Структурно-функциональные особенности белков в комплексах с полиэлектролитами и полиэлектролитными микрокапсулами

Дурденко, Екатерина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональные особенности белков в комплексах с полиэлектролитами и полиэлектролитными микрокапсулами
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные особенности белков в комплексах с полиэлектролитами и полиэлектролитными микрокапсулами"

На правах рукописи

Дурденко Екатерина Владимировна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ БЕЛКОВ В КОМПЛЕКСАХ С ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ И ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫМИ МИКРОКАПСУЛАМИ

03.01.02 - биофизика

2 О СЮН 2012

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2012

005046115

Работа выполнена в секторе физической химии биополимеров Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Сабурова Екатерина Андреевна

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Мошков Дмитрий Алексеевич (зав. лаб. ультраструктуры нейрона ИТЭБ РАН, Пущино)

доктор биологических наук Постникова Галина Борисовна

(зав. лаб. структуры и функции редокс-белков, ИБК РАН, Пущино)

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, Пущино

Защита диссертации состоится 2012 г. в на заседании совета

Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан «ЗС»аШ2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук .//ЛССс^' Ланина Н. Ф.

Актуальность проблемы

Белки в природе, как правило, функционируют в составе тех или иных надмолекулярных ансамблей, которые являются основой молекулярной организации биологических систем. Надмолекулярные структуры играют важную роль во многих биохимических процессах (фолдинг белков, транспорт, биосинтез). Регуляция каталитической активности и стабильности ферментов in vivo часто осуществляется именно посредством образования надмолекулярных ансамблей, включающих вещества различной природы, в частности, полиэлектролиты.

Изучение свойств полиэлектролит-белковых комплексов (ПБК) служит для понимания функциональной роли эндогенных полиэлектролитов (ПЭ) в разных метаболических процессах. ПБК, содержащие синтетические ПЭ, исследуются в качестве модельных систем для изучения взаимодействия белков с клеточными стенками, мембранами, с внутриклеточными ДНК и РНК, а также в системе антиген-антитело. В ряде случаев, исследование ПБК помогает понять механизм катализа, особенно сложный для отдельных ферментов. Преимущества такого моделирования заключаются в том, что оно позволяет исследовать физико-химические свойства комплекса в зависимости от длины цепи ПЭ, знака и плотности зарядов на ПЭ и состава среды. Кроме того, такие системы удобны для исследования, поскольку в определенных условиях допускают применение оптических методов.

Сродство ферментов к полизаряженным компонентам клетки независимо от их агрегатного состояния зависит от присутствия дву- и одновалентных ионов, находящихся в составе любого компартмента живой клетки. И хотя ионы дву- и одновалентных солей могут влиять как на сродство ферментов к полиэлектролитам и величину энергии активации катализа, так и на собственную конформацию ПЭ и соответственно на его персистентную длину, однако такие исследования практически отсутствуют (особенно это касается влияния двувалентных анионов). Это связано с тем, что в настоящее время разработана теория только для полимерных цепей в растворе, в то время как для ПБК описание их поведения находится только на уровне полуэмпирических закономерностей. Настоящая работа посвящена изучению влияния солевого состава среды на динамику образования и функциональные особенности ферментов в комплексе с ПЭ. Изучение динамики образования таких комплексов может позволить решать задачи, направленные на управление биологическими процессами в живых организмах.

При изучении взаимодействия белков как с синтетическими, так и с эндогенными

ПЭ обнаружены значительные изменения ферментативной активности, а в ряде случаев

наблюдали изменения и структурных характеристик белков после связывания их с ПЭ.

Разрушающее действие отдельных ПЭ на белки особенно важно учитывать при

использовании коллоидных частиц в биологических жидкостях при разработке

микроконтейнеров для адресной доставки различных лекарственных препаратов к клеткам-мишеням. Для этой цели разработаны технологии получения полиэлектролитных микрокапсул с последовательным наслоением ПЭ на твердое ядро с включенным в него биологически активным веществом. Применение таких микрокапсул с заряженной полиэлектролитной оболочкой, а также коллоидных частиц различных видов, в частности фосфолипидных везикул, в качестве средства транспортировки лекарств требует тщательной проверки их влияния на функциональные свойства белков, содержащихся в биологических жидкостях. И если изучение ферментов, инкапсулированных в такие микроконтейнеры широко ведется, то исследование состояния белков в суспензии с заряженными коллоидными частицами практически отсутствуют. В настоящей работе было исследовано влияние разных типов заряженных коллоидных частиц на функциональные и структурные характеристики белков в суспензии этих частиц.

Цель исследования

Изучить структурно-функциональные особенности белков в комплексе с полиэлектролитами и полиэлектролитными микрокапсулами и влияние биологически значимых ионов на состояние комплекса.

Задачи работы

1. Исследовать влияние полиэлектролитов на флуоресцентные свойства производных индола.

2. Определить кинетические характеристики изменения флуоресценции белков -лактатдегидрогеназы, уреазы и гемоглобина, при образовании комплекса с полиэлектролитом и сопоставить их с параметрами доступности остатков триптофана полиэлектролиту.

3. Исследовать влияние различных ионных форм фосфата на устойчивость лактатдегидрогеназы к тепловой денатурации и к разрушающему действию полиэлектролита.

4. Изучить влияние ионов сульфата на динамику разрушения лактатдегидрогеназы полиэлектролитом, измеренное различными методами, дающими представление о разрушении разных элементов структуры белка.

5. Исследовать влияние двух типов заряженных коллоидных частиц - полиэлектролитных микрокапсул и липосом на функциональные и структурные характеристики белков в суспензии этих частиц.

Научная новизна работы

Показано, что скорость тушения флуоресценции белка при взаимодействии с ПЭ зависит не только от доступности его индольных аминокислотных остатков растворителю, но и от размеров каналов, в которые они погружены. Впервые показано, что из двух форм фосфата в нейтральной области рН только двувалентная форма стабилизирует лактатдегидрогеназу при разрушении полиэлектролитом и при тепловой денатурации. Это достигается взаимодействием фосфата с «кислой» конформацией белка в межсубъединичном анион-связывающем центре. Были определены временные характеристики процесса разрушения лактатдегидрогеназы полиэлектролитом, измеренные разными методами, которые дают представление о скоростях разрушения разных элементов структуры белка. Впервые показано, что полиэлектролитные микрокапсулы с заряженной оболочкой, суспендированные в растворы белков, сорбируют их на своей поверхности, но не изменяют ни структуру, ни функцию белков. Это дает возможность использовать их в перспективе в качестве средства адресной доставки биологически активных веществ.

Практическая значимость

Результаты теоретического и экспериментального анализа сруктурно-

функциональных особенностей белков в комплексе с полиэлектролитами могут быть использованы не только для выяснения функциональной роли эндогенных полиэлектролитов, но и определить механизм катализа, который в ряде случаев оказывается достаточно сложным для отдельных ферментов.

Результаты исследования сродства белков к полиэлектролитным микрокапсулам (ПМК) показали, что микрокапсулы, формируемые с заданной конфигурацией оболочки, могут быть эффективно использованы в процедуре выделения и очистки белков в качестве сорбента, иммобилизирующего белки, не нарушая их структуру и функции. Показанная в работе «нейтральность» полиэлектролитных микрокапсул по отношению к белку, находящемуся в растворе, позволяет избежать нежелательных побочных эффектов при использовании ПМК в качестве средства адресной доставки биологически активных веществ к клеткам-мишеням.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на отечественных и международных

конференциях: «Ломоносов 2009» (Москва, 2009), «Экспериментальная и теоретическая

биофизика 2009» (Пущино, 2009), «XII Молодежная конференция по органической химии»

(Суздаль, 2009), «Биология - наука 21 века (Пущино, 2010), «Ломоносов 2010» (Москва,

2010), «XV Симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул»

(Петрозаводск, 2010), «Математика. Компьютер. Образование» (Пущино, 2010), «Биология

- наука 21 века (Пущино, 2011), V Российский симпозиум «Белки и пептиды»

(Петрозаводск, 2011), «Математика. Компьютер. Образование» (Дубна, 2011; Пущино, 2011).

По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 4

статьи.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на_страницах, содержит_таблиц и_рисунков.

Результаты и обсуждение

Глава 1. Взаимодействие белков с полиэлектролитами. Флуоресцентные свойства комплекса

1.1. Влияние полиэлектролитов на флуоресценцию производных индола - аналогов триптофа новых остатков в белке

Чтобы оценить влияние полиэлектролитов на флуоресцентные свойства белков, мы исследовали влияние полианиона полистиролсульфоната (ПСС) и поликатиона полиаллиламина (ПАА) на производные индола. Среди производных индола исследованы Ь-Тгр и 1Ч-ацетил-Ь-Тгр-амид (АС-Тгр-МН2). Последний наилучшим образом моделирует конфигурацию триптофановых остатков в полипептидной цепи белка.

Показано, что отрицательно заряженный ПСС вызывает тушение флуоресценции АС-Тгр-МН2 и частично Ь-Тгр по механизму статического тушения флуоресценции с равновесными константами Штерна-Фольмера (Ксв) 104 М"1 и 3-103 М"1 мономеров ПСС, соответственно. Положительно заряженный ПАА не вызывает изменений в интенсивности флуоресценции ни АС-Тгр-ЫН2 ни Ь-Тгр (спектры не приведены).

(а)

/, отн.ед. 120

ПСС, мкг/мл

/.отн.ед. 120

(б) /о//

1,4

мкг/мл

2 1,3

10 1,2

15 1,1

1,0

(в) 2Л

330 360 390 420 450 Я., нм

380 X, нм

400 420

0 2 4 6 8 10 12 14 16 ПСС, мкг/мл

Рис. 1. Спектры флуоресценции Ь-Тгр (а) и АС-Тф-ЫН2 (б) при разных концентрациях ПСС

(цифры на кривых - концентрация ПСС в мкг/мл). Ь-Тгр и АС-Тгр-ЫНг - 2 мкг/мл.

/ - интенсивность флуоресценции при 345 нм; Лех= 280 нм; ширина щели 5 нм.

(в) - Зависимость интенсивности флуоресценции АС-Тгр-]ЧН2 (/) и Ь-Тгр (2) от концентрации

ПСС в координатах Штерна-Фольмера при 360 нм.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что отрицательно заряженный ПСС, взаимодействуя с аминокислотными остатками Тгр в белке, может вызывать тушение их флуоресценции. Поэтому следующей нашей задачей было изучить структурные характеристики белка в комплексе с ПЭ, изучая флуоресценцию триптофановых остатков.

1.2. Влияние полиэлектролитов на флуоресценцию триптофановых остатков в белках

1.2.1. Лактатдегидрогеназа

Изучение триптофановой флуоресценции лактатдегидрогеназы (ЛДГ) при связывании ее с ПСС показало, что данный ПЭ вызывает практически полное тушение ее флуоресценции. Наличие №С1 в растворе ослабляет тушение флуоресценции, при этом положение максимума А.тах и полуширина перехода сохраняются (рис. 2а).

Зависимость константы скорости изменения интенсивности флуоресценции к\ от ионной силы монотонна (рис. 2в), что отличает этот комплекс от большинства других ПБК, в которых такая зависимость имеет максимум в области ионной силы ~30 мМ. Мы полагаем, что это различие связано с особым распределением электростатического потенциала на поверхности молекулы ЛДГ, имеющей высокую степень симметрии (подробное описание в главе 5).

I. о га. ед. 200

(б)

320 340 360 380 400 420 440 ?.. нм

5,6

5,4

5,2

5,0

4,8

30 мМ

VNÜCI.MM

Рис. 2. Спектры (а) и кинетика изменения (б) флуоресценции комплекса ЛДГ-ПСС при разных концентрациях NaCl (цифры на кривых в мМ). Спектры регистрировали через 5 мин после смешивания белка с ПЭ. N - нативный белок; ^ех = 295 нм; I - интенсивность флуоресценции при 345 нм; ширина щели 5 нм. (в) - Зависимость логарифма начальной скорости изменения интенсивности флуоресценции от корня квадратного от ионной силы (концентрации NaCl).

Анализ динамики изменения флуоресценции белка при добавлении ПСС при разных концентрациях №С1 показал, что эти зависимости наиболее оптимально могут быть описаны функцией, представляющей собой сумму двух экспонент:

Такая функция означает, что все Тгр в белке можно в первом приближении разделить на 3 группы, различающиеся по скорости тушения и по амплитудам их флуоресценции (коэффициенты А0, А ] и А2 в уравнении 1) (табл. 1).

Таблица 1. Значения амплитуд и констант скоростей функции, описывающей тушение флуоресценции ЛДГ при связывании с ПСС при разных концентрациях №С1.

№С1, мМ 0 50 100 200 300 500

А0 (%) 20,88 20,7 21,88 29,46 61,48 80,6

А, (%) 66,24 58,25 43,71 19,18 12,94 16,72

¿1=1/Т| [мин-1] 8,9 5,04 2,85 2,83 2,2 0,26

А2 (%) 13,31 22,13 31,46 51,27 25,84 -

АГ2= 1 /Т2, [МИН"'] 0,88 0,82 0,52 0,26 0,26 -

Низкие константы скорости тушения флуоресценции по сравнению со скоростью диффузионных процессов означают, что тушение триптофановых остатков является следствием медленных конформационных изменений в белке, вызванных связыванием полиэлектролита. В результате этих конформационных изменений триптофановые остатки, расположенные внутри глобулы, становятся доступными тушителю. Как видно из табл. 1, с ростом концентрации №С1 амплитуда недоступных растворителю Тгр (А0) и слабо доступных (А2) росла, а число легко доступных (А\) снижалось.

Для того чтобы определить, какие из имеющихся в молекуле Тгр доступны для контакта с ПСС, были рассчитаны с помощью программы Мо1Мо1 параметры доступности растворителю - молекулам воды, для всех Тгр, содержащихся в ЛДГ, (табл. 2) и сопоставлены с конфигурацией их локального окружения в структуре белка (рис. 3).

Из шести триптофанов, Тгр248 имеет наибольшую доступность растворителю (табл. 2), однако детальный анализ ЗП-структуры ЛДГ показал, что Тгр248 расположен в узкой щели, которая хотя и доступна молекулам воды, но не доступна большому ПЭ. Аминокислотные остатки Тгр203, Тгр225 и Тгр150 глубоко «утоплены» в структуре белка и, по всей видимости, представляют собой те

недоступные ни растворителю, ни ПЭ остатки, которые дают вклад в величину А0 уравнения 1, т.е. не тушатся в комплексе ЛДГ-ПСС. Поэтому, только Тгр323 и Тгр190 имеют наибольшую вероятность контакта с полиэлектролитом.

1.2.2. Уреаза

Ранее нами было показано, что отрицательно заряженный ПСС не изменяет активности положительно заряженный ПАА наоборот, полностью ее ингибирует [Тихоненко С.А. с соавт., 2009]. Для понимания механизма ингибирования нами было изучено, как влияет ПАА на структуру уреазы.

Из спектров комплекса уреазы с ПАА (рис. 4) видно, что интенсивность флуоресценции фермента незначительно уменьшается, при этом положение максимума флуоресценции не изменяется.

Таблица 2. Параметры доступности растворителю (для молекул воды) триптофановых остатков в молекуле ЛДГ.

Номер остатка д/п, % Полная поверхность (П) Доступная поверхность (Д)

248 TRP 46,0% 355,2 163,3

323 TRP 23,8% 346,6 82,5

190 TRP 18,6% 351,4 65,5

150 TRP 13,0% 344,8 44,9

225 TRP 7,3% 353,2 25,8

203 TRP 1,8% 355,4 6,5

Рис. 3. Расположение триптофановых остатков в молекуле ЛДГ.

активного центра

Ион вО

Тгр190

Тгр203

Ггр225

Тгр323

Тгр150

Тгр248

Ионы БО^" межсубъединичного центра

300 320 340 360 380 400 X, нм

Тгр 495 <B>

й^к-^атомы Ni

320

340 360 X, нм

380 400

ЩШ&

, ■ ^—_—-Trp 648

Рис. 4. Спектры флуоресценции свободной уреазы (Л/) и в комплексе с ПАА при Хе\= 280 нм (я) и 300 нм (б). 1 - уреаза+ПАА; 2 - ПАА; 3 - уреаза+ПАА+0,5 М NaCI на рис. (о); 3 - разностный спектр (/) - (2) на рис. (б). /V- нативный белок. Уреаза 0,12 мг/мл, ПАА 7,5 мг/мл, pH 6,2.

(в) - Расположение триптофановых остатков Тгр495 и Тгр648 в молекуле уреазы.

Поскольку добавление ПАА не изменяет флуоресценцию исследуемых нами производных индола, как было показано в главе 1.1., то мы полагаем, что эти небольшие изменения флуоресценции уреазы связаны не с тушением Тгр непосредственно ПАА, а вызваны локальной реорганизацией внутренней структуры белка после связывания с ПЭ. Изучение структурных изменений уреазы при взаимодействии с ПЭ методом кругового дихроизма показывает, что уреаза в комплексе с ПАА полностью сохраняет вторичную структуру.

1.2.3. Гемоглобин

Изучение спектров оптического поглощения гемоглобина (НЬ) (рис. 5а), спектров флуоресценции (рис. 56) и кругового дихроизма (КД) при связывании ПСС с НЬ в полосах поглощения ароматических аминокислотных остатков (рис. 5в) и пептидных групп (рис. 5г) показало, что компактная структура НЬ в присутствии ПСС значительно разрушена. Флуоресценция триптофановых остатков (два остатка на молекулу), потушенная гемом в нативном белке, более чем в 10 раз увеличивается в присутствии ПСС. Содержание га-спирали НЬ при образовании комплекса с ПЭ падает от 81 % до 43 % .

300 400 500 X, нм

600 700

320 340 360 380 400 420 440 X, нм

60-

280 300 X, НМ

320

200 220

Рис. 5. Оптическое поглощение НЬ в комплексе с ПСС. I - (Hb+ПСС); N - нативный НЬ (0,5 мг/мл); ПСС 1 мг/мл; 20 мМ Na-фосфатный буфер, рН 6,2. Длина оптического пути 1 мм. (б) - Флуоресценция НЬ в присутствии ПСС. 1 - (Hb+ПСС) дифференц спектр за вычетом спектра ПСС; 2 - ПСС; 3 - НЬ в 7,0 M GuHCl; N - нативный НЬ. ПСС 0,005 мг/мл, НЬ 0,05 мг/мл,; А,ех = 295 нм.

КД-спектры в ближней (в) и в дальней (г) УФ-области свободного НЬ (TV) и в комплексе с ПСС. Цифры на кривых - концентрации ПСС в мг/мл. НЬ 0,45 мг/мл; 10 мМ Na-фосфатный буфер, рН 6,2. Длина кюветы 10 мм (в) и 0,2 мм (г).

Глава 2. Особая роль ионов фосфата в стабилизации белка от разрушающего действия полиэлектролита

Биологическая роль ионов неорганических солей - фосфатов, сульфатов, а также одновалентных ионов - хлоридов, аммония и др. не ограничивается только осмотическим действием, но включает также регуляцию многих метаболических процессов.

Ионы фосфата существуют в биологических жидкостях в двух ионизованных формах Н2Р04 и НРО*", с рК„ перехода 6,9-7,0 в зависимости от ионной силы и локализации. В настоящее время неизвестно, какая из этих форм фосфата конкретно участвует в биохимических процессах. Для того чтобы ответить на этот вопрос, нами были проведены исследования по влиянию ионов фосфата, в сравнении с ионами сульфата, на

стабильность белка при двух значениях рН 6,2 и 7,0, т.к. в этой области рН ионы сульфата находятся только в двувалентной форме.

2.1. Влияние ионов фосфата на ферментативную активность ЛДГ в комплексе с ПСС

было исследовано при двух значениях рН 6,2 и 7,0, при которых соотношение одно- и двувалентной форм фосфата равны 3:1 и 1:1, соответственно.

= 100

100

со 80

я 60

¡5

к 40

В"

Й 20

О 0

0,0 0,3 0,6 0,9 2,0 3,0 4,0 5,0 ПСС, мюг/мл

0 20 40 600 12001800 ПСС, мкг/мл

Рис. 6. Зависимость активности ЛДГ - скорости восстановления пирувата от концентрации ПСС при рН раствора 6,2 (а) и 7,0 (б). Концентрация солей 50 мМ: 1 - SC^ , 2 - Р,; 3 - СГ; 4 - без соли (контроль). ЛДГ 1,0 мкг/мл; пируват 1,0 мМ; NADH 0,2 мМ; 50 мМ трис-HCl буфер.

Как видно из рис. 6 а и б, с ростом концентрации ПСС активность ЛДГ при рН 6,2 и 7,0 уменьшается, но по-разному для разных анионов. Так, в присутствии ионов сульфата при рН 6,2 для 50% инактивации фермента нужны в 2 раза большие концентрации ПСС по сравнению с ионами фосфата. При рН 7,0 в присутствии фосфата фермент, напротив, значительно более стабилен, чем с сульфатом - для 50% ингибирования нужны очень большие концентрации ПСС ~ 300 мкг/мл.

Далее было исследовано, как зависит ферментативная активность ЛДГ в комплексе с ПСС от концентрации солей при фиксированной концентрации ПСС.

Как видно из рис. 7а, при рН 6,2 различия в действии солей незначительны, ионы сульфата немного более эффективно снимают ингибирование ЛДГ полиэлектролитом по сравнению с фосфатом и хлоридом. Однако при рН 7,0 эффективность влияния фосфата увеличивается на порядок по сравнению с сульфатом (рис. 76).

1? 100

а 80

03 60

й £ 40

а-

ё 20 :

И о ;

(а)

/ /

г" г-"

О 20 40 60 80 100 120 140 Соль, мМ

100 Г 80

| 40 | 20 I 0

(б)

...-и

У/-

20 40 80 Соль, мМ

120

Рис. 7. Зависимость активности ЛДГ - скорости восстановления пирувата, в комплексе с ПСС от концентрации солей при рН 6,2 (а) и 7,0 (б). 1 - 804"; 2 -Р,; 3 - СГ. Концентрации ЛДГ и ПСС 1,0 мкг/мл; 1,0 мМ пирувата; 0,2 мМ КАЕ)Н; 50 мМ трис-НС1 буфер.

Из сравнения влияния солей сульфата и фосфата при двух значениях рН, при которых соотношение концентраций одно- и двувалентного ионов фосфата различается, следует, что наибольший стабилизирующий эффект на активность фермента оказывает фосфат в двувалентной форме.

2.2. Влияние ионов фосфата на флуоресцентные свойства комплекса ЛДГ-ПСС

Для исследования влияния солей фосфата и сульфата на структурные характеристики ЛДГ в комплексе с ПСС, изучены спектры триптофановой флуоресценции ЛДГ и динамика их изменений при связывании с ПСС при двух значениях рН буфера 6,2 и 7,0 (рис. 8).

Как видно из рис. 8, присутствие солей в растворе ослабляет тушение флуоресценции, вызванное полиэлектролитом, при этом положение максимума ^па* и полуширина перехода сохраняются.

рН 6,2 рН 7,0

/,отн.ед. без ПСС вО^.мМ 200

320 340 360 380 400 420 440 X, ни

320 340 360 380 400 420 440

X, нм

Рис. 8.

рН 6,2 рН 7,0

Рис. 8. Флуоресцентные свойства комплекса ЛДГ-ПСС при разных концентрациях солей при рН 6,2 (слева) и 7,0 (справа). Спектры зарегистрированы через 5 мин после добавления ПСС. Цифры на кривых — концентрация соли в мМ. Концентрация ЛДГ и ПСС 20 мкг/мл; 50 мМ трис-НС1. На вставках представлена динамика тушения флуоресценции ЛДГ после добавления ПСС. I - интенсивность флуоресценции при 345 нм; Хех = 295 нм, ширина щели 5 нм.

Для количественной оценки влияния солей фосфата и сульфата на тушение флуоресценции ЛДГ в комплексе с ПСС, сравнивали значения скорости изменения интенсивности флуоресценции белка, которые были экстраполированы к нулевому моменту времени [йГ//<#],=0 (рис. 9).

При рН 6,2 влияние солей фосфата и сульфата на скорость тушения флуоресценции ЛДГ в комплексе с ПСС почти одинаково, однако при рН 7,0 эти различия становятся значительными, так же как при изменении активности фермента.

0 -50 -100 •о "150

|Э -200

-250

х к

г 6 II

(а)

/ . //

50 100 150 Соль, мМ

200

0 -10

I"20

-30

-40

(б)

/ I I

I / I А

2___ __________в

, — 1

20 40 60 80 100 120 Соль, мМ

Рис. 9. Зависимость начальной скорости тушения флуоресценции ЛДГ после добавления ПСС от концентрации солей при рН 6,2 (а) и рН 7,0 (б). 1 - 80^"; 2 - Р,; 3 — СГ. Начальную скорость вычисляли из кинетических кривых рис. 8.

Таким образом, изучение влияния анионов фосфата и сульфата на ферментативную активность и флуоресцентные свойства ЛДГ в комплексе с ПСС при рН 6,2 и 7,0 свидетельствует о том, что ионы фосфата значительно более эффективно взаимодействуют с белком по сравнению с ионами сульфата только при рН 7,0. Поскольку с увеличением рН от 6,2 до 7,0 фосфат переходит из состояния одно- в двувалентное, при котором относительное содержание иона НРО^" повышается в три раза, то различия в эффективности действия фосфата на белок вызваны, очевидно, особой ролью в стабилизации белка именно двувалентного иона фосфата.

Согласно рентгеноструктурным данным, ЛДГ из мышцы свиньи в кристаллическом состоянии имеет два анион-связывающих центра - активный и межсубъединичный, в которых зафиксировано присутствие анионов сульфата при их концентрации в растворе более 2 М. Анализ рентгеноструктурных данных для белков, в которых ион фосфата является функциональным, показал, что в кристаллах этих белков ион фосфата замещен ионом сульфата. Данное обстоятельство позволило нам построить модельную структуру межсубъединичного центра ЛДГ, в котором ионы сульфата замещены на двувалентные ионы фосфата.

Рис. 10. Пространственная структура ЛДГ из мышцы свиньи (9ЬОВ), построенная по данным банка РОВ. (а) Показаны атомы полипептидной цепи ЛДГ в радиусе 7 А от БО^, в межсубъединичном центре. Анион НРО^" построен путем замещения иона вО^. Каждый анион НРО4' образует водородные связи, как и 80^", одновременно с двумя субъединицами (точечные линии); сплошными линиями показаны возможные альтернативные водородные связи, характерные только для НРО^", которые могут стабилизировать тетрамерную структуру ЛДГ. (б) - Тетрамерная структура ЛДГ. Субъединицы обозначены как А, В, С и Э. Выделены анион-связывающие центры (два на субъединицу). Р и <3 - оси симметрии.

Измерение расстояний между каждым атомом кислорода HPOf и ближайшими претендентами на образование ионной или водородной связи показывает, что один ион фосфата может образовывать ионные связи сразу с двумя субъединицами, увеличивая т.о. стабильность четвертичной структуры белка.

Предпочтительное связывание иона фосфата в межсубъединичном центре по сравнению с ионом сульфата, по-видимому, связано как с меньшей энергией гидратации гидрофосфата по сравнению с энергией гидратации иона сульфата, так и возможностью создавать альтернативные водородные связи между атомом 0(2) фосфата и кислородом пептидной группы Val286 (4,6 Л), или атомом 0(4) - с 00 Serl86 (4,5 Â). Это может дополнительно стабилизировать четвертичную структуру белка по сравнению с ионами сульфата.

Глава 3. Влияние ионов фосфата на стабильность лактатдегидрогеназы при тепловой денатурации

Из рентгеноструктурных данных для ЛДГ из мышцы свиньи следует, что в межсубъединичном анион-связывающем центре анион содержится только при рН<8 т.е., когда His 188 этого центра ионизован [Celerino Abad-Zapatero et al., 1987]. При pH>8 анион покидает этот центр. Для того чтобы выяснить механизм стабилизации ЛДГ анионами фосфата, мы исследовали кинетику тепловой денатурации в диапазоне рН 6,0-9,0 при заведомо высокой концентрации фосфата - 100 мМ. Чтобы следить за функциональными и структурными характеристиками фермента мы исследовали тепловую денатурацию ЛДГ двумя методами - методом стационарной ферментативной кинетики и методом КД при 222 нм (рис. 11а). Как видно из этого рисунка, скорость денатурации растет согласно сигмоидальному закону с рК перехода, равном 7,8, т.е. стабильность фермента резко падает с ростом рН. Поскольку при рН>8,0 анион отсутствует в межсубъединичном центре, то мы исследовали также зависимость константы скорости денатурации k¿eH от концентрации ионов фосфата в начале перехода при рН 7,0, т.е. в области где анион включен в этот центр и при рН 8,0 где анион отсутствует в нем (рис. 11 б).

Значения к^,,,,, вычисленные из кривых рис. 116, приведены на рис. Ив. С увеличением концентрации ионов фосфата стабильность фермента резко возрастает только при рН 7,0 и не меняется при рН 8,0, оставаясь низкой.

Рис. 11. Кинетика тепловой денатурации ЛДГ в зависимости от рН среды и концентрации ионов фосфата при 55 °С; (а) - рН-зависимость начальной скорости тепловой денатурации ЛДГ по данным ферментативной активности - (■) и кругового дихроизма при 222 нм - (•); ЛДГ 0,04 мг/мл, 0,1 М Иа-фосфатный буфер. (в) - Скорость реакции восстановления пирувата, катализируемой ЛДГ, в зависимости от времени инкубации при концентрациях фосфата (мМ): 1 и б - 40; 2 - 30; 3 - 20; 4 - 10; 5 и 7-5; кривые 1-5 - рН 7,0, кривые 6 и 7 - рН 8,0. Концентрация ЛДГ 0,1 мг/мл. Ионную силу поддерживали постоянной, добавлением раствора №С1; (в) -Значения кж„, вычисленные из кривых, рис. 116, построены как функция концентрации фосфата в логарифмических координатах.

Отметим, что в этой же области рН фосфорная кислота переходит из одновалентной формы в двувалентную с рКа2 6,9-7,0 (пунктирная кривая на рис. 11а). В результате область рН, в которой двувалентный ион фосфата может связаться, представлена заштрихованной областью и имеет максимум при рН 7,0 (рис. 11а), это область наибольшего проявления стабилизирующего действия фосфата. При исследовании разрушающего действия ПЭ на белок (глава 2) было показано, что стабилизация ЛДГ ионом фосфата проявлялась только при рН 7,0 и не проявлялась при рН 6,2. Таким образом, мы видим, что двувалентная форма фосфата является анионом, стабилизирующим белок как при тепловой денатурации, так и при разрушении полиэлектролитом. Иными словами, ЛДГ стабилизируется анионом фосфата только в «кислой» конформации, т.е. при рН < 7,0, и не стабилизируется в «щелочной», при рН > 8,0, причем стабилизирует белок двувалентная форма фосфата.

Далее методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии было исследовано теплопоглощение ЛДГ в присутствии ПСС при разных соотношениях полиэлектролит/белок в условиях наибольшей стабильности - 50 мМ фосфатного буфера, рН 7,0.

Рис. 12. Температурные зависимости избыточного удельного теплопоглощения ЛДГ в комплексе с ПСС при различных концентрациях полиэлектролита: 1 - без добавления ПСС (мг/мл); 2 - 0,02; 3-0,1; 4 - 0,5; 5 - 1,0. Концентрация ЛДГ 1,0 мг/мл, 50 мМ Ка-фосфатный буфер, рН 7,0; скорость сканирования — 1 град/мин. Для удобства представления кривые

расположены со сдвигом по оси ординат.

40 50 60 70

Т,°С

Из приведенных термограмм видно, что с увеличением концентрации ПСС положение максимума пика теплопоглощения смещается в сторону более низких температур, происходит увеличение полуширины пика и уже при концентрации ПСС, равной 0,1 мг/мл теплопоглощение уменьшается в 2 раза. С ростом температуры разрушающее действие ПЭ резко увеличивается. Так, если при 55 °С белок без ПЭ сохраняет нативную структуру в течении 2ч, то в присутствие ПСС пик поглощения почти исчезает даже при низкой концентрации ПСС - 0,1 мг/мл. Отметим, что при 20 °С при той же концентрации ПСС фермент сохраняет компактную структуру и высокую, до 95%, ферментативную активность в течение нескольких часов.

Глава 4. Влияние аниона сульфата на структурно-функциональные особенности

комплекса белка с полиэлектролитом

4.1. Ферментативная активность ЛДГ в комплексе с ПСС

Ранее в нашей лаборатории была исследована зависимость активности ЛДГ в присутствии ПСС от концентрации сульфата аммония (рис. 13а). Как показано на рис. 13а, активность ЛДГ в присутствии ПЭ имеет колоколообразную зависимость. В отсутствии соли фермент полностью ингибирован полиэлектролитом; с ростом концентрации соли активность ЛДГ возрастает и при концентрации более 1 М (МН4)2504 снова падает практически до нуля.

АСр

10"1 кДж/(моль-К)

Рис. 13. (а) - Зависимость скорости восстановления пирувата в лактат, катализируемого ЛДГ в комплексе с ПСС от концентрации (N114)2804. (б) - Инактивация ЛДГ в процессе катализа. Цифры на кривых - концентрация соли в мМ. ЛДГ 2 мкг/мл; ПСС 1,2 мкг/мл; пируват 1 мМ; КА1)Н 0,2 мМ; рН 6,2.

Поскольку активность ЛДГ снижается при больших концентрациях сульфата, то ранее было предположено, что фермент разрушается полиэлектролитом при больших концентрациях соли так же как и при низких ее концентрациях. Для того, чтобы проверить это предположение, мы измерили собственную флуоресценцию белка и содержание элементов вторичной структуры методом кругового дихроизма при разных концентрациях соли. Более того, мы поставили задачу сопоставить временные характеристики процесса разрушения ЛДГ полиэлектролитом, измеренные разными методами, дающие представление о скоростях разрушения разных элементов структуры белка.

4.2. Динамика структурных изменений ЛДГ при образовании комплекса с ПСС

Для исследования были выбраны три концентрации сульфата: низкие - 40 мМ, при которых активность фермента близка к нулю, в максимуме кривой - 400 мМ и при 1,5 М, где активность фермента снова снизилась. Из рис. 14 видно, что если при 40 мМ сульфата флуоресценция белка тушится и содержание а-спиральной структуры падает так же как в отсутствии соли, то при 1,5 М соли оба эти параметра соответствуют величинам для нативного белка. Это означает, что при высокой концентрации сульфата > 1,5 М, когда ферментативная активность ЛДГ в присутствии ПСС близка к нулю, структура фермента практически не меняется и по данным флуоресценции, и по данным КД.

I, отн.ед. % 100

320

360 400

X, нм

440

0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 [, мин

200 210

220 230 X, нм

240 250 — 0

50 100 150 200 250 300 с

Рис. 14. Влияние (N114)2804 на структурные характеристики комплекса ЛДГ-ПСС. (в) - Спектры флуоресценции ЛДГ в комплексе с ПСС при разных концентрациях (N114)2804. (б) -Динамика изменения флуоресценции ЛДГ после добавления ПСС. Яех = 295 нм; / - интенсивность флуоресценции при 345 нм; ширина щели 5 нм.

(в) - КД-спектры в дальней УФ-области ЛДГ в комплексе с ПСС при разных концентрациях (N114)2804.

(г) - Динамика изменения эллиптичности на 222 нм ЛДГ в комплексе с ПСС. N - контроль, без ПСС и соли. Цифры на кривых - концентрация соли в мМ. ЛДГ 20 мкг/мл; ПСС 25 мкг/мл; 50 мМ трис-НС1; рН 6,2.

Комплексное изучение динамики образования комплекса ЛДГ-ПСС тремя независимыми методами (табл. 3) показало, что наиболее быстро изменяется ферментативная активность (в отсутствии соли Ь ~ 5,8 мин"1), затем происходит тушение флуоресценции белка (Ь ~ 4,2 мин"'), и наиболее медленный процесс - разрушение а-спиральной структуры (Ъ -1,92 мин"1).

Таблица 3. Параметры функции/= уо+а-е1"1, описывающей динамику изменения состояния ЛДГ после добавления ПСС полученные тремя методами при разных концентрациях (ЫЬЦ^С^.

(N114)2804, мМ Флуоресценция Круговой дихроизм Ферментативная кинетика

Уо 24,4 ±5 -20,2±2 (3,9±0,19)е-3

0 а 85,9 ± 10 6,19±0,5 9,06±0,27

¿[мин"1] 4,2±0,3 1,92 ±0,08 5, 8±0,25

Уо 27,3±4 -19,5±5 0

40 а 73,7±7 4,55±0,3 (2,58±0,2)е-3

¿[мин"'] 2,5±0,15 1,2 ±0,05 3,8±0,13

400 Уо а 91±10 9±0,7 -20±2 0 100±7 0

¿[мин"1] 0,32±0,06 0 0

Уо 93±4 -19,9±5 0

1500 а 7±0,3 0,4±0,015 (3,2±0,25)е-3

¿[мин"1] 0,27±0,05 0,9±0,03 2,86±0,15

Согласно этим данным в исследуемом интервале солей - от 0 до 4 М можно идентифицировать три разных типа комплекса. В отсутствии соли комплекс характеризуется нулевой ферментативной активностью, полностью разрушенной третичной структурой белка и разрушенной на 30 % а-спиральной структурой. В интервале концентраций сульфата 400 - 800 мМ белок в присутствии ПЭ имеет высокую ферментативную активность и полностью сохраняет структурные параметры нативного состояния. При концентрации больше 1,5 М комплекс характеризуется снова нулевой ферментативной активностью, но с достаточно компактной структурой белка и практически полным сохранением а-спиральной структуры. Мы полагаем, что при высокой концентрации сульфата разрушение белка не происходит, потому что гидрофобные взаимодействия усиливаются внутри белка более, чем между белком и полиэлектролитом. При этом заряды на белке и ПСС экранированы противоионами соли. Это позволяет ферменту в комплексе с ПСС сохранить целостность структуры, хотя при этом «активная петля», участвующая в катализе, тормозится полиэлектролитом и активность фермента падает.

Глава 5. Взаимодействие белков с заряженными коллоидными частицами

В последнее время разрабатываются технологии получения полиэлектролитных микрокапсул (ПМК) для адресной доставки различных лекарственных препаратов к клеткам-мишеням. Для этой цели формируются ПМК с последовательным наслоением полиэлектролитов на твердое ядро с включенными в него биологически активными веществами, в том числе ферментами. Поверхностный слой таких микрокапсул представляет собой гетерогенную поверхность с заряженными фрагментами ПЭ и

участками с гидрофобными зонами, в которых заряды компенсированы соседним заряженным слоем. Поскольку наши данные по взаимодействию белков со свободными ПЭ выявили значительные изменения в ферментативной активности, а в ряде случаев и структурных характеристик белков, то помещение таких ПМК в биологическою жидкость не исключают разрушения растворенных в ней белков. Поэтому при разработке микроконтейнеров, состоящих из заряженных коллоидных частиц типа ПМК или фосфолипидных везикул особенно важно проверять их совместимость с компонентами биологической жидкости. И если изучение ферментов, инкапсулированных в такие микроконтейнеры широко ведется, то исследования состояния белков, сорбированных на поверхностях микрокапсул, практически отсутствуют.

В данной работе были исследованы два типа заряженных коллоидных частиц: 1) полиэлектролитные микрокапсулы с разными по знаку зарядами на поверхности и 2) отрицательно заряженные фосфолипидные везикулы.

5.1. Полиэлектролитные микрокапсулы

На рис. 15 приведены данные по динамике изменения функциональных свойств трех белков из разных биологических жидкостей - ЛДГ, уреаза и НЬ при инкубации их с ПМК. И хотя мы видели, что свободные ПЭ полностью ингибируют белки, но эти же ПЭ, находясь на поверхности ПМК, не вызывают подобного эффекта.

(а)

1 .

(в)

-------В

30 мин

(с!АМ)405 нм, мин-1 0,60 %

0,45

0,30

0,15

0,00

0 12 3 4 250 500 750 мин

(<М/Ж )588 0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0

н-1

(б)

0 5 10 15 30 40 50 60 /, мин

Рис. 15. Влияние микрокапсул и свободных полиэлектролитов на функциональные свойства белков в растворе, (а) - ЛДГ, (б) - уреаза, (в) - НЬ. Инкубационная смесь: белок 0,1 мг/мл, ПМК 1-Ю7 шт/мл. 1 - белок+ПМК; 2 - белок (контроль); 3 - белок+ПЭ. ПМК состава (ПСС /ПАА)3ПСС (а, в) и ПМК состава (ПСС/ПАА)3ПАА (б).

120 N (б)

чЮО

я 80 Л

о 60

^ 40

20 супернатант

300 320 340 360 380 400 X, нм

Рис. 16. Спектры флуоресценции ЛДГ (а), уреазы (б) и НЬ (в), измеренные через 2 часа инкубации с ПМК. Белок 0,1 мг/мл; ПМК 1107 шт/мл. N - белок в растворе (контроль); 295 нм, /-интенсивность флуоресценции при 345 нм.

320

440

360 400 X, нм

Изучение спектров флуоресценции белков с ПМК (рис. 16) показало, что связывание белка с ПМК практически не приводит к тушению флуоресценции. Для того, чтобы оценить, сорбируюся ли белки на поверхности ПМК, мы осадили микрокапсулы из инкубационного раствора путем центрифугирования и затем определили количество белка в супернатанте (табл. 4).

Таблица 4. Значения доли связанного с микрокапсулами белка (% от общего белка), определенные спектральными методами и по ферментативной активности.

Флуоресцентный метод Ферментативная

Белок активность

на ПМК в супернатанте на ПМК в супернатанте

Уреаза 98±2 1,5+1 99+6 2+1

Лактатдегидрогеназа 35±4 65±3 28+4 72+3

Гемоглобин* 72+3 32+2 71+5* 27+2*

* Функциональная активность НЬ определена из оптических спектров в полосе Соре.

Из таблицы видно, что все белки сорбирутся на ПМК, но в разной степени: уреаза практически полностью сорбирована - 98%, НЬ - 70%, ЛДГ - 35%. Низкая способность к связыванию ЛДГ с микрокапсулами, как мы полагаем, вызвана особой конфигурацией электростатического поля на поверхности этого белка. Электростатическое поле на поверхности ЛДГ содержит довольно протяженные области с одноименным потенциалом, но они расположены симметрично таким образом, что белок имеет низкий полный

дипольный момент (ЛДГ имеет три оси симметрии 2-го порядка). Уреаза и НЬ также имеют протяженные области на поверхности с электростатическим потенциалом одного знака, но топология их такова, что обе эти молекулы имеют высокий полный дипольный момент. В результате ассимметрии распределения электронной плотности на поверхности молекул уреазы и НЬ, эти белки хорошо сорбируются на заряженной поверхности ПМК за счет дополнительных ион-дипольных взаимодействий.

5.2. Фосфолипидные везикулы

Далее мы рассмотрели взаимодействие белка НЬ с другим типом заряженных коллоидных частиц - фосфолипидными везикулами (ФЛВ). Для приготовления везикул использовали отрицательно заряженный фосфолипид (ФЛ) 1-пальмитоил-2-олеил-фосфатидилглицерин. На рис. 17а приведены спектры оптического поглощения НЬ при разных молярных соотношениях фосфолипид/НЬ. Присутствие фосфолипидных везикул в растворе изменяет непосредственное окружение гема в молекуле НЬ и уже при соотношении ФЛ:НЬ, равном 50:1, оно приближается к состоянию денатурированного белка. При этом интенсивность спектра флуоресценции резко возрастает (рис. 176), что характеризует изменение окружения также и триптофановых остатков, в результате чего гем перестает быть тушителем триптофановой флуоресценции. Кроме того, спектры КД в ближней и дальней УФ-областях свидетельствуют о том, что разрушается третичная, и незначительно меняется вторичная структура белка (рис. 17 в,г).

Сравнение двух типов заряженных коллоидных частиц - полиэлектролитных микрокапсул и фосфолипидных везикул - по их способности инактивировать белки, находящиеся в растворе, показало принципиальные различия между влиянием этих частиц на белки. Если ПЭ, находящийся в растворе, полностью инактивирует фермент, то тот же ПЭ, связанный на поверхности ПМК, является нейтральным по отношению к сорбированному на ее поверхности белку (рис. 15). Что же касается ФЛВ, то добавление их в раствор белка приводит к полной потере функциональных свойств белка уже через 1 мин, и более того, при этом разрушается пространственная структура белка.

ФЛ/НЬ

50:1

в 7,0 М GuHCl _ (а)

400 500 X, нм

600 700

30 25 §20 I 15 10 5 0

Г,/\4(Ю:1 ФЛ/НЬ

1 А \ в 7,0 М (lullCI

// /\\ \ 100:1 а / V \ : / XV \

йЛ^

300

350 400 X, нм

450 500

280 300 320 340 190 200 210 220 230 240 250

X, нм X, нм

Рис. 17. Спектры оптического поглощения (а), флуоресценции (б) и КД (в, г) НЬ в зависимости от молярного соотношения ФЛ/НЬ (цифры на кривых). НЬ 0,05 мг/мл (а, б),

ХеХ = 295 нм, ширина щели 5 нм. НЬ 0,5 мг/мл (в, г). рН 6,2. Длина оптического пути 10 мм (в) и 0,2 мм (г). N-нативный белок. ФЛ - 1-пальмитоил-2-олеил-фосфатидилглицерин.

Оболочка ПМК, хотя и имеет гидрофобные области, но они «прошиты» послойно ионными связями между отрицательно и положительно заряженными ПЭ, которые образовались при ее формировании путем поочередного наслаивания соответствующего ПЭ. Что касается ФЛВ, то они стабилизированы в основном гидрофобными взаимодействиями между жирными концами фосфолипидных молекул, а электростатические взаимодействия являются в них, напротив, дестабилизирующим фактором, т.е. силой расталкивания между соседними отрицательно заряженными фосфатными группами. Это сочетание разнонаправленных сил определяет меньшую стабильность конформации ФЛВ по сравнению с ПМК. Сорбированный на поверхности ФЛВ, белок может частично проникать внутрь и разрыхляться за счет множественных гидрофобных контактов с относительно подвижной липидной частью ФЛВ. И наоборот, в ПМК жесткая конформация оболочки не способна адаптироваться к специфичной для каждого белка топологии расположения зарядов на его поверхности. Белок при взаимодействии с ПМК имеет меньше электростатических контактов, чем со свободным

полиэлектролитом и поэтому сохраняет свою конформацию, хотя и остается сорбированным на поверхности ПМК.

Выводы

1. Флуоресценция производных индола - 1<-ацетила-Тгр-амида и Ь-Тгр тушится полианионом полистиролсульфонатом с разной эффективностью: константы Фолмера А"|=104 и А"2=3-103 на моль мономеров ПСС соответственно, и не меняется в присутствии поликатиона полиалилламина.

2. Динамика изменения флуоресценции белков лактатдегидрогеназы, уреазы и гемоглобина при образовании комплекса с полиэлектролитом обнаруживает несколько классов триптофановых остатков, идентифицированных по доступности их полиэлектролиту, скорость тушения которых зависит от вида иона.

3. Из двух форм фосфата в нейтральной области рН только двувалентная форма защищает лактатдегидрогеназу от разрушающего действия полиэлектролита и при тепловой денатурации, взаимодействуя с «кислой» конформацией белка в межсубъединичном анион-связывающем центре.

4. В зависимости от концентрации ионов сульфата можно выделить, по крайне мере, три состояния лактатдегидрогеназы в комплексе с полистиролсульфонатом: 1) необратимо разрушенный (0 - 40 мМ), 2) нативный (~400 мМ), и 3) с компактной структурой, но с заторможенной «активной» петлей (> 1,5 М). Было показано, что наиболее быстро изменяется ферментативная активность, затем происходит тушение флуоресценции белка, и наиболее медленный процесс - разрушение а-спиральной структуры.

5. Полиэлектролитные микрокапсулы с заряженной оболочкой, будучи ресуспендированы в растворы белков (лактатдегидрогеназы, уреазы и гемоглобина), сорбируют их на своей поверхности, но не изменяют ни структуру, ни функцию белков, в отличие от фосфолипидных униламеллярных везикул, которые разрушают в основном третичную структуру.

Список публикаций по теме диссертации Статьи

1. Тихоненко С. А., Сабурова Е.А, Дурденко Е.В., Сухорукое Б.И. Фермент-полиэлектролитный комплекс. Влияние солей на взаимодействие уреазы с полиаллиламином //Физ. хим. М. 2009. Т.83. № 10. С. 1966-1974.

2. Дурденко Е.В., Кузнецова С.М., Тихоненко С.А., Емельяненко В.И., Сабурова Е.А. Температурная стабильность лактатдегидрогеназы в комплексе с анионным полиэлектролитом II Биофизика. М. 2010. Т.55. №.4. С. 594-604.

3. Дурденко Е.В., Кузнецова С.М., Басова Л.В., Тихоненко С.А., Сабурова Е.А. Взаимодействие белков с заряженными коллоидными частицами // Биофизика. 2011. Т.56. № 4. С. 623-634.

4. Дурденко Е.В., Сабурова Е.А. Особая роль фосфата в устойчивости лактатдегидрогеназы к разрушению полиэлектролитом // Биоорганическая химия. М. 2012. Т.38. № 4. С. 421-430.

Тезисы

1. Дурденко Е.В., Дыбовская Ю.Н., Тихоненко С.А., Сабурова Е.А. Полиэлектролит белковый комплекс. Влияние полиаллиламина на структуру и функции уреазы II Тезисы XVI конференции «Математика. Компьютер. Образование». Пущино. 2009. Т.1. С. 244.

2. Дурденко Е.В., Дыбовская Ю.Н., Тихоненко С.А. Существует ли связь между стабильностью белков к тепловой денатурации и к разрушению полиэлектролитами? II Тезисы конференции «Ломоносов-2009». М. 2009. секция биология. С. 13.

3. Тихоненко С.А., Дурденко Е.В. Физико-химические основы создания, изучение свойств и применение полиэлектролитного ферментного микродиагномтикума II Тезисы конференции «Ломоносов-2009». М. 2009. секция биология. С. 33.

4. Дурденко Е.В. Различное влияние моно- и дивалентных солей на взаимодействие уреазы с полиэлектролитом II Тезисы конференции молодых ученых ИТЭБ РАН. Пущино. 2009. С. 39-40.

5. Дурденко Е.В., Тихоненко С.А., Сабурова Е.А., Шабарчина Л.И. Влияние солей с разной высаливающей стой на взаимодействие полиэлектролитов с белкалш II Тезисы XII молодежной конференции по органической химии. Суздаль. 2009. С. 73-76.

6. Тихоненко С.А., Дурденко Е.В., Сабурова Е.А., Шабарчина Л.И. Создание биохимических микрореакторов в связи с проблемой микродиагностикума II Тезисы XII молодежной конференции по органической химии. Суздаль. 2009. С. 171-173.

7. Дурденко Е.В., Молочков Н.В., Сабурова Е.А Роль дивалентных анионов в стабилизации четвертичной структуры белков к разрушению полиэлектролитами II Тезисы 14 Международной школы-конференции молодых ученых Биология - наука 21 века. Пущино. 2010.Т.1.С.23.

8. Дурденко Е.В., Тихоненко С.А., Сабурова Е.А., Молочков Н.В. Изменение конформации белков при взаимодействии их с полиэлектролитами II Тезисы XV Симпозиума по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул Петрозаводск. 2010. С. 167.

9. Дурденко Е.В., Сабурова Е.А., Тихоненко С.А., Молочков Н.В. Динамика взаимодействия полиэлектролита с белком. Влияние солей с разным высаливающим эффектом И Тезисы XVII-ой конференции «Математика. Компьютер. Образование». Дубна. 2010. С. 65.

10. Дурденко Е.В., Сабурова Е.А. Влияние ионов неорганических солей на стабильность белка к разрушению полиэлектролитом // Тезисы V Российского симпозиума «Белки и пептиды». Петрозаводск. 2011. С. 320.

11. Дурденко Е.В., Молочков Н.В., Тихоненко С. А., Сабурова Е.А. Роль специфических анион-связывающих центров на белках в стабилизации их к температурной денатурации и разрушению полиэлектролитами // Тезисы XVIII конференции «Математика. Компьютер. Образование». Пущино. 2011. С. 62

Заказ № 163-а/05/2012 Подписано в печать 24.05.12 Тираж 75 экз. Усл. п.л. 1,4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-maihzak@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дурденко, Екатерина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ С БЕЛКАМИ.

1.1 УСЛОВИЯ ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ БЕЛКОВ С

ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМ И.

1.1.1 Конфигурация электростатического поля на поверхности белков и формирование надмолекулярных комплексов.

1.1.2 Зависимость константы связывания полиэлектролитов с белками от ионной силы.

1.1.3 Влияние ионов 1 Ъфмеистера па стабильность белков в комплексах с полиэлектролитами.

1.1.4 Аниои-связываюиц/е центры на белках и влияние некоторых анионов на стабильность белков.

1.1.5 Роль гидрофобных взаимодействш7 в образовании полиэлектролит-белковых комплексов.

Глава 2. ВЛИЯНИЕ СВОБОДНЫХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ НА СТРУКТУРУ И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ ПРИ ОБРАЗОВАНИИ

КОМПЛЕКСА.

Глава 3. ЗАРЯЖЕННЫЕ КОЛЛОИДНЫЕ ЧАСТИЦЫ В

БИОМЕДИЦИНЕ.

Глава 4. ВЛИЯНИЕ ЗАРЯЖЕННЫХ КОЛЛОИДНЫХ ЧАСТИЦ НА

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. ОБЪЕКТЫ.

1.1 Белки и ферменты.

1.1.1 Лактатдегидрогеназа.

1.1.2 Уреаза.

1.1.3 Гемоглобин.

1.2 Индольные производные.

1.3 Полиэлектролиты.

1.4 Неорганические соли и компоненты.

2. МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ.

2.1 Определение активности ферментов.

2.1.1 Активуюсть лактатдегидрогеназы.

2.1.2 Активность уреазы.

2.1.3 Функциональную активность гемоглобина.

2.2 Спектрофотометрические исследования.

2.3 Флуориметрические исследования.

2.4 Круговой дихроизм.

2.5 Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия.

2.6 Измерение скорости тепловой денатурации лактатдегидрогеназы.

2.7 Получение микросферолитов СаСО,.

2.8 Формирование полиэлектролитных микрокапсул на микросферолитах СаСО,.

2.9 Формирование фосфолипидых везикул.

2.10 Инкубация белков с микрокапсулами и полиэлектролитами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВ С ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ.

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ СВОЙСТВА КОМПЛЕКСА.

5.1 Влияние полиэлектролитов на флуоресценцию производных индола - аналогов триптофановых остатков в белке.

5.2 Влияние полиэлектролитов на флуоресценцию триптофановых остатков в белках.

5.2.1 . 1актатдегидрогеназа.

5.2.2 Уреаза.

5.2.3Гемоглобин.

5.3 Особая роль ионов фосфата в стабилизации белка от разрушающего действия полиэлектролита.

5.3.1 Влияние ионов фосфата на ферментативную активность

Л/Ц'в комплексе с ПСС.

5.3.2 Влияние ионов фосфата на флуорссыентные свойства комплекса /1/Ц -ПСС.

5.4 Влияние ионов фосфата на стабильность лактатдегидрогеназы при тепловой денатурации.

5.5 Влияние аниона сульфата на структурно-функциональные особенности комплекса белка с полиэлектролитом.

5.5.1 Ферментативная активность ЛДГ в комплексе с ПС'С.

5.5.2 Динамика структурных изменении Л/Ц' при образовании комплекса с ПСС.

5.6 Взаимодействие белков с заряженными коллоидными частицами.

5.6.1 Полиэлектролитные .микрокапсулы.

5.6.2 Фосфолипидные везикулы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные особенности белков в комплексах с полиэлектролитами и полиэлектролитными микрокапсулами"

Изучение свойств полиэлектролит-белковых комплексов (ПБК) служит для понимания функциональной роли эндогенных полиэлектролитов в разных метаболических процессах. ПБК, содержащие синтетические ПЭ, исследуются в качестве модельных систем для изучения взаимодействия белков с клеточными стенками, мембранами, с внутриклеточными ДНК и РНК, а также в системе антиген-антитело. В ряде случаев, исследование ПБК помогает понять механизм катализа, особенно сложный для отдельных ферментов. Преимущества такого моделирования заключаются в том, что оно позволяет исследовать физико-химические свойства комплекса в зависимости от длины цепи ПЭ, знака и плотности зарядов на ПЭ и состава среды. Кроме того, такие системы удобны для исследования, поскольку в определенных условиях допускают применение оптических методов.

Сродство ферментов к полизаряженным компонентам клетки независимо от их агрегатного состояния зависит от присутствия дву- и однозаряженных ионов, находящихся в составе любого компартмента живой клетки. И хотя ионы дву- и однозаряженных солей могут влиять как на сродство ферментов к полиэлектролитам и величину энергии активации катализа, так и на собственную конформацию ПЭ и соответственно на его персистентную длину, однако такие исследования практически отсутствуют (особенно это касается влияния двузаряженных анионов). Это связано с тем, что в настоящее время разработана теория только для полимерных цепей в растворе, в то время как для ПБК описание их поведения находится только на уровне полу эмпирических закономерностей. Настоящая работа посвящена изучению влияния солевого состава среды на динамику образования и функциональные особенности ферментов в комплексе с ПЭ. Изучение динамики образования таких комплексов может позволить решать задачи, направленные на управление биологическими процессами в живых организмах.

При изучении взаимодействия белков как с синтетическими, так и с эндогенными ПЭ обнаружены значительные изменения ферментативной активности, а в ряде случаев наблюдали изменения и структурных характеристик белков после связывания их с ПЭ. Разрушающее действие отдельных ПЭ на белки особенно важно учитывать при использовании коллоидных частиц в биологических жидкостях при разработке микро контейнеров для адресной доставки различных лекарственных препаратов к клеткам-мишеням. Для этой цели разработаны технологии получения полиэлектролитных микрокапсул с последовательным наслоением ПЭ на твердое ядро с включенным в него биологически активным веществом. Применение таких микрокапсул с заряженной полиэлектролитной оболочкой, а также коллоидных частиц различных видов, в частности фосфолипидных везикул, в качестве средства транспортировки лекарств требует тщательной проверки их влияния на функциональные свойства белков, содержащихся в биологических жидкостях. И если изучение ферментов, инкапсулированных в такие микроконтейнеры широко ведется, то исследование состояния белков в суспензии с заряженными коллоидными частицами практически отсутствуют. В настоящей работе было исследовано влияние разных типов заряженных коллоидных частиц на функциональные и структурные характеристики белков в суспензии этих частиц.

Цель работы:

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние полиэлектролитов на флуоресцентные свойства производных индола.

2. Определить кинетические характеристики изменения флуоресценции белков - лактатдегидрогеназы, уреазы и гемоглобина, при образовании комплекса с полиэлектролитом и сопоставить их с параметрами доступности остатков триптофана полиэлектролиту.

5. Исследовать влияние двух типов заряженных коллоидных частиц -полиэлектролитных микрокапсул и липосом на функциональные и структурные характеристики белков в суспензии этих частиц.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Дурденко, Екатерина Владимировна

выводы

1. Флуоресценция производных индола - М-ацетила-Тгр-амида и Ь-Тгр тушится полианионом полистиролсульфонатом с разной эффективностью: константы Штерна-Фолмера /\\=10-10 и /\2=3-10 на Моль" мономеров ПСС соответственно, и не меняется в присутствии поликатиона полиалилламина.

3. Из двух форм фосфата в нейтральной области рН только двузаряженная форма защищает лактатдегидрогеназу от разрушающего действия полиэлектролита и при тепловой денатурации, взаимодействуя с «кислой» конформацией белка в межсубъединичном анион-связывающем центре.

4. В зависимости от концентрации ионов сульфата можно выделить, по крайне мере, три состояния лактатдегидрогеназы в комплексе с полистиролсульфонатом: 1) необратимо разрушенный (0 - 40 мМ), 2) нативный (-400 мМ), и 3) с компактной структурой, но с заторможенной «активной» петлей (> 1,5 М). Было показано, что наиболее быстро изменяется ферментативная активность, затем происходит тушение флуоресценции белка, и наиболее медленный процесс - разрушение а-спиральной структуры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные в работе данные показывают, что стабильность белков при разрушении их полиэлектролитами зависит не только от полного заряда белка, изоэлектрической точки или распределения электростатического потенциала на поверхности белка, а также в большой степени зависит от особого расположения анион-связывающих центров в белке. Из результатов наших экспериментов, представленных в этой работе, следует, что предпочтительная стабилизация ионом фосфата лактатдегидрогеназы (по сравнению с сульфатом) при разрушающем действии полиэлектролита может иметь регуляторное значение для клетки. Это видно, во-первых, из того, что максимум стабильности белка при связывании аниона приходится на относительно узкую область pH, входящую в физиологический диапазон значений pH (рис. 24а). Во-вторых, концентрации фосфата, которые снимают ингибирующее действие полиэлектролита (рис. 206) и снижают скорость структурных разрушений белка (рис. 21 г, 24а), находятся в пределах среднеклеточной его концентрации ~ 50 мМ. Этот факт особенно важен для процесса сорбции ферментов на заряженных поверхностях, включая мембраны, при взаимодействии их с полифункциональными белковыми комплексами, в том числе с эндогенными полиэлектролитами.

Среди эндогенных полиэлектрлитов особенно существенную роль в клеточном метаболизме играет полифосфат. Образование полифосфорной кислоты и ее катаболизм являются внутриклеточными процессами и присущи всем организмам, независимо от их происхождения - животным [Mino Т. et а!., 1998], растительным [Bental М. et al, 1990, 1991] и бактериальным [Mino Т. et al., 1998]. Большинство стрессовых воздействий, будь то осмотический шок, изменение освещенности для растительных клеток или щелочной стресс, сопровождаются в живой клетке переходом полифосфорной кислоты в ортофосфат, и, наоборот, и в ряде случаев являются пусковым механизмом для переключения некоторых метаболических путей, например, на синтез осмолитов или выравнивание внутриклеточного рН [8игека К. ег а1., 2007; МапГгеёо Т а1., 2010; Ел Т.Н. е1 а1., 2011]. Поэтому обнаруженная в настоящей работе стабилизация белков ионом ортофосфата является еще одной степенью свободы для регуляции процессов, связанных с ответом клетки на стресс.

Вопрос о том, какой фосфат - одно- или двузаряженный ион участвует в реакции, ранее авторами обычно не рассматривался. Как правило применяли фосфатный буфер рН 7 без какой-либо детализации, хотя в нейтральной области рН, ионы фосфата существуют в биологических жидкостях в двух ионизованных формах Н2РО"4 и НРО^2, как мы обсуждали выше. Тот факт, что именно двузаряженная форма фосфата связывается в анион-связывающем центре и влияет на стабильность белка, как показано в настоящей работе, важен не только с теоретической точки зрения, но и как возможность целенаправленного изменения стабилизирующего эффекта путём вариации рН.

Что касается ионов сульфата, то для нас важно было узнать, разрушается ли структура белка в присутствии ПСС при высокой концентрации соли, т.е. около 1,5 М, поскольку ферментативная активность в этом диапазоне концентраций вновь падает до нуля. Результат оказался несколько неожиданным: с повышением концентрации соли больше 1 М белок сохраняет компактную структуру и практически полностью сохраняет а-спиральную структуру. Мы полагаем, что при высокой концентрации сульфата разрушение белка не происходит, потому что гидрофобные взаимодействия усиливаются внутри белка более, чем между белком и полиэлектролитом. При этом заряды на белке и ПСС экранированы противоионами соли. Это позволяет ферменту в комплексе с ПСС сохранить целостность структуры, хотя при этом «активная петля», участвующая в катализе, тормозится полиэлектролитом и активность фермента падает.

Сравнение двух типов заряженных коллоидных частиц -полиэлектролитных микрокапсул и фосфолипидных везикул - по их способности инактивировать белки, находящиеся в растворе, показало существенные различия между этими частицами. Если ПЭ, находящийся в растворе, полностью инактивирует фермент, то тот же ПЭ, связанный на поверхности ПМК, является нейтральным по отношению к растворенному белку. Это мы видим из приведенных в работе данных по активности трех белков - уреазы, ЛДГ и Hb (рис. 29). Что же касается ФЛВ, то добавление их в раствор белка приводит к полной потере его функциональных свойств (рис. 32а) и более того, разрушает пространственную структуру белка (рис. 33).

Изменения конформации белков при связывании с биологическими мембранами могут быть не столь «опасны» для малых белков, которые, как правило, обратимо денатурируют. К ним относятся такие белки, как миоглобин, а-химотрипсин, лизоцим и т.д. [Khechinashvili N.N. et aL, 2008]. Однако мультисубъединичные белки денатурируют чаще всего необратимо, и изменения конформации при связывании их на поверхности заряженных частиц могут привести к необратимой потере функции белка. В этом случае для сохранения функции белка необходимо либо изменение ионной силы, либо комплексообразование с лигандами, стабилизирующими его структуру.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дурденко, Екатерина Владимировна, Пущино

1. Балобанов В.А., Ильина Н.Б., Катина Н.С., Кашпаров И.А., Долгих Д.А., Бычкова В.Е. Кинетика взаимодействия апомиоглобина с фосфолипидной мембраной И Молекулярная биология. 2010. 44 (4). С. 708-717.

2. Басова J1.B., Тиктопуло Е.И., Бычкова В.Е. Влияние модельных мембран на структуру хологлобина• конформационные изменения при pH 6.2 // Молекулярная биология. 2005. 391.. С. 105-1 12.

3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1998. 1990. 704 с.

4. Вакуров A.B. Нековалентные фермент-полиэлектролитные комплексы в водно-органических смесях /7 Дисс канд. хим. наук. М.: МГУ им.М.В. Ломоносова. 1998. с. 84.

5. Григорьев П.А., Постникова Г.Б., Шеховцова Е.А. Изучение взаимодействия миоглобина с липидными бислойными мембранами потенциодннамическим методом /7 Биофизика. 2012. 57 (1). С 68-74

6. Геннис Р. Киомембраны молекулярная структура и функции. М. Мир. 1997. 624 с.

7. Дыбовская Ю.Н. Применение расчетов электростатического поля белков для анализа взаимодействия полиэлектролитов с белками // Диссертация канд ф.-м наук. Пущино. ИТЭБ РАН. 2009. 106 с.

8. Кулаев И.С. Вагабов В. М. и Кулаковская Т. В. Высокомолекулярные неорганические полифосфаты: биохимия, клеточная биология, биотехнология. M " Научный мир, 2005. 216 с.

9. Ларионова Н.И., Унксова И.П., Миронов В.А., Сахаров И.Ю., Казанская Н.Ф., Березин И.В. Исследование комплексообразования растворимых карбоксиметиловых эфиров полисахаридов с белками //ВМС А. 1981. 23 (8). с. 1823-1829.

10. Мусил Я., Новакова О , Кунц К. Современная биохимия в схемах. М.: Мир, 1984. 215 с.

11. Мустафаев М.И. Комплексы неприродных полнэлектролитов с белками /7 Диссертация докт. хим. наук, М.: МГУ им.М.В. Ломоносова. 1981. 344 с.

12. Постникова Г.Б. и Целикова C.B. Миоглобин и митохондрии• изучение кинетики отгцелпеиия кислорода от оксимиоглобипа в суспензии митохондрий И Биофизика. 2005. 502.. С. 297-306.

13. Постникова Г.Б. Целикова C.B. и Шеховцова Е.А. Миоглобин и митохондршг оксимиоглобин в процессе дезоксигеиации взаимодействует с митохоидриальной мембраной // Биохимия. 2009. 74 (11). С 1488-1497.

14. Сабурова Е.А, Бобрешова М.Е., Елфимова Л.И., Сухоруков Б И. Ингибиторный действие полиэлектролитов на олигомерный фермент /7 Биохимия. 2000. 65 (8). С. 11511161.

15. Сабурова Е.А., Ягодина Л.О. Кинетические исследования субстратного ингибирования лактатдегадрогеназы анионами и pH/7 Биохимия. 1990. 55. С 1819-1825.

16. Самсонов В.Г. Полимерные комплексы, включающие синтетические полиэлектролиты и физиологически активные вещества // ВМС A. J 979. 21 (4). с. 725-733.

17. Сивожелезов B.C. Электростатические поля вокруг биологических макромолекул как факторы молекулярного узнавания // Диссертация докт. ф.-м. наук. Пущино. ИБК РАН. 2010. 186 с.

18. Тихоненко С. А., Сабурова Е.А., Дурденко Е.Н., Сухорукое Б.И. Фермент-полиэлектролитный комплекс. Влияние солеи на взаимодействие уреазы с полиаллиламином И Журнал физической химии. 2009. 83 (10). С. 1-9.

19. Abad-Zapatero С., Griffith J.P., Sussman J.L., and Rossman M.J. Refined crystal structure of dogfish M4 a po-lactate dehydrogenase /7 J. Mol. Biol. 1987. 198. p. 445-467.

20. Amstad E., Reimhult E. Nanoparticle actuated hollow drug delivery vehicles H Nanoraedicine (Lond). 2012. 7 (1). p. 145-164.

21. Anbazhagan V. Qu J., Kleinschmidt J.H. Marsh D. Incorporation of outer membrane protein OmpG in lipid membranes: protein-Iipid interactions and beta-barrel orientation // Biochemistry. 2008. 47 (23). p. 6189-61998.

22. Antonov M., Mazzawi M., Dubin P.L. Entering and exiting the protein-polyelectrolyte coacen'ate phase via nonmonotonic salt dependence of critical conditions // Bio macro molecules. 2010. 11 (1). p. 51-59.

23. Antosiewicz J.M., Shugar D. Poisson-Boltzmann continmun-sohation models: applications to pH-dependent properties ofbiomolecules Ii Mol Biosyst. 2011. 7 (11). p. 2923-2949.

24. Atanasov В., Mustafi D., Makinen M.W. Protonation of the b-lactam nitrogen is the trigger event in the catalytic action of class A b-lactamases ¡i Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. 97. p. 3160-3165.

25. Bágel'ová J., Antalík M., Bona M. Studies on cytochrome c-heparin interactions by differential scanning calorimetry //Biochem 1994. 297 (1). p. 99-101.

26. Baldwin R.L. How Hofmeister ion interactions affect protein stability il Biophys. O. 1996. 71. p. 2056-2063.

27. Baldwin R.L. Desolvation penalty for burying hydrogen-bonded peptide groups in protein folding 1П Phys Chem B. 2010. 114 (49). p. 16223-16227.

28. Bashford D., Karplus M. Multiple-site titration curves of proteins an analysis of exact and approximate methods for their calculation // J. Phys. Chem. 1991. 95. p. 9556-9561.

29. Bashford D., Karplus M. pKa's of ionizable groups in proteins: atomic detail from a continuum electrostatic model H Biochem. 1990. 29 (44). p. 10219-10225.

30. Beckera A.L., Henzlera K., Welscha N., Ballauffa M., Borisov O. Proteins and polyelectroiytes: A charged relationship H Current Opinion in Colloid & Interface Science. 2012. 17 (2). p. 90-96.

31. Bental M., Pick U., Avron M., and Degani H. Polyphosphate metabolism in the alga Dunaliella salina studied by 31P-NMR //Biochim. Biophys. Acta. 1991. 1092. p. 21-28.

32. Bental M., Pick U., Avron M., and Degani H. Metabolic studies with NMR spectroscopy of the alga Dunaliella salina trapped in agarose beads //Eur. J. Biochem. 1990. 188. p. 117-122.

33. Berth G., Voigt A. Dautzenberg H., Donath E. and Mohwald H. Polyelectrolyte complex and layer-by-layer capsules from chitosan/chitosan sulfate !! Biomacromolecules. 2002. 3 (3). p. 579590.

34. Boeris V., Romanini D., Farruggia B., Pico G. Interaction and complex fonvation between catalase and cationicpolyelectroiytes: chitosan and Eudragit E100!! Int J Biol Macromol. 2009. 45 (2). p. 103-108.

35. Bonincontro A., Spigone E., Ruiz Pena M., Letizia C., La Mesa C. Lysozyme binding onto cat-anionic vesicles // J Colloid Interface Sci. 2006. 304 (2). p. 342-7.

36. Bronsted J.N. Molecular magnitude and phase distribution /7 I. Z. Phys. Chem. Bodenstein Festband. 1931. p. 257-266.

37. Carlsson F., Malmsten M., Linse P. Monte Carlo simulations of lysozyme self-association in aqueous solution H J. Phys. Chem. B. 2001. 105. p. 12189-12195.

38. Chen F., Madler S., Weidmann S., Zenobi R. MALDI-MS detection of noncovalent interactions of single stranded DNA with Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein IIJ Mass Spectrom. 2012. 47 (5). p. 560-566.

39. Collins K.D. Why continuum electrostatics theories cannot explain biological structure, polyelectroiytes or ionic strength effects in ion-protein interactions 11 Biophys Chem. 2012. Epub ahead of print.,

40. Cousin F., Gummel J., Clemens D., Grillo I., Boue F. Multiple scale reorganization of electrostatic complexes ofpoly(styrenesulfonaie) and lysozyme H Langmuir. 2010. 26 (10). p. 70787085.

41. Cousin F., Gummel J., Ung D., Boue F. Polyelectrolyte-protein complexes: structure and conformation of each specie revealed by SANS ll Langmuir. 2005. 21 (21). p. 9675-9688.

42. De Cock L.J., De Koker S., De Geest B.G., Grooten J., Vervaet C., Remon J.P., Sukhorukov G.B., Antipina M.N. Polymeric multilayer capsules in drug delivery // Angew Chem Int Ed Engl. 2010. 49 (39). p. 6954-6973.

43. Di Sabato G., Kaplan N.O. The denaturation of lactic dehydrogenases // J. Biol. Chem. 1965. 240(3). p. 1072-1076.

44. Felix B. Sheinerman and Honig B. On the Role of Electrostatic Interactions in the Design of Protein Protein Interfaces HI. Mol. Biol. 2002. 318. p. 161-177.

45. Fenley A.T., Gordon J.C., Onufriev A. An analytical approach to computing biomolecular electrostatic potential. 1. Derivation and analysis // J Chem Phys. 2008. 129 (7). Published online 075101.

46. Foreman T.M., Khalil M., Meier P., Brainard J.R., Vanderberg L.A., Sauer N.N. Effects of charged water-soluble polymers on the stability and activity of yeast alcohol dehydrogenase and subtilisin .// Biotechnol Bioeng. 2001. 76 (3). p. 241-246.

47. Fowler C.B., Evers D.L., O'Leary T.J., Mason J.T. Antigen retrieval causes protein unfolding: evidence for a linear epitope model of recovered immunoreactivity // J Histochem Cytochem. 2011. 59 (4). p. 366-381.

48. Fried, M.G., Stickle D.F. Ion-exchange reactions of proteins during DNA binding /7 Eur. J. Biochem. 1993. 218. p. 469-475.

49. Gabdoulkhakov A.G., Timofeev V.I., Mikhailov A.M. Crystal structure of the uridine phosphoiylase from salmonella typhimurium in complex with thymine and phosphate ion at 2.12 A resolution /7 To be published in 2012.

50. Galisteo F., Norde W. Adsorption of lysozyme and a-lactalbumin on poly(styrenesulphonate) latices 1. Adsorption and desorption behaviour /7 Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 1995. 4 (6). p. 375-387.

51. Gao J.Y. Dubin P.L. Binding of proteins to copolymers of varying hydrophobicity // Biopolymers. 1999. 49 (2). p. 185-193.

52. Gebauer M. and Skerra A. Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics /7 Current Opinion in Chemical Biology. 2009. 13 (3). p. 245-255.

53. Gong J., Yao P., Duan H., Jiang M., Gu S., Chunyu L. Structural transformation of cytochrome c and apo cytochrome c induced by sulfonated polystyrene H Biomacromolecules. 2003. 4 (5). p. 1293-1300.

54. Gummel J., Boue F., Deme B., Cousin F. Charge stoichiometry inside polyelectrolyte-protein complexes: a direct SANS measurement for the PSSNci-lysozyme system H J Phys Chem B. 2006. 110 (49). p. 24837-24846.

55. Hallberg R.K. and Dubin P.L. Effect of pH on the binding of ft-Lactoglobulin to sodium polystyrenesulfonate H J. Phys. Chem. B. 1998. 102 (43). p. 8629-8633.

56. Halskau 0., Muga A., Martinez A. Unking new paradigms in protein chemistry to reversible membrane-protein interactions /7 Curr Protein Pept Sci. 2009. 10 (4). p. 339-359.

57. Huang H., He P., Hu N. Zeng Y. Electrochemical and electrocatalytic properties of myoglobin and hemoglobin incorporated in carboxymethyl cellulose films // Bioelectrochemistry. 2003. 61(1-2). p. 29-38.

58. Ivinova O.N. Izumrudov V.A., Muronetz V.I., Galaev I.Y., Mattiasson B. Influence of complexing polyanions on the thermostability of basic proteins /7 Macromolecular Bioscience. 2003. 3 (3). p. 210-215.

59. Jarvis N.L. and Scheiman M.A. Surface potentials of aqueous electrolyte solutions //' J. Phys. Chem. 1968. 72. p. 74-78.

60. Jencks W.P. Catalysis in Chemistry and linzymology H Dover, Mineola, NY. 1987. p. 358392.

61. Jing-jing Liu, Yun-feng Yan, Ping Yao. Binding of thermo-sensitive and pH- sensitive butylated poly(allylamine)s with lysozyme // Chinese Journal of Polymer Science. 2011. 29 (4). p. 397-406.

62. Kaibara K., Okazaki T., Bohidar H.B., Dubin P.L. pH-Induced Coacen'ation in Complexes of Bovine Serum Albumin and Cationic Polyelectrolytes //' Biomacromolecules. 2000. 1. p. 100-107.

63. Khan M.K., Rahaman H., Ahmad F. Conformation and thermodynamic stability of pre-molten and molten globule states of mammalian cytochromes-c I! MetalLomics. 2011. 3 (4) p. 327338.

64. Khechinashvili N.N., Volchkov S.A., Kabanov A.V., Barone G. Thermal stability of proteins does not correlate with the energy of intramolecular interactions // Biochim Biophys Acta. 2008. 1784(11). 1830-1834.

65. Kinraide T.B., and Wang P. The surface charge density of plant cell membranes (a): an attempt to resolve conflicting values for intrinsic a H Journal of Experimental Botany. 2010. 61 (9). p. 2507-2518.

66. Lee B. The physical origin of the low solubility ofnonpolar solutes in water // Biopolymers. 1985. 24. p. 813-823.

67. Levitsky D.i., Ponomarev M.A., Geeves M.A. Shnyrov V.L., Manstein D.J. Differential scanning calorimetric study of the thermal unfolding of the motor domain fragments of Dictvostelium discoideum myosin ////Eur J Biochem. 1998. 251(1-2). p. 275-280.

68. Li T., Hamdi J., Hawthorne F. M. Unilamellar liposomes with enhanced boron content H Bioconjug. Chem. 2006. 17. p. 15-20.

69. Liang B., Tamm L.K. Structure of outer membrane protein G by solution NMR spectroscopy //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. 104. p. 16140-16145.

70. Madan B. and Lee B. Role of hydrogen bonds in hydrophobicity: the free energy of cavity formation in water models with and without hydrogen bonds // Biophys. Chem. 1994. 51. p. 279289.

71. Manfredo J. Seufferheld and Matias J. Curzi Recent discoveries on the roles of polyphosphates in plants /'/Plant Mol Biol Rep. 2010. 28 (4). p. 549-559.

72. Manning G.S. Limiting taws and counterion condensation in polyelectrolyte solutions. I. Colligativeproperties // J. Chem. Phys. 1969. 51. p. 924-933.

73. Marky N.L. Manning G.S. An interpretation of small-ion effects on the electrostatics of the lambda repressor DNA complex H J. Am. Chem. Soc. 2000. 122. p. 6057-6066.

74. Marsich E., Borgogna M., Donati I. Mozetic P., Strand B.L., Salvador S.G., Vittur F., Paoletti S. Alginate/lactose-modified chitosan hydrogels: a bioactive biomaterial for chondrocyte encapsulation /7 J Biomed Mater Res A. 2008. 84 (2). p. 364-376.

75. Mazoniene E. Joceviciute S., Kazlauske J., Niemeyer B., Liesiene J. Interaction of cellulose-based cationic polyelectrolytes with mucin // Colloids Surf B Bio interfaces. 2011. 83(1). p. 160-164.

76. McDevit W.F. and Long F.A. The activity coefficient of benzene in aqueous salt solutions // J. Am. Chem. Soc. 1952. 74. p. 1773-1777.

77. Mehler E.L. A self-consistent, free energy based approximation to calculate pH dependent electrostatic effects in proteins H J. Phys. Chem. 1996. 100. p. 16006 -16018.

78. Mehler E.L., Eichele E. Electrostatic effects in water accessible regions of proteins // Biochemistry. 1984. 23. p. 3887-3891.

79. Mehler E.L., Fuxreiter M., Simon I., Garcia-Moreno E.B. The role of hydrophobic microenvironments in modulating pKa shifts in proteins // Proteins. 2002. 48 (2). p. 283-292.

80. Mehler E.L., Guarnieri F. A self-consistent, microenvironment modulated screened coulomb potential approximation to calculate pH-dependent electrostatic effects in proteins II Biophysical Journal. 1999. 75. p. 13-22.

81. Merrill G.N., Webb S.P. The Application of the Effective Fragment Potential Method to Molecular Anion Solvation: A Study of Ten Oxyanion- Water Clusters, A-(H20ji-4 // J. Phys. Chem. A. 2004. 108. p. 833-839.

82. Mino T., Van Loosdrecht M.C.M., and Heijnen J.J. Microbiology and biochemistry of the enhanced biological phosphate removal process // Wat. Res. 1998. 32. p. 3193-3207.

83. Moss J.M., VanDamme M.P., Murphy W.H., Preston B.N. Dependence of salt concentration on glycosaminoglycan-lysozyme interactions in cartilage II Arch. Biochem. Biophys. 1997. 348. p. 49-55.

84. Mutch N.J., Myles T., Leung L.L., Morrissey J.H. Polyphosphate hinds with high affinity to exosite II of thrombin ¡1 J Thromb Haemost. 2010. 8 (3). p. 548-555.

85. Nakamura S., Seki Y., Katoh E , Kidokoro S. Thermodynamic and structural properties of the acid molten globule state of horse cytochrome c 11 Biochemistry. 2011. 50 (15). p. 3116-3126.

86. Olano J., Arriaga D., Busto F., Soler J. Kinetics and thermostability of NADH-isocitrate dehydrogenase from Cephalosporium acremonium 11 Appl. Enviromental Microbiol. 1995. 61. p. 2326-2334.

87. Paddeu S. Fanigliulo A. Lanzin M., Dubrovsky T., Nicolini C. H Sens. Actuators 1995. 25. p. 876-882.

88. Palankar R., Skirtach A.G., Kreft O. Controlled Intracellular Release of Peptides from Microcapsules Enhances Antigen Presentation on MHC Class I H Molecules. Small. 2009. 5 (19). p. 2168-2176.

89. Park S.J., Borin B.N., Martinez-Yamout M.A., Dyson H.J. The client protein p53 adopts a molten globule-like state in the presence of Hsp9011 Nat Struct Mol Biol. 2011. 18 (5). p. 537-41.

90. Permyakov S.E., Pershikova I.V., Zhadan A.P. Conversion of Human a-lactalbumin to an Apo-like State in the Complexes with Basic Poly-Amino Acids: Toward Understanding of the

91. Molecular Mechanism of Antitumor Action of HAMLET // J. Proteom. Research. 2005. 4 (2). p. 564-569

92. Petrov A.I., Volodkin D.V., Sukhorukov G.B. Protein-calcium carbonate coprecipitation: a tool for protein encapsulation //Biotechnol Prog. 2005. 21 (3). p. 918-925.

93. Pflugrath J.W., Quiocho F.A. Sulphate sequestered in the sulphate-binding protein of Salmonella typhimurium is bound solely by hydrogen bonds // Nature. 1985. 314 (6008). p. 257260.

94. Phillips C., Gover S., Adams M.J. Structure of 6-phosphogluconate dehydrogenase refined at 2 A resolution // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1995. 51 (3). p. 290-304.

95. Polozov R.V. Montrel M., Ivanov V.V., Melnikov Y., Sivozhelezov V.S. Transfer RNAs: electrostatic patterns and an early stage of recognition by synthetases and elongation factor EI'-Tu // Biochemistry. 2006. 45 (14). p. 4481-4490.

96. Pratt L.R. and Pohorille A. Theory of hydrophobic!ty: transient cavities in molecular liquids I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. 89. p. 2995-2999.

97. Rivera-Gil P., Nazarenus M., Ashraf S., Parak W.J. Intracellular processing of proteins mediated by biodegradable polyelectrolyte capsules H Lett. 2009. 9 (12). p. 4398-402.

98. Romanini D., Braia M., Angarten R.G., Loh W., Pico G. Interaction of lysozyme with negatively charged flexible chain polymers // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007. 857 (1). p. 25-31.

99. Saburova E.A., Dybovskaia Yu.N., Sivezhelezov V.S., Elfamova L.I. The electrostatic contribution to interactions of some engines with polyelectrolytes /7 Biofizika. 2005. 50 (3). p. 423433.

100. Sael L. Kihara D. Detecting local ligand-binding site similarity in nonhomologous proteins by surface patch comparison /7 Proteins. 2012. 80 (4). p. 1177-1195.

101. Saftig P., Schroder B.; Blanz J. Lysosomal membrane proteins: life between acid and neutral conditions /7 Biochem Soc Trans. 2010. 38 (6). p. 1420-1423.

102. Sapay N., Cabannes E., Petitou M., Imberty A. Molecular modeling of the interaction between heparan sulfate and cellular growth factors: bringing pieces together // Glycobiology. 2011. 21 (9). p. 1181-1193.

103. Schellman J.A. A simple model for solvation in mixed solvents. Applications to the stabilization and destabilization of macromolecular structures /7 Biophys Chem. 1990. 37 (1-3). p. 121-40.

104. Schellman J.A. Selective binding and solvent denaturation ii Biopolymers. 1987. 26 (4). p. 549-559.

105. Schreiber G., Keating A.E. Protein binding specificity versus promiscuity H Curr Opin Struct Biol. 2011. 21 (1). p. 50-61.

106. Seyrek E., Dubin P.L., Tribet C, and Gamble E.A. Ionic Strength Dependence of Protein-Polyelectrolyte Interactions //' Biomacromolecules. 2003. 4. p. 273-282.

107. Shalova I.N., Naletova I.N. Saso L., Muronetz V.I., Izumrudov V.A. Interaction of poiyelectroiytes with proteins, 3. Influence of complexing poiycations on the thermoaggregation of oligomeric enzymes // Macromol Biosci. 2007. 7 (7). p. 929-939.

108. Sharp K.A., Nicholls A., Fine R.F. and Honig B. Reconciling the magnitude of the microscopic and macroscopic hydrophobic effects // Science. 1991. 252. p. 106-109.

109. Shen Q.W., Swartz D.R. Influence of salt and pyrophosphate on bovine fast and slow myosin SI dissociation from actin /7 Meat Sci. 2010. 84 (3). p. 364-370.

110. Shenoy D.B., Antipov A. A., Sukhoriikov G.B., Mohwald H. Layer-by-layer engineering of biocompatible, decomposable core-shell structures ii Biomacromolecules. 2003. 4 (2). p. 265-272.

111. Singer P.T., Wu C.W. Kinetics of promoter search by Escherichia coli RNA polymerase. Effects of monovalent and divalent cations and temperature II J. Biol. Chem. 1988. 263. p. 42084214.

112. Sivozhelezov V.S, Nicolini C. Homology modeling of cytochrome P450scc and the mutations for optimal amperometric sensor H J. Theor. Biol. 2005. 234 (4). p. 479-485.

113. Sivozhelezov V.S, Pechkova E. Nicolini C. Mapping electrostatic potential of a protein on its hydrophobic surface: implications for crystallization of Cytochrome P450scc !i J. Theor. Biol. 2006. 241 (1). p. 73-80.

114. Skirtach A.G., Dejugnat C.; Braun D. Susha A.S., Rogach A.L., Sukhorukov G.B. Nanoparticles distribution control by polymers: Aggregates versus nonaggregates /7 Journal of Physical Chemistry C. 2007. 111 (2). p. 555-564.

115. Skirtach, A.G., Munoz J.A., Kreft O. Lctser-induced release of encapsulated materials inside living cells // Angew Chem Int Ed Engl. 2006. 45 (28). p. 4612-7.

116. Spassov V.Z., Atanasov B P. Spatial optimization of electrostatic interactions between the ionized groups in globular proteins i! Proteins.P. Struct. Function & Gen. 1994. 19 (3). p. 222-229.

117. Spassov V.Z., Karshikov A.D., Atanasov B.P. Electrostatic interactions in proteins: theoretical analysis oflysozyme ionization // Biochim. Biophys. Acta. 1989. 999. p. 1-6.

118. St-Jean ML, Sygusch J. Slereospecific proton transfer by a mobile catalyst in mammalian fructose- 1,6-bisphosphate aldolase // J Biol Chera. 2007. 282 (42). p. 31028-31037.

119. Stephen J.L., Donald J.W. Fffects of phosphate on the dissociation and enzymic stability of rabbit muscle lactate dehydrogenase /7 Biochemistry. 1974. 13 (17). p. 3527- 3531.

120. Sukhorukov G.B., Rogach A.L., Garstka M. Multifunctionalized polymer microcapsules: novel tools for biological and pharmacological applications //Small. 2007. 3 (6). p. 944-955.

121. Sundelacruz S., Levin M., Kaplan D.L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation ii Stem Cell Rev and Rep. 2009. 5. p. 231-246.

122. Sureka K., Dev S., Datta P., Singh A.K., Dasgupta A., Rodrigue S. Basil J. Kundu M. Polyphosphate kinase is involved in stress-induced mprAB-sigE-rel signalling in mycobacteria //' Mol Microbiol. 2007. 65 (2). p. 261-276.

123. Tang E., Tommaso D.D. and de Leeuw N.H. Hydrogen transfer and hydration properties of H„PO/~" (n-0-3) in water studied by first principles molecular dynamics simulations // The journal of chemical physics. 2009. 130. Published online 234502.

124. Tolstoguzov VB.P. Protein-polysaccharide interactions /7 Food Science and Technology. 1997. 80. p. 171-198.

125. Tribet C.P. Complexation between amphiphilic polyelectrolytes and proteins: from necklaces lo gels // In Physical Chemistry of Polyelectrolytes. Edited by Radeva T. New York. P. Marcel Dekker Inc. 2001.

126. Tricot i\l. Comparison of experimental and theoretical persistence length of some polyelectrolytes at various ionic strengths // Macromolecules. 1984. 17. p. 1698-1704.

127. Turro N.J., Okubo T. Intramolecular excimer formation in aqueous solutions of sodium poly(styrenesulfonate) //J. Phys. Chem. 1982. 86 (9). p. 1485-1497.

128. Wang C„ Luo X., Zhao Y„ Han L„ Zeng X.: Feng M„ Pan S„ Peng H., Wu C. Influence of the polyanion on the physico-chemical properties and biological activities of polyanion/DNA/polycation ternary polypiexes // Acta Biomater. 2012. Epub ahead of print.,

129. Warshel A. Calculations of enzymatic reactions: calculations of pKa, proton transfer reactions, and general acid catalysis reactions in enzymes //' Biochemistry. 1981. 20 (11). p. 31673177.

130. Wojtzak L., Nalecz M.J. Surface charge of biological mem- branes as a possible regulator of membrane-bound enzymes H Eur. J.Biochem. 1979. 94. p. 99-107.

131. Yu Y., Song C., Zhang Q., DiMaggio P.A., Garcia B.A., York A., Carey M.F., Grunstein M. Historie H3 lysine 56 methylation regulates DNA replication through its interaction with PCNA // Mol Cell. 2012. 46(1). p. 7-17.

132. Автор выражает глубокую признательность и благодарность своему научному руководителю д.б.н. Сабуровой Екатерине Андреевне за предоставленную возможность работать вместе, а также за постоянную и разностороннюю помощь в ходе подготовки диссертации.

133. Слова благодарности за постоянное внимание к работе и ценные консультации автор выражает руководителю сектора физической химии биополимеров к.б.н. Шабарчиной Людмиле Ивановне.

134. Хочу сказать слова благодарности сотруднику к.ф.-м.н. Емельяненко Виктора Ивановича за обсуждение результатов работы.

135. Выражаю глубокую благодарность своим родным, друзьям и близким за моральную поддержку, терпение и всестороннюю помощь.

Информация о работе

Дурденко, Екатерина Владимировна
кандидата биологических наук
Пущино, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Структурно-функциональные особенности белков в комплексах с полиэлектролитами и полиэлектролитными микрокапсулами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы