Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурообразующие факторы и механизмы формирования пространственных структур в популяции социальных амеб Dictyostelium dicoideum

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кравченко, Валерия Васильевна, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ

БИОФИЗИКИ

На правах рукописи УДК 577.3

Кравченко Валерия Васильевна

СТРУКТУРООБРАЗУЮЩИЕ ФАКТОРЫ И МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ПРОСТРАНСТВЕННЫХ СТРУКТУР В ПОПУЛЯЦИИ СОЦИАЛЬНЫХ АМЕБ ВШуоМеИит (1ксо1Леит Экспериментальное исследование

03.00.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Руководитель д.ф.-м.н. Медвинский А.Б.

Пущино 1998

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.....5

ГЛАВА I. Обзор литературы.....8

1.1. ОШуозгеНит сИясо1с1еит.....—

1.1.1 .Таксономическое положение ВШуо51еИит сИзсогйеит.....—

1.1.2. Жизненный цикл ОШуоз1еИит сИзссяс1еит.....9

1.2. Регуляторные посредники ВШуо81еИит сИ$со1с1еит.....10

1.2.1. Функция аденозин-3'5'-циклофосфата в жизненном цикле В'1с1уо.ч1еИит сИзсо1с1еит.....11

1.2.2. Функция фолиевой кислоты в жизненном цикле ВгМуоь^еИит сИбсо1с1еит.....14

Краткая характеристика физических и химических свойств фолиевой кислоты.....15

Хемотаксисно активная часть молекулы фолиевой кислоты.....18

Инактивация хемотаксисного сигнала фолиевой кислоты.....—

Клеточные рецепторы фолиевой кислоты.....21

Секреция фолиевой кислоты клетками ВШуо81еИит <И5со1с1еит.....23

Биохимические функции птериновых коферментов.....25

1.3. Кольца Лизеганга.....26

1.3.1. Краткая история вопроса.....—

Влияние физико-химических факторов на формирование колец Лизеганга.....28

1.3.2. Теории формирования колец Лизеганга.....29

ГЛАВА II. Методики.....32

Культивирование популяции ВШуо81еИит сИ$со1с1еит.....—

Измерение концентрации фолиевой кислоты.....33

Измерение кислотности субстрата.....—

ГЛАВА Ш. Структурная модификация внешней среды микроорганизмами на примере формирования колец Лизеганга вокруг популяции ОШуон1еИит йЬсо1Леит.....34

3.1. Динамика формирования периодических структур.....—

3.2. Условия формирования колец Лизеганга.....36

3.3. Параметры среды, определяющие формирование колец Лизеганга.....37

Распределение фолиевой кислоты в субстрате при образовании колец Лизеганга.....—

Изменение кислотности среды при образовании колец Лизеганга.....40

Влияние рН на формирование колец Лизеганга.....43

3.4. Модификация колец Лизеганга ..... 46

3.5. Обсуждение.....47

ГЛАВА IV. Модификации пространственной организации колонии

йксоиЫит под действием изменений внешней среды.....49

4.1. Динамика формирования пространственной структуры колонии ВШуо$1еИит сИясо1с1еит при культивировании на бактериальном газоне.....—

4.2. Кислотность субстрата как структурообразующий фактор колонии Вгс1уоя{е1шт сИясо1с1еит.....51

Модификация пространственной организации популяции

О. (И8со1йеит, растущей на бактериальном газоне.....—

Модификация пространственной структуры колонии О. (Изсохйеит, растущей без бактериального газона.....53

4.3. Влияние распределения фолиевой кислоты на пространственную структуру колонии В1с1уо81еИит сИзсо\(1еит.....54

4.4. Обсуждение.....57

Выводы.....61

Список публикаций Список литературы

62 63

Условные обозначения

цАМФ - аденозин-3'5'-циклофосфат ФК - фолиевая кислота

ДАФК - 2-дезамино-2гидроксифолиевая кислота FAS - C9-N10 гидролизирующий фермент

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Микроорганизмы привлекают внимание не только микробиологов, но и специалистов в других областях - генетиков, биохимиков, биофизиков, почвоведов. Это связано с тем, что микроорганизмы оказались очень удобными объектами для изучения процессов, лежащих в основе жизни на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях. Одним из аспектов исследований является анализ социальной жизни микроорганизмов.

