Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные закономерности в металлобелках на примере цитохромов класса c

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные закономерности в металлобелках на примере цитохромов класса c"

00348421и

На правах рукописи

Дикая Елена Владимировна

Структурно-функциональные закономерности в металлобелках на примере цитохромов

класса с.

03.00.04 - биохимия 02.00.15-катализ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2009

003484210

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в Университете Болоньи (Италия).

Научный руководитель:

Доктор химических наук, профессор А. И. Дикий

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор А. И. Ярополов Доктор биологических наук, профессор А. В. Максименко

Ведущая организация:

Институт физиологически активных веществ РАН

Защита состоится « О^Г^Ъ^?-* 2009 г. в 16 часов на

заседании Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, ауд. 202

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического

факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_ Л/ » 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

И.К.Сакодынская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Установление взаимосвязи между структурой белка и его функциями в организме является важной задачей современной биохимии и биокатализа. Подобные исследования необходимы как для выяснения функций белков и механизмов метаболизма того или иного организма, так и для создания биоматериалов с заданными свойствами. Для понимания молекулярных основ биокатализа необходимо обладать детальной информацией о трехмерной структуре белка, а также о конкретных структурных характеристиках, определяющих его физико-химические свойства.

Для многих важнейших биологических процессов необходимы металлобелки. Однако, нельзя приписать какому-либо конкретному металлу только ему одному свойственную функцию в биокатализе. Один и тот же металл может иметь различные функции, в то время как различные металлы участвуют в сходных каталитических реакциях. Стоит отметить разницу между сравнительно небольшим количеством биологически важных металлов и многообразием функций, которые они выполняют.

Окислительно-восстановительные ферменты и металлобелки составляют более 40 % всех классифицированных Международным союзом биохимии и молекулярной биологии белков. Они играют важную роль в сигнальных процессах, отвечающих за регуляцию генов и их экспрессию, в конверсии энергии в процессах фотосинтеза и дыхания.

Изменяя структуру и природу белкового окружения металла в активном центре, живые организмы способны эффективно регулировать физико-химические свойства этих белков. Одной из важнейших функциональных характеристик металлобелков является их окислительно-восстановительный потенциал. На его значение влияют множество факторов, в том числе координационная геометрия активного центра металлобелка, природа лигандов иона металла и доступность активного центра белка для молекул растворителя. В то же время значение потенциала в значительной мере зависит от внешних условий, в том числе, рН среды, ионного состава и диэлектрических характеристик растворителя. Эта зависимость особенно важна с физиологической точки зрения, т.к. позволяет установить, каким образом внешние условия влияют на процессы электронного переноса, протекающих в живых организмах.

Цитохромы являются важным классом металлобелков, участвующих в процессах электронного переноса и окислительно-восстановительного катализа. Изучение влияния внешних условий на структуру и физико-химические свойства цитохромов позволяет связать структурные особенности этих белков с их функциями, и таким образом, установить их структурно-функциональные особенности.

Цель работы и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось:

• получение данных о структуре цитохромов класса с из различных источников;

• установление функционально важных структурных элементов в соответствующих классах цитохромов;

• изучение влияния внешних условий на структуру цитохромов с и их электрохимический потенциал;

• соотнесение полученных структурных данных с функциональными свойствами этих белков - переносчиков электронов.

Для этого в работе были поставлены следующие задачи:

1. Выделить низкоспиновые и высокоспиновые цитохромы с из различных источников.

2. С помощью различных физико-химических методов получить данные о структуре выделенных цитохромов;

3. Изучить влияние внешних условий на структурные и функциональные характеристики выделенных в работе цитохромов с.

4. Выявить общие для цитохромов класса с структурно-функциональные закономерности.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В работе впервые были получены кристаллы и определены структуры цитохрома с' из МобосусШэ деШИпозиэ и цитохрома се из СЫорЬога д!отега\а. Разработана методика выделения цитохрома с из мутантного штамма метилотрофных дрожжей НапвепШа ро!утогрЬа. В работе проведен детальный анализ влияния внешних условий на структурные характеристики изученных белков и на их окислительно-восстановительные свойства. Проведен сравнительный анализ структур изучаемых цитохромов со структурами гомологичных белков.

Выявлены общие для цитохромов класса с структурно-функциональные закономерности.

Полученные данные о структурно-функциональных зависимостях в цитохромах с могут быть применены при целевом моделировании ферментов с заданными каталитическими свойствами. Структурная информация о металлоцентре и функционально значимых участках белка необходима при создании комбинаторных библиотек металлосодержащих лекарств. Кроме того, знания механизмов электронного переноса могут быть применены при создании модуляторов электронного переноса.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях: "Microbial Physiology and Gene Regulation: Emerging Principles and Applications", Hague, December 10-14, 1995 и "Biocatalysis-2009. Fundamentals & Applications", Arkhangelsk, June 19-24, 2009.

Публикация.

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них - 3 статьи, 2 тезисов докладов на международных конференциях.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 130 страницах, содержит 43 рисунка, 26 таблиц и 3 диаграммы.

Основное содержание работы.

Выделение и очистка цитохромов с из различных источников.

В работе были предложены методики выделения и очистки до гомогенности следующих белков: цитохром с из мутантного штамма метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha с подавленной каталазной активностью, цитохром се из зеленых водорослей Cladophora glomerate, а также выделен и очищен цитохром с' из фотосинтетических бактерий Rhodocyclus gelatinosus.

Цитохром с из мутантного штамма метилотрофных дрожжей Н. polymorpha был выделен в три основных этапа:

- разрушение клеток этилацетатом с одновременным частичным осаждением белков сульфатом аммония;

- осаждение белков на специфическом фильтре Целите-545;

- серия ионнообменных хроматографий.

Уровень экспрессии данного белка в мутантном штамме был в 3-4 раза выше, чем в нативном штамме. Общий выход белка из 1,4 кг клеток был равен 20 мг.

Цитохром с6 из зеленых водорослей С. д!отега1а был выделен в три основных

этапа:

- экстракция белков из таллома водорослей;

- осаждение белков сульфатом аммония;

- серия ионнообменных хроматографий.

Цитохром с' из фотосинтетических бактерий ЯИ. де/айповиз был выделен в два основных этапа:

- разрушение клеток на ультразвуковом дезинтеграторе с последующим осветлением ультрацентрифугированием;

- серия ионнообменных хроматографий.

Чистота полученных белков определялась электрофоретически и по отношению интенсивности максимума пика Соре к интенсивности полосы на 280 нм в спектрах поглощения. Все белки были выделены с чистотой выше 95%.

Альтернативный механизм детоксикации метилотрофных дрожжей Н. ро1утогрЬа с подавленной каталазной активностью.

Для изучения возможных каталитических механизмов детоксикации метилотрофных дрожжей в работе использовали мутантный штамм метилотрофных дрожжей НапвепЫа ро!утогрНа (С-105-65) с подавленной каталазной активностью, но с восстановленной способностью к метилотрофному росту и использованию метанола в качестве единственного источника углерода и энергии.

В метилотрофных дрожжах, растущих в среде метанола, последний вступает в реакцию окисления, катализируемую алкогольоксидазой (АОХ), в результате которой выделяется токсичный для организма пероксид водорода:

СНзОН + 02 лох > СН20 + Н202

Важным последующим шагом является детоксикация организма от пероксида водорода. Реакция детоксикации у нативных дрожжей Н. ро1утогрЬа протекает в пероксисомах и катализируется каталазой.

В мутантном штамме дрожжей Н. polymorphe каталазная активность была подавлена и удаление пероксида водорода каталазой становилось невозможным. При этом, хотя выход биологической массы уменьшался, по сравнению с биологической массой нативного организма, мутантный штамм был способен расти в среде с единственным источником углерода - метанолом. Таким образом, вывод пероксида водорода из организма происходил по другому механизму. В то же время было известно, что пероксид водорода способен индуцировать в Н. polymorpha экспрессию другого фермента - цитохром с пероксидазы, также способного служить катализатором в реакциях детоксификации и выводить пероксид водорода. Действительно, в исследуемом в работе мутантном штамме экспрессия данного фермента была увеличена. Кроме того, было замечено увеличение экспрессии другого неизвестного белка.

В данной работе был выделен белок, экспрессия которого повышена в вышеупомянутом мутанте в 3-4 раза. На основании спектров поглощения, ЯМР и ЭПР данных, молекулярной массы и яркой, характерной для цитохромов окраски, белок был отнесен к классу низкоспиновых цитохромов с из митохондрий. Данный белок является субстратом цитохром с пероксидазы в реакции восстановления перекиси водорода до воды. Таким образом, было подтверждена возможность существования альтернативного механизма удаления пероксида водорода окислением цитохрома с в митохондриях, катализируемого цитохром с пероксидазой (СсР) по следующей реакции:

2 cyt с (Fe2+) + H202 +2H* С'Р > 2 cyt с (Fe3+) + 2Н20

УФ- видимые спектры поглощения цитохромов с

Для всех изученных в работе цитохромов были записаны и проанализированы спектры поглощения. Проведенные спектральные исследования позволили определить спиновое состояние изученных белков. Спектры цитохрома с из Н. polymorpha и цитохрома св из С. glomerata, представленные на рисунке 1, являются типичными для низкоспиновых цитохромов, в то время как цитохром с' из Rh. gelatinosus (рисунок 2) имеет спектр, характерный для высокоспиновых систем.

я, пт

Цитохром с из Н. ро1утогрЬа

итохром се из С. д/отега1а.

Рисунок 1. Спектры поглощения низкоспиновых цитохромов с в окисленной и восстановленной формах

Рисунок 2. Спектр поглощения высококоспинового цитохрома с' из ЯЛ. де/айпоэиз в окисленной форме.

Анализ полученных спектров поглощения позволил охарактеризовать координационную сферу иона железа в активном центре изученных цитохромов. Спектры поглощения низкоспиновых цитохромов с и се в восстановленной форме имеют а-полосы при -550 нм, р-полосы - 523 нм и полосы Соре ~ 415 нм. В спектрах окисленной формы этих белков полосы Соре сдвигаются в коротковолновую область ~ 410 нм, а а- и р-полосы сливаются в одну широкую полосу на ~530 нм, с небольшим плечом на 560 нм. У обоих белков в окисленном состоянии можно обнаружить типичную слабоинтенсивную полосу на 695 нм, характеризующую взаимодействие серы аксиального метионина с железом гема. Эта полоса может пропадать при частичной денатурации белка, при его восстановлении или при связывании железа гема с другими лигандами. Для обоих белков в окисленном состоянии при изменениях значения рН до щелочного данная полоса пропадает, указывая на происходящие конформационные перегруппировки в белке.

Спектр поглощения цитохрома с' отличается от спектров низкоспиновых цитохромов. Действительно, цитохром с' - это пятикоординационный, самоокисляющийся высокоспиновый белок. В его спектре не наблюдается полосы на 695 нм, но присутствует полоса на 638 нм, которая служит маркером

высокоспинового состояния и появляется благодаря взаимодействию высокоспинового иона железа с порфирином.

Кислотно-основные равновесия цитохромов с.

Анализ спектров поглощения, ЯМР, ЭПР и результатов электрохимического титрования при различных значениях рН среды позволил количественно охарактеризовать устанавливающиеся кислотно-основные равновесия для изученных цитохромов. Для всех выделенных цитохромов были определены два наиболее ярко выраженных равновесия (Рисунок 3). Первое устанавливается в кислой среде (значение рКа ~ 4,5) и обусловлено изменением в степени ионизации карбоксильной группы пропионэта 7 гема как у низкоспиновых, так и у высокоспинового цитохромов. Данное равновесие не сопровождается какими-либо существенными структурными изменениями в координационной сфере иона железа. Так как пропионатные группы не входят в сопряженную систему электронной плотности порфиринового кольца и иона железа, то изменения в значениях потенциалов белков при изменении степени ионизации этих групп являются незначительными.

В щелочных средах для всех изученных в работе цитохромов с устанавливается другое кислотно-основное равновесие (р/(а~9,0). С ним связаны более значительные изменения в структуре низкоспиновых цитохромов с. При этих значениях рН понижается электрохимический потенциал белков. В спектрах поглощения пропадает полоса на 695 нм, характеризующая взаимодействие серы аксиального метионина с железом гема. В ЯМР спектрах пропадают сигналы метилового и метиленового пиков аксиального метионина. Все эти данные позволяют сделать вывод о разрыве аксиальной связи железо-сера метионина. При этом общий вид спектров остается характерным для низкоспинового шестикоординационного железа гема.

Принимая во внимания полученные данные, был сделан вывод о замещении аксиального метионина на другой лиганд. В качестве альтернативного аксиального лиганда был предложен лизин, находящийся в удобной для такой замены позиции. рКа процесса замещения метионина хорошо согласуется со значениями рН, при которых происходит депротонация NhV-концевой группы лизина, которая в этом случае становится нейтральной и способной координировать Fe (III). Кроме того, уменьшение электрохимического потенциала (Рисунок 4) позволяет предположить

стабилизацию окисленного состояния железа тема, происходящую при замене серы метионина на более сильный донор электронов, каким является азот лизина.

В ЯМР спектрах цитохрома с' при щелочных значениях рН (рКа~9,0) также происходят значительные изменения, которые можно объяснить депротонацией аксиального гистидина, что приводит к увеличению силы поля этого лиганда и, как следствие, изменению общего спина системы.

В 26.4

А СО

н ¡г 3 X 26.2

£ о

" с

ж о 1 с 26

В со

эт сг 5 го 2 X 25.8

* §

Е

■£

ф о. о О

3

о §

с

Рисунок 3. Определение значений рКа на примере цитохрома с6 из С. д1отега(а. А - ЯМР спектры: изменения а химическом сдвиге сигнала С, отнесенного к сигналам пропионата 7 порфирина; В - спектры поглощения

0.330 -j

о

%

0.320 ■ о

о

У

— 0.310 ■

О.ЗОО- ° * о

0.2М - '

0.280 ---,---1-

S.60 6.60 7.60 8.60 9.60 10.60 рН

Рисунок 4. Зависимость электрохимического потенциала от рН для цитохрома с из Н. polymorphs.

Кристаллизация цитохрома Сб из С. glomerate и цитохрома с' из Rh. gelatinosus.

В работе были получены кристаллы цитохрома Св из С. д!отега(а и цитохрома с' из ЯЛ. деШтоэиз методом паровой диффузии (табл. 1).

Таблица 1. Условия кристаллизации цитохромов се и с'методом висящей капли.

Белок Буфер для белка Осадитель Раствор для роста кристаллов Температура роста Время роста

Цитохром cs S мг/мл 20 мМ Tris'CI рН 7,6 30%PEG 8000 0,2 М Na ацетат, 0,1 М Na какодилат, рН 6,5 22'С 1-2 недели

Цитохром с' 10 мг/мл 50 тМ (NH4)jHP04 рНб.О 55% (NH^SO, 200 мМ (NHibSO«, 30% PEG 4 К 50 тМ (NH4)2HP04,1М Na CI, рНб.О 100 мМ какодилат рН6,5 ГС 2-3 недели

Полученные кристаллы исследовались методом рентгеноструктурного анализа для расчета структуры этих белков.

Анализ структуры цитохрома с6 из С. д1отега1а и цитохрома с' из ЯЬ. де/аИпозиз

Цитохром с«

С помощью рентгеноструктурного анализа в работе были получены данные о трехмерной структуре цитохрома се. Обработка данных проводилась методом молекулярного замещения. Трехмерная структура цитохрома Се, определенная с разрешением 1,3 А, представлена на рисунке 5. Молекула белка (молекулярный вес 10,5 кДа) находится в ассиметричной элементарной ячейке, содержание

растворителя около 50%. Координаты атомов белка депонированы в белковой базе данных www.rcsb.org с кодом ИЭЭ.

Рисунок 5. Структура цитохрома с6из С. д1отега!а.

Цитохром Сб из С. д!отега1а является мономером и его структура в нейтральной среде характеризуется четырьмя альфа спиралями, одной короткой Зш спиралью и антипараллельным |3-слоем (а - а - а - р - а).

Большая часть тема расположена в гидрофобном окружении. Он связан с белком через Суэ17 и Суз20 (тиоэфирные связи), а также через Н1э21 и Ме163 (аксиальноые лиганды). Таким образом, железо в теме координировано шестью лигандами - четыре азота порфиринового кольца и два аксиальных лиганда. Гем почти полностью укрыт от растворителя. Наиболее доступными группами гема являются 3-СНз и 4-СНз, вместе с атомами кислорода пропионатов 6 и 7.

Водородные связи, образуемые водой могут определять координационные свойства иона железа и, следовательно, играют функциональную роль в электронном переносе. И хотя многие эукариотические цитохромы с имеют молекулу воды около аксиальных лигандов гема, в случае цитохрома с6 из С. g/omeraíа молекул воды в этой области не было обнаружено.

Для определения функционально важных структурных элементов белка был проведен сравнительный анализ структуры цитохрома с6 из С. д1отега(а с известными структурами других цитохромов с6. Сравнение значений

£2 - петля

спираль-|

среднеквадратичного отклонения позволяет судить о структурной консервативности тех или иных участков структур. Было найдено, что данное значение ниже для спиралей I, III, IV и Q-петли, в то время как спираль II и петля, соединяющая ее с третьей спиралью, имели высокое значения среднеквадратичного отклонения. Проведенный анализ хорошо согласуется с гомологичностью последовательности аминокислот на этих же участках.

Из трех структурных элементов, окружающих гем, только П-петля и петля, соединяющая спирали III и IV хорошо сохраняются внутри класса цитохромов се. Обе петли расположенны около доступных растворителю 3-СНз и 4-СН3 атомов пиррольного кольца. Короткий участок антипараллельного р-слоя, следующего за спиралью III, находится между Lys60 и Met63 и стабилизирован водородной связью, образуемой амидным протоном Lys60 и карбонильным атомом Met63. Этот участок имеет стабильную аминокислотную последовательность и сходные структурные характеристики у всех цитохромов Се- Как аксиальный лиганд тема Met63, так и выдвинутый в качестве альтернативного аксиального лиганда при щелочных значениях рН Lys60 расположены на этом структурно-консервативном Р-слое.

Данный анализ позволяет предположить, что эти консервативные структурные элементы участвуют во взаимодействии цитохрома с6 с его функциональными партнерами, и впоследствии, в переносе электрона. Полученные данные позволяют заключить, что спираль II, характеризующаяся низкой гомологичностью аминокислотной последовательности и высоким значением среднеквадратичного отклонения, не имеет определяющего функционального значения.

Для дальнейшего изучения свойств цитохрома с$ был проведен анализ поверхностного потенциала этого белка и других белков того же класса.

Сравнение показывает (Рисунок 6) схожее распределение поверхностных зарядов в данном классе белков. Во всех случаях гем находится в окружении гидрофобных групп, а большинство отрицательных зарядов расположено с противоположной тему стороны. Положительно заряженные группы, в основном лизина, сгруппированы около доступного растворителю пиррольного кольца тема. Необходимо отметить, что именно поверхность белка вокруг канала, ведущего к гему играет важную роль при молекулярном распознавании в реакциях электронного переноса. Из рисунка 6 видно, что доступность гема растворителю сходна для всех анализируемых цитохромов.

1LS9

!C6R

1CTJ

1CYJ

1F1F

ft Ш

Рисунок 6. Распределение зарядов на поверхности цитохромов с6. Показаны две ориентации белков, под углом 180° вокруг вертикальной оси. Гем указан стрелками. 1LS9 -цитохром с6 из С.glomerate, 1C6R - цитохром с6 из S.obliquus, 1CTJ - цитохром с6 из M.braunii, 1CYJ - цитохром с6 из СЛ. reinhardti, 1F1F - цитохром се из A.maxima, 1GDV - цитохром с6 из P. yezoensis.

Как было определено в работе, значение окислительно-восстановительного потенциала для цитохрома с6 из С. д!отега1а при стандартных условиях (водородный электрод, рН 7, 298 К, 0,1 М №С1) было равно 0,352 V. Найденное значение близко к значениям потенциалов для других цитохромов Се.

Таблица 2. Окислительно-восстановительные потенциалы и доступность гема различных цитохромов Се с известной структурой.

Источник РОВ код Потенциал, Е(тУ) Идентичность, %а Доступность растворителю, А2

Весь тем Порфириновое кольцо

АйЫозрха тахта 1Р1Р 314 53,3 62,3 17,9

РЬогткИит 1ат'тозит 2У08 325 58,2 57,7 14,7

СШЫога д/оте^а ивэ 352 100 60,9 11,2

МопогарЬШ'шт ЬгаипИ 1СТЛ 358 61,5 60,7 7,4

СЫатуботопав гетЬагсИН 1CYJ 370 58,1 70,0 9,4

° - идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью цитохрома Сб из С1ас1орЬогз дЬт&Ыа

Различная доступность активного центра растворителю может быть одной из причин различий в значениях окислительно-восстановительного потенциала у цитохромов. В таблице приведены окислительно-восстановительные потенциалы цитохромов Се и данные о доступности их активного центра, расчитанные для двух различных участков гема. Общая доступность активного центра определяется доступностью растворителю групп пропионатов. Однако, они не входят в сопряженную систему электронной плотности порфиринового кольца, и, в основном, они лишь электростатически стабилизируют положительный заряд на геме. Поэтому невозможно провести прямую корреляцию между доступностью пропионатных групп растворителю и окислительно-восстановительным потенциалом. Более определенную зависимость между этими значениями можно обнаружить, анализируя доступность системы, включающей в себя железо, порфириновое кольцо и атомы, расположенные на расстоянии одной сигма связи от него. Из таблицы видно, что с увеличением доступности этой части гема, значение окислительно-восстановительного потенциала уменьшается. Проведенный анализ позволяет предположить схожесть механизмов редокс реакций, в которые вовлечены цитохромы Се.

Цитохром с'

С помощью метода рентгеноструктурного анализа в работе были получены данные о трехмерной структуре цитохрома с' из ЙЬ. дэШИповиэ. Обработка экспериментальных данных проводилась методом молекулярного замещения. Расчитанная в работе структура цитохрома с', определенная с разрешением 2,5 А, представлена на рисунке 7. Как видно из рисунка цитохром с' из Я?/?. деШНпоБиэ в нейтральной среде является ассимметричным димером. Кристалл цитохрома с' состоит из ассимметричных элементарных ячеек с одной молекулой димера на ячейку. Содержание растворителя около 60 %. Координаты атомов белка депонированы в белковой базе данных www.rcsb.org с кодом 1

Каждый из мономеров состоит из четырех антипараллельных альфа спиралей. Вместе они образуют вытянутый левоскрученный узел. Гем расположен около С-конца молекулы.

Рисунок 7. Структура цитохрома с' из Rh. Gelatinosus

Сравнение аминокислотных последовательностей.

Попарное сравнение аминокислотной последовательности цитохрома с' из Rh. gelatinosus с аминокислотными последовательностями других цитохромов с' из различных источников [RGCP (Rhodocyclus gelatinosus), АХСР (Achromobacter xyloseoxidans)\ CVCP (Chromatium vinosum)\ RMCP (Rhodospirillum molischianum): RRCP (Rhodospirillum rubrum) и RCCP (Rhodobacter capsulatus)] проводилось с

помощью программы СШБТАЬ \Л/ и показало 48, 28, 27, 33 и 27% идентичности, соответственно. Среди всех проанализированных трехмерных структур цитохромов с' выявлено только 9 идентичных и восемь гомологичных аминокислотных остатков. Необходимо отметить, что наибольшая гомологичность с цитохромом с' из Я?/). де/а/Уловив обнаружена для цитохрома с' (АХСР) из АсЬготоЬаЫег ху/озеохМапв, который выделен из организмов, принадлежащих к другому семейству. Наблюдаемое структурное сходство между цитохромами с', выделенных из организмов, принадлежащим к различным семействам, является уникальным и не применимо к другим высокоспиновым белкам из тех же источников (например, высокопотенциальный железосерный белок, №Р1Р). Возможным объяснением этого аномального феномена может послужить гипотеза о происшедшем в ходе эволюции межвидовом переносе генов.

Окружение гема

Гем цитохрома с' из де/аИпозиз имеет несимметричное окружение (Рисунок 8).

Рисунок 8. Гем и его окружение в цитохроме с' из Rh. gelatinosus. На рисунке изображены две молекулы воды, пунктирные линии показывают образование водородных связей.

Одна его сторона обращена внутрь белка, а другая частично открыта растворителю. Гем ковалентно связан с белковой матрицей посредством двух тиоэфирных мостиков Cys119 и Cys122. His123 занимает пятое координационное место, в то время как шестое координационное место свободно. Аксиальный гистидин доступен растворителю и образует водородную связь NS1 атомом с

молекулой воды. Молекула воды найдена также между прогшонатыми группами тема в обоих субъединицах цитохрома с' из ЯЛ. де/аИпозиз. Подобная включенная молекула воды найдена во всех цитохромах с', с уже известной структурой. Агд12, характерный для всех цитохромов с', важен для стабилизации структуры, так как образует шесть структурно важных водородных связей (на рисунке 8 представлены лишь две из них).

Атом железа довольно значительно приподнят над плоскостью порфиринового кольца (~0,25А ) по направлению к аксиальному гистидину. Подобный эффект можно объяснить большим эффективным радиусом высокоспинового иона железа, из-за чего ион не входит полностью во внутреннее пространство порфиринового кольца. Кроме того, отсутствие шестого лиганда с дистальной стороны, не накладывает жестких стереохимических ограничений и позволяет железу занять более удобное, приподнятое положение.

У цитохрома с' из ЯЛ. де/аИпозиз пропионатные группы тема лишь частично прикрыты белком и направлены в сторону второго мономера, в виде клещей. Найденные между двумя мономерами молекулы воды стабилизируют димер солевыми и водородными связями. С тыльной стороны шестое координационное место иона железа сгерически блокировано РИе16, принадлежащим спирали А. Фенильное кольцо расположено параллельно плоскости тема и лежит на расстоянии ~3,6 А. Это пространство весьма гидрофобно и вблизи гема не было найдено ни одной молекулы воды. У цитохромов с' из СУСР и ЯССР ароматические остатки также блокируют доступ к шестому координационному месту иона железа (Рисунок 9). У других цитохромов (ЯМСР, ИЯСР, АХСР) на соответствующих позициях гидрофобных групп не было найдено. Подобные структурные особенности позволяют разделить цитохромы с' на две группы.

Первая группа включает СУСР, 13ССР и КйСР, в то время как вторая группа состоит из ЙМСР и АХСР. Члены первой группы имеют глубокий проход между спиралью В и С. Прямой доступ к аксиальной позиции железа гема блокирован ароматическим остатком. У второй группы цитохромов с' подобный канал отсутствует.

Имеющиеся данные не позволяют провести однозначную корреляцию между доступностью гема для растворителя среди цитохромов этого класса и значением их окислительно-восстановительного потенциала, которые варьируются от £°= -5 тУ до £°= +110 тУ.

RGCP

CVCP

RCCP

AXCP RMCP

Рисунок 9. Трехмерная структура цитохромов с' из различных источников. Гем указан стрелкой. RGCP- Rhodocyclus gelatinosus), CVCP - Chromatium vinosum, RCCP - Rhodobacter capsulatus, AXCP - Achromobacter xyloseoxidans; RMCP - Rhodospiríllum molischianum.

Соединение димерое

Два мономера цитохрома с' из Rh. gelatinosus образуют димер. Он имеет характерную для цитохромов c'X-форму и обе субъединицы расположены почти под прямым углом друг к другу. В изученном белке было найдено несколько межмономерных связей, обеспечивающих стабилизацию димера. Обнаружено шесть водородных связей между боковыми цепями спиралей А и А' двух мономеров. Другие стабилизирующие димер водородные связи образуются молекулами воды, находящимися между двумя субъединицами. Кроме того, существуют гидрофобные контакты между спиралями В и В' и А и А1.

Сравнение структуры цитохрома с' из Rh. gelatinosus со структурами других белков.

Характерная структура цитохромов с', состоящая из четырех а-спиралей, встречается и среди белков других классов. Поиск сходных структур с помощью программы DALI позволил обнаружить 40 белков, для которых значение Z (степень структурной схожести) было больше 2, что говорит о значительном сходстве

20

структур этих белков со структурой мономера цитохрома с' из Rh. gelatinosus. Цитохром Ö562 из Е. coli имеет значение Z равное 10,6, при этом аминокислотные последовательности этих двух белков идентичны на 13%. Миогемеритрин из сипункулоидных червей имеет значение Z равное 7,0.

Миогемеритрин - негемный белок, состоящий из 118 аминокислот и имеющий биядерный центр, содержащий ионы железа. Интересно, что положение биядерного центра почти полностью совпадает с положением активного центра цитохрома с'. Миогемеритрин в живых организмах связывает кислород. Этот белок имеет разные олигомерные формы: мономер, димер, тетрамер и октамер.

Цитохром Ö562 - мономер, состоящий из 106 аминокислот, в котором гем, расположенный около С-конца, связан с белковой матрицей аксиальными метионином и гистидином. Как цитохром Ь5бг так и цитохром с' имеют гем в качестве простетической группы. Сходство общей структуры цитохрома с' и цитохрома Ь552, одинаковое расположение гемов, их химическое окружение и доступность растворителю позволило выдвинуть предположение о наличии общего эволюционного предка для этих классов цитохромов.

Рисунок 10. Сравнение структуры цитохрома с'(показана серым цветом) со структурами: а) - цитохрома (показана черным цветом) и в) миогемеритрина (показана черным цветом).

Выгоды

Комплексный анализ полученных в ходе работы физико-химических и структурных данных позволил детально охарактеризовать цитохром с из Н. polyrnorpha, цитохром се из С. g/omerafa, цитохром с' из Rh. gelatinosus и сделать общие для цитохромов класса с выводы о структурно-функциональных закономерностях..

1. В работе были выделены цитохром с из мутантного штамма С-105-65 метилотрофных дрожжей Н. polyrnorpha, цитохром с$ из зеленых водорослей С. glomerata и цитохром с' из фотосинтетических бактерий Rh. gelatinosus. V,

2. Впервые были получены кристаллы цитохрома с6 из С. glomerata и цитохрома с' из Rh. gelatinosus и определены их трехмерные структуры методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 1,3 и 2,5 А, соответственно. Координаты атомов белков депонированы в белковой базе данных www.rcsb.org. Анализ спектров поглощения, ЯМР и ЭПР данных позволил детально изучить активные центры выделенных цитохромов и отнести цитохром с из Н. polyrnorpha и цитохром Се из С. glomerata к низкоспиновым, а цитохром с' из Rh. gelatinosus к высокоспиновым цитохромам.

3. Показано, что при изменении рН среды до щелочного значения (рКа~9) у низкоспиновых цитохромов с и cs происходит структурная перегруппировка, в ходе которой аксиальный метионин обратимо замещается на лизин. Обе группы расположены на структурно-консервативных участках с высокой аминокислотной гомологией для всех белков соответствующих классов, что позволяет сделать вывод о важности рН-зависимого замещения метионина на лизин в процессах электронного переноса, в которых участвуют цитохромы с. Замещение аксиального метионина на лизин приводит к понижению окислительно-восстановиТельного потенциала.

4. Проведенные исследования позволили выявить корреляцию между доступностью растворителю порфиринового кольца активного центра цитохромов Се и значениями их окислительно-восстановительного потенциала: при увеличении доступности активного центра значение потенциала уменьшалось. Кроме того, на основании сходства общей

; .22

структуры цитохрома с' и цитохрома b$e2, одинакового расположения гемов, их химического окружения и доступности растворителю, было выдвинуто предположение о наличии общего эволюционного предка для этих классов белков.

Список публикаций по теме диссертации

1. Агсег М„ Band L., Dikaya Е., Romao M.J. Crystal structure of cytochrome c' from Rhodocyclus gelatinosus and comparison with other cytochromes c'./ J.Biol. Inorg. Chem. - 1997-vol. 2-pp.611-622.

2. Borsari M., Dikaya E., Dikiy A., Gonchar M.V., Maidan M.M., Pierattelli R., Sibirny A.A. Isolation and Physico-Chemical Characterization of the Cytochrome с from Methylotrophic Yeast Hansenula polymorphs./ Вiochem. Biophys. Acta - 2000 - vol.1543 - pp.174-188.

3. Dikiy A., Carpentier W., Vandenberghe I., Borsari M„ Safarov N., Dikaya E., Van Beeumen J., Ciurli S. Structural Basis for the Molecular Properties of Cytochrome from the Green Alga Cladophora glomerate./ Biochemistry - 2002 - vol. 41 - pp.14689-14699.

4. Gonchar M.V., KostrykL.B., Maidan M .M, Dikaya E .V., LuchinatC., Sibirny A.A.. Derepression of cytochrome с peroxidase restores methylotrophic growth of catalase deficient mutant of Hanselula polymorpha II Beijerinck Centennial "Microbial Physiology and Gene Regulation: Emerging Principles and Applications" (December 10-14, 1995). -Hague (The Netherlands). -1995 - pp.424-425.

5. Dikaya E., Ciurli S., Banci L., Dikiy A. "Comparative analysis of heme's availability in Cytochtomes cs and c". Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2009. Fundamentals & Applications", Arkhangelsk, June 19-24, 2009, p.124 (poster).

Подписано в печать: 16.09.2009

Заказ № 2509 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Дикая, Елена Владимировна

Введение

II. Литературный обзор

1.1 Координационная геометрия металлов и лигандное поле

1.2 Металлобиомолекулы как сложные комплексы

1.2.1 Функции металлов в металлобелках

1.2.1.1 Мд, Са. 2п, Мп: активация субстрата и электростатическая стабилизация

1.2.1.2 Ре и Си: окислительно-восстановительные центры

1.2.1.3 Со и Мо: комплексные кофакторы

1.2.2 Лигандное окружение металлов в белках

1.2.2.1 Влияние лигандов на окислительно-восстановительные свойства белков

Влияние координационной геометрии

Влияние донорно-акцепторных свойств аксиальных лигандов

Влияние непрямых эффектов: гидрофобность и водородные связи

Влияние природы лигандов

Влияние свободных координационных мест

1.2.2.2 Влияние лигандов на кислотно-основное равновесие в белках

1.3 Функции металлобелков 27 1.3.1 Белки - переносчики электронов

1.3.1.1 Железосерные белки

1.3.1.2 Медьсодержащие голубые белки

1.3.1.3 Цитохромы

1.4 Классификация цитохромов

1.4.1 Классификация по типу гема

1.4.1.1 Цитохромы а типа

1.4.1.2 Цитохромы Ь типа

1.4.1.3 Цитохромы с типа

1.4.2 Классификация цитохромов с по аминокислотной последовательности

1.4.2.1 Некоторые подклассы цитохромов с

Цитохромы с из митохондрий

Цитохромы с' а) спектры поглощения цитохромов с' б) сила лигандного поля в цитохромах с' 39 Цитохромы с

1.5 Окислительно-восстановительные свойства цитохромов с

1.6 Цитохромы в различных организмах

1.6.1 Цитохромы в фотосинтетических бактериях

1.6.2 Другие организмы, содержащие цитохромы с

1.6.2.1 Дрожжи Hansenula polvmorpha

1.6.2.2 Зеленые водоросли Cladophora plomerata

1.7 Физико-химические методы характеризации белков

1.7.1 Ретгено-структурный анализ 51 Кристаллизация белков

1.7.2 Электронный парамагнитный резонанс 53 ЭПР цитохромов

1.7.3 Ядерно-магнитный резонанс 59 ЯМР парамагнитных металлобелков

1.7.4 УФ-видимая спектроскопия поглощения

1.7.5 Вольтамперометрия

II. Экспериментальная часть

2.1 Рост организмов и экстракция белков

2.2 Очистка цитохромов

2.3 Характеризация цитохромов с

III. Обсуждение результатов

3.1 Цитохром с из метилотрофных дрожжей

3.1.1 Очистка, молекулярная масса и изоэлектрическая точка цитохрома с

3.1.2 Спектроскопические исследования цитохрома с: спектры поглощения, ЭПР и ЯМР

3.1.3 Электрохимические исследования

3.1.4 Выводы

3.2 Цитохром Сб из зеленых водорослей С/ас/орЛога д1отега(а

3.2.1 Очистка, молекулярная масса и аминокислотная последовательность цитохрома с

3.2.2 Спектроскопические исследования цитохрома с6: спектры поглощения и ЯМР

3.2.3 Электрохимические исследования цитохрома с

3.2.4 Структура цитохрома с

3.2.5 Выводы

3.3 Цитохром с' из /?/?обосусШэ де/аИпозиэ

3.3.1 Очистка цитохрома с' Ю

3.3.2 Спектры поглощения цитохрома с'

3.3.3 Кислотно-основное равновесие цитохромов с' Ю

3.3.4 Структура цитохрома с' Ю8 3.3.5. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные закономерности в металлобелках на примере цитохромов класса c"

Установление взаимосвязи между структурой белка и его функциями в организме является важной задачей современной биохимии и биокатализа. Подобные исследования необходимы как для выяснения функций белков и механизмов метаболизма того или иного организма, так и для создания биоматериалов с заданными свойствами. Для понимания молекулярных основ биокатализа необходима детальная информация о трехмерной структуре белка, а также о конкретных структурных характеристиках, определяющих его физико-химические свойства.

Для многих важнейших биологических процессов необходимы металлобелки. Однако, нельзя приписать какому-либо конкретному металлу только ему одному свойственную функцию в биокатализе. Один и тот же металл может иметь различные функции, в то время как различные металлы участвуют в сходных каталитических реакциях. Стоит отметить разницу между сравнительно небольшим количеством биологически важных металлов и многообразием функций, которые они выполняют.

Окислительно-восстановительные ферменты и металлобелки составляют более 40 % всех классифицированных Международным союзом биохимии и молекулярной биологии белков. Они играют важную роль в сигнальных процессах, отвечающих за регуляцию генов и их экспрессию, в конверсии энергии в процессах фотосинтеза и дыхания.

Изменяя структуру и природу белкового окружения металла в активном центре, живые организмы способны эффективно регулировать физико-химические свойства этих белков. Одной из важнейших функциональных характеристик металлобелков является их окислительно-восстановительный потенциал. На его значение влияют множество факторов, в том числе координационная геометрия активного центра металлобелка, природа лигандов железа и доступность активного центра белка для молекул растворителя. В то же время значение потенциала в значительной мере зависит от внешних условий, в том числе, рН среды, ионного состава и диэлектрических характеристик растворителя. Эта зависимость особенно важна с физиологической точки зрения, т.к. позволяет установить, каким образом внешние условия влияют на процессы электронного переноса, протекающих в живых организмах.

Цитохромы являются важным классом металлобелков, участвующих в процессах электронного переноса и окислительно-восстановительного катализа.

Изучение влияния внешних условий на структуру и физико-химические свойства цитохромов позволяет связать структурные особенности этих белков с их функциями, и таким образом, установить их структурно-функциональные особенности.

I. Литературный обзор

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Дикая, Елена Владимировна

3.2.5 Выводы

•

В то время как в литературе имеются данные о димеризации цитохромов Св в растворах или в кристаллах в работе показано, что цитохром Се - мономер в обоих состояниях окисления [97-99].

Полученное значение Ео= + 0,352 V для цитохрома Се в нейтральной среде почти полностью совпадает со значениями для других цитохромов Сб [85].

Методами ЯМР, спектроскопии поглощения и вольтамперометрией для цитохрома Сб были определены как минимум два кислотно-щелочных равновесия. Первое равновесие было определено с помощью ЯМР и электрохимии, и дало значение рКа -4,5. Это равновесие может относиться к изменениям в ионизации группы, не приводящей к структурным изменениям лигандов железа. Было предложено считать, что данное равновесие характеризует ионизацию пропионата-7. Второе кислотно-основное равновесие в щелочных рН было обнаружено из данных спектров поглощения. Оно характеризовалось значением рКа ~ 9,0. Было предложено, что метионин при рН >7 заменяется на другой лиганд. В качестве альтернативного лиганда был предложен лизин (Lys60). Обмен метионина при высоких значениях рН наблюдался для многих цитохромов.

Было показано, что Q-петля и петля, соединяющая спирали III и IV могут быть вовлечены в цитохром сб-субстрат взаимодействие, и в перенос электрона. Проведенный анализ позволил предположить, что спираль II не имеет большого функционального значения.

Показана высокая гомология внешней поверхности белка и доступности его активного центра.

Проведенный в работе структурный анализ показал значительной сходство первичной, вторичной и третичной структур всех цитохромов Сб, за исключением факта димеризации.

3.3 Цитохром с' из Rhodocyclus gelatinosus

Цитохром с' относится ко второму классу цитохромов с, который характеризуется связыванием гема около С конца. Это по большей части димеры. Молекулярный вес димерной формы около 28 кДа. Железо стабильно в состоянии окисления +3 и имеет пятикоординационную сферу. Лиганды - четыре атома азота пиррольного кольца и один аксиальный гистидин. Ион железа высокоспиновый как в состоянии окисления 2, так и три (рисунок 11 и 14).

Несмотря на схожесть свойств, наличие у всех белков этого класса четырех антипараллельных а-спиралей и одинакового расположения гема, гомология аминокислотных последовательностей этих цитохромов мала (около 20%). Эти белки были найдены в большинстве фотосинтетических и денитрифицирующих бактериях. До сих пор нет ясного представления о функциях этих белков. Однако стоит заметить, что нами было сделано наблюдение об увеличении количества цитохрома с' в организмах, где количество высокопотенциальных железосерных белков мало. Так как последние участвуют в электронном переносе, то можно выдвинуть предположение об участии в этих реакциях и цитохромов с'. Этот белок интересен потому, что некоторые его структурные свойства нуждаются в соотнесении с его физико-химическими свойствами.

Цитохромы с' характеризуются средним значением восстановительного потенциала, который ниже, чем у низкоспиновых цитохромов с. Это различие можно объяснить большим размером гема и сравнительно большей доступностью для растворителя гистидина в цитохромах с', по сравнению с цитохромами с [41, 100].

В отличие от других пяти координационных гемсодержащих белков, дистальная ниша гема цитохромов с' - гидрофобна, и молекул воды вблизи иона железа не было обнаружено.

3.3.1 Очистка цитохрома с'

Цитохром с' из фотосинтетических бактерий ЯЬ. де1аИпоэиз был выделен в два основных этапа:

- разрушение клеток на ультразвуковом дезинтеграторе с последующим осветлением ультра центрифугированием;

- серия ионообменных хроматографий.

Чистота полученного белка определялась электрофоретически и с помощью спектроскопии поглощения (по отношению интенсивности максимума пика Соре к поглощению на 280 нм).

3.3.2 Спектры поглощения цитохрома с'

На рисунке 38 представлены спектр поглощения окисленного цитохрома с' в 10 мМ фосфате калия и 50 мМ МаС1. а с с с о с

Рисунок 37. Спектр окисленного цитохрома с' в 10 мМ фосфате калия и 50 мМ МаС1.

Спектр окисленного цитохрома с' имеет полосы перенесения заряда на 495 нм и 638 нм и основной пик поглощения на 390 нм, характерный для высокоспиновых цитохромов. Полоса на 638 нм также служит маркером высокоспинового состояния [101] и появляется благодаря взаимодействию иона железа с порфирином.

3.3.2 Кислотно-основное равновесие цитохрома с'

ЯМР исследования показали [102, 103], что цитохром с' из Rh. gelatinosus имеет три рКа: в кислой рКа 4,8, в нейтральной среде рКа 6,7 и одну в щелочной рКа 9,0. Последняя, характерная для всех цитохромов с' [104], была приписана депротонированию проксимального гистидина.

Нормальная константа диссоциации связанного с Fe(lll) гистидина до гистидината составляет около 10,5. В цитохроме с' N51 аксиального гистидина ионизируется при более низких pH, возможно, благодаря электростатическим взаимодействиям с лизиновым или аргининовым остатками, которые стабилизируют гистидинат. В RGCP около His123 на расстоянии 5А находится Lys127, чье место у других цитохромов с' занято Lys или Arg у других цитохромов. Наличие кислотно-основного равновесия со значением р/Са около 6,5, характерное для всех цитохромов с', приписывается депротонированию пропионатной группы гема. Кислотно-основное равновесие со значением рКа 4,8 и 5,3 для RGCP и CVCP, соответственно, отнесли к изменениям в степени ионизации одного из аминокислотных остатков, характерному лишь для этих цитохромов. Возможно, таковым является Glu10. Вблизи от гема найден Glu70 (около 3,9 А между карбоксильной группой и пропионатом гема).

3.3.4 Структура цитохрома с'

Кристалл цитохрома с' состоит из асимметричных элементарных ячеек с одной молекулой димера на ячейку. Элементарная ячейка кристаллов относится к P3i21 пространственной группе. Содержание растворителя около 60%. Данные записывались при комнатной температуре

Структура цитохрома с', определенная с разрешением 2,5 А, представлена на рисунке 39. Структуру определяли методом замещения атомных координат, с использованием координат цитохрома с' из Alealigen sp. Аминокислотная последовательность этих двух белков показывает 48% идентичности.

Рисунок 39. Структура цитохрома с' из Rhodocyclus gelatinosus.

Данные эксперимента и статистические данные представлена в таблице 25.

IV.Заключение

Комплексный анализ полученных в ходе работы физико-химических и структурных данных позволил детально охарактеризовать цитохром с из Н. ро1утогрЬа, цитохром Сб из С. д/отега^а, цитохром с' из ЯЛ. деЫтозиэ и сделать общие для цитохромов класса с выводы о структурно-функциональных закономерностях.

1. В работе были выделены цитохром с из мутантного штамма С-105-65 метилотрофных дрожжей Н. ро!утогрЬа, цитохром Сб из зеленых водорослей С. д!отега1а и цитохром с' из фотосинтетических бактерий Я/7. деШтозиэ.

2. Впервые были получены кристаллы цитохрома Сб из С. д1отега(а и цитохрома с' из Я/7. деШтоБиэ и определены их трехмерные структуры методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 1,3 и 2,5 А, соответственно. Координаты атомов белков депонированы в белковой базе данных www.rcsb.org. Анализ спектров поглощения, ЯМР и ЭПР данных позволил детально изучить активные центры выделенных цитохромов и отнести цитохром с из Н. ро1утогрМа и цитохром Сб из С. glomerata к низкоспиновым, а цитохром с' из ЯЛ. деШтозиэ к высокоспиновым цитохромам.

3. Показано, что при изменении рН среды до щелочного значения (рКа~9) у низкоспиновых цитохромов с и Сб происходит структурная перегруппировка, в ходе которой аксиальный метионин обратимо замещается на лизин. Обе группы расположены на структурно-консервативных участках с высокой аминокислотной гомологией для всех белков соответствующих классов, что позволяет сделать вывод о важности рН-зависимого замещения метионина на лизин в процессах электронного переноса, в которых участвуют цитохромы с. Замещение аксиального метионина на лизин приводит к понижению окислительно-восстановительного потенциала.

4. Проведенные исследования позволили выявить корреляцию между доступностью растворителю порфиринового кольца активного центра цитохромов Сб и значениями их окислительно-восстановительного потенциала: при увеличении доступности активного центра значение потенциала уменьшалось. Кроме того, на основании сходства общей структуры цитохрома с' и цитохрома Ь562, одинакового расположения гемов, их химического окружения и доступности растворителю, было выдвинуто предположение о наличии общего эволюционного предка для этих классов белков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Дикая, Елена Владимировна, Москва

1. Bertini 1., Gray H. В., Stiefel Ed. I., Valentine J. S. Biological Inorganic Chemistry: Structure and Reactivity/ Bertini I.// University Science Books - 2006 - pp. 137-657

2. Frausto da Silva J. J. R., Williams R. J. P. The Biological Chemistry of the Elements: The Inorganic Chemistry of Life/ Williams R. J. P. второе издание// Oxford University Press-2001-575 p.

3. Bertini I., Sigel A., Sigel H. Handbook on metalloproteins //CRC Press 2001 - 1182 p.

4. Holm R.H., Kennepohl P., Solomon E.I. Stuctural and Functional Aspects of metal sites in Biology / Chem. Rev. -1996 vol. 96 - pp. 2239-2314

5. Lippard S.J., Berg J.M. Principles of Bioinorganic Chemistry /Lippard S.J.// University Science Books 1994 - 411 p.

6. Ueno Т., Yokoi N., Abe S., Watanabe Y. Crystal structure based design of functional metal/protein hybrids / J. Inorg. Biochem. 2007 - vol. 101 - pp. 1667-1675

7. Andreini C., Bertini I., Cavallaro G., Holliday G., Thornton J. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles/ J.Biol.Chem.- 2008 vol. 13-pp. 1205-1218

8. Shannon R.D. Revised Effective Ionic Radii and Systematic Studies of Interatomie Distances in Halides and Chaleogenides /Acta Crystallogr. -1976 Sect. A - vol.32-pp.751-767

9. Goldblatt C, Lenton T.M., Watson A.J. / Bistability of atmospheric oxygen and the Great Oxidation. / Nature 2006 - vol. 443 - pp. 683-686

10. Maguire M.E., Cowan J.A. Magnesium chemistry and biochemistry. / Biometals 2002 -vol. 15-pp. 203-210

11. Jaiswal J.K. Calcium how and why? / J. Biosci. - 2001- vol. 26 - pp. 357-363

12. Irving H.M., Williams R.J.P. Order of Stability of Metal Complexes. / Nature 1948 -vol. 162 - pp.746 - 747

13. Gray H.B., Winkler J.R. Electron tunneling through proteins. / Q. Rev. Biophys. 2003 - vol. 36 - pp. 341-372

14. Banci L., Bertini I., Savellini G., Luchinat C. Individual Reduction Potentials of the Iron Ions in Fe(2)S(2) and High-Potential Fe(4)S(4) Ferredoxins. / Inorg. Chem. 1996 - vol. 35 - pp. 4248-4253

15. Dey A., Jenney F.E. Jr., Adams M.W., Babini E., Takahashi Y., Fukuyama K., Hodgson K.O., Hedman B., Solomon E.I. Solvent tuning of electrochemical potentials in the active sites of HiPIP versus ferredoxin. I Science 2007 - vol. 318 - pp. 1464-1468

16. Van Holde K. E., van Bruggen E. F. J. Subunits in Biological Systems, Part N Timasheff S. N., Fasman G. D. / Dekker- 1971 pp. 1-53

17. Vallee B.L., Williams R.J.P. Metalloenzymes: the entatic natuer of their active sites. / Proc Natl Acad Sci USA 1968 - vol. 59 - pp. 498-505

18. Malmstrom B.G. Rack-induced bonding in blue-copper proteins./ Eur. J. Biochem. -1994 vol. 223 - pp. 711-718

19. Williams R.J.P. Energised (entatic) states of groups and of secondary structures in proteins and metalloproteins./ Eur. J. Biochem. 1995 - vol. 234 - pp.363-381

20. Colman P.M., Freeman H.C., Guss J.M., Murata M., Norris V.A., Ramshaw J.A.M., Ventakappa M.P. X-ray crystal structure analysis of plastocyanin at 2.7 A resolution I Nature -1978 vol. 272 - pp.319-324

21. Ryde U., Olsson M.H.M., Pierloot K., Roos B.O. The cupric geometry of blue copper proteins is not strained./ J. Mol. Biol. 1996 - vol. 261- pp.586-596

22. Ghosh S., Xie X., Dey A., Sun Y., Scholes C.P., Solomon E.I. Thermodynamic equilibrium between blue and green copper sites and the role of the protein in controlling function./ Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2009 vol.106 - pp.4969-4974

23. Shack J., Clark W.M. Metalloporphyrins: cycles of changes in systems contaning heme. / J. Biol. Chem. 1947 - vol. 171 - pp. 143-187

24. Falk J.E. Porphyrins and Metalloporphyrins: Their General, Physical and Coordination Chemistry, and Laboratory Methods/ Elsevier Pub. Co. -.1964 266 p.

25. Rodriguez J.C., Rivera M. Conversion of mitochondrial cytochrome b5 into a species capable of performing the efficient coupled oxidation of heme. / Biochemistry 1998 - vol. 37-pp. 13082-13090

26. Degtyarenko K. Bioinorganic motifs: towards functional classification of metalloproteins. /Bioinformatics review 2000 - vol. 16 - no. 10 - pp. 851-864

27. Keilin D. On cytochrome, a respiratory pigment, common to animals, yeast, and higher plants / Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci.-1925 vol. 98 - pp. 312-339

28. IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (1986)

29. Reedy C. J., Gibney B. R. Heme Protein Assemblies / Chem. Rev. 2004 - vol. 104 -pp. 617-650

30. Romao M. J., Archer M. in Handbook of Metalloproteins/ Messerschmidt A., Huber R., Poulos T., Wieghardt K./ Wiley 2001 -45 p.

31. Wood P.M. Why do c-type cutochromes exist? /Biochi. Biophys. Acta 1991 - vol. 1958-pp. 5-7

32. Ambler R.P. The structure of beta-lactamases. / Philos. Trans. R. So.c Lond. B Biol. Sci. 1980 - vol. 289 - pp. 321-31

33. Pettigrew G.W., Moor G.R. Cytochromes C: biological Aspects. / Springer 1987 - 282 P

34. Vernon L.P., Kamen M.D. Hematin compounds in photosynthetic bacteria. / J. Biol. Chem. 1954 - vol. 211- pp.643-663

35. Bartch R.G. in The Photosynthetic Bacteria / Clayton R.K., Sistrom W.R., eds./ Plenum Press 1978 - pp.249-279

36. Cusanovich M.A. Molecular Weights of same cytochromes c'J Biochim. Biophys. Acta -1971 vol. 236 - pp. 238-241

37. Meyer E., Cusanovich M. A. Discovery and characterization of electron transfer proteins in the photosynthetic bacteria I Photosynthesis Research 2003 - vol. 76 - pp. 111-126

38. Meyer T.E., Cusanovitch M.A. Soluble cytochrome composition of the purple phototrophic bacterium, Rhodopseudomonas sphaeroides ATCC 17023. / Biochim. Biophys. Acta 1985 - vol. 807 - pp. 308-319

39. Moore G.R., Pettigrew G.W. Cytochromes C: Evolutionary, Structural and Physicochemical Aspects I Springer 1990 - 494 p.

40. Maltempo M.M., Moss T.H., Cusanovich M.A. Magnetic studies on the changes in the iron environment in Chromatium ferricytochrome c'. / Biochim. Biophys. Acta 1974 - vol. 342 - pp. 290-305

41. Meyer T.E., Kamen M.D. New perspectives on c-type cytochromes. I Adv. Protein Chem.-1982 vol. 35 - pp. 105-212

42. Horio T., Kamen M.D. Preparation and properties of three pure crystalline bacterial haem proteins./ Biochim. Biophys. Acta 1961 - vol. 48 - pp. 266-286

43. Taniguchi S., Kamen M.D. On the anomalous interaction of ligands with Rhodospirillum haem protein / Biochim. Biophys. Acta 1963 - vol. 74 - pp. 438 -455

44. Cusanovich M. A., Tedro S.M., Kamen M.D. Pseudomonas denitrificans cytochrome cc'. I Arch. Biochem. Biophys. 1970 - vol. 141 - pp. 557-570

45. Weber P.C. Correlations between structural and spectroscopic properties of the highspin heme protein cytochrome c'. / Biochemistry -1982 -vol. 21 pp. 5116-5119

46. Landrum J.T., Hatano K., Scheidt W.R., Reed C.A. Imidazolate complexes of iron and manganese tetraphenylporphyrins./ J. Am. Chem. Soc.- 1980 vol.102 - pp. 6729-6735

47. Wood P.M. Interchangeable copper and iron proteins in algal photosynthesis. Studies on plastocyanin and cytochrome c-552 in Chlamydomonas. / Eur. J. Biochem. 1978 -vol. 87-pp. 9-19

48. Tezcan F.A., Winkler J.R., Gray H. B. Effects of ligation and folfing on reduction potentials of heme proteins./ J.Am.Chem.Soc. 1998 - vol.120 - pp.13383 - 13388

49. Vernon L.P. Cytochrome с content of Rhodospirillum rubruml Arch. Biochem. Biophys. 1953 - vol. 43 - pp. 492 - 493

50. Kamen M.D., Vernon L.P. Existence of haem compounds in a photosynthetic obligate anaerobe/ J. Bacteriol. -1954 vol. 67 - pp. 617 - 618

51. Kamen M.D.,Vernon L.P. Comparative studies on bacterial cytochromes./ Biochim. Biophys. Acta 1955 - vol. 17 -10 - 22

52. Ponsano E.H.G., Lacava P.M., Pinto M.F. Isolation of Rhodocyclus gelatinosus from poultry slaughterhouse wastewater/ Braz. arch. biol. technol. 2002 - vol.45 - pp.445-449

53. Madigan M.T., Martinko J.M., Brock T.D. Brock Biology of Microorganisms/ Pearson Prentice Hall 11 ed., - 2006 - 1056 p.

54. Weaver P. F. Environmental and mutational variations in the photosynthetic apparatus of Rhodospirillum rubrum /Ph.D. thesis / University of California San Diego - 1974

55. Gellissen G. Heterologous protein production in methylotrophic yeasts./ Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000 - vol.54 - pp. 741-750

56. Электронный парамагнитный резонанс/ Экспериментальные методы химической кинетики: Учебное пособие/ под ред. Н. М. Эмануэля, М.Г. Кузьмина изд. Московского Университета - 1985г.

57. Brautigan D. L., Feinberg В .A., Hoffman B. M., Margoliash E. Multiple Low Spin Forms of the Cytochrome с Ferrihemochrome./ J. Biolog. Chem. 1977 - vol. 252 - pp. 574-582

58. Bertini I., Turano P., Vila., A.J. Nuclear magnetic resonance of paramagnetic metalloproteins /Chem. Rev. 1993- vol.93 - pp.2833- 2932

59. Smith D.W., Williams R.J.P. The spectra of ferric haems and haemoproteins. / Structure and Bonding 1970 - vol. 7 - pp. 1-45

60. Lemberg R., Barrett J. The cytochromes. / Academic Press 1973 - 580 p.

61. Wood P.M. Bacterial proteins with СО-binding b- or c- type haem functions and absorption spectroscopy./Biochim. Biophys. Acta 1984 - vol.768 - pp. 293-317

62. Pfennig N. Rhodopseudomonas globiformis, sp. п., a new species of the Rhodospirillaceae/ Arch, of Microbiol. 1974 - vol. 100 - pp. 197-206

63. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4./ Nature 1970 - vol. 227 - pp. 680-685

64. Остерман Л.А. Исследование биопогических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. / Мир 1983-с. 20-38

65. Andrews P. Estimation of the molecular weights of proteins by Sephadex gel-filtration/ Biochem J. 1964 - vol.91 - pp. 222-233

66. Berry E. A., Trumpower B. L. Simultaneous determination of hemes a, b, and с from pyridine hemochrome spectra. / Anal. Biochem. 1987 - vol.161 - pp. 1-15

67. Verduyn C., Giuseppin M. L. F., Scheffers W. A., VAN Dijken J. P. Hydrogen Peroxide Metabolism in Yeasts / Appl. Environ. Microbiol. 1988 - vol. 54 - pp. 2086-2090

68. Gonchar M.V., Kostryk L.B., Sibirny A.A. Cytochrome с peroxidase from a methylotrophic yeast: physiological role and isolation / Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997 - vol.48 - pp.454-458

69. Mathews F. S. The structure, function and evolution of cytochromes. /Progr. Biophys. Mol. Biol. 1985 - vol. 45 - pp. 1-56

70. Moore T.A., Greenwood C. A method for investigatiing the effect of temperature on the 695 nm band of insoluble cutochrome c.l Biochem. J. 1975 - vol. 149 - pp. 169 -177

71. Schejter A, George P. The 695-nmband of ferricytochrome с and its relationship to protein conformation./ Biochemistry -1964 vol.3 - pp. 1045-1049

72. Greenwood C, Wilson MT. Studies on ferricytochrome с. I. Effect of pH, ionic strength and protein dénaturants on the spectra of ferricytochrome c.l Eur J Biochem. -1971 vol. 13-pp. 5-10

73. Blumberg W. E., Peisach J., /Probes of Function and Structure of Macromolecules and Membranes// B. Chance, T. Yonetani, A.S. Mildvan Academic Press - 1971 - p. 215

74. Pielak G.J., Auld D.S., Betz S.F., Hilgen-Willis S.E., Garcia L.L. Cytochromes c: A Multidisciplinary Approach/ R.A. Scott, A.G. Mauk / University Science Books 1996 - pp. 203-284

75. Turner D.L. Obtaining ligand geometries from paramagnetic shifts in low-spin haem proteins. /J Biol. Inorg. Chem. 2000 - vol.5 - pp. 328-332

76. Louro R.O., de Waal E.C., Ubbink M., Turner D.L. Replacement of the methionine axial ligand in cytochrome c(550) by a lysine: effects on the haem electronic structure./ Febbes Letter 2002 - vol.510 - pp. 185-188

77. Turner D. L. Determination of Haem Electronic Structure in His-Met Cytochromes c by 13C-NMR /Eur. J.Biochem. -1995 vol. 227 - pp. 829-837

78. Turner DL, Salgueiro CA, Schenkels P, LeGall J, Xavier AV. Carbon-13 NMR studiesVof the influence of axial ligand orientation on haem electronic structure. / Biochim. Biophys. Acta. 1995 - vol.1246 - pp.24-28

79. Barker P. D., Mauk A. G. pH-Linked conformational regulation of a metalloprotein oxidation-reduction equilibrium: electrochemical analysis of the alkaline form of cytochrome c.I J. Am. Chem. Soc. 1992 - vol. 114 - pp. 3619-3624

80. Banci L, Bertini I, De la Rosa M.A., Koulougliotis D., Navarro J.A., Walter O. Solution structure of oxidized cytochrome c6 from the green alga Monoraphidium brauniiJ Biochemistry 1998 - vol. 37 - pp. 4831-4843

81. Benini, S., Gonzalez, A., Rypniewski, W. R., Wilson, K. S., Van Beeumen, J. J., Ciurli, S. Crystal structure of oxidized Bacillus pasteurii cytochrome C553 at 0.97-A resolution. / Biochemistry 2000 - vol.39 - pp. 13115-13126

82. Rosell F. J., Ferrer J. C., Mauk A. G. Protonlinked protein conformational switching: Definition of the alkaline conformational transition of yeast isolferricytochrome c. /J. Am. Chem. Soc.- 1998-vol. 120-pp. 11234-11245

83. Bertini I., Banci L., Ciurli S., Dikiy A., Dittmer J., Rosato A., Sciara G., Thompsett A. NMR solution structure, backbone mobility, and homology modeling of c-type cytochromes from gram-positive bacteria. /ChemBioChem 2002 - vol.3 - pp. 299- 310

84. Luntz T. L., Schejter A., Garber E. A. E., Margoliash E. Structural significance of an internal water molecule studied by site-directed mutagenesis of tyrosine-67 in rat cytochrome c. /Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989 - vol. 86 - pp. 3424-3528

85. Bushnell G. W., Louie G. V., Brayer G. D. High-resolution three-dimensional structure of horse heart cytochrome c. / J. Mol. Biol. 1990 - vol. 214 - pp. 585-595

86. Berghuis A. M., Guillemette J. G., McLendon G., Sherman F., Smith M., Brayer G. D. The role of a conserved internal water molecule and its associated hydrogen bond network in cytochrome c. / J. Mol. Biol- 1994 vol. 236 - pp. 786-799

87. Berghuis A. M., Guillemette J. G., Smith M., Brayer G. D. Mutation of tyrosine-67 to phenylalanine in cytochrome c significantly alters the local heme environment. / J. Mol. Biol.-1994-vol. 235-pp. 1326-1341

88. Lett C. M., Berghuis A. M., Frey H. E., Lepock E. F., Guillemette J. G. The role of a conserved water molecule in the redox-dependent thermal stability of iso-1-cytochrome c. / J. Biol. Chem. 1996 - vol. 271 - pp. 29088-29093 ,

89. Cho Y. S., Wang Q. J., Krogmann D., Whitmarsh J. Extinction coefficients and midpoint potentials of cytochrome cg from the cyanobacteria Arthrospira maxima, Microcystis aeruginosa, and Synechocystis 6803// BBA 1999 - vol. 1413 - pp. 92-97

90. Worrall A.R., Schlarb-Ridley B.G., Reda T., Marcaida M.J., Moorlen R. J., Wastl J., Hirst J., Bendall D. S., Luisi B. F., Howe C. J. Modulation of heme redox potential in the cytochrome c6 family// JACS 2007 - vol.129 - 9468-9475

91. Gorman D.S., Levine R.P. Photosynthetic Electron Transport Chain of Chlamydomonas reinhardi VI. Electron Transport in Mutant Strains Lacking Either Cytochrome 553 or Plastocyanin.// Plant. Physiol. -1966 vol.41 - pp. 1648-1656

92. Sawaya M. R., Krogmann D. W., Serag A., Ho K. K., Yeates T. O., Kerfeld C. A. Structures of cytochrome c-549 and cytochrome c6 from the cyanobacterium Arthrospira maxima. / Biochemistry- 2001 vol. 40 - pp. 9215-9225

93. Kerfeld C. A., Anwar H. P., Interrante R., Merchan, S., Yeates T. O. The structure of chloroplast cytochrome cB at 1.9 A resolution: evidence for functional oligomerization. / J. Mol. Biol.- 1995 vol. 250 - pp. 627-647

94. Meyer T.E. Evolution and classification of c-type cytochromes // Scott R.A., Mauk A.G. Cytochrome c- multidisciplinary approach/ University Science Books -1996 -728 p.

95. Band L., Bertini I., Turano P., Vicens Oliver M., NOE and two-dimensional correlated 1H-NMR spectroscopy of cytochrome c' from Chromatium vinosum / Eur. J. Biochem. 1992 - vol.204 -pp.107-112

96. Bertini I., Gori G., Luchinat C., Vila A.J., One- and two-dimensional NMR characterization of oxidized and reduced cytochrome c'from Rhodocyclus gelatinosus. / Biochemistry 1993 - vol.32 - pp.776-783

97. Ambler R.P., Meyer Т.Е., Kamen M.D. Anomalies in amino acid sequences of small cytochromes с and cytochromes c' from two species of purple photosynthetic bacteria./ Nature -1979 vol.278 - pp.661-662

98. Finzel B.C., Weber P.C., Hardman K.D., Salemme F.R Structure of fem'cytochrome c'from Rhodospirillum molischianum at 1.67 A resolution./ J. Mol. Biol. 1985 - vol.186 - pp.627-643

99. Weber P.C., Salemme F.R. Structural and functional diversity in 4-alpha-helical proteins. / Nature -1980 vol.286 - pp.302-304

100. Dobbs A.J., Anderson B.F., Faber H.R., Baker E.N. Three-Dimensional Structure of Cytochrome c'from Two Alcaligenes Species and the Implications for Four-Helix Bundle Structures / Acta Cryst. 1996 - vol. - D52 - pp. 356-368

101. Kassner R.J. Ligand binding properties of cytochromes c'.l Biochim. Biophys. Acta. 1991 -vol.1058-pp. 8-12

102. Doyle M.L., Gill S.J., Cusanovich M.A. Ligand controlled dissociation of Chromatium vinosum cytochrome c'.l Biochemistry 1986 - vol. 25 - pp. 2509-2516

103. Ren Z., Meyer Т., McRee D.E. Atomic structure of a cytochrome c' with an unusual ligand-controlled dimer dissociation at 1.8 A resolution./ J. Mol. Biol. 1993 - vol.234 - pp. 433-445