Структурно-метаболические и цитофизиологические аспекты реактивности гладкой мышечной ткани висцеральных органов.

Бармина, Анастасия Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-метаболические и цитофизиологические аспекты реактивности гладкой мышечной ткани висцеральных органов.
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-метаболические и цитофизиологические аспекты реактивности гладкой мышечной ткани висцеральных органов."

На правах рукописи

БАРМИНА Анастасия Олеговна

СТРУКТУРНО-МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ И ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕАКТИВНОСТИ ГЛАДКОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ВИСЦЕРАЛЬНЫХ ОРГАНОВ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Архангельск- 2009 003463870

003463870

Работа выполнена на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Северный государственный медицинский университет (г. Архангельск) Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Зашихин Андрей Леонидович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, доцент

Быков Владимир Лазаревич Одинцова Ирина Алексеевна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия Росздрава»

Защита диссертации состоится « $ » (^Ур^М^.009 года в -/У часов на заседании диссертационного совета Д 208.087.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Адрес: 194100, Санкт-Петербург, ул. Литовская, д.2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «СПбГПМА Росздрава» по адресу: 194100, Санкт-Петербург, ул. Кантемировская, д. 16.

Автореферат разослан « с^-ъ _ 2009 г.

Ученый секретарь совета,

доктор медицинских наук, профессор

су

Наталья Рафаиловна Карелина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Гладкая мышечная ткань (ГМТ) представляет собой один из основных тканевых компонентов, входящих в состав висцеральных органов и сосудов различного типа. Сокращение гладкой мышечной ткани вызывает, как правило, изменение просвета или диаметра тех органов, в составе которых она находится. Общепризнана ее определяющая роль, как в реализации нормального функционирования органных систем, так и в развитии их реактивных состояний и заболеваний. Расшифровка тканевых, цитологических и молекулярных механизмов работы гладкой мышечной ткани во многом обеспечивает успех в исследовании различных жизнеобеспечивающих систем организма, что, в свою очередь, создает базу для разработки новых эффективных методов лечения. Несмотря на центральную роль ГМТ в патогенезе функциональных расстройств различных органов (респираторный тракт, пищеварительный тракт, мочевыносящая система), до настоящего времени имеются лишь единичные исследования, касающиеся детальных структурно-метаболических особенностей гладких миоцитов.

Исследованиями ряда авторов были значительно расширены имеющиеся представления о морфо-функциональной организации, гистогенезе и реактивности ГМ (Баженов Д.В., 1988; Зашихин A.JI., 1994; Давиденко В.К., 2000; Кауфман О.Я., 1979). Большое значение для понимания закономерности физиологической регенерации мышечных тканей имеют сведения о пролиферативных свойствах дифферона (Гансбургский А.Н., Павлов А.В., 1998; Stenmark K.R., Mecham R.P., 1997), соотношении процессов пролиферации и дифференцировки (Данилов Р.К., 1994; Ямщиков Н.В., 1991). За последние годы появилось значительное количество работ, свидетельствующих о сложности организации гладкой мышечной ткани (ГМТ) в составе стенок сосудов и висцеральных органов. Многие исследователи полагают о неоднородности популяции гладких миоцитов, входящих в состав различных внутренних органов лабораторных животных, а также о гетероморфии гладких мышечных клеток (Зашихин А.Л., 2002; Barnes P.J., 2003, 2006; Gabella G., 1994, 2002; Guarino M.P., 2007; Halayko A.J., 2005), которые отличаются по своим линейным параметрам, форме, организации внутриклеточных органелл (Cook C.L., et al., 1994; Giuriato L.E., at al., 1995; Halayko A.Í., 1996, 2001; Neylon C.B., et al., 1995; Roelofs M., 1995), распределению внутриклеточных цитоскелетных и сократительных белов (актина, миозина, десмина, виментина) (Halayko A.J., 1999,2003; Neylon C.B., et al., 1995; Shirinsky V.P., 1992).

Однако значительная часть этих сведений была получена при исследовании ГМТ кровеносных сосудов различных лабораторных животных, в то же время висцеральной мышечной ткани уделено меньше внимания. Вопросы о характере структурно-метаболических параметров ГМК и ■ механизмов их реактивной трансформации остаются недостаточно изучены, и эта тема требует дальнейших исследований.

Различные висцеральные органы отличаются не только по анатомическому строению, соотношению тканевых компонентов, но и уровню функциональной активности. Имеющиеся в литературе данные позволяют предположить существование межорганных и внутриорганных особенностей

(V 4

организации ГМТ висцеральных органов. Вопрос о характере структурно-метаболических параметров гладких миоцитов в составе бронхов и тонкой кишки лабораторных животных остается недостаточно изученным, что диктует необходимость их дифференцированного анализа.

Ряд авторов выявили некоторые закономерности морфо-функциональных механизмов реактивности гладкой мышечной ткани желудочно-кишечного тракта (Богач П.Г., 1974; Гладкий А.П., Баженов Д.В., 1976; Gabella G., 1994, 2002; Stanghellini V., et al., 2007) и бронхиального дерева (Barnes P.J., 2003, 2006; Halayko A.J., et al., 2003). Однако эти данные не позволяют оценить реактивные изменения структуры популяции и значение различных типов миоцитов в адаптивных реакциях.

Таким образом, представляется актуальным проведение комплексного сравнительного анализа висцеральной ГМТ (бронхов и тонкой кишки) лабораторных животных в норме и в процессе развития компенсаторно-приспособительных реакций при изменении функциональной нагрузки.

Цель исследования - изучить структурно-функциональные характеристики гладкой мышечной ткани висцеральных органов лабораторных животных (крыс) в условиях физиологической нормы и выяснить закономерности ее реактивной трансформации.

Задачи исследования:

1. Провести комплексный сравнительный анализ организации интактной гладкой мышечной ткани бронхов и тонкой кишки.

2. Изучить структурно-метаболические параметры гладких мышечных клеток бронхов крыс при развитии бронхоспастического синдрома.

3. Исследовать структуру популяции, пролиферативный потенциал и содержание суммарного белка гладких миоцитов стенки тонкой кишки при развитии частичной обтурационной непроходимости.

4. Отработать методику ферментативной диссоциации для получения изолированных гладких мышечных клеток, сохраняющих нормальные физиологические параметры. Провести анализ изменения цитоплазматического кальция в разных типах гладких миоцитов при стимуляции сокращения.

Научная новизна исследования.

Впервые на основе интегративного анализа дана сравнительная оценка тканевых и клеточных механизмов реактивной перестройки гладкой мышечной ткани висцеральных органов.

Впервые с помощью анализа изолированных гладких мышечных клеток бронхов и тонкой кишки установлено, что одним из основных механизмов компенсаторно-приспособительных реакций гладкой мышечной ткани висцеральных органов является динамичное изменение структуры клеточной популяции.

Проведен сравнительный анализ экспрессии маркерных белков интактных гладких мышечных клеток бронхов и тонкой кишки и при изменении их функциональной нагрузки.

Впервые отработана методика ферментативной диссоциации ГМТ тонкой кишки для получения живых изолированных гладких миоцитов. Проведены цитофизиологические исследования базального уровня

цихоплазматического кальция в изолированных гладких мышечных клетках и механизма регуляции контрактильной активности разных субтипов гладких мышечных клеток.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Висцеральная гладкая мышечная ткань лабораторных животных имеет сложную морфо-функциональную организацию, которая различается по структуре популяции, пролиферативному потенциалу и адаптационным возможностям.

2. Состояние гиперконтрактации гладкой мышечной ткани бронхов вызывает изменение структуры популяции. Бронхоспастическая реакция стимулирует метаболическую активность, малых миоцитов и вызывает реактивную деградацию больших клеток в гладкой мышечной ткани бронхов.

3. Уровень реактивной трансформации гладкой мышечной ткани разных отделов тонкой кишки при развитии экспериментальной обтурационной непроходимости имеет существенные различия, обусловленные характером изменения функциональной нагрузки.

4. Разные фенотипы гладких мышечных клеток характеризуются аналогичными параметрами изменения уровня цитоплазматического кальция при стимуляции сокращения.

Научно-практическая значимость работы.

Полученные в работе комплексные данные о структурно-метаболических параметрах и структуре популяции гладких мышечных клеток интактных бронхов и тонкой кишки и при изменении их функциональной нагрузки имеют существенное значение для расшифровки клеточных механизмов реактивности и адаптационных реакций висцеральной гладкой мышечной ткани.

На основании комплексной оценки получены данные о различии структурно-метаболических параметров гладких мышечных клеток интактной и реактивно измененной гладкой мышечной ткани бронхов при бронхоспастическом синдроме, которые могут служить теоретической основой для понимания патогенеза заболеваний легких, сопровождающихся аллергическим компонентом, и могут быть использованы как объективный критерий оценки эффективности и разработки новых методов лечения патологии органов дыхания.

Полученные морфометрические, цитоспектрофотометрические, электронно-микроскопические и иммуногистохимические данные о механизмах регуляции функций гладкой мышечной ткани интактной тонкой кишки и реактивно измененной гладкой мышечной ткани тонкой кишки при обтурационной непроходимости могут быть использованы в научно-практической работе при изучении патогенеза ряда заболеваний тонкой кишки (обтурационная непроходимость), а также для разработки и реализации новых методов лечения.

Разработан и апробирован новый метод получения изолированных гладких мышечных клеток, сохраняющих нормальные физиологические параметры. Использование этой методики можно рекомендовать в практику

научных лабораторий для проведения широкого круга цитологических исследований.

Результаты исследования могут быть использованы в учебных программах медицинских и биологических вузов и для разработки новых экспериментальных моделей ряда заболеваний.

Общетеоретические результаты целесообразно использовать в преподавании соответствующих разделов гистологии, физиологии, патологической физиологии, патологической анатомии, пульмонологии и гастроэнтерологии.

Апробация материалов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях: на 3 научно-практических конференциях студентов и молодых ученых (Архангельск, 2003, 2005, 2006); на 7 международных симпозиумах «Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки» (Архангельск, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008), на IV международном конгрессе «European asthma congress» (Испания, 2006), на IX Конгрессе международной ассоциации морфологов (Узбекистан, Бухара, 2008).

Внедрение в практику.

Основные положения диссертации использованы при составлении учебно-методического пособия «Материалы итогового контроля студентов по цитологии, общей и частной гистологии».

Полученные данные включены в учебную программу при изложении материала по темам «Мышечные ткани», «Дыхательная система», «Пищеварительная система» на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии и нормальной физиологии Северного Государственного Медицинского Университета.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, в том числе в ведущих рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации представлены на 166 страницах. Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, главы по материалу и методам исследования, трех глав собственных исследований и одной главы по их обсуждению, выводов и списка литературы. Список литературы включает 248 источников, из них 56 работ отечественных авторов и 192 иностранных. Диссертация содержит 16 таблиц, 62 рисунка, включающих микрофотографии.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Изучение структурно-метаболической и цитофизиологаческой трансформации гладкой мышечной ткани висцеральных органов проводили на материале лабораторных животных (табл.1). Использовали взрослых белых беспородных крыс и лабораторных мышей. Материал интактных бронхов и тонкой кишки для контрольной группы брался у крыс в возрасте 6-6,5месяцев, массой 300-350грамм. Экспериментальные исследования выполняли в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных

животных (1996), а также с соблюдением правил гуманного обращения с животными (Report of the AVMA Panel on Euthanasia JAVMA, 2001).

Реактивность гладкой мышечной ткани бронхов изучался на материале, полученном в результате развития экспериментального бронхоспазма. Исследовались фрагменты гладкой мышцы бронхов крыс, взятые на 24, 28, 31, 38, 44 сутки эксперимента на высоте бронхоспастической реакции (35 животных). Контрольную группу составили 10 животных с указанной исходной массой тела, которые получали аналогичный объем раствора без аллергена. Для изучения реактивного ответа гладкой мышечной ткани при наложении лигатуры на тонкую кишку крыс использовался материал, полученный при проведении экспериментальной частичной обтурационной непроходимости (10 животных). В качестве контрольной группы использовали материал интактной тонкой кишки 10 лабораторных крыс. Получение живых изолированных гладких миоцитов и изучение динамики уровня кальция изучалась на материале тонкой кишки лабораторных мышей (SO животных).

Всего в работе проанализирован материал от 125 объектов исследования. Изучено 4550 изолированных гладких миоцитов по 11 параметрам: линейные и объемные размеры клеток и их ядер, ядерно-цитоплазматическое отношение, оптическая плотность ДНК ядер и суммарного белка цитоплазмы. Проанализировано более 300 электронограмм. Характеристика изученного материала приведена в таблице 1.

Таблица 1.

Характеристика исследованного материала.

Объект Серия исследования, Экспериментальная модель Методы исследования Число объектов

Крысы: бронхи Гладкая мышечная ткань контрольная группа Общая гистология, морфометрия изолированных ГМК, цитоспектрофотометрм ДНК и суммарного белка цитоплазмы, электронная микроскопия, иммуноцитохимия 10

Крысы: бршгхи Гладкая мышечная ткань при бронхоспазме, материал взят на 24, 28, 31, 38, 44 сутки эксперимента. Общая гистология, морфометрия изолированных ГМК, цитоспектрофотометрия ДНК и суммарного белка цитоплазмы, электронная микроскопия, иммуноцитохимия ■ 35 ■

Крысы: тонкая кишка Гладкая мышечная ткань, контрольная группа Общая гистология, морфометрия изолированных ГМК, цитоспектрофотометрия ДНК и суммарного белка цитоплазмы, электронная микроскопия, иммуногистохимия и иммуноцитохимия 10

Крысы: тонкая кишка Гладкая мышечная ткань при обтурационной непроходимости (Зотдела): 1-проксимальный, 2-зона лигатуры, 3-дистальный Общая гистология, морфометрия изолированных ГМК, цитоспектрофотометрия ДНК и суммарного белка цитоплазмы, электронная микроскопия, иммуноцитохимия V 10

Мыши: тонкая кишка Гладкая мышечная ткань в норме Ферментативная диссоциация, иммуноцитохимия, конфокальная микроскопия 30

Мыши: тонкая кишка Гладкая мышечная ткань в норме Ферментативная диссоциация, Микрофлуорометрия с Рига-2АМ, МйоТгаскег, Нио-З. 30

В работе использованы следующие методы.

Общеморфологическое исследование. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине. Из парафиновых блоков были изготовлены срезы 5-7 мкм и окрашены гематоксилин-эозином.

Прицельная щелочная диссоциация. Работами Бродского В.Я., с соавт (1983), Данилова Р.К. с соавт (1989), Ямщикова Н.В. (1991) было убедительно обосновано применение метода щелочной диссоциации тканей для количественных цитологических исследований. Для получения однородной взвеси изолированных гладких миоцитов и изучения фрагментов стенок бронхов и тонкой кишки использовался оригинальный метод прицельной клеточной диссоциации (Зашихин А.Л., Агафонов Ю.А., Лисишников Л.В, патент РФ на изобретение № 2104524 от 23.05.94.), позволяющий избирательно выделять из стенки органов тканевые компоненты определенного типа и проводить их последующую диссоциацию. Выделенные микрофрагменты диссоциировали в 50% водном растворе КОН в течение 2,5-3 часов. Разделение клеток достигали с помощью гидроудара струи воды из микропипетки с последующим пассажем содержимого пробирки, что позволяло получить однородную взвесь клеток, из которой изготовляли мазки.