Популяция социальных амеб Dictyostelium discoideum (D. discoideum) в естественных условиях развивается в почве в сообществе организмов различной организации. Большой интерес представляет исследование взаимоотношений простейших с другими микроорганизмами, в частности, взаимодействие D. discoideum и Escherihia coli (Е. coli). В природной обстановке микроорганизмы образуют сложные устойчивые микроценозы (0.05-5 мм в диаметре), которые иногда включают и автотрофный компонент; тогда они служат реальной природной структурой, соответствующей представлению о простейшей экосистеме. Изучение механизмов устойчивости и путей метаморфоз в сообществах микроорганизмов представляет интересный аспект исследований.

Почва как среда обитания — сложная система, состоящая из твердой, жидкой и газообразной фаз, которые обладают химическим составом непостоянным во времени. Кроме того, условия жизни почвенных микроорганизмов усложняют колебания различных физических факторов: температуры, влажности, аэрации. Поэтому для успешного развития почвенных микроорганизмов, в частности, D. discoideum большое значение имеет способность простейших противостоять «давлению» внешней среды. Механизм приспособления колоний простейших к различным лимитирующим факторам окружающей среды - одно из важнейших направлений биологических исследований.

Цели и задачи исследования

Живые системы не только приспосабливаются к условиям внешней среды, но и в свою очередь способны на нее заметно влиять. В связи с этим большой интерес представляет анализ воздействия популяций микроорганизмов, в частности, Э. (Изсогйеит как локального биотического фактора биогеоценоза, на окружающую среду. Целью диссертационной работы является анализ взаимодействий в модельной системе «микроорганизмы <-» среда» на примере экспериментального исследования взаимосвязи между структурными изменениями внешней среды, индуцированными популяциями микроорганизмов, с одной стороны, и влиянием этих изменений на поведение самих популяций, с другой. Задачи исследований:

1) определение пространственно-временных характеристик популяционных структур, формируемых социальными амебами О. сИзсо1с1еит\

2) анализ воздействия популяций микроорганизмов на среду обитания;

3) установление взаимосвязи биотических и абиотических факторов, определяющих развитие колонии В. (Изсогйеит,

4) определение модификаций пространственной структуры колонии £>. (Изсогйеит, в зависимости от начальных условий культивирования микроорганизмов.

Научная новизна

1. Впервые описано формирование колец Лизеганга, инициированное жизнедеятельностью микробиологической популяции, и исследован механизм его формирования.

2. Определены пространственно-временные характеристики колоний О. сИясо1с1еит.

3. Показано, что пространственно-временные характеристики колонии хищника (£>. а\iscoideum) в сообществе «хищник о жертва» существенно

зависят от начальных условий культивирования популяции жертвы {Е. coli).

4. Предложен механизм модификаций структуры колоний D. discoideum, спонтанно возникающих при изменении абиотических компонентов среды в ходе культивирования колоний.

Практическая ценность

Результаты диссертационной работы могут быть использованы при исследовании базисных механизмов структурообразования в сообществах микроорганизмов. Такого типа исследования важны при разработке моделей и программ управления ростом и развитием почвенных микроценозов, для решения различных экологических задач (улучшение плодородия почв; ускорение вторичной сукцессии; совершенствование системы очистки почвы от промышленных и сельскохозяйственных ядов). Работа может представлять интерес для исследований эволюционных изменений в сообществах микроорганизмов и их воздействия посредством изменения абиотических компонентов биогеоценозов на развитие высших организмов.

Апробация работы

Результаты работы докладывались на заседании Ученого Совета ИТЭБ РАН (Пущино, 1996), на конференции молодых ученых Пущинского Научного центра (Пущино, 1997), на международной конференции «Биомеханика 1998» (Москва, 1998), на ежегодном семинаре университета Регенсбурга, Германия (1998).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 7 статей.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на страницах и содержит 18 рисунков.

ГЛАВА I. Обзор литературы

1.1. Dictyostelium discoideum 1.1.1. Таксономическое положение Dictyostelium discoideum

Впервые вид Dictyostelium discoideum описал и идентифицировал Râper в 1935 г. [1]. В данной работе систематическое положение Dictyostelium discoideum представлено по классификации, разработанной для простейших Международным комитетом протозоологов в 1980 г. [2].

ПОДЦАРСТВО Protozoa Goidfuss, 1818.

ТИП Sarcomas tigophora1 Honigberger Balamuth, 1963 (Саркомастигофо-ры; по-русски этот термин можно перевести как амебы и жгутиконосцы).

ПОДТИП Sarcodina Schmarda, 1871 (Саркодовые).

НАДКЛАСС Rhizopoda von Siebold, 1845 (Корненожки).

КЛАСС Eumycetozoea Zopf, 1884 (Настоящие миксомицеты).

ПОДКЛАСС Dictyostelia (Диктиостелии).

ОТРЯД Dictyostelid2.

СЕМЕЙСТВО Dictyosteliaceae.

Таксономическое положение многих видов простейших на сегодняшний день окончательно не определено. Это связанно с новыми данными, получаемыми в ходе исследований простейших, поэтому, например, подтип Sarcodina на данном этапе развития знаний - сборный и в обозримое время возможны изменения в систематическом положении слизневых грибов.

1 В этот тип ныне включены миксомицеты (класс ЕитусеЮгоа), паразитические плазмодифореи (класс Р1а5шоё1орЬогеа), акразиевые (класс Асгаэеа) - группы амебоидных организмов, которые ранее многие микологи относили к грибам.

2 Представителей этого отряда также называют слизневыми грибами.

8

1.1.2. Жизненный цикл ШауоъгеНит йксо1йеит

В жизненном цикле £>. <Изсо1(1еит, схема которого представлена на рис. 1 [3], выделяют две фазы - одноклеточную и многоклеточную. В одноклеточной фазе популяция развивается в виде свободноживущих миксамеб, увеличивающих свою численность в результате вегетативного деления [4]. Миксамебы, или, как их часто называют, вегетативные амебы питаются различными бактериями [5]. При истощении запасов питания стадия вегетативного роста (или одноклеточная фаза развития) популяции завершается. Голодающие миксамебы - преагрегационные амебы - в течение нескольких часов претерпевают изменения в метаболизме, позволяющие им объединяться [5].

плодовое тело

формирование плодового тела

А

миграция

формирование псевдоплазмодия

миксамебы

о

-А

^>6 ч

голодание

\

\

ранняя ' агрегация

поздняя агрегация

РИС. 1. Схема жизненного цикла £>. (И$со1йеит [3].

Миксамебы - диаметр около 10 цм, время между двумя делениями - 3 ч.; псевдоплазмодий - длина составляет приблизительно 1.5-2.5 мм, ширина - 0.2-0.5 мм; высота плодового тела приблизительно 2-5 мм [5].

Вторая фаза жизненного цикла В. сИ$со1с1еит начинается со стадии агрегации. Сильно удлиненные преагрегационные амебы [65] двигаются к центральной объединяющей клетке. Движущиеся клетки собираются в ра-диально направленные потоки, разветвленные в дистальных концах. Эта стадия завершается образованием конического агрегата, который трансформируется в сигароподобную структуру, называемую псевдоплазмодием3 (отличие от истинного плазмодия в том, что клетки сохраняют свою целостность) [6]. Псевдоплазмодии, проявляющие фототаксис, термотаксис и осмотаксис [3], мигрируют подобно червям на значительные расстояния. Подвижность псевдоплазмодиев /). сИ8со1йеит является систематическим признаком данного вида [7].

Многоклеточная фаза жизненного цикла I). сИ$со1с1еит продолжается формированием плодового тела из слизевика после его остановки. В образовании плодового тела в зависимость от условий может принять участие от 10 до 100000 клеток [1]. Зрелое плодовое тело состоит из спор, ножки, образованной из вакуолизировынных паренхимных клеток и покрытой целлюлозой капсулой и базального диска [6] (развитие базального диска, характерное только плодовых тел /). (И8со1с1еит, является еще одним систематическим признаком этого вида [7]). В благоприятных условиях из проросших спор возобновляется развитие вегетативных амеб.

Жизненный цикл £>. сИ$со1с1еит завершается в течение 2-3 дней [6].

1.2. Регуляторные посредники ВШуоПгИит йксо 'ьйеит

Процессы жизненного цикла различных слизневых грибов регулируются внеклеточными сигналами. Обнаружена большая группа соединений, которые являются межклеточными посредниками: аденозин-3'5'-циклофосфат [8], фолиевая кислота [9], птериновые производные [10], фактор поворачивания (БТР) [11], фактор плотности (СМР) [12,13], репелленты

3 В специальной литературе для обозначения этой стадии развития слизневых грибов наиболее часто пользуются другим термином - слизевик.

10

[14,15], активаторы и ингибиторы прорастания спор [16,17] и др. Регулятор-ные посредники вида D. discoideum исследованы в разной степени.

