Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение тройных комплексов миозиновой головки с ADP и аналогами неорганического фосфата методом дифференциальной сканирующей калориметрии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение тройных комплексов миозиновой головки с ADP и аналогами неорганического фосфата методом дифференциальной сканирующей калориметрии"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

л ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н.БАХА

Г? ' / - - -!

На правах рукописи УДК 577.152.2

ПАВЛОВ Дмитрий Анатольевич

Изучение тройных комплексов мнозиновой головки с АОР и аналогами неорганического фосфата методом дифференциальной сканирующей калориметрии

03.00.04 — биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998

Работа выполнена в Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН и в Институте физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ

Научный руководитель:

доктор биологических наук Д. И. Левицкий

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н. Б. Гусев доктор химических наук, профессор Б. И. Курганов

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им В. А. Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится 1998 г. в. /О ч

на заседании диссертационного совета (К.002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (Москва, Ленинский пр., 33, корп. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский пр., 33, корп. 1)

Автореферат разослан 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук М. И. Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В основе молекулярного механизма мышечного сокращения и множества других явлений клеточной подвижности лежит взаимодействие головок миозина с актином, сопровождаемое гидролизом АТР. Молекула мышечного миозина представляет собой гексамер, состоящий из 6 субъединиц: двух тяжелых и четырех легких цепей. Тяжелые цепи на большем протяжении закручены в двойную суперспираль, образуя стержневую часть молекулы. N —концевая часть каждой тяжелой цепи образует глобулярную головку, с каждой из которых ассоциированы 2 легкие цепи. При ограниченном протеолизе можно получить изолированные миозиновые головки, называемые субфрагментом — 1 миозина (S1), который сохраняет все главные свойства миозиновой головки: АТРазную активность и способность взаимодействовать с актином, являясь, таким образом, идеальным объектом для изучения структуры и свойств миозиновой головки.

Ключевую роль в молекулярном механизме мышечного сокращения играют конформационные перестройки, происходящие в миозиновой головке в ходе АТРазной реакции: М + АТР ** М*—АТР <-> M"-ADP-Pi о M-ADP + Pf о М + ADP

где М* и М" — миозиновая головка в измененной конформации. Промежуточные состояния миозиновой головки в ходе АТРазной реакции, М*—АТР и М**—ADP — Pir подвергаются в последнее время интенсивному изучению. Время жизни этих интермедиатов в процессе АТРазной реакции определяется секундами, что совершенно недостаточно для применения большинства методов структурных исследований. Поэтому для изучения структуры S1 в таких промежуточных комплексах используются стабильные аналоги этих интермедиатов — тройные комплексы S1 с ADP и аналогами Pj, такими как анионы ортованадата (V;), и фторидов бериллия (BeFx), алюминия (A1F4~) или скандия (ScFx). Одним из методов, применяемых для изучения структуры S1 в таких стабильных тройных комплексах, является метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), позволяющий в деталях изучать процесс теплового разворачивания белка. Изменения в характере этого процесса свидетельствуют о структурных перестройках белковой молекулы. Ранее в нашей группе этот метод был применен для исследования стабильных тройных комплексов SI— ADP— Vj и SI—ADP —BeFx. Было показано, что образование этих комплексов вызывает значительные структурные перестройки в молекуле S1, выражающиеся в значительном увеличении термостабильности S1 и в изменении его доменной структуры [Levitsky et al., 1992; Bobkov et al., 1993].

Цель и задачи исследований. Целыо представленной работы было изучение механизма таких перестроек. Для этого используются следующие подходы: проводятся видоизменения всех трех компонентов тройных комплексов миозиновой головки с ADP и аналогами Pj — белка,

нуклеотида и аналога Р;, после чего методом ДСК исследуется влияние этих изменений на характер тепловой денатурации миозиновой головки в этих комплексах. Исследования в этих направлениях и составляли цель настоящей работы. Конкретные задачи сводились к тому, чтобы исследовать методом ДСК тепловую денатурацию миозиновой головки в ее тройных комплексах с АБР и аналогами Р1р используя следующие видоизменения компонентов этих комплексов:

1) Специфическая модификация (тринитрофенилирование) остатка Ьуэ — 83 в молекуле из скелетных мышц кролика.

2) Метилирование всех лизиновых остатков в молекуле

3) Модификация АБР по аденину и по рибозному кольцу, а также использование вместо АБР ее искусственных аналогов — ненуклеозидных органических дифосфатов.

4) Использование в качестве аналогов фосфата фторидов алюминия и скандия, эффекты которых ранее не исследовались методом ДСК.

5) Использование вместо Б1 из скелетных мышц гладкомышечного тяжелого меромиозина (НММ), содержащего две головки с дефосфорилированными или с фосфорилированными регуляторными легкими цепями (ЯЬС).

