Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурные перестройки, происходящие в миозиновой головке при взаимодействии с нуклеотидами и F-актином
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Структурные перестройки, происходящие в миозиновой головке при взаимодействии с нуклеотидами и F-актином"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА
На правах рукописи
УДК 577.152.2
> .О ;
I О ;
ПОНОМАРЕВ Михаил Александрович
Структурные перестройки, происходящие в миозиновой головке
/
при взаимодействии с нуклеотидами и Е-актином.
03.00.04 - биологическая химия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2000
Работа выполнена в Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН и в Институте физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ
Научный руководитель:
доктор биологических наук Д. И. Левицкии
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Н. Б. Гусев доктор физико-математических наук, профессор В. И. Лобышек
Ведущая организация:
НИИ Экспериментальной Кардиологии Российское Кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ
Защита диссертации состоится " " июня 2000 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К.002.96.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в институте биохимии им. А.Н Баха РАН (Москва, Ленинский пр., 33, корп. 2).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский пр., 33, корп. 1)
Автореферат разослан
« 6 »
2000 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук уОг^
А. Ф. Орловскш
Ь 9 И - о
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В основе молекулярного механизма плечного сокращения и многих иных проявлений биологической движности лежит циклическое взаимодействие головок миозина с типом, сопровождаемое гидролизом АТР, согласно следущей схеме: + АТР
A M A M* АТР А + М* АТР -ADP t i
AM ADP <- AM" ADPPj <~ А + M" ADPP;
-Pi
г M - головка молекулы миозина (удобным в экспериментальном ношении объектом являются изолированные миозиновые головки - т. н. □фрагмент 1 миозина или SI), А - актин, AM - актомиозиновый мплекс. В отсутствие нуклеотида головки миозина связываются с тином очень прочно. Такое взаимодействие носит название "сильного", нзывание молекулы АТР головкой миозина приводит к изменению «формации головки (М*) и к диссоциации актомиозинового комплекса, [едующей стадией цикла является гидролиз АТР в активном центре [озиновой головки, приводящий к дальнейшему изменению конформации товки (М *). В этой конформации головка миозина, содержащая в тивном центре продукты АТРазной реакции ADP и Pj, снова взывается с актиновым филаментом, но это связывание значительно абее, чем в отсутствие нуклеотида. Поэтому его называют "слабым" взыванием. Высвобождение продуктов АТРазной реакции из активного нтра приводит к тому, что присоединенная к актину головка миозина эемится принять исходную конформацию, и такая конформационная рестройка приводит к смещению актинового филамента вдоль озинового филамента. При этом "слабое" связывание переходит, в шьное" и цикл замыкается. Согласно современным представлениям, миозиновая головка состоит двух основных, хорошо выраженных структурных доменов: збулярного моторного (N-концевого) и вытянутого регуляторного, зущего на себе легкие цепи. Предполагается, что регуляторный домен и переходе миозиновой головки из состояния "слабого" связывания гтермедиат M" ADPPj) в состояние "сильного" (без нуклеотидов в гивном центре) поворачивается относительно моторного домена как :сткий рычаг (т. н. гипотеза "swinging lever arm") (рис. 1). Он гспечивает увеличение амплитуды конформационных изменений, оисходящих в моторном домене, и таким образом дает наблюдаемые in 'о и in vitro величины взаимного перемещения актиновых и миозиновых шаментов. Однако механизм конформационных изменений, оисходящих в моторном домене в ходе гидролиза АТР, а также пути эедачи этих изменений от активного центра на всю головку остаются до ща невыясненными. Еще более запутанная ситуация складывается с ханизмом модуляции этих изменений за счет взаимодействия озиновой головки с актином.
Поворот регуляторного домена относительно моторного происходит в шем шарнирном участке. Этот участок молекулы содержит интересную спиральную область, содержащую две высокореакционные SH-группы
остатков Суз-697 и Су$-707. Данная область обладает аномально высок подвижностью и предположительно играет важную роль в сопряжен изменений в активном центре с изменением ориентации регулятор» домена.
Актин
Рис. 1. Схематическое изображе! миозиновой головки в до состояниях: до поворота регуляторы домена ("lever arm") относител) моторного домена (заретушировано после поворота (не закраше [Spudich, 1994].
Для структурных исследований интермедиатов АТРазной реаки миозиновой головки в последнее время широко применяются стабильн (долгоживущие) аналоги этих интермедиатов. Это тройные комплек миозиновой головки с АОР и аналогами неорганического фосфата - таки как ортованадат и фториды бериллия, алюминия или скандия. В частно« были кристаллографически определены третичные структуры мотор» домена миозиновой головки в таких комплексах [ОиНск et а1., 1997]. Х( эти работы позволили детально описать механизм гидролиза Аг структурные их аспекты трактуются разными авторами по-разному, сих пор оставалось неясным каким именно интермедиатам АТРаз! реакции соответствуют определенные тройные комплексы. Помимо этс рентгенографические данные, полученные в разное время и разнЫ авторами с использованием фрагментов из разных источников, зачаст противоречат друг другу. Все это приводит к необходимости дальнейш исследования структуры миозиновой головки в тройных комплексах АО] аналогами Р;, причем желательно не только в кристаллах, но и в раство и на объектах из одинаковых источников.
С другой стороны немаловажным представляется исследова! конформационных перестроек миозиновой головки, вызываем взаимодействием с актином. На настоящий момент большине структурных иссследований в этом направлении сводится моделированию комплексов с Е-актином на основании извести третичных структур фрагментов миозиновой головки и актина, а такж! исследованиям локальных конформационных изменений различны методами. Следовательно явно назрела необходимость исследований применением методов интегральной оценки структуры белков комплексов.
Подходящим методом для этого является, на наш взгляд, дфферециальная сканирующая калориметрия (ДСК). Этот метод ззволяет детально изучать процесс тепловой денатурации белка. В нашей >уппе ранее было показано, что ДСК позволяет отчетливо регистрировать знформационные изменения, происходящие в миозиновой головке при >разовании комплексов с АБР и аналогами неорганического фосфата [евицкий и др. 1996]. Также было показано, что данный метод позволяет ггистрировать изменения конформации миозиновой головки, вызываемые ¡аимодействием с актином [№ко1аеуа а!., 1996]. Мы полагаем, что эименение метода ДСК в сочетании с иными методами позволит успешно более детально исследовать механизмы таких конформационных грестроек. Кроме того, с. помощью метода ДСК можно определять шориметрическую доменую организацию белков [ЬеуНэку с1 а1., 1992]. акие исследования мышечных белков проводились в мировой практике гень редко, и мы предполагаем, что информация, полученная из >добных экспериментов, будет немаловажной для понимания эле ку лирного механизма структурных перестроек, происходящих в дозиновой головке в процессе ее функционирования.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы было ¡следование механизмов распространения конформационных перестроек миозиновой головке, вызываемых взаимодействием с нуклеотидами и :тином. В связи с этим ставились следующие задачи:
1). Исследование роли участка, содержащего "существенные" 8Н->уииы остатков Суа-697 и Суя-707, в передаче конформационных ¡менений от активного центра АТРазы на всю молекулу белка. • • - -
2). Исследование методом ДСК доменной организации миозиновой ловки и ее изменений, вызываемых нуклеотидами.
3). Исследование механизма структурных изменений миозиновой ловки, вызываемых формированием комплекса с Е-актином в состоянии ильного" связывания.
Научная новизна работы. С использованием метода ДСК разработаны >вые подходы к исследованию конформационных перестроек, »исходящих в миозиновой головке при взаимодействии с нуклеотидами актином. Впервые получены прямые подтверждения высказывавшихся в ггературе предположений о том, что комплекс 31-АБР-ВеЕх отличается всех других тройных комплексов: он моделирует промежуточное стояние М*-АТР АТРазной реакции миозина, тогда как комплексы .51-ЭР-У; и 81-АБР-А1Р4 имитируют состояние М**-АБР-Р^ ¡Выявлена жная роль области, содержащей "существенные" БН-группьг остатков «-7 0 7 и СуБ-697, в распространении конформационных изменений от тивного центра АТРазы и участка взаимодействия с актином на вею юзиновую головку. Впервые получены данные об изменениях доменной руктуры миозиновой головки, происходящих при связывании АБР.
Практическая ценность работы состоит в том, что полученные зультаты являются основой для дальнейшего изучения механизма аптечного сокращения. Разработанные методические подходы к следованию конформационных перестроек миозиновой головки могут [ть использованы в структурных исследованиях других белков.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены Втором съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), на
з
конференции Национального Института здоровья США (Бетесда, С LUÍ 1997), на Международном симпозиуме "Структура, стабильность и фолдин белков: фундаментальные и медицинские аспекты" (Москва, 1998), н Международном симпозиуме "Биологическая подвижность: современны методы исследований" (Пущино, 1998), на съезде Американског биофизического общества (Балтимор, США, 1999), на 25-ой, 27-ой и 28-о Европейских мышечных конференциях (Монпелье, Франция, 1996; Лун; Швеция, 1998; Йорк, Англия, 1999), на Втором съезде биофизиков Росси (Москва, 1999) и на Гордоновской научной конференции "Мышцг сократительные белки" (Нью Лондон, США, 1999).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатны работ. , ,.,- ..
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзор литературы, описания материалов и методов исследования, изложени результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литератур: (_источников). Работа иллюстрирована_рисунками и_таблицам!
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Получение белков. Миозин получали из быстрых скелетных мыш кролика. Субфрагмент 1 миозина (S1) получали протеолизом миозив химотрипсином при низкой ионной силе в присутствии ЭДТА [Weeds i Taylor, 1975]. Актин выделяли из ацетонового порошка скелетных мыш кролика и очищали двумя циклами полимеризации-деполимеризаци [Spudich & Watt, 1971]. Мономерный G-актин хранили в течение месяг при температуре +4°С в буфере с низкой ионной силой. За час ; использования мономерный G-актин полимеризовали, добавляя MgCl2 1 конечной концентрации 5 мМ, и использовали в F-форме. Дд калориметрических экспериментов Г-актин стабилизировали добавление полуторакратного молярного избытка фаллоидина. Концентрацию S1 актина определяли спектрофотометрически, используя коэффициент поглощения E'^sOhm = 7.5 см"1 для S1 и Е1%>290нм = 6.6 см"1 для актин Молярные концентрации S1 и актина рассчитывали, исходя i молекулярных масс 115 кДа и 42,5 кДа для S1 и мономеров актин соответственно. Рекомбинантные фрагменты миозиновой головк экспрессированные в слизевике Dictyostelium discoideum, были любез! предоставлены группой д-ра Д. Манштейна (Гейдельберг, Германия).
Модификация остатка Cys-707 в S1. Модификацию S1 спиновьн, метками IAASL (на йодоацетамидной основе) или MSL (на малеимидн< основе) проводили по модифицированной процедуре, основанной i методах, описанных в работах [Barnett & Thomas, 1987; Ajtai et al. 1991 Специфическую модификацию SHl-группы остатка Cys-71 регистрировали по ингибированинию К+-ЭДТА-АТРазы S1 и по активащ Са2+-АТРазы S1, измеряемой в присутствии 0.5 М KCl.
Модификация остатка Cys-697 в S1. Специфическую модификаци SH2-rpyraibi остатка Cys-697 в S1 реагентом IANBD проводили i модифицированной процедуре, основанной на методах, описанных работах [Ajtai & Burghardt, 1989; Root & Reisler 1992]. Степень включеш IANBD в SI контролировали по падению Са2+-АТРазной активности S измеряемой в присутствии 0.5 М KCl, и спектрофотометрически, использ;
коэффициент молярного поглощения присоединенного к белку кодификатора, равный 27000 М^слг1 при длине волны 495 нм [Ajtai & 3urghardt, 1989].
Формирование стабильных тройных комплексов S1 и эекомбинантных форм миозиновой головки из D. discoideum с ADP и шалогами P¡ (V¡, BeFx, A1F4~, ScFJ. Препараты миозиновой головки ;иализовали против буфера 30 мМ HEPES, 2 мМ MgCl2, рН 7.3 (КОН). Затем к препаратам, содержащим 0.5 - 4 мг/мл белка, добавляли ADP до сонечной концентрации 0.5 - 1 мМ. Для получения комплекса с ADP и V¡ к юлученному комплексу с ADP добавляли NaH2V04 до конечной концентрации 0.2 - 1.0 мМ, раствор перемешивали и выдерживали 30 шнут при температуре +4°С. Для получения комплексов с ADP и BeFx, V1F4" или ScFx к белку в нрисутствииАПР добавляли NaF до концентрации i мМ, инкубировали 10 мин при комнатной температуре; затем добавляли ВеС12, AICI3 или БсС1з, соответственно, до конечной концентрации 0.2 - 0.8 iM и выдерживали 30 минут при температуре 4°С.
Исследования методом дифференциальной сканирующей шкрокалориметрии (ДСК). Калориметрические исследования проводили ia дифференциальных адиабатических сканирующих микрокалориметрах 5ASM-4 и DASM-4M (Институт биологического приборостроения РАН, г. 1ущино-яа-Оке) с капиллярными платиновыми ячейками, рабочий объем :оторых составляет -0.5 мл [Privalov & Potekhin, 1986; Shnyrov et al., 1997). 1змерения проводили при скоростях нагрева ячеек от 0.125 до 1.8 К/мин в ;иапазоне температур от 5 до 130°С. Для исключения возможных ртефактов, вызываемых выделением газа из растворов при нагреве, во сех экспериментах в ячейках поддерживали избыточное давление в 2.5 тм. Диапазон концентраций белка составлял 0.5 - 10 мг/мл. Стандартная корость сканирования составляла 1 К/мин; стандартные концентрации елка составляли 1.5-3 мг/мл. Ячейки сравнения заполняли буфером, дентичным тому, . в котором находился белок. Для проверки еобратимости денатурации регистрировали повторные прогревы репаратов, то есть повторные сканы, полученные после регистрации енатурации белка и последующего его охлаждения без перезаправки чеек прибора. Такие повторные прогревы использовались при дальнейшей бработке результатов в качестве базовых линий.
При кинетических исследованиях учитывался вклад в егистрируемую кривую экспериментально определяемого времени ответа рибора (т). Для обоих приборов величина т составляла от 15 до 30 сек.
Для обработки и анализа кривых тешюпоглогцения изучаемых белков спользовали пакеты программного обеспечения "Origin" версий 1.16, 2.90, .73.
Исследования методом спектроскопии электронного парамагнитного езонанса (ЭПР). Исследования методом ЭЛР проводили совместно с д. ф.-. н. В. П. Тимофеевым в Институте молекулярной биологии им. В. А. нгельгардта РАН. Измерения проводили на ЭПР-спектрометре "Varían" -104А в стандартной кювете объемом 100 при частоте
пектромагнитного поля 5 мВт, развертке 100 G (начиная с 3250 G), ощности СВЧ-поля 5 мВт, и амплитуде модуляции 2 G.
s
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 1. Химические модификации SH-групп остатков Cys-697 : Cys-707 в молекуле S1. По современным представлениям на пут сопряжения конформационных перестроек, происходящих в активно) центре АТРазы миозиновой головки, с поворотом регуляторного домен молекулы относительно моторного домена (рис. 1) находится нескольк важных участков третичной структуры, консервативных для большинств миозинов. Один из них, непосредственно примыкающий к регуляторном; домену, представляет собой а-спираль, содержащую два абсолюта консервативных остатка глицина. Эта область обладает высоко подвижностью как за счет возможных поворотов на остатках глицина, та и за счет возможности частичного разворачивания а-спирали зависимости от нуклеотидов, находящихся в активном центре АТРаз] [Houdussie et al., 1999]. Однако имеющиеся данные о функционально значимости и изменении структуры этой области в цикле работ) миозиновой головки во многом противоречивы. В S1 из скелетных мыш такая а-спираль содержит две SH-грухшы остатков Cys-697 и Cys-707 - -н. SH2- и SHl-группы, соответственно. Эти SH-группы могут быт специфически модифицированы химическими реагентами. Исходя из этоп мы поставили перед собой задачу - с одной стороны, исследовать методо: ДСК влияние таких модификаций на способность S1 подвергатьс глобальной структурной перестройке при образовании стабильны тройных комплексов с ADP и аналогами Р; и, с другой стороны, методо: ЭПР исследовать локальные структурные изменения в области SH1 группы, вызываемые связыванием нуклеотидов.
1.1. Специфическая модификация SH2-группы S1. Ранее в наше группе было показано, что метод ДСК позволяет отчетливо регистрироват конформационные изменения, происходящие в молекуле S1 пр образовании тройных комплексов с ADP и аналогами Р,. На рис. показаны кривые теплопоглощения контрольного немодифицированного S (рис. 2А) и S1, специфически модифицированного по SH2 -групп флуоресцентной меткой IANBD (IANBD-S1) (рис. 2Б) в отсутстви нуклеотидов, в присутствии ADP и в тройных комплексах SlADPBeF SI ADP V; и SI ADPA1F4-.
... Видно, что в отсутствие нуклеотидов в активном центре АТРазы S модификация заметно изменяет характер тепловой денатурации белк Заметно возрастает термостабильность - температура максимума криво (Тт) увеличивается почти на 5°С. Заметно изменяется калориметрическа доменная организация молекулы S1, которую можно оценить л изменению кооперативное™ кривой денатурации (ДТ0.5). Эта величии увеличивается с 7.5°С для S1 до 9.7°С для IANBD-S1. Связывание AD практически не меняет Тт и калориметрическую энтальпию (АНса1), к приводит к некоторому увеличению кооперативности перехода для обои препаратов белка (величина ДТ05. снижается). При образовании тройны комплексов (кривые 3-5 на рис. 2) различия между модифицированным нативным препаратами S1 становятся наиболее заметны. Для контрольно] S1 формирование тройных комплексов SlADPBeFx, SlADPVj SI ADP AIF4" вызывает сильную стабилизацию белка (увеличение Tm г
1.6, 8.2 и 7.7°С соответственно), увеличение ЛНеа] на 15, 25 и 30 % оответственио, а также увеличение кооперативное™ теплового перехода фимерно вдвое. В то же время образование тройных комплексов 1АЫВО->1 с АБР и У; или не оказывает значительного влияния на характер
■епловой денатурации модифицированного белка. С другой стороны, бразование комплекса 1АМВО-£>1 АБРВеЕх приводит к заметному гвеличению термостабильности (Тт увеличивается на 4.4°С) и ^оперативности по сравнению с комплексом 1АМВВ-51АБР. По гараметрам тепловой денатурации комплекс 1А^тВВ-31АВРВеГх близок к налогичному комплексу, сформированному немодифицированным Б1, а по еличине Тт даже превышает последний.
70 60 50 40 30 20 10 0
30
20
10
01-
А ,5
li Контрольный SI x/j ■ 2 /й
/1\ !\ • /il 1
/ \i//i 1 J> V.//< г V/f L
Б \ л
IANBD-S1 2 7/i
Л( / 41
fjjj -и
,1,1.1.1,1.1. , 1 . 1
Рис.
_2. Кривые препаратов
30 35 40 45 50 55 60 65 Температура (°С)
70
теплопогло-контрольного (А) и S1,
щения
немодмфицированного специфически модифицированного по БН2-группе флуорес-центной меткой 1АКВБ (ТАЫВБ-Э!) (Б), в отсутствие нуклеогидов (кривые 1), в комплексах с АВР (кривые 2) и в тройных комплексах 31АБРВеГх, Б1АБРУ; и вГАБР-АЦу (кривые 3-5).
Таким образом, модификация БШ-группы в приводит, во-первых, к увеличению
термостабильности белка в отсутствие нуклеотидов. Это, возможно',-, объясняется тем, что такая. модификация может частично моделировать изменения структуры молекулы, вызываемые связыванием нуклеотидов (в литературе имеются данные по исследованию собственной
это предположение). Во-вторых,
шуоресценции S1, подтверждающие одификация SH2-rpynnbi препятствует конформационным перестройкам S1, вызываемым образованием комплексов с ADP и Vj или AIF4", но не пияет на перестройки, вызываемые образованием комплекса с ADP и eFx.
1.2. Специфическая модификация SHl-грулпы S1 спиновыми метками. Исследования методом ДСК Ранее в нашей группе было показано, что азличные модификаторы SH1-группы по-разному влияют на изменения арактера тепловой денатурации S1, вызываемые образованием тройных эмплексов с ADP и V; или BeFx [Golitsina et al., 1996]. Для детализации еханизма таких различий нам представлялось интересным сравнить шные о изменениях всей молекулы белка, получаемые методом ДСК, с
данными о локальном окружении SHl-группы, получаемыми методом ЭП1 Поэтому мы использовали для модификации SHl-группы спиновые метк: на двух разных основах - йодоацетамидной и малеимидной (IAASL и MSI соответственно). Модификация SHl-группы обеими этими метками н вызывала серьезных изменений характера тепловой денатурации белка отсутствие нуклеотидов и в присутствии ADP. В то же время об модификатора, по по-разному, изменяли эффекты, вызываемы образованием тройных комплексов S1 с ADP и аналогами Pj. На рис. представлены кривые теплопоглощения немодифицированного S1 и S1 модифицированного по SHl-группе IAASL или MSL (IAASL-S1 и MSL-S1 соответственно) в тройных комплексах с ADP и BeFx (рис. ЗА) или A1F; (рис. ЗБ).
Рис. ' 3. Кривые тешюпоглс щения препаратов контрольног немодифицированного S1 (кривы 1) и S1, специфическ модифицирован-ного по SH1 группе спиновыми меткам IAASL (IAASL-S1) (кривые 2) ил MSL (MSL-S1) (кривые 3) тройных комплексах с ADP •BeFx (А) или A1F4- (В).
Хорошо видно, чт
модификация SHl-rpynm существенно препятствуе конформационным изменениям сопровождающим образовани комплекса S1 с ADP и A1F4", заметно меньше - комплекса Температура (°С) ADP и BeFx. Важно отметит!
что в этом отношении спинова метка на основе малеимида оказалась намного эффективней метки н основе йодоацетамида - однако лишь в случае тройного комплекса с ADP A1F4,' но не для комплекса с ADP и BeFx. Тройные комплекс! модифицированных по SHl-группе препаратов S1 с ADP и V, был: практически идентичны по характеру тепловой денатурации комплекса) этих препаратов с ADP и A1F4".
Таким образом, исследования тепловой денатурации S1 с химическ модифицированной SH1 -группой выявляют, во-первых, существенны отличия между разными тройными комплексами белка с ADP и аналогам фосфата, которые можно разделить на две группы: с одной сторош SlADPBeFx, а с другой - Sl ADPYj и SI ADPAIF4". Во-вторых, эт исследования выявляют разницу между эффектами разны модификаторов. По-видимому, различия в эффектах разны: модификаторов определяются взаимодействием их основ (йодоацетамидно:
ъли малеимидной) с непосредственным окружением SHl-группы остатка :ys-707.
1.3. Специфическая модификация SHl-группы S1 спиновыми метками. Исследования методом ЭПР, Для исследования изменений локального жружения SHl-группы при образовании различных комплексов S1 с [уклеотидами мы использовали те-же спиновые метки, что и при «¡следованиях методом ДСК. Здесь мы приводим в графическом ютолнении данные только для модификатора IAASL, поскольку, как это !ИДно из предыдущего раздела, он оказывает наименьшее собственное шияние на характер структурных перестроек, происходящих в молекуле •елка. " ■ " ■■':>■
' На рис. 4 приведены спектры ЭПР нитроксильного радикала для IAASL-S1 в отсутствие нук^ёотиДов,'! в комплексах с ADP ' или нерасщепляемым аналогом АТР ATPyS, и в тройных комплексах с ADP и аналогами неорганического фосфата.
М1М2
В отсутствие нуклеотидов
ADP
ATPyS ADP+BeF
ADP+ScF
ADP+V
\DP+A1F -
4
Рис. 4. Спектры ЭПР IAASL-S1 в отсутствие и в присутствии нуклеотидов.
Характерной особенностью спектра является наличие даже в свободном от нуклеотидов 1АА8Ь-31 двух состояний окружения метки
(обозначенных на рис. 4 как М1 и М2). Все изменения спектров, вызываемые образованием
комплексов с различными уклеотидами, вызваны изменением соотношения вероятностей вождения нитроксила в этих состояниях. Из рисунка хорошо видно, что эи взаимодействии с нуклеотидами уменьшается расстояние между )айними широкими пиками спектра (величина 2А2' - единственная ¡мпонента тензора сверхтонкого расщепления, которая может быть ф еде лена непосредственно из спектра), причем по степени уменьшения ого параметра все исследованные препараты можно расположить в ряд. а одном конце этого ряда расположены свободный от нуклеотидов ^АБЬ-51 и комплекс ЬААБЬ-ЗГАБР (2Аг" = 68.91+0.21. и 67.52±0.34 ^ ответственно), а на другом - комплексы 1АА8Ь-51АВР"У1 и 1АА8Ь-. АОРА1Е4- (54 и 52 Сг, соответственно). Тройной комплекс 1ААБЪ-
31АОРВеРх имеет величину 2Аг', равную 65.010.6 С, и близок по этом параметру к IА АЗЪ-БГАТР-уЭ (2Аг' = 66.1910.44 О- По процентном соотношению состояний М1 и М2 все исследованные препараты чет» делятся на две группы. Первая включает в себя 1АА8Ъ-Б1,1ААЗЬ-51АВ] 1АА5Ь-51АТРуЗ и 1ААЗЬ-81АОРВеЕх (вклад состояния М1 составляЕ более 70%), а вторая - тройные комплексы 1ААБЬ-51 с АБР и другим аналогами фосфата (вклад состояния М1 - менее 30%).
В случае экспериментов с Б1, модифицированным по БШ-групг малеимидной спиновой меткой (МБЬ-Б!), все исследованные препарат можно также расположить в ряд и точно в такой-же последовательност Однако эффекты, вызываемые связыванием различных нуклеотидо выражены в этом случае намного слабее, чем в случае 1ААЭЬ-31. Кро^ того, если состояние М1 одинаково для обоих модификаторов (что говор» о сходности окружения меток в свободном от нуклеотидов белке), т состояние М2 по своим динамическим параметрам гораздо ближе состоянию М1 в случае МБЬ-Б!, чем в случае 1ААЗЬ-51.
Таким образом, исследования методом ЭПР выявляют ка существенные различия между комплексами миозиновой головки нуклеотидами, так и разницу между эффектами использовании модификаторов. Во-первых, по влиянию на локальнре окружение Суз-7С все исследованные комплексы четко делятся на ¡'две группы. Во-вторы: тройной комплекс Б1-АБРВеРх сходен с комплексом БГАТРуБ, I существенно отличается от других тройных комплексов с АБР и аналогам фосфата. В-третьих, спиновая метка на : малеимидной оснм демонстрирует намного более низкую подвижность при образована белком тройных комплексов, чем метка на йодоацетамидной основе.
Исходя из вышеизложенного, можно. сделать некоторь предположения.
1. Тройной комплекс 81АОРВеЕх отличается от всех остальнь: тройных комплексов и, по-видимому, моделирует состояние М'АТР, тог; как комплексы БЬАБРЛ^ и 51АБРА1Г4" имитируют, скорее всег состояние М" АБР Р^
2. Локальные конформационные перестройки в области БН!- и ЭН! групп (в частности увеличение подвижности области БШ-групга происходят в основном при переходе из состояния М' АТР в состояю М"АОРР^
3. Увеличение подвижности области БШ- и БН2-групп необходимо Д1 распространения конформационных перестроек, сопровождающ» образование интермедиата М** АБР РЬ от активного центра АТРазы на вс молекулу Б1, но несущественно для такого процесса при образован» интермедиата М' АТР.
: 4. Имеющиеся в литературе объяснения малой подвижности спиновь или флуоресцентных меток на основе малеимида в цикле гидролиза АТ головками миозина жесткостью малеимидной компоненты могут приводит к неадекватным интерпретациям результатов, поскольку так} модификаторы в значительной степени препятствуют конформационны изменениям всей молекулы.
Глава 2. Исследования доменной организации миозиповой головки методом ДСК. Важным достоинством метода ДСК является возможность определения калориметрической доменной организации белков. Ранее в нашей группе методом "последовательного отжига" (экспериментальная процедура выявления доменов в необратимо денатурирующих белках) 5ыло показано наличие в молекуле S1 трех калориметрических доменов -г. е. областей, денатурирующих относительно независимо друг от друга 'Levitsky, 1994]. Сходные результаты дает компьютерная деконволюция по минимизационным алгоритмам, реализованным в программе Origin 'Microcal Inc.). Вопрос о соответствии калориметрических доменов определенным областям молекулы S1 был отчасти разрешен экспериментально. Предполагается, что первые два калориметрических домена соответствуют некоторым областям моторной части миозиновой -оловки, а третий, самый термостабильный - регуляторной части ("lever irm"). Интересной представляется задача идентификации салориметрических доменов в комплексах S1 с различными нуклеотидами 1 соотнесение их с доменами в свободном от нуклеотидов SI, а :ледовательно и с определенными структурными частями молекулы. Мы топытались решить такую задачу в наиболее простом варианте -юменение доменной организации миозиновой головки при образовании сомплекса с ADP.
2.1. Тепловая денатурация фрагментов миозиновой головки из глизевика Dictyostelium discoideum. Рекомбинантный фрагмент головки шозина II из Dictyostelium discoideum (М765), представляющий собой полированную моторную часть головки (остатки 1-765), был любезно федоставлен нам для калориметрических исследований группой д-ра Д. Данштейна (Гейдельберг, Германия). На рис. 5 приведены кривые еплопоглощения фрагмента М765 в отсутствие нуклеотидов, в комплексе ADP и в тройных комплексах с ADP и аналогами неорганического эосфата
i 20 о.
)
о
1-М765
2 - M765-ADP
3 - M765-ADP-BeF
.а
i - M765-ADP-ALF, 5 - M765-ADP-V
30 35 40 45 50 55 60 65 Температура (°С)
Рис. 5. Кривые тепло-поглощения фрагмента головки миозина М765 из О. discoideum в отсутствие нуклеотидов (кривая 1), в
присутствии АИР
(кривая 2) и в тройных комплексах с АБР и ВеГх (кривая 3), А1Р4-(кривая 4) или V; (кривая 5).
И
Хорошо видно, что изменения характера тепловой денатурации М765, вызываемые формированием тройных комплексов (рис. 5), сходны с таковыми для скелетномышечного 51 (рис. 2А). При образовании тройных комплексов М765 с АОР и ВеРх, У; и А1Г4" максимум кривой теплопоглощения смещается в сторону более высоких температур на 3.6, 6.3 и 5.8°С, соответственно; при этом также увеличивается энтальпия (на 10-25 %) и кооперативность тепловых переходов. Таким образом, можно утверждать, что структурные перестройки, регистрируемые методом ДСК, происходят в основном в моторной части миозиновой головки. Следует отметить, что по абсолютным значениям Тт фрагмент М765 и его комплексы с нуклеотидами менее термостабильны, чем скелетномышечный БГ. например, в отсутствие нуклеотидов величина Тт для М765 на 4.0°С ниже, чем для Э1 (кривые 1 на рис. 2А и рис. 5). Сопоставляя это с имеющимися литературными данными, можно говорить о том, что низкая термостабильность характерна для миозинов, выделяемых из нетеплокровных организмов, и, таким образом, не является следствием удаления регуляторного домена миозиновой головки.
На рис. 6 представлены результаты компьютерной деконволюцим кривых теплопоглощения скелетномышечного Б1 (рис. 6А) и фрагмента М765 (рис. 6Б), полученных в отсутствие нуклеотидов.
Рис. 6. Результаты компьютерной деконволюции кривых теплопоглощениг скелетномышечного (А,Б) и фрагмента М765 из О. сИзсслёеит (Б,Г) полученных в отсутствие нуклеотидов (А,Б) или в присутствии 0.5 мМ АББ (В,Г). Пунктиром показаны выявляемые деконволюцией независимые тепловьк переходы (калориметрические домены).
Важно отметить, что для скелетного Б1 результаты такс« деконволюции сходны с теми, которые ранее были получены методок "последовательного отжига" [Levitsky, 1994] (т. е. в Б1 выявляются тр;
30 40 50 60 30 40 50 60
Температура (°С)
этдельных калориметрических домена). Напротив, в отличие от S1, во фрагменте М765 выявляется только два отдельных перехода (рис. 6Б). Методом последовательного отжига мы показали, что в М765 действительно отсутствуют отдельные тепловые переходы после основного максимума кривой. Таким образом, эти результаты подтверждают тредложенную ранее модель доменной организации миозиновой головки Levitsky, 1994], согласно которой третий (самый термостабильный) тепловой переход в составе кривой теплопоглощения скелетного S1 »ответствует регуляторному домену головки.
Различия между S1 и М765 особенно ярко выявляются при >ассмотрении эффектов, вызываемых связыванием ADP. В отличие от :келетного S1, связывание ADP с фрагментом М765 приводит к юачительному (на 3.5°С) увеличению термостабильности белка без аметного изменения коопёративности (рис. 6Б,Г). Принимая во внимание 1тсутствие в М765 регуляторного домена, а также то, что согласно ипотезе "lever arm" этот домен функционирует как единое целое (не [зменяя заметно своей структуры), мы предложили следующую [нтерпретацию таких данных. Моторный домен в S1 (представленный алориметрическими доменами 1 и 2 на рис. 6А) претерпевает изменения, ходные с М765, т. е. смещается в сторону более высоких температур без ущественного увеличения коопёративности. Третий же алориметрический домен S1, соответствующий регуляторной части оловки, остается, по-видимому, неизменным, и в результате совпадает по оложениго с пиком теплопоглощения моторной части. Такое развитие обытий вполне могла бы вызывать наблюдаемые на рис. 6 различия :ежду S1 и М765. Это предположение требовало, однако, ксперименгальной проверки.
2.2. Кинетический анализ тепловой денатурации скелетяомышечного '1 и его комплекса с ADP. Для проверки вышеизложенной гипотезы мы рименили метод последовательного отжига совместно с кинетическим иализом калориметрических данных. Структурные различия моторного и егуляторного доменов S1 позволяют предполагать разные механизмы эпловой денатурации этих доменов, а следовательно и разную 1Висимость их тепловых переходов от скорости сканирования по змпературе. Мы . исследовали методом последовательного отжига эменную организацию S1 и S1ADP при скоростях нагрева от 0.25 до 1.8°С минуту. Приняв простейший одностадийный вариант кинетической схемы знатурации для комплекса SI ADP, т. е. схему:
к
N D
[е N и D - соответственно нативное и денатурированное состояния белка, к - константа скорости денатурации первого порядка, мы рассчитали гсргии активации (Еа) процесса денатурации различными методами и для 1зных скоростей нагрева. Наиболее показательные результаты приведены i рис. 7А.
105
О
S
X
"rt о M
100
95
W
ВО
85
A
—Я— к vs. ÎOVT -•-lti(ln(Q,/Q-Q» vs. 103/T
0.5 1.0 1.5
Скорость сканирования (K/min)
я о X
О <
: 0.25 K/min i 1 -1 1 M '■ ' i Б
........... Sl-ADP /
~-S1 P »
UV "Эй
: r^flflffr w
fp~ 1
1 . t . 1 1.1.
Рис. 7. А - Зависимост] энергии активации (Еа) дл] процесса тепловой денатураци! комплекса 81АВР от скорост! нагрева образца. Представлен! зависимости, рассчитанные двум; разными способами. Б Экспериментальные крицы-
теплопоглогцения Б1 (пунктир) 1 51-АОР (сплошная линия] полученные в результат процедуры "последовательноп отжига", то есть после нагрев; образцов до температур! основного максимума ]
последующего охлаждения.
30 40 50 60 Температура (°С)
На рисунке 7 А представлен; зависимость рассчитанной и экспериментальных данны: величины Еа от скорост] нагрева для комплекса SI ADI В случае соответстви. механизма денатурации предполагаемой модели такая зависимост очевидно должна быть линейной. Хорошо видно, что относительна, линейность (в пределах экспериментальных ошибок) сохраняется пр: высоких скоростях нагрева (более 0.5°С/мин) и серьезно нарушается пр переходе к низким. Это свидетельствует о том, что процесс денатураци комплекса SI ADP имеет как минимум двустадийную кинетику. Ме-годо: последовательного отжига мы проверили на низких скоростях нагрева (0.2 и 0.5°С в мин.) наличие отдельных тепловых переходов после основног максимума кривой теплопоглощения. И действительно, таким способга неоднократно удавалось выявить в препарате SI ADP отдельный теплово переход, совпадающий по положению и форме с аналогичным переходом препаратах свободного от нуклеотидов S1 при тех же скоростях нагрев (рис. 7Б). Это значит, что и в препарате S1ADP имеется тепловой перехо; отражающий плавление регуляторной части головки, однако при высоки скоростях сканирования он может совпадать по положению с тепловым переходами моторной части и поэтому не выявляется на термограммах.
Таким образом, были получены подтверждения предложенно гипотезы о характере изменений доменной организации S1, вызваемы связыванием ADP. То, что калориметрический домен, соответствующи регуляторной части миозиновой головки, не претерпевает значительны изменений при образовании комплекса S1 с ADP, хорошо согласуется известной из литературы гипотезой "swinging lever arm" [Spudich, 1994].
Глава 3. Исследования методом ДСК комплексов миозиновой (ловки с F-актином в состоянии "сильного" связывания. Структурные грестройки миозиновой головки, происходящие в цикле гидролиза АТР, в гачительной мере модулируются за счет ее взаимодействия с актином, днако на данное время существует мало методов оценки структурного •стояния комплекса миозин-актин. В этом плане многообещающим зедставляется метод ДСК, позволяющий . регистрировать процесс ;натурации белка под действием температуры и, таким образом, щучать информацию о структурных перестройках молекулы белка. В 196 году было показано, что при взаимодействии с актином характер пловой денатурации миозиновой головки в значительной мере меняется: (еличиваются термостабильность S1, энтальпия и кооперативность плового перехода [Nikolaeva et. al., 1996]. Однако при этом кривые плопоглощения F-актина и S1 сильно перекрывались. В последнее время [я лучшего • разрешения пиков мы используем для калориметрических следований F-актин, стабилизированный фаллоидином. Этот гексапептид эксин бледной поганки) специфически связывается с F-актином и ачительно увеличивает его термостабильность.
Рис. 8. А .- экспериментальные термограммы фрагмента... М765 (пунктир), стабилизирован-
ного фаллоидином Р-актина (прерывистая линия) и их комплекса, полученного в присутствии 1мМ МУР (сплошная линия). Вертикальная отметка соответствует 10 цЛ^. Б Температурные зависимости
избыточной теплоемкости
фрагмента М765 в отсутствие и в присутствии Г-актина. Параметр ЛТт ' - индуцируемый актином сдвиг кривой теплопоглощения М765. , Область денатурации актина ,(>65°С) здесь не показана.
На рисунке 8А представлены кривые теплопоглощения
фрагмента миозиновой головки М765, стабилизированного
фаллоидином Р-актина и их комплекса, полученного в присутствии 1 мМ АБР (т. е. в состоянии " "сильного"
юывания). Хорошо видно, что взаимодействие М765 с Р-актином 1ктически не влияет на характер тепловой денатурации актина, но детно увеличивает термостабильность М765, а также кооперативность и
энтальпию его теплового перехода. На рис. 8Б представлена бол« подробно область денатурации М765 в отсутствие и в присутствии I актина. В качестве основного параметра изменения характера денатурацт: миозиновой головки мы использовали параметр ДТт, т. е. смещен* температуры максимума теплового перехода, вызываемс взаимодействием с Б-актином. В данном случае (для фрагмента М76! величина этого параметра составляет 6°С. Таким образом, метод ДС позволяет отчетливо регистрировать изменения характера тепловс денатурации миозиновой головки, вызываемые взаимодействием с I актином. Мы предположили, что такие изменения отражают глобальнь структурные перестройки, индуцируемые актином в головке миозина. Дх выявления характера таких перестроек мы использовали в подобны экспериментах фрагменты миозиновой головки со специфическим модификациями некоторых функционально важных участков.
Миозиновая головка имеет несколько участков взаимодействия актином. Один из них представляет собой подвижную петлю в облает 600-х остатков (т. н. петля 2), насыщенную положительно заряженным аминокислотными остатками. Как предполагается, эта петля отвечает г первичное электростатическое узнавание актина миозиновой головкой пр образование актомиозинового комплекса. Мы исследовали теплову денатурацию фрагмента миозиновой головки М765 из DictyosteIiu, сНясси^еит с изменениями в петле 2 как в отсутствие, так и в присутстви Р-актина. Изменения петли заключались во вставках участке аминокислотной последовательности, несущих либо дополнительнь: положительно заряженные остатки, либо отрицательно заряженнь остатки, либо не несущих дополнительных зарядов. Мутантные белки I основе фрагмента М765 были любезно предоставлены группой д-р Д.Манштейна (Гейдельберг, Германия).
Все мутанты были исследованы методом ДСК на способное'] претерпевать конформационные перестройки, вызываемые связывание АВР и образованием тройных комплексов с АБР и аналогам неорганического фосфата. Показано, что все исследованные мутант обладали такой способностью, подобно исходному препарату М765 (рис. Е На рис. 9 для всех мутантов М765 представлены величины сдвига кривс теплопоглощения (ДТт), вызываемого взаимодействием с Е-актином, также величины сдвига, вызываемого образованием комплекса с АБР. обозначениях белков первая цифра указывает длину вставки, а вторая вносимый дополнительный заряд. Например, М765(8/+4) означает, что петлю вставлено 8 дополнительных остатков и 4 из них нес} положительный заряд. Из рисунка видно, что величина индуцируемо] актином сдвига кривых теплопоглощения фрагментов миозиновой головк хорошо коррелирует с вносимыми дополнительными зарядами. В то вреы как внесение вставок с нулевым зарядом вызывает лишь неболыш снижение величины ДТЮ (на 0.9-1.3°С по сравнению с контрольным М76Е внесение дополнительных положительных зарядов увеличивает величии ДТт, причем тем сильнее, чем больше положительных зарядов внесено петлю 2. Например, для М765(4/+1) величина ДТт увеличивается на 0.8° по сравнению с контрольным М765, а для мутанта М765(11/+6) - на 3.1°< С другой стороны, внесение дополнительных отрицательных зарядов
[етлю 2 уменьшает индуцируемый актином сдвиг кривой теплопоглощения Д705, который для фрагмента М765(20/-10) составляет всего 1.2°С.
|J-аш I -ИМ«| -—I -—иии+J—ип [ -НТЫ | -ГУИЯ||-ВВЖ+
(20/-10) (4/-1) (8/0) (11/0) М765 (4/+1) (8/+4) (11/+6)(20/+12)
Препараты М765 с изменениями по петле 2.
Рис. 9. Сдвиг в сторону более высоких температур (ДТт) максимумов ривых теплопоглощения препаратов М765 с мутациями по петле 2, вызываемый зязыванием F-актина или ADP.
Из рисунка 9 также видно, что увеличение термостабильности сследованных препаратов, вызываемое связыванием ADF в отсутствие ктина, тоже зависит от вносимого в петлю 2 дополнительного заряда. Это озволяет утверждать, что изменения заряда в петле 2 влияют на аспространение конформационных перестроек от активного центра .ТРазы на всю молекулу белка даже в отсутствие актина.
Важно отметить, что в условиях проведения эксперимента все сследованные белки связывались с актином. При этом, по данным инетических экспериментов, сродство к актину изменялось в зависимости г заряда, внесенного в петлю 2 [Furch et al., 1998]. Эта зависимость орошо коррелирует с полученной нами зависимостью величины АТт от аряда в петле 2 (рис. 9). Имеются, однако, и некоторые различия между энными кинетических экспериментов и данными ДСК. В частности, >рагмент М765(20/+12) демонстрирует наибольшее увеличение сродства иозиновой головки к актину, хотя его калориметрический эффект ниже, ем, например, для фрагмента М765(8/+4). Кроме этого, в литературе меются данные о том, что замещение петли 2 в миозине из D. discoideum а соответствующую петлю из скелетномышечного S1 приводит к ллыюму увеличению сродства к актину [Murphy & Spudieh, 1999]. С
другой стороны, в наших исследованиях методом ДСК препараты М765 и в сходных условиях демонстрируют примерно одинаковое увеличение термостабильности в присутствии Р-актина (6.0 и 5.9°С соответственно). Все это позволяет предполагать, что наблюдаемые калориметрические эффекты отражают не локальные изменения в области актин-связывающей петли 2, а глобальные изменения структуры миозиновой головки, вызываемые связыванием Е-актина. Следовательно, можно заключить, что изменения зарядов в петле 2 влияют на такие структурные перестройки.
Мы исследовали также влияние модификации БН-групп остатков Суц-697 и Суэ-707 на способность скелетномышечного претерпевать структурные перестройки, вызываемые связыванием Е-актина. Было показано, что взаимодействие с Е-актпном препарата 81, модифицированного по БШ-группе остатка СуБ-697 специфическим реагентом ЬАШШ, несколько увеличивало температуру максимума кривой теплопоглощения, хотя сродство к актину при этом снижалось почти на порядок. Модификация БШ-группы остатка Су5-707 специфическим реагентом ¡ААЭЬ сильно увеличивала вызываемый актином сдвиг кривой теплопоглощения Б1: величина ДТт увеличивалась с 5.9°С до 8.4°С (т. е. дс величины, сравнимой с таковой для мутантного фрагмента М765(8/+4) -8.8°С). Следует отметить, что такая модификация не оказывала влияния на сродство Б1 к Г-актину. Это еще раз свидетельствует об отсутствия прямой корреляции между наблюдаемыми методом ДСК изменениями характера тепловой денатурации миозиновой головки при связывании с Р-актином и сродством миозина к актину.
Важно отметить, что 8Н1-группа остатка СуБ-707 находится I миозиновой головке довольно далеко (на расстоянии более 5 нм) от петли 2 Сходство эффектов, вызываемых модификацией БШ-группы и внесение» дополнительных положительных остатков в петлю 2, наводит на мысль ( наличии дальнодействующих структурных взаимосвязей между этим! участками. Следовательно, можно предполагать, что область миозиново» головки, содержащая существенные БН-группы, важна дл5 распространения конформационных изменений на всю миозиновую головку не только от активного центра АТРазы, но также и от центро] взаимодействия с актином.
выводы
1. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) 1сследовано влияние модификации остатков Суэ-707 и Суэ-697 в полированной миозиновой головке (субфрагмент 1 миозина, 51) на труктурные перестройки Э1, вызываемые образованием стабильных •ройных комплексов с АБР и аналогами неорганического фосфата -фтованадатом (У;) и фторидами бериллия (ВеГ„) или алюминия (А1Е4). 1оказано, что специфическая модификация этих остатков препятствует труктурным перестройкам, происходящим в молекуле Э1 при образовании юмплексов■,81гАВР-У] и БХ-АОР-АП»^, но почти не влияет на перестройки, взываемые образованием комплекса 81-АОР-ВоГх.
2. При комплексном использовании методов ДСК и ЭПР получены [рямые подтверждения высказывавшихся в литературе предположений о ом, что комплекс 81-АВР-ВеГх отличается от всех других тройных :омплексов: он моделирует промежуточное состояние М*-АТР АТРазной »еакции миозина, тогда как комплексы ЭЬАБР-У; и 51-АБР-А1Г4 [митируют состояние М**-АБР-Р!.
3. Методом ДСК исследованы экспрессируемые в ОШуа^еИит НзсоМеит фрагменты миозиновой головки, соответствующие глобулярной шторной части головки, и ¡показано, что эти фрагменты сохраняют пособноеть к структурным перестройкам при образовании тройных омплексов с АБР и аналогами фосфата. Сделан вывод, что такие ;ерестройки происходят в глобулярной моторной части головки.
4. Методом ДСК с использованием процедуры "последовательного тжига" исследовано влияние АБР на доменную структуру 81. Показано, то связывание АБР вызывает структурные изменения лишь в моторном яо не в регуляторном) домене миозиновой головки и не влияет на заимодействие между этими доменами.
5. Разработан новый подход к регистрации структурных перестроек, роисходящих в миозиновой головке при взаимодействии с Е-актином. В снове этого подхода лежит значительное увеличение термостабильности золированной головки миозина в результате ее взаимодействия с Е-ктином, отчетливо регистрируемое методом ДСК.
6. При исследованиях фрагментов головки миозина из 01сЬуоз^Иит Чясо1с1еит с изменениями заряда в области актин-связывающего участка оказано, что такие изменения оказывают существенное влияние на пособность головки подвергаться глобальной структурной перестройке ри взаимодействии с Е-актином.
7. Показано, что модификация ЭШ-грулпы остатка Суэ-697 в Б1 не казывает существенного влияния на вызываемые Е-актином изменения арактера тепловой денатурации Э1, тогда как модификация ЭШ-группы статка Суэ-707 существенно усиливает такие изменения. Высказано редположение о том, что наблюдаемые методом ДСК глобальные груктурные перестройки головки миозина при связывании Е-актина ключают взаимодействие между участками головки, расположенными в ространстве далеко друг от друга.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Ponomarev М. A., Timofeev V. P., Levitsky D. I. (1995) The difference between ADP-beryllium fluoride and ADP-aluminium fluoride complexes of the spin-labeled myosin subfragment 1. FFBS Letters, 371, 261-263.
2. Levitsky D. I., Ponomarev M. A., Geeves M. A., Nikolaeva O. P., Manstein D. J. (1997) Calorimetric characterization of the motor domain of Dictyostelium discoideum myosin. J. Muscle Re,s. and Cell Motil, 18, 258.
3. Левицкий Д. И., Николаева О. П., Орлов В. Н., Пономарев М. А., Павлов Д. А. Калориметрический подход к изучению двигательных белков. Тезисы симпозиальных докладов Второго Съезда Биохимического общества РАН (Москва, 19-23 мая 1997), С. 61-62.
4. Bobkov A. A., Ponomarev М. A., Bobkova Е. A., Zhurinsky Y. А., Levitsky D. I. and Reisler Е. (1997) The effects of SHI and SH2 modifications on myosin: similarities and differences. Abstracts of Int. simp, myosin family reunion:bioiogy to pathology, NIH, Bethesda, MD, USA, F-18.
5. Levitsky D. I., Ponomarev M. A., Geeves M. A., Shnyrov V. L. and Manstein D. J. (1998) Differential scanning calorimetric study of the thermal unfolding of the motor domain fragments of the Dictyostelium discoideum myosin II. Eur. J. Biochem., 251, 275-280.
6. Левицкий Д, И., Николаева О. П., Орлов В. Н., Павлов Д. А., Пономарев М. А., Росткова Е. В. (1998) Дифференциальная сканирующая калориметрия миозина и актина. Биохимия. 63, С. 381394.
7. Ponomarev М. A., Khvorov N. V., Shnyrov V. L., Levitsky D. I. ADP-induced changes in domain structure of myosin subfragment 1. A differential scanning calorimetric study. Abstracts of the Int. Symp. "Protein structure, stability, and folding. Fundamental and medica. aspects." (Moscow, Russia, June 22-26, 1998), p. 142.
8. Ponomarev M. A., Nikolaeva O. P., Levitsky D. I. The use of the differential scanning calorimetry to studies of strong-binding state oi the myosin head complex with F-actin. Abstracts of the Int. Symp. "Biological motility: modern methods for studying." (Pushchino, Russis August 30 - September 5, 1998), p. 122-123.
9. Levitsky D. I., Nikolaeva O. P., Orlov V. N., Pavlov D. A., Ponomarev M A., Rostkova E. V. The use of the differential scanning calorimetry tc studies on myosin and actin. Abstracts of the Int. Symp.: "Biologica
motility: modern methods for studying." {Pnshchmo, Russia August 30 - September 5, 1998), p. 83-85.
I. Ponomarev M., Furch M., Knetsch M., Manshtein D. and Levitsky D. (1999) Changes in Loop 2 affect the thermal unfolding of myosin head fragments while complexed to F-actin. J. Muscle Res. Cell Motil., 20, 72.
Dmitrii Levitsky D., Pavlov D., Ponomarev M. (1999) Differential scanning calorimetric studies show a significant difference of the myosin-ADP-bery Ilium fluoride complex from other stable ternary complexes of the myosin head with ADP and phosphate analogues. J. Muscle Res. Cell Motil., 20, 80-81.
Levitsky D. I., Nikolaeva O. P., Ponomarev M. A., Orlov V. N., Rostkova E. V. (1999) Thermal unfolding of myosin head fragments and tropomyosin bound to F-actin. Biophys. J., 76, A166.
Пономарев M. А., Николаева О. П., Орлов В. Н., Островская М. В., Левицкий Д. И. Изучение тепловой денатурации комплексов миозиновой головки с F-актином методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Тезисы докладов Второго Съезда Биофизиков Россия. (Москва, 23-27 Августа, 1999), С. 357-358.
Levitsky D., Nikolaeva О., Kaspieva О., Orlov V. and Ponomarev M. Actin-induced structural changes in the myosin head studied by differential scanning calorimetry. Abstracts of 28th European Muscle Congress (York, UK, 4-7 September 1999), p. 43.
Levitsky D., Nikolaeva O., Orlov V. and Ponomarev M. The use of the differential scanning calorimetry to studies on the interaction between myosin and actin. Abstracts of Italian-Bussian calorimetry workshop: New Trends in Calorimetry and its Application. (II Ciocco (Barga), Italy, October 31 - November 3, 1999), IV-41.
. Ponomarev M. A, Furch M., Levitsky D. I. and Manstein D. J. (2000) Charge changes in loop 2 affect the thermal unfolding of the myosin motor domain bound to F-actin. Biochemistry 39, 4527-4532.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пономарев, Михаил Александрович
Список сокращений
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Структура и основные свойства миозина
1.1.1. Разнообразие миозинов и их общие черты
1.1.2. Фрагменты, получаемые при расщеплении миозина II протеолитическими ферментами
1.1.3. АТРазная активность миозина
1.2. Структура миозиновой головки
1.2.1. Первичная структура тяжелой цепи S1 из скелетных мышц
1.2.2. Третичная структура тяжелой цепи S1 из скелетных мышц
1.3. Цикл работы миозиновой головки. Гипотеза "Lever arm"
1.4. Структурные перестройки, происходящие в миозиновой головке в ходе АТРазной реакции
1.5. Взаимодействие миозина с актином
1.5.1. Структура и основные свойства актина
1.5.2. Кинетическая схема взаимодействия миозина и актина
1.5.3. Свойства поверхности взаимодействия миозиновой головки с актином
1.6. Применение метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) для изучения структурных перестроек миозиновой головки
1.6.1. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия как метод изучения структуры белков
1.6.2. Принципы регистрации данных и устройство прибора
1.6.3. Информация, получаемая из калориметрического эксперимента
1.6.4. Применение метода ДСК для изучения структуры S
1.6.5. Применение метода ДСК для изучения структурных перестроек, происходящих в S1 при взаимодействии с нуклеотидами
1.6.6. Применение метода ДСК для исследования изменений тепловой денатурации S1, вызываемых взаимодействием с актином
1.6.6.1. Тепловая денатурация актина
1.6.6.2. Тепловая денатурация комплексов миозиновой головки с актином 63 Экспериментальная часть
2. Материалы и методы
2.1. Выделение миозина из быстрых скелетных мышц кролика
2.2. Получение субфрагмента 1 миозина
2.3. Выделение актина из ацетонового порошка
2.4. Полимеризация актина и стабилизация Е-актина фаллоидином или фторидом бериллия
2.5. Определение АТРазной активности миозина и
2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле с ЗББ-Ыа
2.7. Определение концентрации белков методом Бредфорд
2.8. Модификация остатка Суз-707 в Б
2.9. Модификация остатка Суэ-697 в Б
2.10. Формирование стабильных тройных комплексов и рекомбинантных форм миозиновой головки из В^уозЬеИит сИ8со(йеит с АБР и аналогами Р1 (Уь ВеГх, А^-, 8сЕх)
2.11. Формирование комплексов Б1 и рекомбинантных форм миозиновой головки из ВШуозЬеИит сИ8со1(1еит с Р-актином в состоянии сильного связывания
2.12. Исследования методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДСК)
2.13. Исследования методом спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) 76 3. Результаты и их обсуждение
3.1. Химические модификации БН-групп остатков Суз-697 и Суз-707 в молекуле Б
3.1.1. Специфические модификации 8Н1- и БШ-групп в 81. Исследования методом ДСК
3.1.2. Специфические модификации БШ-группы Б1 спиновыми метками. Исследования методом ЭПР
3.2. Калориметрические исследования фрагментов миозиновой головки из Вж1уо81еИит сИвсогйеит
3.2.1. Калориметрические исследования фрагментов М754, М765, М765-1Л, М765-2К и М864 в отсутствие нуклеотидов
3.2.2. Тепловая денатурация фрагментов миозиновой головки из Dгcíг/osíeZггí.m сИ8со{с1еит в комплексах с АБР и аналогами фосфата
3.2.3. Влияние связывания АБР на тепловую денатурацию фрагмента М765 из Огс£г/05£еКштг сИзсо{с1еит и скелетномышечного
3.3. Исследования методом ДСК доменной организации S1 в отсутствие и в присутствии ADP
3.4. Исследования методом ДСК комплексов миозиновой головки с F-актином
3.4.1. Взаимодействие с F-актином фрагмента М765 с изменениями в актин-связывающей петле
3.4.2. Влияние условий среды на взаимодействие S1 и М765 с F-актином
3.4.3. Взаимодействие S1 с G-актином
3.4.4. Взаимодействие с F-актином препаратов S1, специфически модифицированных по существенным SH-группам 132 Заключение 135 Выводы 136 Список литературы 138 Благодарности
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ATP - аденозинтрифосфат ADP - аденозиндифосфат Pi - неорганический фосфат PPi - пирофосфат Vi - ортованадат
AMPPNP - аденозинимидотрифосфат ATPyS - аденозинтиотрифосфат EDTA - этилендиаминтетраацетат ПААГ -полиакриламидный гель SDS-Na - додецилсульфат натрия DTT - дитиотреитол TLCK - тозиллизинхлорметилкетон PMSF -фенилметилсульфонил фторид
IASL - 4-Ы-йодоацетамидо-2,2,6,6-тетраметилпиперединоксил
MSL - 4-К-малеимидо-2,2,6,6-тетраметилпиперединоксил
IANBD - 4-[Ы-[(йодацетокси)этил]-Ы-метиламино]-7-нитрбензо-2-оксо-1,3диазол
ЛЦ - легкие цепи миозина
ELC - существенная легкая цепь миозина
RLC - регуляторная легкая цепь миозина
LMM - легкий меромиозин
НММ - тяжелый меромиозин
S2 - субфрагмент 2 миозина
S1 - субфрагмент 1 миозина
MD - моторный домен миозиновой головки
MDE - моторный домен миозиновой головки с частью регуляторного домена и существенными легкими цепями
МН - головка миозина
MHF - фрагмент головки миозина
SIDc - фрагмент головки миозина из Dictyostellium discoideum
Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурные перестройки, происходящие в миозиновой головке при взаимодействии с нуклеотидами и F-актином"
В основе любых проявлений биологической подвижности у эукариот лежат циклические межбелковые взаимодействия. Такие взаимодействия осуществляются между двумя принципиально разными типами белков. Так называемые "молекулярные моторы" обеспечивают собственно функцию пространственного перемещения и цикличность их работы обусловлена реакцией гидролиза АТР. Направление перемещения определяется другим типом белков, формирующих в некотором роде "рельсы" для "молекулярных моторов". Основным свойством таких белков является способность к полимеризации с образованием филаментов разной длины, причем свойства поверхности филаментов различны, если рассматривать их вдоль с одного конца или с другого. По таким филаментам однонаправленно перемещаются "молекулярные моторы".
Одной из основных задач изучения процессов биологической подвижности является выяснение молекулярных механизмов взаимодействия белков вышеназванных типов. К типу "молекулярных моторов" относятся три класса белков: миозины, динеины и кинезины. Большинство представителей этих классов имеют сложную мультисубъединичную организацию, однако собственно моторную функцию всегда выполняют глобулярные части тяжелых субъединиц, называемые головками. Ко второму типу белков, формирующих "рельсы", относятся актины и тубулины. При этом функциональные системы биологической подвижности сформированы либо миозинами и актинами, либо динеинами, кинезинами и тубулинами. Наиболее распространенными объектами являются миозины и актины, присутствующие во всех эукариотических клетках, а также обеспечивающие все известные типы мышечного сокращения. Наиболее интенсивному исследованию подвергаются мышечные актомиозиновые системы, преимуществом которых является доступность в больших количествах. В связи с этим, наибольшее количество информации накоплено именно об их структуре и функциях. Что же касается тубулинов, формирующих микротрубочки, и взаимодействующих с ними динеинов и кинезинов (эти системы обеспечивают в основном процессы внутриклеточного транспорта), то изучение этих объектов развивается по аналогии с методами и способами, разработанными при исследованиях актомиозиновой системы. Принимая во 7 внимание вышесказанное, объектом для данной диссертационной работы была выбрана именно актомиозиновая система биологической подвижности.
Один из наиболее важных вопросов сводится к следующему - как происходит трансформация химической энергии гидролиза АТР в механическую энергию движения? Для ответа на него в первую очередь необходимо выяснить на уровне изменения химических связей - что происходит с белками, осуществляющими этот процесс. Какими путями исходно локальные изменения структуры миозиновой головки в области активного центра, сопутствующие гидролизу АТР, распространяются на всю молекулу, достигая актин-связывающих центров и, в конечном итоге, обеспечивая глобальные изменения конформации миозиновой головки, необходимые для процесса пространственного перемещения. Не менее важна и другая задача - выяснить, каким образом взаимодействия миозиновой головки с актином (по сравнению с размерами самого "мотора" эти взаимодействия тоже можно назвать локальными) модулируют АТР-зависимые структурные перестройки головки.
К девяностым годам в мировой науке был накоплен огромный материал, позволивший на основании косвенных данных предложить несколько гипотез пространственной организации миозиновой головки [Vibert & Cohen, 1988; Botts et al., 1989; Winkelmann et al., 1991; Левицкий, 1991; Levitsky, 1994]. В 1993 году была представлена ее третичная структура, определенная методом рентгеноструктурного анализа [Rayment et al., 1993а]. Это событие позволило перейти от предположительных рассуждений о структуре миозиновой головки и ее комплексов с актином к более конкретным данным, оперирующим с параметрами отдельных ковалентных связей в полипептидной цепи. Однако результаты, получаемые методом рентгенографии, остаются спорными при использовании их для описания систем, работающих в физиологических условиях. Таким образом, молекулярная механика работы актомиозиновой системы остается еще до конца не ясной. Настоящая диссертационная работа посвящена дальнейшему выяснению молекулярных механизмов, обеспечивающих процессы биологической подвижности в актомиозиновых системах, и разработке новых подходов к решению возникающих при этом задач. 8
1. Обзор литературы
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Пономарев, Михаил Александрович
Выводы
1. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) исследовано влияние модификации остатков Cys-707 и Cys-697 в изолированной миозиновой головке (субфрагмент 1 миозина, S1) на структурные перестройки S1, вызываемые образованием стабильных тройных комплексов с ADP и аналогами неорганического фосфата -ортованадатом (Vj) и фторидами бериллия (BeFx) или алюминия (A1F4). Показано, что специфическая модификация этих остатков препятствует структурным перестройкам, происходящим в молекуле S1 при образовании комплексов Sl-ADP-Vi и S1-ADP-A1F4, но почти не влияет на перестройки, вызываемые образованием комплекса Sl-ADP-BeFx.
2. При комплексном использовании методов ДСК и ЭПР получены прямые подтверждения высказывавшихся в литературе предположений о том, что комплекс Sl-ADP-BeFx отличается от всех других тройных комплексов: он моделирует промежуточное состояние М*-АТР АТРазной реакции миозина, тогда как комплексы Sl-ADP-Vi и S1-ADP-A1F4 имитируют состояние M**-ADP-Pi
3. Методом ДСК исследованы экспрессируемые в Dictyostelium discoideum фрагменты миозиновой головки, соответствующие глобулярной моторной части головки, и показано, что эти фрагменты сохраняют способность к структурным перестройкам при образовании тройных комплексов с ADP и аналогами фосфата. Сделан вывод, что такие перестройки происходят в глобулярной моторной части головки.
4. Методом ДСК с использованием процедуры "последовательного отжига" исследовано влияние ADP на доменную структуру S1. Показано, что связывание ADP вызывает структурные изменения лишь в моторном (но не в регуляторном) домене миозиновой головки и не влияет на взаимодействие между этими доменами.
5. Разработан новый подход к регистрации структурных перестроек, происходящих в миозиновой головке при взаимодействии с F-актином. В основе этого подхода лежит значительное увеличение термостабильности
137 изолированной головки миозина в результате ее взаимодействия с F-актином, отчетливо регистрируемое методом ДСК.
6. При исследованиях фрагментов головки миозина из Dictyostelium discoideum с изменениями заряда в области актин-связывающего участка показано, что такие изменения оказывают существенное влияние на способность головки подвергаться глобальной структурной перестройке при взаимодействии с F-актином.
7. Показано, что модификация SH2-rpynnbi остатка Cys-697 в S1 не оказывает существенного влияния на вызываемые F-актином изменения характера тепловой денатурации S1, тогда как модификация SH1-группы остатка Cys-707 существенно усиливает такие изменения. Высказано предположение о том, что наблюдаемые методом ДСК глобальные структурные перестройки головки миозина при связывании F-актина включают взаимодействие между участками головки, расположенными в пространстве далеко друг от друга.
Заключение
Приведенные данные наглядно демонстрируют, на наш взгляд, те новые возможности, которые предоставляет использование метода ДСК для структурно-функциональных исследований головки миозина и для выяснения особенностей ее работы в качестве "молекулярного мотора". Применение этого метода позволяет не только проводить подробные исследования доменной организации миозиновой головки, но и выявлять (а впоследствии более детально изучать) глобальные структурные перестройки, происходящие в головке миозина в процессе ее функционирования, т. е. в ходе АТРазной реакции и при взаимодействии с актином. Таким образом, применение метода ДСК в сочетании с другими методами предоставляет новые (и зачастую уникальные) возможности для разработки новых подходов к изучению молекулярного механизма процессов биологической подвижности, основанных на взаимодействии миозина с актином.
136
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пономарев, Михаил Александрович, Москва
1. Левицкий Д. И., Хайтлина С. Ю., Гусев Н. Б. Белки актомиозиновой системы подвижности. (1995) В кн.: "Белки и пептиды" (ред. Иванов В. Т., Липкин В. М.) М.: Наука, том 1, Глава "Двигательные белки", с. 249-293.
2. Любарев А. Е., Курганов Б. И. Моделирование процесса необратимой тепловой денатурации белка при переменной температуре. I. Модель,включающая две последовательно протекающие необратимые стадии. (1998) Биохимия, 63, 516-523.
3. Поглазов Б. Ф., Билуши В., Баев А. А. О сульфгидрильных группах миозиновой аденозинтрифосфатазы. (1958) Биохимия, 23, 269-284. Поглазов Б. Ф., Левицкий Д. И. Миозин и биологическая подвижность. (1982) Изд-во "Наука", М., 160 С.
4. Хворов Н. В., Левицкий Д. И., Букатина А. Е., Шныров В. Л., Поглазов Б.Ф. Калориметрические доказательства двух конформационных состояний комплекса субфрагмента-1 миозина с нуклеотидами. (1990) Доклады АН СССР, 315, 745-748.
5. Шныров В. Л., Левицкий Д. И., Веденкина Н. С., Николаева О. П., Хворов Н. В., Пермяков Е. А., Поглазов Б. Ф. Доменная структура субфрагмента 1 миозина. (1989) Доклады АН СССР, 304, 1497-1499.
6. Ajtai K. and Burghardt T. P. Fluorescent modification and orientation of myosin sulfhydryl 2 in skeletal muscle fibers. (1989) Biochemistry, 28, 2204-2210.
7. Ajtai K., Poto L., Burghardt T. P. Specificity and orientation of (iodoacetamido)proxyl spin-labeled myosin subfragment 1 decorating muscle fibers: localization of protein-bound spin labels using SDS-PAGE. (1990) Biochemistry, 29, 7733-7741.
8. Barnett V. A., Thomas D. D. Resolution of conformational states of spinlabeled myosin during steady-state ATP hydrolysis. (1987) Biochemistry, 26, 314-323.
9. Bertazzon A. and Tsong T. Y. High-resolution differential scanning calorimetric study of myosin, functional domains, and supramolecular structures (1989) Biochemistry, 28, 9784-9790.
10. Bertazzon A. Tian G. H., Lamblin A., Tsong T. Y. Enthalpic and entropic contributions to actin stability: calorimetry, circular dichroism, and fluorescence study and effects of calcium. (1990) Biochemistry, 29, 291298.
11. Bobkova, E. A., Bobkov, A. A., Levitsky, D. I., Reisler, E. Effects of SHI and SH2 modifications on myosin: similarities and differences. (1999) Biophys. J., 76, 1001-1007.
12. Botts J. , Thomason J. F. and Morales M. F. On the origin and transmission of force in actomyosin subfragment 1. (1989) PNAS USA, 86, 2204-2208.
13. Bradford M. M. A rapid and sencitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. (1976) Anal. Biochem., 72, 248-254.
14. Brandts J. F. and Lin L.-N. Study of strong to ultralight protein interactions using differential scanning calorimetry. (1990) Biochemistry, 29, 6927-6940.
15. Brouillette C. G., Muccio D. D. and Finney T. K. (1987) Biochemistry, 26, 74431-7438.
16. Burke M., Rajasekharan K. N., Maruta S. and Ikebe M. A second consensus sequence of ATP-requiring proteins resides in the 21-kDa C-terminal segment of myosin subfragment-1. (1990) FEBS Lett., 262, 185188.
17. Cope M., Whisstock J., Rayment I. and Kendrick-Jones J. Conservation within the myosin motor domain: implications for structure and function. (1996) Structure, 4, 969-987.
18. Cremo C. R., Grammer J. C. and Yount R. G. Direct chemical evidence that serine 180 in the glycine-rich loop of myosin binds to ATP. (1989) J. Biol. Chem., 264, 6608-6611.
19. DasGupta G. and Reisler E. Antibody aganist the amino terminus of alpha-actin inhibits actomyosin interactions in the presence of ATP. (1989) J. Mol. Biol, 207, 833-836.
20. Dominguez R., Freyzon Y., Trybus K. M. and Cohen C. Crystal structure of a vertebrate smooth muscle myosin motor domain and its complex with the essential light chain: visualization of the pre-power stroke state. (1998) Cell, 94, 559-571.
21. Engelgardt V. A. and Ljubimova M. N. Myosin andadenosinetriphosphatase (1939) Nature, 144, 668-669.
22. Finkelstein A. A. Can protein unfolding simulate protein folding? (1997) Protein Engineering, 10, 843-845.
23. Fisher A. J., Smith C. A., Thoden J. B., Smith R., Sutoh K., Holden H. M. and Rayment I. X-ray structure of the myosin motor domain of Dictyostellium discoideum complexed with MgADPBeFx and MgADP AIF4-. (1995a) Biochemistry, 34, 8960-8972.
24. Fisher A. J., Smith C. A., Thoden J. B., Smith R., Sutoh K., Holden H. M. and Rayment I. Structural studies of myosin;nucleotide complexes: A revised model for the molecular basis of muscle contraction. (1995b) Biophys. J., 68, 19s-28s.
25. Geeves M. A., and Conibear P. B. Th role of the three-state docking of myosin SI with actin in force generation. (1995) Biophys. J., 68, 194s-199s.
26. Goodno C. C. Inhibition of myosin ATPase by vanadate ion. (1979) PNAS USA, 76, 2620-2624.
27. Gopal D. and Burke M. Formation of stable inhibitory comlexes of myosin subfragment-1 using fluoroscandium anions. (1995) J. Biol. Chem., 270, 19282-19286.
28. Gulick A. M., Bauer C. B., Thoden J. B. and Raiment I. X-ray structures of the MgADP, MgADPyS, and MgAMPPNP complexes of the Dictyostellium discoideum myosin motor domain. (1997) Biochemistry, 36, 11619-11628.
29. Holmes K. C. Muscle proteins their actions and interactions. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol, 6, 781-789.
30. Holmes K. C. The swinging lever-arm hypothesis of muscle contraction. (1997) Curr. Biol, 7, R112-R118.
31. Holmes K. C. Muscle contraction. In the limits of reductionism in biology. (1998) Novartis Foundation Symposium 213 (Chichester: Wiley), 76-92.
32. Houdusse A., Kalabokis V. N., Himmel D., Szent-Gyorgyi A. G. and Cohen C. Atomic structure of scallop myosin subfragment SI complexed with MgADP: a novel conformation of the myosin head. (1999) Cell, 97, 459-470.
33. Hozumi T. and Muhlard A. Reactive lysyl of myosin subfragment-1: location on the 27K fragment and labeling properties. (1981) Biochemistry, 20, 2945-2950.
34. Huston E., E., Grammer J., C. and Yount R. G. Flexibility of the myosin heavy chain: direct evidence that the region containing SHX and SH2 can move 10 A under influence of nukleotide binding. (1988) Biochemistry, 27, 8945-8952.
35. Jonson K. A. and Taylor E. W. Intermediate states of subfragment-1 ATPase: réévaluation of the mechanism. (1978) Biochemistry, 17, 34323442.
36. Kurganov B. I., Lyubarev A. E., Sanchez-Ruiz J. M., Shnyrov V. L. Analysis of differential scanning calorimetry data for proteins. Criteriaof validity of one-step mechanism of irreversible protein denaturation. (1997) Biophys. Chem., 69, 125-135.
37. Manstein D. J., Ruppel K. M. and Spudich J. A. Expression and characterization of a functional myosin head fragment in Dictyostelium discoideum. (1989) Science, 246, 656-658.
38. Mendelson R. and Morris E. P. The structure of the acto-myosin subfragment 1 complex: results of searches using data from electron microscopy and x-ray cristallography. (1997) PNAS USA, 94, 8533-8538.
39. Milligan R., Whittaker M., Safer D. Molecular structure of F-actin and locations of surface binding sites. (1990) Nature, 348, 217-221.
40. Milligan R. A. Protein-protein interactions in the rigor actomyosin complex. (1996) PNAS USA, 93, 21-26.
41. Mornet D., Pantel P., Audemard E., Derancourt J. and Kassab R. Molecular movements promoted by metal nucleotides in the heavy-chain regions of myosin heads from sceletal muscle. (1985) J. Molec. Biol., 183, 479-489.
42. Mornet D., Bertrand R., Pantel P., Audemard E. and Kassab R. Structure of the actin-myosin interface. (1981) Nature, 292, 301-306.
43. Muhlard A. and Takashi R. Ionization of reactive lysyl residue of myosin subfragment-1. (1981) Biochemistry, 20, 6749-6754.
44. Murphy C. T. and Spudich J. A. The sequence of the myosin 50-20 K loop affects myosin's affinity for actin throughout the actin-myosin ATPase cycle and its maximum ATPase activity. (1999) Biochemistry, 38, 3785-3792.
45. Nikolaeva O. P., Bobkov A. A., Orlov V. N., Levitsky D.I. Thermal stability of myosin subfragment 1 dramatically decreases upon tryptic cleavage in the N-terminal region of myosin heavy chain. (1997) J. Muscle Res. and Cell Motility., 18, 258.
46. Nikolaeva O. P., Dedova I. V., Khvorova I. S., Levitsky D. I. Interaction of F-actin with phosphate analogues studied by differential scanning calorimetry. (1994) FEBS Lett., 351, 15-18.
47. Nikolaeva N. O., Orlov V. N., Dedova I. V., Drachev V. A. and Levitsky D. I. Interaction of myosin subfragment 1 with F-actin studied by differential scanning calorimetry. (1996) Biochem. Mol. Biol. Int., 40, 653661.
48. Okamoto Y. and Yount R. G. Identification of an active site peptide of skeletal myosin after photoaffinity labeling with N-(4-azido-2-nitrophenyl)-2-aminoethyl diphosphate. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, 1575-1579.
49. Panusz T. H., Graczyk G., Wilmanska D. and Skarzinsky J. Analysis of ortophosphate-pyrophosphate mixtures resulting from weak pyrophosphatase activity (1970) Anal. Biochem., 35, 494-504.
50. Patterson B., Ruppel K. M., Wu Y. and Spudich J. A. Cold-sensitive mutants G680V and G691C of Dictyostelium myosin II conferdramatically different biochemicle defects. (1997) J. Biol. Chem., 272, 27612-27617.
51. Phan B., Faller L. D. and Reisler E. Kinetics and equilibrium analysis of the interactions of actomyosin subfragment-1 ADP with berillium fluoride. (1993) Biochemistry, 32, 7712-7719.
52. Phan B. and Reisler E. Inhibition of myosin ATPase by berillium fluoride. (1992) Biochemistry, 31, 4787-4793.
53. Privalov P. L. Stability of proteins. Proteins which do not present a single cooperative system. (1982) Adv. Protein Chem., 35, 1-104.
54. Privalov P. L. and Potekhin S. A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. (1986) Methods Enzymol, 131, 4-51.
55. Rayment I., Holden H. M., Wittaker M., Yohn C. B., Lorenz M., Holmes K. C., Milligan R. A. Structure of the actin-myosin complex and its implication for muscle contrction. (1993b) Science, 261, 58-65.
56. Rayment I. and Holden H. The three-dimentional structure of a molecular motor. (1994) TIBS, 19, 129-134.
57. Rayment I., Ripniewsky W. R., Schmidt-Base K., Smith R., Tomchick D. R., Benning M., M., Winkelmann D. A., Wesenberg G. and Holmes H. M. Three-dimentional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. (1993a) Science, 261, 50-58.
58. Reedy M. K., Myosin-actin motors: the partnership goes atomic. (1993) Structure, 1, 1-5.
59. Reisler E., Sulfhydryl modification and labeling of myosin (1982) Methods Enzymol, 85, 84-93.
60. Reisler E., Burke M., Himmelfarb S. and Harrington W. F. Spatial proximity of the two essential sulfhydryl groups of myosin. (1974) Biochemistry, 13, 3837-3840.
61. Ritchie M. D. Geeves M. A., Woodward S. K. A. and Manstein D. J. Kinetic characterization of a cytoplasmic myosin motor domain expressed in Dictyostelium discoideum. (1993) PNAS USA, 90, 8619-8623.148
62. Roopnarine O. and Thomas D. D. Orientation of intermediate nucleotide states of indan dione spin-labeled myosin heads in muscle fibers. (1996) Biophys. J., 70, 2795-2806.
63. Root D. and Reisler E. Cooperativity of thiol-modified myosin filaments. ATPase and motolity assays of myosin function. (1992) Biophys. J., 63, 730-740.
64. Ruiz-Arribas A., Santamaria R. I., Zhadan G. G., Villar E. and Shnyrov V. L. Differential scanning calorimetric study of the thermal stability of xylanase from Streptomyces halstedii JM8. (1994) Biochemistry, 33, 13787-13791.
65. Sanchez-Ruiz J. M., Lopez-Lacomba J. L., Cortijo M. and Mateo P. L. Differential scanning calorimetry of the irreversible thermal denaturation of thermolysin. (1988) Biochemistry, 27, 1648-1652.
66. Sanchez-Ruiz J. M. Differential scanning calorimetry of proteins. (1992a) Subcell. Biochem., 24, 133-176.
67. Sanchez-Ruiz J. M. Theoretical analysis of Lumry-Eyring models in differential scanning calorimetry. (1992b) Biophys. J., 61, 921-935.
68. Saraste M., Sibbald P. and Wittinghofer A. The P-loop a common motif in ATP and GTP-binding proteins. (1990) TIBS, 15, 430-434.
69. Sellers J., K., Goodson H., V. and Wang F. A miosyn family reunion. (1996) J. Muscle Res. Cell Motil., 17, 7-22.
70. Shnyrov V. L. and Mateo P. L. Thermal transitions in purple membrane from Halobacterium halobium. (1993) FEBS Lett., 324, 237-240.
71. Shnyrov V. L., Sanchez-Ruiz J. M., Boiko B. N., Zhadan G. G., Permyakov E. A. Application of scanning microcalorimetry in biophysics and biochemistry. (1997a) Thermochimica Acta 302, 165-180.
72. Sriver J. W. and Kamath U. Differential scanning calorimetry of the unfolding of myosin subfragment 1, subfragment 2, and heavy meromyosin. (1990) Biochemistry, 29, 2556-2564.
73. Smyth C. A. and Rayment I. X-ray structure of the Magnesium(II)-pyrophosphate complex of the truncated head of Dictyostelliumdiscoideum myosin to 2.7 A resolution. (1995) Biochemistry, 34, 89738981.
74. Smyth C. A. and Rayment I. X-ray structure of the Magnesium(II)'ADP Vanadate complex of the Dictyostellium discoideum myosin motr domain to 1.9 A Resolution. (1996) Biochemistry, 35, 54045417.
75. Spudich J. A. How molecular motors work. (1994) Nature, 372, 515-518.
76. Spudich J. A. and Watt S The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. (1971) J. Biol. Chem., 246, 4866-4871.
77. Sugimoto Y., Tokunaga M., Takezawa Y., Ikebe M. and Wakabayashi K. Conformational changes of the myosin heads during hydrolysis of ATP as analyzed by x-ray solution scattering. (1995) Biophys. J., 68, 29s-34s.
78. Sutoh K. Identification of the myosin-binding sites on the actin sequens1982) Biochemistry, 21, 3654-3661.
79. Sutoh K. A short hydrophobic segment next to tryptophan-130 in myosin heavy chain is close to the ribose ring of ADP bound in the adenosinetriphosphatase site. (1987) Biochemistry, 26, 7648-7654.
80. Suzuki Y., Yasunaga T., Ohkura R., Wakabayashi T. and Sutoh K. Swing of the lever arm of a myosin motor of the at the isomerization and phosphate-release steps. (1998) Nature, 396, 380-383.
81. Tong S. W. and Elzinga M. The sequence of the NH2-terminal 204-residue fragment of the heavy chain of rabbit skeletal muscle myosin.1983) J. Biol. Chem., 258, 13100-13110.
82. Tong S. W. and Elzinga M. Amino acid sequence of rabbit skeletal muscle myosin. 50 kDa fragment of the heavy chain. (1990) J. Biol. Chem., 265, 4893-4901.
83. Trayer I. P., Trayer H. R., Levin B. A. Evidence that the N-terminal region of A1-light chain of myosin interacts directly with C-terminal region of actin. (1987) Eur. J. Biochem., 164, 259-266.
84. Uyeda T., Abramson P. and Spudich J., A. The neck region of the myosin motor acts as a lever arm to generate movement. (1996) PNAS USA, 93, 4459-4464.
85. Uyeda T. Q. P., Ruppel K. M. and Spudich J. A. Enzymatic activities correlate with chimaerie substitutions at the actin-binding face of myosin. (1994) Nature, 368, 567-569.150
86. Vibert P. and Cohen C. Domains, motions and regulation in the myosin head. (1988) J. Muscle Res. Cell Motil, 9, 296-305
87. Weeds A. G. and Pope B. Studies on the chymotriptic digestion of myosin. Effect of divalent cations on the proteolytic susceptibility. (1977) J. Mol. Biol, 111, 129-157.
88. Weeds A. G. and Taylor R. S. Separation of subfragment-1 isoenzymes from rabbit skeletal muscle myosin. (1975) Nature, 257, 54-56.
89. Wells C., Bagshaw C. R. The characterization of vanadate-trapped nucleotide complexes with spin-labeled myosin. (1984) J. Muscle Res. and Cell Motil, 5, 97-112.
90. Wells J. A. and Yount R. G. Reaction of a 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) with myosin subfragment one: evidence for formation of a single protein disulfide with trapping of metal nucleotide at the active site. (1980) Biochemistry, 19, 1711-1717.
91. Werber M. M., Peyser M., Muhlard A. Characterization of stable beryllium fluorid, aluminium fluoride, and vanadate containing myosin subfragment 1 nucleotide complexes. (1992) Biochemistry, 31, 71907197.
92. Werber M. M., Szent-Gyorgy A. G. and Fasman G. Fluorescence studies on heavy meromyosin-substrate interactions. (1972) Biochemistry, 11, 2872-2883.
93. Whittaker M., Wilson-Kubalek E. M., Smith J. E., Faust L., Milligan R. A. and Sweeney H. L. A 35-A movement of smooth muscle myosin on ADP release. (1995) Nature, 378, 748-751.
94. Winkelmann D. A., Baker T. S. and Rayment I. Three-dimentional structure of myosin subfragment-1 from electron microscopy of sectioned crystals. (1991) J. Cell Biol, 114, 487-501.
95. Xie X., Harrison D. H., Schlichting I., Sweet R. M., Kalabokis V. N., Szent-Gyorgi A. G. and Cohen C. Structure of regulatore domain of scallop myosin at 2.8A resolution. (1994) Nature, 368, 306-312.
96. Yamamoto K. Shift of binding site at the interface between actin and myosin. (1990) Biochemistry, 29, 844-848.
97. Yamamoto K. and Sekine T. Interaction of alkali light chain 1 with actin: effect of ionic strength on the cross-linking of alkali chain 1 with actin. (1983) J. Biochem. (Tokyo), 94, 2075-2078.1521. Благодарности
98. Я глубоко признателен своему научному руководителю доктору биологических наук Дмитрию Ивановичу Левицкому за постоянную поддержку на протяжении всего времени моей работы и черезвычайно неоценимое внимание.
99. Я благодарен моим родным и близким за постоянную моральную и техническую поддержку, и особенно жене и дочери, без которых вряд ли когда-нибудь появился бы (и т. д.) настоящий текст.
-
Пономарев, Михаил Александрович
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2000
-
ВАК 03.00.04
- Структура головки миозина и функции его легких цепей
- Рентгеноструктурное исследование молекулярной механики мышечного сокращения
- Исследование конформационных изменений Ф-актина при его взаимодействии с головкой миозиновой молекулы методом поляризационной микрофлуориметрии
- Изучение тройных комплексов миозиновой головки с ADP и аналогами неорганического фосфата методом дифференциальной сканирующей калориметрии
- Тепловая денатурация актиновых филаментов и влияние на нее актин-связывающего белка кофилина
