных куль-., турах, выращенных на средах с формантом, этанолом и f^+CO^, бита представлены неподвижными палочками с закругленними кон-, нами размером 0,0x2-3 мкм. Бактердт отнесены к роду Meumno-

baotftrtm». Светящиеся микроорганизм, выявленные на среде с метанолом, образов'ввали еарцяноподобные скопления- Диаметр клеток в скоплениям варьировал от 1,4 до 3,0 мкм. Культура образовывала метан при перссеее на среды о ацетатом и Н2+С02. Бактерии бшги отнес^нц к роду Methaiioaarcina.

Особенностью метаксгенных ассоциаций из нефтяных пластов являлась устойчивость к повышенной солености сред {до 40 г/л 4«<Jl ) и концентрации сульфида (до 250 мг/я).

На рис. 2 показано влияние концентрации сульфатов на образовав не метана сообществом микроорганизмов из нефтяных пластов, включающим сульфатвосстанавлкгашие и метанобразукщяе бактерии.

О 4 8 12 ГО

Концентрация s»2sov mkM/wi

Рис. 2, Образование метана накопительной культурой в зависимости от концентрации сульфатов. Культивирование вели в среда Зейкуса с лактатом (3 г/л) в течение 14 суток.

Поскольку чистые культуры метанобреауших бактерий не используют лактат, в опыте проявляется их зависимость от суль-фатвосстанавливаищих и других анаэробных б-, тзркй. Первоначальное количество сульфида в среде составляю 2 Из рло. 2 ввдно, что внесение двде незначительных количеств сульфата ингибировало метаногенез. Таким образом, микробиологическое образование метана следует ожидать в нефтяных месторождениях, : пластовые воды которых не содержат сульфатов ш их количео-тво незначительно.

в) Факультативно-анаэробные коринефоркше бактерии

В пластовых водах одной из преобладающих форм бшш палочковидные бактерии^ которые на плотных средах образовывали характерные красно-розовые колонии. Эти микроорганизмы были палу- ' -чекы наш в чистой культуре. Бактерии проявляли плеошрфизм, имели форму прямых или изогнутых палочек с закругленными концами, обнаруживались овопдные и кокковкдныб клетки. Культура не утилизировала углеводороды, но использовала нефть и широкий набор органических субстратов, проявляла факультативно-нетило-

«

тройные свойства. Количество Г+Ц ь ДНК составляло 69 дал.' %. По' совокупности признаков этот факультативно-анаэробный микроорганизм отнесен к новой комбинации хи£е всеаа аот. сошЬ. (Назина, 1961).

Ш. Образование молекулярного водорода и метала под воздействием пластовой микрофлоры на нефть

Одной из задач исследования явилось выяснение отношения микроорганизмов* из нефтяных пластов к органическому веществу нефти. С углзводородокислямЕиш бактериями вопрос достаточно . ясен. Горленко и Кузнецовой (1966) было выдв:шуто предпслояе- ,

míe, что.продукту, обрдауксгиеся при окислении нефти углеводород они едящими бактериями, используются дплее еульфатвосста-навливаюкей микрофлорой.

Мы полагали, что органические вещества, содержащиеся в культуральной жидкости бактерий, окисляющих углеводороды, ш-гут служить субстратами и для других, амауройнш »микроорганизмов. D среде о нафтеново-оромптической нефтью н;шш сливалось до 20?j иг/л ацетата, показано образование и других жирных кислот. Указанную культураяьнуго жидкость по ее тонгшливами внесением 500 мг/л н20 и зараязяи ме тан обра зукщими бактериями За 14

суток инкубация в среде образовалось 10-25 мкл метана а 10-16 !-*л углекислоты на I ыя культураяыюй жидкости.

Било необходимо выяснить возможность образования молекуляр-кого водорода в результате комплексного воздействия на нефть ааробшх и анаэробных бактерий. С этой целью из пластовой воды была получена накопительная культура бродильных микроорганизмов, в состав которой наряду с бесспоровими формами входили спорообразупцие бактерии, отнесешше к cioerridUia paeteu-riaaua, С. buxyricum, С. acetobutyricum. Метанобразужщие бактерии в биоценозе отсутствовали, Культуральную жидкость углеводородокисляодих бактерий, выращенных на I) метановой, 2)

м?/гадово-нафтеновой и 3) нзфтенойо-ароматической нефти, отделя-

t

ли от клеток, восстанавливали 50-мг/л Ма^х 9 н^о . и заражали бродильными микроорганизмами. Во всех опытах через 5 суток инкубирования било получено образование молекулярного водорода и углекислоты: в первой случае накапливалось 36,7 мкл И2 я 18,0 LZ'Ji COg; во втором - 30,0 мкл Hg и 24,0 мкл CO2Í в третьем -31,5 мкл Н2 и 15,0 мкл 002 на I ш культуральной жидкости. Динамика образования газообразных продуктов была аналогичной

(рис. 3). Появления метана в гаЭовой фазе не наблюдали.

, 10 14

Вреич, сутки

Рис. 3. Образование В2 и С02 бродсльнндг ш£кроорганкзшми на культуральной жидкости углеводородокисляадкх бактерий, выращенных на нафтеново-ароматлческой пефтя.

Таким образом, в результате проведению: исследований установлена принципиальная возможность образования молекулярнаго водорода при последовательном воздействии на нефть углеводо-" ' родокисляших и бродильных микроорганизмов.

0БОТ5ИЗЫИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

При эксплуатации нефтяных месторождений значительная часть нефти (до 60$) остается в пласте 1Э67), Для увели-

чения добнчи нефти используются различные <£иэкк0-хи:.тач£ские методы^ Одним из наиболее широко распространенных служит закачивание в пласт воды. Заводнение приводит к увеличению кал. общей численности бактерий, так ж отдельных <эжзиолог;гче с к:: ;< груш, в частности, вэсстанавливакщлх сульфата. Развитее суль-фатвосстаназлквгкгдих Сактери* с о про в т ся г:о-

роводорода, что вызывает необходимость дальнейшей очистки нефтяНих газов.

■ Б связи с этим наш бшга предпринята попытка более подробно изучить а) распределение и ^вдовой состава микроорганизмов в заводняемом нефтяном месторождении Бннагадн; б) интенсивность л механизм процесса образования штат в шгасте.

Проба для микробиологических анализов били отозракы из 60 н мтютательншс и э ксплуатацшлших скьажин, Нагнетательные скважин", через которые закачивают воду, были гидродинамически связан» с определенным) эксплуатационными скважинами. Обследовано 8 таких "кустов". В диссертанта более подробно рассмотрены данные по одному из них.

Псказано, что углеводородокислгавдие бактерии населяют не только призабойную »оку нагнетательной скважины, но распространяются с током воды на 200 м и белее по пласту. В эксплуатационных скважинах, удаленных от зоны нагнетанил, обнаружены также бродильные (10^-10® кл/мд), судьфатвосетанавливглощие (10-Ю5 кл/мд) и метанобразующие бактерии (10-Ю4 ю0лл).

Физиологическое и видовое разнообразие микроорганизмов в месторождении велико. Развитие аэробной и анаэробной микрофлоры в плаотах сопровождается образованием углекислоты, метана » сероводорода. Нами были поставлены опыты по выяснению меха-казмв образования метана из нефти о учетом экологической об-• охаловки, которая создается в пласте при закачке воды, содержащей растворенный кислород.

Годоеяко и Кузнецова (1906) показали образование сероводо-' рода ив нефти комплексом утл еводо родокксляющих и сульфатвооста-аавливамцих бактерий. Экэерцеа (1968) ваблшал медленное образование метана из нефти анаэробными микрооргаяизмами. Исходя »43 этих данных, а также результатов собственных »ксшогичес-

9

го

ких исследований, мы предположили, что пра последовательном воздействии аэробных и анаэробных бактерий гч нефть шжет образовываться метай. Механизм б!к проверен на мзтановой, мета- ■ ново-нафтеновой и нафтеново-аргл-дтической нефти.

Среды, садержасрге нефть, заракали углеводородокисляюсрсл! 1 бактериям!. В процессе культивирования в среде накаплзшалксь жирные и.летучие кислоты, в частности ацетат. Клетки углево-дородокисятопзис бактерий отделяли центрифугированием и пату- '■ ченную кульгуральную жидкость заражали бродильным микроорганизмами из нефтяных пластов, включалиунш С1оеЫ1<11лщ ЪиЪу-1-1 сига. С, асе^ЪиЪу г!сит, С. рааъешг1аа.ша И1 всзШйЯО, С. каитувг! . При развитии микроорганизм» на продуктах окисления нефти впервые показано образование молекулярного водоро-

•

да. При последовательном воздействии ва нефть углеводородокис- ~ ляющих и бродильных бактерий образуются субстраты (ацетат, Н^, С02), непосредственно используемые метакобразуущда бактериями.

' Образование метана мы наблюдала при совместном развитии бродильных и метанобразующях бактерий ка культуральной жидкости * -углеводородоклоляодих бактерий, выращенных на нафгеново-аро-' ' . магической нефти. Таким обраэсм, определился круг микроорганизмов, способных разрушать нефть до газообразных продуктов.

Непосредственное определение интенсивности микробиологического образования метана показало, что процесс действительно происходи? в пластах. На отдельных участках ПК свиън место- ■ рождения Еинагадн его скорость варьировала от 0,07 до 0,97 см9 СН4/л в сутки.

Выяснение видового состава и численности микроорганизмов. в шгастовых водах показало, что приэабойная зона нагнетатель- ■ ных скважин характеризуется максимумом общеК численности бак-' терий - 25,9 млн, кд/мл, По мерз удаления от забоя их колгчес-

21

тьо снижается до 0,3-0,5 млн. кл/ш. Среди банальной шпсрофло-рц,' развивающейся за счет органичсс:сого вещества, растворенного в .пластовой воде, преобладали корине'^ормше бактерии Brevibac-teriua rufsecens nav. сошЪ. Другими широко распространенными грушами были сульфатвосстонавливинщио - DecuifotomacuXum nigrlflceiiß ьиЬвр. esüinue 435, Dia. nigrificaaa ?ßi, Deeul-fabacter ep., Deeulfotomaculvm ар,, бродильные - С. acetobu-tyjpicum, C, paeCeiwiaBun, 0. bufcyr-tcim и метанобрааухщие бактерии.

Таким образом, можно считать, что процесс образования метгла в условиях нефтяного пласта идет до схема:

Нефть gBeud<>aionaa . спирты, 1 Др0,1*'"™1*». ц Cü 1 матац- . ш и другие rjipjüje I и сянтроф- Г образую-

нсфтеокис- киодоты! 1Ша бактерии ' щие бак-

ляющие ' терпи

бактерии

ВЫВОДЫ

1. Выявлены закономерности распространения углевддородокис-ляпцих, бродильных, сульфатвосстанавливаюцих и ыетанобразуюшх бактерий в нефтяных пластах. Впервые установлена связь распространения иетанобразушцюс бактерий с заводнением нефтяного '

* *

пласта. Определена приуроченность микроорганизмов указанных физиологических груш к различным его зонам.

2. В лабораторных экспериментах выяснены условия, способствующие преимущественному образованию метана яла сероводорода. Определяющими факторами являются концентрация сульфатов, сероводорода и минерализация пластовых вод.

3. Из нефтяных пластов наделены в чистую- культуру и идентифицированы Desulfotomaculum nlgrlflctma ■ чЬар.ваИпив 455, Ш. nigrlficane 781, Desulfovibrlo baculatue И, Brevlbacte— riu« rufescens nov. comb. В пластовых ведах обнаружены микроорганизмы, отнесенные к с. butyricum, С, pasteurlamm, с* acetobutyricum, а таете представители родов Desulfotomaculum, '

Desuü fobacter, tletiiano saxcina и Uethanobacterium - . Еак— терки проявляли устойчивость к повышенной солености, коицент- ■ рации сульфида и сульфатов, что свидетельствовало о их приспособленности к среде обитания.

4. Впервые у сульфатвосстанавливаотшх бактерий исследован процесс спорообразования. Показано, что образование спор у Da. nigrlficane протекало по механизму, описанному для бактерий рода Bacillus.

5. Показано существование современного процесса образования метана в водах нефтяных месторовдений Апшероиа. Интенсивность »того процесса в различных участках пласта подкармакинской-свиты месторождения Бинагады варьировала от 0,0915 до 0,9746 см3 СН^/л пластовой вода в сутки,

6. Установлена принципиальная возможность образования молекулярного водорода и метана из нефти в ходе аэробно-анаэробной микробиологической сукцессии.

Расшифрована последовательность процёссов превращения углеводородов нефти, приводящих к образованию метала. Б ходе 'аэробного окисления нефти углеведородокиелнзщими бактериями накапливаются жирные кислоты, в процессе сбраживания которых образуются ацетат и Н2+С02, являющиеся непосредственными субстратами металобраэования,

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

. I. Розанова Е.П., 'Назина Т.ЗГ. Геуофкльнгя палочкоьидпая бесспоровая бактерия, босстагавлиьакжад сульфаты. - Uimpoönология,ХЭТб, Т. 45, в, *5, о. 825-83С.

2. Назина Т.Н. Термофильные сульфатвосс та нашивающие бактерии из нефтяных пластов, - В' сб.¡Проблемы микробиологии и виру сологии. Тез докл., Рига, Зинэтне, 1977, с. IC-I7.

3. Назина Т.Н. Выделение чистых культур "улМатвосстанавлл-ваицих бактерий. - Инф. <5гл, Ик-та Биологии Внутренних вод, 1977» № 37, с, 4-7, Л., Наука.

4. Назина Т.К., Розанова Е.П. Термо^шьнш су.-;ьфатвосстанав-ливашие бактерии из нефтяных пластов. -- Микробиология, IQ7C, Т. 47, в. I, о. 142 148.

5. ГГазина Т.П., Розанова Е.П., Калипт. екая Т.Д. ¿иксация молекулярного азота сульфатво сстенавди^ащиш бактерияпи иэ нефтяных гиастов. - Микробиология, 1979, т. 48, в. I, е. 133-136,

6. Назина Т.Н., Пивоварова Т.А. Субмикроскотгчеокан организация и спорообразование у Deeulfotomaculum alg^iilcane. -Микробиология, 1979, т, 48, в. 2, с. 302-306.

7. Розанова E.H., Назина Т.Н. Распространение термофильных сульфатвосстанавдивающис бактерий в нефтяных пластах Ашлерона

и Западной Сибири. - ГАикробиология, IS79, т,48, в.б, с.1113-1117.

8. Назина Т.Н., Розанова Е.П. Экологические условия распространения метанобразующих бактерий в нефтяннх пластах Апшерона. - Микробиология, 1980, т. 49, в. I, с. 123-129,

9. Назина Т.Н., Розанова Е.Л. Преобразование нефти с образованием газов при учаотии аэробной и анаэробной микрофлоры, -В с*. УХ Съезда Всес. микробиол. о^ва. Микроорганизмы в защите к рациональном использовании окружающей среды. Тез докл., т., 6, Рига, 1980, с. 9.

10. Назина Т.П., Розанова Е.П. Микробиологические методы увеличения нефтеоздачи. - В сб.: Особенности заражения нефтяных пластов микроорганизмами, совершенствование системы подготовки вод для закачки их з продуктивные масти я методы борьбы о микробиологической коррозией. Ы., БКИИОЗНГ, 1980, с, I47-1К.

XI. Назина Т.П. Образование молекулярного водорода под воздействием гиьстовой микрофлоры на нзфть. - Микробиология, I9SI, т. 60, в. 1, о. 163-166.

12. Наяккэ Т.Н. Факультатквыо-аиазробная метилотрофная'бах-

терш 3»ш>*о*»г1ш1 ги£**о«па ноу» совЬ. ' из нефтяных пластов. - Микробиология, 1981, т. 50, в. 2, с. 311-319.

13. Розанова Е.П., Назина Т.Н. Распроо-А^^анение оообщеотва оудъфатвоостанавливавдих бактерий в нефтяных месторождениях Алшерова. - Микробиология, 1981« т. 50, в, 3, о. 566-570.

14. Розанова £.11., Назина Т.Н. Углеводородокислянцие бактерии и кх активность в нефтяных пластах* - Микробиология, 1982, т. 51, в. 2, о. 342-349. ,

--

Т-02-103 фг 7.1,83. Элказ 1780 Тир »ж 150 Формат 60x14/10

Типография влсхнил в.хармтоиьввекн й пер. а. 21