Методы цитохимической обработки препаратов. Выявление ДНК в ядрах проводили в строго идентичных условиях по методу Фёльгена (Пирс Э., 1962), контролем служили мазки, не подвергшиеся гидролизу в растворе соляной кислоты. Суммарный белок цитоплазмы выявляли амидочерным 10Б (Брумберг В. А., Певзнер Л.З., 1972).

Морфометрия и цитоспектрофотометрия. Цитоспектрофотометрию проводили одноволновым методом на сканирующем спектрофотометре МФТХ-2М, оборудованным монохроматором и позволяющем строго выдерживать параметры длины волны. Определение ДНК ядер и суммарного белка в цитоплазме проводили методом сканирования (Агроскин Л.С., Папаян Г.В., 1977). ДНК фотометрировали при длине волны - 546нм, а суммарный белок цитоплазмы - при 580нм, зондом диаметром 0,5мкм. Одновременно измеряли линейные размеры миоцитов и их ядер при помощи окуляр-микрометра МОВ-1-15х в двух взаимно перпендикулярных плоскостях. Объемы гладких миоцитов и их ядер вычисляли по формуле эллипсоида вращения (Хесин Я.Е., 1967).

Электронно-микроскопический метод. Материал фиксировали в 2,5% растворе глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 1,2-1,А) в течение 2 часов и последующей постфиксацией в течение 1 часа в 2% растворе тетраоксида осмия при температуре 5°С (МШюш§ I., 1961). Кусочки промывали в буфере, затем проводили обезвоживание в ацетоне возрастающей концентрации (50%, 70%, 90%, 100%), контрастировали в 70° спирте и 1% уранилацетате в течение 12 часов. Заливали в смесь эпон-аралдита. Для

обеспечения прицельного электронно-микроскопического анализа со всех блоков получали серийные полутонкие срезы толщиной 1-2 мкм, которые окрашивали 1% раствором метиленового синего. После идентификации необходимых объекгов блоки затачивали и прицельные ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB-5 (Bromma, Sweden), подвергали двойному контрастированию в 2,5% растворе уранилацетата и 0,3 % растворе цитрата свинца по Рейнольдсу (Reynolds E.S., 1963). В последующем данные объекты просматривали и фотографировали в электронных микроскопах JEM-100 СХ, ПЭМ-100 при увеличениях 4000-40000.

Иммуногистохимия. Экспериментальный материал (гладкую мышечную ткань, фрагменты стенки бронхов и тонкой кишки) лабораторных животных (крыс) фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (PBS, phosphate buffer solution, Sigma, Immunochemicals, USA), затем готовили парафиновые срезы (5-7мкм в толщину). Перед инкубацией в растворе первичных антител парафиновые срезы на стеклу подвергались депарафинизации в ксилоле и дегидратации в этаноле снижающейся концентрации обычным способом с последующей промывкой в дистиллированной воде. Затем срезы были инкубированы с 0,6% перекисью водорода, добавленной к 50% раствору метанола в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего воздействовали 1% раствором тритона X-100 в течение 25 минут и инкубировали с 5% нормальной лошадиной сывороткой (Vector Laboratories, Inc, USA) 45 минут при комнатной температуре. После каждой операции материал крыс на стеклах отмывали, стандартным раствором фосфатно-солевого буфера.

Экспозицию с первичными антителами к гладкой мышечной ткани осуществляли в течение 12 часов при 4°С, в течение 6 часов при комнатной температуре или в течение 2 часов при 37°С. В качестве первичных антител использовали: моноклональный мышиный иммуноглобулин Gl против десмина, клон D33 (Dakopatts, Дания), моноклональный мышиный IgG против виментина, клон ЗВ4 (Dako), поликлональный кроличий IgG против виментина, клон ICN (Chemicon), моноклональный мышиный IgG2 против бсактина, клон 1А4 (Biomeda), моноклональный мышиный IgG против миозина, клон 12В (Chemicon), фактор некроза опухоли TNF-R (Ab-1) (IgG, клон 16803.1,Oncogene Research Products, Boston). Для разведения антител использовался фосфатно -солевой буфер с белком (bovine serum albumin, Sigma Chemical Company), при : pH 7,2. Далее процедуру выявления белков проводили по двум вариантам окрашивания: по методу иммунофлуоресценции (с FITC и СуЗ) и ПАП-методом (пероксидаза хрена и моноклональная мышиная антипероксидаза).

Иммунофлуоресцентный метод. Препараты были Инкубированы С вторичными антителами в течеиие 30 минут при 37°С. Использовались вторичные антитела (козьи против первичных антител мыши), конъюгированные с флуорохромами FITC для десмина D33, альфа-* гладкомышечного актина, гладкомышечного миозина и виментина ЗВ4; и вторичные антитела (козьи против первичных антител кролика), конъюгированные с СуЗ для виментина (ICN); моноклональные люминисцентные флуорохромы: Alexa Fluor 594, красный (козьи против

первичных антител мыши IgG, Molecular Probes, Inc), поликлональные Alexa Fluor 488, зеленый, (козьи против первичных антител мыши, IgG, Molecular Probes, Inc) на 45-60 мин при комнатной температуре. Окраску ядер клеток проводили с помощью ядерного красителя DAPI (4,6-diaminodino-2-phenylindole, Molecular probes, Inc). Результаты окрашивания оценивались с помощью флуоресцентного микроскопа.

Пероксидаза-антипероксидазный комплекс (ПАП- метод.) Использовали вторичные биотинилированные антитела (biotinylated anti-mouse IgG (H+L) rat adsorbes, in horse, Vector, Laboratories, USA) с добавлением 5% нормальной сыворотки крысы в течение 45-60 мин при 37°С. Затем проводили промывку. После чего инкубировали в течение 45 мин с ПАП-иммунным комплексом (пероксидаза хрена и моноклональная антихреновая пероксидаза, тип IgGl, Dako) в разведении 1:100 в течение 30 минут. Далее препараты отмывали в буфере и обрабатывали хроматогеном ДАБ (1% 3,3*-диаминобензидинтетрагидрохлорид, Dako, Дания) в течение 5-10 минут. Результаты оценивали при световой микроскопии.

Ферментативная диссоциация. Образцы мышечной ткани из стенки тонкой кишки объемом 1мкм3 выделяли с помощью диссекционного микроскопа. Гладкие мышечные клетки были изолированы методом энзимного разделения. Использовали питательные растворы, содержащие отдельно ферменты: эластазу (1-1,5мг/мл (Туре 1; Sigma chemical СО (ЕС 3.421.36), коллагеназу (1-1,5мг/мл, Туре 2; Sigma St Louis, МО USA; N.c-9263) и коллагеназу Р (1-1,5мг/мл, Mannhem, Germany). Инкубация проводилась в течение 45 минут. Полученную суспензию гладких миоцитов для отмывки энзимов однократно центрифугировали в останавливающем растворе с добавлением альбумина (1мг/мл, BSA, Sigma Chemical Co. St.Louis, MO, USA) при комнатной температуре (15 минут при 600 об/мин). Затем надосадочную жидкость удаляли с помощью микропипетки, оставляя около 1мл суспензии полученных живых клеток.

Микрофлуориметрия. Изолированные гладкие миоциты тонкой кишки получали методом ферментативного разделения. В качестве индикатора ионов кальция использовались флуоресцентные агенты Fura-2AM и Fluo-3 (Molecular probes Inc, Eugene, Oregon, USA). Клетки, инкубированные с Fura-2AM и Fluo-3, помещались в перфузионную камеру на предметном столе флуоресцентного микроскопа. Регистрация сигнала проводилась с интервалом в 2 сек в течение 5 мин. Для определения оценки уровня активности митохондрий в полученных живых изолированных клетках проводили инкубацию их с 70нМ MitoTraker Red в течение 15 минут в темноте при температуре 37°С. Затем следовала промывка прёпаратов в буфере (KRBB), после чего препараты переносили в перфузионную камеру лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica SP2 (Confocal laser scanning microscopy, CLSM, Leica Microsystems, Mannheim, Germany), где поддерживалась постоянная температура 37°С. Клетки были визуализированы на экран компьютера с помощью сканирующей системы микроскопа.

Автор выражает благодарность Шведскому Институту (Swedish Institute, Visby Program), директору департамента Интегративной

Медицинской Биологии Умеа Университета профессору Я.Селину за поддержку и предоставленную возможность проведения ряда исследований в рамках данной научной работы.

Статистическая обработка. Статистический анализ проводился на персональном компьютере с использованием пакета прикладных статистических программ STATISTICA (Statsoft Inc, USA, http: www.statsoft.ru). Результаты тестов считались статистически значимыми при р<0,05. Определяли числовые характеристики переменных, оценку соответствия вида распределения признака закону нормального распределения, оценку значимости различных количественных показателей в независимых выборках с использованием t- критерия Стыодента. В результате вычисляли средние значения, стандартные отклонения, ошибки средней арифметической, определяли коэффициенты вариации, асимметрии и эксцесса.

Качественные (номинальные, порядковые, категориальные) признаки представлены как абсолютные частоты и процентные доли. Нормально распределенные количественные признаки представлены как средняя арифметическая (X) ± стандартное отклонение (Sx). Нормальность распределения определялась по критерию Холмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса.

Для сравнения двух независимых совокупностей по одному признаку при нормальном распределении количественных переменных использовали t-критерий для независимых совокупностей (t- критерий Стьюдента, T-test for Independent Simples). Для оценки взаимосвязи между двумя количественными переменными при их нормальном распределении использовали коэффициент простой линейной корреляции (Пирсона, Pearson product-moment correlation coefficient, Pearson r).

Для выявления существования взаимосвязей между некоторыми изучаемыми параметрами использовали регрессионный анализ.

Методы работы были одобрены этической комиссий Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Северного государственного медицинского университета Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Результаты исследования и их обсуждение

Структурно-функциональная организация интактной гладкой мышечной ткани бронхов и тонкой кишки.

При сравнительном анализе интактной гладкой мышечной ткани бронхов и тонкой кишки крыс были изучены показатели объемов клеток и их ядер, а также оптической плотности ядерного вещества и цитоплазмы, отражающих плоидность ядер и содержание суммарного клеточного белка в миоцитах. Анализ основных морфометрических параметров ГМК интактной гладкой мышечной ткани воздухоносных путей и желудочно-кишечного тракта у лабораторных животных показал, что среднее значение объёмов миоцитов варьирует от З414,48±150,01мкм3 в гладкой мышечной ткани бронхов до 4619,52±230,70мкм3 в стенке тонкой кишки (Табл.2). Среди всех

морфометрических параметров ГМК каждого исследованного органа показатель объёма клеток обладал наибольшей вариабельностью значений: коэффициент вариации колебался от 62,74% в гладкой мышечной ткани бронхов до 74,07% в тонкой кишке. Высокая вариабельность признака подтверждалась значениями асимметрии и эксцесса, которые выходили за пределы, установленные законом нормального распределения. Это свидетельствует о неоднородности ГМК, что позволяет выделить среди них группы малых, средних и больших миоцитов. Все группы являются представительными и характеризуются нормальным типом распределения.

Таблица 2.

Средние морфометрические и цитоспектрофотометрические параметры ГМК интактных бронхов и тонкой кишки у крыс._

Показатели Бронхи Среднее арифметическое Х+вх , Тонкая кишка Среднее арифметическое Х±8х У/о

Объем миоцита, (мкм") 3414,476± 150,0099 62,74 4619,516+230,706 74,07

В том числе: малых средних больших 870,2666+ 51,03335 . 3225,535+ 104,599 7377,96± 253,0277 33,68 38,77 18,14 2612,831±82,838 7808,604±380,41 36,83 44,91

Объем ядер миоиитов (мкм"1) 181,752±6,5286 51,30 116,883±4,6006 58,38

В том числе: малых средних больших 80,2789± 6,833 179,287+5,8085 313,935± 16,2962 48,89 38,74 27,54 89,746±3,132 159,984±9,051 40,55 52,15

ЯЦО 0,069+ 0,0024 50,72 0,033+0,0012 54,54

В том числе: малых средних больших - 0,1036+0,00664 0,065+0,0026 0,045±0,0021 36,87 47,69 24,44 0,039±0,00154 0,023+0,0012 45,89 47,82

Опт. гш. ДНК ядер (отн. ед.) 0,670±0,0023 4,77 0,763+0,0123 23,98

В том числе: малых средних больших 0,6754+0,0088 0,669+0,0023 0,673+0.0055 7,49 4,03 4,31 0,804±0,017 0,699±0,0144 24,62 19,02

Опт. пл суммарного белка цитоплазмы миоцитов (отн.ед.) 0,442±0,0007 2,48 0,495±0,0056 16,56

В том числе: малых средних больших 0,4377+0,0016 0,443 +0,0009 0,440±0,0016 2.10 2,48 1,81 0,506+0,0077 0,477+0,007 17,88 13,41

При этом структура популяции ГМК также имеет органную специфику. В гладкой мышечной ткани бронхов отмечается преобладание средних миоцитов, в то время как в изученном отделе кишки наиболее представительна субпопуляция малых клеток, которые характеризуются более высоким ЯЦО и содержанием цитоплазматического белка в сравнении с другими типами миоцитов. Содержание суммарного цитоплазматического белка в миоцитах кишки было выше (0,495±0,0056отн.ед.), чем в ГМК бронхов (0,442+0,0007отн.ед.) (р<0,025). Содержание гиперплоидных клеток, как

косвенный показатель пролиферативного потенциала ГМК, существенно преобладало в гладкой мышечной ткани тонкой кишки.

Выявление различных типов миоцитов в ГМТ бронхов и тонкой кишки подтверждает данные литературы о клеточной неоднородности дефинитивной ГМТ (Зашихин А.Л., 2001; Barnes P.J., 2006; Carotti S., et al., 2007; Halayko A.J., et al., 2003; Guarino M.P., 2004; Stanghellini V., et al., 2007). Малые, средние и большие миоциты тесно интегрированы в ГМТ. Полученные данные позволяют рассматривать субпопуляции миоцитов как звенья единого миобластического дифферона, где малые миоциты представляют собой группу клеток, содержащих камбиальные и дифференцирующиеся элементы, а большие клетки являются его терминальным звеном.

Проведенный сравнительный анализ ультраструктуры гладкой мышечной ткани исследованных органов лабораторных животных свидетельствует о том, что трансмиссионная электронная микроскопия не позволяет выявить существенных различий ультраструктурной организации гладких миоцитов, входящих в состав стенки воздухоносных путей и желудочно-кишечного тракта. Полученные данные соответствуют результатам предыдущих исследований (Gabella G., 1994, 2002; Kuo К.Н., et al., 2003; Somlyo A.V., et al., 2004). Ультраструктура контрактильных гладких миоцитов в изученных областях, характеризуется типичной для ГМТ висцеральных органов организацией мембранных контактов, сократительного и синтетического аппаратов. Выявляются «темные» и «светлые» миоциты, характеризующиеся различной электронной плотностью цитоплазмы (Зашихин А.Л., 2004). «Темные» ГМК характеризуются параллельным расположением ориентированных по длине клетки сократительными филаментами. В «светлых» миоцитах имеет место беспорядочная локализация и меньшая плотность этих структур.

Среди типичных гладких мышечных клеток располагаются единичные, тесно интегрированные в состав мышечного пласта мелкие клетки, имеющие особые ультраструктурные параметры. Они имеют крупные ядра, в которых преобладает диффузный эухроматин. В цитоплазме отсутствуют миофиламенты, а органеллы представлены единичными профилями эндоплазматического ретикулума и группами свободных рибосом. Сравнение электронно-микроскопической характеристики данных клеток с результатами исследований, посвященных анализу ультраструктурной организации гладких миоцитов на различных стадиях гистогенеза (Зашихин А.Л., 1991, 1996; Румянцев П.П., 1981; Brewster С.Е., et а]., 1990; Gabella G„ 2002), позволяет предположить, что они представляют субпопуляцию премиобластов и могут рассматриваться в качестве камбиальных элементов гладкой мышечной ткани. Данная точка зрения согласуется с мнением ряда авторов. Этот тип клеток описан и в гладкой мышечной ткани кровеносных сосудов (Amano J., et al., 1997; Giuriato L.E., et al., 1995; Pusovsky V., et al., 2003).

В составе ГМТ исследованных органов также располагаются клетки, которые по характеру ультраструктурной организации можно отнести к интерстициальным клеткам Кахаля (ИКК) (Зашихин А.Л., 2005; Bassotti G., et

al., 2006; Rumessen J.J., et al., 1996; Sanders K.M., 1996; Thuneberg L., 1995; Yamazawa T., et al., 2002). Их общим признаком является отсутствие организованного контрактильного аппарата и тесная интеграция в состав гладкой мышечной ткани ЖКТ и бронхов. В настоящее время не существует единой точки зрения о типах ИКК и их структурно-функциональных характеристиках.

Иммуногистотохимический анализ экспрессии гладкомышечного а-актина, гладкомышечного миозина, десмина и виментина показал, что независимо от видовой или органной принадлежности, маркерными белками ГМТ являются альфа-ГМ актин, ГМ-миозин и десмин. Это свидетельствует об определенной идентичности процессов цитоплазматического синтеза белка в висцеральной ГМТ различных органов лабораторных животных (Зашихин A.JL, Михайлов В.М., 1996; Paulin D, et al., 2004). При электронно-микроскопическом анализе в составе ГМТ тонкой кишки и бронхов были выявлены клетки, которые идентифицировали как интерстициальные клетки Кахаля (Bassotti G., et al., 2006; Duquette R.A., et al., 2005; Pusovsky V., et al., 2003; Thuneberg L., et al., 1995).

Таким образом, результаты комплексного электронно-микроскопического, морфометрического и цитоспектрофотометрического анализа гладких миоцитов подтверждают наличие в интактной ГМТ бронхов и тонкой кишки крыс клеточных элементов, соответствующих различным звеньям миобластического дифферона. Вероятно, соотношение различных типов миоцитов в популяции определяется функциональными потребностями дыхательных путей и желудочно- кишечного тракта.

Трансформация гладкой мышечной ткани бронхов крыс при экспериментальном бронхоспазме.

ГМТ бронхов при развитии гиперконтрактации изучали в динамике формирования экспериментального бронхоспастического синдрома у белых лабораторных крыс. Анализ структуры популяции гладких миоцитов свидетельствует о том, что при развитии бронхоспазма происходит изменение соотношения различных фенотипов ГМК по сравнению с контролем. Изучение среднего показателя объема миоцитов бронхов на разных сроках эксперимента выявило достоверное его уменьшение в динамике эксперимента от 3315,17±161,78мкм3 на 24 сутки до 2312,53±112,04мкм3 на 44 сутки по сравнению с контрольной группой З414,48±150,01мкм3 (Рис.3). Выявленные изменения отражают структурные перестройки в популяции ГМК при развитии бронхоспастического синдрома. Это проявляется в значительном увеличении доли малых миоцитов, уменьшении количества больших клеток на всех сроках эксперимента, начиная с 24 суток опыта (Рис.4).

4000 3800 3600 3400

■с; 3200

зооо

1— 2Ш 2

О) 2600

А ю

О 2*00 2Й» 2000 1800

Рис.3. Изменение средних объемов гладких миоцитов бронхов в динамике развития бронхоспастического I синдрома. По оси абсцисс - сроки

эксперимента, по оси ординат- объем ' гладких миоцитов (в мкм3).

13,73*^—-16 к."* ——V 13.15% —---

70-10% 60,68% 57.28%

контроль 24 сутки 28 сутки

4,59% 12,98% 4,48%

60,

31 сутки 38 сутки 44 сутки

Рис.4. Структура популяции гладких мышечных клеток бронхов на разных сроках эксперимента. О -малые ГМК; О - средние ГМК; • - большие ГМК.

Структурная перестройка гладкой мышечной ткани бронхов I сопровождается достоверным увеличением доли гиперплоидных клеток на всех сроках эксперимента по сравнению с контрольной группой. При этом в гладких миоцитах бронхов отмечается достоверное увеличение показателя оптической плотности цитоплазмы, отражающего содержание суммарного клеточного белка. В динамике эксперимента наблюдается значительное увеличение данного показателя на 24 сутки (0,535±0,0072отн.ед.), а затем его последовательное снижение до 0,479±0,0055отн.ед. на 44 день опыта.

Данная перестройка популяции ГМК сопровождается значительным усилением пролиферативной активности миоцитов всех субпопуляций, наиболее выраженной на 24 сутки эксперимента (содержание гиперплоидных клеток увеличилось с 6,37% до 27,67%), и элиминацией из популяции в результате гибели больших миоцитов, наиболее выраженной на 44 сутки (количество больших миоцитов сократилось с 13,73% до 4,48%) (Рис.4). На протяжении всего эксперимента наибольший пролиферативный потенциал демонстрировали малые миоциты, подтверждая свою камбиальную роль в миобластическом диффероне. Увеличение пролиферативной активности малых миоцитов сопровождалось снижением содержания цитоплазматических белков в данных клетках, что подтвердил корреляционный анализ (коэффициент корреляции г =-0,8). В малых, средних и больших ГМК в динамике эксперимента наблюдалось увеличение содержания белка.

В субпопуляции больших миоцитов на 24-е сутки отмечалось появление гиперплоидных клеток, что свидетельствовало о способности к делению части больших миоцитов. Такую реакцию, по-видимому, проявляли и ГМК, близкие по своим параметрам к средним миоцитам. Другая часть больших миоцитов, утративших в процессе дифференцировки способность к делению и не

способных адаптироваться к нарастающему по частоте состоянию гиперконтрактации, гибнет. Полученные данные соответствуют имеющимся сведениям о перестройке гладкой мышечной ткани бронхов и фенотипической модуляции ГМК при развитии бронхоспастического синдрома (Chan V., 2006; Chung K.F., 2000).

Проведенное электронно-микроскопическое исследование показало, что на всех этапах эксперимента в гладкой мышечной ткани бронхов наблюдались миоциты с реактивно-дистрофическими изменениями. В их цитоплазме имели место деструкция миофиламентов, расширение канальцев эндоплазматического ретикулума, появление миелииовых телец. Ядро уменьшалось в размере, наблюдалась конденсация хроматина и концентрация его под кариолеммой. Данные ультраструктурные параметры являются характерными для клеток, подверженных гибели путем апоптоза. Эти результаты также подтверждаются при иммуногистохимическом исследовании. На поздних этапах эксперимента в составе гладкой мышечной ткани бронхов выявлены иммунопозитивные клетки при постановке реакции на TNF-R (Oncogene Research Products, Boston), маркер апоптотически измененных клеток. Данные процессы приводят к значительному уменьшению количества больших клеток в популяции к концу опыта. Наши данные подтверждают мнение ряда авторов о том, что при развитии бронхоспастического синдрома возможны повреждения гладких миоцитов: нарушение циторецептороного аппарата и контракта льного аппаратов, снижение скорости внутриклеточной передачи информации (Ebina M., et al., 1993; Bergner A., et al., 2003; Hirst S.J., et al., 2000; Howarth P.H., et al., 2004). •

Учитывая тот факт, что данные изменение преобладали в больших ГМК, вероятно, что нарастающее по частоте состояние гиперконтрактации является повреждающим фактором, вызывающим выраженные реактивно-дистрофические изменения в терминальном звене дифферона и обусловливающим элиминацию данных клеток их популяции.

Реактивные изменения гладкой мышечной ткани тонкой кишки

крыс при экспериментальной кишечной непроходимости.

Изменения ГМТ тонкой кишки при развитии обтурационной непроходимости сопровождается как морфологическими изменениями, так и нарушением моторики кишки, обусловленной наложением лигатуры. При формировании частичной непроходимости транспортировка содержимого кишки замедляется. Проксимальный сегмент растягивается, éro стенка гипертрофируется, мышечный слой утолщается (Bertoni S., et al., 2006; Guarino M.P., et al., 2007), параллельно страдает слизистая (Cogliandro R.F., et al., 2007) и отмечается снижение представительства интерстициальных клеток Кахаля (Bassotti G., et al., 2006; Sanders K.M., 1996; Yamazawa T., et al., 2002). В зоне наложения лигатуры происходит деструкция клеточных элементов, отек межклеточного вещества, нарушение гемодинамики, трофики и иннервации (Stanghellini V., et al., 2007), при этом дистальный отдел кишки (ниже наложения лигатуры) подвержен гипофункции и последовательной атрофии стенки (Dite P., Lata J., 2003; Guarino М.Р., et al., 2007).

Сравнение гладкой мышечной ткани различных отделов тонкой кишки при развитии экспериментальной непроходимости выявлены достоверные различия в ее структурно-функциональной организации. Отмечается достоверное увеличение среднего показателя объема ГМК в проксимальном отделе (6579,07±327,63мкм;'), уменьшение данного показателя в зоне наложения лигатуры (З177,17±157,97мкм3) и дистальном отделе (3097,15±127,03мкм") по сравнению с контрольной группой, где он составляет-4619,51±230,70мкм3 (Рис.5).

В основе изменений среднего значения объема миоцитов лежат структурные перестройки в популяции ГМК. В проксимальном отделе, подверженном повышению функциональной нагрузки, выявлено снижение доли малых клеток с 61,36% до 49,60%, возрастание количества средних миоцитов с 38,64% до 48,80% и появление доли больших миоцитов (1,60%). В дистальном отделе и в зоне наложения лигатуры при снижении функциональной нагрузки, отмечается увеличение представительства малых миоцитов и снижение доли средних миоцитов по сравнению с контролем (малые миоциты в контрольной группе составили 61,36%, в зоне лигатуры -80,80%, в дистальном - 82,47%), а средние миоциты соответственно - 38,64%, 19,20% и 17,53% (Рис.6). Таким образом, ГМТ проксимального отдела, по сравнению с контрольным сегментом, характеризуется более выраженными изменениями в структуре популяции.

1,60%

контроль лигатура

проксимальный дистальный

Рис. 5. Изменение средних объемов гладких миоцитов тонкой кишки при развитии обтурационной непроходимости. По оси абсцисс -различные участки исследуемой кишки, по оси ординат- объем гладких миоцитов (в мкму).

61,36%

^/49,60%

контроль

проксимальный

17,53%

80,80%

82,47%

лигатура

дистальныи

Рис. 6. Структура популяции гладких мышечных клеток тонкой кишки в разных участках при развитии экспериментальной кишечной непроходимости. О- малые миоциты;© - средние миоциты; ф - большие миоциты

Исследование содержания цитоплазматических белков в ГМК показало достоверное уменьшение этого показателя во всех отделах. Оптическая плотность белков цитоплазмы в миоцитах контрольной группы составила 0,495±0,0056отн.ед., в проксимальном отделе- 0,447±0,0017отн.ед., в зоне лигатуры- 0,444±0,0008отн.ед., в дистальном отделе - 0,449+0,0021 отн.ед. Это, вероятно, отражает различный характер перестройки внутриклеточных обменных процессов в разных отделах кишки в динамике развития обтурационной непроходимости.

Показатель оптической плотности ДНК ядер и процент гиперплоидных клеток достигали наибольшего значения в проксимальной области (р<0,0018). Это подтверждает данные литературы о том, что изменение функциональной нагрузки ГМК активирует в них синтез ДНК и пролиферативную активность (Гладкий А.П., Баженов Д.В., 1976; Зашихин A.JL, 1998; Кауфман О.Я., 1974, 1987). Оптическая плотность белков цитоплазмы ГМК в изученных отделах существенно не различалась. В структуре популяции ГМК проксимального отдела появляются большие клетки. В свете имеющихся данных, появление больших миоцитов в гипертрофированном отделе тонкой кишки свидетельствует о том, что в основе изменений ГМТ наряду с гиперплазией имеют место гипертрофические процессы.

Электронно-микроскопическое исследование ГМТ в области наложения лигатуры выявило отек межклеточного вещества, наличие значительного количества миоцитов с признаками деструкции, присутствие макрофагов в межклеточном веществе. Это отражает воспалительные и деструктивные процессы в гладкой мышечной ткани кишки (Shi X.Z., Sarna S.K., 2005). В пласте ГМК среди типичных миоцитов сократительного типа, характеризующихся развитым контрактильным аппаратом, располагаются клетки, ультраструктура которых соответствует описанию гладких миоцитов синтетического типа (Huizinga J.D., 1998; Paulin D., Li Z., 2004; Santicioli P., et al., 2001; Won K-J., et al., 2006).

Таким образом, при формировании частичной обтурационной кишечной непроходимости характер структурной и функциональной трансформации гладкой мышечной ткани разных отделов тонкой кишки существенно различается. Наиболее выражена перестройка в проксимальном отделе, где имеет место растяжение и гипертрофия мышечного компонента (Bertoni S., Gabella G., 2006). Данные изменения сопровождаются увеличением представительства средних и больших миоцитов в популяции и нарастанием синтеза ДНК. Эти результаты соответствуют данным литературы (Гладкий А.П., Баженов Д.В., 1976; Зашихин А. Л., 1998; Кауфман О Л., 1974) о повышении ядерного и белкового синтеза в гладкой мышечной ткани при увеличении функциональной нагрузки. В области дистального отдела, где имеет место снижение функциональной активности (Dite P., Lata J., 2003), отмечается уменьшение средних показателей объема ГМК и их ядер, уменьшение активности ядерного синтеза и экспрессии цитоплазматических белков. Характер перестройки популяции ГМК в условиях эксперимента осуществляется в соответствии с основными закономерностями гистогенетичесхой дифференцировки гладкой мышечной ткани. Важным

фактором этого процесса является систематический уровень функциональной нагрузки (Зашихин А.Д., 1994). Изменение этого фактора (гипер- или гипофункциональное состояние) обусловливает характер перестройки структуры популяции ГМТ.

Таким образом, полученные данные позволяют констатировать, что , структурно- функциональная перестройка гладкой мышечной ткани разных отделов тонкой кишки при развитии обтурационной непроходимости характеризуется дифференцированными изменениями, которые, вероятно, обусловлены особенностями функциональным нагрузок на гладкую мышечную ткань различных отделов в условиях эксперимента (Guarino М.Р., Carotti S., 2007). Эти процессы в ГМК разных отделов тонкой кишки можно рассматривать как проявление тканевой адаптационной реакции, направленной на компенсацию нарушений функции тонкой кишки. При этом перестройка структуры популяции ГМТ является одним из существенных тканевых механизмов, обеспечивающих адаптацию к изменяющимся функциональным нагрузкам.

Кальций-зависимые механизмы регуляции функции гладких мышечных клеток.

Характер функционирования контрактилыюго аппарата гладких миоцитов определяется уровнем ионных потоков кальция в цитоплазме ГМК, поскольку повышение концентрации свободного кальция является триггером контрактильного процесса (Allen B.G., et al., 1994; Amrani Y., et al., 2002; Chung S-S., et al., 2005; Espelt M.V., et al., 2005; Sweeney M., et al., 2002). Характер изменения содержания внутриклеточного Са2+ может объяснить активизацию потенциал-зависимых Са2+ каналов (Golovina V.A., 2006; Perry S.V., et al., 1984; Pusovsky V., 2003). По данным ряда авторов характер контрактилыюй реакции гладких миоцитов имеет существенные отличия в разных органах (Golovina V.A., et al., 2006; Essine К., et al., 2007; Hirota S„ et al., 2007; Pusovsky V., et al., 2003; Takeuchi T., et al., 2004).

Анализ сократительных процессов возможен только при изучении гладких мышечных клеток, полностью сохраняющих все прижизненные параметры и особенности циторецепторного аппарата. Разработка метода ферментативной диссоциации гладкой мышечной ткани тонкой кишки показала, что при сравнительном использовании различных видов энзимов: эластазы (1-1,5мг/мл, Туре 1; Sigma Chemical СО-(ЕС 3.421.36), коллагеназы (1-1,5мг/мл, Туре 2; Sigma St. Louis, МО USA; N.c-9263) и коллагеназы Р (1-1,5мг/мл, Туре Р, Roche Diagnostics GmbH, Mannhem, Germany), оптимальные результаты удается получить при применении коллагеназы Р в концентрации равной 1,25мг/мл (Туре Р, Roche Diagnostics GmbH, Mannhem, Germany). При этом использование многоуровневого контроля качества жизнеспособности ГМК показывает, что изолированные клетки сохраняют свои функциональные^ параметры.

Проведенный с помощью микрофлуорометрии с Fura-2AM (Molecular probes Inc, Eugene, Oregon, USA) и Fluo-3 (Molecular probes Inc, Eugene, Oregon, USA) сравнительный анализ базального уровня цитоплазматического кальция в

различных фенотипах интактных ГМК выявил мелкоосцилляторные изменения концентрации Са2+. Динамика изменения этого показателя в гладких мышечных клетках при стимуляции отражает изменение их мембранного потенциала и характеризует активность кальциевых каналов L-типа. Наличие разных вариантов кривой базальной концентрации Са2+ является показателем различного функционального состояния контрактильного аппарата исследуемых объектов, что может определять особенности реакции миоцитов на стимулирующие влияния (Espelt M.V., et al., 2005; Chung S-S., et al., 2005; Ma T, et al., 2004; Takeuchi Т., et al, 2004; Van Breemen C, et al, 1989; Wassdal I, et al, 1999). Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что несмотря на некоторые различия в базальном уровне цитоплазматического С а2" в разных фенотипах висцеральных ГМК (малые, средние, большие), стимуляция их контрактильной активности приводит к аналогичному синхронизированному повышению уровня цитоплазматического Са2'(Рис.7). Это свидетельствует об идентичности запуска механизмов контрактильной активности у разных типов гладких мышечных клеток.

1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 Время эксперимента,сек

Рис. 7. Динамика изменения концентрации внутриклеточных ионов кальция в разных фенотипах изолированных гладких мышечных клетках.

ВЫВОДЫ

1. Гладкая мышечная ткань в составе стенки бронхов и тонкой кишки имеет единый принцип структурной организации и представляет собой сложно организованную клеточную популяцию, в составе которой присутствуют различающиеся по морфометрическим и метаболическим характеристикам малые, средние и большие гладкие миоциты. Маркерными протеинами висцеральной гладкой мышечной ткани лабораторных животных являются альфа-гладкомышечный актин, гладкомышечный миозин и десмин. Экспрессия данных протеинов в гладкой мышечной ткани осуществляется вне зависимости от ее видовой или органной принадлежности.

2. Различия морфо-функциональной организации гладкой мышечной ткани бронхов и тонкой кишки определяются функциональными

потребностями данных органных систем. В воздухоносных путях они детерминированы функцией регуляции воздушных потоков, а в тонкой кишке-характером пропульсивной перистальтики.

3. В динамике развития экспериментального бронхоспастического синдрома компенсаторно-приспособительная реакция гладкой мышечной ткани бронхов сопровождается перестройкой клеточной популяции. В мышечной ткани при этом происходит последовательное уменьшение средних объемов гладких миоцитов, увеличение доли малых клеток и снижение содержания больших.

4. Состояние гиперконтрактации при бронхоспастическом синдроме является фактором, вызывающим развитие деструктивных изменений, преимуществешю в субпопуляции больших миоцитов, представляющих терминальное звено миобластического дифферона. На субклеточном уровне в этих клетках наблюдаются изменения, определяющие их элиминацию из популяции гладких миоцитов.

5. При развитии частичной обтурационной непроходимости разные отделы тонкой кишки характеризуются специфическим характером реактивной трансформации мышечного компонента стенки, обусловленным изменением уровня функциональной нагрузки.

6. Для изолированных гладких миоцитов характерны мелкоосциляторные изменения базального уровня кальция. Различные фенотипы висцеральных гладких мышечных клеток характеризуются идентичной реакцией на воздействие стимулирующих факторов в виде синхронизированного повышения уровня цитоплазматического кальция.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бармина, А.О. Структурно-метаболическая организация гладкой мускулатуры лимфатических сосудов различных органов / В.А. Болдуев, А.Л. Зашихин, Ю.В. Агафонов, А.О. Бармина // Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки. Материалы IV международен Симпозиума. — Архангельск: Б.И. -2002. -С.10-11.

2. Бармина, А.О. Изменение белкового синтеза в гладких миоцитах воздухоносных путей при развитии хронических обструктивных бронхитов / А.Л. Зашихин, А.О. Бармина // Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки. Материалы V международн. Симпозиума. - Архангельск: Б.И. -2003. -С.12-14.

3. Бармина, А.О. Некоторые аспекты реактивной трансформации гладкой мускулатуры воздухоносных путей / А.Л. Зашихин, А.О. Бармина // Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки. Материалы VI международн. Симпозиума. - Архангельск: Б.И.-2004.-С.8-9.

4. Бармина, А.О. Реактивная трансформация гладкой мускулатуры воздухоносных путей при антигенн-стимулированном бронхоспазме / А.Л. Зашихин, А.О. Бармина // Применение современных методов

анализа в изучении структуры и функции клетки. Материалы VII международн. Симпозиума. - Архангельск: Б.И. -2005. -С. 10-11.

5. Бармина, А.О. К вопросу о механизмах регуляции контрактильной активности изолированных гладких миоцитов / A.JI. Зашихин, А.О. Бармина // Бюллетень Северного Государственного Медицинского Университета. - Архангельск. - 2005. - №1. - С. 16-17.

6. Бармина, А.О. Тканевые механизмы адаптации гладкой мускулатуры воздухоносных путей к гиперконстрикции // Бюллетень Северного Государственного Медицинского Университета. - Архангельск. - 2005. -№2. - С. 15-16.

7. Бармина, А.О. К вопросу о ферментативной диссоциации гладкой мышечной ткани / A.JI. Зашихин, А.О. Бармина // Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки. Материалы VIII международн. Симпозиума. - Архангельск: Б.И. -2006. -С.5-6.

8. Бармина, А.О. Тканевые механизмы реактивности гладкой мускулатуры воздухоносных путей при антиген-стимулированном бронхоспазме / А.Л. Зашихин, Я.Селин, А.О. Бармина // «Аллергология и иммуннология». -2006. -Т.7, №1. -С. 35.

9. Barmina, А.О. Tissue mechanism of airway smooth muscle reactivity in antigen-induced bronchoconstriction / A.L. Zashikhin, J. Sehlin, А.О. Barmina // International journal on Immunorehabilitation. -2006. -Vol.8, №1. -P.25.

10. Бармина, А.О. Особенности организации энергетического аппарата гладких миоцитов / А.О. Бармина // Бюллетень Северного Государственного Медицинского Университета. - Архангельск. — 2006. -№1. - С. 14-15.

11. Бармина, А.О. Особенности фенотипической модуляции гладкой мускулатуры воздухоносных путей при развитии хронических неспецифических заболеваний легких на Европейском Севере / А.Л. Зашихин, Ю.В. Агафонов, А.О. Бармина, В.П. Быков // Экология человека. -2006. -№8. -С. 49-51.

12. Бармина;А.О. Энзиматическая диссоциация гладкой мышцы: новые аспекты / А.О. Бармина // Экология человека. -2006. -Приложение 4/2. -С.346.

13. Бармина, А.О. Клеточные механизмы реактивности гладкой мускулатуры тонкого кишечника при развитии экспериментальной непроходимости / А.Л. Зашихин, Ю.В. Агафонов, А.О. Бармина, С.Н. Детков, С.Н. Брозницкий, М.А. Прялухина // Экология человека. -2006. -Приложение 4/2. -С.264.

14. Бармина, А.О. Трансформация гладкой мускулатуры тонкого кишечника при развитии экспериментальной непроходимости / А.Л. Зашихин, Ю.В. Агафонов, А.О. Бармина // Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки. Материалы IX международн. Симпозиума. - Архангельск: Б.И. -2007. -С.7-8.

15. Бармина, А.О. Некоторые тканевые и клеточные механизмы реактивной трансформации гладкой мускулатуры различных

висцеральных органов / А.Л. Зашихин, А.О. Бармина // Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки. Материалы X международн. Симпозиума. - Архангельск: Б.И. -2008. -С.5-8.

16. Бармина, А.О. Некоторые аспекты прижизненного анализа изолированных гладких миоцитов / А.О. Бармина, А.Л. Зашихин, Я. Селин // "Морфология". - 2008. - №2. - С.16.

Отпечатано ИП Артемьев А.Н., г. Архангельск, ул. Полова, 17, оф. 308, Формат 60x84 1/16, заказ JVs 101, Подписано в печать 27.02.2009. Объем 1,0 пл. Тираж 100 жз.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Бармина, Анастасия Олеговна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И РЕАКТИВНОСТЬ ГЛАДКОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ

1.1. Ультраструктурная организация гладких мышечных клеток.

1.2.Структура клеточной популяции гладких миоцитов в составе гладкой мышечной ткани внутренних органов.

1.3.Сократительный аппарат гладких миоцитов. Молекулярные основы сокращения.

1.4.0собенности компенсаторно-приспособительных реакций и механизмы регуляции контрактильной активности гладкой мышечной ткани.

1.5.Гладкая мышечная ткань бронхов. Особенности организации и реактивности гладкой мышечной ткани бронхов.

1.5.1.Морфо-функциональная организация гладкой мышечной ткани бронхов.30 1.5.2.0собенности реактивности бронхиального дерева и механизмы нарушения вентиляции легких при аллергическом воспалении.

1.6.Гладкая мышечная ткань органов желудочно-кишечного тракта. Особенности организации и реактивности ГМТ тонкой кишки. 1.6.1.Морфо-функциональная организация гладкой мышечной ткани кишечника.

1.6.2.Особенности реактивности гладкой мышечной ткани тонкой кишки.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Материал исследования.

2.2.Методы исследования.

Глава 3. МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И РЕАКТИВНОСТЬ ГЛАДКОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ БРОНХОВ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ БРОНХОСПАЗМЕ

3.1.Структурно-метаболическая характеристика интактной гладкой мышечной ткани бронхов крыс.

3.2.Ультраструктурные характеристики интактных гладких миоцитов бронхов.

3.3.Иммуногистохимический анализ ГМТ бронхов.

3.4.Ультраструктурные характеристики гладких миоцитов бронхов крыс при экспериментальном бронхоспазме.

3.5.Реактивные изменения гладких мышечных клеток бронхов крыс при экспериментальном бронхоспазме.

Глава.4. МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И РЕАКТИВНОСТЬ ГЛАДКОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ТОНКОЙ КИШКИ ПРИ ОБТУРАЦИОННОЙ НЕПРОХОДИМОСТИ.

4.1. Структурно-метаболическая характеристика интактной гладкой мышечной ткани тонкой кишки крыс.

4.2.Ультраструктурные характеристики гладких миоцитов тонкой кишки.

4.3.Иммуногистохимический анализ гладкой мышечной ткани тонкой кишки.

4.4.Реактивные изменения гладких мышечных клеток тонкой кишки при экспериментальной обтурационной кишечной непроходимости.

Глава 5. ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛАДКИХ МИОЦИТОВ

5.1.Роль кальция в процессе контрактации гладких мышечных клеток.

5.2.Энзимная диссоциация гладкой мышечной ткани.

5.3.Определение уровня жизнеспособности ГМК, полученных методом ферментной диссоциации.

5.4.Анализ концентрации цитоплазматического уровня кальция с помощью Fura-2AM.

5.5. Анализ концентрации цитоплазматического уровня кальция в изолированных ГМК с помощью Fluo-З.

5.6. Динамика изменения уровня цитоплазматического кальция в изолированных ГМК при стимуляции контрактильной активности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-метаболические и цитофизиологические аспекты реактивности гладкой мышечной ткани висцеральных органов."

Гладкая мышечная ткань (ГМТ) представляет собой один из основных тканевых компонентов, входящих в состав висцеральных органов и сосудов различного типа. Сокращение гладкой мышечной ткани вызывает, как правило, изменение просвета или диаметра тех органов, в составе которых она находится. Общепризнана ее определяющая роль, как в реализации нормального функционирования органных систем, так и в развитии их реактивных состояний и заболеваний. Расшифровка тканевых, цитологических и молекулярных механизмов работы гладкой мышечной ткани во многом обеспечивает успех в исследовании различных жизнеобеспечивающих систем организма, что, в свою очередь, создает базу для разработки новых эффективных методов лечения. Несмотря на центральную роль ГМТ в патогенезе функциональных расстройств различных органов (респираторный, пищеварительный тракт, мочевыносящая система), до настоящего времени имеются лишь единичные исследования, касающиеся детальных структурно-метаболических особенностей гладких миоцитов.

Исследованиями ряда авторов были значительно расширены имеющиеся представления о морф о-функциональной организации, гистогенезе и реактивности ГМТ (Баженов Д.В., 1988, Зашихин A.JL, 1994, Давиденко В.К., 2000, Кауфман О.Я., 1979). Большое значение для понимания закономерности физиологической регенерации мышечных тканей имеют сведения о пролиферативных свойствах дифферона (Гансбургский А.Н., Павлов А.В., 1998, Stenmark K.R., Mecham R.P., 1997), соотношении процессов пролиферации и дифференцировки (Данилов Р.К., 1994, Ямшиков Н.В., 1991). За последние годы появилось значительное количество работ, свидетельствующих о сложности организации гладкой мышечной ткани (ГМТ) в составе стенок сосудов и висцеральных органов. Многие исследователи полагают о неоднородности популяции гладких миоцитов, входящих в состав различных внутренних органов лабораторных животных, а также о гетероморфии гладких миоцитов (Зашихин А.Л., 2002, Barnes P.J., 2003, 2006, Gabella G., 1994, 2002, Guarino M.P., 2007,

Halayko A J., 2005), которые отличаются по своим линейным параметрам, форме, организации внутриклеточных органелл (Cook C.L., et al, 1994, Giuriato L.E., at al, 1995, Halayko A.J., 1996, 2001, Neylon C.B., et al, 1995, Roelofs M., 1995), распределению внутриклеточных цитоскелетных и сократительных белов (актина, миозина, десмина, виментина) (Halayko A J., 1999, 2003, Neylon С.В., 1995, Shirinsky V.P., 1992).

Однако значительная часть этих сведений была получена при исследовании ГМТ кровеносных сосудов различных лабораторных животных, в то же время висцеральной мышечной ткани уделено меньше внимания. Вопросы о характере структурно-метаболических параметров ГМК и механизмов их реактивной трансформации остаются недостаточно изучены и эта тема требует дальнейших исследований.

Известно, что различные висцеральные органы отличаются не только по анатомическому строению, соотношению тканевых компонентов, но и уровню функциональной активности. Имеющиеся в литературе данные позволяют предположить существование межорганных и внутриорганных особенностей организации ГМТ висцеральных органов. Вопрос о характере структурно-метаболических параметров гладких миоцитов в составе бронхов и тонкой кишки лабораторных животных остается недостаточно изученным, что диктует необходимость их дифференцированного анализа.

Ряд авторов выявили некоторые закономерности морфо-функциональных механизмов реактивности гладкой мышечной ткани желудочно-кишечного тракта (Богач П.Г., 1974, Гладкий А.П., Баженов Д.В., 1976, Gabella G., 1994, 2002, Stanghellini V., et al, 2007) и бронхиального дерева (Barnes P.J., 2003, 2006, Halayko A.J., et al, 2003). Однако эти данные не позволяют оценить реактивные изменения структуры популяции и значение различных типов миоцитов в адаптивных реакциях.

Таким образом, в литературе не удалось обнаружить сведений, дающих точное представление о структуре популяции ГМК и характере ее реактивных перестроек в гладкой мышечной ткани бронхов и тонкой кишки. Следовательно, представляется актуальным проведение комплексного сравнительного анализа ГМТ висцеральных органов (бронхов и тонкой кишки) лабораторных животных в норме и в процессе развития компенсаторно-приспособительных реакций с позиции клеточно-дифферонной организации ткани.

Цель работы. Изучить структурно-функциональные характеристики гладкой мышечной ткани висцеральных органов лабораторных животных (крыс) в условиях физиологической нормы и выяснить закономерности ее реактивной трансформации.

Задачи исследования.

4. Отработать методику ферментной диссоциации для получения изолированных гладких мышечных клеток, позволяющую сохранять их нормальные физиологические параметры. Провести анализ изменения цитоплазматического кальция в разных фенотипах гладких миоцитов при стимуляции сокращения.

Научная новизна исследования.

Впервые с помощью анализа изолированных гладких миоцитов бронхов и тонкой кишки установлено, что одним из основных механизмов компенсаторно-приспособительных реакций гладкой мышечной ткани висцеральных органов является динамичное изменение структуры клеточной популяции.

Впервые отработана методика ферментной диссоциации гладких миоцитов тонкой кишки для получения живых изолированных клеток. Проведены цитофизиологические исследования базального уровня цитоплазматического кальция в изолированных гладких мышечных клетках и механизма регуляции сократительной активности их разных фенотипов.

Научно-практическая значимость работы.

Полученные морфометрические, цитоспектрофотометрические, электронно- микроскопические и иммуноцитохимические данные о механизмах регуляции функций гладкой мышечной ткани интактной тонкой кишки и при реактивных изменениях, обусловленных обтурационной непроходимостью, могут быть использованы в научно-практической работе при изучении патогенеза ряда заболеваний тонкой кишки (обтурационная непроходимость), а также для разработки и реализации новых методов лечения.

Разработан и апробирован новый метод получения изолированных гладких мышечных клеток, позволяющий сохранять их нормальные физиологические параметры. Использование этой методики можно рекомендовать в практику научных лабораторий для проведения широкого круга цитологических исследований.

Материалы исследования включены в методическое пособие «Материалы итогового контроля студентов по цитологии, общей и частной гистологии».

Основные положения, выносимые на защиту.

2. Состояние гиперконтрактации гладкой мышечной ткани бронхов вызывает изменение структуры популяции. Бронхоспастическая реакция стимулирует метаболическую активность малых миоцитов и вызывает реактивную деградацию больших клеток в гладкой мышечной ткани бронхов.

3. При развитии экспериментальной обтурационной непроходимости уровень реактивной трансформации гладкой мышечной ткани разных отделов тонкой кишки имеет существенные различия, обусловленные характером изменения функциональной нагрузки.

4. Разные фенотипы гладких миоцитов характеризуются аналогичными параметрами изменения уровня цитоплазматического кальция при стимуляции сокращения.

Внедрение в практику.

Полученные данные включены в учебную программу при изложении материала по темам «Мышечные ткани», «Дыхательная система», «Пищеварительная система» на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии и нормальной физиологии Северного Государственного Медицинского Университета. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 2 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, главы по материалу и методам исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и библиографии, включающей 248 источников, из них 56 отечественных авторов и 192 иностранных. Диссертация содержит 16 таблиц, 62 рисунка, включающих микрофотографии. Работа изложена на 166 страницах машинописного текста.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Бармина, Анастасия Олеговна

ВЫВОДЫ

1. Гладкая мышечная ткань в составе стенки бронхов и тонкой кишки имеет единый принцип структурной организации и представляет собой сложно организованную клеточную популяцию, в составе которой присутствуют различающиеся по морфометрическим и метаболическим характеристикам малые, средние и большие гладкие миоциты. Маркерными протеинами висцеральной гладкой мышечной ткани лабораторных животных являются а-гладкомышечный актин, гладкомышечный миозин и десмин. Экспрессия данных протеинов в гладкой мышечной ткани осуществляется вне зависимости от ее видовой или органной принадлежности.

2. Различия морфо-функциональной организации гладкой мышечной ткани бронхов и тонкой кишки определяются функциональными потребностями данных органных систем. В воздухоносных путях они детерминированы функцией регуляции воздушных потоков, а в тонкой кишке- характером пропульсивной перистальтики.

4. Состояние гиперконтрактации при бронхоспастическом синдроме является фактором, вызывающим развитие деструктивных изменений, преимущественно в субпопуляции больших миоцитов, представляющих терминальное звено миобластического дифферона. На субклеточном уровне в этих клетках наблюдаются изменения, определяющие их элиминацию из популяции гладких миоцитов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Бармина, Анастасия Олеговна, Санкт-Петербург

1. Автандилов, Г.Г. Медицинская морфометрия / Г.Г. Автандилов. М.: Медицина. -1990. -383с.

2. Агроскин, JI.C. Цитология / JI.C. Агроскин, Г.В. Папаян. -1977. -С.88.

3. Адо, А.Д. О некоторых механизмах нарушения бронхиальной проходимости / А.Д. Адо // Клиническая медицина. 1989. -Т. 67, №2. -С.23-28.

4. Баженов, Д.В. Межклеточные взаимоотношения в мышечных тканях пищевода / Д.В. Баженов // Арх. Пат. -1987. -Т.93, вып. 8. -С.77-82.

5. Белов, JI.H. Получение изолированных клеток методом щелочной диссоциации фиксированных формалином тканей / JI.H. Белов, М.Е. Коган, Т.Я. Леонтьева // Цитология. -1975. -Т.17, №2. -С.1332-1338.

6. Богач, П.Г. Моторная деятельность тонкого кишечника. Физиология пищеварения / Под ред. В.Н. Черниговского. Л.: Наука. -1974. -С.474-522.

7. Богач, П.Г. Алгоритмические и автоматные модели деятельности гладких мышц / П.Г. Богач, Л.В. Решодько // Киев.: Наукова думка.-1979.

8. Бродский, В.Я. Измерение абсолютного числа клеток в сердце и печени. Количественное сохранение белков и ДНК в изолированных клетках. / В.Я. Бродский, Н.Н. Цирекидзе, М.Е. Коган и др. -1983. -265с.

9. Брумберг, В. Использование амидочерного в цитофотометрическом исследовании клеточных протеинов / В. Брумберг, Л.З. Певзнер // Цитология. -1972. -Т. 14, №5, -С.674-676.

10. Быков, В.Л. Основы частной гистологии / В.Л. Быков. Спб: СЩИТИС, 1997.-Т. 1-2.-300с.

11. Вейбель, Э.Р. Морфометрия легких человека / Э.Р. Вейбель. М.: Медицина, 1970.-270с.

12. Гансбургский, А.Н. Пролиферативные свойства клеточных дифферонов сосудистой стенки / А.Н. Гансбургский, А.В. Павлов // Морфология. —1998. №2. -С.66-69.

13. Гладкий, А.П. Гистогенез гладкой мышечной ткани стенки аорты и тонкой кишки / А.П. Гладкий // В кн.: Реактивность и пластичность тканей. -М., Д., Гос. изд-во мед. литерат., труды Лен. сан.- гиг. Мед. ин-та. -1953. —Т.6. —С.246-263.

14. Гладкий, А.П. Реактивность гладкой мышечной ткани толстой кишки в условиях экспериментальной непроходимости / А.П. Гладкий, Д.В. Баженов // Арх.анат. -1976. -Т.71.№7, -С.47-51.

15. Говырин, В.А. Формирование мышечного и нервного компонентов бедренной артерии у собак в раннем постнатальном онтогенезе / В.А. Говырин, Е.В. Озирская, P.M. Рейдлер // Арх. Анат. -1983. -Т.84. -вып. 6. -С.38-39.

16. Гриппи, М. Патофизиология легких / М. Гриппи -М.: Бином, 1997. —332с.

17. Данилов, Р.К. Функциональная морфология миосателлитов в онтогенезе высших позвоночных и человека // Арх.анат. -1982. №10. —С.71-78.

18. Данилов, Р.К. Процессы пролиферации и дифференцировки в развитии мионейральной ткани у птиц / Р.К. Данилов, Э.Б. Ишмеева // Арх. анат. —1989. -Т.97, №10. -С.56-62.

19. Данилов, Р.К. Очерки гистологии мышечных тканей. -Уфа. Башкортостан.-1994. -50с.

20. Евдокимов, И.Р. К вопросу о влиянии повышения осмолярности внеклеточной среды на ультраструктуру гладких мышечных клеток сосудов / И.Р. Евдокимов, И.В. Фролькис // Арх анат. -1980. -Т.78. -вып. 1. -С.78-82.

21. Есипова, И.К. Патологическая анатомия легких / И.К. Есипова. — М.: Медицина, 1976.-101с.

22. Есипова, И.К. Структурно-функциональные особенности крупных и мелких бронхов и различия, возникающих в них воспалительных реакций / И.К. Есипова, Ю.Г. Алексеевских // Арх. пат. -1994. -Т.56, №4. -С.6-8.

23. Заварзин, А.А. Основы частной цитологии и сравнительной гистологии многоклеточных животных / А.А. Заварзин. Л.: Наука. -1976. -С. 236.

24. Зашихин, А. Л. Ультраструктура межклеточных контактов гладких миоцитов дыхательных путей // Арх.анат. -1988. -Вып. 12. -С.49-54.

25. Зашихин, A.JI. Структурно-метаболический анализ мышечной ткани бронхов в условии повышенной функциональной нагрузки легких / А.Л. Зашихин, Ю.В. Агафонов // Архангельск, Архангельский мед.ин-т, -1994. -С. 10. -Деп. в ВИНИТИ, №488-1394.

26. Зашихин, А. Л. Динамика популяции мышечных клеток воздухоносных путей при изменении функциональной нагрузки легких / А. Л. Зашихин, Ю.В. Агафонов // Пульмонология 1994. -№ 3. - С.76-81.

27. Зашихин, А.Л., Агафонов Ю.В., Лисишников Л.В., патент РФ на изобретение №2104524 от 23.05.94. «Способ получения препаратов изолированных клеток»

28. Зашихин, А.Л. Экспрессия виментина при дифференцировке некоторых клеточных систем развивающихся легких / А.Л. Зашихин, В.М. Михайлов // Морфология. -1996. -Т. 109. № 1. -С.63-65.

29. Зашихин, А.Л. Гладкая мышечная ткань бронхов (особенности гистогенеза) / А.Л. Зашихин, Ю.В. Агафонов // Морфология. 1997. - Том.111. - № 1. -С.75-81.

30. Зашихин, А.Л. Морфометрическая и ультраструктурная характеристика гладкой мускулатуры бронхов при экспериментальном бронхоспазме / А.Л. Зашихин, Ю.В. Агафонов, А.Л. Черняев // Архив патологии. 1997.- Том 59, № 2. - С.38-41.

31. Зашихин, А.Л. Структура популяции гладких миоцитов (аспекты внутриорганной организации гладкой мышечной ткани) / А.Л. Зашихин, Ю.В. Агафонов // Морфология 1997. -Том.112, № 4. -С.61-67.

32. Зашихин А.Л., Селин Я. Висцеральная мышечная ткань // Архангельск-Умео.-2001.-170с.

33. Зашихин, А.Л. Морфо-функциональная организация, гистогенез и реактивность гладкой мышечной ткани бронхов: Автореф. дис. докт. мед. наук / А.Л. Зашихин; Архангельск, 1994. - 36с.

34. Катинас, Г.С. О нахождении стандартной ошибки среднего с учетом изменчивости признака в пределах организма / Г.С. Катинас, В.И. Булгак, Е.Н. Никифорова и др. // Арх. анат. -1969. -Т.57, №9. -С.99-104.

35. Катинас, Г.С. Некоторые способы оценки пространственной и временной организации тканей // Временная и пространственная организация тканей. — JL: Изд. 1-го ЛМИ. -1981. -С.7-25.

36. Кауфман, О.Я. Сосудистая стенка и сосуды как система. Гладкие мышечные клетки кровеносных сосудов в норме и при изменении гемодинамики // Очерки по гемодинамической перестройке сосудистой стенки. М.: Медицина, 1971. -С. 19-44.

37. Кауфман, О.Я. Реакция гладких мышечных клеток кровеносных сосудов на увеличение функциональной нагрузки / О.Я. Кауфман, В.Д. Помойнецкий // Бюл. Экспер. Биол. -1974. -Т.78. -№7. -С. 113-116.

38. Кауфман, О.Я. Гипертрофия и регенерация гладких мышц / О.Я. Кауфман. -М.: Наука, 1979.-183с.

39. Кауфман, О.Я. Гладкая мышечная ткань / Структурные основы адаптации и компенсации нарушений функций // Под ред. Д.С. Саркисова. М.: Медицина, 1987. -С.131-153.

40. Кириллов, О.И. Процессы клеточного обновления и роста в условиях стресса / О.И. Кириллов. М.: Наука. -1977. -117с.

41. Клишов, А.А. Процессы пролиферации и дифференцировки в гистогенезе скелетной мышечной ткани у человека / А.А. Клишов, Р.К. Данилов // Арх. анат. -1980.-В.7. -С.37-45.

42. Клишов, А.А. Гладкие мышечные клетки (актуальные вопросы ультраструктурной организации) / А.А. Клишов, A.JI. Зашихин // Арх. анат. -1989. -Вып.З. -С.82-92.

43. Количественные методы исследования функциональной активности клеток: метод, рекомендации // Сост. Данилов Р.К., Сперанский В.В. -Уфа. -1988. -32с.

44. Кнорре, А.Г. Эмбриональный гистогенез / А.Г. Кнорре. JL, Медицина, -1971.-432с.

45. Мотавкин, П.А. Адренергические нейромышечные связи в артериях мозга птиц / П.А. Мотавкин, Г.Г. Божко // Архив анатомии. -1985. -С.367.

46. Нанаев, А.К. Распределение миозина, десмина и виментина в ГМК эмбриональных сосудах человека / А.К. Нанаев, В.П. Ширинский, Г.К. Бирюков // Бюлл. Экспер. Биологии и медицины. -1990. -Вып.8. -С.213-218.

47. Пирс, Э. Гистохимия теоретическая и прикладная / Э. Пирс. М.: Медицина, 1962. -226с.

48. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных: Применение пакета прикладных программ / О.Ю.Реброва // Медиа Сфера, 2006. -305с.

49. Романова, J1.K. Регенерация легких в эксперименте и клинике / JI.K. Романова. -М.: Медицина, 1971. -198с.

50. Румянцев, П.Н. Морфологические аспекты дифференцировки и пролиферации в гистогенезе скелетной, сердечной и гладких мышц позвоночных / П.Н. Румянцев, H.JI. Ерохина // Проблемы миогенеза. JL: Наука. -1981. -С. 2250.

51. Уголев, А.Н. Некоторые особенности пищеварения и их значение в формировании пищеварительной системы / А.Н. Уголев, А.А. Груздков, П. Де Лей и др // Физиол. Журн. СССР. -1974. -Т.60. -С.240.

52. Фролькис, А.В. Двигательная активность толстой кишки. // Физиология пищеварения / Под ред. В.Н. Черниговского. JL: Наука. -1974. -С.531-541.

53. Хесин, Я.Е. Размеры ядер и функциональное состояние клеток / Я.Е. Хесин. -М.: Медицина. -1967. -225с.

54. Черняев, A.JI. Морфология и морфометрическая характеристика бронхоспастического синдрома при хроническом бронхите и бронхиальной астме / A.JI. Черняев, А.А. Жаворонков // Арх. патол. -1981.-Т. 18, ЖЗ.-С.60-66.

55. Чучалин, А.Г. Бронхиальная астма / А.Г. Чучалин. -М.: Агар. -1997. — Т.2. -400с.

56. Ямшиков, Н.В. Структурная организация мышечной ткани сердца и нарушение миогенеза в различные периоды развития: Автореф. дис. д-ра мед. наук / Н.В. Ямшиков: -ИКЗМ. -Новосибирск. -1991. -26с.

57. Amano, J. Proliferation of smooth muscle cells in acute allograft vascular rejection / J. Amano, S. Ishiyam, T. Nishikawa et al. // Thorac. Cardiovasc. Surg. -1997. -V.113. -P. 19-25.

58. Amrani, Y. Modulation of calcium homeostasis as a mechanism for altering smooth muscle responsiveness in asthma / Y. Amrani, R.A. Panettiery // Opinion in allergy and clinical immunology. -2002. -V.2. -P. 39-45.

59. An, S.S. Airway smooth muscle dynamics: a common pathway of obstruction in asthma / S.S. An, T.R. Bai, J.H. Bates // Eur Respir J. -2007. -V.29. -P.834-860.

60. An, S.S. Mechanical signals and mechanosensitive modulation of intracellular Ca2+ in smooth muscle / S-.S. An, Ch-M. Hai // Cell physiology. -2000. V.279. -P.1375-1384.

61. Allen, B.G. The biochemical basis of the regulation of Smooth muscle contraction / B.G Allen, M.P. Walsh // Trends Biochem Sci. -1994T -V.19, №9. -P.362-368.

62. Araujo, B.B. Extracellular matrix components and regulators in the airway smooth muscle in asthma / B.B. Araujo, M. Dolhnikoff, L.F.F. Silva et al. // Eur Respir J. -2008. -V.32. -P.61-69.

63. Asselt, E. Cell length measurement in longitudinal smooth muscle strips of the pig urinary bladder / E. Asselt, R. Chot, R. Mastrigt // Urol Res. -1993. -V.21. -P.253-256.

64. Barnes, P.J. Pathophysiology of asthma / P J. Barnes // Eur Respir Monograph. -2003. -V.8, Monograph 23. P.84-113.

65. Barnes, P.J. Cells and mediators of chronic obstructive pulmonary disease / P.J. Barnes, M.G Cosio // Eur Respir Monograph. -2006. -V.l 1, Monograph 38. -P. 130158.

66. Barnes, P .J. Pharmacology of airway smooth muscle / P.J. Barnes // Am J Respir Crit Care Med. -1998. -V.158. -P. 123-132.

67. Barajas-Lopez, C. Pacemaker activity recorded in interstitial cells of Cajal of the gastrointestinal tract / C. Barajas-Lopez, I. Berezin, E.E. Daniel et al. // Am J Physiol. -1989. —V.257 (4 Pt 1). -P.L830-L835.

68. Bass, P. The relationship of electric activity to contraction / P. Bass // Gastrointestinal motility. -N.Y. -London. -1971. -P.59.

69. Bassotti, G. Loss of interstitial cells of Cajal network in severe idiopatic gastroparesis / G. Bassotti, G. Bellone, L. Dughera et al. // World J Gastroenterology. -2006.-V. 14.-P. 6172-6177.

70. Barany, K. Involvement of calponin and caldesmon in sustained contraction of arterial smooth muscle / K. Barany, E. Polyak, M. Barany // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1992. -V. 187. -P.847-852.

71. Barrett, T.B. Polyploid nucley in human artery wall smooth muscle cells / T.B. Barrett, P. Sampson, G.K Owens // Proc Nat Acad Sci USA. -1983. -80. -P.882-885.

72. Bergner, A. Acetylcholine-induced calcium signaling and contraction of airway smooth muscle cells in lung slices / A. Bergner, M.J. Sanderson // J. Gen. Physiology. -2002.-V.l 19.-P. 187-198.

73. Bertoni, S. Plasticity of rat small intestine after removal of a chronic mechanical obstruction / S. Bertoni, G. Gabella, V. Ballabeni et al. // Neurogastroenterol Motil. -2006.-V. 18. -P.862-872.

74. Bertoni, S. Hypertrophy of mucosa and serosa in the obstructed intestine of rats / S. Bertoni, G. Gabella // J Anat. -2001. -V. 199(Pt 6). -P. 725-734.

75. Bin, Li. Effects of protopine on intracellular calcium and the PRC activity of rat aorta smooth muscle. / Li. Bin, W. Qin, S. Jig-Shan et al. // Acta pharmacological Sinica. -2005. -V.57 (2). -P.240-246.

76. Birukov, K.G. Expression of calponin in rabbit and human aortic smooth muscle cells / K.G. Birukov, O.V. Stepanova, A.K. Nanaev et al. // Cell Tissues. -1991. -66(3).-P. 579-84.

77. Blaes, N. Isolation of two morphologically distinct cell lines from rat arterial smooth muscle expressing high tumorigenic potentials / N. Blaes, M-C. Bourdillon, J-M. Daniel -Lamaziere et al // In vitro Cell Dev. Biol. -1991. -V. 27. -P.725-734.

78. Bochaton-Piallat, M.L. Cultured aortic smooth muscle cells from newborn and adult rats showed distinct cytoskeletal feature / M.L. Bochaton-Piallat, F. Gabbiani, R. Patricia et al. // Differentiation. -1992 -V. 49. -P. 175-185.

79. Borrione, A.C. Myosin heavy-chain isoforms in adult and developing rabbit vascular smooth muscle / A.C. Borrione, A.M. Zanellato, G. Scannapieco et al. // Eur J Biochem. -1989. -V. 183(2). -P.413-7.

80. Boulet, L-P. A new series on airway remodeling / L-P. Boulet, P.J. Sterk // Eur Respir J. -2007. -V. 29, N.2. -P.231-231.

81. Bourne, H.R. G-proteins and GPCrs: from the beginning / H.R. Bourne // Ernst Schering Found Symp Proc. -2006. -V. 2. -P. 1-21.

82. Bozler, E. Some questions of general importance for the mechanics of muscle contraction / E. Bozler // Prog Clin Biol Res. -1990. -V. 327. -P. 399-407.

83. Brewster, C.E. Myofibroblast and subepithelial fibrosis in bronchial asthma / C.E. Brewster, P.H. Howarth, R. Djukanovic et al. // Am J Respir Cell Mol Biol. -1990. -V.3. -P.507-511.

84. Burns, A.J. Interstitial cells of Cajal mediate inhibitory neurotransmission in the stomach / A.J. Burns, A.E. Lomax, S. Torihashi et al. // Proc Natl Acad Sci USA. -1998.-V.23 (21). -P.12008-12013.

85. Burnstock, G. Structure of smooth muscle and its innervation / G. Burnstock // Smooth muscle. -London: E.Arnold Publishers. Ltd. -1970. -P. 1-70.

86. Campbell, J.H. Haemopoietic origin of myoblasts formed in the peritoneal cavity in response to a foreing body / J.H. Campbell, J.L. Efendy, C. Han et al. // J vase Res. -2000. -V.37 (5). -P.364-71.

87. Campbell, G.R. Arterial smooth muscle. A multifunctional mesenchymal cell / G.R Campbell, J.H. Campbell, J.A. Manderson et al. // Arch Pathol Lab Med. -1988. -V. 112.-P.977-986.

88. Capron, L. Effects of insulin on lipid synthesis by the rat thoracic aorta / L. Capron, J. Jarnet// Arterioscler-Thromb. -1991. -V. 11(1). -P.91-96.

89. Chan, V. Extracellular matrix regulates enhanced eotaxin expression in asthmatic airway smooth muscle cells / V. Chan, J.K. Burgess, J.C. Ratoff // Am J Respir Crit Care Med. -2006. -V.174. -P.379-385.

90. Chang, E.B. Intestinal water and electrolyte absorption and secretion / E.B. Chang // Transplant Proc. -1996. -V. 28 (5). -P.2679-2682.

91. Chitano, P. Relevance of classification by size to topographical differences in bronchial smooth muscle response / P. Chitano, S.B. Sigurdsson, A.J. Halayko et al. // J Appl Physiol. -1993. -75(5). -P.2013-2021.

92. Chung, S-S. Inhibition of carbachol-evoked oscillatory currents by the NO donor sodium nitroprusside in guinea-pig ileal myocytes / S-S. Chung, D-S. Ahn, H-G. Lee et al. //Exp Physiol. -2005. -V. 90(4). -P.577-586.

93. Chou, R.G. Assembly of contractile and cytoskeletal elements in developing smooth muscle cells / R.G. Chou, M.H. Stromer, R.M. Robson et al. // Dev Biol. -1992.-V.149 (2). -P.339-348.

94. Cogliandro, R.F. Chronic intestinal pseudo-obstruction / R.F. Cogliandro, R. De Giorgio, G. Barbara et al. // Best Pract Res Clin Gastroenterol. -2007. -V. 21(4). -P. 657-669.

95. Collins, E.M. Contraction of single vascular smooth muscle cells by phenylephrine at constant Ca2+.i / E.M. Collins, M.P. Walsh, K.G. Morgan //Am J Physiol. -1992. -V. 262 (3 Pt 2). -H. 754-762.

96. Cook, C.L. Developmentally timed expression of an embryonic growth phenotype in vascular smooth muscle cells / C.L. Cook, M.C.M. Weiser, P.E. Schwartz et al. // Circ Res. 1994. -V. 74. -P. 189-196.

97. Contard, F. Arterial smooth muscle cells phenotype in stroke-prone spontaneously hypertensive rats / F. Contard, A. Sabri, M. Glukhova et al. // Hypertension. -1991. -V.22, №5. -P.665-676.

98. Cuevas, P. Intracellular junction between smooth muscle in myointimal hyperplasia / P. Cuevas, D. Gutterus, D Reimers // Acta anat. -1982. -V.l 14. -N.l. -P.22-24.

99. Davies, P. Peripheral and central Vascular Smooth Muscle Cells from rat lung exhibit different cytoskeletal protein profiles but similar growth factor requirements / P. Davies, W. Patton // J of Cellular Physiol. -1994. -V. 159. -P. 399-406

100. Dingemans, K.P. Ultrastructure of the normal human aortic media / K.P. Dingemans, N. Jansen, A.E. Becker // Virch. Arch. -1981. -V.92. -P. 199-216.

101. Der-Silaphet, T. Interstitial cells of cajal direct normal propulsive contractile activity in the mouse small intestine / T. Der- Silapher, J.Malysz, S.Hagel et al. // Gastroenterology. 1998. -V.l 14 (4). -P. 724-736.

102. Dite, P. Intestinal obstruction and perforation- the role of the gastroenterologist / P. Dite, J. Lata, I. Novotny // Dig Dis (Digestive Diseases). -2003. -Vr21(l)7^P:63-67.

103. Dixon, E.R. Effect of dexomethasone on bovine airway smooth muscle cell proliferation / E.R. Dixon, J.A. Weinberg, D.B. Lew // J Asthma. -1999. -V.36 (6). -P.519-525.

104. Dixon, J.S. The musculature of the human renal calices, pelvis and upper ureter / J.S. Dixon, J.A Gosling // J Anat. -1982. -V. 135, №1. -P.129-137.

105. Donnelly, G. The myogenic component in distention-induces peristalsis in the guinea pig small intestine / G. Donnelly, T. Jackson, K. Ambrous et al. // Am J Physiol Gastrointestin Liver Physiol. -2001. -280 (3). -G.491-500.

106. Du, W. Excitation-contraction coupling in airway smooth muscle /W. Du, T.J. McMahon, Z.S. Zhang et al. // J Biol Chem. -2006. -V.281 (40). -P.30143-30151.

107. Duquette, R.A. Vimentin- positive C-KIT -negative interstitial cells in human and rat uterus: a role in pacemaking? / R.A. Duquette, A. Shmygol, C. Vaillant et al. // Biology of reproduction. -2005. -72. -P. 276-283.

108. Durand-Arczynska, W. Caldesmon, calpoin and a smooth muscle actin expression in subcultured vascular smooth cell from human airway / W. Durand-Arczynska, N. Marmy // Histochemistry. -1993. -V. 100 (6). -P.465-471.

109. Ebina, M. Cellular hypertrophy and hyperplasia of airway smooth muscles underlying bronchial asthma/ a 3-D morphometric study / M. Ebina, T. Takahashi, T. Chiba et al. // Am Rev Respir Dis. -1993. -V.148. -P.720-726.

110. Elwood, W. Characterization of allergen-induced bronchial hyperresponsiveness and airway inflammation in actively sensitized brown-Norway rats / W. Elwood, J.O. Lotvall, P.J. Barnes et al. // J Allergy Clin Immunol. 1991. - V. 88(6) -P. 951-960.

111. Elwood, W. Allergen-induced airway hyperresponsiveness in Brown-Norway rat: role of parasympathetic mechanisms / W. Elwood, T. Sakamoto, P.J. Barnes et al // J Appl Physiol. -1993. -75(1). -P. 279-284.I

112. Essine, K. Indirect coupling between Cavl.2 channels and ryanodine receptors to generate Ca2+ sparks in murine arterial smooth muscle cells / K. Essine, A. Welling, F. Hofmann et al. // J Physiol. -2007. -V.584 (Pt 1). -P. 205-219.

113. Fang, S. Distribution of NADPH diaphorase in intramural plexuses of cat and opossum esophagus / S. Fang, J. Chrisstensen // J Auton Nerv Syst. -1994. -46(1-2). -P.123-133.

114. Farruga, G. Calcium currents in human and canine jejual circular smooth muscle cells / G. Farruga, A. Rich, J.L Rae et al. // Gastroenterology. -1995. -V.109. -P.707-717.

115. Fraser, D.G. Systemic complement system depletion does not inhibit cellular accumulation in antihistamine pretreated allergic guinea pig lung / D.G. Fraser, J.E. Regal // Int Arch Allergy Immunol. // -1996. -V. 109(2). -P. 150-160.

116. Freyer, A.M. Effects of growth factors and extracellular matrix on survival of human airway smooth muscle cells / A.M. Freyer, S.R. Johnson, I.P. Hall // Am J Respir Cell Mol Biol. -2001. -V. 25. -P.569-576.

117. Frid, M.G. Smooth muscle cells isolated from discrete compartments of the mature vascular media exhibit unique phenotypes and distinct growth capabilities /

118. M.G. Frid, A.A. Adashev, E. Dempsey et al. // Circ -Res. -1997. -V. 81(6). -P.940-952.

119. Frid, M.G. Multiple Phenotypically Distinct Smooth Muscle Cell Populations Exist in the Adult and Developing Bovine Pulmonary Arterial Media In vivo / M.G. Frid, E.P. Moiseeva, K.R. Stenmark // Circulation Research. -1994. -V.675 (4). -P.669-681.

120. Frid, M.G. Phenotypic changes of human smooth muscle cells during development: late expression of heavy caldesmon and calponin / M.G. Frid, B.V. Shekhonin, V.E. Koteliansky et al. // Dev Biol. -1992. -V.153 (2). -P. 185-193.

121. Fry, G.N. Freeze stadies of nexuses between smooth muscle cells. Close relationship to sarcoplasmic reticulum / G.N. Fry, C.N. Devine, G. Burnstock // J Cell Biol. -1977. -V.72.-P.26-34. ,o

122. Gabella, G. Structure of smooth muscle / G. Gabella // In Smooth muscle. -London. -Arnold. -1981. -P. 1-46.

123. Gabella, G. Structural apparatus for force transmission in Smooth muscle / G. Gabella // Physiol. Rev. -1984. -V.64, N.3. -P.455-457.

124. Gabella, G. Development of smooth muscle: ultrastructural study of the chick embryo gizzard / G. Gabella // Anat Embryol (Berl). -1989. -V.180 (3). -P.213-226.

125. Gabella, G. Reversal of muscle hypertrophy in the rat urinary bladder after removal of ureteral obstraction / G. Gabella, B. Uvelius // Cell Tissue Res. -1994. -Vol. 277. -P.333-339.

126. Gabella, G. Development of visceral smooth muscle / G. Gabella // Results Probl Cell Differ. -2002. -V.38. -P.l-37.

127. Garfield, R.E. Possible role of gap-junction inactivation of myometrium during parturition / R.E. Garfield, S.M. Sims, S. Kennon // Amer J Physiol. -1978. -V.5. -P.169-179.

128. Gayan-Ramirez, G. Respiratory and skeletal muscles in chronic obstructive pulmonary disease / G. Gayan-Ramirez, N. Koulouris, J. Roca et al. // Eur Respir Monograph. -2006. -V.l 1, Monograph 38. -P.201-223.

129. Goldberg, I.D. Isolation and culture of a tetraploid subpopulation of smooth muscle cells from the normal rat aorta / I.D. Goldberg, E.M. Rosen, H.M. Shapiro // Science. -1984. -V. 226. -P.559-561.

130. Golovina, V.A. Preparation of primary cultured mesenteric artery smooth muscle cells for fluorescent imaging and physiological studies / V.A. Golovina, M.P. Blaustein //Nat Protoc. -2006. -V.l, N.6. -P.2681-2687.

131. Gosling, J.A. The musculature of the human renal calices? Pelvis and upper ureter / J.A. Gosling // J Anat. -1982. -V.l 16 (1). -P.77-92.

132. Goyal, R.K. The enteric nervous system / R.K. Goyal, I. Hirano // N Engl J Med.-1996.-V. 334 (17).-P.l 106-1115. —• 2+ * •

133. Grynkiewicz, G. A new generation of Ca indicators with greatly improvedfluorescence properties / G. Grynkiewicz, M. Poenie, R.Y Tsien // Journal of Biological Chemistry. -1985. -V. 260. -P.3440-3450.

134. Guarino, M.P. Structural immaturity of the pylorus muscle in infantile hypertrophic pyloric stenosis / M.P. Guarino, H. Shima, P. Puri // Pediatr Surg Int. — 2000. -V.l6 (4). -P.282-284.

135. Guarino, M.P. Impaired contractility of colonic muscle cells in a patient with chronic intestinal pseudo-obstruction / M.P. Guarino, S.Carotti, R. Cogliandro et al. // Dig Liver Dis. -2007. -V. 10. -P. 225-229.

136. Halayko, A J. Distribution of phenotypically disparate myocytes subpopulations in airway smooth muscle / A.J. Halayko, G.L. Stelmack, A. Yamasaki et al. // Can J Physiol Pharmacol -2005. -V. 83. -P.l04-116.

137. Halayko, A.J. Mechanisms of inflammation-mediated airway smooth muscle plasticity and airways remodelling in asthma / A.J. Halayko, Y. Amrani // Respir Physiol Neurobiol. -2003. -V. 137. -P.209-222.

138. Halayko, A.J. Molecular mechanisms of phenotypic plasticity in smooth muscle cells / A.J. Halayko, J. Solway // J Appl Physiol. -2001. -V. 90. -P.358-368.

139. Halayko, A.J. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes / A.J. Halayko, B. Camoretti-Mercado, S.M. Forsythe et al. // Am J Physiol. -1999. -V. 276. -P. 197-200.

140. Halayko, A.J. Markers of airway smooth muscle cell phenotype / A.J. Halayko, H. Salari, X. Ma et al. // Am J Phyiol. -1996. -270(6 Pt 1). -LI040-1051.

141. Halayko, A.J. Potential role for phenotypic modulation of bronchial smooth muscle cells in chronic asthma / A.J. Halayko, N.L Stephens // Can J Physiol Pharmacol. -1994. -V. 72 (11). -P.1448-1457.

142. Harnett, K.M. Calcium-dependent and calcium-independent contractions in smooth muscles / K.M. Harnett, P. Biancani // Am J Med. -2003. -V. 115. -P. 24-30.

143. Haudenschild, C.C. Effects of hypertension on migration and proliferation of smooth muscle in culture / C.C. Haudenschild, J, Grunwald, A.V. Chobanian // Hypertension. -1985. -V. 7 (3 Pt 2). -1101-104.

144. Haust, D. The nature of bi- and trinuclear cells in atherosclerotic lesions in man / D. Haust // Atherosclerosis. -1980. -V.36. -P.365-377.

145. Henderson, R.M. Cell contacts in duodenal smooth muscle layer / R.M. Henderson, Dichon, D. Paton // Amer J Physiol. -1971. -V.211. -P.564-574.

146. Hedin, U. Induction of tenascin in rat arterial injury. Relationship to altered smooth muscle cell phenotype / U. Hedin, J. Holm, G.K. Hansson // Am J Pathol. -1991. -V. 193 (3). -P.649-656.

147. Henderson, D.M. A new example of a morphine-sensitive neuro-effector junction: adrenergetic transmission in the mouse vas deferens / D.M. Henderson, J. Hughes, H.W. Kosterlitz // Br J Pharmacology. -1997. -V. 120 (4 Suppl). -P.396-398.

148. Hirota, S. Ionic mechanisms and Ca2+handling in airway smooth muscle / S. Hirota, P. Helli, L.G. Janssen // Eur Respir J. -2007. -V. 30, N.l. -P. 114-133.

149. Hirst, S.J. Differential effects of extracellular matrix proteins on human airway smooth muscle cell proliferation and phenotype / S.J. Hirst, C.H. Twort, Т.Н. Lee // Am J Respir Cell Mol Biol. -2000. -V. 23. -P. 335-344.

150. Howarth, P.H. Synthetic responses in airway smooth muscle / P.H. Howarth, A.J. Knox, Y. Amrani et al. // J Allergy Clin Immunol. -2004. -V. 114. -P. 32-50.

151. Huizinga, J.D. Neural injury, repair and adaptation in the GI tract. IV Pathophysiology of GI motility related to interstitial cells of Cajal / J.D. Huizinga // Am J Physiol. -1998. -V. 275 (3 Pt 1). -P.381-396.

152. James, A.L. The mechanics of Airway Narrowing in Asthma TAUT James, P.D. Pare, J.C. Hogg // Am Rev Respir Dis. -1989. -V.139. -P.242-246.

153. Johnson, P.R. Extracellular matrix proteins modulate asthmatic airway smooth muscle cell proliferation via an autocrine mechanism / P.R. Johnson, J.K. Burgess, P.A. Underwood et al. // J Allergy Clin Immunol. -2004. -V. 113. -P. 690-696.

154. Joelle, M.C. Dick. Interplay between nitric oxide and vasoactive intestinal polypeptide in the pig gastric fundus smooth muscle / Joelle M.C. Dick, Romain A. Lefebvre // Eur J of Pharmacology. -2000. -V. 397. -P.389-397.

155. Kittel, A. Ecto-ATPases and 5- nucleotidases in the caveolae of smooth muscle. Enzyme-histochemical evidence may indicate a role for caveolae in neurotransmission / A. Kittel, E. Bacsy // Cell Biol Int. -1994. -V. 18(9). -P.875-879.

156. Khromov, A. Ca -free contraction of the skinned guinea pig taenia coli preparation with unphosphorylated myosin light chains / A. Khromov, L. Srebnitskaya // J muscle Res and cell Motil. -1992. -V. 13. -№2. -P.238-239.

157. Коскх, М.М. The modulation of smooth muscle cell phenotype is an early event in human aorto-coronary saphenous vein grafts / М.М. Коскх, B.A. Cambier, H.E. Bortier et al. // Virchows-Arch-A-Pathol-Anat-Histopathol. -1992. V. 420 (2). -P.155-162.

158. Kottegoda, S.R. Peristalsis of the small intestine / S.R. Kottegoda // Smooth muscle. -London. -1970. -P.525-550.

159. Kovanen, V. Intramuscular extracellular matrix: complex environment and submucosal collagen in the asthmatic airway / V. Kovanen // Clin Exp Allergy. -1997. -V.27. -P.363-371.

160. Kuhn, C.I. The role of the myofibroblast in idiopathic pulmonary fibrosis: ultrastructural and immunohistochemical features of sites of activ extracellular matrix synthesis / C.I. Kuhn, J.A. McDonlad // Am J Pathol. -1991. -V. 138. -P.1257-1265.

161. Kuo, K.H. Ultrastructure of airway smooth muscle / K.H. Kilo, A.M. Herrera, C.Y. Seow // Respiratory Physiology and Neurobiology. -2003. -V. 137. -P.197-208.

162. La Mantia, J. Development changes in the plasma membrane of gizzard smooth muscle of chicen / J. La Mantia, S.A. Shafig // J Anat. -1982. -V.134. -N.2. -P.243-253.

163. Langen, R.C.J. Inflammation: friend of toe of muscle remodeling in COPD? / R.C.J. Langen, A.M.W.J. Schols // Eur Respir J. -2007. -V.30, N.4. -P.605-607.

164. Lisanti, M.P. Caveolin forms a hetero-oligometric protein complex that onteracts with an apical GPI-linked protein: implications for the biogenesis of caveolae / M.P. Lisanti, Z.L. Tang, M. Sargiacomo // J Cell Biol. -1993. -V. 123 (3). -P.55-604.

165. Lommatzsch, M. Airway dendritic cell phenotypes in inflammatory diseases of the human lung / M. Lommatzsch, K. Bratke, A. Bier et al. // Eur Respir J. -2007. -Vol.30, N.5. P.878-886.

166. Leung, S.-Y. Resolution of allergic airways inflammation but persistence of airway smooth muscle proliferation after repeated allergen exposures / S.-Y. Leung, P. Eynott, A. Noblew, et al. // Clin Exp Allergy -2004. -V. 34. -P.213-220.

167. Luft, Y.H. The structure and properties of the cell surface cift / Y.H. Luft // Int. Rev. Cytol. -1976. -V.45. -P.120-124.

168. Ma, Т. Signal pathways involved in emodin-induced concentration of smooth muscle cells rat colon / T. Ma, Q-H. Qi, J. Xu et al. // World J Gastroenterol. -2004. -V.10 (10). -P.1476-1479.

169. Malysz, J. Action potential generation in the small intestine of W mutant mice that lack interstitial cells of Cajal / J. Malysz, 1. Thuneberg, H.B. Mikkelsen et al. //Am. J. Physiol. -1996. -V. 271. -G387 G399.

170. Mansour, S. Structural changes in tracheal nerves and muscle associated with in vivo sensitization of guinea pigs / S. Mansour, E.E. Daniel // Respir. Physiol. -1988. -V.72. -P.283-294.

171. Marin, M.L. Human greater saphenous vein histologic and ultrastructural variation / M.L. Marin, R.E. Gordon, F.J. Veith et al. // Cardiovasc-Surg. -1994. -V. 2 (1). -P.56-62.

172. Martin, J.E. Myofibroblasts in hollow visceral myopathy- the origin of gastrointestinal fibrosis / J.E. Martin, M. Benson, M. Swash et al. // Gut. -1993. -V. 34 (7). -P.999-1001.

173. McCarron, J.G. Myogenic contraction by modulation of voltage-dependent calcium currents in isolated rat cerebral arteries / J.D. McCarron, C.A. Crichton, P.D. Langton et al. // J Physiol. -1997. -V. 498 ( Pt 2). -P.371-379.

174. McParland, B.E. Airway wall remodeling: friend or foe? / B.E. McParland, P.T. Macklem, P.D. Pare // J Appl Physiology. -2003. -V.95. -P.426-434.

175. Mehta, A.K. Effect of choline chloride in allergen-induced mouse model of airway inflammation / A.K. Mehta, S.N. Gaur, N. Arora et al. // Eur Respir J. -2007. -V.30, N.4. -P.662-671.

176. Mitchell, H.W. Increased responsiveness to cholinergic stimulation small compared to large cartilaginous bronchi / H.W. Mitchell, M.P. Sparrow // Eur Resp J. -1994. -7 (2).-P.298-305.

177. Moerch, U. Allergen-specific polyclonal antibodies reduce allergic disease in a mouse model of allergic asthma / U. Moerch, M. Hansen Haahr, N.J. Vest Hansen et al. // Int Arch Allergy Immunol. -2006. -V. 140 (3). -P. 261-269.

178. Morin, С. Organ-cultured airway explants: a new model of airway hyperresponsiveness / C. Morin, S. Proteau, E. Roussea et al. // Exp Lung Res. -2005. -V.31 (7).-P.719-744.

179. Moriya, M. Force-velocity characteristics of stomach muscle: a comparison between longitudinal and circular muscle strips / M. Moriya, E. Miyazaki // Comp Biochem Physiol A. -1985. -V. 81(3). -P.531-537.

180. Murakami, U. Contents of myofibrillar proteins in cardiac, skeletal and smooth muscles / U. Murakami, K. Uchida // J Biochem. -1985. -V. 98 (1). -P.187-197.

181. Neylon, C.B. Different electrical responses to Vasoactive Agonists in Morphologically Distinct Smooth Muscle Cell Types / C.B. Neylon, P.V. Avdonin, R.J. Dilley et al. // Circulation Research. -1994. -№75. -P.733-41.

182. Ngai, P.K. Inhibition of smooth muscle actin-activated myosin Mg ~ ATPase activity by caldesmon / P.K. Ngai, M.P. Walsh // J Biol Chem7-19847^:2597^1. P.13656-13659.

183. Ngai, P.K. The effects of phosphorylation of smooth muscle caldesmon / P.K. Ngai, M.P. Walsh // Biochem J. -1987. -V.244. -P.417-425.

184. Ohta, K. Immunohistochemical Identification and Characterization Smooth Muscle-like Cells in Idiopathic Pulmonary Fibrosis / K. Ohta, R.L. Mortenson, R.A.F. Clark et al. // Am J Respir Crit Care Med. -1995. -V.152. -P.1659-1665.

185. Owens, M.K. Cytokines increase proliferation of human intestinal smooth muscle cells: possible role in inflammation-induced stricture formation / M.K. Owens, M.B. Grishman//Inflammation. -1993. -17(4). -P.481-487.

186. Panattiery, R.A. Repeated allergen inhalations induce DNA synthesis in airway smooth muscle and epithelial cells in vivo / R.A. Panattiery, A.J. Reynold, Richard K. Murray et al. // Am J Physiol 274. -1998. -L.417-424.

187. Pasternak, C.A. The cell surface in relation to the growth cycle / C.A. Pasternak // J Theor Biol. -1976. -V.58. -P.365.

188. Paul, E.R. Embrionic chiken gizzard: expression of the smooth muscle regulatory proteins caldesmon and myosin light chain kinase / E.R. Paul, P.K. Ngai, M.P. Walsh // Cell Tissue res. -1995. -V. 279. -P.331-337.

189. Pauletto, P. Smooth-muscle-cell proliferation and differentiation in neointima formation and vascular restenosis / P. Pauletto, S.Sartore, A.C. Pessina // Clin Sci (Lond). -1994. -V. 87 (5). -P. 467-79.

190. Paulin, D. Desmin: a major intermediate filament protein essential for the structural integrity and function of muscle / D. Paulin, Z. Li // Exp Cell Res. -2004. -V. 301.-P. 1-7.

191. Pare, P.D. Airway wall remodeling in chronic obstructive pulmonary disease / P.D. Pare, T.R. Bai //Eur Respir Rev. -1996. -V.6. -№39. -P.259-263.

192. Perry, S.V. Calmodulin and calmodulin-binding proteins in brain / S.V. Perry, R.J. Grand // Biochem Soc Trans. -1980. -8(5). -P.487-489.

193. Perry, S.V. Mechanisms of contraction and the specialized protein components of smooth muscle / S.V. Perry, R.A. Grand // British Medical Bulletin. -1979. -V.70.1. P.418-439. "

194. Price, M.G. Expression of intermediate filament-associated proteins paranemin and sinemin in chicken development / M.G. Price, E. LoZalides // J Cell Biol. -1983. -V.97, №6. -P. 1860-1974.

195. Pusovsky, V. Non-contractile cells with thin processes resembling interstitial cells of cajal found in the wall of guinea-pig mesenteric arteries / V. Pusovsky, R.F. Mos, T.B. Bolton // Journal of physiology. -2003. -V. 552. -P.l 19-133.

196. Renda, T. Increased activation of p38 MARK in COPD / T. Renda, S. Baraldo, G. Pelaia et al. //Eur Respir J. -2008. -V.31, N.l. -P.62-69.

197. Reynolds, E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy / E.S. Reynolds // J.Cell.Biol. -1963. №17: -P. 208-212.

198. Roche, W.R. Subepithelial fibrosis bronchi of asthmatics / W.R. Roche, R. Beasley, J.H. Williams et al. // Lancet. -1989, №1. -P.520-524.

199. Roelofs, M. Contractility and phynotype transitions in serosal thickening of obstructed rabbit bladder / M. Roelofs, A.J. Wein, F.C. Monson // Appl. Physiol. -1995. -V.78, №.4. -P. 1432-1441.

200. Rosen, E.M. Strain and site dependence of polyploidization of cultured rat smooth muscle / E.M. Rosen, I.D. Goldberg, H.M. Shapiro // J Cell Physiol. -1986. -V.128. -P.337-341.

201. Rumessen, J.J. Pacemaker cells in the gastrointestinal tract: interstitial cells of Cajal / J.J. Rumessen, I. Thuneberg // Scand J Gastroenterol Suppl. -1996. -V. 216. -P. 82-94.

202. Sanders, K.M. Invited review: Mechanisms of calcium handling in smooth muscles / K.M. Sanders // J Appl Physiol. -2001. -V. 3. -P.1438-1449.

203. Sanders, K.M. A Case for Interstitial Cells of Cajal as Pacemakers and Mediators of Neurotransmission in the Gastrointestinal Tract / K.M. Sanders // Gastroenterology. -1996. -V. 111. -P. 492 515.

204. Schwartz, S.M. Derivation and properties of platelet-derived growth factor-independent rat smooth muscle cells / S.M. Schwartz, L. Foy, D. Bowel -Pore et al. // Am J Pathol. -1990. -V. 136. -P.1417-1428.

205. Sieck, G.C. Excitation-contraction coupling in Airway smooth muscle / G.C. Sieck, Y.S. Prakash, M.S. Kannan // Abstracts of the Annual Congress European respiratory society. -1998. -P. 2941.

206. Shapiro, S.D. Transgenic and gene-targeted mice as models for chronic obstructive disease / S.D. Shapiro // Eur Respir J. -2007. -V.29, N.2. -P. 375-378.

207. Shi, X.Z. Transcriptional regulation of inflammatory mediators secreted by human colonic circular smooth muscle cells / X.Z. Shi, S.K. Sarna // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. -2005. -V. 289 (2). -P.274-285.

208. Shirinsky, V.P. Contractile rabbit aortic smooth muscle cells in culture. Preparation and characterization / V.P. Shirinsky, K.G. Birukov, A.V. Sobolevsky et al. // Am J Hypertens. -1992. -V. 5 (6 Pt 2). -P.124S-130S.

209. Small, V.J. The contractile apparatus of smooth muscle / V.J. Small // Int Rev Cytol. -1995. -V.64. -P.257-306.

210. Somlyo, A.V. Smooth muscle myosin: regulation and properties / A.V. Somlyo, A.S. Khromov et al. // Philos Trans R Soc bond В Biol Sci. -2004. -V. 359 (1452). -P. 1921-1930.

211. Sparrow, M.P. Innervation and function of the distal airways in the developing bronchial tree of fetal pig lung / M.P. Sparrow, S.P. Warwick, A.W. Everett // Am J Resp Dis. -1995. -V. 13. -P. 518-525.

212. Stanghellini, V. Chronic intestinal pseudo-obstruction: manifestations, natural history and management / V. Standhellini, Cogliandro R.F., R. de Giorgio et al. // Neurogastroenterol Motil. -2007. -V. 19 (6). -P.440-452.

213. Stratuss, B.N. Directional arterioctomy for treatment of restenosis within coronary stents: clinical, angiographic and histologic results / B.N. Stratuss, V.A. Umans, R.J. Van-Suylen //'J Am Coll Cardiol. -1992. -V. 20 (7). -P. 1465-1473.

214. Stephens, N.L. Sensitized airway smooth muscle plasticity and hyperreactivity: a review / N.L. Stephens, Z.O. Cheng, A. Fust // Can J Physiol Pharmacol. -2007. -V. 85 (7). -P.679-685.

215. Stephens, N.L. Airway smooth muscle / N.L. Stephens // Lung. -2001. -V.179 (6). -P.333-373.

216. Sweeney, M. Role of capacitative Ca2+ entry in bronchial contraction and remodeling / M. Sweeney, S.S. McDaniel, O. Platoshyn et al. // Journal Appl Physiol. -2002. -V. 92. -P. 1594-1602.

217. Hirayama et al. // British Journal of Pharmacology. -2004. -V. 142. -P.65 7-666.

218. Taylor, C.W. The role of G proteins in transmembrane signaling / C.W. Taylor // Biochem J. -1990. -V.272. -P.l-13.

219. Timple, A.P. Laminin A glycoprotein from basement membranes / A.P. Timple, A.V. Somlyo, P.G. Rohde // J Biol Chem. -1979. -V.254. -P.9933-9937.

220. Thompson, R. J. Airway muscle stereology; implications for increased shortening in asthma / R. J. Thompson, A.M. Bramley, R.R. Schellenberg // Am J REspir Crit Care Med. -1996. -V.154. -P.749-757.

221. Thompson, R.J. Increased amount of airway smooth muscle does not account for excessive bronchoconstriction in asthma / R.J. Thompson, R.R. Schellenberg // Can Respir J. -1998. -V.5.№1.-P.61-62.

222. Thuneberg, L. One hundred years of interstitial cells of Cajal / L. Thuneberg // Microsc Res Tech. -1999. -V. 47 (4). -P.223-338.

223. Thuneberg, L. Structural aspects of interstitial cells of Caial as intestinal pacemaker cells. In: Pacemaker activity and intercellular communication / L. Thuneberg, J.J. Rumessen, H.B. Mikkelsen et al. // CRC Press. Boca Raton. -1995. -P. 193-222.

224. Tsukada, T. HHF35 a muscle actin specific monoclonal antibody. Reactivity in normal reactive and neo-plastic human tissues / T. Tsukada, M.A. McNutt, R. Ross et al. // Am J Pathol. -1987. -V.127. -P.3 89-402.

225. Xu, L. Mechanisms mediating serotonin-induced contraction of colonic myocytes / L. Xu, B.P. Yu, J.G. Chen et al. // Clin Exp Pharmacol Physiol. -2007. -V. 34 (1-2).-P.120-128.

226. Ward, J.P.T. On Ca2+ sensitivity and the airways: not just any smooth muscle / J.P.T. Ward // Eur Respir J. -2006. -V. 28, N.4. -P.680-682.

227. Wassdal, I. Bradikynin elevates cytosolic Ca concentration in smooth muscle cells isolated from rat duodenum /1. Wassdal, K. Larsen, J-G. Iversen // Acta Physiool Scand. -1999. -V. 165. -P.259-264.

228. White, C. Regulation of basal intracellular calcium concentration by the sarcoplasmic reticulum in myocytes from the rat gastric antrum / C. White, J.G. McGeown // J Physiol. -2000. -V. 1 (529 Pt 2). -P.395-404.

229. Won, K-J. Motility disorder in experimentally obstructed intestine: relationship between muscularis inflammation and disruption of the ICC network / K-J. Won, T. Suzuki, M. Hori et al. //Neurogastroenterol Motil. -2006. -V. 18. -P.53-61.

230. Wynn, G. Adenosine 5'-triphosphate and its relationship with other mediators that activate pelvic nerve afferent neurons in the rat colorectum7 G. Wynn7 G, Burnstock // Purinergic Signal. -2006. -V. 2 (3). -P. 517-526.I

231. Van Breemen, C. Cellular mechanisms regulating Ca" .i smooth muscle / C. Van Breemen, K. Saida // Annu Rev Physiol. -1989. -V. 51. -P. 315-329.

232. Yamamoto, M. Retardation of Phenotypic Transition of Rabbit Arterial Smooth Muscle cells in Three-Dimensional Primary Culture / M. Yamamoto, H. Nakamura, M. Yamato et al. // Experimental Cell Research. -1996. -V. 225. -P.12-21.

233. Yamazawa, T. Simultaneous imaging of Ca2+ signal in interstitial cells of Cajal and longitudinal smooth muscle cells during rhythmic activity in mouse ileum / T. Yamazawa, M. lino // Journal of physiology. -2002. -V. 538 (Pt 3). -P.823-835.

234. Young, H.M. Origin of Interstitial Cells of Cajal in the Mouse Intestine / H.M. Young, D. Ciampoli, B.R. Southwell et al. // Developmental Biology. 1996. - V. 180. -P. 97- 107.

235. Zashikhin, A.L. Allergen induced airway hyperresponsiveness in guinea pigs: the characteristic feature of smooth muscle population / A.L. Zashikhin, J.V. Agafonov // Allergy. -1996. -V.51. -N.32. -P. 194.

236. Zhang, K.M. Myofibroblast and their role in lung collagen gene expression during pulmonary fibrosis. A combined immunohistochemical and in situ hybridizationstudy / K.M. Zhang, D. Rekhter, D. Gordon et al. // Am J Pathol. -1994. -V. 145. -P.l 14-125.

237. Zholos, A.V. Ca2+ inhibition of inositol trisphosphate-induced Ca2+ release in single smooth muscle cells of guinea-pig small intestine / A.V. Zholos, S. Komori, H. Ohashi et al. // J Physiol. -1994. -V. 481 (Pt 1). -P. 97-109.

Информация о работе

Бармина, Анастасия Олеговна
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.25

Диссертация

Структурно-метаболические и цитофизиологические аспекты реактивности гладкой мышечной ткани висцеральных органов. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы