Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфо-функциональная характеристика гладкой мышечной ткани матки в различные физиологические периоды

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Морфо-функциональная характеристика гладкой мышечной ткани матки в различные физиологические периоды"

На правах рукописи

ДОЛГИХ Ольга Васильевна

МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЛАДКОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ МАТКИ В РАЗЛИЧНЫЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ

ПЕРИОДЫ

03.03.01 - Физиология 03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г * апр 2013

Архангельск - 2013

005057885

Работа выполнена на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Агафонов Юрий Витальевич

Официальные оппоненты: Игнатьева Светлана Николаевна

доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Северный государственный медицинский университет (г. Архангельск), профессор кафедры патологической физиологии

Чумасов Евгений Иванович

доктор биологических наук, профессор, ФБГОУ ВПО Санкт-Петербургская академия ветеринарной медицины, профессор кафедры биологии,экологии и гистологии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Ярославская государственная

медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится 13 года в //часов на

заседании диссертационного совета Д 2l2.008.04 на базе Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова по адресу: 163045, г. Архангельск, проезд Бадигина, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Северный (Арктический) федеральный университет имени М.В. Ломоносова».

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь

диссертационного совета УУ^^^/у^-^ Старцева Лариса Федоровна

Актуальность исследования. Гладкая мышечная ткань (ГМТ) является одним из основных тканевых компонентов, входящих в состав органов репродуктивной системы. Среди висцеральных органов, гладкая мышечная ткань матки обладает наибольшей амплитудой физиологической перестройки и фенотипических трансформаций в ходе астрального цикла и при беременности. Исследованиями ряда авторов были выявлены закономерности гистофизиологии и трансформации гладкой мускулатуры матки во время физиологической беременности (Бесков В.Н., 1973; Шубникова Е.А и др., 2001; Дубинин Е.В., 2005; Савицкий А.Г., Савицкий Г.А., 2009; Afting E.G., Elce J.S., 1978; Burroughs K.D., 2000; Shynlova О. et al., 2005, 2010) и ряде органической генитальной патологии (Вихляева Е.М.,1981, 2000; Марфунин Д.Л., 1988; Шехтман М.М.,1999; Прилепская В.И., 2004; Краснопольский В.И.,2000, 2009). В последние годы проводятся многочисленные исследования процесса послеродовой инволюции матки. Значительное количество работ посвящено структурным преобразованиям эндометрия (Крутиков Г.Г. и др., 2002; Радзинский В.Е., 2005; Кирсанов Я.Н., 2009) и механизмам элиминации коллагена (Рывняк В.В. и др., 1999, 2001, 2003; Woessner J.F., 1962; Goto Т., 1999; Melendez J.A. et al., 2001; Manase K., 2002). Несмотря на центральную роль ГМТ в процессе протекания послеродовой инволюции, в настоящее время имеются лишь единичные исследования, касающиеся структурно-метаболических особенностей гладких миоцитов (Дубинин Е.В., 2005; Обединская К.С., 2010; Shynlova О., 2006).

Известно, что различные отделы матки отличаются не только по анатомическому строению, соотношению тканевых компонентов, но и уровню функциональной активности (Абрамченко В.В., 1996; Бакшеев Н.С., Орлов Р.С., 1976; Серов В.Н. с соавт.,2001; Чернуха E.JL, Малгаждарова Б.С., 1990; Краснопольский В.И. и др., 2000; Ноздрачев А.Д., 2001; Савицкий Г.А., Савицкий А.Г.,2003; Jenssen, 1970; Leppert Р.С., Yu S.Y., 1994). Исследования последних лет свидетельствуют о том (Guarino М.Р., 2007; Halayko A.I., 1996; Зашихин А.Л., 2001), что в состав популяции гладкой мышечной ткани различных органов входят гладкомышечные клетки (ГМК) различных типов, отличающиеся по линейным параметрам и структурно-функциональной организации. Вместе с тем, в литературе не удалось обнаружить данных о структурно-функциональной организации, физиологических перестройках, и значении типов ГМК миометрия в разных отделах матки.

Таким образом, представляется актуальным получение объективных данных о типах гладкомышечных клеток, характеристике клеточной популяции в норме и динамике формирования ее перестроек в процессе беременности и после родов, что позволит выявить общие структурно-функциональные закономерности, присущие гладкомышечной ткани разных отделов матки.

Цель и задачи исследования. Цель работы - определить особенности морфо-функциональной организации гладкой мускулатуры матки интактных крыс, а также структурно-функциональные закономерности ее трансформации при развитии беременности и в послеродовой период.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфо-функциональную организацию гладкой мышечной ткани матки крыс на световом и электронно-микроскопическом уровнях.

2. Исследовать структуру популяции, пролиферативную активность и содержание суммарного белка цитоплазмы гладких мышечных клеток матки.

3. Провести сравнительный морфо-функциональный анализ организации гладкой мышечной ткани разных отделов матки.

4. Выявить динамику и механизмы изменения структуры популяции гладкой мышечной ткани матки во время беременности и ранний послеродовой период.

Положения, выносимые на защиту:

1. Гладкая мышечная ткань матки лабораторных животных (крыс) представляет собой сложно организованную клеточную популяцию, в составе которой присутствуют различающиеся по морфометрическим и метаболическим характеристикам малые, средние и большие миоциты, отражающие определенные степени дифференцировки в составе миобластического дифферона.

2. Особенности функциональной нагрузки разных отделов матки обуславливают различия структуры популяции, пролиферативного потенциала, содержания цитоплазматического белка в гладкой мышечной ткани, входящей в состав рогов, тела и шейки матки крыс.

3. Механизмы адаптивной трансформации мышечной ткани матки включают в себя динамичное изменение структуры клеточной популяции и метаболических параметров ГМК. Выраженность физиологической трансформации гладкомышечного компонента разных отделов матки при развитии беременности и в период послеродовой инволюции обусловлена особенностями функциональной нагрузки, имеет разнонаправленный характер и протекает с разной скоростью.

Научная новизна исследования. Впервые комплексный анализ изолированных ГМК, позволил с большой достоверностью определить линейные и структурно-метаболические параметры миоцитов матки, на основе этих данных определить структуру популяции и оценить пролиферативный потенциал ГМТ отделов матки в интактном организме, в процессе беременности и ранний послеродовой период.

Установлено, что мускулатура матки имеет в своем составе ГМК различного уровня дифференцировки (малые, средние и большие), соотношение которых определяет адаптационные возможности ткани. Показано, что по направлению от рогов к шейке матки происходит последовательное изменение структуры популяции ГМК, которое характеризуется уменьшением представительства малых и увеличением доли больших миоцитов, что определяется особенностями функционирования различных отделов матки. Установлено, что одним из механизмов адаптационной трансформации ГМТ матки является изменение структуры популяции миоцитов.

Научно-практическая значимость исследования. В результате исследования сформулированы положения, которые существенно углубляют и дополняют современные представления о физиологических механизмах адаптивной трансформации миометрия и роли в них гладкомышечного компонента в различные физиологические периоды. Полученные данные о различии структурно-метаболических параметров ГМК разных отделов матки могут быть использованы для оценки морфофункционального состояния миометрия и служить теоретической основой для изучения ряда патологических состояний в процессе беременности, родов и в послеродовой период на экспериментальных моделях и у человека. Результаты работы могут найти применение в практике научных исследований специалистов, занимающихся фундаментальными и прикладными проблемами трансформации гладкой мускулатуры матки и висцеральных органов в целом.

Результаты исследования используются в учебном процессе на педиатрическом и лечебном факультетах Северного государственного медицинского университета (акт внедрения от 4.12.12), на кафедре возрастной физиологии и валеологии (акт внедрения от 15.01.13) Северного (Арктического) федерального университета.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: международных научных симпозиумах «Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки» (Архангельск, 2004, 2007, 2008); международных медицинских конференциях молодых ученых и студентов (Архангельск, 2009, 2010); 6-ом съезде анатомов, гистологов, эмбриологов (Саратов, 2009); X Конгрессе международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); III Эмбриологическом симпозиуме Всероссийского научного медицинского общества анатомов, гистологов и эмбриологов «Югра-Эмбрио-2011» «Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных» (Ханты-Мансийск, 2011); XXXIX, ХХХХ, XLI Ломоносовских чтениях (Архангельск, 2010, 2011, 2012).

По результатам исследования опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований.

Структура и объем работы. Материалы диссертации представлены на 158 страницах и включают введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы и список литературы. Диссертация содержит 10 таблиц, 48 рисунков, включающих микрофотографии. Список литературы включает 126 отечественных и 103 зарубежных публикации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение структурно-метаболических характеристик гладкой мышечной ткани матки проводили на материале лабораторных половозрелых белых беспородных крыс массой 200-250г. Экспериментальные исследования

проводились в соответствии с «Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных» (1996). Стадии астрального цикла определяли по картине влагалищных мазков. Чтобы получить беременных особей, крыс в предменструальный период сажали на ночь в клетку с особями противоположного пола с испытанной плодовитостью. День, когда во влагалище обнаруживали сперму, считался первым днем беременности. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом. Образцы тканей рогов, тела и шейки матки брали утром: у небеременных (интактных) крыс на стадии диэструса (контрольная группа), на 4, 12 и 20 сутки беременности и на 1, 2, 4, 7 сутки после родов. Протокол исследования одобрен Комитетом по этике при СГМУ (протокол № 03/02 от 12.02.2010 г.).

Всего в работе проанализирован материал от 58 объектов исследования. Изолированные гладкие мышечные клетки изучены по 11 параметрам: линейные и объемные размеры клеток и их ядер, ядерно-цитоплазматическое отношение, оптическая плотность ДНК ядер и суммарного белка цитоплазмы, распределение клеток по модальным классам плоидности ядер и уровню содержания белков в цитоплазме. Проанализировано более 50 электронограмм. Характеристика изученного материала приведена в таблице.

Таблица

Характеристика изученного материала

Серия исследования, экспериментальная модель Методы исследования Количество объектов

Гладкая мускулатура небеременных животных (стадия диэструса), контрольная группа Общая гистология, морфометрия изолированных ГМК, цитоспектрофотометрия ДНК и суммарного белка цитоплазмы, электронная микроскопия, иммуноцитохимия 7 особей

Беременность 4, 12, 20 сутки Общая гистология, морфометрия изолированных ГМК, цитоспектрофотометрия ДНК и суммарного белка цитоплазмы, иммуноцитохимия 21 особь

Послеродовой период 1, 2,4, 7 сутки Общая гистология, морфометрия изолированных ГМК, цитоспектрофотометрия ДНК и суммарного белка цитоплазмы, электронная микроскопия, иммуноцитохимия 30 особей

Прицельная щелочная диссоциация. Для количественных цитологических исследований использован метод щелочной диссоциации (Бродский В.Я. с соавт., 1983, Данилов Р.К. с соавт., 1989, Ямщиков Н.В. 1991), позволяющий повысить объективность анализа и избежать ошибок при морфометрических и цитохимических исследованиях, производимых на срезах. Для получения однородной взвеси изолированных гладких миоцитов использовался оригинальный метод прицельной клеточной диссоциации (Зашихин А.Л., Агафонов Ю.В., Лисишников Л.В. патент РФ на изобретение № 2104524 от 23.05.94.), который позволяет избирательно выделять из стенки органов

тканевые компоненты определенного типа и проводить их последующую диссоциацию. Фиксация материала осуществлялась в 10% формалине на фосфатном буфере (РН=7.2-7.4) в течение 14 суток. Выделенные микрофрагменты, содержащие только гладкомышечную ткань, диссоциировали в 50% водном растворе КОН в течение 2,5-3 часов при температуре 18-20° С. Диссоциацию клеток получали при помощи гидроудара струи воды из микропипетки с последующим пассажем содержимого пробирки, что позволяло получить однородную взвесь клеток, из которой изготовляли мазки.

Мазки изолированных ГМК окрашивали комбинированным способом. Выявление ДНК в ядрах проводили в строго идентичных условиях по методу Фёльгена (Пирс Э., 1962), контролем служили мазки, не подвергшиеся гидролизу в растворе соляной кислоты. Суммарный белок цитоплазмы выявляли амидочерным 10Б (Брумберг В.А., Певзнер Л.З., 1972). Для определения содержания ДНК и белка в ГМК проводили цитофотометрическое исследование.

Морфометрия и цитоспектрофотометрия. Изолированные гладкие миоциты подвергались комплексному морфометрическому и цитоспектрофотометрическому анализу. Цитоспектрофотометрию проводили одноволновым методом на сканирующем спектрофотометре МФТХ-2М (JIOMO, Россия), оборудованным монохроматором и позволяющем строго выдерживать параметры длины волны. Определение ДНК ядер и суммарного белка в цитоплазме проводили методом сканирования. ДНК фотометрировали при длине волны - 546 нм, а суммарный белок цитоплазмы - при 580 нм, зондом диаметром 0,5 мкм. Одновременно измеряли линейные размеры миоцитов и их ядер при помощи окуляр-микрометра МОВ-1-15х в двух взаимно перпендикулярных плоскостях. Объемы гладких миоцитов и их ядер вычисляли по формуле эллипсоида вращения.

Иммуноцитохимическое исследование. Материал исследуемых объектов лабораторных 'животных (крыс) фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (PBS, phosphate buffer solution, Sigma Immunochemicals, США) в виде блоков в течение 2 дней, затем готовили парафиновые срезы (5-7 мкм в толщину). Перед инкубацией в растворе первичных антител парафиновые срезы на стеклах подвергали депарафинизации в ксилоле, спиртах возрастающей концентрации. Затем обрабатывали 3% водным раствором перекиси водорода в течение 10 минут, и преадсорбировапи с 5% лошадиной сывороткой (Dako, Дания) 30 минут при комнатной температуре. После каждой операции срезы отмывали стандартным раствором фосфатно-солевого буфера (Sigma Immunochemicals, США). Для идентификации пролиферативной активности и апоптотических изменений в миоцитах проводили иммунногистохимическое окрашивание срезов с использованием моноклональных антител PCNA, TNF-R1 (Santa Cruz, США). Экспозицию в растворах первичных антител проводили в течение 1 часа при комнатной температуре. Визуализация реакции проводилась с помощью вторичных биотинилированных антител с применением диаминобензидина для

выявления реакции пролиферации и апоптоза. Препараты подкрашивали квасцовым гематоксилином (с подсинением в щелочной воде).

Для люминисцентной визуализации сигнала вторичные антитела использовались в разведении 1:100, конъюгированные с флюорохромами Alexa Fluor 568. После отмывки первичных антител в буфере и обработки 5% лошадиной сывороткой препараты были инкубированы с вторичными антителами в течение 30 минут при 37°С. После повторения отмывки от антител, препараты дополнительно контрастировали DAPI и заключали в MOVIOL.

Электронно-микроскопический метод. Материал фиксировали в 2,5% растворе глютарового альдегида на 0,1 M фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) в течение 2 часов и последующей фиксацией в течение 1 часа в 2% тетраоксида осмия при температуре 5°С. Кусочки промывали в буфере, обезвоживали в спиртах с контрастированием в 70° спирте и 1% уранилацетатом в течение 12 часов. Заливали в смесь эпон-аралдита. Для обеспечения прицельного электронно-микроскопического анализа со всех блоков получали серийные полутонкие срезы толщиной 1-2 мкм, которые окрашивали 1% раствором метиленового синего. После идентификации необходимых объектов блоки затачивали и прицельные ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB-5, контрастировали в 2,5% растворе уранилацетата и 0,3 % растворе цитрата свинца. Просматривали в электронных микроскопах JEM-100 СХ (Япония).

Общеморфологическое исследование. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине. Обзорные гистологические препараты получали путем окраски парафиновых срезов толщиной 5-7 мкм гематоксилином и эозином. Коллагеновые волокна выявляли окраской по Ван-Гизону.

Статистическая обработка. Статистический анализ проводился с использованием пакета прикладных статистических программ STATISTICA v 6.0 для «WINDOWS-XP». Результаты тестов считались статистически значимыми при р<0,05. Определяли числовые характеристики переменных, оценку соответствия вида распределения признака закону нормального распределения, оценку значимости различных количественных показателей в независимых выборках с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При анализе интактной дефинитивной мышечной ткани матки крыс были изучены показатели объемов клеток и их ядер, а также оптической плотности ядерного вещества и цитоплазмы, отражающих плоидность ядер и содержание суммарного клеточного белка в миоцитах. Анализ гистограммы распределения миоцитов по объему клетки свидетельствует, что данный показатель характеризуется наиболее высоким коэффициентом вариации (69,4%) среди других изученных параметров. Характер гистограммы не соответствует параметрам нормального распределения, что отражает высокий показатель асимметрии (2,43). Это свидетельствует о гетероморфии изучаемой популяции. Математический анализ гистограммы распределения по объему клетки выявил

наличие в популяции гладкой мускулатуры матки трех групп миоцитов: малых, средних и больших, основные параметры которых соответствуют закону нормального распределения, ошибки репрезентативности не превышают 5%, что отражает представительность выборок. Аналогичные данные были получены ранее при изучении ГМТ бронхов и кишечника (Зашихин А.Л., Агафонов Ю.В., 1994,1997), мочеточника (Башилова E.H., 2000). Согласно полученным данным наиболее представительной группой в популяции ГМК матки у крыс являются средние миоциты, составляющие 64%, большие клетки соответственно - 25%, малые миоциты - 11%. Цитофотометрический и морфометрический анализ выявил различия объемных и метаболических параметров разных типов гладких миоцитов. Малые ГМК характеризуются более высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, показателем оптической плотности ядер по сравнению с другими типами миоцитов. В этой группе отмечается самое высокое содержание гипердиплоидных клеток 24%, что определяет пролиферативный потенциал ГМТ матки, тогда как в группе средних и больших соответственно 7% и 4%.

Полученные данные о малых, средних и больших миоцитах, интегрированных в ГМТ матки, позволяют рассматривать субпопуляции миоцитов как звенья единого миобластического дифферона. Малые миоциты представляют собой камбиальные и дифференцирующиеся, а большие - клетки с терминальной дифференцировкой. Средние миоциты составляют наиболее многочисленную, стабильную и функционально активную субпопуляцию. Наличие трех групп миоцитов, различающихся по своим морфометрическим, цитохимическим параметрам и уровню пролиферативной активности, позволяет сформулировать новый подход к исследованию морфометрических и функциональных особенностей функционирования мышечной ткани в составе стенки матки. Полученные данные о существовании различных типов миоцитов в интактной мускулатуре крыс подтверждают мнения ряда авторов о клеточной неоднородности ГМТ (Авцын А.П., Шахламов В.А., 1979; Шубникова Е.А. и др., 2001; Шкурупий В.А. и др., 2008; Адамян JI.B., и др., 2007; Kemp M.W., 2009).

С целью изучения взаимосвязи физиологических аспектов функционирования и структурно-метаболической организации

гладкомышечного компонента матки в данной работе впервые был проведен анализ ГМТ различных отделов матки крысы: рогов, тела и шейки.

Статистический анализ средних значений объема ГМК разных отделов матки выявил его достоверные различия между рогами, телом и шейкой (р<0,001). Полученные данные свидетельствуют об увеличении данного показателя по направлению от рогов к шейке матки крысы. Изменения среднего объема миоцитов, прежде всего, определяются перестройкой структуры популяции. От рогов к шейке наблюдается последовательное снижение доли малых (с 17% до 7%) и средних клеток (с 72% до 54%), а также возрастание доли больших миоцитов (с 11% до 39%).

Параллельно с нарастанием объемов ГМК от верхних отделов матки к нижним снижается содержание гипердиплоидных миоцитов с 9% в рогах до 4% в шейке матки.

Выявленные различия структурной организации ГМТ разных отделов матки обусловлены функционально. Они связаны с уменьшением спонтанной частоты сокращений (электрической активности) гладких миоцитов и совпадают с направлением импульсов миогенного ритма, идущих из областей первичной пейсмекерной активности, расположенных на овариальных и цервикальных концах рогов матки крыс. Ведущую роль в обеспечении продольной контрактуры матки отводится пейсмекерам, находящимся в овариальном отделе рогов матки (Казарян К.В., Унанян Н.Г. и др., 2010; Duguette R.A. et al., 2005). Показано также, что продолжительность разрядов электрической активности является определяющим параметром возникновения координированной контрактуры матки (Buhimschi С. et al., 1998).

Неоднородность механических свойств ГМТ различных отделов матки является приспособительным, физиологически обусловленным механизмом. Активность ГМК рогов матки крыс значительно превосходит таковую у нижерасположенных участков органа (Унанян Н.Г., 2012). Что и обуславливает более высокое содержание средних миоцитов в ГМТ рогов матки, характеризующихся как более стабильная, функционально активная субпопуляция, способная демонстрировать выраженные сократительные реакции. С другой стороны, рога матки являются местом имплантации и вынашивания плодов, поэтому здесь наблюдается более высокое содержание малых миоцитов, что обусловлено необходимостью функционального тканевого резерва популяции для обеспечения адекватных приспособительных реакций. Малые миоциты менее дифференцированы, характеризуются высоким ядерно-цитоплазматическим индексом и пролиферативным потенциалом. Высокий процент малых миоцитов (17%) и большой процент средних (72%) в структуре маточного рога крысы, очевидно, является оптимальным для поддержания постоянного тонического напряжения и создания более частого ритма сократительной активности, в то же время более высокий пролиферативный потенциал миоцитов способствует высокой степени адаптации миометрия рогов в различные физиологические периоды.

Электронно-микроскопическое исследование дефинитивной ГМТ матки крысы продемонстрировало единый принцип организации, подобно другим висцеральным органам (бронхиальное дерево, кишечник, мочеточники) (Зашихин А.Л., 1997, 2001; Башилова Е.Н., 2000). Она содержит типичные сократительные миоциты, цитоплазма которых характеризуется различной электронной плотностью. В ГМТ матки крысы на стадии диэструса под влиянием прогестерона преобладают «темные» миоциты с гладкой поверхностью. В «темных» миоцитах, по сравнению со «светлыми», наблюдается более упорядоченная и плотная организация филаментов. Доминирующей формой взаимодействия между ГМК миометрия в стадию диэструса у крыс является контакт по типу десмосом.

При изучении электронограмм были выявлены в ГМТ ткани рогов матки клетки с характеристиками интерстициальных клеток Кахаля (ИКК). Клетки имеют многоотросчатую форму, расширенную перинуклеарную часть, отличаются от типичных ГМК отсутствием миофиламентов и базальной мембраны. В цитоплазме содержится гладкая эндоплазматическая сеть, митохондрии, кавеолы и плотная масса промежуточных филаментов. Паукообразные клетки образуют контакты с аксонами, соседними подобными отросчатыми клетками и клетками гладкомышечной ткани. В исследованиях R.A. Duguette, A. Shmygol et al. (2005) в миометрии крыс также были обнаружены клетки, которые полностью отличались от миоцитов своей морфологией и ультраструктурой. Роль этих клеток до конца не ясна, возможно, они вызывают подавление сократительной функции гладких миоцитов во время беременности, а в процессе родов происходит снятие факторов торможения и восстановление естественной функции этого органа.

Среди изолированных ГМК, полученных из стенки матки, также удалось обнаружить клетки с морфологическими характеристиками интерстициальных. Данные клетки характеризуются паукообразной формой, имеют центрально расположенное ядро и отростки различной протяженности. Аналогичные клетки были выявлены в миометрии рогов мышей (Allix S., Reyes-Gomez Е. et al., 2008).

Трансформация ГМТ матки во время беременности.

При изучении механизмов трансформации ГМТ разных отделов матки крысы в ходе физиологической беременности получены следующие результаты. Анализ показателей миоцитов матки на 1 неделе беременности показал достоверное снижение среднего клеточного объема ГМК всех отделов матки (р<0,001), которое закономерно отразилось на структуре популяции миоцитов матки. Это проявилось в увеличении доли малых миоцитов и уменьшении представительства больших миоцитов. К концу гестационного периода средний клеточный объем ГМК в рогах матки увеличивался (р<0,001), а в теле и шейке оставался достоверно меньше объемов миоцитов контрольной группы (р<0,001).

Выявленные изменения отражают структурные перестройки в популяции ГМК, которые в отделах имели разнонаправленный характер. Наибольшая амплитуда изменения средних значений объемов клеток выявлена в рогах матки крыс, где отмечается снижение доли малых миоцитов и возрастание количества больших в ГМТ рогов матки крысы, в теле и шейке выявлено нарастание представительства малых и средних клеток (рис.1).

Структурная перестройка сопровождалась увеличением пролиферативного потенциала ГМТ в ранние сроки беременности во всех отделах матки (р<0,001), что выражалось в значительном увеличении содержания гипердиплоидных миоцитов, причем малые миоциты демонстрировали наибольший пролиферативный потенциал в сравнении с другими субпопуляциями клеток. Перед родами доля гипердиплоидных миоцитов достоверно снижается (р=0,013) (рис.2).

На протяжении всей беременности отмечается достоверное увеличение показателя оптической плотности цитоплазмы (р<0,001), отражающего содержание суммарного клеточного белка. Миоциты с высоким уровнем цитоплазматического белка в ГМК составили в рогах - 89%, теле - 78%, шейке - 95%, при этом увеличение уровня цитоплазматического синтеза наблюдалось во всех клеточных субпопуляциях.

11%

88%

5%

я

5 В

= о.

¡к ^ °

й й Ч

ч о о

_ С о.

і щ а

X с; о

а 3 ч

Ч О о

= ч о

а о ч

ч О 3

■я- с и.

65'

44% <

68%

5%

Ж

11%

56%

26%

10%

29%

33%

65%

61%

9%

43%

44% <

48%

12%

44%

■------

54%

39%

50%

25'

40%

59%

30%

1Д% -55%

4%

62% рога

40%

30' 17

53%

Рис.1. Структура популяции ГМК различных отделов магки беременности и после родов.

Примечание: ф - малые ГМК; ф - средние ГМК;

шейка крысы при развитии

к - большие ГМК;

Изучение трансформации ГМТ рогов, тела и шейки матки крыс при развитии беременности выявило различный характер изменений. В первую неделю происходит резкий рост пролиферативного потенциала популяции, увеличение содержания цитоплазматических белков и увеличение доли малых миоцитов во всех отделах матки. Усиление синтеза ДНК является необходимым условием для поддержания структуры популяции и достаточного камбиального потенциала, обеспечивающего физиологическую трансформацию и адаптацию к изменяющимся функциональным нагрузкам.

Эти результаты также подтверждаются при иммуногистохимическом исследовании. В первую неделю беременности в составе гладкой мышечной ткани во всех отделах матки наблюдалось увеличение иммунопозитивных клеток при постановке реакции на ядерный антиген пролиферирующих клеток PCNA (Santa Cruz, USA). Снижение пролиферативной активности в миометрии в конце беременности может являться следствием ингибирующего воздействия прогестерона на пролиферацию, что подтверждается отсутствием экспрессии PCNA в миометрии крысы.

93%

25%

5%

2%

7% 25% 5% 2% 9% 2% 2% 8%

СГ> СГ> СOD

75% 95% 98% 91% 98% 98% 92%

я 4% 14%

I С^ сз

з 96% 86% 100%

100%

5% 5% 3% Ю%

cz^ C2D

95% 95% 97% 91%

1 нед.

2 нед.

контроль бер-сти бер-сти

3 нед. бер-сти

1 день после родов

2 день после родов

4 день после родов

7 день после родов

Рис.2. Структура плоидности гладких мышечных клеток различных отделов матки крысы при развитии беременности и после родов.

Примечание: Q - диплоидные клетки, ф - гипердиплоидные клетки

На протяжении беременности вследствие неодинаковой функциональной нагрузки процессы перестройки миометрия разных отделов матки происходят с разной скоростью. В ГМТ рогов к концу гестационного периода наблюдаются достоверные структурные перестройки популяции (Р<0,001) в сторону увеличения представительства больших миоцигов. Наши данные подтверждают мнение ряда авторов о том, что к моменту родов матка набирает максимальную массу в частности за счет гипертрофии миометрия, поскольку она должна быть готова к выполнению функциональной нагрузки в процессе родов (Бесков В.И., 1973; Дубинин Е.В.,2005; Shynlova О., Tsui P. et al., 2005; Shynlova О., Oldenhof A. et al., 2006). Но в то же время в ГМТ шейки происходит достоверное увеличение доли средних миоцитов (р<0,001), являющихся наиболее функционально-активной группой клеток, что сопровождается угнетением в ядрах синтеза ДНК и накоплением в цитоплазме внутриклеточных белков. Шейка на протяжении всей беременности выполняет функцию запора, позволяющего сохранять определенную изолированность полости матки и обеспечивать, таким образом, условия для адаптивной реконструкции других

отделов матки и развитии плода. Это обстоятельство, на наш взгляд, во второй половине беременности является причиной преобладания в популяции ГМК средних миоцитов, что согласуется с литературными данными о том, что в шейке матки статистически достоверного увеличения мышечной ткани не наблюдается (Бакшеев Н.С., Орлов P.C., 1976), а, по мнению ряда авторов, процент мышечных клеток значительно уменьшается (Циркин В.И., 1986; Leppert P.C., Yu S.Y., 1994).

В родовой деятельности различные отделы матки принимают неодинаковое участие. Беременность с ее сложным нейро-гуморальным влиянием приводит к постепенному и закономерному повышению во всех отделах матки (рога, тело, шейка) содержания белковых соединений, активно участвующих в сократительной деятельности. Максимум накопления их имеет место непосредственно перед родами. По мнению Павлович Е.Р. с соавт. (2005) именно миоциты с большим содержанием сократительного аппарата в цитоплазме являются теми клетками, которые обеспечивают длительный тонический процесс сокращения матки в родах. Более низкое содержание цитоплазматических белков в конце беременности в области шейки, вероятно, создает условия для быстрого растяжения этого отдела матки при нормальном течении родовой деятельности.

Снижение пролиферативной активности в сочетании с повышением доли миоцитов с высоким уровнем цитоплазматических белков в популяции в конце беременности может быть обусловлено трансформацией ГМК матки к синтетическому фенотипу. Причем индуктором клеточной трансформации может являться активация апоптоза в миометрии в середине беременности, что ведет к увеличению расщепления большого количества белков, являющихся субстратом протеаз. Ферменты апоптоза участвуют в окончании пролиферативной фазы роста миометрия и переходе к фазе гипертрофии (Shynlova О., Oldenhof А. et al., 2006).

Эти результаты также подтверждаются при иммуногистохимическом исследовании. В конце беременности в составе гладкой мышечной ткани всех отделов матки крысы выявлено увеличение иммунопозитивных клеток при постановке реакции на TNF-Rl (Santa Cruz, USA) маркер апоптотически измененных клеток.

По данным морфометрического исследования мазков изолированных гладких миоцитов матки крыс в период беременности отмечалась тенденция к увеличению отросчатых ГМК и клеток с вакуолизированной цитоплазмой, которое достигает максимальных значений перед родами. Учитывая различие в реакциях поверхностного мембранного комплекса на эстрогены и прогестерон, можно предполагать, что значение структурных преобразований мембран заключается в создании соответствующих определенному гормональному фону условий для проведения возбуждения и синхронизации сокращений. Разветвленная клеточная поверхность способствует быстрому распространению возбуждения, что, по мнению Н.С. Бакшеева, P.C. Орлова (1976) характерно для эффекта эстрогенов, а возникновение внутри клеток

вакуолей различных размеров обусловлено проявлением эффекта прогестерона. По мнению других авторов (Шкурупий В.А., Дубинин Е.В., Дубинина H.H., 2008), наличие вакуолей, свидетельствует о развитии в миоцитах гидропической дистрофии, причинами которой могут являться гипоксия, нарушение водного обмена в клетке, недостаток питания. Дистрофически измененные миоциты могут быть причиной различных осложнений, связанных с нарушением сократительной деятельности миометрия в акте родов (слабость родовых сил) и в послеродовом периоде (атонические кровотечения) (Бесков В.Н., 1973).

Трансформация ГМТ матки в период послеродовой инволюции.

Изучение показателей миоцитов матки в процессе послеродовой инволюции выявило достоверное снижение среднего клеточного объема (р=0,035) в рогах матки крыс. В ГМТ тела и шейки наблюдалось значительное увеличение среднего объема миоцитов на 1-й день после родов (р<0,001) и тенденцией к снижению в последующие дни пуэрперия (р<0,001). Выявленные изменения отражают структурные перестройки в популяции, которые имеют разнонаправленный характер в отделах матки. В рогах матки это проявляется увеличением доли малых и снижением содержания больших миоцитов. На 7-е сутки после родов структура популяции ГМК миометрия рогов имеет показатели близкие к значениям контроля (небеременные крысы). В теле и шейке в 1-е сутки пуэрперия наблюдается увеличение доли больших миоцитов, в последующие сроки отмечается тенденция к значительному увеличению представительства малых и снижению больших клеток, но полного восстановления популяции не наблюдается (рис.1).

Структурные перестройки сопровождаются возрастанием доли гипердиплоидных клеток в первый день после родов во всех отделах матки, что подтверждает положительная иммуногистохимическая реакция на ядерный антиген пролиферирующих клеток PCNA (Santa Cruz, USA). Увеличение пролиферативной активности в миометрии в данный период может являться следствием увеличивающегося воздействия эстрогена на ГМК. В ГМТ шейки на 7-ой день послеродовой инволюции увеличение пролиферативного потенциала наиболее выражено, гилердиплоидные клетки составляют 10%, тогда как в теле - 8%, а в рогах - 2%. В первые дни инволюции увеличение общего содержания ДНК в миометрии рогов крыс ведет к увеличению в популяции доли малых миоцитов, затем к 7-му дню наблюдается угнетение синтеза ДНК (рис.2). Полученные нами данные подтверждают экспериментальные исследования Ailing E.G., Elce J.S. (1978), Helguera G.(2009), в ходе которых наблюдалось снижение содержания ДНК в миометрии крыс более чем на 50%. При этом масса миометрия и размеры миоцитов оказывались достоверно меньшими, чем до беременности. В период инволюции в ГМТ всех отделов матки выявлено увеличение гипердиплоидных клеток среди больших миоцитов, что можно рассматривать как компенсаторно-приспособительную реакцию. Появление тетраплоидных больших миоцитов может отражать дистрофические изменения в ГМТ, с другой стороны,

возможно, эти клетки при делении могут быть субстратом перестройки миометрия в послеродовой период.

В мышечной ткани всех отделов матки крыс отмечается достоверное снижение показателя оптической плотности цитоплазмы (р<0,001), отражающего содержание суммарного клеточного белка. Миоциты с высоким уровнем цитоплазматического белка в ГМК составили в рогах - 64%, теле -72%, шейке-77%.

В процессе послеродовой инволюции характер структурной и функциональной перестройки ГМТ существенно различается в разных отделах матки, что обусловлено различным уровнем функциональной нагрузки. Во время послеродовой инволюции в миометрии рогов на 2-е сутки наблюдается повышение пролиферативного потенциала, что ведет к увеличению в популяции доли малых миоцитов. К 7-м суткам послеродовой инволюции миометрии рогов имеет популяционные показатели, близкие к параметрам контрольной группы (небеременные животные), что говорит о завершении в ней инволютивных преобразований и свидетельствует о мощных адаптивных возможностях ГМТ матки и существенной скорости биологических процессов в определенные физиологические периоды. В то же время в ГМК тела и шейки матки наблюдается повышение уровня синтеза ДНК, активируются процессы пролиферации, которые имеют адаптивный характер, что сопровождается увеличением представительства малых миоцитов в структуре популяции. Эти данные свидетельствуют о том, что инволюция тела и шейки матки крыс после родов происходит значительно медленнее, чем инволюция рогов матки.

Таким образом, ведущим фактором перестройки популяции ГМТ всех отделов матки крыс в период пуэрперия становится элиминация больших миоцитов, так как они представляют собой терминальное звено гладкомышечного дифферона. В ходе иммуноцитохимического исследования нами были получены результаты выраженной экспрессии TNF-Rl (Santa Cruz, USA) в гладких миоцитах всех отделов матки в процессе послеродовой инволюции, что свидетельствует о том, что основная доля структур, подлежащих элиминации приходится на апоптотически измененные гипертрофированные миоциты. Факторами, инициирующими механизмы инволюции, являются ухудшающиеся условия трофики и гипоксия миометрия (Айламазян Э.К. и др., 1999; Кулаков В.И. и др., 2007; Обединская К.С.,2010).

Электронно-микроскопическое исследование подтверждает полученные результаты. Наряду с увеличением межклеточных пространств, нарушением межклеточных коммуникаций, среди миоцитов были выявлены клетки с признаками дегенерации. В цитоплазме этих клеток наблюдались участки деструкции миофиламентов, миелиновые тельца, расширение перинуклеарного пространства и образование многочисленных вакуолей, содержащих лизируемые компоненты клетки. В ряде клеток наблюдали агрегацию ядерного хроматина в виде гранулярных масс, прилегающих к ядерной мембране, ядерная мембрана имела неровную поверхность. Наши данные подтверждают мнение ряда авторов о том, что в миометрии в послеродовой период

определяются апоптотически измененные миоциты (Дубинин Е.В., 2005; Шкурупий В .А., Дубинин Е.В., Дубинина H.H., 2008; Обединская К.С., 2010; Leppert P.C., 1995). В период послеродовой инволюции системы регуляции клеточного деления и клеточной смерти тесно взаимосвязаны между собой.

Таким образом, проведенное исследование гладкомышечного компонента матки крысы свидетельствует о достаточно сложной его организации. В популяции ГМК сосуществуют три типа миоцитов, различающиеся степенью дифференцировки. Данное исследование показало, что высокая пластичность миометрия в различные физиологические периоды обусловлена динамичностью популяции ГМК, соотношением и метаболическими характеристиками отдельных типов миоцитов, их различной реакцией на изменяющиеся условия. Характер адаптационных перестроек гладкой мускулатуры матки разных отделов определяется их физиологическими потребностями.

ВЫВОДЫ

1. Цитофизиологические особенности функционирования гладкой мышечной ткани матки определяются структурно-метаболическими параметрами гладких миоцитов. Гладкая мускулатура матки представляет собой сложно организованную клеточную популяцию, в составе которой присутствуют малые, средние и большие миоциты, различающиеся по степени дифференцировки, структурным и метаболическим параметрам.

2. Мышечная ткань, входящая в состав разных отделов матки, различается по структуре популяции, пролиферативному потенциалу и степени адаптационных возможностей. По направлению от рогов к шейке матки крысы отмечается последовательное увеличение средних клеточных объемов, уменьшение доли малых миоцитов и увеличение представительства больших клеток, сопровождающееся снижением пролиферативного потенциала ГМТ и нарастанием суммарного белка цитоплазмы в направлении координированной продольной контрактуры матки, что определяется различными функциональными потребностями данных отделов.

3. Адаптация гладкой мышечной ткани матки к повышению функциональной нагрузки на раннем этапе беременности характеризуется увеличением содержания цитоплазматического белка и возрастанием доли малых миоцитов, которое сопровождается значительным усилением пролиферативного потенциала во всех отделах матки.

4. Физиологическая трансформация гладкой мускулатуры матки в поздний гестационный период имеет разнонаправленный характер: в области рогов отмечается увеличение содержания цитоплазматического белка и возрастание больших миоцитов, что обеспечивает поддержание длительного тонического процесса сокращения матки в родах; в гладкой мускулатуре шейки возрастает доля средних миоцитов - функционально-активной группы клеток, позволяющих выполнять шейке функцию сфинктера во время беременности.

5. Трансформация гладкой мышечной ткани рогов матки после родов сопровождается снижением синтеза ДНК, содержания цитоплазматических

белков и восстановлением структуры популяции до исходных параметров, что свидетельствует о завершении инволютивных преобразований. 6. Послеродовая инволюция ГМТ тела и шейки матки происходит значительно медленнее, чем в рогах и выражается в увеличении представительства малых миоцитов в структуре популяции, усилении процессов пролиферации.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Долгих О.В. Структурная и метаболическая характеристика гладкой мускулатуры висцеральных органов крыс / О.В. Долгих, А.Л. Зашихин, Ю.В. Агафонов // Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки: материалы 6-го междунар. научного симпозиума. Архангельск, 2004. - С.5-6.

2. Долгих О.В. Трансформация миометрия крыс при беременности / О.В. Долгих, А.Л. Зашихин, Ю.В. Агафонов // Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки: материалы 9-го междунар. научного симпозиума. Архангельск, 2007. - С.17-18.

3. Долгих О.В. Гладкая мускулатура матки. Некоторые механизмы тканевой реактивности / О.В. Долгих, А.Л. Зашихин, Ю.В. Агафонов // Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки: материалы 10-го междунар. научного симпозиума. Архангельск, 2008. -С.14-16.

4. Долгих О.В. Трансформация миометрия крыс при беременности и после родов / О.В. Долгих, Ю.В. Агафонов // Бюл. Сев. гос. мед. ун-та. - 2009. - №1. -С. 176.

5. Долгих О.В. Реактивная перестройка гладкой мускулатуры матки крыс при беременности / О.В. Долгих, А.Л. Зашихин, Ю.В. Агафонов // Морфология. — 2009. — №4. — С.52.

6. Особенности структурной перестройки гладкой мускулатуры рогов матки крыс при беременности / М.В. Сиволобова, О.В. Долгих, Е.Д. Жерновая, Ю.В. Агафонов // Бюл. Сев. гос. мед. ун-та. - 2010. - №1. - С. 174-175.

7. Клеточные механизмы трансформации гладкой мускулатуры матки крыс при развитии беременности / О.В. Долгих, Ю.В. Агафонов, А.Л. Зашихин, E.H. Башилова // Экология человека. - 2010. - №9. - С.18-21.

8. Долгих О.В. К вопросу о клеточных механизмах трансформации миометрия крыс в различные физиологические периоды / О.В. Долгих, Ю.В. Агафонов II Морфология. - 2010. - №4. - С.69.

9. Долгих О.В. Особенности структурной перестройки миометрия крыс в послеродовый период / О.В. Долгих, Ю.В. Агафонов // Морфология. — 2011. — Т.140. — №4. - С.52.

10. Долгих О.В. Гладкая мышечная ткань матки в период раннего пуэрперия: механизмы инволюции / О.В. Долгих, Ю.В. Агафонов, АЛ. Зашихин // Экология человека. - 2012. - №12. - С.31-35.

Подписано в печать 22.02.2013 г. Бумага офсетная. Уся. печ. л. 1,0. Заказ № 750, тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Типография Пресс - Принт» Архангельск, ул. Гагарина, 42, оф. 507 Тел./факс: 212-210, 212-616

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Долгих, Ольга Васильевна, Архангельск

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ СЕВЕРНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ДОЛГИХ Ольга Васильевна

МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЛАДКОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ МАТКИ В РАЗЛИЧНЫЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПЕРИОДЫ

03.03.01 - Физиология 03.03.04 — Клеточная биология, цитология, гистология

[Ч Диссертация 00

^^ на соискание ученой степени

Ю г- кандидата биологических наук

Ю £

со Я

^^ О Научный руководитель:

ГЧ1 О

V 7 С*-) доктор медицинских наук, N

О профессор Ю.В. Агафонов

Архангельск 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4 Глава 1. ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ И

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ГЛАДКОЙ

МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ МАТКИ 8

1.1. Гистогенез гладкой мышечной ткани матки. 8

1.2. Современные представления о структурно-функциональной организации гладкой мышечной ткани матки. 11

1.2.1. Ультраструктурная организация гладких миоцитов матки. 12

1.2.2. Сократительная функция матки. 16

1.2.3. Структура клеточной популяции гладкой мышечной ткани матки. 20

1.3. Гладкая мышечная ткань матки в различные физиологические периоды. Особенности организации. 24

1.3.1. Строение интактной матки. 2 5

1.3.2. Особенности морфофункциональной организации ГМТ

матки во время беременности. 28

1.3.3. Особенности морфофункциональной организации ГМТ

матки в послеродовой период. 34

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38

2.1. Материалы исследования. 38

2.2. Методы исследования. 39 Глава 3 МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И

УЛЬТРАСТРУКТУРА ДЕФИНИТИВНОЙ ГЛАДКОЙ

МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ МАТКИ КРЫС 45

3.1. Морфофункциональная характеристика дефинитивной

гладкой мышечной ткани матки крыс. 46

3.2. Ультраструктура лейомиоцитов дефинитивной гладкой мышечной ткани матки крысы. 62

Глава 4. МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ТРАНСФОРМАЦИИ ГЛАДКОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ МАТКИ КРЫС В ПРОЦЕССЕ БЕРЕМЕННОСТИ Глава 5. МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ТРАНСФОРМАЦИИ ГЛАДКОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ МАТКИ КРЫС В ПЕРИОД ПОСЛЕРОДОВОЙ ИНВОЛЮЦИИ

5.1. Морфофункциональная характеристика гладкой мышечной ткани матки крыс в послеродовой период.

5.2. Ультраструктура гладких миоцитов матки крыс в послеродовой период.

Глава 6. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования:

Гладкая мышечная ткань (ГМТ) является одним из основных тканевых компонентов, входящих в состав органов репродуктивной системы. В настоящее время существует значительное количество работ, посвященных изучению гладкой мышцы сосудистой стенки и внутренних органов [10, 40, 43, 50, 130, 155, 172, 213]. Среди висцеральных органов, гладкая мышечная ткань матки обладает наибольшей амплитудой физиологической перестройки и фенотипических трансформаций в ходе эстрального цикла и при беременности.

Исследованиями ряда авторов были выявлены закономерности гистофизиологии и трансформации гладкой мускулатуры матки во время физиологической беременности [13, 37, 71, 92, 127, 128, 164, 178, 209]. Хорошо известны данные, полученные на основе общеморфологических и физиологических методик, о гипертрофии и гиперплазии миометрия и гладкой мускулатуры маточных труб, при беременности и ряде органической генитальной патологии [23, 61, 82, 88, 103, 118]. В последние годы проводятся многочисленные исследования процесса послеродовой инволюции матки. Значительное количество работ, касающихся послеродовых изменений в матке, посвящено структурным преобразованиям эндометрия [53, 83] и механизмам элиминации коллагена [25, 89, 90, 141, 171, 189, 226]. Несмотря на центральную роль ГМТ в процессе протекания послеродовой инволюции, в настоящее время имеются лишь единичные исследования, касающиеся структурно-метаболических особенностей гладких миоцитов [37, 75, 194].

Известно, что различные отделы матки отличаются не только по анатомическому строению, соотношению тканевых компонентов, но и уровню функциональной активности [1, 9, 74, 87, 95, 96, 103, 115, 175, 184].

Исследования последних лет свидетельствуют о том [40, 190, 219], что в состав популяции гладкой мышечной ткани различных органов входят гладкие миоциты различных типов, отличающиеся по линейным параметрам и структурно-функциональной организации. Вместе с тем, в литературе не удалось обнаружить данных о структурно-функциональной организации, физиологических перестройках, и значении типов гладкомышечных клеток (ГМК) миометрия в разных отделах матки.

Таким образом, представляется актуальным получение объективных данных о типах гладкомышечных клеток, характеристике клеточной популяции в норме и динамике формирования ее перестроек в процессе беременности и после родов, что позволит выявить общие структурно-функциональные закономерности, присущие гладкомышечной ткани разных отделов матки.

Цель исследования - определить особенности морфо-функциональной организации гладкой мускулатуры матки интактных крыс, а также структурно-функциональные закономерности ее трансформации при развитии беременности и в послеродовой период.

Задачи исследования:

1. Изучить морфо-функциональную организацию гладкой мышечной ткани матки крыс на световом и электронно-микроскопическом уровнях.

2. Исследовать структуру популяции, пролиферативную активность и содержание суммарного белка цитоплазмы гладких мышечных клеток матки.

3. Провести сравнительный морфо-функциональный анализ организации гладкой мышечной ткани разных отделов матки.

4. Выявить динамику и механизмы изменения структуры популяции гладкой мышечной ткани матки во время беременности и ранний послеродовой период.

Научная новизна исследования.

Впервые комплексный анализ изолированных ГМК, позволил с большой достоверностью определить линейные и структурно-метаболические параметры миоцитов матки, на основе этих данных определить структуру популяции и оценить пролиферативный потенциал ГМТ отделов матки в интактном организме, в процессе беременности и ранний послеродовой период.

Установлено, что мускулатура матки имеет в своем составе ГМК различного уровня дифференцировки (малые, средние и большие), соотношение которых определяет адаптационные возможности ткани. Показано, что по направлению от рогов к шейке матки происходит последовательное изменение структуры популяции ГМК, которое характеризуется уменьшением представительства малых и увеличением доли больших миоцитов, что определяется особенностями функционирования различных отделов матки. Установлено, что одним из механизмов адаптационной трансформации ГМТ матки является изменение структуры популяции миоцитов.

Научно-практическая значимость.

В результате исследования сформулированы положения, которые существенно углубляют и дополняют современные представления о физиологических механизмах адаптивной трансформации миометрия и роли в них гладкомышечного компонента в различные физиологические периоды. Полученные данные о различии структурно-метаболических параметров ГМК разных отделов матки могут быть использованы для оценки морфофункционального состояния миометрия и служить теоретической основой для изучения ряда патологических состояний в процессе беременности, родов и в послеродовой период на экспериментальных моделях и у человека. Результаты работы могут найти применение в практике научных исследований специалистов, занимающихся

фундаментальными и прикладными проблемами трансформации гладкой мускулатуры матки и висцеральных органов в целом.

Результаты исследования используются в учебном процессе на педиатрическом и лечебном факультетах Северного государственного медицинского университета (акт внедрения от 4.12.12), на кафедре возрастной физиологии и валеологии (акт внедрения от 15.01.13) Северного (Арктического) федерального университета.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гладкая мышечная ткань матки лабораторных животных (крыс) представляет собой сложно организованную клеточную популяцию, в составе которой присутствуют различающиеся по морфометрическим и метаболическим характеристикам малые, средние и большие миоциты, отражающие определенные степени дифференцировки в составе миобластического дифферона.

2. Особенности функциональной нагрузки разных отделов матки обуславливают различия структуры популяции, пролиферативного потенциала, содержания цитоплазматического белка в гладкой мышечной ткани, входящей в состав рогов, тела и шейки матки крыс.

3. Механизмы адаптивной трансформации мышечной ткани матки включают в себя динамичное изменение структуры клеточной популяции и метаболических параметров ГМК. Выраженность физиологической трансформации гладкомышечного компонента разных отделов матки при развитии беременности и в период послеродовой инволюции обусловлена особенностями функциональной нагрузки, имеет разнонаправленный характер и протекает с разной скоростью.

ГЛАВА 1.

ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ГЛАДКОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ МАТКИ

1.1. Гистогенез гладкой мышечной ткани матки.

Изучение синтеза ДНК и кинетики репродукции ГМК при развитии гладких мышц показало, что характерной особенностью изменения митотических циклов этих клеток в процессе развития является постепенное увеличение их продолжительности. Это происходит за счет увеличения длительности всех периодов митотического цикла [77]. Эмбриональные миоциты характеризуются in vivo очень высокой пролиферативной активностью, независимой от факторов роста и не связанной с секрецией митогенов взрослых ГМК, а также обладают способностью к саморегулирующейся пролиферации [154]. Отмечено снижение уровня экспрессии виментина [45] по мере дифференцировки ГМК. Также показано, что в эмбриогенезе в миоцитах меняется соотношение и изоформы ряда сократительных и регуляторных белков: кальдесмона, кальпонина, тропомиозина, альфа-актина, миозина [134, 166].

Данные, полученные при изучении пренатального развития ГМТ стенки матки эмбрионов человека, свидетельствуют о возможности существования единого мезенхимного предшественника ГМ миометрия и стромальных элементов [180]. Даже электронномикроскопически очень сложно отличить недифференцированные мезенхимные предшественники фибробластов и гладких миоцитов [180]. Показано также, что мезенхимные клетки, окружающие парамезонефральный проток, могут развиваться как в ГМ, так и в стромальные клетки эндометрия [202].

Субэндометриальный миометрий человека происходит из Мюллерова канала, в то время как внешний миометрий не имеет мюллеровского

происхождения, однако оба они являются производными мезенхимы [210]. Шейка матки вместе с маткой образуется путем слияния мюллеровых каналов на 12-16 неделе внутриутробного развития [61]. Наиболее ранние проявления специфической дифференцировки ГМК в стенке развивающейся матки крыс обнаруживаются на 17-е сутки эмбриогенеза в "темных" мезенхимных клетках стенок сближающихся дистальных отделов парамезонефральных протоков [105].

В миометрии плода 12-14 недель ГМК расположены в межклеточном веществе и образуют 3 слоя, средний - с циркулярной ориентацией ГМК, наружный и внутренний - с радиальной ориентацией. Выражен полиморфизм клеток (округлые безотросчатые и звездчатые клетки). Пролиферативная активность ГМК внутреннего слоя выше, чем в других слоях. Клетки, экспрессирующие РСИА, распределены в фетальном миометрии равномерно. Типичные зрелые клетки не идентифицируются. Почти все клетки дают отрицательную или слабоположительную реакцию на 8М-актин. О низкой дифференцированности ГМК свидетельствует слабая реакция на виментин. Таким образом, в этот период развития в миометрии преобладают малодифференцированные ГМК [71]. В это время отмечается появление обильной сосудистой сети, которая развивается в наружном слое маточной мезенхимы. В сосудах этой зоны фетальной матки, в составе их средней оболочки уже функционируют вполне зрелые миоциты сократительного фенотипа. И только через полтора месяца - к 20 неделе беременности, в наружном слое интерстициальной мезенхимы начинается процесс дифференцировки её клеток в миоциты - появляются первые признаки внутриклеточного филаментогенеза [92].

Закономерными морфологическими проявлениями раннего лейомиогенеза в мезенхиме презумптивных закладок матки крыс, то есть в стенках дистальных отделов парамезонефральных протоков, являются: изменение формы клеток (она становится вытянутой) и частичная утрата ими отростков, установление межклеточных взаимоотношений, возрастающий

уровень развития органелл интра- и экстрацеллюлярного биосинтезов, появление в цитоплазме специфического гладкомышечного а-актинина, очагов сборки сократительного аппарата и др. [105].

На 20-26-й неделе развития в миометрии плода хорошо развиты 2 слоя - наружный и внутренний. Толщина наружного слоя интерстициальной мезенхимы продолжает нарастать. В наружном слое выделяются две зоны: поверхностная субсерозная и сосудистая - зачаток будущего среднего (сосудистого) слоя матки. В поверхностной зоне содержатся в основном ГМК удлиненной формы с размером около 15-20 мкм. Ядерно-цитоплазматический индекс в них понижен до 0,28, в цитоплазме органеллы развиты незначительно, имеются филаменты. По ультраструктурным признакам эти клетки уже можно относить к гладкомышечным клеткам секреторного фенотипа [92]. Второй тип ГМК представлен более крупными клетками (20-40 мкм). В них ядеро-цитоплазматический индекс снижен до 0,14. Филаменты более выражены, имеют диаметр около 6-7 нм (Шубникова Е.А. и др., 2001). Но только после 32 недели беременности количество миофиламентов и плотных телец в этих клетках достигает величины, которая наряду с другими ультраструктурными маркерами [70] позволяет отнести их уже к гладкомышечным клеткам сократительного фенотипа. С этого периода времени вновь образованные миоциты сократительного фенотипа начинают объединяться в пучки, активно участвуя при этом в создании собственной соединительнотканной «упряжки» [92]. Среди ГМК поверхностной зоны имеются 2 субпопуляции клеток: РСЫА-позитивные и РСЫА-негативные. Первый тип клеток не имеет развитого сократительного аппарата, дает слабоположительную или отрицательную реакцию на 8М-актин. Это мало дифференцированные формы. В более дифференцированных ГМК 8М-актин хорошо выявляется.

В сосудистой зоне среди ГМК имеются оба описанных типа клеток, а также клетки отростчатой формы - звездчатые и У-образные. РСИА-положительные лейомиоциты располагаются преимущественно в

преиваскулярных зонах миометрия. ГМК сосудистой зоны дают положителгую реакцию на 8М-актин и отрицательную - на виментин.

Во внутреннем слое миометрия ГМК сходны с клетками поверхностной зоны наружного слоя, но имеют меньше сократительных филаментов и чаще встречаются РСЫА-положительные [71].

Субпопуляция ГМК сосудистой зоны обеспечивает основной пролиферативный пул миометрия [67, 71]. Это согласуется с уже давно имеющимися данными о том, что большинство гладкомышечных пучков образовано из элементов периадвентициальной прослойки сосудисто-соединительнотканного каркаса, являющегося камбиальным стволом, из которого образуются и фибробластические, и гладкомышечные клетки [64].

В миометрии женщины популяция ГМК гетерогенна на всем протяжении онтогенеза, о чем свидетельствуют иммуноцитохимические исследования 8М-актина, виментина, ядерного антигена пролиферирующих клеток РСЫА и др. [70]. В процессе гистогенеза гладкой мышечной ткани матки крыс происходит: нарастание мономорфности популяции дифференцирующихся лейомиоцитов, усложнение их межмиоцитарных взаимодействий, падение пролиферативной активности и элиминация некоторых из них путем апоптоза. Наблюдается возрастание относительного объема гладких миоцитов и уменьшение относительных объемов их ядер, закономерная значительная редукция органелл биосинтеза и, как следствие, -снижение интенсивности образования сократительного аппарата, компонентов межклеточного вещества и др. [105].

1.2.Современные представления о структурно-функциональной организации

гладкой мышечной ткани матки.

Матка человека и животных является чрезвычайно интересным примером резких масштабных преобразований, периодически происходящих в физиологических условиях: многократное увеличение размеров матки во время беременности, а также уникально высокая скорость процесса

послеродовой инволюции, который активно исследуют с позиции морфологии [16, 37, 90]. Основная масса матки представлена миометрием, который, как и всякая другая гладкомышечная ткань организма, является комплексной морфоструктурой, в которой одновременно функционируют: силовой миометрий - основа сократительной системы матки, нервная система, собственно сосудистая система силового