Среди множества сложных межклеточных взаимодействий в регуляции процессов роста и развития клеток D. discoideum огромную роль играет хемотаксис. В зависимости от стадии жизненного цикла клетки D. discoideum проявляют хемотаксисную чувствительность к разным аттрактантам. ФК является аттрактантом одноклеточной фазы развития; цАМФ проявляет своё действие на стадии агрегации. Механизм взаимодействия клеток D. discoideum с вышеназванными аттрактантами аналогичен гормональным регуляторным механизмам позвоночных. В связи с этим, будучи простым объектом наблюдения, D. discoideum широко используется для исследований молекулярного механизма гормонально-подобных сигналов. Эти исследования были начаты с изучения функции и механизма воздействия цАМФ при формировании псевдоплазмодия и плодового тела.

1.2.1. Функция аденозин-3'5'-циклофосфата в жизненном цикле

Dictyostelium discoideum

В начале столетия Olive и Potts предположили, что преагрегирующие амебы приобретают способность реагировать на хемотаксисный сигнал [5]. Первые эксперименты, подтвердившие хемотаксисный контроль агрегации амеб, были выполнены Runyon в 1942 г. [5]. Bonner в 1947 г. на основе экспериментальных наблюдений выдвинул предположение, что агрегирующие амебы секретируют хемоаттрактант [18]. Только в 1969 году было установлено, что таким хемоаттрактантом является цАМФ [8], пороговая концентрация которого для хемотаксисного ответа клеток составляет 10"6 - 10"7 М. Чувствительность к цАМФ амебы приобретают в течение 4-х часов голодания [5]. Таким образом, первичным проявлением изменения метаболизма голодающих амеб является секреция цАМФ преагрегирую-щими амебами и их способность к хемотаксисному ответу на этот аттрак-тант.

Амебы, чувствительные к цАМФ, реагируют на этот аттрактант временной активизацией аденилатциклазы, в результате внутренний уровень цАМФ поднимается [19], и клетки начинают выделять новые порции цАМФ во внеклеточную среду [20]. Количество цАМФ, выделяемого каждой клеткой, пропорционально внутриклеточной концентрации цАМФ [21]. Движение каждой клетки направлено к ближайшей клетке, секретирующей цАМФ. Таким образом, амебы собираются в потоки, направленные в сторону автоколебательного центра цАМФ [22]. Временной интервал голодания амеб является фактором, определяющим автоколебательный центр импульсов цАМФ, инициирующих агрегацию клеток.

Агрегация амеб завершается образованием многоклеточной конической структуры, формирование которой сопровождается начальными этапами дифференциации. Поэтому сформированный агрегат уже состоит из двух основных типов клеток, среди которых 80 % составляют «ргеэрог»-клетки и 20 % - «ргес1а1к»-клетки [3]. В дальнейшем менее 1 % клеток подобных «ргес1а1к»-клеткам образуют базальную пластинку. Образование новых типов клеток сопровождается активизацией различных генов [23], инициация которых наблюдается при микромолярных концентрациях цАМФ [24]. Различия между этими типами клеток усиливаются в ходе формирования и миграции псевдоплазмодия. Так например, в «ргезрог»-клетках накапливаются специфические преспоровые антигены [25], специфические преспоровые ферменты [26], увеличивается количество преспоро-вых вакулей [27]. При этом «концевая доминанта» агрегата, а впоследствии псевдоплазмодия продолжает секретировать цАМФ в виде отдельных порций. На рис. 2 представлена схема развития плодового тела И. сИзсо1йеит.

Исследование механизма воздействия цАМФ на клетки О. сИзсо1с1еит позволило выявить, что цАМФ является не только инициатором агрегации, но и играет роль морфогена [28}. Интересно, что в обоих случаях цАМФ функционирует как первичный, так и вторичный медиатор [28].

___^

0 2 4 6 8 10 12

st

pst^ st psp-

pst;.

El* psp pst

PsPHj brf-V

ЬГчИк

psp

1ГГН

psp pst

14

16

18

20

22 24 26

Время (ч)

РИС. 2. Схема формирования плодового тела D. discoideum [34].

Psp - «рге5рог»-клетки, pst - «prectalkw-клетки, br - клетки, формирующие

базальную пластинку, st - клетки ножки.

Анализ взаимодействия цАМФ с клеточной поверхностью позволили выделить четыре взаимопревращающихся рецепторные формы: Ан, AL, Bs, Bss с различными константами и скоростями диссоциации [29], кроме того в последнее время был выделен еще один рецептор (С) тщательный анализ, которого еще предстоит провести [3]. Трансдукция внеклеточного сигнала цАМФ в течение хемотаксисной агрегации амеб и во время дифференциации осуществляется одними и теми же рецепторам [30]. Однако хемотаксис-ная реакция инициируется импульсами цАМФ в наномоля