Научная новизна. Впервые методом ДСК были исследованы протеолитические фрагменты гладкомышечного миозина, такие, как Б2 и НММ, а также комплексы с АБР и новыми аналогами неорганического фосфата — А1Р4~ и БсРх. Получены новые доказательства того, что комплекс 51—АБР —ВеРх отличается от всех других тройных комплексов Б1 с АБР и аналогами Р^ и соответствует миозиновой головке в промежуточном комплексе М*—АТР АТРазной реакции миозина, тогда как комплексы 51—АБР—V;, Б1— АБР—АН3,.- и 51—АБР —5сРх соответствуют, скорее всего, интермедиату М"—АБР —

Практическая ценность работы состоит в том, что полученные результаты являются основой для дальнейшего изучения механизма мышечного сокращения. Разработанные методические подходы к исследованию конформационных перестроек 51 могут быть использованы в структурных исследованиях других белков.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на XXII Европейской конференции по мышечному сокращению и клеточной подвижности (Гватт, Швейцария, 1993), на международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино, 1994), на 39 —м Конгрессе Биофизического общества США (Сан-Франциско, Калифорния, США, 1995) и на II — м Съезде Биохимического Общества РАН (Москва, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на стр., содержит 39 рисунков и 5 таблиц. Список цитируемой литературы включает источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Миозин из скелетных мышц кролика получали по методу Б.Ф.Поглазова с соавторами [Поглазов и др., 1958] с некоторыми модификациями. Миозин гладких мышц получали из мускульных желудков индейки [Sobieszek & Bremel, 1975]. SI миозина скелетных мышц получали протеолизом миозина химотрипсином при низкой ионной силе в присутствии ЭДТА [Weeds & Taylor, 1975]. Реакцию тринитрофенилирования аминогрупп в S1 из скелетных мышц кролика проводили по методу, описанному Mornet с соавторами, добавляя к раствору S1 (30 мкМ) в 50 мМ трис-HCl буфере (pH 7,5) 10 мМ TNBS до конечной концентрации 0,3 мМ, и инкубировали 0,5 — 20 мин при 25°С. Степень тринитрофенилирования определяли

спектрофотометрически при 345 нм на спектрофотометре Hitachi —557 (Япония) в двухлучевом режиме, используя узкощелевые кюветы фирмы "Sigma" (США) с длиной оптического пути 1 см. Параллельно, отбирая аликвоты смеси по 5—10 мкл через определенные промежутки времени, контролировали снижение АТРазной активности (см. раздел 12). Реакцию останавливали, удаляя TNBS быстрой гель — фильтрацией при центрифугировании. Метилирование всех лизиновых остатков S1 проводили по методу, описанному Rayment с соавторами [Rayment et al., 1993].

SI и HMM гладкомышечного миозина получали, переваривая предварительно сформированные миозиновые филаменты папаином или а — химотрипсином, соответственно [Redowicz et al.,1990; Sobieszek, 1994]. S2 получали из изолированной стержневой части миозина гладких мышц, переваривая ее а —химотрипсином. Переваривание останавливали добавлением холодного этанола. Образующийся осадок отделяли центрифугированием и экстрагировали из него S2 буфером с высокой ионной силой, после чего очищали гель — фильтрацией. Обратимое фосфорилирование или необратимое тиофосфорилирование RLC проводили, инкубируя миозин, S1 или НММ в присутствии АТР или ATPyS, соответственно, киназы легких цепей миозина, кальмодулина и СаС12 [Sobieszek, 1985; Sobieszek, 1994; Sobieszek & Jertschin, 1986]. Для получения SI и НММ с дефосфорилированными RLC к препаратам добавляли фосфатазу легких цепей миозина, после чего инкубировали не менее 2 часов при комнатной температуре. Степень фосфорилирования RLC в S1 или НММ контролировали методом электрофореза в ПААГ в присутствии мочевины и глицерина [Sobieszek & Jertschin, 1986]. Для анализа полученных препаратов миозина, SI, S2 и НММ использовали электрофорез в ПААГ с SDS [Laemmli, 1970].

Стабильные тройные комплексы SI— ADP—Vj или НММ—ADP — Vj получали, инкубируя S1 или НММ (1,5 мг/мл) с ADP (0,2 — 0,4 мМ) и V;

(0,002 — 4,0 мМ) 30 мин при 20° в среде, содержащей 30 мМ Hepes — КОН (рН 7,3) и 1 мМ МдС12. Для получения тройных комплексов S1 (НММ) — ADP — BeFx и Sl(HMM) -ADP- A1F4" SI или НММ (1,5 мг/мл) инкубировали 5—10 мин при комнатной температуре в среде, содержащей 30 мМ Hepes-КОН (рН 7,3), 1 мМ МдС12, 0,2 мМ ADP и 5 мМ NaF, после чего добавляли ВеС12 или А1С13, соответствешю, до конечной концентрации 0,1 — 2,0 мМ, и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Формирование тройных комплексов контролировали по ингибированию К+—ЭДТА— или Са2+— АТРазы S1 или НММ, степень которого коррелировала со степенью сборки комплекса.

