Структурно-функциональные отношения трифенилэтиленов и эстрогенового рецептора в клетках рака молочной железы

Максимов, Филипп Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональные отношения трифенилэтиленов и эстрогенового рецептора в клетках рака молочной железы
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные отношения трифенилэтиленов и эстрогенового рецептора в клетках рака молочной железы"

На правах рукописи

Максимов Филипп Евгеньевич

С'.руктурно-функциональные отношения трифенилэтиленов и эстрогенового рецептора в клетках рака молочной железы

03.01.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 2 ДПР 2010

Москва - 2010

004601333

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному

развитию»

Научный руководитель: Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Терентьев Александр Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Шимановский Николай Львович

доктор медицинских наук,

профессор Шевченко Ольга Павловна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Москва

Защита состоится «.........» ................................. 2010 года в 14.00 часов на заседании

диссертационного совета Д 208.072.01 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «..........»............................2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор П.Х Джанашия

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

По данным ВОЗ онкологические заболевания это ведущая причина всех смертей во всем мире, где рак молочной железы это самое распространенное онкологическое заболевание у женщин во всем мире (519,000 смертей в 2004 году) и пятая самая распространенная причина смерти от онкологических заболеваний в общей популяции. Этиология этого заболевания до сих пор изучается, но множественные исследования показали, что эстрогены играют важную роль в развитии этого заболевания (Russo и Russo, 1998). Биологические эффекты эстрогенов опосредовании через эстрогеновые рецепторы альфа (ЭРа) и бета (ЭР0), которые эскпрессируются в более чем 80% всех диагносцируемых опухолей молочной железы. ЭРа в данный момент остается основной мишенью в терапии рака молочной железы, а так же уровень его экспрессии используется для прогнозирования эффективности лечения селективными модуляторами ЭР (Selective Estrogen Receptor Modulators или SERM), такими как тамоксифен (EBCTCG, 1998; EBCTCG, 2005). Тамоксифен является первым хемиотерапевтическим препаратом, который предотвращает туморогенез ЭР-положительных опухолей (Jordan, 2008) у женщин входящих в группу риска по данному заболеванию по всему миру (Fisher и другие, 199S). Тамоксифен сам по себе является видоизмененной производной долгодействующего эстрогеноподобного вещества трифенилэтилена (Robson, 1937; Harper и Walpole, 1966; Harper и Walpole, 1967). Эффективность тамоксифена зависит от образования клинически активного метаболита 4-гидрокситамоксифена и эндоксифена, которые в свою очередь обладают более высоким сродством к ЭРа и обладают более выраженными антиэстрогеновыми свойствами в клетках рака молочной железы (Jordan и другие, 1977; Johnson и другие, 2004). Сейчас не известны точные преобразования, которым подвергается ЭР после образования комплекса с эстрогенами, поскольку весь комплекс рецептора с лигандом не был до сих пор кристаллизован, таким образом недостаток знаний в этой области компенсируется изучением структурно-функциональных отношений ЭР и его лигандов. Тем не менее, сам лиганд-связывающий домен (ЛСД) ЭР, ассоциированный с 17р-эстрадиолом (Е2) и диетистилбестролом (DES) и SERM 4-гидрокситамоксифеном и ралоксифеном были кристаллизованны. Подробный рентгеноструктурный анализ информационных изменений ЛСД ЭР выявил определенную разницу в конформациях ЛСД ЭР ассоциированного с 4-гидрокситамоксифеном и ралоксифеном по сравнению с ЛСД ЭР связанного с Е2 и DES (Brzozowski и другие, 1997; Shiau и другие, 1998). Поскольку в ходе исследований с тамоксифеном было выявленно, что тамоксифен в ряде тканей обладает слабыми эстрогеноподобными свойствами, то результаты более подробных исследований данного феномена позволили предположить что это свойство связано с взаимодействием боковой цепи (алкиламиноэтокси группы) тамоксифена с аспартатом в 351

позиции и переориентирование данного аминокислотного отстатка в рецепторе позволяет аспартату взаимодействовать с функциональным лиганд-независимым доменом ЭР AF-1, что и обеспечивает эстрогеноподобное действие тамоксифена (Levenson и Jordan, 1998; Levenson и другие, 1998). Поскольку, как ранее было показано, тамоксифен является производным трифенилэтилена, то было сделано предположение, что не все эстрогены одинаково взаимодействуют с ЭРа (Jordan и другие, 2001). Планарные вещества (такие как эстрадиол) и непланарные (такие как трифенилэтилен) являются эстрогенами и могут вызывать увеличение массы матки у грызунов, а так же вызывать ороговение вагинальной слизистой в кастрированных жиывотных, хотя непланарные эстрогены вызывают антагонистическую кон формацию ЭР. Таким образом, эстрогены были классифицированны на основе их химической структуры на эстрогены класса I и класса II (Gust и другие, 2001; Jordan и другие, 2001). Несмотря на определеную разницу в конформационных изменениях ЭР, ассоцииированных с различными классами эстрогенов, до сих пор в полной мере не известны связанные с ними биологические эффекты, такие как рост клеток, апоптоз, активация транскрипции эстроген-зависимых генов и ее регуляция.

Цель настоящего исследования

Целью настоящего исследования является проверка гипотезы о том, что конформация ЭРа, которая зависит от структуры эстрогенов двух разных классов, играет роль в регуляции ряда биологических процессов (клеточная пролиферация, апоптоз и т.д.) в уникальных культурах клеток рака молочной железы человека in vitro.

Задачи настоящего исследования:

1. Определить биологическую активность (пролиферация клеток, апоптоз и т.д.) непланарных эстрогенов (серии синтезированных гидроксилированных трифенилэтиленов) по сравнению с пленарными эстрогенами (17Р-эстрадиол и диэтилстилбестрол) на клонах клеток линии рака молочной железы человека MCF7 in vitro.

2. Подтвердить явление и уровень апоптоза при обработке эстроген-независимых клонов клеток рака молочной человека MCF7:5C in vitro исследуемыми трифенилэтиленами по сравнению с пленарными эстрогенами.

3. Определить опосредованность действия исследуемых веществ через ЭРа в клонах клеток линии рака молочной железы человека MCF7:WS8 и MCF-7:5C in vitro.

4. Определить механизм активации ЭРа эстрогенами класса I и класса II при помощи репортерных тестов с мутантной формой ЭР в ЭР-отрицательной линии клеток рака молочной железы человека T47D.C4 in vitro.

5. Определить регуляцию транскрипционной активности ЭРа (индукцию транскрипции мРНК и протеосомальной деградации) испытуемыми трифенилэтиленами по сравнению с планарными

эстрогенами в клонах линии клеток рака молочной железы человека MCF7 in vitro. 6. Подтвердить гипотезу об изменении конформации лиганд-связывающего домена ЭРа исследуемыми трифенилэтиленами при помощи молекулярного докинга.

Научная новизна

В ходе настоящего исследования было проведено структурно-функциональное исследование синтезированных производных трифенилэтилена (некоторые из них синтезированны впервые) на уникальных клеточных линиях рака молочной железы человека in vitro.

В ходе данного исследования была показана эстрогеноподобная активность в клетках рака молочной железы с диким фенотипом, а так же впервые была показана невозможность исследуемых трифенилэтиленов индуцировать эстроген-индуцированный апоптоз эквивалентный апоптозу индуцируемому эстрадиолом в клетках рака молочной железы с эстроген-независимым фенотипом, что впервые указывает на зависимость данного феномена от структуры лигнда и, как следствие, конформации рецептора.

Была подтверждена гипотеза о механизме активации ЭР в клетках рака молочной железы экспрессирующих мутантный типа ЭР, при помощи репортерных тестов. Были определны амикислотные остатки лиганд связывающего домена ЭР, критичные для активации рецептора трифенилэтиленами. Наиболее значимым результатом является выявление критичности наличия аспартата в 351 позиции на ЭР для активации рецептора трифенилэтиленами.

Впервые был проведен молекулярный докинг моделей структур исследуемых веществ в модели известных конформаций рецептора, в ходе которого были определены анинокислотные остатки, образующие с лигандами образуют водородные связи, и вероятные конформации, придаваемые трифенилэтиленами рецептору после связывания.

Впервые было показало, что, несмотря на измененную конформацию ЭР при связывании трифенилэтиленов, ЭР способен выполять свою транскрипционную функцию на промоторах эндогенных эстроген-зависимых генов (на примере pS2) в клетках рака молочной железы.

На основе полученных данных, были подтверждены выдвинутые гипотезы о регуляции транскрипционной активности ЭР в клетках при измененной конформации последнего и измененном механизме активации. Так было показано, что ЭР с измененной конформацией после связывания с трифенилэтиленами не способен эффективно деградировать и присоединять коактиватьрные молекулы (на примере SRC3).

Практическая значимость работы

Полученные данные ставят задачу по проведению клинических исследований о возможности применения эстрогена (17р-эстрадиола) для лечения резистентных ко всем видам адьювантной терапии форм рака молочной железы. Применение производных трифенилэтилена

для лечения таких форм рака было бы актуальным в силу менее выраженных системных побочных эффектов в ходе применения таких веществ для лечения. Ранее производные трифенилэтиленов уже исследовались в качестве противоопухолевых препаратов для лечения рака молочной железы в поздних стадиях развития. Обнаружилось, что хотя и был положительный терапевтический эффект от применения таких веществ и были менее выраженны побочные эффекты, данные вещества уступали в своей терапевтической эффективности планарным эстрогенам эстрадиолу и DES. Развитие новых клеточных моделей для симуляции резистентности рака молочной железы к современным формам адъювантной терапии позволило нам оценить возможность применения производных трифенилэтилена для индукции апоптоза в таких клетках. Результаты показали, что данные вещества не индуцируют апоптоз эффективно и обладают меньшим сродством к ЭР, что ставит под сомнение потенциальное развитие хемиотерапевтических препаратов на основе трифенилэтиленов для лечения таких резиситентных форм рака за счет их эстрогеноподобных свойств.

Но стоит отметить, что результаты настоящего исследования могут в дальнейшем прояснить механизмы формирования резистентности к лечению рака молочной железы тамоксифеном, так как и тамоксифен является производной трифенилэтилена.

Положения выносимые на защиту 1. Гидроксилированные производные трифенилэтилена, изучаемые в данном

исследовании, являются агонистами ЭР в клетках рака молочной железы с диким фенотипом, но являются антагонистами в клетках рака молочной железы резистентных к тамоксифену и с эстроген-независимым фенотипом.

Исследуемые производные трифенилэтилена не способны индуцировать увеличение уровней проапоптотических маркеров в клетках с эстроген-независимым фенотипом, несмотря на способность трифенилэтиленов активировать ЭР в этих клетках так же эффективно как и в клетках с диким фенотипом.

Для активации ЭР трифенилэтиленами необходимо взаимодействие с 351 амикислотным остатком в рецепторе, так как именно эта аминокислота участвует в активации рецептора не пленарными эстрогенами.

Образование комплекса трифенилэтиленов с ЭР приводит к конформационным изменениям рецептора больше напоминающих его антагонистическую конформацию.

За счет измененной конформации ЭР, рецептор активированный трифенилэтиленами способен выполнять свою фукцию как транскрипционный фактор, но не способен присоединять таке же количество коактиваторных белков как в случае с эстрадиолом.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на русском языке, на 103 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы и приложения. Библиография включает 195 наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 22 рисунками и 1 таблицей.

Матрналы и методы исследований

Исследуемые гидроксилированные производные трифенилэтилена синтезировании были in situ в Фокс Чейзовском Онкологическом Центре (Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA, USA). Всего было синтезирование для настоящего исследования пять производных

тригидрокситрифенилэтилен); 2) 1,1-Бис(4,4'-гидроксифенил)-2-фенилбут-1-ен (далее бисфенолтифенилэтилен); 3,4) Цис/Транс-4-(1-(4-гидроксифенил)-1-фенилбут-1-ен-2-ил)фенол (далее цис/транс-дигидрокситрифенилэтилен); и 5) Цис-4-(1-(4-этоксифенил)-1-(4-гидроксифенил)буг-1-ен-2-ил)фенол (далее этокситрифенилэтилен). Все синтезированные вещества имели чистоту не менее 80% и были синтезированны в объемах 80-120 мг. Чистота всех синтезированных веществ была проверена при помощи высоко продуктивной жидкостной хроматографии (HPLC).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

трифенилэтилена (Рис.1): 1) 1,1,2-Трис(4-гидроскифенил)бут-1-ен (далее

А. Пленарные эстрогены класса I

Б. Синтезированные in situ эстрогены клсса II трифенилэтилены и известные антиэстрогены тамоксифен и его метаболиты

4-гвдрокситамоксифен (N-десмет ил -4 -гмдрохеит аы окси фен)

Рис.1 Химические структуры веществ исследуемых в настоящей работе

ЭР-положительные клетки рака молочной железы человека MCF-7:WS8 были выведены по признаку гиперчувствительности к эстрогенам из клеток рака молочной железы дикого типа MCF7, которые были полученны из коллекции АТСС. Эстрадиол индуцирует рост данных клеток. Клетки MCF-7:5C были клонированны из клеток линии MCF-7 дикого типа путем долговременного эстрогенового голодания и содержались в безстероидной стреде RPMI 1640, без содержания pH индикатора фенол-красного, но с содержанием 10% очищенной активированным углем от эндогенных эстрогенов фетальной бычьей сыворотки. Гормон-независимые, ЭР-отривдтельные клетки T47D:C4:2 были клонированны из клонов T47D:C4, которые, в свою очередь, были клонированны при помощи эстрогенового голодания из T47D клеток рака молочной железы, полученных из коллекции АТСС. Клетки T47D:C4:2 культивировались в безстероидной среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку очищенную активированным углем. Клетки линиий МС2 и 538А были полученны путем стабильной трансфекции ЭР-отрицательных клеток рака молочной железы человека линии MDA-MB-231 векторами для стабильной экспрессии ЭРа дикого типа и ЭРа с заменой D538A, соответственно. Клетки линии МС2 и 53 8А культивировались в среде MEM без содержания pH индикатора фенол-красного, но с содержанием 5% фетальной бычьей сыворотки очищенной активированным углем.

Для определения клеточной пролиферации при обработке клеток исследуемыми веществами в течение недели использовался метод обпределения количества ДНК в культурах клеток. Все вещества разводились в безстероидной среде по методу серийных разведений и добавляли к клеткам рассеяных в 24-луночных плашках. Определение количества ДНК проводилось при помощи флуоресцентного ДНК-интеркалирующего красителя Hoechst 33258 (входящего в состав набора для определения содержания ДНК от Bio-Rad), а так же при помощи флуориметра Mirth as LB540 (Berthold Technologies).

Для количественно-качественного анализа эстроген-ивдуцированного апоптоза в эстроген-независимых клетках рака молочной железы MCF-7:5C мы использовали набор ApoPecentage apoptosis detection kit (Biocolor). Данный набор позволяет количественно определить апоптоз в культуре клеток непосредственно на культуральной подложке без отделения от последней. Данаый набор нам позволил определить апоптоз и количественно зарегистрировать колориметрическим методом прямо в культуре клеток. Обработка клеток исследуемыми веществами проводилась в течение 4 суток, в качестве положительного контроля использовалась обработка клеток той же линии пероксидом водорода в концентрации 5 мМ в течении 4 часов. На четвертые сутки после начала обработки культур веществами, клеткам заменялась питательная среда на среду, содержащую специфический апоптотический краситель

ApoPercentage Dye, работа которого основывается на феномене транслокации фосфатидилсерина цитолазматической мембраны с внутренней стороны мембраны на наружную, что соответствует раннему апоптотическому ответу клеток. Эта транслокация фосфатидилсерина, т.н. "flip-flop" эффект, изменяет проницаемость цитоплазматической мембраны апоптотических клеток и специфически позволяет красителю ApoPercentage Dye войти в апоптотические клетки и окрасить их относительно здоровых жизнеспособных клеток. Далее краситель высвобождался из клеток лизирующим раствором и измерялась оптическая плотность образцов при 550 нм на флуориметре/спектрофотомтере Mirthas LB540.

