Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-клеточные изменения в паховых лимфатических узлах крыс при применении интерлейкина-2 в норме и в условиях воспаления

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-клеточные изменения в паховых лимфатических узлах крыс при применении интерлейкина-2 в норме и в условиях воспаления"

На правах рухсописи

СТРЕЛЬЦОВА Елена Ивановна

СТРУКТУРНО-КЛЕТОЧНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ПАХОВЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛАХ КРЫС ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ВОСПАЛЕНИЯ

03 00 25 - гисюлогия, цтолотя. клеточная биология 14 00 15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских паук

Новосибирск - 2007

003066755

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск) и ГОУ ВПО Новосибирском государственном медицинском университете Росздрава

Научные руководители:

доктор медицинских па> к кандидат медицинских наук, доцент

Егоров Вадим Анатольевич Бромбин Александр Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских паук, профессор доктор медицинских пау к

Машагс Светлана Владимировна Волков Александр Михайлович

Ведущая организация:

IОУ В1Ю Алтайский государственный медицинский университет

Росздрава

(I Барнаул)

Защша диссертации оосюшся " '50 2007 I в

часов на заседании диссерыционною совет Д 208 062 05 при Новосибирском государслвенном медицинском унивсрсигое Росздоава (630091 Новосибирск, Красный проспект, 52)

С диссертацией можно ознакомиться в библиоюке Новосибирскою шсударс]веннош медицинскою универсшет (630091. Новосибирск, Красный проспект, 52)

Автореферат разослан '' " 2007 г

Ученый секрс1арь

диссертационно!о совет Д 208 062 05 доктор медицинских наук, профессор

Волков Аркадий Васильевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы: Впервые сообщения о действии ингерлейкина-2 (ИЛ-2) (но разным названиям lymph node activating factor, T cell growth factor, thymocyte specific growth factor и т д ) на лимфоидные органы появились в конце 70-годов прошлого столетия Тогда же было найдено возрастание веса лимфатических узлов, общего числа клеток в них, плотности коркового плато и паракортекса, появление фолликулов со свешыми центрами (Korcakova L , Holub M., 1977)

Рекомбинантный человеческий Ш1-2 может активировать В-метки., индуцируется как их пролиферация, так и дифференцировка в иммуноглобулин-синтезирующие клетки, происходит стимуляция секреции антител (Collins RA, Oldham G, 1993, Poudrier J, Owens T, 1995, Spieker-Polet H et al, 1999)

Размножение Т-клеток регулируется ИЛ-2 Вследствие индукции ИЛ-2-рецепторов, имму но логически нормальные клетки пролиферируют и это продолжается до снижения уровня ИЛ-2 (Nishimura T et al, 1984, Cheever MA et al, 1984, Santoro T J et al, 1984, Vohr H W , Humg T , 1985, Kroczek RA et al, 1987, Shimonkevitz R P et al, 1987, Pierce V E et al, 1988, Hmuma S et al, 1989, Maurer T , Kimber 1, 1991, McCulloch P et al, 1991. D'Souza W N, Lefrancois L , 2003)

В настоящее время ИЛ-2 широко применяют для терапии опухолей и их метастазов в клинике и эксперименте в качестве основного препарата или вводят ИЛ-2 в схему лечения При этом уменьшается сама опухоль, сокращаются или даже исчезают метастазы, увеличивается выживаемость больных Чаще всего иммунотерапию с использованием ИЛ-2 применяют для лечения рака почки и меланомы, но, с не меньшим успехом, лечат и опухоли другого генеза (Pfohler С et al, 2004, Nishikirm T et al, 2004, Sehrama D et al, 2004, (Juan W et al, 2005a, 20056, 2006a, 20066, 2006b, Giacosa R et al, 2004, Inoue T et al, 2005 Tokunaga M et al, 2005, Maker A V et al, 2005, Моисеенко В M и др, 2005, Donskov F , Maase von der H , 2006, Lewis К D et al, 2006, Jack A et al, 2006, Wojas-Pelc A et al, 2006, Dillman R О et al, 2006, Gez E et al, 2007)

Таким образом, несмотря на большой объем литературных данных, посвященных изучению действия на те или иные группы клеток, а также противоопухолевому' эффекту ИЛ-2, в литературе полностью отсутствуют результаты исследований лимфатических узлов после введепия данного цитокина на фоне активного септического воспалительного процесса в регионе лимфосбора

Цель исследования: Выявить сфуктурно-клеточные изменения регионарных и контрлатеральных к гнойной ране лимфатических узлов крыс в условиях применения препарата ИЛ-2

Задачи исследования:

1 Методами свешвой микроскопии исследовать сгр}кгурные изменения лимфашческих учло в крыс в условиях применения ИЛ-2

2 Изучить морфоло£ию регионарных к гаойной ране лимфатических углов в условиях использования ИЛ-2

3 Изучить морфололию конгрлсиералышх к ране лимфашческих углов при введении ИЛ-2

Научная попизна: Впервые было найдено, что в лимфатических у злах крыс после введения ИЛ-2 уменъшае1ся площадь корковою нлаю при одновременном возраслании объема паракорюкса В клеючном сое1аве вссх ¿он лимфашческих узлов было обнаружено высокое содержания эритроцитов и эозинофидов

Впервые исследованы структурно-клеточные изменения регионарных к гнойной ране лимфатических узхов крыс в условиях лечения ИЛ-2 Было найдено уменьшение выражеиносш морфологических изменений лимфатических узлов, что свиде1ельствуег об ускоренном завершении воспалительной реакции

Впервые было обнаружено, что после применения ИЛ-2 в условиях гнойной раны резко возрастает митотическая активность в мякотных тяжах, по сравнению с таковой у нелечеиных животных

Впервые установлено, что в различных зонах всех исследованных лимфатических узлов после введения ИЛ-2 возрастает численность эритроцитов, что связано с повышением проницаемости кровеносных сосудов в самих узлах и в тканях региона лимфосбора

Впервые показано, чго в различных зонах всех исследованных лимфатических узлов после введения ИЛ-2 увеличивается количество эозинофидов, что свидетельствует о возможности развития аллергических реакций

Теоретическое и практическое значение: Полученные в работе данные о характере структурных изменений регионарных и кохггрлатеральных, относительно гнойной раны, лимфатических узлов недеченных животных и крыс после лечения препаратом ИЛ-2 дополняют представ тения об особенностях реакции этих органов на данный цшокин Для сохранности и ранней репарации лимфатических узлов в условиях гнойного воспалешм в регионе лимфосбора целесообразно применение препаратов ИЛ-2. стиму.шрующих пролиферацию и функциональную активность 1-й В-клеток и фагоцитоз у макрофаг ов В связи с тем что введение ИЛ-2 способствует повышению сосудисюй проницаемоеIи, целесообразна разраболка способов стабилизации сосудисюй стпш и улучшения сохранности тадотелиоцитов кровеносных сосудов Эозипофилия, обнаруженная в лимфоидпой паренхиме и синусной системе лимфашческих умов некоюрых животных после инъекций ИЛ-2 може!

свидетельствовать о возможности развития аллергических реакций на препарат и требует применения мер по профилактике данных осложнений

Внедрение результатов исследовании в практику: Результаты исследования внедрены в практику лечебной и научно-исследовательской работы лабораюрии Ценгра новых медицинских технологий ГУ НИИ химической биоло! ии и фундаментальной медицины СО РАН и лечебную рабогу оjделения реанимации и интенсивной терапии гнойной хирурши и отделения гнойной хирургии ОГУЗ "Государственная Новосибирская областная клиническая больница"

На защиту выносятся следующие основные положения:

1 В лимфатических узлах интакшых крыс после введения ИЛ-2 сокращается обьем коркового плато при гипертрофии паракор гекса

2 У живогных после использования ИЛ-2 в условиях гнойной раны в лимфатических узлах была отмечена нормальная площадь паракортикальной зоны При этом бьшо обнару жено уменьшение числа моноцшов, макрофагов и нейтрофилов, по сравненшо с узлами нелеченных крыс

3 После введения ИЛ-2 в структурах всех исследованных лимфатических узлов увеличивается количество эритроцитов и эозинофилов

Апробация материалов диссертации: Основные положения диссертации доложены на 11 научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 2001), V и VII Всероссийских научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2001, 20Ó3), научной конференции «Клиническая иммунология в практическом здравоохранении» (Барнаул, 2002), IV Межрегиональной нау'чно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической иммунологии» (Кемерово, 2004), III съезде иммунологов России (Екатеринбург, 2004) и на объединенном заседании сотрудников кафедр ГОУ BIIO Новосибирского государственного медицинского университета Росздрапа, практических врачей, научного персонала лабораторий ГУ НИИ химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и ГУ НИИ региональной патологии и патоморфолоши СО РАМН (Новосибирск, 2007)

Публикации: По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, 7 из которых в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертаций

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования, 3 глав собственных результатов с их обсуждением, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы Работа изложена на 186 страницах компьютерного текста, содержит 15 таблиц, иллюстрирована 17 рисунками, состоящими из множества ощельных фрагментов Список

лшерагуры включает 304 исхочника (49 русскоязычных и 255 иностранных авторов) Весь махериал, нредсхавлснный в диссерхации, получен, обработан и проанализирован лично автором

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работ основана на резулыахах морфологическою исследования рехионарных к тонной ране и кошрлагеральнык лимфашческих узлов крыс-самцов породы Висхар весом 250-300 1 при развитии гнойною вооналения в условиях лечения нрешраюм ИЛ-2 Группами сравнения (контроля) выступали интактные животные без каких-либо манипуляций, крысы с гнойной раной без лечения и интактные после введения ИЛ-2 в той же дозе и в хе же сроки В каждой хрухше было не менее 12 особей, всего было использовано 48 живогных Все крысы были получены ил вивария ГУ НИИ цшолохии и хенегики СО РАН 9кспсримешальные работы содержание животных осуществляли на базе вивария ГУ НИИ химической биолох ии и фундаментальной медицины СО РАН

Моделирование гнойной раны производили инъекцией 1 мл 10% раствора СаСЬ под кожу наружной поверхности правого бедра (Даценко БМ и др , 1985, Аратский В11 и др, 1986) Препарат человеческого рекомбинантного ИЛ-2 «Ронколейкин» (ООО "Биотех'1, Россия) вводили по 104 ЕД на животное (подкожно в область спины по средней линии в проекции нижней части грудного отдела позвоночника) непосредственно после введения хлорида кальция и повторно спустя 1 неделю Все манипуляции с животными проводили под общим ингаляционным офирным наркозом Контрольных животных выводили из эксперимента вместе с опытными передозировкой эфирного наркоза через 1 недешо после последней инъекции ИЛ-2

Правые (регионарные) и левые (контрлагералъные) паховые лимфатические узлы фиксировали в 4% нейтральном растворе параформадельгида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 часов, обезвоживали в серии этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в парафин Срезы толщиной 5-10 мкм окрашивали хемаюксияином и эозином и по Романовскому (Саркисов ДС, ГТеров ЮЛ, 1996)

Определение структурной орл анизации различных отделов исследуемых органов проводили при увеличении световою микроскопа до 1200 раз Применяли квадратную тестовую сисхему, совмещаемую на экране компьютера с изображением, полученным при помощи цифровой видеокамеры микроскопа Для изучения показателей структурной организации лимфатических узлов (использование объектива с увеличением X 10) конечная площадь тесговохх> квадрата была равна 3600 мкм2 (схх>рона квадрата 60 мкм), при подсчете цшохраммы жлехок (применение объектива с увеличением X 40) - 36 мкм2 (сторона квадрата 6

мкм) (Майбородин ИВ и др, 2005) Статистическую обработку результатов проводили на прикладной статистической прохрамме MS Exccl (Microsoft, USA), определяли среднее арифметическое и ошибку среднею арифметического (стандартное отклонение) Различия между средними считали достоверными при р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Структурная организация правых (регионарных) паховых лимфатических узлов крыс после лечения гнойной раны правого бедра препаратом интерлейкина-2

Соотношение структурных эленентов лимфатических узлов. В

правых паховых лимфатических узлах ингактяых животных после введения Ш1-2, по сравнению с интактным контролем, сила меньше площадь коркового плато на 69,7% при одновременном возрастании объема наракоргекса на 90,7%

В литературе имеются данные, что введение ИЛ-2 приводит к расширению паракортикальной зоны лимфатических узлов за счет стимуляции функциональной и пролиферативной активности Г-лимфоцитов (Chang А Б et al, 2003, Nguyen С L et al, 2003, Parviz M et ai , 2003, Amchrni A et al, 2003, Jackaman С et al, 2003, Andre N D et al, 2004, Hoffmann P et al, 2004, Chen J et al, 2004, Dillman R О et al, 2005, Златник E Ю , Голотина Л Ю , 2005) Несомненно, что за счет возрастания процента паракоргекса в лимфатических узлах сократилось относительное содержание коркового плато

У животных с пелеченной гнойной рапой, относительно иптактного контроля, в регионарных лимфатических узлах уменьшился процент коркового нлаю на 77,2%, но возросло содержание лимфоидпых фоллшеулов с герминативными центрами па 35,9% Кроме того, при воспалении увеличился объем мякотных тяжей на 42,5% При воспалительном процессе в регионе лимфосбора в лимфатические узлы поступает большой объем антигенных веществ После стимуляции антигенами в корковом плато начинается пролиферация и дифференттировка В-лимфоцитов, из которых сначала формируются лимфовдные фолликулы, а мгем, но мере созревания В-лимфоцитов до иммуно- и плазмоблаотов в зшх фолликулах ноявляехся герминативный центр Далее В-клепси постепенно дафференцируясь в плазмоцшы, мигрируют в мякотпые тяжи, вызывая их расширение

При сравнении результатов изучения лимфатических узлов между животными с нелечепиой гнойной ратюй и раной па фоне лечения ИЛ-2 были отмечены юлысо меньший (на уровне шпакгного контроля) на 26,9% пронеш мякошых тяжей у геченных крыс 1акой обьем мякотных 1яжей, видимо, связан с более быстрым завершением воспалительной реакции

Стимуляция иммунных показателей - пролиферации и функциональной активности Т-лимфоцитов B-клеток (Kroczek R Л et al, 1987, Poudrier J„ Owens Г, 1995, Spieker-Polet H et al, 1999) фатвдю« y макрофахов (Hancock WW et al, 1986) приводи! к бысхромл очищению раны, а значш к меньшему объему антшенных веществ, попавших в opianmy, меньшей ciсисни реакции клеток шшзмоцшарпохо ряда к меньшей выраженноеш реакции макетных хяжей

У животных после лечения раны ИЛ-2, опюсителмю ишакпшх после инъекций этого цитотсыта, была отмечена нормальная площадь нарако]Ликальной юны наряду о расширь „яеч мякошы\ хижей на 13,7% ИЛ-2 сгимулирусх пролиферацию Т-хсдехок и приводит к расширению Т-зачисимых тон лимфатических узлов (Korcakova L Holub M, 1977, Musiarn P et al, 1989) При воспалении нройсходш мшрация. Т-лимфопитов из яимфоидных органов, в частность лимфатических узлов, в пораженные ххани Архивация цролиоерацм i-химфоцигов ИЛ-2 позволяет сохрани! ь объ~м хмракорт ихса тьной юны, иесмо1ря т>.» миграцию из нее клеток, за счет -усиления их миготнческой активности Таким образом, можно ошешть м'ивм) схеперъ реакции лимфатических узлов на воспалительный процесс в регионе у животных после введения ИЛ-2 относительно нелечекчых крыс

Цитоарзштектоника коркового ьлато В ци гоархитек тонике 1соркоього плато животных из интактпого контроля и здоровых после введения ИЛ-2 достоверно отличалось только относительное и абсолютное число иммуно- и плазмобластов после введения препарата больше в 2.1 и 2,4 раза, соответственно

Скорее всего такие изменения произошли в результате стимуляции ИЛ-2 пролиферативной и функциональной амивноста В-лимфоцитов (Kroczek R A* et aî. 1987, Poudrier J Owens T 1995, Spieker-Polet II et al, 1999) В результате такого «оздействия В-шмфоциты начинают дифференцироваться в плазматические гаетки и при этом проходят через стадии сначала имму нобласгов и, далее, илазмоблаоплх В результате ттого численность незрелых клеточных форм в цитоархитектонике кортсового плато возрастает

В ф\ пне нелеченных животных, относитетьно интактном контроля, появились эритроциты, возросло процентное и абсолютное чисто макрофагов в 3,9 и 3,2 раза, соответственно, нейтрофилоь - в 10,7 и 8.3 раза, соответственно, при одновременном снижении процента и численной плотности лимфоцитов ira 32,2% и 59,6% также соответственно Сокращению числа лимфоцитов, скорее всею, способствует их усиленная дифференцировка в бласгы и плазма!ичсские клеши, происходящая иод воздействием антигенов из лимфы поступающей из участка гнойной рапы Для у деления из лимфы антигенных веществ в различных структурах лимфатических узлов ирису ютвует какое-то число фаюциюв -

иейтрофилов и макрофагов В результате воспаления в тканях, в лимфе содержится значителыпдй объем чужеродного материала, для его элиминации в лимфатических узлах резко возрастает численность клеток-фа! оцтов, которые сами по себе или их предшественники мигрируюi в узлы и i кровеносных сосудов, проходящих через данные органы

К появлению эригроцшов среди клеток коркового плато лимфашческих узлов на фойе гнойного воспаления, наиболее вероятно, приводи/ повышение проницаемости кровеносных сосудов, происходящее в результате влияния биологически активных веществ, содержащихся в .шмфе, притекающей к органу из воспалительного очага (Кузин МИ, Косдчочецок Б М 1990)

В качестве различий между группами животных с нелеченной гнойной раной и после лечения раны ИЛ-2 можно отмстить большую численную плотность лимфоцитов на 26% на фоне введения препарата Выше мы уже ошечали, что ИЛ-2 ешмулируш пролиферацию и диффереццировку В-лимфоцитов Го есп> в результате лечения гнойной раны препаратом ИЛ-2 в корковом плато наблюдается большая сохранность количества лимфоцитов

У леченных ИЛ-2 животных, относительно ингактных после инъекций этого же препарата в цитоархитектонике коркового плато было отмечено появление эритроцитов, увеличение относительного и абсолютного числа макрофагов в 4.6 и 4,3 раза, соответственно, при одновременном снижении относительного количества и численной плотности лимфоцитов на 25,7% и 32,3, также соответственно Эти изменения практически полностью, кроме абсолютной численности нейтрофилов, повторяют различия между неполучавшими ИЛ-2 интактными крысами и нелеченными животными с гнойной раной По-видимому , эти различия обусловлены теми же самыми причинами, которые были рассмотрены выше

Следует отметить, что введение ИЛ-2 может само по себе служить причиной появления эритроцитов в структурах исследуемых органов вследствие повышения проницаемости кровеносных капилляров (Harms В A et al, 1989. 1991, Bechard D Е et al, 1990, Sobotka PA et al, 1990, Morse ED et al, 1990, Lei D et al, 1994, Faggiom R et al, 1994, Mahvi DM et al, 1996, Jerome EH et al. 1996 Quan W et al, 20056) При этом усиливается связывание лимфоцитов с эндотелием (Salmi М et al, 1992, 1995, Pryce G et al, 1997, Bielawska-Pohl A et al, 2005) и даже возможны повреждение и лизис эпдотелиоцитов (Duke S S et al, 1989, Hayakawa M, 1992)

Отсутствие достоверных различий числа иейтрофильных лейкоцитов скорее всего, обусловлено более быстрым очищением (заживлением) гнойной раны па бедре в результате лечения В результате более быстрого завершения воспалительной реакции снижается

численное 1Ь нейфофилов как в ране (уменьшается поступление их с лимфой в регионарные лимфахические узлы), так и миграция их из крови в лимфоидную паренхиму узлов

Ци 1 оир\н гею опнка наракор i икдлыюи зоны. В наракортсксс лимфатических узлов животных из шггактного коптроля и здоровых нослс введения ИЛ-2 можно отмстить юлько значительную эозинофилию у последних, численная плох но«ь эгич лейкоцшов была выше в 4,1 раза

Увеличение числа эозинофилов в крови после применения данного цитокина отмечают и другие исследователи (Nomura К , Fujioka Г . 1993, LeBcl CP et al, 1995, Pectasidcs D et al, 1998) При введении низких доз ИЛ-2 (100 БД) вокруг опухоли и в область регионарных лимфатических узлов была найдена выраженная инфильграция опухоли лимфоцихами и эозинофилами (Musxam Р et al „ 1989, Balemans L I el al, 1993) He исключено, 4i о эозинофилия связана со стимуляцией иммунитета, шперреактивностью иммунной системы и аллергизацией организма В таком случае, видимо, применение нрепараюв ИЛ-2 необходимо проводить под прикрытием десенсибилизирующих средств

В группе нелеченных животных, относительно интактного контроля, возросло относительное содержание делящихся клеток в 2,2 раза, процентное и абсолютное число моноцитов - в 2,6 раза, при одновременном снижении процента и численной плотности лимфоцитов на 28,2% и 47,8% соответственно При гнойном воспалении в регионе для поглощения антигенов в узлах увеличивается число фагоцитов, в том числе и моноцитов - предшественников макрофагов С попаданием в лимфатические узлы антигенных и токсических веществ, по-видимому, связано и усиление в паракортикалыюй зоне митотической активности

У леченных ИЛ-2 животных, относительно иитактных после инъекций этого же пренараха, в цитоархитекгоишее паракоршкальной зоны было найдено только снижение относительного количества и численной плотности лимфоцитов на 23% и 39,7%, соответственно Считаем необходимым отметить довольно значительное число эозинофилов в обеих группах В литературе имеются результаты исследований, свидетельствующие, что ИЛ-2 вызывав х перераспределение 1-клеток в организме (Рзсгсе VE et al, 1988. Sarna G et al, 1994), стимулирует их миграцию (Meneses A et al, 2003) Обрабохка ИЛ-2 усиливает способность нормальных лимфодшов к эх^гравазации (Bhrmger WD et al, 1998) Возможно, что ахстипировапные аншгенами из раны и стимулированные ИЛ-2 лимфоциты мигрируют из лимфатических узлов в пораженные ткани

Цитоархитектоиика центров размножения личфои.шых фолликулов с i ершшагавньгаи цен ¡рами. В херминах шшых цешрах лимфоидных фолликулов достоверные изменения не были обнаружены при сравнении результатов между группами животных как из интактною

кот роля и здоровых после введения ИЛ-2, так и с нелеченной гнойной раной на бедре и после лечения данной раны эгим цигокином

По сравнению с интактным контролем, в группе нелеченных животных возросло относительное содержание иммуно- и плазмобластов на 36,4%, при одновременном снижении процента лимфоцитов на 78,5% При воспалении в лимфашческие узлы поступает значительный объем ашшенных веществ, коюрью схиму лируют дифференщировку клеток В-линии За счех этою в центрах размножение возрастает численность незрелых клеточных элементов - иммуно- и плазмобластов и, параллельно этому снижается процент лимфоцитов

У леченных ИЛ-2 животных, относительно ннтактных после инъекций этою же препарата, в цитоархитектонике светлых центров было охмечено возрасхание относительного числа макрофагов в 2,7 раза на фоне снижения нроненга лимфоцитов в 2.3 раза Не исключено, что большая степень снижения содержания лимфоцитов в центрах размножения при лечении воспаления ИЛ-2 может быть связана и с ускоренной дифференцировкой этих клеток, и с миграцией их из узлов в кровеносное русло, миграцией в пораженные ткани, и с сочетанием этих процессов

Цитоархитектошпса мякотных тяжей. В клеточном составе мякотных тяжей при сравнении полученных результатов между группами животных из интактного контроля и здоровых после введения ИЛ-2 достоверные различия найдены не были В мякотных тяжах преобладают плазматические клетки Мы не нашли в литературе других данных о действии ИЛ-2 на плазматические клетки, кроме того, что препарат может стимулировать синтез антител у клеток В-линии (Эргекег-РоМ Н е1 а1, 1999) Видимо, в связи с этим достоверные изменения между данными двумя группами живогпых не были обнаружены

В группе нелечепшлх животных, относительно интактного контроля, появились эритроциты, возросло процентное и абсолютное число иммуно-и плазмобластов на 60% и 89,7%, соответственно, относительное содержание макрофагов па 54,3% Выше мы уже рассматривали возможные причины появления эритроцитов (нарушения микроциркуля/щи и повышение нроницаемосш кровеносных сосудов) и макрофагов (миграция из участка воспаления и кровеиосного русла) в личфойгдной паренхиме лимфатических узлов нря хнойном воспалении в регионе лимфосбора

Поступление антшенов ш рехиохха при хнойном воспалении стимулирует пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов Можно предположить, что в результате активации данных процессов, в мякотных тяжах оказывается часть относительно незрелых клеток В-линии (иммуно-и плсимобласюв). кохорые уже хам завершаю! дифферешщровку

Не были обнаружены достоверные отличия и при сравнении результатов между группами животных с нелеченной гнойной раной и

после лечения раны ИЛ-2 Но здесь можно отметить резкое возрастание митотяческой активности в мякотпых тяжах лимфатических узлов крыс из последней группы К огамуляции ми-'отческой активности В-лимфоцитов приводит как аншгонная стимуляция лимфатических у гюв, jaK и введение ИЛ-2 (Kroc/ek R A et al, 1987, Poudrier Т. Owens Т , 1995, Spieker-Polet H et al, 1999) Не исключено, что появление и резкое увеличение числа фигур мигоюв в мякошых 1яжах лимфатических узлов живошых обусловлено совместным действием факюров, приводящих к появлению в данных стр}ктурах незрелых клсточш>1х форм (иммуно- и плазмобластов), сохраняющих пролиферашвных по!ендиал, о факгорами, резко С1имулирующими мшотическую активное 1ь у данных клеток

У леченных ИЛ-2 животных, относительно ишакгаых после инъекций этого же препарата, в цитоархитекюншсс мякошых тяжей увеличился процент макрофагов на 53,4% и иммуно- и плазмобластов на 68,8% Изменения были практически нкже выражены, как и при сравнении резулыаюв в группах нелечешшх крыс и иш¿юного коипгроля и скорее всего, обусловлены теми же самыми вышеизложенными причинами

Строение левых (контрлатеральных) паховых лимфатических узлов крыс после лечения гнойной раны правого бедра интерлейкином-2 Соотношение структурных элементов лимфатических узлов. В

левых лимфатических у злах интактных животных после введения ИЛ-2, по сравнению с интакшым контролем, стала меньше площадь коркового плато на 76 3% при одновременном возрастании объема паракортекса на 80,3% Это полностью соответствует литературным данным о том, что применение ИЛ-2 приводит к расширению паракортикалыюй зош>1 лимфашчес-ких узлов за счет стимуляции функциональной и мигошческой активности Г-лимфопитов (Chang A h et al, 2003, Nguyen CI et al , 2003, Par viz M et dl, 2003, Anichim A et dl, 2003. Jaduman С et al, 2003, Andre ND et al, 2004, Hoffmann P et al, 2004 Chen J et dl, 2004, Ddlman R О et al, 2005, Златншс Е Ю , Голотина Л Ю. 2005) За счет возрастания процента паракортекса в лимфатических узчах сократилось относительное содержание коркового плато

В контрлатеральных к гнойной ране лимфатических узлах не было найдено достоверных различий между шпактными и живошыми с 1 но иной раной, как без введения тем и другим ИЛ-2. так и после иньекций данного препарат Большая часть токсических и антигенных веществ ш пораженных тканей всасывается именно в лимфу и uocsynaei в ретионарные лимфашческие узлы (Сапин M Р и др , 1978, Бородин Ю И , Григорьев В H, 1986) Кровеносное русло также реагирует на гнойный воспалительный процесс, но очень быстро наступает его блокада в регионе

воспаления для профилактики гематогенной диссеминации Видимо, в связи с ранней блокадой кровеносных капилляров в кровь поступает очень мало юксинов и антшенов, и эти чужеродные вещества не могу г оказать достгочно заметного влияния на соотношение структурных элементов конгрлагсральных лимфатических узлов

Цтоархитекюыика коркового плаго. В клеточном составе коркового TLiaio паховых лимфатических узлов, контрлатеральных к шойпой ране, было найдено достоверное изменение только одного показателя После введения ИЛ-2 интактпым животным была выше относительная численность иммуно- и нлазмобласгов на 23,2%, чем у шпакхпых крыс без каких-либо мапицу.хянии По-видимому, такие изменения обусловлены деживием ИЛ-2, который, согласно литературным данным, стимулирует пролиферацию, дифференцировку и функциональную активность клеток В-ряда (Collins R А, Oldham G , 1993, Poudncr J , Owens T , 1995, Spxeker-Polet H ct al, 1999)

Цигоархитекюиика наракоргикалыгой юны. В

парахшртикальной зоне лимфатических узлов после введения ИЛ-2 интакшым крысам произошло резкое возрастание численной плотности эозинофилов и эритроцитов в 5.4 и 7 раз. соответственно, относительно интактного контроля без любых воздействий Мы уже выше сообщали, что, согласно литературным данным, возможно увеличение количества эозинофхшьцых лейкоцитов (Musxanx Р et al. 1989, Balemans L Т et al, 1993, Nomura К, Fujioka I , 1993, LeBel С P et al, 1995, Pectasxdes D et al, 1998) посте применения препаратов ИЛ-2 При применении ИЛ-2 усиливается и проницаемость эндотелия кровеносных сосудов (Salmi М. et al, 1992, 1995, Lei D et al, 1994, Faggxonx R et al, 1994, Mahvx D M. et al, 1996 Jerome EH et al, 1996, Pryce G et al, 1997, Quan W et al, 20056, Bxelawska-Pohl A et al, 2005)

Цитоархитектонпка лимфоидных фолликулов и мякотных тяжей. В цитоархитектохшке лимфоидных фолликулов и мякотных тяжей левых (коптрлатералыхых к гнойной ране на бедре) паховых лимфатических узлов между всеми сравниваем1>ши группами животных достоверные различия обнаружены не были Основной объем токсинов и антигенов из воспаленных тканей поступает в правые (регионарные) лимфатические узлы Видимо. 1соличества антигенов, поступающих из крови в контрлатералыхые лимфатические узлы недостаточно для заметной стимуляции клеток данных В-зависимых структур этих органов и, в связи с этим. ИЛ-2 пе оказывает выражехшого действия на пролиферацию и дифференцировку неакшвировашхых клеток в них

Сравнительная характеристика изменений регионарны; и контрлатеральных лимфатических узлов крыс после лечения гнойной раны интерлейкином-2

В соотношении стру кту р и различных клеточных элементов между правыми (регионарными) и левыми (кошрлагеральными к хнойкойране на правом бедре) паховыми лимфахическими узлами достоверные различия найдены не были у ишакхных живохных без каких-либо манипу.хяций и интактных крыс после введения ИЛ-2 В данном случае, видимо, отсутствие достоверных результатов связано с тем, что не было различных воздействий на сравниваемые органы В группе интактного контроля вообще не ххроизводили каких-либо манипу.хяций с животными В хруххне с введением ИЛ-2 здоровым (итактным) крысам иньекции были сделаны в область нижнехру дного ох дела спины и, таким образом, воздействие препарата было одинаковым на оба сравниваемых у зла

Различия в соотношении структурных элемешов лимфатических узлов. У животных с нелеченной гнойной раной на правом бедре в регионарных паховых лимфатических узлах была достоверно меньше объемная плотпостъ паракортикальной зоны в 2,1 раза, но больше относительная площадь мякотных тяжей на 37,3%, по сравнению с контрлатералышми узлами Однонаправленные изменения были также обнаружены при сравнении различий между лимфатическими узлами в группе крыс при лечении гнойной раны ИЛ-2 В регионарных лимфатических узлах также была ниже площадь паракортекса на 16,1%, но вхлпе процент на срезе мякотных тяжей на 34,5%, относительно контрлатералышх органов

Исследование предпринято спустя 2 недели после моделирования гнойной раны, за это время, по-видимому, уже образовалось, дифференцировалось и мигрировало в мякотные тяжи достаточно много плазматических клеток Скоре всего, за счет этого и произошла гипертрофия этих структур Сокращение продета паракортекса, возможно, произошло как за счет гипертрофии дрч гих стру ктур (мозгового вещества), так и вследствие миграции лимфоциюв из наракор шкальной зоны в пораженные ткани (Pierce VP] et al, 1988, Sarna G et al 1994, Ehrxnger WD et al, 1998. Meneses A et al, 2003)

Различия в цитархитектоиике корковою плат. В корковом плато регионарных лимфатических узлов животных с нелеченной х нойхгой раной, по сравнению с контрлатеральными органами, присутствовали эритроциты, были выше относительное число и числехшая плотность макрофагов в 3,3 и 2,9 раза, соответственно, хго были достоверно меньше на 29,3% и 45,6%, хакже соохветственно, относительная и абсолютная численность лимфоцитов

При сравнении различий между лимфатическими умами в группе крыс при лечении гнойной раны ИЛ-2 было обнаружено, чю в регионарных органах, относительно контрлатеральных, были выше процент и число на единицу площади среза макрофагов в 3,6 и 3,5 раза, соответствехпю, но ниже на 24,1% процентное содержание лимфоцитов Следует обратить внимание, чю и в тех и в других лимфатических узлах нрисутслвовали эритроциты

Наиболее вероятно, что все указанные различия связаны с поступлением в регионарные лимфатические узлы токсичной лимфы с высокой концентрацией антигенов из участка воспаления Между регионарными и контрлатеральными узлами у леченных ИЛ-2 животных с хнойной раной изменения не хакие значихельные, как у нелеченных крыс Это, по-видимому, связано со стимуляцией иммунных процессов ИЛ-2, более быстрым очищением раны и ранним насхушхенисм ренаративных процессов в ней Быстрое заживление раны приводит как к меньшему посхуплению токсичной лимфы в рехионарные узлы, хак и меньшей стимуляцией через кровь контрлатеральных органов

Присутствие эритроцитов в регионарных узлах и отсутствие этих клеток в контрлатеральпых у нелеченных крыс объясняется изменениями сосудистой проницаемости и повреждениями эндотелия кровеносных сосудов при гнойном процессе Однако, при лечении раны ИЛ-2 эритроциты присутствовали в корковом плато обоих лимфатических узлов животных этой группы Видимо, в регионарных лимфатических узлах наличие клеток красной крови обусловлено как влиянием воспалительного процесса в регионе, так и действием препарата А в контрлатеральпых -толх>ко действием ИЛ-2 на кровеносные сосуды, проходящие через лимфоидпую паренхиму данных органов

Различия в циюархигектоиике наракор шкальной юны. В паракортексе у животных с нелеченной гнойной раной в регионартн>1х лимфатических узлах, по сравнению с контрлатеральными, было на 23,1% достоверно меньше относительное число лимфоцитов, но в 2,4 раза больше процент макрофагов Дахпхые отличия, несомненно, обусловлены разной аеиеаью антигенной схимуляции органов

У 1фыс после лечения гнойной раны ИЛ-2 в правых (регионарных) лимфатических узлах, относи! ельно левых, был достоверно меньше юлько процехгх лимфоцихов на 17,8% Оюугсхвие различий числа махсрофахов може1 быть связано с тем, чю после применения ИЛ-2 быстрее начинаются репаративные процессы в ране, снижается объем антигенов в пораженных тканях, и количество фагоцитов, мигрирующих в регионарные лимфатичесхсие узлы из крови и лимфы, умеш>тается

Различия в ци гоархи тектонике центров размножения лимфоидымх фолликулов с термин;и икнымп ценерами. Не были обнару жены достоверные отличия при изучении цитоархитектоники

герминативных центров лимфоидных фолликулов между регионарными (к гнойной ране) и контрлатералъными лимфатическими узлами у нелеченных животных После лечения гнойной раны ИЛ-2 в регионартлх лимфатических узлах, относительно контрлатеральных, был достоверно меньше на 99,4% процент лимфоцитов при одновременно большем в 2,1 раза относительном числе макрофагов

Снижение числа лимфоцшов, скорее всего, в данном случае связано с усилением их дифференцировки в иммуно- и плазмобласш и, далее, в плазматические клетки, под совместгалм воздействием антигенной стимуляции из притекающей из воспаленных тканей лимфы и нрепараы ИЛ-2

Различия в ци 1 оархнтектоыике мякотных шжей. У животных с нелеченной гнойной раной в мякотных тяжах регионарных к ране узлов присутствовали эритроциты, было больше на 66,8% и 95,7%, соответственно, относительное и абсолютное число иммуно- и пла *мобласт ов и па 49% продет макрофагов, по сравнению с состоянием контрлатеральных органов Наличие эритроцитов в региональных узлах и <л сую тис этих клеток в контрлатеральных, наиболее вероятно связано с поступлением их из региона раны, где появление клеток красной крови обусловлено нарушениями микроциркуляции и сосудистой проницаемости Более высокое число бластов и макрофагов в региональных узлах, видимо, зависит от большей степени антигенной стимуляции этих узлов В данные органы антигены и токсины из места воспаления проникают вместе с афферентной лимфой, тогда как в контрлатеральные - только посредством внутриузлового кровеносного русла

После лечения гнойной раны ИЛ-2 в регионарных лимфатических узлах только процент незрелых клеточных элементов был достоверно больше на 58 8%, чем в контрлатеральных Эритроциты присутствовали в паренхиме тяжей обоих сравниваемых узлов Меньшая выраженность различий между регионарными и контрлатеральными органами у леченых-животных, по сравнению с нелеченными. наиболее вероятно, обусловлена более быстрым очищением раны после применения ИЛ-2 и меньшей разницей в степени антигенной нагрузки между правыми и левыми лимфатические узлами

ВЫВОДЫ

1 В лимфатических узлах крыс после введения ИЛ-2 уменьшается площадь коркового плато при одновременном возрастании объема паракортекса В клеточном составе всех зон увеличиваеюя содержание эозинофилов и эритроцитов

2 У животных с нелеченной гнойной рапой в регионарных лимфатических узлах уменьшаю юя относительные размеры коркового шито счс!

расширения структур мозгового вещества В лимфоидиой паренхиме и синусной системе узлов присутствуют эритроциты, увеличивается число иммуно- и нлазмобласюв, макрофагов и пейтрофююв при снижении числа лимфоцитов

3 У животных после использования ИЛ-2 в условиях гнойной раны в лимфа шческих узлах была отмечена нормальная площадь паракортикалыюй зоны При этом было обнаружено уменьшение числа моноцитов, макрофагов и нейтрофилов но сравнению с узлами нелечетшых крыс

4 Обнаруженные морфоло1 ические изменения в регионарных лимфатических узлах животных с гнойной раной более значительны, по сравнению с конгрлатеральными узлами

5 В различных зонах всех исследованных лимфатических узлов животных после введения ИЛ-2 возрастает численность эритроцитов, что связано с повышением проницаемости кровеносных сосудов в результате действия препарата

6 В различных зонах всех исследованных лимфатических узлов животных после введения ИЛ-2 возрастает количество эозинофилов, что свидетельству ет о возможности развития аллергических реакций

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 В связи с тем, что гнойный воспалительный процесс приводит к нарушению структуры регионарных лимфатических узлов целесообразно применение препаратов ИЛ-2 для сохранности и ранней репарации этих органов

2 В связи с тем, что введение ИЛ-2 способствует повышению сосудистой проницаемости, необходима разработка способов стабилизации сосудистой стешш

3 Эозинофилия лимфоидной паренхимы лимфатических узлов после инъекций ИЛ-2 может свидетельствовать о возможности развития аллергических реакций, что требует применения мер профилактики

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Овечкин А В . Шалганова И Г , Захарова II Ф , Мешков М В , Ведяшев Л В , Абаимов О В , Стрельцова Е И, Леплина О Ю , Тихонова М А, Черных Е Р, Останин А А Изучение эффективности ронколейкина в комплексном лечении больных с гнойно-хирургической патологией с позиций доказательной медицины // Актуальные вопросы современной медицины Мат 11 науч-прак копф врачей - Новосибирск 2001 - С 258-259

2 Стрельцова Е И , Бромбип А И , Зайнутдинов Ю Г, Тюрин И Н, Шустова И К , Уфимцев В А, Эвенкии А В , Шалганова И Г, Васильев СВ, Лештина ОЮ, Тихонова МА, Черных ЕР, Останин А А

Рандомизированные, двойные-слепые, плацебо-контролируемые исследования эффективности экстракорпоральной иммунотерапии при лечении хирургических больных с гнойно-септическими заболеваниями предварительные результат // Актуальные вопросы современной медитщиы Мат 11 науч-прак конф врачей - Новосибирск, 2001 -С 264-265

3 Тихонова М А , Овечкин А В , Агеев Н Л , Стре.тьцова Е И , Лешшна

0 Ю , Черных Е Р , Останин А А Биологическая активность сыворотки крови больных с хируршческим сепсисом //Мед иммунология -2001 -Т 3 -№2 - С 153-154

4 Лешшна О Ю , Агеев IIЛ, Овечкин А В , Захарова IIФ, Стрельцова Е И. Черных Е Р , Ошанин А А Характеристика иммунных нарушений у больных с гнойно-хирургической патологией // Мед иммунология -2001 -Т 3 - № 2 - С 197-198

5 Агеев Н Л , Шамрай Н А, Овечкин А В , Захарова Н Ф, Стрельцова Е И, Леплина О Ю , Черных Е Р , Останин А А Ронколейкин в лечении больных с гнойно-хирургической патологией предварительные результаты рандомизированных, двойных-слепых плацебо-кошролируемых клинических испытаний // Мед иммунология - 2001 -Т 3 - № 2 -С 301

6 Останин А А, Черных ЕР, Леплина ОЮ, Тихонова МА, Овечкин А В , Агеев IIЛ , Захарова Н Ф , Стрельцова Е И Эффективность цитокинотерапии Ронколейкином в комплексном лечении хирургической инфекции Пособие для врачей С -Пб Изд-во С -Петерб ун-та, 2002 28 с

7 Останин А А , Леплина О Ю , Тихонова М А, Шевела Е Я, Курганова Е В, Стрельцова Е И, Черных Е Р Цитокия-опосредовашше механизмы развития системной иммуносупрессии у больных с гнойно-хирургической патологией // Цитокины и воспаление - 2002 - Т 1 - №

1 -С 38-45

8 Останин А А , Агеев Н Л, Зайнутдинов Ю Г , Стрельцова Е И , Овечкин АВ, Шустова ИК, Леплина ОЮ, 1ихонова МА, Черных ЕР Эффективность цитокинотерапии рекомбипантным интерлешсипом-2 при лечении больных с хирургическим сепсисом // Клиническая иммунология в практическом здравоохранении - Барнаул, 2002 -С 3041

9 Останин А А, Леплина ОЮ, Тихонова МА, Зайнучдшгов Ю1 , Стрельцова Е И, Овечкип А В , Черных Е Р Хирургический сепсис I Иммунологические маркеры системной воспалительной реакции // Вест хирургии -2002 -Т 161 - № 3 -С 101-107

10 Останин А А, Зайнутдинов Ю Г , Стрельцова Е И . Овечкин А В , Агеев Н Л, Леплина О Ю, Тихонова М А, Черных Ь Р Хирургический сепсис II Эффективность иммунотерапии

рекомбинангным интсрлейкином-2 // Вест хирургии - 2002 -Т 161 -№4 - С 79-84

11 Черных Е Р, Леплина О Ю , Сахно Л В , Тихонова М А, Шевела Е Я , Фридлянд И Ф , Ступак В В , Центнер М И , Никонов С Д , Соловьева И Г . Стрельцова Е И , Останин А А Роль апоптоза и анергии Т-клеток в развшии иммунной недостахочности при инфекционно-воспалитсльных и онкологических заболеваниях // Мед иммунология

- 2003 - Т 5 - № 3/4 - С 365-366

12 Черных Е Р , Леплина О Ю . Тихонова М А, Курганова Е В , Схрельцова ЕИ, Останин А А, Козлов В А Феномен Т-клеточной анергии при хирургическом сепсисе И Мед иммунология - 2003 - Т 5 - № 6 -С 46-48

13 Черных Е Р , Леплина О Ю . Шевела Е Я , Тихонова М А , Курганова Е В , Фридлянд И Ф . Никонов С Д , Стрельцова Е И, Останин А А Апоптоз и анергия Т-клеток в патогенезе иммунной недостаточности при инфекционно-воспалительных и онкологических заболеваниях как новая мишень иммунотерапевтических воздействий // Актуальные вопросы клинической иммунологии Мат IV Межрегион науч -прак копф - Кемерово. 2004 -С 73-81

14 Черных Е Р . Курганова Е В Шевела Е Я, Сенюков В В , Кожевников В С , Останин А А, Стрельцова Е В , Козлов В А Характеристика 1РМ-у и 1Е-4 продуцирующих клеток у больных тяжелым сепсисом // Russian J Immunology Мат III съезда иммунол России - 2004 - Vo 1 9

- Suppl 1 -Р 302

15 Черных Е Р , Кур1^анова Е В . Сенюков В В , Шевела Е Я , Стрельцова Е И , Кожевников В С . Остахшп А А, Козлов В А Цитокин-зависимые механизмы Т-клеточпых дисфункций при хирургическом сепсисе // Цитокины и воспаление - 2005 -Т 4 - № 2 - С 45-53

Автор искренне благодарен научным руководителям дмн В А Егорову и к м н А И Бромбину за научно-методическую помощь, ценные замечания и консультации в ходе выполнения работы

Подписано к печати 26 09 2007 формах- - 60x84 -1 печатный лист

Бумага офсетная Печать Duplo DP-43S 1 ираж 100 э к i Номер заказа № 523 1 ипография ООО "Ю1 УС 11РИНI" г Новосибирск, у л Залесского, 4