Калориметрические исследования проводили на

дифференциальном сканирующем адиабатическом микрокалориметре ДАСМ —4М (Институт биологического приборостроения РАН, г. Пущино —на —Оке) с капиллярными платиновыми ячейками объемом 0,47 мл [Privalov & Potekhin, 1986]. Измерения проводили при скорости нагрева 1 град/мин в диапазоне температур от 20 до 70°С. Для предотвращения возможного дегазирования растворов при повышении температуры во всех экспериментах в ячейках калориметра поддерживалось избыточное давление 1,5 атм. Базовую линию записывали при требуемой скорости прогрева, помещая в рабочую и контрольную ячейки используемый в опыте буфер (30 мМ HEPES —КОН (рН 7,3), содержащий 1 мМ МдС12). После охлаждения ячеек до 8— 10°С из рабочей ячейки отбирали буфер и помещали в нее препарат белка в том же буфере (1,0— 10,5 мг/мл). Базовую линию впоследствии вычитали из полученных кривых теплопоглощения белка. Для обработки и анализа кривых теплопоглощения изученных белков использовали пакеты программного обеспечения "Origin 1.16" и "Origin 3.73" фирмы "Microcal" (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Специфические модификации лизиновых остатков в молекуле

Одна из главных проблем заключалась в том, чтобы понять, как исходно локальные изменения, происходящие в активном центре АТРазы 51 при образовании тройного комплекса 51 с АОР и аналогами Р1г распространяются на всю молекулу белка, изменяя участок связывания актина. Для этого применялся следующий подход: проводили специфические модификации определенных участков миозиновой головки, после чего методом ДСК исследовали способность модифицированных препаратов образовывать стабильные тройные комплексы с АБР и аналогами Р; и подвергаться при этом конформационным перестройкам. Предполагается, что такой подход позволит выявить группы и участки, важные для распространенияя

конформационных изменений через головку миозина. К сожалению, в S1 мало таких групп, доступных для специфической химической модификации: это Lys —83, Cys —707 и Cys —697 (см. рис. 1). Эффекты, вызываемые модификациями SH —групп, были уже исследованы ранее в нашей группе, а эффекты, вызываемые модификацией Lys —83, еще не исследовались к моменту начала работы над данной диссертацией.

Рис. 1. Третичная структура миозиновой головки (по [ЯаутеМ е1 а!., 1993]).

Таким образом, одна из задач состояла в том, чтобы провести специфическую модификацию остатка Lys —83 и исследовать влияние этой модификации на способность модифицированных препаратов образовывать стабильные тройные комплексы с АБР и аналогами Р; и подвергаться при этом конформационным перестройкам.

Мы провели специфическое тринитрофенилирование аминогруппы Lys —83 в молекуле Б1. На рисунке 2А показаны кривые избыточного теплопоглощения модифицированного в сравнении с контрольным немодифицированным 51. Как видно, модификация заметно увеличивает термостабильность белка, однако различия между модифицированным и контрольным Б1 исчезают в присутствии АОР (см. рис. 2Б].

На рисунке 2 В показана кривая теплопоглощения трипитрофенилированного Б1 в комплексе с АБР и V; в сравнении с комплексом, полученным из контрольного Б1, а на рисунке 2Г — кривые теплопоглощения комплексов модифицированного и контрольного Б1 с

АктинсБязывающий

с£йт'\ [щвль

• Lys - 83

• Cys -707

• Cys-697

-"Р—петля"

J0 ^ХАТРсбезыееккций Ç/fo * ^ сайт

ELC

АГ)Р и ВеРх. Как видно, модификация существенно препятствует конформационным перестройкам, которые выражаются в сдвиге кривой теплопоглощения при образовании комплекса Б1— АОР —V;, но не оказывает существенного влияния на перестройки, вызываемые образованием комплекса Б1—АОР —ВеРх.

«о ж. эш

"§■ 300

0,250

и 200

150 1ю 50 0 400 зээ

300 250 200 153 100 50 0

55 60 Темхршура, °С

Рис. 2. Температурные зависимости избыточного

теплопоглощения (ЛСр) препаратов (пунктир) и Б1, тринитрофенилированного по остатку ЬуБ-ВЗ (ТЬ'Р-Б!) (сплошная линия) в отсутствие нуклеотидов (А), в присутствии АОР (Б), и в трошшх комплексах с АОР и V} (В) или ВеРх (Г). Концентрация белка 1,5 мг/мл.

Таким образом, область, в которой находится Ьув —83, играет важную роль в распространении конфор — мационных изменений от активного центра АТРазы на всю молекулу при

образовании комплекса с АОР и V;, но не принимает участия в этом процессе при образовании комплекса с АОР и ВеРх. Эти данные являются хорошим

подтверждением гипотезы о том, что комплексы Б1 — АОР — ВеБх и — АОР—У; имитируют разные

М*—АТР и М"—АОР —Р<,

интермедиа™ АТРазной реакции соответственно.

Для кристаллизации и последующего определения его третичной структуры (рис. 1) авторам [Лаутеп1: е1 а1., 1993] пришлось подвергнуть метилированию все остатки лизина в молекуле Б1. В связи с этим в литературе долго обсуждался вопрос, насколько такой метилированный Б1 адекватен по своим свойствам нативному. Для проверки этого предположения мы исследовали методом ДСК свойства метилированного и показали, что эффекты такого метилирования

почти неотличимы от эффектов, вызванных специфическим тринитрофенилированием остатка Lys —83 в молекуле S1. В связи с этим можно сделать вывод, что эффекты метилирования в основном вызываются модификацией остатка Lys —83, а структура метилированного S1 не совсем адекватна структуре нативного.

30 40 50 60 Температура, °С

Рис. 3. Температурные зависимости избыточного теплопоглощения (АСр)

препаратов 31—АВР—У1

(пунктир) и ТМР-Б^АОР-У^ (сплошная линия),

подвергнутых интенсивному диализу з течение 12 часов против буфера 30 тМ НЕРЕБ—КОН, содержащего 1 тМ МдС12. После диализа к препаратам был добавлен АОР до конечной

концентрации 0,2 тМ. Концентрация белка 1,5 мг/мл, АИР (до диализа) 0,2 тМ, V,- (до диализа) 0,2 тМ.

Одной из характеристик тройных комплексов S1 с ADP и аналогами Pj является их стабильность, которая регистрируется по скорости их распада. Для исследования этого параметра мы подвергали препараты этих комплексов интенсивному диализу в течение 24 ч для удаления избытка ADP и аналога фосфата, после чего исследовали их методом ДСК (см. рис. 3). Как в случае тринитрофенилированного S1, так и в случае метилированного S1, после диализа на кривых теплопоглощения мы наблюдали лишь пик с максимумом в области 50°, соответствующий свободному S1, и лишь небольшое плечо, соответствующее тройному комплексу. Это свидетельствует о почти полном распаде тройных комплексов, полученных из препаратов модифицированного S1. Напротив, после диализа комплексов, полученных из контрольного ^модифицированного S1, распад комплекса составлял не более 10—15%. Таким образом, как тринитрофенилирование остатка Lys —83, так и метилирование всех лизиновых остатков в молекуле S1 значительно снижает стабильность тройных комплексов Sic ADP и аналогами Pj.

Исходя из известного из литературы анализа кинетических параметров АТРазной реакции, было высказано предположение, что как тринитрофенилирование остатка Lys —83, так и метилирование всех лизиновых остатков снижает время жизни промежуточного интермедиата АТРазной реакции M"—ADP —Pj. Поскольку комплекс SI—ADP—V; имитирует именно это состояние, легко предположить, что такие модификации должны снижать стабильность этого комплекса. Полученные нами данные полностью подтверждают это предположение.

Глава 2. Использование новых аналогов неорганического фосфата для моделирования интермедиата АТРазной реакции 81"-АБР-Р1.

Еще одно направление для характеристики комплексов с АБР и аналогами фосфата — применение различных аналогов неорганического фосфата и сопоставление их действия. Комплексы 51—АОР—V; и 51 — АБР —ВеРх ранее были исследованы методом ДСК, а комплексы Б1 — АБР —А1Р4~ и 51—АБР —5сБх не исследовались до начала работы над данной диссертацией. Мы исследовали эти эти комплексы методом ДСК (рис. 4). Кривые теплопоглощения, полученные для комплексов 51 — АОР—А1Р4~ и — АГ>Р —5сРх, были почти полностью идентичны кривой, полученной для

комплекса 51 — АБР — V;. Таким образом, эти комплексы можно

с успехом применять -...-.--

в калориметрических исследованиях.

Рис. 4.

Температурные зависимости избыточного теплопоглощения (ЛСр) препаратов 81, Б ¡-АБР, 51-АВР-А1Р4- и АОР-БсРх.

Концентрация белка 1,5 иг/мл, АОР - 0,4 тМ, Л'аР - 5 тМ, А1С13 и 5сС13 - 0,4 тМ.

40 50 60 70 Температура, °С

Глава 3. Использование искусственных аналогов ADP для исследования их способности образовывать с S1 стабильные тройные комплексы в присутствии аналогов неорганического фосфата.

Еще один подход для исследований стабильного тройного комплекса S1 с ADP и аналогами Р< заключался в изменениях нуклеотида (ADP). Как известно, миозин способен использовать в качестве субстрата довольно широкий круг природных и синтетических аналогов АТР. Меняя положение того или иного заместителя в молекуле синтетического аналога АТР, можно, исследуя как трифосфатазную активность S1, так и его способность к образованию стабильных комплексов с соответствующим аналогом ADP и аналогами фосфата, исследовать структуру активного центра S1.

Ранее в работе А. Бобкова и Д. И. Левицкого были подробно исследованы комплексы S1 с природными аналогами ADP и аналогами неорганического фосфата (Vj и BeFx) и было показано, что из всех природных NDP только CDP вызывает эффекты, подобные ADP [Bobkov & Levitsky, 1995]. Таким образом, для структурных перестроек молеку.лы S1 при образовании тройных комплексов с аналогами ADP и Pj принципиально важное значениие имеет аминогруппа в 6 —ом положении аденина или в 4 —ом положении цитидина. Мы продолжили исследования в этом направлении. Так, например, мы использовали в этих исследованиях e-ADP, в которой аминогруппа путем введения этена замыкается в еще один гетероцикл.

НО-Р-О-Р-О-

ОН

О

II

ОН

О

II

ОН ОН

e-ADP

Рис. 5. Температурные "

зависимости избыточного ^ 200

теплопоглощения (Ср) Б1 (1,5 _

мг/мл) в присутствии 0,4 тМ 150

е-АБР в отсутствие (I) и в <

присутствии аналогов §

неорганического фосфата (2 Й 100

- 4): 0,05 тМ V, (2), 0,05 тМ <

ВеРх (3) и 0,15 тМ А1Р4~ (4). 50

25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Температура, °С

Как видно из рисунка 5, замена ADP на е—ADP существенно препятствует конформационным перестройкам при образовании комплексов с Vj или A1FX, но не влияет на конформационные перестройки, возникающие в миозиновой головке при образовании комплекса SI—ADP —BeFx.

Таким образом, замена ADP на е—ADP вызывает эффекты, сходные по характеру с модификацией Lys — 83 (см. рис. 2). Исходя из этих данных, можно предположить, что наличие свободной аминогруппы в 6 — ом положении пуринового кольца играет важную роль в осуществлении конформационных изменений, выражающихся в увеличении термостабильности белка при образовании комплексов с V; и AIF4-, но не BeFx. Это еще раз указывает на значительное отличие комплекса SI — ADP —BeFx от остальных комплексов S1 с ADP и другими аналогами фосфата.

Другой аналог ADP — энофуранозиладенозиндифосфат (enfADP), любезно предоставленный нам профессором M.Burke (Case Western Reserve University, Cleveland, ОН, США), имел модификацию по рибозному кольцу, не отличаясь от ADP по структуре аденина. Эта модификация заключалась во введении двойной связи между 2 — м и 3 — м углеродами рибозы, превращающей ее в жесткое плоское кольцо.

епШЭР

Рис. 6. Температурные зависимости избыточного теплопоглощения (Ср) 51 (1,5 мг/мл) в присутствии 0,2 тМ еп1АВР в отсутствие (1) и в присутствии (2—5) V; в различных концентрациях: 0,1 тМ (2), 0,3 тМ (3), 1 тМ (4) и 4 тМ (5).

25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Температура, °С

Мы исследовали методом ДСК тройные комплексы, образуемые с еп{АБР и аналогами Р, и показали, что кривые теплопоглощения этих комплексов в принципе не отличались от кривых, полученных при использовании АБР, по сами комплексы были значительно менее стабильны, чем тройные комплексы с АБР. Это хорошо видно при исследовании сборки комплекса с еп1АБР в присутствии различных концентраций V, (рис. 6). Если в аналогичных условиях для полной сборки комплекса ¿1—АБР—V; достаточно микромолярных концентраций то для комплекса с епГАБР его сборка в присутствии 1мМ составляла не более 50%, и была еще неполной даже в присутствии 4 мМ V;.

Таким образом, такая модификация рибозного кольца, превращая его в жесткую плоскую структуру, значительно снижает стабильность тройных комплексов с АБР и аналогами фосфата. При такой модификации эффект мог быть обусловлен двумя причинами: изменением конформации рибозного кольца за счет введения двойной связи, делающей его жестким и плоским, или же просто химической модификацией, то есть удалением гидроксилов из положений 2' и 3' рибозного кольца. Для проверки этих предположений мы исследовали в подобной системе коммерческие аналоги АБР: 2' —¿АБР, 3' —<1АБР и 2',3'— сНАБР. Все эти аналоги по своим эффектам, в том числе и по

стабильности получаемых тройных комплексов, не отличались от ADP, Следовательно, снижение стабильности тройных комплексов обусловлено именно изменением конфигурации и подвижности рибозного кольца, а не простым удалением гидроксилов из его 2' и 3' положений. Таким образом, конфигурация и подвижность рибозного кольца очень важны для получения стабильных тройных комплексов S1 с аналогами ADP и Pj.

Мы исследовали также искусственные ненуклеозидные дифосфаты, синтезировшшые в лаборатории проф. М. Burke, имитирующие молекулу ADP, в которых роль азотистого основаниия выполнял нитробензол с нитрогруппами в различных положениях, а роль рибозы — углеводородная цепочка различной длины и состава. Мы сравнили 2 таких аналога, обозначенные как аналоги II и III, которые отличались лишь положением нитрогруппы в нитробензолыюм кольце (орто— и пара— положения). Оказалось, что аналог II с нитрогруппой в орто— положении бензольного кольца был эффективен, то есть обладал способностью образовывать тройные комплексы с S1 в присутствии аналогов фосфата, что проявлялось в увеличении термостабильности белка, а аналог III с нитрогруппой в пара—положении был полностью неэффективен (рис. 7 В,Г).

Таким образом, положение нитрогруппы играет определяющую роль для способности дифосфатного аналога нуклеотида образовывать тройной комплекс с 51 в присутствии аналога фосфата и вызывать, в результате, конформационные перестройки в молекуле Другая группа исследованных аналогов включала аналоги II, IV и VI, которые при неизменном нитробензольном кольце с нитрогруппой в орто— положении различались длиной и конфигурацией боковой цепи (линкера), линкер же представлял собой производные этана, пентана или диэтилового эфира. Исследования методом ДСК показали, что длина линкера не слишком принципиальна для обнаруженных эффектов,

N02

NH — СН2 — СН2 — О—DP III

II

IV

VI

Рис. 7. Температурные зависимости избыточного теплопоглощения (Ср) Б1 (1,5 мг/мл) в присутствии 0,4 тМ аналогов IV (А), VI (Б), II (В) и III (Г), в отсутствие и в присутствии аналогов неорганического фосфата.

поскольку аналог IV, у которого линкер был более чем в 2 раза длиннее линкера аналога II, практически не отличался от него по эффектам, выражающимся в увеличении термостабильности в присутствии этих аналогов АБР и аналогов фосфата (рис. 7 А,В). В то же время, замена кислорода на метильную группу у аналога VI приводила к полной потере таким аналогом способности формировать тройные комплексы с Б1 в присутствии аналога фосфата (рис. 7 Б).

На основании этих данных можно сделать вывод, что способность определенного искусственного аналога АЕ>Р образовывать с Б! в присутствии аналога неорганического фосфата тройные комплексы зависит не столько от длины линкера, соединяющего нитробензол с дифосфатной группировкой, сколько от его конфигурации и распределения заряда в нем.

Глава 4. Исследования протеолитических фрагментов миозина гладких мышц методом ДСК.

Нужно отметить, что описанные выше эксперименты были проведены на из скелетных мышц кролика. Этот препарат был лишен участка шейки миозиновой головки и регуляторных легких цепей (М.С). В то же время известно, что в гладких мышцах позвоночных ШС полностью подавляют активацию миозина актином и способность миозина перемещать актиновые филаменты в искусственных подвижных системах, причем такой их эффект проявляется только при наличии двух головок в молекуле, например в НММ, но он полностью снимается при фосфорилировании ЯЬС.

Мы предположили, что такое действие БШС могло бы быть связано с тем, что они в дефосфорилированном состоянии подавляют конформационные перестройки, происходящие в головках миозина в процессе АТРазной реакции и имитируемые при формировании тройных комплексов миозиновой головки с АВР и аналогами фосфата. Если это так, то в препаратах НММ из гладких мышц с интактными дефосфорилированными Й1С мы не должны наблюдать методом ДСК изменений термостабильности белка при образовании комплексов с АБР и аналогами фосфата. Для проверки этого предположения мы исследовали методом ДСК препараты НММ из гладких мышц мускульного желудка индейки в присутствии АБР и аналогов фосфата. На рисунке 8 показаны кривые теплопоглощения НММ в отсутствие нуклеотидов, в присутствии АБР, и в присутствии АБР и V;, ВеБх или АИ^". Как видно, в присутствии АБР и аналогов фосфата происходит значительное увеличение термостабильности белка, отражающее значительные конформационные перестройки в миозиновых головках. Фосфорилирование ШС не оказывает существенного влияния на этот эффект. В целом эти эффекты были очень похожи на то, что мы наблюдали в случае из скелетных мышц кролика; отличие, однако, заключалось в том, что на кривых теплопоглощения НММ с АБР и или А1Р4~ наблюдалось хорошо выраженное плечо в области 50°С. Это можно было бы объяснить тем, что в НММ в отличие от присутствует участок стержневой части миозина — область Б2.

Для проверки этого предположения мы исследовали тепловую денатурацию Б2 в изолированном состоянии и в составе НММ. Изолированный Б2 плавился с максимумом при 46°С, и его денатурация была полностью обратима. В то же время миозиновые головки плавятся полностью необратимо. Для того, чтобы выявить тепловой переход Б2 в составе НММ, мы прогрели НММ до 65°С, после чего охладили и прогрели вновь. После полной денатурации миозиновых головок на термограмме наблюдали лишь один переход с максимумом при 50°С, отражающий плавление Б2 в составе НММ. Таким образом, плечо на термограммах комплексов НММ—АБР—АИ^- и НММ—АБР—V; может быть обусловлено плавлением Б2.

, 300

-н м м

-НМ М ~ АОР

----НМ М - АБР - V

..... НММ - АОР - ВеР

-----НММ - АБР- А1И

200

- 100

I

30 40 50 60

Температура, (°С)

70

Рис. 8. Температурные зависимости избьипочного теплопоглощения (Ср) гладкомы ш е чпото НММ (1,5 мг/мл) с дефосфорилировштыми КЬС в отсутствие нуклеотидов, в присутствии 0,2 тМ АИР, и в тройных комплексах с АГ>Р и аналогами неорганического фосфата.

Из этих данных можно сделать вывод, что ШС не влияют на характер конформационных перестроек при образовании стабильных тройных комплексов с АБР и аналогами фосфата. Следовательно, ингибирующее действие ПЬС обусловлено иными причинами. Можно предположить, например, что эти Ш_С оказывают существенное влияние на стабильность интермедиата АТРазной реакции М" — АБР — Р;, сильно ее увеличивая и препятствуя распаду интермедиата. В этом случае и тройные комплексы с АБР и аналогами фосфата должны быть очень стабильны. Однако, проверка этого предположения представляет сложную задачу, требующую специальных экспериментов.

В заключение следует обратить внимание на то, что образование комплекса НММ—АБР —ВеБх вызывает значительно менее выраженные изменения термостабильности белка, чем образование других комплексов (рис. 10). Это еще раз свидетельствует о том, что комплекс миозиновой головки с АБР и ВеРх существенно отличается от

комплексов миозиновой головки с ADP и другими аналогами неорганического фосфата.

Таким образом, при видоизменении всех компонентов тройного комплекса миозиновой головки с ADP и аналогами фосфата получены дополнительные подтверждения того, что комплекс миозиновой головки с ADP и BeFx отличается от всех других тройных комплексов с ADP и аналогами Р;: он имитирует состояние миозиновой головки в комплексе с ATP (М*—АТР), тогда как все остальные тройные комплексы имитируют интермедиат М"—ADP —Pj АТРазной реакции миозина.

ВЫВОДЫ

1. Проведена специфическая модификация остатка Lys —83 в тяжелой цеи S1 и исследовано ее влияние на характер тепловой денатурации S1 в отсутствие нуклеотидов, в присутствии ADP и в тройных комплексах S1 с ADP и аналогами неорганического фосфата. Показано, что тринитрофенилирование увеличивает термостабилыюсть S1 в отсутствие нуклеотидов, препятствует увеличению термостабильности S1 при образовании комплекса S1 — ADP —Vir но не влияет на термостабильность S1 в комплексе S1 — ADP —BeFx. Сделан вывод, что область остатка Lys —83 играет важную роль в осуществлении конформационных перестроек при образовании комплекса SI—ADP—V;, но не SI—ADP —BeFx.

2. Показано, что метилирование всех лизиновых остатков в молекуле S1 снижает термостабилыюсть S1 в отсутствие нуклеотидов и вызывает такие же изменения термостабильности S1 в тройных комплексах с ADP и аналогами фосфата, как и тринитрофенилирование остатка Lys —83. Сделан вывод, что структура метилированного S1 не вполне адекватна структуре нативного S1, а эффекты метилирования, сходные с эффектами тринитрофенилирования, обусловлены, по-видимому, модификацией остатка Lys —83.

3. Показано, что, как специфическое тринитрофенилирование остатка Lys —83, так и метилирование всех остатков лизина в молекуле S1 значительно снижают стабильность тройных комплексов SI—ADP —Vj и SI — ADP —BeFx.

4. Методом ДСК показано, что такие аналоги неорганического фосфата, как фтористые алюминий и скандий могут быть с успехом использованы для формирования стабильных тройных комплексов с S1 в присутствии ADP.

5. Методом ДСК исследована тепловая денатурация S1 в тройных комплексах с модифицированной ADP (eADP, enfADP) или синтетическими аналогами ADP (ненуклеозидные органические дифосфаты) и аналогами фосфата. Показано, что возможность образования комплексов S1 с аналогами ADP и фосфата и характер конформационных перестроек S1, происходящих при образовании таких комплексов, зависят от строения аналога: важную роль играют

аминогруппа в положении 6 аденина, конфигурация и подвижность рибозного кольца ADP, а в случае синтетических аналогов — положение нитрогруппы в бензольном кольце, имитирующем азотистое основание, и распределение зарядов в линкере, соединяющем это кольцо с дифосфатной группировкой.

6. Методом ДСК исследована способность тяжелого меромиозина гладких мышц формировать тройные комплексы с ADP и аналогами фосфата и подвергаться при этом конформационным перестройкам. Показано, что ни наличие двух головок в молекуле НММ, ни наличие в головках интактных регуляторных легких цепей, ни степень их фосфорилирования не оказывают существенного влияния на изменения характера тепловой денатурации миозиновых головок, происходящие при образовании тройных комплексов с ADP и аналогами неорганического фосфата.

7. При видоизменении всех компонентов тройного комплекса миозиновой головки с ADP и аналогами фосфата получено дополнительное подтверждение того, что комплекс миозиновой головки с ADP и фтористым бериллием отличается от всех других исследованных комплексов и имитирует интермедиат АТРазной реакции миозина М* —АТР, тогда как тройные комплексы с остальными аналогами фосфата имитируют интермедиат М" —ADP —

Pi-

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Levitsky, D.I., Bobkov, А.А., Golitsina, N.L., Nikolaeva, O.P., Pavlov, D.A., Khvorov, N.V. (1993) Calorimetric studies on the stable complexes of myosin subfragment 1 with ADP and vanadate or beryllium fluoride. Abstracts of XXII—nd European Muscle Conference. (Gwatt, Switzerland, October 4-8, 1993), abstract 79.

2. Levitsky, D.I., Bobkov, A.A., Golitsina, N.L., Nikolaeva, O.P., Pavlov, D.A., Khvorov, N.V., Poglazov, B.F. (1994) Calorimetric studies on the stable complexes of myosin subfragment 1 with ADP and phosphate analogues. Abstracts of Internal Symp. "Biological Motility". 1994. {Pushchino, September 25 - October 1, 1994). p. 31-32.

3. Pavlov, D.A., Bobkov, A.A., Nikolaeva, O.P., Golitsina, N.L., Dedova, I.V., Levitsky, D.I. (1994) Effects of lysine modifications on the stractural changes in myosin subfragment 1 induced by the formation of the stable complexes with nucleotides. Abstracts of Intemat. Symp. "Biological Motility". 1994. (Pushchino, September 25 - October 1, 1994). p. 38-39.

4. Levitsky, D.I., Golitsina, N.L., Bobkov, A.A., Nikolaeva, O.P., Dedova, I.V., Pavlov, D.A. A differemtial scanning calorimeric study of stable myosin —nucleotide complexes. Biophys. J. 1995. v. 68, № 2, Pt. 2, p. A160.

5. Павлов Д.А., Левицкий Д.И., Дедова И.В., Потехин С.А., Николаева О.П., Поглазов Б.Ф. Влияние метилирования остатков лизина на свойства комплексов субфрагмента — 1 миозина с ADP и аналогами фосфата. Доклады Академии Наук. 1995. Т. 341, № 5, С. 696-698.

6. Павлов Д.А., Бобков А.А., Николаева О.П., Магретова Н. Н., Дедова И.В., Левицкий Д.И. Влияние модификации остатка лизина—83 на термостабильность субфрагмента 1 миозина и ее изменения, вызываемые связыванием нуклеотидов. Биохимия. 1995. Т. 60, № 7, С. 1100-1109.

7. Левицкий Д.И., Бобков А.А., Голицына Н.Л., Николаева О.П., Павлов Д.А., Поглазов Б.Ф. Калориметрические исследования стабильных комплексов субфрагмента 1 миозина с аналогами аденозинтрифосфата и фосфата. Биофизика. 1996. т. 41. № 1. С. 64 — 72.

8. Golitsina, N.L., Bobkov, А.А., Dedova, I.V., Pavlov, D.A., Nikolaeva, О.P., Orlov, V.N., Levitsky, D.I. Differential scanning calorimetric study of the complexes of modified myosin subfragment 1 with ADP and vanadate or beryllium fluoride. J. Muscle Res. and Cell Motility. 1996. v. 17. № 4. p. 475-485.

9. Gopal, D„ Pavlov, D. A., Levitsky, D. I., Ikebe, M„ Burke, M. Chemomechanical transduction in the actomyosin molecular motor by 2',3' — dideoxydidehydro—ATP and characterization of its interaction with myosin subfragment 1 in the presence and absence of actin. Biochemistry. 1996. v. 35. №31. p. 10149-10157.

10. Левицкий Д. И., Николаева О. П., Орлов В. Н., Пономарев М. А., Павлов Д. А. (1997) Калориметрический подход к изучению двигательных белков. Тезисы симпозиальных докладов Второго Съезда Биохимического общества РАН (Москва, 19 — 23 мая 1997 г.), С. 61—62.

11. Левицкий Д. И., Николаева О. П., Орлов В. Н., Павлов Д. А., Пономарев М. А., Росткова Е. В. Дифференциальная сканирующая калориметрия миозина и актина. Биохимия. 1998. Т. 63, № 3, С. 93 — 106.

12. Павлов Д. А., Собешек А., Левицкий Д. И. Калориметрические исследования тепловой денатурации фрагментов миозина гладких мышц и их комплексов с ADP и аналогами /фосфата. Биохимия. 1998 (в печати).