Для определения уровней активации ЭР исследуемыми веществами применялся метод репортерных тестов. Репортерный ген люциферазы находился под кнтролеи промотора, содержащего пятикратную последовательность эстроген-респонсивного элемента (ЭРЭ), к которому присоединяется активированный ЭР. Для экспрессии репортерного гена клетки транфицировались векторами pERE(5X)TA-ffLuc для экспрессии репортерного гена и pTA-srLuc для контроля трансфекции. Уровень активности люциферазы в клетках, обработанных исследуемыми веществами, указывает на уровень транскрипции репортерного гена и, соответственно, на уровень активации ЭР, который выполняет роль транскрипционного фактора. Клетки рассевались на 24-луночные плашки, после чего обрабатывались тестируемыми веществами в течение 24 часов. Для определения уровня активности люциферазы в клетках использовался набор Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Уровень флуоресценции субстратов люциферазы, определялся при помощи флуориметра Mirthas МВ540. Для проведения аналогичных экспериментов на ЭР-отрицательных клетках линии T47D:C4:2, клетки трансфицировались дополнительно векторами pSG5HEGO для экспрессии ЭР дикого типа и вектором pSG5D351GER для экспрессии ЭР с заменой Асп351 на Гли. Эти эксперименты были необходимы для определения роли 351 а.о. для активации ЭР трифенилэтиленами.

Для определения уровней белков ЭР и про- и анти-апоптотических маркеров использовался метод иммуноблота. Иммуноблот проводился при помощи соответственных первичных антител против ЭРа, р53, Bad, Bax, Bcl-2, Bcl-XL, Bim (все от Santa Cruz), а так же против ß-актина (Sigma-Aldrich) и соответствующих вторичных кроличьих антииммуноглобулиновых антител, коньюгированных с пероксидазой хрена (Santa Cruz). Сигнал визуализировался при помощи хемилюминисцентного метода с использованием набора ECL Western Blotting Detection Reagents (General Electrics).

Для определения уровня транскрипции эндогенного эстроген-респонсивного гена pS2 клетки инкубировались с разведенными в питательной среде исследуемыми веществами в течении 24 часов, после чего проводилось лизирование агентом Trizol (Invitrogen) и экстракция РНК хлороформом. Очистка РНК проводилась при помощи очистительных колонок входящих в

набор Quiagen RNeasy Midi Column Kit (Quiagen), после чего проводился синтез кДНК с использованием рандомизированных праймеров. Уровень кДНК гена pS2 проводилось при помощи количественного ПЦР в реальном времени на амплификаторе от Applied Biosystems.

Для определения уровня белков ЭР и коативатора SRC3 привлекаемых на промоторный участок гена pS2 использовался метод иммунопреципитацни хроматина. Для этого клетки обрабатывались исследуемыми веществами в течение 45 минут, после чего выделялся фиксированный формальдегидом хроматин. Преципитация ЭР и SRC3, ассоциированных с ДНК проводилась при помощи моноклональных антител против данных белков (все от Santa Cruz), и агарозных частиц, ассоциированных с белком G (Santa Cruz). Участки ДНК, копреципигированные с белками, очищались при помощи колонок, входящих в набор QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen). Количество преципитированной ДНК определялось при помощи ПЦР в реальном времени на амплификаторе от Applied Biosystems.

Для определения наиболее вероятных ориентации исследуемых трифенилэтиленов в полости лиганд-связывающего домена ЭР, был проведен молекулярный докинг моделей всех трифенилэтиленов. Докинг проводился в известные модели ЛСД ЭР в агонистическокой (эстрадиол) и антагонистической (4-гидрокситамоксифен) конформации ЭР. Метод осуществлялся Др-м Рамоной Курпан из Химического Института при Академии Наук Румынии в рамках коллаборационного проекта.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Для сравнения биологических активностей планарных эстрогенов (класса I) и непланарных эстрогенов (класса II) были выбраны 17(5-эстрадиол (Е2 и DES для класса I) и все in situ синтезированные трифенилэтилены (для класса II). Для сравнения эстрогеноподобных свойств веществ использовались клетки линии MCF-7:WS8, которые обладают фенотипом дикого типа и были селектированны из клеток MCF-7 дикого типа по признаку высокой чувствительности к пролифератиным эффектам эстрогенов. Эффекты всех исследуемых трифенилэтиленов сравнивались с эффектами метаболитов тамоксифена 4-гидрокситамоксифеном и эндоксифеном, которые являются антиэстрогенами в связи с наличием алкиламиноэтокси боковой цепи. Клетки MCF-7.WS8 были чувствительны ко всем веществам особенно к Е2, которые вызывали макимальную пролиферацию клеток при 1х10'пМ (Рис. 1).

Все исследуемые трифенилэтилены являются выраженными агонистами и вызывают пролиферацию MCF-7:WS8 клеток, но, тем не менее, их агонистическая эффективность меньше по сравнвению с Е2, значение концентрации 50% эффекта (ЕС50) которого 1х10"12М. Вещество этокситрифенилэтилен было синтезированно для репликации молекулы 4-гидрокситамоксифена или эндоксифена без алкильной группы. Этокситрифенилэтилен обладает менее выраженными эстрогеноподобными свойствами, чем остальные исследуемые трифенилэтилены, но, тем не

менее, данное вещество является полным агонистом в наших опытах по определению пролиферативных эффектов. Метаболиты 4-гидрокситамоксифен и эндоксифен фактически не имеют никаких агонистических эффектов в МСР-7:\У58 клетках, но оба эти вещества при концентрации 1 мкМ способны полностью ингибировать пролифератиный эффект эстрадиола в той же линии клеток, таким образом, подтверждая их роль как антагонистов/антиэстрогенов. Остальные тестированные трифенилэтилены не имели никаких антагонистических свойств в клетках данной линии.

Рис.2 Эффекты тестируемых трифенилэтиленов и антиэстрогенов 4-гидрокситамоксифена и эндоксифена на пролиферацию клеток линии MCF-7:WS8 дикого фенотипа

Для определения способности тестируемых трифенилэтиленов вызывать эстроген-индуцированный апоптоз использовалась линия MCF-7:5C, которая была выведенна в результате долгосрочного (2 года) культивирования в безстероидной питательной среде, что привело к формированию эстроген-независимого фенотипа. Клетки, которые были жизнеспособны и пролиферировали в безстероидной среде были селектированы. Пародоксально, то, что вместо гиперсенсибилизации клеток к пролиферативным эффектам эстрогенов, данная линия клеток отвечает на обработку Е2 и DES полной гибелью популяции клеток по типу апоптоза, а так же

Е2

О Ю"14 Ю-13 10-п 10'" 10'1° 10» 10-« 10-' 10-®

[М]

другими планарными эстрогенами класса I (Рис. 3). В отличие от чувствительности клеток МСР-7:Ш88 линии с диким фенотипом, клетки линии МСР-7:5С оказались менее чувствительными к агонистическим эффектам трифенилэтиленов и проявили себя больше как антагонисты (Рис. 3).

О 10-" 10" 10-" ю-11 ю-10 10'8 10-' 10"7 ю-5

[М]

Рис. 3 Эффекты тестируемых трифенилэтиленов и антиэстрогенов 4-гидрокситамоксифена и эндоксифена на пролиферацию клеток линии MCF-7:5C.

Пленарные эстрогены Е2 и DES оказались, как и предполагалось, самыми эффективными веществами, которые вызывали апоптотический эффект за счет своего агонизма с ЭР клеток, со значением концентрации 50% ингибирования пролиферативного эффекта (IC50) приблизительно 1х10'"М. Для исследования антагонистической эфективности тестируемых трифенилэтиленов были выбраны два самых эффективных агониста в MCF-7.WS8 клетках бисфенолтрифенилэтилен (2) и тригидрокситрифенилэтилен (1), а так же для сравнения самый мало эффективный агонист этокситрифенилэтилен (5). Исследуемые трифенилэтилены 1, 2 и 5 при концентрации в 1 мкМ эффективно способны ингибировать проапоптотический эффект Е2 и восстанавливать пролиферацию клеток на уровень приблизительный к контрольному. Это, парадоксально, делает исследуемые трифенилэтилены в данном опыте антагонистами ЭР

(поскольку действие Е2 в клетках MCF-7:5C опосредованно через ЭР), при этом являясь агонисгами в клетках с диким фенотипом.

Для количественно-качественного определения эстроген-индуцированного апоптоза, мы использовали метод калориметрического измерения уровня апоптоза в культурах клеток MCF-7:5С. Е2 при концентрации 1 нМ способен вызывать существенное увеличение количества апоптотических клеток по сравнению с контрольным необработанным образцом (почти в 5,5 раз), что утверждает эстрадиол как проапоптотический агент в клетках MCF-7.5C в эстроген-индуцируемом апоптозе. DES так же способен индуцировать апоптоз в данных клетках, но в меньшей степени (4 раза), по сравнению с Е2. Остальные трифенилэтилены способны вызывать апоптоз при концентрации 1 мМ в течении 4-х суток, но данные уровни апоптоза в среднем значительно меньше, что соответствует данным об их биологических активностях в ранее описанных опытах. Отдельно необходимо отметить бисфенолтрифенилэтилен, который является единственным эстрогеноподобным трифенилэтиленом, абсолютно не вызывающим апоптоз в клетках MCF-7:5C. В качестве отрицательного контроля использовался известный антиэстроген 4-гидрокситамоксифен, который так же как бисфенолтрифенилэтилен не вызывает апоптоза в клетках. Для установления разницы между способностью эстрогенов класса I и II (билфенолтрифенилэтилен, тригидрокситрифенилэтилен и этокситрифенилэтилен в концентрации 1 мМ) индуцировать апоптоз, мы проводили иммуноблоты при помощи специфичных антител против митохондриальных про- (Bim, Bad, Вах, Bak, р53) и анти-апоптотических маркеров (Bcl-Xl, Вс1-2), для того что бы оценить индукцию и соотношение каждого маркера относительно друг друга и оценки апоптотической эффективности. Клетки MCF-7:5C, обработанные Е2 в концентрации 1 нМ, индуцируют в течении первых 24 часов увеличение уровня экспрессии белков проапоптотических маркеров Вах, Bim, Bak, Bad и р53, а так же снижение уровня антиапоптотического маркера Вс1-Х1, что указывает на активацию апоптотических факторов внутри клеток и снижение активности экспрессии фактора выживаемости, что приводит к запуску сигнального каскада эстроген-индуцированного апоптоза.

Связывание ЭР, активированного лигандом, с ДНК на ЭРЭ увеличивает транскрипцию репортерного гена люциферазы. Измерение уровня экспрессии люциферазы в клетках позволяет судить об уровне агонистической активности комплекса ЭР:трифенилэтилен. Все тестируемые трифенилэтилены эстрогеноподобные, но Е2 и DES с 100 раз более эффективнее, чем даже самый эффективный трифенилэтилен бисфенолтрифенилэтилнен. Порядок эффективности активации ЭР в клетках MCF-7:WS8 следующий: Е2 > DES > бисфенолтрифенилэтилен > тригидрокситрифенилэтилен > цис/транс-дигидрокситрифенилэтилен > этокситрифенилэтилен > 4-гидрокситрифенилэтален. Ни один из исселедуемых трифенилэтиленов не проявил никаких антиэстрогеновых свойств в данных опытах (Рис. 4).

Рис. 4 Определение уровня активности ЭРа при помощи репортерного гена пюцифенразы под промотором с пятикратным эстрогенреспонсивным элементом (ЭРЭ) в клетках MCF-7: WS8 после обработки планарными эстрогенами Е2 и DES и тестируемыми трифенилэттенами в течении 24 часов.

Для определения способности тестируемых трифенилэтиленов активировать ЭР в клетках линии MCF-7:5C, мы провели аналогичный, с вышеописанным экспериментом, опыт. Результаты данного опыта показали, что все эстрогены, вне зависимости от класса, способны так же, как и в клетках с диким фенотипом, активировать транскрипцию гена люциферазы.

Все эти результаты указывают на то, что данные вещества несмотря на их непланарную структуру спосбны активировать ЭР и вызывать активацию транскрипции генов, ответственных за инициацию эстроген-стимулированной пролиферации. Несмотря на то, что по результатам данных экспериментов, тестируемые трифенилэтилены вызывают пролиферативные эффекты в клетках с диким фенотипом при более высоких концентрациях чем планарные эстрогены, как 17Р-эстрадиол и синтетический нестероидный эстроген диэтилстилбестрол (DES), трифенилэтилены способны связываться с ЭР, хотя, вероятнее всего с более низкой аффинностью. В отличии от тестируемых трифенилэтиленов, которые не обладают боковой

аминоэтокси группой, метаболиты тамоксифена 4-гидрокситамоксифен и эпдоксифен не способны активировать ЭР (по результатам репортерных тестов) и, следовательно, вызывать пролиферативный эффект (по результатам пролиферативных тестов). Пародоксально, но непланарные трифенилэтилены неспособны вызывать полной гибели клеток в течении 7 суток дяже при высокой концентрации в среде (1 мкМ). Только, два вещества были способны вызывать биологически существенный уровень апоптоза в культуре. Тригидрокситрифенилэтилен был способен зызывать в среднем 40-50% гибели клеток, в то время как транс-изомер дигидрокситрифенилэтилен был способен вызывать полную гибель клеток. Объяснить такую проапоптотическую активность транс-изомера дигидрокситрифенилэтилена можно только тем, что это вещество не имея 4-гидроксигруппы, как остальные трифенилэтилены, может связываться с ЛСД ЭР таким образом, что бы гидроксигруппа на противоположном фенильном кольце воспроизводила позицию гидрокси группы на эстрадиоле, таким образом, позиционируясь в полости ЛСД так, что второе фенильное кольцо не создает стерического препятствия для 12-ой а-спирали, позволяя ей закрыть полость ЛСД и связаться коактиваторам с ЭР и активировать его. Таким образом, данный трифенилэтилен может связываться с рецептором с достаточно высоким сродством, активировать его по пути сходным с этрадиол-опосредованным и вызывать апоптоз клеток. Так же возможна трансизомеризация, которая известна для тамоксифена, когда цис-изомер тамоксифена частично в растворе переходит в транс-изомер тамоксифена и перестает проявлять антиэстрогеновые свойства. Остальные вещества не способны были вызывать гибель клеток, что было показно в пролиферативных тестах и в опытах по определению уровня апоптоза в культуре клеток. Более того, данные трифенилэтилены способны выступать в роли антагонистов ЭР, ингибируя эстрадиол-индуцированный апоптоз клеток. При этом все трифенилэтилены, так же как и планарные эстрадиол и DES, способны активировать транскрипционную активность репортерного гена, а следовательно и активировать ЭР. Это может указывать, что исследуемые непланарные трифенилэтилены способны связываться в ЭР в данных клетках, ативировать его, как и в клетках дикого типа, но неспособны индуцировать гибель клеток, как это делают планарные эстрогены, которые являются агонистами ЭР в обеих линиях клеток.

Рис. 5 Определение уровня активности ЭРа при помощирепортерного гена люцифенразы под промотором с пятикратным эстрогенреспонсивным элементом (ЭРЭ) в клетках MCF-7:SC после обработки планарными эстрогенами Е2 и DES и тестируемыми трифенилэтиленами в

течении 24 часов.

Определение мехнюма активации ЭР в клетках нам было необходимо для объяснения роли измененной корформации ЭР в неспособности индуцировать апоптоз в эстроген-независимых клетках и некритичности данного конформационного изменения для индукции роста клеток дикого типа. Для этого мы использовали результаты молекулярного докинга и репортерных тестов с мутантной формой ЭР. Результаты молекулярного докинга показали, что все наши исследуемые трифенилэтилены лучше входят в модель антагонистической конформации ЭР и связываются лучше с рецептором орентируясь в ЛСД ЭР сходным образом с 4-гидрокситамоксифеном. В случае с агонистической конформацией ЭР, связывание трифенилэтиленов и образование водородных связей с аминокислотными остатками ЛСД, необходимых для подходящей ориентации лигандов в полости ЛСД, невозможно из-за стерических помех 12-ой а-спирали рецептора. Из этих результатов можно сделать вывод, что поскольку трифенилэтилены не могут войти в агонистическую конформацию ЭР из-за

стерических помех, но входят в аналогичную антагонистической конформации рецептора с 4-гидрокситамоксифеном, то с наибольшей вероятностью все трифенилэтилены при связывании с ЭР придают последнему конформацию схожую с антагонистической конформацией ЭР, но тем не менее, способны активировать его, в отличии от 4-гидрокситамоксифена. Это было подтверждено при помощи молекулярного докинга. Анализ результатов молекулярного докинга проводился на основании наиболее вероятных ориентировок тестируемых трифенилэтилеиов в ЛСД ЭР и сравнивался с ориентацией 4-гидрокситамоксифена. Конформации ЭР, ассоциированных с 4-гидрокситамоксифепом и эстрадиолом были полученны из базы данных PDB. RMSD (Raw Median Standart Deviation, значение которое отображает эфективность докинга двух молекул) для докинга 4-гидрокситамоксифена составила 0,55 А, более того, низкое значение RMSD было получено так же в результате докинга тестируемых лигандов в ходе аналогичного позиционирования их моделей в ЛСД ЭР в антагонистической конформации (обозначена как 3ert в базе данных PDB), что показано на Рис. 6А. Все тестируемые трифенилэтилены способны образовывать такие же взаимодействия с аминокислотными остатками D351, Е353, R394, Т347 и Н524, как и 4-гидрокситамоксифен. Самая большая разница в докинге трифенилэтилеиов в сравнении с 4-гидрокситамоксифеном заключается в том, что боковая цепь последнего подвинута ближе к D351 и образует связь между амино группой тамоксифена и карбоксильной группой а.о. D351. Суперимпозиция моделей тестируемых трифенилэтилеиов выявила то, что их ориентация в ЛСД ЭР очень схожа с той, что у 4-гидрокситамоксифена и, таким образом, позволяет образовывать взаимодействия с теми же аминокислотными остатками ЭР, что и тамоксифен. Для контроля подобное ориентирование молелей лигандов было проведено на агонистической модели ЭР (ЭР кристаллизованного с эстрадиолом, обозначен как 1GWR в базе данных PDB). Результаты такого докинга показало, что трифенилэтилены не могут уместиться в полость ЛСД из-за стерических препятстсвий между углеводными радикалами лейцинов Leu525, Leu540 на 12-ой а-спирали, как показано на Рис. 6Б. Это указывает на то, что трифенилэтилены наиболее вероятно будут вызывать антагонистическую конформацию ЭРа, сходную с той, которую образует 4-гидрокситамоксифен.

Рис. 6 Молекулярный докинг исследуемых трифенилзтиленов и модель лиганд-связывающего домена ЭР в А: антагонистической конформации и в Б: агонистической конформации.

Для поддгверждения гипотезы, что для активации ЭР трифенилэтиленам необходимо взаимодействие с 351 а.о. ЭР мы провели репортерные тесты на клетках транзиторно экспрессирующих дикий тип ЭР и мутантный тип с заменой Асп351 на глицин, репортерные тесты, результаты которых показали, что все вещества вне зависимости от класса способны активировать транскрипцию гена люциферазы, соответственно, способны активировать ЭР дикого типа (Рис. 7), в то время как только пленарные эстрогены класса I способны активировать мутантный тип ЭР, т.к. не нуждаются во взаимодействии с 351 а.о (Рис. 8).

Для потверждения того, что все тестируемые трифенилэтилены не активируют мутантную форму ЭР не за счет того, что они просто не способны связываться с рецептором, а потому что не способны в ходе стерических нарушений рецептора его активировать, мы провели опыты с конкуренцией некоторых наиболее интересных трифенилзтиленов против Е2 за связывание с ЭР. Результаты показали, что все трифенилэтилены, в том чичсле и антиэстрогены способны ингибировать зстроген-стимулированную транскрипцию репортерного гена, при концентрации Е2 в 1 нМ. При более высокой концентрации в 10 нМ тестируемых трифенилзтиленов, последние

способны фактически полностью ингибировать эстрадиол-стнмулированную транскрипцию. Эти результаты указывают на то, что эстрогены класса II несмотря на то, что не способны активировать мутантную форму ЭР, способны с таким рецептором образовывать комплекс.

[М]

Рис. 7 Определение уровня активности ЭРа дикого типа при помощи репортерного гена люцифенразы под промотором с пятикратным эстроген респонсивным элементом (ЭРЭ) в клетках T47D.C42 после обработки планарными эстрогенами Е2 и DES и тестируемыми трифенилэтиленами в течении 24 часов.

Рис. 8 Определение уровня активности мутантной формы ЭРа с заменой аспартата на глицин в 351 позиции при помощи репортерного гена люцифенразы под промотором с пятикратным эстрогенреспонсивным элементом (ЭРЭ) в клетках T47D.C42 после обработки планарными эстрогенами Е2 и DES и тестируемыми трифенилэтиленами в течении 24 часов.

Для определения уровней деградации белка ЭР и характера этого процесса во времени мы провели эксперименты, в которых мы обрабатывали клетки линий MCF-7:WS8 и MCF-7.5C тестируемыми трифенилэтиленами: тригидрокситрифенилэтилен (1 нМ), бисфенолтрифенилэтилен (1нМ) и этокситрифенилэтилен (1 мкМ) в минимальных концентрациях, необходимых для индукции транскрипции репортерного гена, а так же планарным эстрадиолом в течении 24 часов. Результаты показали, что Е2 способен начинать деградацию ЭР уже начиная с 1 часа, после чего происходит фактически полная и стабильная деградация ЭР. В отличие от планарного эстрадиола, тестируемые трифенилэтилены, хоть и вызывают деградацию ЭР после 4-8 часов обработки клеток, но не способны эту деградацию вызывать стабильно, т.к. уровни белка ЭР в клетках возвращаются на уровень сходный с контрольным на 24 часовой отметке (Рис. 9). Отдельно стоит отметить бисфенолтрифенилэтилен,

который способен вызывать деградацию белка ЭР в клетках только между 8 и 24 часами обработки, то есть значительно медленее, чем остальные трифенилэтилены. Для подтверждения того, что снижение уровней белка ЭР в клетках при обработке трифенилэтиленами это именно протеосомальная деградация, мы провели аналогичную обработки клеток МСР-7:\¥58 и МСР-7.5С веществами индивидуально и в комбинации с ингибитором 26Б протеосомы М0132 в течении 4 часов. В результате, как и ожидалось, все вещества в индивидуальном порядке вызвали деградацию белка ЭР, но в комбинации с протеосомным ингибитором, уровни ЭР остались на контрольном уровнях, что указывает на то, что именно протеосомальная деградация на 26Э протеосоме является причиной снижения уровня белка ЭР в клетках (Рис. 10).

Для опредеоления способности тестируемых трифенилэтиленов индуцировать транскрипцию эндогенных эстроген-респонсивных генов в МСР-7:\М58 и МСР-7:5С клетках, мы обработали последние всеми тестируемыми трифенилэтиленами (кроме бисфенолтрифенилэтилена), а так же Е2. Далее была собрана мРНК из каждого образца, после чего, на основе мРНК, была получена кДНК и проведен анализ при помощи количественного ПЦР в реальном времени. Результаты показали, что все анализируемые трифенилэтилены способны активировать транскрипцию эндогенного эстроген-зависимого гена р52. Самым эффективнм эстрогеном по уровню индукции транскрипции мРНК гена рБ2 является Е2 в концентрации 1 нМ, остальные трифенилэтилкены так же увеличивают уровень транскрипции, но не настолько существенно как Е2.

Оч. 1ч. 2ч. 4ч. 8ч. 24ч. Оч. 1ч. 2ч. 4ч. 8ч. 24ч. Оч. 1ч. 2ч. 4ч. 8ч. 24ч.

Е2 1нМ 1 1нМ 51мМ

Оч. 1ч. 2ч. 4ч. 8ч. 24ч. Оч. 1ч. 2ч. 4ч. 8ч. 24ч. Оч. 1ч. 2ч. 4ч. 8ч. 24ч.

¡ЭРа ¡ИШ р-актин

21нМ 4-гидрокситамоксифен Эндоксифен 1 мМ

1 мМ

Рис. 9. Иммуноблоттинг лизатов клеток МСР-7:5С обработанных антителами против ЭРа и Р-актина для контроля нагрузки. Клетки обрабатывались в течении 24 часов тестируемыми трифенилэтиленами и эстрадиолом в течении определенных периодов времени.

Для определения уровня привлечения белков ЭРа и коактиватора раецептора БЯС-З на промоторный участок гена р52, что напрямую отражает транскрипционную функцию ЭР после активации эстрогенами разных классов, мы использовали метод хроматиновой иммунопреципитации. Результаты данной серии экспериментов показали, что Е2 явялется самым эффективным эстрогеном и имеет самое большое привлечение ЭР на промоторный участок гена рБ2, а так же белка БЯС-З. Тригидрокситрифенилэтилен и этокситрифенилэтилен так же способны привлечь ЭР на промотор гена, но в среднем на чуть меньшем уровне. Что касается коактиватора ЗЯС-З, то пародоксально, исследуемые трифенилэтилены, так же как и антиэстроген 4-гидрокситамоксифен не привлекают детектируемое количество белка 5ЯС-3. Антиэстроген 4-гидрокситамоксифен в концентрации 1мкМ способен привелчь некоторое количество ЭР на промотор гена, но то что данное вещество не способно инициировать транскрипцию с гена объсняется тем, что комплекс ЭР:4-гидрокситамоксифен присоединяет белки-корепрессоры, а не коактиваторы.

СМ СО

см см см

5 5 со п со

о 5 5

+ 5 + 2 + +

X 5

СМ ш X

т— ю

С/5

Рис. 10 Иммуноблоттинг лизатов клеток МСР-7: №8 и МСР-7:5С, обработанных антителами

против ЭРа и /?-актина. Клетки обрабатывались в течении 4 часов тестируемыми

трифенилэтиленами и эстрадиолом индивидуально, а так же в комбинации с

ингибитором 268 протеосомы МО/32. 22

В случае с трифенилэтиленами, ЭР, активированный такими непланарными эстрогенами, способен быть активным как транскрипционный фактор, но привлечение коактиваторов низкое, что может объяснить пониженную транскрипционную активность за счет сниженного уровня деградации белка ЭР протеосомальным комплексом. Подтвердением наших результатов, полученных при помощи ммунопреципитации хроматина могут служить результаты полученные, группой Лекперка из Бельгии (Bourgoin-Voillard и другие, 2009). Их группа обнаружила на другой in vitro модели, что ЭР ассоциированный с эстрогенами не планарными класса II не может образовывать комплекс с коактиваторными молекулами по причине конформационных изменений молекулы рецептора. В своих исследованиях они использовали вещество бисфенотрифенилэтилен и другие непланарные эстрогены, при связывании с которыми наблюдалось увеличение транскрипционной активности ЭР, а так же могли проявлять некоторые антагонистические свойства, подобные тем, которые обнаружили и мы. Бисфенолтрифенилэтилен в их исследованиях активировал ЭР, но рецептор не способен в этом случае присоединать коактиваторы (Bourgoin-Voillard и другие, 2009).

Все эти данные указывают, что изменение конформации ЭР при связывании с трифенилэтиленами не только лишает его способности индуцировать эстроген-индуцированный апоптоз в эстроген-независимых клетках, но и играет роль в регуляции стабильности белка ЭР, что, в свою очередь, изменяет механизм регуляции транскрипционной активности опосредованной ЭР.

Таким образом, в настоящей работе исследовалась роль конформационных изменений ЭР при связывании с непланарными эстрогенами. Непланарные эстрогены были представлены серией синтезированных нестероидных гидроксилированных производных трифенилэтилена. Биологические свойства данных непланарных эстрогенов класса II сравнивались с планарными эстрогенами класса I, такими как эстрадиол и DES. Для определения разницы в вероятных конформационных изменениях ЭР при связывании с эстрогенами различных классов мы применили метод виртуального докинга и показали, что конформационные изменения ЭР при связывании трифенилэтиленов вероятнее всего больше напоминают антагонистическую конформацию рецептора, придаваемую рецептору антиэстрогеном 4-гидрокситамоксифеном. Для определения биологической активности трифенилэтиленов по сравнению с эстрогенами класса I применялись пролиферативные тесты, с помощью которых мы показали, что все эстрогены, вне зависимости от класса, способны инициировать пролиферацию клеток рака молочной железы с диким фенотипом, но не все способны индуцировать эстроген-идуцированный апоптоз в эстроген-независимых клетках. При помощи Вестерн блотгингов мы показали, что из-за измененной конформации ЭР рифенилэтилена, невозможно существенное увеличение уровней проапоптотических факторов, что возможно и является причиной низкой степени клеточной

гибели. При помощи репортерных тестов, проведенных на тех же линиях клеток, мы показали, что вне зависимости от класса эстрогенов, все вещества были способны активировать транскрипционную активность ЭР. Таким образом, можно сделать вывод о том, что конформационное изменение ЭР не критично для активации рецептора и индукции клеточной пролиферации, но критично для индукции апоптоза в эстроген-независимых клетках. Так же при помощи репортерных тестов с мугантной формой ЭР мы показали разницу в механизме активации ЭР. Мы подтвердили гипотезу о том, что для активации ЭР трифенилэтиленами, последним необходимо взаимодействие с аспартатом в 351 позиции на рецепторе, что позволит этому а.о. взаимодейтсвовать с активным доменом рецептора АР-1, что, по всей видимости и обеспечивает активность рецептора. Так же мы определили разницу в регуляции транскрипционной активности ЭР посредством изменения стабильности белка ЭР, связанного с непланарными эстрогенами, в сравнении с планарным эстрадиолом. При помощи Вестерн блотгингов мы показали, что ЭР, активируемый трифенилэтиленами, деградирует в меньшей степени, чем посредством планарного эстрадиола. Мы объяснили при помощи иммунопреципитации хроматина, что ЭР с измененной трифенилэтиленами конформацией не может эффективно связывать коактиваторы, что и обуславливает нарушение в протеосомальной деградации белка ЭР и объясняет пониженный уровень транскрипционной активности ЭР на промоторе эндогенных эстроген-респонсивных генов в клетках.

ВЫВОДЫ

1. Все эстрогены вне зависимости от их химической структуры (планараности) способны инициировать клеточную пролиферацию клеток рака молочной железы.

2. Непланарные эстрогены не способны индуцировать апоптоз эстроген-независимых клеток МСР-7:5С. Только планарные эстрогены (17Р-эстрадиол и диэтилстилбестрол) могут вызывать полную гибель таких клеток.

3. Уровень апоптоза в эстроген-независимых клетках при обработке непланарными эстрогенами ниже по сравнению с уровнями, индуцированными пленарными эстрогенами. Планарные эстрогены способны увеличивать уровень митохондриальных проапоптотических маркеров в клетках эффективнее чем трифенилэтилены, тем самым предрасполагая клетки к апоптозу.

4. Все эстрогены вне зависимости от их химической структуры могут активировать ЭРа в ЭР-положительных клетках рака молочной железы как с диким фенотипом, так и с эстроген-независимым фенотипом.

5. Механизм активации ЭРа трифенилэтиленами отличен от механизма активации эстрадиолом за счет разной принимаемой рецептором конформации. Эстрогены класса II нуждаются во взаимодействии с аспартатом в 351 позиции ЭР для его эффективной активации.

6. Регуляция транскрипционной активности ЭР при активации различными классами эстрогенов

разная. Трифенилэтилены не позволяют ЭР эффективно связывать коактиваторные белки с рецепторным комплексом, что нарушает механизм деградации белка ЭР и снижает транскрипционную активность в клетках рака молочной железы.

7. Непланарные трифенилэтилены вероятнее всего изменяют конформацию ЭРа по типу антагонистической, подобно антиэстрогену 4-гидрокситамоксифену. В отличие от пленарных эстрогенов, трифенилэтилены за счет своей химической структуры не позволяют 12-ой а-спирали закрыть полость лиганд-связывающего домена ЭРа.

8. Полученные результаты подчеркивают важность конформационных изменений ЭР при активации эстрогенами различных клессов для модуляции эстрогенового ответа в клетках.

Практические рекомендации

Результаты настоящего исследования, описывающие структурно-функиональные отношения трифенилэтиленов и эстрогенового рецептора в клетках рака молочной железы могут служить важным дополнением к тем, уже имеющимся, знаниям о механизмах регулирующих эстрогеновый ответ в клетках, в том числе и резистентных к адъювантной терапии. Вещества типа производных трифенилэтиленов могут послужить основой к созданию новейших препаратов терапии рака молочной железы с меньшими побочными эффектами.

Список научных работ опубликованных по теме диссертации

1. The Paradox of Oestradiol-Induced Breast Cancer Cell Growth and Apoptosis. Maximov PY, Lewis-Wambi JS, Jordan VC. Curr Signal Transduct Ther. 2009 May 1;4(2):88-102.

2. Structure Function Relatiionships of Estrogenic Triphenylethylenes Related to the Antiestrogens Endoxifen and 4-Hydroxytamoxifen. Maximov PY, Myers C, Curpan RF, Lewis-Wambi JS, Jordan VC. J Med Chem. 2010 March 23; http://pubs.acs.Org/toc/jmcmar/0/0

Подписано в печать: 05.04.10

Объем: 1,5 усл.печ.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 256 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г.Москва, пр-т Вернадского, 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Максимов, Филипп Евгеньевич

Глава 1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность.

Цель настоящего исследования.

Задачи настоящего исследования.

Положения выносимые на защиту.

Глава 2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1 История специфической гормональной терапии.

2.2. Эстрогеновые рецепторы и механизм действия эстрогенов.

2.2.1. Эстрогеновые Рецепторы (ЭР): структура и свойства.

2.2.2. Корегуляторы ЭР и механизм действия ЭР.

2.2.3. Негеномный механизм действия эстрогенов.

2.3. Антигормональная терапия рака молочной железы

2.3.1 Нестероидные антиэстрогены: переход к специфической терапии.

2.3.2 Селективные Модуляторы Эстрогенового Рецептора (вЕКМ).

2.3.3 Механизм действия БЕКМ.

2.3.4 Клиническое применение БЕКМ.

2.4 История изучения структурно-функциональных отношений производных трифенилэтилена, в том числе тамоксифена и его метаболитов и ЭР.

2.5. Резистентность к антнгормональпым препаратам

2.5.1. Нарушение метаболизма тамоксифена.

2.5.2. Врожденная резистентность.

2.5.3. Приобретенная резистентность.

2.6. Эстрогеновая терапия рака молочной железы

2.6.1 Механизмы эстроген-индуцнрованного апоптоза.

2.6.2 Перспективы применения эстрогеновой терапии в клинике.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Синтезированные трифенилэтилены и другие вещества.

3.2. Культуры клеток и методы культуральной работы.

3.3. Тесты для определения клеточной пролиферации.

3.4. Количественное определение апоптоза в культуре клеток.

3.5. ДНК-вектора.

3.6. Транзиторные трансфекции и люциферазные репортерные тесты.

3.7. Иммуноблоттинг.

3.8. Выделение мРНК из клеток и сиптез кДНК.

3.9. ПЦР в реальном времени.

3.10. Хроматиновая иммунопреципитация (СЫР).

3.11. Молекулярный докинг.

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Определние биологической активности в линиях клеток рака молочной железы человека МСЕ-7 и МСЕ-7:5С.

4.2. Определение эстроен-индуцированного апоптоза в эстроген-независимых клонах клеток рака молочной железы человека МСЕ-7:5С и его количественный анализ.

4.3. Определение опосредованности эффектов исследуемых эстрогенов через ЭР во всех клеточных линиях МСЕ-7.

АЛ. Значение аспартата в 351 позиции ЭР для его активации непланарными трифенилэтиленами.

4.5. Определение механизмов регуляции транскрипционной активности ЭРа в клетках рака молочной железы.

4.6. Результаты молекулярного докинга.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Максимов, Филипп Евгеньевич

выводы

1. Все эстрогены вне зависимости от их химической структуры (планарности) способны инициировать клеточную пролиферацию клеток рака молочной железы.

2. Непланарные эстрогены не способны индуцировать апоптоз эстроген-независимых клеток МСР-7:5С. Только планарные эстрогены (17р-эстрадиол и диэтилстилбестрол) могут вызывать полную гибель таких клеток.

3. Уровень апоптоза в эстроген-независимых клетках при обработке непланарными эстрогенами ниже по сравнению с уровнями, индуцированными планарными эстрогенами. Планарные эстрогены способны увеличивать уровень митохондриальных проапоптотических маркеров в клетках эффективнее чем трифенилэтилены, тем самым предрасполагая клетки к апоптозу.

5. Механизм активации ЭРа трифенилэтиленами отличается от механизма активации эстрадиолом за счет разницы в принимаемых рецептором конформациях. Эстрогены класса II нуждаются во взаимодействии с аспартатом в 351 позиции ЭР для его эффективной активации.

6. Регуляция транскрипционной активности ЭР при активации различными классами эстрогенов разная. Трифенилэтилены не позволяют конформационно измененному белку ЭР эффективно связывать коактиваторные белки с лиганд-рецепторным комплексом, что нарушает механизм деградации белка ЭР и снижает транскрипционную активность в клетках рака молочной железы.

7. Непланарные трифенилэтилены вероятнее всего изменяют конформацию ЭРа по типу антагонистической, подобно антиэстрогену 4-гидрокситамоксифену. В отличие от планарных эстрогенов, трифенилэтилены за счет своей химической структуры не позволяют 12-ой а-спирали закрыть полость лиганд-связывающего домена ЭРа. 8. Полученные результаты подчеркивают важность конформационных изменений ЭР при активации эстрогенами различных клессов для модуляции эстрогенового ответа в клетках.

Глава 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5.1. Определение биологической активности непланарных эстрогенов

Целью настоящего исследования структурно-функциональных отношений является изучение роли конформационных изменений ЭР при связывании непланарных эстрогенов в биологических процессах клеток рака молочной железы. Для этого использовались клеточные модели линии MCF-7 рака молочной железы и пролиферативные тесты для оценки биологических активностей серии синтезированных трифенилэтиленов, а так же репортерные тесты для определения способности данных эстрогенов активировать ЭР в данных клетках. Наши результаты показали, что все синтезированные трифенилэтилены обладают эстрогеноподобными свойствами в клетках рака молочной железы с диким фенотипом. Данные эстрогены существенно увеличивали пролиферативную активность клеток и увеличивали транскрипцию репортерного гена, которая регулировалась промотором, содержащим Эстроген-Респонсивный Элемент (ЭРЭ). Это указывает на то, что данные вещества несмотря на их непланарную структуру спосбны активировать ЭР и вызывать активацию транскрипции генов, ответственных за инициацию эстроген-стимулированной пролиферации. Несмотря на то, что по результатам данных экспериментов, тестируемые трифенилэтилены вызывают пролиферативные эффекты в клетках с диким фенотипом при более высоких концентрациях чем планарные эстрогены, как 17Р-эстрадиол и синтетический нестероидный эстроген диэтилстилбестрол (DES), трифенилэтилены способны связываться с ЭР, хотя, вероятнее всего с более низкой аффинностью. В отличии от тестируемых трифенилэтиленов, которые не обладают боковой аминоэтокси группой, метаболиты тамоксифена 4-гидрокситамоксифен и эндоксифен не способны активировать ЭР (по результатам репортерных тестов) и, следовательно, вызывать пролиферативный эффект (по результатам пролиферативных тестов).

Рентгеноструктурный анализ кристаллов комплексов ЭР-4-гидрокситамоксифена и ЭР-ралоксифена показал, что наличие боковой цепи у 4-гидрокситамоксифена критично для принятия ЭР антагонистической конформации путем репозиционирования а-спирали 12 рецептора этой боковой цепью. Это и предотвращает связывание коактиваторов с ЭР [12]. Основываясь на результатах наших пролиферативных и репортерных тестов мы предполагаем, что репозиционирование гидроксильных групп на синтезированных трифенилэтиленах изменяет их биологическую активность относительно друг друга, а так же понизило их сродство к рецептору по сравнению с эстрадиолом. Результаты все же показали, что данные непланарные эстрогены являются полными агонистами ЭР в клетках линии МСР-7:\У88, отсутствие боковой цепи как у метаболитов тамоксифена не позволяет трифенилэтиленам выступать в роли антагонистов в данной линии клеток, что показали опыты с ингибированием эстрадиол-стимулированной пролиферации клеток антиэстрогенами, у которых присутствует боковая цепь [12]. Несмотря на репозицонирование гидроксильных групп и добавление этокси группы, что снижает их биологическую активность в культуре клеток, все вещества сохранили способность индуцировать транскрипцию репортерного эстроген-зависимого гена в полной мере.

Для определения способности синтезированных трифенилэтиленов индуцировать апоптоз в тамоксифен-резистентных и эстроген-независимых клетках, мы проводили аналогичные тесты на пролиферативную активность. Все планарные эстрогены способны индуцировать апоптоз во всей культуре клеток МСР-7:5С, которые были выведены для создания модели клеток рака молочной железы с развитой резистентностью ко всем формам адьювантной терапии. Пародоксально такие клетки развили механизм выживания в бесстероидной среде и ингибировали апоптотический путь, активирующийся при эстрогеновом голодании у клеток с диким фенотипом. Эстроген при концентрации близкой к концентрации эстрогена у женщин в постклимактерическом возрасте (1 нМ) убивает почти все клетки линии МСР-7:5С в течении недели, как это было показано в наших пролиферативных тестах. DES, который является планарным эстрогеном со структурой, похожей на структруру эстрогена, так же способен полностью убивать такие клетки в культуре. Поскольку наши тестируемые трифенилэтилены так же являются эстрогенами в клетках дикого типа и способны активировать ЭР, было решено сравнить их способность индуцировать апоптоз в клетках MCF-7:5C. Пародоксально, но не пленарные трифенилэтилены неспособны вызывать полной гибели клеток в течении 7 суток дяже при высокой концентрации в среде (1 мкМ). Только, два вещества были способны вызывать биологически существенный уровень апоптоза в культуре. Тригидрокситрифенилэтилен был способен зызывать в среднем 40-50% гибели клеток, в то время как цис-изомер дигидрокситрифенилэтилен был способен вызывать полную гибель клеток. Объяснить такую проапоптотическую активность цис-изомера дигидрокситрифенилэтилена можно только тем, что это вещество не имея 4-гидроксигруппы, как остальные трифенилэтилены, может связываться с ЛСД ЭР таким образом, что бы гидроксигруппа на противоположном фенильном кольце воспроизводила позицию гидрокси группы на эстрадиоле, таким образом, позиционируясь в полости ЛСД так, что второе фенильное кольцо не создает стерического препятствия для 12-ой а-спирали, позволяя ей закрыть полость ЛСД и связаться коактиваторам с ЭР и активировать его. Таким образом, данный трифенилэтилен может связываться с рецептором с достаточно высоким сродством, активировать его по пути сходным с этрадиол-опосредованным и вызывать апоптоз клеток. Так же возможна трансизомеризация, которая известна для тамоксифена, котда цис-изомер тамоксифена частично в растворе переходит в транс-изомер тамоксифена и перестает проявлять антиэстрогеновые свойства [190]. Остальные вещества не способны были вызывать гибель клеток, что было показно в пролиферативных тестах и в опытах по определеншо уровня апоптоза в культуре клеток. Более того, данные трифенилэтилены способны выступать в роли антагонистов ЭР, ингибируя эстрадиол-индуцированный апоптоз клеток. При этом все трифенилэтилены, так же как и планарные эстрадиол и DES, способны активировать транскрипционную активность репортерного гена, а следовательно и активировать ЭР. Это может указывать, что исследуемые непланарные трифенилэтилены способны связываться в ЭР в данных клетках, ативировать его, как и в клетках дикого типа, но неспособны индуцировать гибель клеток, как это делают планарные эстрогены, которые являются агонистами ЭР в обеих линиях клеток.

Поскольку в вышеописанных результатах му показали зависимость индукции эстроген-опосредованного апоптоза в эстроген-независимых клетках от химической стуктуры лигандов, а именно то, что трифенилэтилены не способны активировать апоптоз в таких клетках и выступают в качестве антагонистов, но в тоже время являются полными агонистами в клеках с диким фенотипом, то мы решили показать разницу в механизме активации ЭР планарными и непланарными эстрогенами. Так было показано ранее при помощи ренгено структурного анализа ЛСД ЭР связанного с эстрадиолом и 4-гидрокситамоксифеном и изучении эстрогеноподобных свойств последнего, что для активации ЭР необходима 351 аминокислота для активации рецептора трифенилэтипленами, на примере 4-гидрокситамоксифена. Для подтверждения гипозы о том, что данный амикислотный остаток необходим для активации рецепора, иы провели репортерные тесты для определения активности ЭР дикого типа и с заменой Асп351 на глицин испытуемыми везществами. Наши результаты показали, что только планарные эстрогены, такие как эстрадиол и DES способны активировать мутантную форму ЭР так же как и дикий тип ЭР, что чвязянно с тем что по результатам молекулярного моделирования и ренгеноструктурного анализа данные эстрогены не образуют водородной связи с 351 аминокислотой. В то время, как трифенилэтилены взаимодействуютс 351 аминокислотой, то это объяснет их неспособность активировать мутантную форму ЭР при связывании. Эти данные подтверждают данные ранее полученные группой Джордана [188Д89] о важности. 351 амикислоты для активации ЭР непланарными эстрогенами, такими как трифенилэтилены. Имеено химическая структура трифенилэтиленов обуславливает конформацию ЭР, а в свою очередь определяет механизм активации рецептора, после образования лиганд-рецепторного комплекса. Такой механизм активации может вполне определять и регуляцию биологических процессов, таких как апоптоз и активность ЭР как транскрипционного фактора.

5.2. Определение способности ненланарных эстрогенов активировать аноптотнческие маркеры

Подтверждением того, что исследуемые трифенилэтилены, которые не вызывают полной гибели клеток (тригидрокситрифенилэтилен, бисфенолтрифенилэтилен и этокситрифенилэтилен) действительно не способны в достаточной мере индуцировать апоптоз клеток, мы провели Вестерн блоттинг лизатов клеток MCF-7:5C и обрабатывали мембраны антителами против про- и анти-апоптотических маркеров. Результаты данных экспериментов только подтверждают разницу в характере изменений в уровнях вышеказанных маркеров различными классами эстрогенов. Так оказалось, что вне зависимости от структуры эстрогенов, все вещества способны вызывать снижение уровня анти-апоптотического маркера Вс1-Х1 в клетках MCF-7:5C, но только планарный эстрадиол способен вызывать достаточное увеличение про-апоптотических маркеров в течение первых 24 часов, в отличие от не планарных трифенилэтиленов. Трифенилэтилены не вызывая достаточного увеличения внутриклеточных уровней проапототических фаторов как Ьах и bim и не способны таким образом инициировать достаточную активацию каспаз в клетках и последующего апоптоза. Подтверждением того, что эти процессы, опосредованные трифенилэтиленами, специфичные для данной линии клеток мы провели аналогичные опыты на линии клеток MCF-7:WS8 с диким фенотипом. Результаты показали, что в отличие от эстроген-независимых клеток, в клетках с диким фенотипом, всеми эстрогенами, в независимости от класса, происходит увеличение внутриклеточных уровней обоих антиапоптотических маркеров Вс1-Х1 и Bcl

2, отсутствие увеличения уровней проапоптотических маркеров bim и bad, а так же отсутствие детектируемого уровня Ьах. Это указывает на то, что в данных клетках, в независимости от структуры лигандов ЭР происходит активация сигнальных путей для выживания клеток. Все эти результаты еще раз подтверждают результаты вышеописанных экспериментов, из которых можно сделать вывод о том, что конформация ЭР, которую ЭР принимает после связывания не планарных трифенилэтиленов, играет важную роль в активации апоптотических процессов в эстроген-независимых клетках, в то время, как агонистическая конформация, которая принимается при связывании планарных эстрогенов, не играет такой роли.

5.3. Определение конформации ЭР при связывании трифенилэтиленов и механизма активации ЭР не планарными эстрогенами

Определение мехнизма активации ЭР в клетках нам было необходимо для объяснения роли измененной корформации ЭР в неспособности индуцировать апоптоз в эстроген-независимых клетках и некритичности данного конформационного изменения для индукции роста клеток дикого типа. Для этого мы использовали результаты молекулярного докинга и репортерных тестов с мутантной формой ЭР.

Результаты молекулярного докинга показали, что все наши исследуемые трифенилэтилены лучше входят в модель антагонистической конформации ЭР и связываются лучше с рецептором орентируясь в ЛСД ЭР сходным образом с 4-гидрокситамоксифеном. В случае с агонистической конформацией ЭР, связывание трифенилэтиленов и образование водородных связей с аминокислотными остатками ЛСД, необходимых для подходящей ориентации лигандов в полости ЛСД, невозможно из-за стерических помех 12-ой а-спирали рецептора. Из этих результатов можно сделать вывод, что поскольку трифенилэтилены не могут войти в агонистическую конформацию ЭР из-за стерических помех, но входят в аналогичную антагонистической конформации рецептора с 4-гидрокситамоксифеном, то с наибольшей вероятностью все трифенилэтилены при связывании с ЭР придают последнему конформацию схожую с антагонистической конформацией ЭР, но тем не менее, способны активировать его, в отличии от 4-гидрокситамоксифена.

Дополнительным подтверждением гипотезы о том, что конформация ЭР при связывании планарных и непланарных (трифенилэтиленов) эстрогенов разная и соответственно, позволяющая классифицировать эстрогены на два класса, мы использовали результаты репортерных тестов с мутантной формой ЭР. Данная гипотеза была независимо развита как группой Джордана [15,191], так и группой Густа из Германии [16]. Как стало известно в результате рентгеноструктурного анализа кристаллов ЭР ассоциированного с 4-гидрокситамоксифеном, последний образует водородную связь с аспартатом в 351 позиции рецептора, которая является частью транскрипционно-функционального мотива AF-2 на 12-ой а-спирали, которая не может закрыть полость ЛСД ЭР из-за наличия у тамоксифена боковой цепи. Предотвращение конформационных изменений рецептора, которые бы позволили коактиваторам присоединиться и активировать рецептор, делают 4-гидрокситамоксифен антиэстрогеном в клетках рака молочной железы, но по каким-то причинам агонистом ЭР в клетках эндометрия, а так же даже в клетках с врожденной резистетностью к тамоксифену. При изучении эстроген-подобных свойств 4-гидрокситамоксифена, выяснилось, что для модуляции агонистических свойств тамоксифена, последнему абсолютно критично образование водородной свзяи с 351 а.о. В последующих исследованиях было показано, что замена 351 аспартата на глицин в ЭР полностью подавляет какие либо эстрогено-подобные свойства 4-гидрокситамоксифена, а именно транскрипционную активность ЭР на промоторе эндогенного гена TGFa [188]. Именно эти данные позволили классифицировать все эстрогены; на два клсса, где непланарные эстрогены (класса II) нуждаются во взаимодействии с 351 аспартатом для активации ЭР. Результаты репортерных тестов на ЭР-отрицательных клетках T47D:C42 [192], транзиторно трансфицированных векторами для экспрессии ЭР дикого типа и ЭР с заменой Асп351 на глицин, показали, что все планарные эстрогены способны активировать обе формы ЭР, т.к. не нуждаются во взаимодействии с 351 а.о., в то время как трифенилэтилены неспособны активировать мутантную форму ЭР, что указывает на то, что для модуляции эстрогено-подобных свойств трифенилэтиленов через ЭР, необходимо взаимодействие с 351 а.о. По сравнению с тамоксифеном, у другого адъювантного препарата ралоксифена нет эстрогеноподобных свойств, немотря на схожесть структуры с тамоксифеном. Ралоксифен отличается более длинной бокой цепью, чем у тамоксифена и по результатам рентгеноструктурного анализа комплекса ЭР ".ралоксифен стало известно, что боковая цепь ралоксифена нейтрализует заряд на аспартате 351 и не позволяет последнему взаимодействовать с функциональным мотивом АР-1, в отличие от тамоксифена, цепь которого короче и позволяет взаимодейтсвовать 351 а.о. с АБ-1 мотивом и активировать рецептор. Соответственно, как стало ясно из молекулярного моделирования, синтезированные трифенилэтилены взаимодействуют с теми же а.о. в ЛСД ЭР, что и 4-гидрокситамоксифен, и они вероятнее всего вызывают изменение конформации подобное тамоксифену, но поскольку у них отстутствуют боковые цепи, то они вероятнее всего способны более эффективно обеспечивать взаимодейтвие 351 а.о. с АР-1 мотивом, чем 4-гидрокситамоксифен, а соответственно и активность ЭР, что репортерные тесты и показали. Таким образом, мы определили механизм активации ЭР непланарными эстрогенами трифенилэтиленами в клетках рака молочной железы.

Важно отметить, что все наши исследуемые трифенилэтилены были агонистами ЭР дикого типа во всех клеточных линиях (по результатам репортерных тестов), но тем не менее, результаты обширых исследований структурно-функциональных отношений трифенилэтиленов, проведенных группой Густа [193,194] показали, что некоторые из таких же трифенилэтиленов являются эффективными антагонистами в их клеточной линии МСР-7:2а, которые были стабильно трансфицированны векторами с репортерными генами. Авторы обнаружили, что трищцрокситрифенилэтилен и бисфенолтрифенилэтилен в та исследованиях почти полностью ингибировали эстрадиол-стимулированную транскрипцию репортерного гена при концентрации 100 нМ. Антагонистические свойства трифенилэтиленов, описываемые в их исследованиях, не коррелируют с их же результатми цитотоксических тестов на клетках дикого типа МСР-7 [193,194]. Оба рассматриваемых трифенилэтилена производили только слабый цитотоксический эффект, но при концентрациях выше 5 мкМ, что гораздо выше предела концентрационного диапазона, использованного в настоящем исследовании. Эту разницу в результатах полученных в настоящем исследовании и группой Густа можно объяснить разницой в наших клеточных линиях, а так же в схемах экспериментов.

5.4. Определение роли конформационного изменения ЭР непланарными эстроганами в транскрипционной активности ЭР и его протеосомальной деградации

Для определения роли конформационных изменений ЭР в регуляции транскрипционной активности ЭР мы опирались на известные факты, что транскрипционная активность ЭР поддерживается за счет постоянного время полужизниа белка ЭР. Время полужизни белка ЭР обеспечивается системой протеосомальной деградации белка. После активации ЭР лигандом и присоединения белков-коактиваторов, к этому комплексу присоединяются дополнительные коактиваторные молекулы, среди которых ДНК метилтрансфераза и ацетилтрансфераза, для изменения нуклеосомнальной структуры ДНК, что позволяет ЭР присоединиться к ДНК, а так же и убиквитин-лигазы иЬЬ и иЬС, которые осуществляют убиквитинилирование белка ЭР [48]. Убиквитинилирование белка ЭР «метит» последний для деградации 26Б протеосомой и это позволяет поддерживать постоянную ЭР-опосредованную транскрипцию эстроген-зависимых генов. Так было показано, что ингибирование деградации ЭР в клетках рака молочной железы существенно снижает транскрипционную активность на эстроген-респонсивных генах [48,195]. Эти факты заставили нас предположить, что транскрипционная активность ЭР с измененной конформацией белка и, соответственно, механизмом активации, может быть отличной от той, которая была описана при активации рецептора плпнарным эстрадиолом.

Для определения транскрипционной активности на эстроген-зависимом гене в клетках молочной железы мы провели количественную ПЦР в реальном времени на гене рБ2, который является классическим примером эстроген-зависимого гена. ПЦР проводились на основе кДНК полученных их обоих сублиний МСР-7^88 и МСР-7:5С, обработанных как эстрадиолом, так и исследуемыми трифенилэтиленами. Результаты данных опытов показали, что все эстрогены вне зависимости от структуры способны активировать ЭР в обоих линиях клеток. Это укзывает на то, что конформация ЭР не особо влияет на активацию транскрипционной активности эстроген-зависимых генов, таких как р82. Это так же подтверждается нашими репортерными тестами, проведенными на обеих линиях клеток. Но следует отметить, что транскрипционная активность генов в данных типах опытов у ЭР активированных трифенилэтиленами в среднем ниже, чем у инициированных планарным эстрадиолом. По этой причине мы решили проверить механизм регуляции этой транскрипционной активности через деградацию белка ЭР. Для этого мы провели Вестерн блоттинг лизатов клеток обеих линий клеток и обработали мембраны антителами против ЭРа и сравнили уровни белка ЭР в каждом образце. Результаты после 24 часов обработки клеток показали, что только эстрадиол в обеих линиях клеток способен деградировать белок ЭР стабильно, а трифенилэтилены никак не изменяли уровень белка. При проведении экспериментов с изучением динамики деградации ЭР мы обнаружили, что и трифенилэтилены способны стимулировать деградацию ЭР, но это происходит только между 2-8 часами обработки клеток, после чего уровень белка ЭР стабилизируется на контрольном уровне. Это может указывать на то, что механизм регуляции деградации белка ЭР активированного непланарными эстрогенами, отличный от механизма деградации ЭР, или может быть связанно с более низким сродством трифенилэтиленов с рецептором. Для проверки гипотезы о том, что низкий уровень деградации ЭР и его нестабильность связана с низким привлечением коактиваторных белков мы провели эксперименты с хроматиновой иммунопреципитацией промоторного участка гена pS2 и белков ЭР и коактиваторного белка SRC-3, после обрабоки клеток дикого типа MCF-7 некоторыми трифенилэтиленами и эстрадиолом в течении 45 минут. Нашей задачей являлось определить уровень привлечения белка SRC-3 на промотор гена pS2, так как именно привлечение коактиваторов обуславливает присоединение белков, необходимых для убиквитинирования ЭР [48]. Результаты данных экспериментов показали, что трифенилэтилены, которые обладают эстрогеноподобными свойствами, привлекают активированный ЭР на промотор так же эффективно, как и эстрадиол, но уровень белка SRC-3, ассоциированного с ЭР активированным трифенилэтиленами, занчительно меньше. Известно, что такие антиэстрогены как метаболиты тамоксифена 4-гидрокситамоксифен и эндоксифен так же способны привлекать ЭР на промоторы эстроген-зависимых генов, скорее всего из-за своих слабых эстрогеноподобных свойств, но с ними ассоциированны корепрессоры, поэтому они и не вызывают активацию транскрипции на промоторах [195]. В случае с трифенилэтиленами, ЭР, активированный такими непланарными эстрогенами, способен быть активным как транскрипционный фактор, но привлечение коактиваторов низкое, что может объяснить пониженную транскрипционную активность за счет сниженного уровня деградации белка ЭР протеосомальным комплексом. Подтвердением наших результатов, полученных при помощи иммунопреципитации хроматина могут служить результаты полученные, группой Леклерка из Бельгии [196]. Их группа обнаружила на другой in vitro модели, что ЭР ассоциированный с непланарными эстрогенами класса II не может образовывать комплекс с коактиватоными молекулами по причине конформационных изменений молекулы рецептора. В своих исследованиях они использовали вещество бисфенотрифенилэтилен и другие непланарные эстрогены, при связывании с которыми наблюдалось увеличение транскрипционной активности ЭР, а так же могли проявлять некоторые антагонистические свойства, подобные тем, которые обнаружили и мы. Бисфенолтрифенилэтилен в их исследованиях активирвал ЭР, но рецептор не способен в этом случае присоединать коактиваторы [196].

Для доказательства, того что снижение уровня белка ЭР, которое наблюдается в первые часы обработки клеток трифенилэтиленами, это именно протеосомальная деградация, мы провели опыты с ингибированием 26Б протеосомального комплекса. Результаты показали, что при ингибировании протеосомы специфическим ингибитором 1уЮ132, деградация ЭР, индуцируемая эстрадиолом, предотвращается, что подтверждает факт эстрадиол-индуцированной деградации ЭР [48]. Ингибирование протеосомы так же предотвращает деградацию ЭР; это доказывает, что снижение уровня белка ЭР в первые часы обрабоки клеток связано именно с протеосомальной деградацией белка ЭР. Для выявления возможных механизмов, регулирующих стабильность ЭР при активации трифенилэтиленами, мы провели обработку ЭР-отрицательных клеток рака молочной железы МБА-231, стабильно трансфицированных векторами для экспрессии белков ЭР дикого типа и с мутантной формы ЭР с заменой глицина 538 на аспартат. Было ранее замечено в рамках исследования по изучению эстрогеноподобных свойств тамоксифена, что при замене 538 а.о. на аспартат снижается стабильность ЭР, ассоциированного с 4-гидрокситамоксифеном и происходит эго деградация, чего не наболюдается с ЭР дикого типа. Результаты показали, что эстрадиол может стимулировать деградацию обеих форм ЭР, а тамоксифен только мутантную. Тригидрокситрифенилэтилен был неспособен стимулировать деградацию ЭР дикого типа в течении 24 часов, но способен стимулировать деградацию ЭР с заменой глицина в 538 позиции на аспартат, это указывает на схожесть механизмов регуляции стабильности ЭР ассоциированного с 4-гидрокситамоксифеном и на различия, в регуляции стабильности ЭР активированного эстрадиолом или трифенилэтиленами: Это подтверждает ранее предложенную группой

Джордана гипотезу о том, что непланарные эстрогены нуждаются в наличии 538 а.о. в поддержании стабильности ЭР, что и отличает этот механизм от механизма регуляции стабильности рецептора, активированного планарными эстрогенами [195].

Все эти данные указывают, что изменение конформации ЭР при связывании с трифенилэтиленами не только не только лишает его способности индуцировать эстроген-индуцированный апоптоз в эстроген-независимых клетках, но и играет роль в регуляции стабильности белка ЭР, что, в свою очередь, изменяет механизм регуляции транскрипционной активности опосредованной ЭР.

Таким образом в настоящей работе исследовалась роль конформационных изменений ЭР при связывании с непланарными эстрогенами. Непланарные эстрогены были представлены серией синтезированных нестероидных гидроксилированных производных трифенилэтилена. Биологические свойства данных непланарных эстрогенов класса II сравнивались с планарными эстрогенами класса I, такими как эстрадиол и DES. Для определения разницы в вероятных конформационных изменениях ЭР при связывании с эстрогенами различных классов мы применили метод виртуального докинга и показали, что конформационные изменения ЭР при связывании трифенилэтиленов вероятнее всего больше напоминают антагонистическую конформацию рецептора, придаваемую рецептору антиэстрогеном 4-гидрокситамоксифеном. Для определения биологической активности трифенилэтиленов по сравнению с эстрогенами класса I применялись пролиферативные тесты, с помошью которых мы показали, что все эстрогены, вне зависимости от класса, способны инициировать пролиферацию клеток рака молочной железы с диким фенотипом, но не все способны индуцировать эстроген-идуцированный апоптоз в эстроген-независимых клетках. При помощи Вестерн блоттингов мы показали, что из-за измененной конформации ЭР рифенилэтилена, невозможно существенное увеличение уровней проапоптотических факторов, что возможно и является причиной низкой степени клеточной гибели. При помощи репортерных тестов, проведенных на тех же линиях клеток, мы показали, что вне зависимости от класса эстрогенов, все вещества были способны активировать транскрипционную активность ЭР. Таким образом можно сделать вывод о том, что конформационное изменение ЭР не критично для активации рецептора и индукции клеточной пролиферации, но критично для индукции апоптоза в эстроген-независимых клетках. Так же при помощи репортерных тестов с мутантной формой ЭР мы показали разницу в механизме активации ЭР. Мы подтвердили гипотезу о том, что для активации ЭР трифенилэтиленами, последним необходимо взаимодействие с аспартатом в 351 позиции на рецепторе, что позволит этому а.о. взаимодейтсвовать с активным доменом рецептора АБ-1, что, по всей видимости и обеспечивает активность рецептора. Так же мы определили разницу в регуляции транскрипционной активности ЭР посредством изменения стабильности белка ЭР, связанного с непланарными эстрогенами, в сравнении с планарным эстрадиолом. При помощи Вестерн блотгингов мы показали, что ЭР активируемый трифенилэтиленами деградируется в меньшей степени, чем посредством планарного эстрадиола. Мы объяснили при помощи иммунопреципитации хроматина, что ЭР с измененной трифенилэтиленами конформацией не может эффективно связывать коактиваторы, что и обуславливает нарушение в протеосомальной деградации белка ЭР и объясняет пониженный уровень транскрипционной активности ЭР на промоторе эндогенных эстроген-респонсивных генов в клетках.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Максимов, Филипп Евгеньевич, Москва

1. Russo IH, Russo J: Role of hormones in mammary cancer initiation and progression. J

2. Mammary Gland Biol Neoplasia 1998, 3:49-61.

3. EBCTCG: Tamoxifen for early breast cancer: an overview of the randomised trials.

4. Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group. Lancet 1998, 351:1451-1467.

5. EBCTCG: Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer onrecurrence and 15-year survival: an overview of the randomised trials. Lancet 2005, 365:1687-1717.

6. Jordan VC: Tamoxifen: catalyst for the change to targeted therapy. Eur J Cancer 2008,44:30-38.

7. Fisher B, Costantino JP, Wickerham DL, Redmond CK, Kavanah M, Cronin WM, Yogel V,

8. Robidoux A, Dimitrov N, Atkins J, et al.: Tamoxifen for prevention of breast cancer: report of the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project P-l Study. J Natl Cancer Inst 1998, 90:1371-1388.

9. Robson JM, Schonberg, A.: Estrous reactions, including mating, produced by triphenylethylene. Nature 1937,140:196.

10. Harper MJ, Walpole AL: Contrasting endocrine activities of cis and trans isomers in aseries of substituted triphenylethylenes. Nature 1966,212:87.

11. Harper MJ, Walpole AL: A new derivative of triphenylethylene: effect on implantationand mode of action in rats. JReprod Fertil 1967,13:101-119.

12. Jordan YC, Collins MM, Rowsby L, Prestwich G: A monohydroxylated metabolite oftamoxifen with potent antioestrogenic activity. J Endocrinol 1977, 75:305-316.

13. Johnson MD, Zuo H, Lee KH, Trebley JP, Rae JM, Weatherman RV, Desta Z, Flockhart DA,

14. Skaar TC: Pharmacological characterization of 4-hydroxy-N-desmethyl tamoxifen, a novel active metabolite of tamoxifen. Breast Cancer Res Treat 2004, 85:151-159.

15. Brzozowski AM, Pike AC, Dauter Z, Hubbard RE, Bonn T, Engstrom O, Ohman L, Greene

16. GL, Gustafsson JA, Carlquist M: Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature 1997,389:753-758.

17. Shiau AK, Barstad D, Loria PM, Cheng L, Kushner PJ, Agard DA, Greene GL: Thestructural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell 1998,95:927-937.

18. Levenson AS, Jordan VC: The key to the antiestrogenic mechanism of raloxifene isamino acid 351 (aspartate) in the estrogen receptor. Cancer Res 1998, 58:1872-1875.

19. Levenson AS, Tonetti DA, Jordan VC: The oestrogen-like effect of 4-hydroxytamoxifenon induction of transforming growth factor alpha mRNA in MDA-MB-231 breast cancer cells stably expressing the oestrogen receptor. Br J Cancer 1998, 77:18121819.

20. Jordan VC, Schafer JM, Levenson AS, Liu H, Pease KM, Simons LA, Zapf JW: Molecularclassification of estrogens. Cancer Res 2001, 61:6619-6623.

21. Gust R, Keilitz R, Schmidt K: Investigations of new lead structures for the design ofselective estrogen receptor modulators. J Med Chem 2001, 44:1963-1970.

22. Beatson GT: On the treatment of inoperable cases of carcinoma of the mamma:suggestions for a new method of treatment, with illustrative cases. Lancet 1896, 2:101-107.

23. Allen E, Doisy, E.A.: An ovarian, hormone: Preliminary reports on its localizationextraction and partial purification and action in test animals. JAMA 1923, 81:810821.

24. Dodds EC, Goldberg, L., Lawson, W., Robinson, R.: Estrogenic activity of certainsynthetic compounds. Nature 1938,141:247-248.

25. Haddow A, Watkinson, J.M., Paterson, E.: Influence of synthetic oestrogens uponadvanced malignant disease. British Medical Journal 1944:393-398.

26. Boyd S: On Oophorectomy in cancer of the breast. British Medical Journal 1900, 2:134141.

27. Kennedy BJ: Systemic effects of androgenic and estrogenic hormones in advancedbreast cancer. J Am Geriatr Soc 1965,13:230-235.

28. Kennedy BJ: Hormone therapy for advanced breast cancer. Cancer 1965,18:1551-1557.

29. Haddovv A: David A. Karnofsky memorial lecture. Thoughts on chemical therapy.1. Cancer 1970,26:737-754.

30. Haddow A: The chemotherapy of cancer. Br Med J1950,2:1271-1272.

31. Cooper RG: Combination chemotherapy in hormone resistant breast cancer. Proc Am

32. Assoc Cancer Res 1969,10:15.

33. Jensen KA, Luu TC, Chan WK: A truncated Ah receptor blocks the hypoxia andestrogen receptor signaling pathways: a viable approach for breast cancer treatment. Mol Pharm 2006, 3:695-703.

34. Toft D, Gorski J: A receptor molecule for estrogens: isolation from the rat uterus andpreliminary characterization. Proc Natl Acad Sci U SA 1966, 55:1574-1581.

35. Greene GL, Gilna P, Waterfield M, Baker A, Hort Y, Shine J: Sequence and expression ofhuman estrogen receptor complementary DNA. Science 1986, 231:1150-1154.

36. Kuiper GG, Enmark E, Pelto-Huikko M, Nilsson S, Gustafsson JA: Cloning of a novelreceptor expressed in rat prostate and ovary. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93:5925-5930.

37. Evans MJ, Eckert A, Lai K, Adelman SJ, Harnish DC: Reciprocal antagonism betweenestrogen receptor and NF-kappaB activity in vivo. Circ Res 2001, 89:823-830.

38. Menasce LP, White GR, Harrison CJ, Boyle JM: Localization of the estrogen receptorlocus (ESR) to chromosome 6q25.1 by FISH and a simple post-FISH banding technique. Genomics 1993,17:263-265.

39. Kumar V, Green S, Stack G, Berry M, Jin JR, Chambón P: Functional domains of thehuman estrogen receptor. Cell 1987,51:941-951.

40. Lees JA, Fawell SE, Parker MG: Identification of two transactivation domains in themouse oestrogen receptor. Nucleic Acids Res 1989,17:5477-5488.

41. Sanchez R, Nguyen D, Rocha W, White JH, Mader S: Diversity in the mechanisms of generegulation by estrogen receptors. Bioessays 2002,24:244-254.

42. Klinge CM: Estrogen receptor interaction with co-activators and co-repressors. Steroids2000, 65:227-251.

43. Kushner PJ, Agard DA, Greene GL, Scanlan TS, Shiau AK, Uht RM, Webb P: Estrogenreceptor pathways to AP-1. J Steroid Biochem Mol Biol 2000, 74:311-317.

44. Saville B, Wormke M, Wang F, Nguyen T, Enmark E, Kuiper G, Gustafsson JA, Safe S:1.gand-, cell-, and estrogen receptor subtype (alpha/beta)-dependent activation at GC-rich (Spl) promoter elements. J Biol Chem 2000,275:5379-5387.

45. McKenna NJ, O'Malley BW: Minireview: nuclear receptor coactivators—an update.

46. Endocrinology 2002,143:2461-2465.

47. Lannigan DA: Estrogen receptor phosphorylation. Steroids 2003, 68:1-9.

48. Feng W, Webb P, Nguyen P, Liu X, Li J, Karin M, Kushner PJ: Potentiation of estrogenreceptor activation function 1 (AF-1) by Src/JNK through a serine 118-independent pathway. Mol Endocrinol 2001,15:32-45.

49. Denton RR, Koszewski NJ, Notides AC: Estrogen receptor phosphorylation. Hormonaldependence and consequence on specific DNA binding. J Biol Chem 1992, 267:72637268.

50. Tzeng DZ, Klinge CM: Phosphorylation of purified estradiol-liganded estrogen receptorby casein kinase U increases estrogen response element binding but does not alter ligand stability. Biochem Biophys Res Commun 1996, 223:554-560.

51. Picard N, Charbonneau C, Sanchez M, Licznar A, Busson M, Lazennec G, Tremblay A:

52. Phosphorylation of activation function-1 regulates proteasome-dependent nuclear mobility and E6-associated protein ubiquitin ligase recruitment to the estrogen receptor beta. Mol Endocrinol 2008, 22:317-330.

53. Saji S, Hirose M, Toi M: Clinical significance of estrogen receptor beta in breast cancer.

54. Cancer Chemother Pharmacol 2005, 56 SuppI 1:21-26.

55. Lonard DM, Nawaz Z, Smith CL, O'Malley BW: The 26S proteasome is required forestrogen receptor-alpha and coactivator turnover and for efficient estrogen receptor-alpha transactivation. Mol Cell 2000, 5:939-948.

56. Gee AC, Carlson KE, Martini PG, Katzenellenbogen BS, Katzenellenbogen JA: Coactivatorpeptides have a differential stabilizing effect on the binding of estrogens and antiestrogens with the estrogen receptor. Mol Endocrinol 1999,13:1912-1923.

57. Pedram A, Razandi M, Levin ER: Nature of functional estrogen receptors at the plasmamembrane. Mol Endocrinol 2006, 20:1996-2009.

58. Arpino G, Wiechmann L, Osborne CK, Schiff R: Crosstalk between the estrogen receptorand the HER tyrosine kinase receptor family: molecular mechanism and clinical implications for endocrine therapy resistance. Endocr Rev 2008, 29:217-233.

59. Migliaccio A, Di Domenico M, Castoria G, de Falco A, Bontempo P, Nola E, Auricchio F:

60. Tyrosine kinase/p21ras/MAP-kinase pathway activation by estradiol-receptor complex in MCF-7 cells. EMBO J1996,15:1292-1300.

61. Schiff R, Massarweh SA, Shou J, Bharwani L, Mohsin SK, Osborne CK: Cross-talkbetween estrogen receptor and growth factor pathways as a molecular target for overcoming endocrine resistance. Clin Cancer Res 2004,10:331 S-336S.

62. Shou J, Massarweh S, Osborne CK, Wakeling AE, Ali S, Weiss H, Schiff R: Mechanisms oftamoxifen resistance: increased estrogen receptor-HER2/neu cross-talk in ER/HER2-positive breast cancer. J Natl Cancer Inst 2004, 96:926-935.

63. Campbell RA, Bhat-Nakshatri P, Patel NM, Constantinidou D, Ali S, Nakshatri H:

64. Phosphatidylinositol 3-kinase/AKT-mediated activation of estrogen receptor alpha: a new model for anti-estrogen resistance. J Biol Chem 2001, 276:9817-9824.

65. Saeki T, Cristiano A, Lynch MJ, Brattain M, Kim N, Normanno N, Kenney N, Ciardiello F,

66. Salomon DS: Regulation by estrogen through the 5'-flanking region of the transforming growth factor alpha gene. Mol Endocrinol 1991, 5:1955-1963.

67. Kenney NJ, Saeki T, Gottardis M, Kim N, Garcia-Morales P, Martin MB, Normanno N,

68. Salomon DS, Brandt R, Ciardiello F, Normanno N: Epidermal growth factor-relatedpeptides and their receptors in human malignancies. Crit Rev Oncol Hematol 1995, 19:183-232.

69. Levin ER: Bidirectional signaling between the estrogen receptor and the epidermalgrowth factor receptor. Mol Endocrinol 2003,17:309-317.

70. Razandi M, Pedram A, Park ST, Levin ER: Proximal events in signaling by plasmamembrane estrogen receptors. J Biol Chem 2003,278:2701-2712.

71. Schiff R, Massarweh S, Shou J, Osborne CK: Breast cancer endocrinc resistance: howgrowth factor signaling and estrogen receptor coregulators modulate response. Clin Cancer Res 2003,9:447S-454S.

72. Lerner LJ, Holthaus FJ, Jr., Thompson CR: A non-steroidal estrogen antiagonist l-(p-2diethylaminoethoxyphenyl)-l-phenyl-2-p-methoxyphenylethanol. Endocrinology 1958,63:295-318.

73. Lerner LJ, Jordan VC: Development of antiestrogens and their use in breast cancer:eighth Cain memorial award lecture. Cancer Res 1990,50:4177-4189.

74. Jordan VC: Biochemical pharmacology of antiestrogen action. Pharmacol Rev 1984,36:245-276.

75. Jordan VC: Tamoxifen: a most unlikely pioneering medicine. Nat Rev Drug Discov 2003,2:205-213.

76. Jordan VC: The development of tamoxifen for breast cancer therapy: a tribute to thelate Arthur L. Walpole. Breast Cancer Res Treat 1988,11:197-209.

77. Walpole AL, Patterson, E.: Synthetic oestrogens in mammary cancer. Lancet 1948, 2:783786.

78. Jordan VC, Robinson SP: Species-specific pharmacology of antiestrogens: role ofmetabolism. Fed Proc 1987, 46:1870-1874.

79. Jordan VC, Phelps E, Lindgren JU: Effects of anti-estrogens on bone in castrated andintact female rats. Breast Cancer Res Treat 1987,10:31-35.

80. Gottardis MM, Jordan VC: Antitumor actions of keoxifene and tamoxifen in the Nnitrosomethylurea-induced rat mammary carcinoma model. Cancer Res 1987, 47:4020-4024.

81. Gottardis MM, Robinson SP, Satyaswaroop PG, Jordan VC: Contrasting actions oftamoxifen on endometrial and breast tumor growth in the athymic mouse. Cancer Res 1988, 48:812-815.

82. Gottardis MM, Ricchio ME, Satyaswaroop PG, Jordan VC: Effect of steroidal andnonsteroidal antiestrogens on the growth of a tamoxifen-stimulated human endometrial carcinoma (EnCalOl) in athymic mice. Cancer Res 1990, 50:3189-3192.

83. Ettinger B, Black DM, Mitlak BH, Knickerbocker RK, Nickelsen T, Genant HK,

84. Cummings SR, Eckert S, Krueger KA, Grady D, Powles TJ, Cauley JA, Norton L, Nickelsen

85. T, Bjarnason NH, Morrow M, et al.: The effect of raloxifene on risk of breast cancer in postmenopausal women: results from the MORE randomized trial. Multiple Outcomes of Raloxifene Evaluation. JAMA 1999, 281:2189-2197.

86. Vogel VG, Costantino JP, Wickerham DL, Cronin WM, Cecchini RS, Atkins JN, Bevers TB,

87. Fehrenbacher L, Pajon ER, Jr., Wade JL, 3rd, et al.: Effects of tamoxifen vs raloxifene on the risk of developing invasive breast cancer and other disease outcomes: the NSABP Study of Tamoxifen and Raloxifene (STAR) P-2 trial. JAMA 2006, 295:27272741.

88. Chisamore MJ, Ahmed Y, Bentrem DJ, Jordan VC, Tonetti DA: Novel antitumor effect ofestradiol in athymic mice injected with a T47D breast cancer cell line overexpressing protein kinase Calpha. Clin Cancer Res 2001, 7:3156-3165.

89. Jordan VC, O'Malley BW: Selective estrogen-receptor modulators and antihormonalresistance in breast cancer. J Clin Oncol 2007, 25:5815-5824.

90. Paruthiyil S, Parmar H, Kerekatte V, Cunha GR, Firestone GL, Leitman DC: Estrogenreceptor beta inhibits human breast cancer cell proliferation and tumor formation by causing a G2 cell cycle arrest: Cancer Res 2004, 64:423-428.

91. Lieberman ME, Gorski J, Jordan VC: An estrogen receptor model to describe theregulation of prolactin synthesis by antiestrogens in vitro. J Biol Chem 1983, 258:4741-4745.

92. Jordan VC, Lieberman ME, Cormier E, Koch R, Bagley JR, Ruenitz PC: Structuralrequirements for the pharmacological activity of nonsteroidal antiestrogens in vitro. Mol Pharmacol 1984,26:272-278.

93. Jordan VC, Koch R, Mittal S, Schneider MR: Oestrogenic and antioestrogenic actions in aseries of triphenylbut-l-enes: modulation of prolactin synthesis in vitro. Br J Pharmacol 1986,87:217-223.

94. Jensen EV, Jordan VC: The estrogen receptor: a model for molecular medicine. Clin

95. Cancer Res 2003,9:1980-1989.

96. Jordan VC, Brodie AM: Development and evolution of therapies targeted to the estrogenreceptor for the treatment and prevention of breast cancer. Steroids 2007, 72:7-25.

97. Howell A, Cuzick J, Baum M, Buzdar A, Dowsett M, Forbes JF, Hoctin-Boes G, Houghton

98. J, Locker GY, Tobias JS: Results of the AT AC (Arimidex, Tamoxifen, Alone or in Combination) trial after completion of 5 years' adjuvant treatment for breast cancer. Lancet 2005,365:60-62.

99. Fisher B, Dignam J, Wolmark N, Wickerham DL, Fisher ER, Mamounas E, Smith R,

100. Begovic M, DimitrovNV, Margolese RG, et al.: Tamoxifen in treatment of intraductal breast cancer: National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project B-24 randomised controlled trial. Lancet 1999,353:1993-2000.

101. Gail MH, Costantino JP, Bryant J, Croyle R, Freedman L, Helzlsouer K, Vogel V: Weighingthe risks and benefits of tamoxifen treatment for preventing breast cancer. J Natl Cancer Inst 1999, 91:1829-1846.

102. Jordan VC: SERMs: meeting the promise of multifunctional medicines. J Natl Cancer1.st 2007,99:350-356.

103. Martino S, Cauley JA, Barrett-Connor E, Powles TJ, Mershon J, Disch D, Secrest RJ,

104. Cummings SR: Continuing outcomes relevant to Evista: breast cancer incidence in postmenopausal osteoporotic women in a randomized trial of raloxifene. J Natl Cancer Inst 2004, 96:1751-1761.

105. Goss PE, Ingle JN, Martino S, Robert NJ, Muss HB, Piccart MJ, Castiglione M, Tu D,

106. Shepherd LE, Pritchard KI, et al.: Randomized trial of Ietrozole following tamoxifen as extended adjuvant therapy in receptor-positive breast cancer: updated findings from NCIC CTG MA.17. J Natl Cancer Inst 2005, 97:1262-1271.

107. Gottardis MM, Jordan VC: Development of tamoxifen-stimulated growth of MCF-7tumors in athymic mice after long-term antiestrogen administration. Cancer Res 1988, 48:5183-5187.

108. Jordan VC, Mittal S, Gosden B, Koch R, Lieberman ME: Structure-activity relationshipsof estrogens. Environ Health Perspect 1985, 61:97-110.

109. Stearns V, Johnson MD, Rae JM, Morocho A, Novielli A, Bhargava P, Hayes DF, Desta Z,

110. Flockhart DA: Active tamoxifen metabolite plasma concentrations after coadministration of tamoxifen and the selective serotonin reuptake inhibitor paroxetine. J Natl Cancer Inst 2003, 95:1758-1764.

111. Desta Z, WardBA, SoukhovaNV, Flockhart DA: Comprehensive evaluation of tamoxifensequential biotransformation' by the human cytochrome P450 system in vitro: prominent roles for CYP3A and CYP2D6. J Pharmacol Exp Ther 2004, 310:10621075.

112. Borges S, Desta Z, Li L, Skaar TC, Ward BA, Nguyen A, Jin Y, Storniolo AM, Nikoloff

113. DM, Wu L, et al.: Quantitative effect of CYP2D6 genotype and inhibitors on tamoxifen metabolism: implication for optimization of breast cancer treatment. Clin Pharmacol Ther 2006, 80:61-74.

114. Weigel RJ, deConinck EC: Transcriptional control of estrogen receptor in estrogenreceptor-negative breast carcinoma. Cancer Res 1993, 53:3472-3474.

115. Robertson KD, Ait-Si-Ali S, Yokochi T, Wade PA, Jones PL, Wolffe AP: DNMT1 forms acomplex with Rb, E2F1 and HDAC1 and represses transcription from E2F-responsive promoters. Nat Genet 2000,25:338-342.

116. Davis T, Kennedy C, Chiew YE, Clarke CL, deFazio A: Histone deacetylase inhibitorsdecrease proliferation and modulate cell cycle gene expression in normal mammary epithelial cells. Clin Cancer Res 2000, 6:4334-4342.

117. Normanno N, Ciardiello F, Brandt R, Salomon DS: Epidermal growth factor-relatedpeptides in the pathogenesis of human breast cancer. Breast Cancer Res Treat 1994, 29:11-27.

118. Stoica A, Saceda M, Doraiswamy YL, Coleman C, Martin MB: Regulation of estrogenreceptor-alpha gene expression by epidermal growth factor. J Endocrinol 2000, 165:371-378.

119. Tang CK, Perez C, Grunt T, Waibel C, Cho C, LupuR: Involvement of heregulin-beta2 inthe acquisition of the hormone-independent phenotype of breast cancer cells. Cancer Res 1996,56:3350-3358.

120. Oh AS, Lorant LA, Holloway JN, Miller DL, Kern FG, El-Ashry D: Hyperactivation of

121. MAPK induces loss of ERalpha expression in breast cancer cells. Mol Endocrinol 2001,15:1344-1359.

122. Osborne CK, Bardou V, Hopp TA, Chamness GC, Hilsenbeck SG, Fuqua SA, Wong J,

123. Allred DC, Clark GM, Schiff R: Role of the estrogen receptor coactivator AIB1 (SRC-3) and HER-2/neu in tamoxifen resistance in breast cancer. J Natl Cancer Inst 2003, 95:353-361.

124. Dowsett M, Harper-Wynne C, Boeddinghaus I, Salter J, Hills M, Dixon M, Ebbs S, Gui G,

125. JW, Weiss GR: NF-kappa B inhibition markedly enhances sensitivity of resistant breast cancer tumor cells to tamoxifen. Ann Oncol 2004,15:885-890.

126. Sovak MA, Bellas RE, Kim DW, Zanieski GJ, Rogers AE, Traish AM, Sonenshein GE:

127. Aberrant nuclear factor-kappaB/Rel expression and the pathogenesis of breast cancer. J Clin Invest 1997,100:2952-2960.

128. Cogswell PC, Guttridge DC, Funkhouser WK, Baldwin AS, Jr.: Selective activation of NFkappa B subunits in human breast cancer: potential roles for NF-kappa B2/p52 and for Bcl-3. Oncogene 2000,19:1123-1131.

129. Zhou Y, Eppenberger-Castori S, Marx C, Yau C, Scott GK, Eppenberger U, Benz CC:

130. Activation of nuclear factor-kappaB (NFkappaB) identifies a high-risk subset of hormone-dependent breast cancers. Int JBiochem Cell Biol 2005,37:1130-1144.

131. Biswas DK, Shi Q, Baily S, Strickland I, Ghosh S, Pardee AB, Iglehart JD: NF-kappa Bactivation in human breast cancer, specimens and its role in cell proliferation and apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA 2004,101:10137-10142.

132. Sliva D, English D, Lyons D, Lloyd FP, Jr.: Protein kinase C induces motility of breastcancers by uprcgulating secretion of urokinase-type plasminogen activator through activation of AP-1 and NF-kappaB. Biochem Biophys Res Comman 2002,290:552-557.

133. Bloom ND, Tobin EH, Schreibman B, Degenshein GA: The role of progesteronereceptors in the management ofadvanced breast cancer. Cancer 1980, 45:2992-2997.

134. Dowsett M, Cuzick J, Wale C, Howell T, Houghton J, Baum M: Retrospective analysis oftime to recurrence in the ATAC trial according to hormone receptor status: an hypothesis-generating study. J Clin Oncol 2005, 23:7512-7517.

135. Jordan VC, Gelber RD: Problems with the progesterone receptor in practice? J Clin1. Oncol 2007,25:1957-1959.

136. Osborne CK, Shou J, Massarweh S, Schiff R: Crosstalk between estrogen receptor andgrowth factor receptor pathways as a cause for endocrine therapy resistance in breast cancer. Clin Cancer Res 2005, ll:865s-870s.

137. Howell A, Dodwell DJ, Anderson H, Redford J: Response after withdrawal of tamoxifenand progestogens in advanced breast cancer. Ann Oncol 1992,3:611-617.

138. O'Regan RM, Gajdos C, Dardes RC, De Los Reyes A, Park W, Rademaker AW, Jordan

139. VC: Effects of raloxifene after tamoxifen on breast and endometrial tumor growth in athymic mice. J Natl Cancer Inst 2002,94:274-283.

140. Nicholson RI, Staka C, Boyns F, Hutcheson IR, Gee JM: Growth factor-drivenmechanisms associated with resistance to estrogen deprivation in breast cancer: new opportunities for therapy. Endocr Relat Cancer 2004,11:623-641.

141. Jordan NJ, Gee JM, Barrow D, Wakeling AE, Nicholson RI: Increased constitutiveactivity of PKB/Akt in tamoxifen resistant breast cancer MCF-7 cells. Breast Cancer Res Treat 2004, 87:167-180.

142. Gee JM, Harper ME, Hutcheson IR, Madden TA, Barrow D, Knowlden JM, McClelland

143. RA, Jordan N, Wakeling AE, Nicholson RI: The antiepidermal growth factor receptor agent gefltinib (ZD1839/Iressa) improves antihormone response and prevents development of resistance in breast cancer in vitro. Endocrinology 2003, 144:51055117.

144. Hutcheson IR, Knowlden JM, Madden TA, Barrow D, Gee JM, Wakeling AE, Nicholson

145. RI: Oestrogen receptor-mediated modulation of the EGFR/MAPK pathway in tamoxifen-resistant MCF-7 cells. Breast Cancer Res Treat 2003, 81:81-93.

146. Knowlden JM, Hutcheson IR, Barrow D, Gee JM, Nicholson RI: Insulin-like growthfactor-I receptor signaling in tamoxifen-resistant breast cancer: a supporting role to the epidermal growth factor receptor. Endocrinology 2005,146:4609-4618.

147. Normanno N, De Luca A, Bianco C, Maiello MR, Carriero MV, Rehman A, Wechselberger

148. C, Arra C, Strizzi L, Sanicola M, et al.: Cripto-1 overexpression leads to enhanced invasiveness and resistance to anoikis in human MCF-7 breast cancer cells. J Cell Physiol 2004,198:31-39.

149. Atlas E, Cardillo M, Mehmi I, Zahedkargaran H, Tang C, Lupu R: Heregulin is sufficientfor the promotion of tumorigenicity and metastasis of breast cancer cells in vivo. Mol Cancer Res 2003,1:165-175.

150. Brodie AH, Jelovac D, Long B: The intratumoral aromatase model: studies witharomatase inhibitors and antiestrogens. J Steroid Biochem Mol Biol 2003,86:283-288.

151. Wolf DM, Jordan VC: A laboratory model to explain the survival advantage observedin patients taking adjuvant tamoxifen therapy. Recent Results Cancer Res 1993, 127:23-33.

152. Lee ES, Schafer JM, Yao K, England G, O'Regan RM, De Los Reyes A, Jordan VC: Crossresistance of triphenylethylene-type antiestrogens but not ICI 182,780 in tamoxifen-stimulated breast tumors grown in athymic mice. Clin Cancer Res 2000, 6:4893-4899.

153. Herman ME, Katzenellenbogen BS: Response-specific antiestrogen resistance in a newlycharacterized MCF-7 human breast cancer cell line resulting from long-term exposure to trans-hydroxytamoxifen. J Steroid Biochem Mol Biol 1996, 59:121-134.

154. Liu H, Lee ES, Gajdos C, Pearce ST, Chen B, Osipo C, Loweth J, McKian K, De Los

155. Reyes A, Wing L, et al.: Apoptotic action of 17beta-estradiol in raloxifene-resistant MCF-7 cells in vitro and in vivo. J Natl Cancer Inst 2003, 95:1586-1597.

156. Park WC, Liu H, Macgregor Schafer J, Jordan VC: Deregulation of estrogen inducedtelomerase activity in tamoxifen-resistant breast cancer cells. Int J Oncol 2005, 27:1459-1466.

157. Song RX, Mor G, Naftolin F, McPherson RA, Song J, Zhang Z, Yue W, Wang J, Santen

158. RJ: Effect of long-term estrogen deprivation on apoptotic responses of breast cancer cells to 17beta-estradioI. J Natl Cancer Inst 2001, 93:1714-1723.

159. Lewis JS, Osipo C, Meeke K, Jordan VC: Estrogen-induced apoptosis in a breast cancermodel resistant to long-term estrogen withdrawal. J Steroid Biochem Mol Biol 2005, 94:131-141.

160. Robinson SP, Jordan VC: Antiestrogenic action of toremifene on hormone-dependent,independent, and heterogeneous breast tumor growth in the athymic mouse. Cancer Res 1989, 49:1758-1762.

161. Osborne CK, Coronado E, Allred DC, Wiebe V, DeGregorio M: Acquired tamoxifenresistance: correlation with reduced breast tumor levels of tamoxifen and isomerization of trans-4-hydroxytamoxifen. J Natl Cancer Inst 1991, 83:1477-1482.

162. Yao K, Lee ES, Bentrem DJ, England G, Schafer JI, O'Regan RM, Jordan VC: Antitumoraction of physiological estradiol on tamoxifen-stimulated breast tumors grown in athymic mice. Clin Cancer Res 2000, 6:2028-2036.

163. Osipo C, Gajdos C, Liu H, Chen B, Jordan VC: Paradoxical action of fulvestrant inestradiol-induced regression of tamoxifen-stimulated breast cancer. J Natl Cancer Inst 2003, 95:1597-1608.

164. Jordan VC: Selective estrogen receptor modulation: concept and consequences incancer. Cancer Cell 2004,5:207-213.

165. Scherbakov AM, Lobanova YS, Shatskaya VA, Onopchenko OV, Gershtein ES,

166. Krasil'mkov MA: Activation of mitogenic pathways and sensitization to estrogen-induced apoptosis: two independent characteristics of tamoxifen-resistant breast cancer cells? Breast Cancer Res Treat 2006,100:1-11.

167. Ingle JN, Ahmann DL, Green SJ, Edmonson JH, Bisel HF, Kvols LK, Nichols WC,

168. Creagan ET, Hahn RG, Rubin J, et al.: Randomized clinical trial of dietliylstilbestrol versus tamoxifen in postmenopausal women with advanced breast cancer. N Engl J Med 1981, 304:16-21.

169. Lonning PE, Taylor PD, Anker G, Iddon J, Wie L, Jorgensen LM, Mella O, Howell A:

170. High-dose estrogen treatment in postmenopausal breast cancer patients heavily exposed to endocrine therapy. Breast Cancer Res Treat 2001, 67:111-116.

171. Peter ME, Krammer PH: The CD95(APO-l/Fas) DISC and beyond. Cell Death Differ2003,10:26-35.

172. Tsujimoto Y: Bcl-2 family of proteins: life-or-death switch in mitochondria. Biosci Rep2002,22:47-58.

173. Lewis JS, Meeke K, Osipo C, Ross EA, Kidawi N, Li T, Bell E, Chandel NS, Jordan VC:1.trinsic mechanism of estradiol-induced apoptosis in breast cancer cells resistant to estrogen deprivation. J Natl Cancer Inst 2005, 97:1746-1759.

174. Lobanova YS, Scherbakov AM, Shatskaya VA, Krasil'nikov MA: Mechanism of estrogeninduced apoptosis in breast cancer cells: role of the NF-kappaB signaling pathway. Biochemistry (Mosc) 2007,72:320-327.

175. Song RX, Zhang Z, Mor G, Santen RJ: Down-regulation of Bcl-2 enhances estrogenapoptotic action in long-term, estradiol-depleted ER(+) breast cancer cells. Apoptosis 2005,10:667-678.

176. Zeitlin BD, Zeitlin IJ, Nor JE: Expanding circle of inhibition: small-molecule inhibitorsof Bcl-2 as anticancer cell and antiangiogenic agents. J Clin Oncol 2008, 26:41804188.

177. Voehringer DW: BCL-2 and glutathione: alterations in cellular redox state thatregulate apoptosis sensitivity. Free Radic Biol Med 1999,27:945-950.

178. Schroder CP, Godwin AK, O'Dwyer PJ, Tew KD, Hamilton TC, Ozols RF: Glutathioneand drug resistance. Cancer Invest 1996, 14:158-168.

179. Anderson ME: Glutathione: an overview of biosynthesis and modulation. Chem Biol1.teract 1998,111-112:1-14.

180. Townsend DM, Tew KID, Tapiero H: The importance of glutathione in human disease.

181. BiomedPharmacother 2003, 57:145-155.

182. Anderson CP, Tsai JM, Meek WE, Liu RM, Tang Y, Forman HJ, Reynolds CP: Depletionof glutathione by buthionine sulfoxine is cytotoxic for human neuroblastoma cell lines via apoptosis. Exp Cell Res 1999,246:183-192.

183. Lewis-Wambi JS, Kim, H., Wambi, C., Patel, R., Pyle, J.R., Klein-Szanto, A.J., Jordan,

184. V.C.: Buthionine Sulfoximide Sensitizes Antihormone-Resistant Human Breast Cancer Cells to Estrogen-Induced Apoptosis. Breast Cancer Research 2008, (In Press).

185. Bailey HH, Ripple G, Tutsch KD, Arzoomanian RZ, Alberti D, Feierabend C, Mahvi D,

186. Schink J, Pomplun M, Mulcahy RT, et al.: Phase I study of continuous-infusion L-S,R-buthionine sulfoximine with intravenous melphalan. J Natl Cancer Inst 1997, 89:1789-1796.

187. Bailey HH, Mulcahy RT, Tutsch KD, Arzoomanian RZ, Alberti D, Tombes MB, Wilding

188. G, Pomplun M, Spriggs DR: Phase I clinical trial of intravenous L-buthionine sulfoximine and melphalan: an attempt at modulation of glutathione. J Clin Oncol 1994,12:194-205.

189. Ellis MJ, Dehdahti, F., Kommareddy, A., Jamalabadi-Majidi, S., Crowder, R., Jeffe, D.B.,

190. Lewis-Wambi JS, Kim HR, Wambi C, Patel R, Pyle JR, Klein-Szanto AJ, Jordan VC:

191. Buthionine sulfoximine sensitizes antihormone-resistant human breast cancer cells to estrogen-induced apoptosis. Breast Cancer Res 2008,10:R104.

192. O'Dwyer PJ, Hamilton TC, LaCreta FP, Gallo JM, Kilpatrick D, Halbherr T, Brennan J,

193. Bookman MA, Hoffman J, Young RC, et al.: Phase I trial of buthionine sulfoximine in combination with melphalan in patients with cancer. J Clin Oncol 1996,14:249-256.

194. Khor LY, Moughan J, Al-Saleem T, Hammond EH, Venkatesan V, Rosenthal SA, Ritter

195. MA, Sandler HM, Hanks GE, Shipley WU, et al.: Bcl-2 and Bax expression predict prostate cancer outcome in men treated with androgen deprivation and radiotherapy on radiation therapy oncology group protocol 92-02. Clin Cancer Res 2007,13:3585-3590.

196. Stein CA, Benimetskaya L, Mani S: Antisense strategies for oncogene inactivation.

197. Semin Oncol 2005,32:563-572.

198. Walensky LD, Kung AL, Escher I, Malia TJ, Barbuto S, Wright RD, Wagner G, Verdine

199. GL, Korsmeyer SJ: Activation of apoptosis in vivo by a hydrocarbon-stapled BH3 helix. Science 2004,305:1466-1470.

200. Oh KJ, Barbuto S, Pitter K, Morash J, Walensky LD, Korsmeyer SJ: A membranetargeted BID BCL-2 homology 3 peptide is sufficient for high potency activation of BAX in vitro. J Biol Chem 2006,281:36999-37008.

201. Leone M, Zhai D, Sareth S, Kitada S, Reed JC, Pellecchia M: Cancer prevention by teapolyphenols is linked to their direct inhibition of antiapoptotic Bcl-2-family proteins. Cancer Res 2003, 63:8118-8121.

202. Zhai D, Jin C, Satterthwait AC, Reed JC: Comparison of chemical inhibitors ofantiapoptotic Bcl-2-family proteins. Cell Death Differ 2006,13:1419-1421.

203. Mohammad RM, Wang S, Aboukameel A, Chen B, Wu X, Chen J, Al-Katib A: Preclinicalstudies of a nonpeptidic small-molecule inhibitor of Bcl-2 and Bcl-X(L) (-)-gossypol. against diffuse large cell lymphoma. Mol Cancer Ther 2005, 4:13-21.

204. Wang JL, Liu D, Zhang ZJ, Shan S, Han X, Srinivasula SM, Croce CM, Alnemri ES,

205. Huang Z: Structure-based discovery of an organic compound that binds Bcl-2 protein and induces apoptosis of tumor cells. Proc Natl Acad Sci U SA 2000, 97:71247129.

206. Zeitlin BD, Joo E, Dong Z, Warner K, Wang G, Nikolovska-Coleska Z, Wang S, Nor JE:

207. Antiangiogenic effect of TW37, a small-molecule inhibitor of Bcl-2. Cancer Res 2006, 66:8698-8706.

208. Oltersdorf T, Elmore SW, Shoemaker AR, Armstrong RC, Augeri DJ, Belli BA, Bruncko

209. M, Deckwerth TL, Dinges J, Hajduk PJ, et al.: An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression of solid tumours. Nature 2005,435:677-681.

210. Mohammad RM, Goustin AS, Aboukameel A, Chen B, Baneijee S, Wang G, Nikolovska

211. Coleska Z, Wang S, Al-Katib A: Preclinical studies of TW-37, a new nonpeptidic small-molecule inhibitor of Bcl-2, in diffuse large cell lymphoma xenograft model reveal drug action on both Bcl-2 and Mcl-1. Clin Cancer Res 2007,13:2226-2235.

212. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, Fuchs H, Paton V, Bajamonde A, Fleming T,

213. Eiermann W, Wolter J, Pegram M, et al.: Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 2001,344:783-792.

214. Marty M, Cognetti F, Maraninchi D, Snyder R, Mauriac L, Tubiana-Hulin M, Chan S,

215. Gasparini G, Gion M, Mariani L, Papaldo P, Crivellari D, Filippelli G, Morabito A,

216. Burstein HJ, Keshaviah A, Baron A, al. E: Trastuzumab and vinorelbine or taxanechemotherapy for HER2+ metastatic breast cancer: the TRAVIOTA study. Journal of Clinical Oncology 2006 ASCO Ann Meet Proc Part I, 24:abstract 650.

217. Robert N, Leyland-Jones B, Asmar L, Belt R, Ilegbodu D, Loesch D, Raju R, Valentine E,

218. Sayre R, Cobleigh M, et al.: Randomized phase III study of trastuzumab, paclitaxel, and carboplatin compared with trastuzumab and paclitaxel in women with HER-2-overexpressing metastatic breast cancer. J Clin Oncol 2006,24:2786-2792.

219. Bernard-Marty C, Lebrun F, Awada A, Piccart MJ: Monoclonal antibody-based targetedtherapy in breast cancer: current status and future directions. Drugs 2006, 66:15771591.

220. Johnston JB, Navaratnam S, Pitz MW, Maniate JM, Wiechec E, Baust H, Gingerich J,

221. Skliris GP, Murphy LC, Los M: Targeting the EGFR pathway for cancer therapy.

222. CurrMed Chem 2006,13:3483-3492.

223. Agus DB, Gordon MS, Taylor C, Natale RB, Karlan B, Mendelson DS, Press MF, Allison

224. DE, Sliwkowski MX, Lieberman G, et al.: Phase I clinical study of pertuzumab, a novel HER dimerization inhibitor, in patients with advanced cancer. J Clin Oncol 2005,23:2534-2543.

225. Jager M, Ruf P, Schoberth A, Hess J, Lindhofer H: Effect of low HER2(+1) expressingtumor cells of the trifunctional antibody ertumaxomab. Journal of Clinical Oncology 2008, 26:abstract 3071.

226. Konecny GE, Pegram MD, Venkatesan N, Finn R, Yang G, Rahmeh M, Untch M, Rusnak

227. DW, Spehar G, Mullin RJ, et al.: Activity of the dual kinase inhibitor lapatinib (GW572016) against HER-2-overexpressing and trastuzumab-treated breast cancer cells. Cancer Res 2006, 66:1630-1639.

228. Nelson MH, Dolder CR: Lapatinib: a novel dual tyrosine kinase inhibitor with activityin solid tumors. Ann Pharmacother 2006, 40:261-269.

229. Cameron D, Casey M, Press M, Lindquist D, Pienkowski T, Romieu CG, Chan S, Jagiello

230. Chu QS, Cianfrocca ME, Goldstein LJ, Gale M, Murray N, Loftiss J, Arya N, Koch KM,

231. Pandite L, Fleming RA, et al.: A phase I and pharmacokinetic study of lapatinib in combination with letrozole in patients with advanced cancer. Clin Cancer Res 2008, 14:4484-4490.

232. Konecny G, Pauletti G, Pegram M, Untch M, Dandekar S, Aguilar Z, Wilson C, Rong HM,

233. Bauerfeind I, Felber M, et al.: Quantitative association between HER-2/neu and steroid hormone receptors in hormone receptor-positive primary breast cancer. J Natl Cancer Inst 2003,95:142-153.

234. Ariazi EA, Kraus RJ, Farrell ML, Jordan VC, Mertz JE: Estrogen-related receptor alphaltranscriptional activities are regulated in part via the ErbB2/HER2 signaling pathway. Mol Cancer Res 2007, 5:71-85.

235. Levenson AS, MacGregor Schafer JI, Bentrem DJ, Pease KM, Jordan YC: Control of theestrogen-like actions of the tamoxifen-estrogen receptor complex by the surface amino acid at position 351. J Steroid Biochem MolBiol 2001, 76:61-70.

236. McCague R, Leclercq G, Jordan VC: Nonisomerizable analogues of (Z)- and (E)-4hydroxytamoxifen. Synthesis and endocrinological properties of substituted diphenylbenzocycloheptenes. J Med Chem 1988,31:1285-1290.

237. Bentrem D, Fox JE, Pearce ST, Liu H, Pappas S, Kupfer D, Zapf JW, Jordan VC: Distinctmolecular conformations of the estrogen receptor alpha complex exploited by environmental estrogens. Cancer Res 2003, 63:7490-7496.

238. Pink JJ, Bilimoria MM, Assikis J, Jordan VC: Irreversible loss of the oestrogen receptorin T47D breast cancer cells following prolonged oestrogen deprivation. Br J Cancer 1996,74:1227-1236.

239. Lubczyk V, Bachmann H, Gust R: Investigations on estrogen receptor binding. Theestrogenic, antiestrogenic, and cytotoxic properties of C2-alkyl-substituted l,l-bis(4-hydroxyphenyl)-2-phenylethenes. J Med Chem 2002, 45:5358-5364.

240. Lubczyk V, Bachmann H, Gust R: Antiestrogenically active l,l,2-tris(4-hydroxyphenyI)alkenes without basic side chain: synthesis and biological activity. J Med Chem 2003,46:1484-1491.

241. Pearce ST, Liu H, Jordan VC: Modulation of estrogen receptor alpha function andstability by tamoxifen and a critical amino acid (Asp-538) in helix 12. J Biol Chem 2003,278:7630-7638.

Информация о работе

Максимов, Филипп Евгеньевич
кандидата медицинских наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Структурно-функциональные отношения трифенилэтиленов и эстрогенового рецептора в клетках рака молочной железы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы