Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные аспекты терапевтического действия корковых нейротрофических факторов при экспериментальном геморрагическом инсульте

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные аспекты терапевтического действия корковых нейротрофических факторов при экспериментальном геморрагическом инсульте"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ

на правах рукописи

003057122

Голобородько Евгений Владимирович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ КОРКОВЫХ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГЕМОРРАГИЧЕСКОМ ИНСУЛЬТЕ

03 00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2007

003057122

Работа выполнена в Лаборатории ультраструктурных и цитохимических основ условного рефлекса (заведующий -дбн, профессор НС Косицын) Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (директор -дбн, профессор ПМ Балабан)

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Н.С. Косицын

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,

профессор

М.Г. Айрапетянц

Доктор медицинских наук, профессор Ю.В. Урываев

Ведущее учреждение:

Кафедра нормальной физиологии Медицинского факультета Российского университета дружбы народов

Защита состоится 28 марта 2007 г в^} Ц часов на заседании специализированного ученого совета (Д-002.044 01) Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (г. Москва, ул Бутлерова, 5а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИВНД и НФ РАН. Автореферат разослан 27 февраля 2007 г.

Ученый секретарь специализированного совета/у/ /

Доктор биологических наук, профессор /л^^г^о В.В. Раевский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Методический арсенал, сформировавшийся в современной нейробиологии, позволяет достаточно полно изучать особенности возникновения и развития процесса нейродегенерации Одним из способов изучения структуры и функции мозга в норме и патологии является использование экспериментальных моделей заболеваний, в основе которых лежит поражение структурных элементов нервной ткани (Karwacki Z, 2006, MacLellan С., 2006, Gharbawie О, Whishaw 1, 2006) Частной задачей таких исследований является поиск лекарственных средств, обладающих нейропротекторным эффектом, которые могут применяться при коррекции поражений ткани мозга

Сосудистые заболевания головного мозга среди всех причин смерти населения вышли в России на второе место (после кардиоваскулярных заболеваний), а также на первое место, как причина стойкой утраты трудоспособности 10% больных становятся тяжелыми инвалидами, многие из них нуждаются в посторонней помощи (Скворцова В И., Крылов В В., 2005)

Среди них выделяют инсульт ишемический (в основе его патогенеза лежит резкое снижение притока крови) и геморрагический (вследствие внутримозгового кровоизлияния) По данным международных мультицентровых исследований, преобладают ишемические поражения мозга (соотношение ишемического и геморрагического инсультов составляет в среднем 85% и 15%) (Завалишин ИА, Захарова М Н, 1999). Однако геморрагическая форма протекает более тяжело, чем ишемическая, характеризуется более высокой смертностью (50% всех заболевших), трудностью реабилитации и более высокой степенью инвалидизации больных (88%) К концу первого года после инсульта из-за протекающих в головном мозге постинсультных изменений летальность увеличивается еще на 12-15%

При геморрагическом инсульте происходит прорыв 1фови в вещество мозга и образование внутримозговой гематомы («ядра» инсульта), места тотальной деструкции нервной ткани Прямое механическое сдавливание мозга вокруг гематомы и некоторое влияние Еазоконстрикгорных веществ в излившейся крови приводят к нарушению кровоснабжения окружающей нервной ткани (Warach S, 2003) Таким образом, внутримозговую гематому окружает периинсультная зона пенумбра, в которой инициируется ряд процессов, приводящих в прогрессирующей гибели структурных элементов нервной ткани (White В, 2000) Последние исследования позволили раскрыть ряд общих механизмов гибели нервных клеток, лежащих в базисе не только инсульта, но и ряда нейродегенеративных заболеваний. К этим механизмам относят «эксайтотоксичность» - токсическое действие на нейроны повышенных концентраций возбуждающих аминокислот, «оксидантный стресс» - повреждение мембран нейронов активными формами свободных радикалов кислорода и продуктов перекисного окисления липидов, а также инициация апоптоза (Nakamura Т, 2005, Goldstein L, 2003, White В , 2000) Нейропротекция поражений структурных элементов нервной ткани в пенумбре, направленная на увеличение их выживаемости, снижает выраженность функциональных последствий кровоизлияния

Наиболее часто встречаемое место локализации гематом стриатокапсулярная зона (Frost S, 2006, Kumon Y, 1996) Внутренняя капсула, входящая в ее состав, является своеобразным коллектором, через который проходят связи коры больших полушарий головного мозга с нижележащими структурами В связи с этим при локализации гематомы в области внутренней

капсулы нарушения двигательной сферы более выражены, чем при поражении соответствующих первичных двигательных зон коры

Область внутренней капсулы в комплексе с другими структурами мозга почти всегда подвергается патологическому воздействию и при моделировании экспериментальной гипоксии/ишемии (окклюзия средней мозговой артерии, перинатальная асфиксия) (Не Z, 2000, Не Z, 1999, Iizuka Н, 1989) Кроме того, известно, что нейроны стриатокапсулярной зоны являются высокочувствительными к гипоксическому/ишемическому воздействию клеточными структурами головного мозга (Schabitz W, 2000, Pulsinelli W, 1982) Несмотря на это, большинство экспериментальных работ по изучению постинсультных дегенеративных процессов проводятся на примере других структур, в частности, полей CAI и САЗ гиппокампа В одном из наиболее известных обзоров по ишемии (Lipton Р, 1996), процесс дегенерации структурных элементов нервной ткани описан на их примере. Особенности морфологических изменений в других областях мозга, в частности, в области внутренней капсулы, остаются малоизученными. Кроме этого, данные о структурных изменениях в области внутренней капсулы, возникающих вследствие экспериментального геморрагического а не ишемического инсульта, практически отсутствуют В связи с этим изучение особенностей структурных изменений и динамики функциональных последствий в результате моделирования локального поражения в области внутренней капсулы представляется особенно актуальным

Большее число существующих методов моделирования геморрагического инсульта, по мнению Gharbawie (2006), не дает возможность проводить изучение динамики улучшения функционального статуса животных в кратчайшие сроки после операции Модель локального экспериментального геморрагического инсульта, позволяющая проводить такую оценку, может также стать и моделью для доклинических испытаний лекарственных средств, обладающих протекторными свойствами (MacLellan, 2006)

Из практики нервных болезней известно, что возникающий в ходе перенесенного инсульта неврологический дефицит не всегда напрямую связан с пораженной областью Описаны случаи возникновения клинически значимых симптомов и синдромов, связанных с функциональными изменениями в удаленных зонах мозга по типу диахизиса (Flint АС, 2006) Диахизис - частный случай пластичности мозга, феномен, обозначающий появление функциональных изменений в областях мозга анатомически или функционально связанных с патологическим очагом (Monakow, 1914) (в результате снижения афферентного притока из разрушенной области) По мнению Paradowski В (2005) возникновение изменений по типу диахизиса является неотъемлемой частью генеза многих нейродегенеративных заболеваний. Кроме этого, в настоящее время рядом авторов предлагается использование клинической оценки диахизиса в практической неврологии (Duffau Н, 2006) Таким образом, актуальной представляется задача оценки наличия и выраженности структурных изменений в связанных с инсультным очагом (внутренняя капсула) анатомическими связями отдаленных областях (кора больших полушарий головного мозга)

Принимая во внимание полимодальную картину геморрагического инсульта, для его лекарственной коррекции, по мнению White et al (2000), необходим политерапевтический подход, направленный кроме увеличения выживаемости нейронов на инициацию пластичных перестроек в здоровой ткани, приводящих к

компенсации приобретенного неврологического дефицита Возможно, поэтому ни один из используемых в настоящее время при лечении инсульта узкоспециализированных лекарственных препаратов (по данным American Heart Association, 1997), не обладает клинически выраженными нейропротекторными свойствами

Качественно новым подходом к лечению геморрагического инсульта может стать использование нейротрофических факторов мозга (Nicole 0, 2001) Нейротрофины - эндогенные пептиды головного мозга, участвующие в контроле процессов физиологического развития нейронов, сохранения структурной и функциональной целостности нервных или глиальных клеток Различные факторы роста, обеспечивающие трофическую поддержку нейронов, проявляют защитное действие на моделях повреждения нейронов in vitro (Hutter-Paier В, 1998) Существенной представляется нейропротекгорная роль нейротрофинов в процессах, связанных с дегенерацией нервной ткани (Dechant G, 2002) Однако, в настоящее время ни один из препаратов, обладающих нейротрофической активностью не введен в клиническую практику Одна из причин заключается в том, что такие молекулы не в состоянии проникать через гематоэнцефалический барьер С этим связана необходимость применения инвазивных терапевтических стратегий, например, инфузии препарата непосредственно в желудочки головного мозга

Будучи высоколабильным образованием, кора больших полушарий головного мозга при определенных условиях может повышать лабильность подкорковых центров (И П. Павлов, 1932, П.К Анохин, 1964, В.Н Казаков, П.Я. Кравцов, 1978) В связи с этим было высказано предположение, что при действии экстремальных или патологических факторов в коре больших полушарий головного мозга может происходить индукция выработки ряда факторов, обладающих протекторными свойствами (Батрак ГЕ, 1981). Из данных литературы известно, что нейротрофины и пептидные факторы активно синтезируются при экспериментальной мозговой травме и внутримозговой геморрагии (Rosenberg et al, 1992, Kawamata et al ,1996, Xue, Del Bigio, 2000) В ходе предварительно проделанной работы (Макаренко АН, 1998) в нашей лаборатории была разработана методика получения вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт В дальнейшем, было показано, что на модели культуры нейронов m vitro эта вытяжка увеличивала выработку мРНК ФРН и синтез этого нейротрофического фактора (Макаренко АН, 2004) В настоящем исследовании на модели экспериментального геморрагического инсульта в области внутренней капсулы нами также оценивалась выраженность нейропротекгорного эффекта вытяжки из коры головного мозга животных успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, что может явиться основой для разработки нового лекарственного средства для терапевтической коррекции постинсультных состояний головного мозга.

Цель работы: структурно-функциональный анализ нейропротекгорного действия вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, на модели данной цереброваскулярной патологии

Задачи работы:

1 Структурная характеристика особенностей нейродегенеративных процессов при экспериментальном геморрагическом инсульте

2 Оценка функциональных последствий моделирования локального кровоизлияния в области внутренней капсулы

3 Структурно-функциональная характеристика эффективности и особенностей нейропротекгорного действия вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, на модели данной патологии.

4 Исследование выраженности противоинсультного действия отдельных фракций исследуемой вытяжки

Положения, выносимые на защиту:

1 На модели экспериментального геморрагического инсульта показано, что нейродегенерация в периинсультной зоне заключается в прогрессирующей дегенерации нейронов и их отростков Наиболее уязвимыми клеточными структурами являются мелкие нейроны вне зависимости от их гистохимического субтипа

2 Функциональные изменения, происходящие после моделирования геморрагического инсульта обусловлены как гибелью нейронов в периинсультной зоне, так и дегенеративными изменениями в отдаленных областях головного мозга (кора больших полушарий), связанных с зоной поражения.

3 Вытяжка из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, обладает эффективным противоинсультным действием, приводящим к компенсации функциональных последствий инсульта, оказывая нейропротекгорное действие в периинсультной зоне и купируя нейродегенеративные процессы в отдельных компонентах нервной клетки в отдаленных областях головного мозга (кора больших полушарий), связанных с зоной поражения Обоснована перспективность ее дальнейшего фракционирования с целью выделения нового противоинсультного моновещества

Научная новизна работы: В ходе проведенных исследований нами впервые было показано, что уровень гибели нейронов в областях мозга, прилежащих к очагу экспериментального геморрагического инсульта в большей степени зависит от размеров их клеточных тел Уже через 24 часа после операции наблюдалось достоверное снижение количества в основном мелких нейронов в периинсультной области, которое продолжало снижаться вплоть до 21 дня после операции Нами также было выявлено отсутствие корреляционной взаимосвязи между типологической принадлежностью нейронов, определяемой методом

иммуногистохимического анализа, и величиной их гибели в пенумбре экспериментального геморрагического инсульта

При моделировании геморрагического инсульта в области внутренней капсулы нами были описаны морфологические изменения в области головного мозга, отдаленной от очага инсульта (кора больших полушарий) Так, при локализации гематомы в области внутренней капсулы, нами наблюдалось снижение числа шипиков на апикальных дендритах пирамидных нейронов V слоя сенсомоторной коры больших полушарий головного мозга

Изменения структурных компонентов нервной ткани при моделировании локального кровоизлияния в области внутренней капсулы приводили к следующим функциональным последствиям, в начальном угнетении ориентировочно-исследовательской и двигательной активности крыс, которая нарастала по 3 неделю включительно и переходила в гиперактивность (тест «открытое поле») Двигательная гиперактивность крыс совпадала со снижением латентного периода условного рефлекса пассивного избегания, что говорило о нарушении тормозных процессов Тонкие манипуляционные движения нарушались и к 3 неделе постинсультного периода полностью не восстанавливались

По динамике морфологических и поведенческих последствий локального кровоизлияния в области внутренней капсулы была показана эффективность применения в качестве терапевтического средства, обладающего выраженными нейропротекторными и нейромодуляторными свойствами, вытяжки из коры больших полушарий головного мозга животных, успешно перенесших геморрагический инсульт Нами было проведено четыре серии экспериментов по фракционированию вытяжки с последовательным выделением фракции, обладающей наиболее выраженным протекторным действием, для дальнейшего разделения В результате была получена субфракция, состоящая из ограниченного числа компонентов, которая перспективна для выделения нового моновещества, обладающего протекторными свойствами

Полученные данные позволяют расширить существующие представления о нейродегенеративных изменениях, протекающих при геморрагическом инсульте Они также позволяют подтвердить гипотезу о противоинсультном, в частности, нейропротекгорном действии вьггяжки из коры больших полушарий головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт и показывают перспективность ее последовательного фракционирования с целью получения нового противоинсультного моновещества Кроме того, полученные данные позволяют расширить представления о функционировании коры больших полушарий головного мозга при экстремальных воздействиях и различных видах патологии

Практическая ценность работы. Вытяжка из коры больших полушарий головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, обладающая (по результатам настоящего исследования) выраженным нейропротекторным эффектом, может найти применение в клинической неврологии в качестве терапевтического средства при лечении геморрагического инсульта Полученные данные о нейропротекгорном действии отдельных компонентов вытяжки позволяют сделать заключение о перспективности продолжения данной работы с целью получения нового моновещества, которое также может найти применение в практической медицине

Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс кафедры высшей нервной деятельности МГУ, анатомии и физиологии МПТУ

Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на Конференции молодых ученых по проблемам высшей нервной деятельности, посвященной 90-летию со дня рождения чл -корр. АН и АПН СССР Л.Г. Воронина (Москва, 1998); Второй российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии, экспериментальной и клинической медицины» (Орел, 2001), XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004), Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004) (работа отмечена дипломом конференции), 14-ой Международной конференции по нейрокибернетике, посвященной 60-летию победы советского народа в Великой Отечественной войне и 90-летию Ростовского государственного университета (Ростов-на-Дону, 2005), Международной конференции "Колосовские чтения - 2006" (Санкт-Петербург, 2006) и на научных конференциях молодых ученых Инстшута высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН в 2002,2003,2004,2005 и 2006 гт

Результаты работы были использованы в докладе на Общем собрании ОБН РАН, 2006 и представлены к публикации в сборнике-справочнике «Отделение биологических наук РАН в 2005 году. Основные результаты научных исследований»

Диссертация апробирована на совместном заседании группы ультраструктурных и цитохимических основ условного рефлекса, лаборатории функциональной нейроморфологии, группы общей физиологии временных связей, группы экспериментальной патологии и терапии ВНД Института 29 ноября 2006 года

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, из них 2 статьи в реферируемых журналах

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и иллюстрирована 33 рисунками Список литературы включает 106 наименований отечественной и зарубежной литературы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объект и методы исследования.

Эксперименты проводились на 223 крысах-самцах линии Вистар массой 200300 г согласно Директивы Совета Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) об использовании животных в экспериментальных целях

Экспериментальная часть работы состояла из следующих блоков-структурная характеристика специфики нейродегенеративных процессов при экспериментальном геморрагическом инсульте, оценка функциональных последствий моделирования локального кровоизлияния в области внутренней капсулы, структурно-функциональная характеристика эффективности и специфики

нейропротекгорного действия вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, на модели данной патологии, исследование выраженности противоинсультного действия отдельных фракций исследуемой вытяжки

У 131 крысы в области внутренней капсулы (координаты (#=4 мм, ¿=3 О мм, А=-15 мм) от брегмы по атласу РахтоБ О е1 а1) под нембуталовым наркозом в доминантном полушарии моделировался биполушарный геморрагический инсульт по методу, разработанному в нашей лаборатории (А Н. Макаренко, 2001) Суть данного метода заключалась во введении в ткань мозга через направляющую иглу-канюлю мандрена-ножа, с помощью которого производилась механическая деструкция нервной ткани в очаге поражения Затем, через эту же канюлю через 23 мин гамильтоновским шприцем вводилась аутокровь животного, взятая из хвостовой вены в количестве 0 1-0 14 мл, в область деструкции мозговой ткани Используемый подход позволял смоделировать базисные патогенетические составляющие геморрагического инсульта масс-эффекг излившейся крови, действие продуктов ее распада и периинсультное воспаление К числу достоинств данного метода можно также отнести его стереотаксичностъ и возможность моделировать поражение определенного малого объема, позволяющего определить динамику восстановительных процессов в максимально короткий срок (рис 1)

а в

Рисунок 1. Принципиальная схема устройства для моделирования локального кровоизлияния в образования мозга (А -устройство в положении с выдвинутым мандреном-ножом 1 - вольфрамовый мандрен - нож, 2 -направляющая игла - канюля, 3 - держатель стереотаксического прибора, 4 - фиксатор верхнего участка мандрена - ножа, 5 - режущий нижний конец мандрена-ножа, 6 — введение аутокрови Б—устройство в положении, при котором оно погружается в структуры мозга)

Остальные 52 животных служили ложнооперированным контролем У них также производилось рассечение кожных покровов, трепанация черепа с последующим введением канюли, но без употребления мандрена-ножа и без введения аутокрови

Нами определялись наличие, выраженность и специфичность нейропротекгорного действия факторов, индуцируемых в коре больших полушарий головного мозга животных в результате успешно перенесенного патологического процесса, протекающего с поражением нервной ткани В течение недели до операции все крысы приучались к интраназальным и внутрибрюшинным инъекциям Затем, в течение 10 дней после операции 1 раз в день внутрибрюпшнно (2 мл/кг) и интраназально (0,05 мл) животным вводился супернатант гомогената вытяжки из коры больших полушарий головного мозга свиней, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт Терапевтическая эффективность исследуемой вытяжки анализировалась в сравнении с плацебо

(изотонический NaCl), с фракцией вытяжки не обладающей нейропротекгорной активностью и по сравнению с аналогичным по составу препаратом с доказанной эффективностью («Церебролизин»)

Для достижения максимальной концентрации исследуемой вытяжки в головном мозге нами были использованы два разных метода инъекций В норме основным ограничением для системного введения вытяжки является ограниченная проницаемость гематоэнцефалического барьера Однако считается, что в пенумбре геморрагического инсульта она резко возрастает Таким образом, внутрибрюшинное введение исследуемой вытяжки в постинсультный период является обоснованным

Интраназальный способ введения также является способом преодоления ГЭБ Это объясняется возможностью аксонального транспорта веществ по ольфакгорному тракту, взаимодействием с нервными рецепторами в области верхних хоан, диффузией по межклеточному пространству к рецепторам (Domino et al, 2000, Fishbem et al., 2000, Lloyd et al ,2000) Существование такого внесистемного пути доставки позволяет достигать выраженный терапевтический эффект при введении ультрамалых доз нейроактивных лекарственных препаратов (преимущественно гормонов и веществ пептидной природы) (Ашмарин ИП, 1988)

Вытяжка из коры головного мозга свиней, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, в количестве, необходимом для проведения экспериментов, была произведена на опытном производстве предприятия «Днепрофарм», Украина Дальнейшая препаративная наработка и фракционирование вытяжки осуществлялись совместно с Группой аналитической химии белка Института Биоорганической Химии РАН.

После тестирования наличия, выраженности и специфики противоинсультного действия вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, нами изучалось действие фракций и субфракций этой поликомпонентной вытяжки с целью выделения нового противоинсультного моновещества Было проведено четыре серии экспериментов (ni=33, П2=32, пз=33, at=33), в каждой из которых последовательно выбиралась субфракция, обладающая максимальным фармакологическим эффектом

Динамика изменений функционального уровня животных после операции моделирования экспериментального геморрагического инсульта в контроле, при введении исследуемой вытяжки или отдельных ее фракций, а также ложнооперированных животных оценивалась по нижеследующим показателям, которые нормировались по отношению к их предоперационному уровню

Неврологический дефицит определяли один раз в день на протяжении 10 суток после операции в тесте поворота на наклонной плоскости, ходьбы по бревну, растопыривания пальцев конечностей на плоскости, по латентности падения из положения виса на турнике и вычисляли коэффициент по Rosenberg G (1990), с модификацией

Ориентировочно-исследовательская и двигательная активность животных оценивалась в тесте «открытое поле» Животное помещалось в большую прямоугольную камеру (100X100 см) с деревянными стенками высотой 40 см Полом служил лист черного пластика, на который была нанесена решетка, делящая поле на 25 (5X5) равных квадратов Крысу помещали в угол камеры и наблюдали

за ее поведением в течение 5 мин Как только животное вступало на новый квадрат обеими передними лапами, это регистрировалось. Число посещений 16-ти периферийных квадратов (прилегающих к стенкам) регистрировали отдельно от числа посещений 9 внутренних квадратов После 5 мин исследования животное возвращали в клетку Подсчитывалось число посещенных крысой квадратов, число стоек, число замираний животного и их время, число катышков помета (болей) Пол тщательно мыли после каждого теста

Общую исследовательскую активность оценивали в процессе проведения теста "норковый рефлекс". Для этого в цетре каждого квадрата, из которых состояло «открытое поле», было проделано отверстие диаметром 3 см При проведении теста "норковый рефлекс" регистрировалось каждое норковое движение крысы в отверстие для обнюхивания

У животных также оценивали динамику восстановления тонких манипуляционных движений в тесте на сохранность тонких манипуляционных движений передней конечностью (по Whlshaw 1, 1986), так как нарушение координации тонких движений - один из основных исходов геморрагического инсульта у людей. В этом тесте животное помещалось в клетку из металлических прутьев диаметром 2 мм, расстояние между ними составляло 11 мм С наружной стороны на всем протяжении стенки клетки на высоте 4 см от пола располагался лоток с семечками, шириной 6 см и глубиной 1 см Пол клетки был также решетчатый, чтобы крыса в случае выпадения семечка из лапы, теряла ее вовсе Перед каждым проведением теста крысы подвергались 24-часовой пищевой депривации. До операции крыса обучалась доставать лапой семечко в течение 2 тренировок по 1 часу, во время которых в одной клетке находилось по 3 крысы Затем, также до операции, производилась регистрация числа движений лапой и количества съеденных и потерянных семечек Эта процедура повторялась 2 раза по 10 мин, в течение нее в клетке находилось по 1 крысе

Сохранность тормозных процессов оценивалась по времени латентного периода условной реакции пассивного избегания Крыса помещалась в вытянутую пластмассовую камеру с электрифицированным решетчатым полом Стены и потолок одной половины комнаты были выкрашены в черный цвет, а в другой половине они были прозрачны Лампочка мощностью 100 Вт 1фепилась на высоте 40 см над светлой частью камеры Как только крыса вступала в темный отсек при последней попытке ознакомления, подавали удар тока (50 Гц, 1,5 мА в течение 1 с) Затем крысу сразу же переводили в жилую клетку Этап обучения повторялся два раза Для регистрации времени условной реакции пассивного избегания, характеризующего торможение, животное помещали в освещенную половину и устанавливали латентный период входа в темноту Тест заканчивался, когда животное вступало в темный отсек или если животное не делало этого в течение 3 мин

Все исследования, связанные с регистрацией поведения животных проводились в осенне-зимний период в одно и то же время суток (после 16 00)

Схема п роведения поведенческой части исследования

Название теста До операции, день После операции, день

Неврологическое тестирование - 1-10

Открытое поле -13,-7 2, 3,4, 6, 9,11,12,17,21

Тест на сохранность тонких манипуляционных движений -5,-2 5,10,20

Условная реакция пассивного избегания -9 5, 9,20

С целью анализа динамики дегенеративно-регенеративных процессов нами определялись объем инсультного очага, величина гибели нейронов в прилегающих областях, а также морфологические изменения в отдаленных областях головного мозга, характер распределения шипиков на апикальных дендритах пирамидных нейронов V слоя коры больших полушарий Все подсчеты производились двумя независимыми исследователями

Оценку объема инсультного повреждения, динамики нейродегенеративных процессов и контроль топологии очага внутримозговой гематомы производили по фронтальным срезам мозга Мозг крыс фиксировали интракардиальной перфузией 4% раствора параформальдегида на 0,1н фосфатном буфере (рН=7,4), обезвоживали, заливали в парафин и делали срезы на микротоме "Historange" (LKB) толщиной 6 мкм с шагом 200 мкм, после чего срезы окрашивали по методу Ниссля

Оценка морфологических изменений в отдаленных от кровоизлияния областях мозга производилась на 60 цм срезах сенсомоторной области коры головного мозга, окрашенных по методу Гольджи Подсчитывалось среднее число шипиков на 10 цм длины апикального дендрита пирамидного нейрона V слоя коры в интервале от 30 до 500 цм от тела клетки

Нами также оценивалась величина относительной плотности нейронов в периинсультной зоне и их гистохимическая типологизация Для этого у 40 животных (10 - ложнооперированные) в доминантном полушарии в области внутренней капсулы моделировался монополушарный геморрагический инсульт (методику см. выше) Относительная плотность нейронов в периинсультной зоне оценивалась по сравнению с симметричной областью в интакгном (контрольном) полушарии (по Masuda Т, 2006, Del Bigxo М, 1996) Для этого, на окрашенных фронтальных срезах мозга (метод Ниссля, иммуногистохимическое окрашивание) выбирали несколько участков (размером 450x450 цм), расположенных за скоплением клеток глии, окружающих очаг инсульта. Для каждого участка по пропорции рассчитывался процент погибших нейронов по сравнению с симметричным участком в противоположном интакгном полушарии (число нейронов в котором принималось за 100%), полученные значения затем усреднялись (для каждого животного)

Большинство нейронов, локализующихся в стриатокапсулярной зоне -тормозные, ГАМК-эргические Для типологизации нейронов, находящихся в периинсультной зоне, нами производилось иммуногистоцитохимическое окрашивание серийных срезов мозга (толщина 6 цм) антителами к ГАМК, кальбиндину D28k, парвальбумину и соматостатину (основным субтипам ГАМК-эргических нейронов) (Chemicon, Temecula, USA)

Плотность определенного субтипа нейронов в прилежащей к гематоме области подсчитывалась также, как и при окраске фронтальных срезов мозга методом Ниссля (см, выше)

Морфологическую картину оцифровывали на морфометрической установке Axoplan 2 (Zeiss, Германия) Затем реконструировали и вычисляли объем инсультного повреждения с использованием программы KS-300 (Zeiss, Германия) и Image-Pro Plus 3

Полученные поведенческие и морфологические данные были сведены в электронные таблицы Excell, статистический анализ проводили с использованием

программ "Microsoft office Excell 2003" и "Statistica 6 0" Все значения даны в виде mtSEM

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I Структурно-функциональная характеристика нейродегенеративных процессов при экспериментальном геморрагическом инсульте

Операция моделирования геморрагического инсульта осуществлялась стереотаксически путем механического разрушения ткани мозга и локальных кровеносных сосудов в области внутренней капсулы четырьмя-шестью вращательными движениями изогнутого мандрена-ножа, с последующим введением аутокрови животного Этот метод позволяет наиболее полно экспериментально воспроизвести комплекс патологических процессов, возникающих при геморрагическом инсульте, а также дает возможность осуществить мониторинг процессов компенсации утраченных функций в остром и хроническом периоде. Кроме того, универсальность данного подхода состоит в возможности экспериментального выключения различных структур и отделов мозга.

II Структурные изменения в очаге инсульта

Зона геморрагического инсульта захватывала клеточные образования и территорию не только внутренней капсулы, но и расположенных рядом образований стриатума

Через 24 часа после операции вокруг очага кровоизлияния идентифицировался выраженный отек Гематома была окружена валом клеток, в котором различались отдельные клеточные элементы, наблюдались участки скопления интактных и лизированных эритроцитов В пенумбральной области также идентифицировались дегенерирующие пшерхромные нейроны с трудно различимым ядром

Через 21 день после операции в области поражения наблюдали образование лакун, очаги скопления олигодендроцитов, астроцитов и микроглии Также была очевидна большая плотность эндотелиальных клеток, возникшая из-за гиперваскуляризации очага поражения Наблюдали расширение кровеносных сосудов

В области поражения наблюдали ацидофильные нейроны и клетки - "тени" Кроме этого была заметна редукция плотности расположения нейронов в области, прилегающей к очагу поражения, что связано с их дегенерацией. Нами производилась объемная реконструкция очага поражения В среднем, через 21 день после операции, он составлял 2,04 ± 0,65 мм3. Используемая нами модель геморрагического инсульта маленького объема сделала возможным проследить динамику протекающих изменений в максимально короткие сроки

1 2 Структурные изменения в периинсультной зоне

Прогресс геморрагического инсульта зависит от характера нейродегенеративных процессов, происходящих в нервной ткани, окружающей инсультный очаг, в зоне пенумбра В настоящее время вопрос о ее существовании

вокруг внутримозговой геморрагии остается открытым В частности, Pascual et al

(2007), базируясь на данных серийных ЭМРТ снимков больных с геморрагическим инсультом, высказали предположение о том, что развитие патологического процесса вокруг гематомы связано со снижением кровотока в периинсультных областях. В ходе настоящей работы нами была априорно выдвинута и проверена гипотеза о существовании вокруг очага геморрагического инсульта такой зоны пенумбра, в которой возможны дегенерация и гибель нейронов в результате обратимых патологических процессов.

Экспериментальный инсульт в области внутренней капсулы, затрагивал также и некоторые образования стриатума, в частности, globus pallidus и putamen. Для количественной оценки происходящих морфологических изменений мы определяли величину относительной плотности нейронов в прилежащих к гематоме участках этих структур на фронтальных срезах мозга, окрашенных по методу Ниссля. В остром периоде этот коэффициент показывал преимущественно Относительное число дегенерирующих (гиперхром ных) нейронов (рис, 2).

ЮЧ -■■■ - '--- - - ——■ ---—---

-104 '

Рисунок 2, Величина относительной томности нейронов в периинсультной зоне (в %) через 24 часа (п 10) и 21 день (п=!5) после моделирования геморрагического инсульта (А * р< 0,05).

Уменьшение плотности нейронов в периинсультной зоне по сравнению с симметричным участком в интакгном полушарии достоверно наблюдалось уже через 24 часа после операции. Этот процесс носил динамический характер: гибель нейронов продолжалась вплоть до 21 дня после операции.

В научной периодике одной из актуальных и спорных проблем является вопрос о существовании отека вокруг очага геморрагического инсульта. Согласно нашим данным, на него можно дать положительный отвес. Следует обратить особое внимание на то, что снижение относительной плотности нейронов в периинсультной зоне наблюдается уже через сутки после его моделирования. В связи с тем, чго за это время завершение процесса лизиса структурных элементов нервной ткани практически невозможно, косвенно можно предположить, что такое «разрежение» нервных клеток связано с возникновением вокруг' очага инсульта отечных изменений основного вещества нервной ткани (экстрацеллюлярный отек), что наблюдалось и визуально.

Нами было также отмечено, что в основном нейродегенерация затрагивает нейроны с небольшими клеточными телами (площадь центрального сечент < 100 рм2). Результаты подсчетов представлены на рис, 3.

Рисунок 3. Величина относительной плотности нейронов « першшсуаывной зоне (е %) через 24 часа (п=10) и 21 день (п=15) после моделирования геморрагического инсульта (площадь центрального сечения крупных > ¡00 ши'; мелких <:100 шп!) (& р<0,05; *р<0,01)

Основная масса нейронов, составляющих стриатум, с клеточным телом среднего и малого размера, ГАМК-эргические, По специфическим иммуногистохимическим маркерам они могут быть поделены на несколько субтипов. Выделяют нейроны содержащие калбиндин, парвальбумин и соматостатин. В настоящее время высказываются предположения об отличиях в реактивности разных типов ГАМК-эргаческих нейронов к патологическим воздействиям. В частности, предполагается, что нервные клетки стриатума новорожденных крысят, содержащие соматостатин. наименее чувствительны к гипоксии/ишемии (КоЬШаизсг С., 1999). В других исследованиях показано, что в условиях общей гипоксии в стриатуме избирательно уменьшается число калбиндин-нммунореактивных и парвальбумин-иммунореактивных нейронов, а число соматостатин-реактивных нейронов остается неизменным (Ьик К., 2001). Следует заметить, что все эти исследования касаются нарвальбумин-реактивных нейронов среднего размера, имеющих связи вне стриагума. Динамика изменения числа пар вал ьбу м и н-им м у нореакги вн ы х интернейронов малого размера при патологических воздействиях на мозг оставалась неизученной.

Нами была предпринята попытка определения наиболее чувствительных к цсреброваскулярной патологии субтипов нейронов с клеточными телами среднего и малого размеров. С этой целью производилось иммуногистохимическое окрашивание фронтальных срезов мозга крыс, у которых моделировался геморрагический инсульт, антителами к кальбиндику 028к, парвальбумину и сомато стати ну. После этого по пропорции производился подсчет относительной плотности нейронов в периипсультной области по сравнению с симметричным участком в интактном полушарии (количество клеток в котором принималось за 100%) (рис. 4).

кальйикдин 'V парвапьСумин парвальбумин соматостатин "+" крупные '+' мелкие "+"

Рисунок 4. В&тчина относительной плотности различных гистохимических субтипов нервных клеток в периинсультной зоне по сравнению с интактным полушарием, регистрируемая через 24 часа fn=15) и 21 день (п-15) после моделирования геморрагического инсульта (площадь центрального сечения крупных >100 рпГ; мелких < 100 fwf) (* р<0,05: & р<0,01').

Процесс табели различных субтипов нейронов в пери инсультной области носил динамический характер (развивал« к 21 дню после операции). Резистентность нейронов к патологическому воздействию не зависела от их гистохимического субтипа, В частности, парвальбу мин-позитивные нейроны разделяют на две труппы: отростчатые (с клеточными телами среднего размера) и безотростчатые (с клеточными телами малого размера). Согласно полученным данным, мелкие парвальбу ми к-позитивные нейроны страдали в большей степени, чем средние.

Область внутренней капсулы в комплексе с другими структурами мозга почти всегда подвергается патологическому воздействию и при моделировании экспериментальной гипоксии/ишемии (окклюзия средней мозговой артерии, перинатальная асфиксия) (Не Z., 2000; Не Z., 1999; Iizuka Н., 1989). Кроме того, известно, что нейроны сприатокапсулярной зоны являются высокочувствительными к гип о ксическому/й ше ми ч еск ому воздействию клеточными структурами головного мозга (Schabitz W., 2000; Pulsinelii W., 1982). Несмотря на это, большинство экспериментальных работ но изучению постинсультных дегенеративных процессов проводятся па примере другие структур, в частности, полей САЗ и САЗ гиппокампа (из-за удобства количественной оценки). Известно, что мелкие нейроны стриатокапсулирной зоны являются более чувствительными к гипоксическому/ишемическому воздействию клеточными структурами головного мозга (Schabitz W„ 2000; Pulsinelii W„ 1982). Нами было показано, что наиболее реактивно при экспериментальном геморрагическом инсульте реагируют мелкие нейроны области внутренней капсулы вне зависимости от их гистохимического субтипа.

1.3. Структурные изменения в отдаленных областях мозга

Кроме очага инсульта и прилежащих областей нами также анализировались изменения в отдаленных областях мозга. Внутренняя капсула образована отростками пирамидных нейронов сенсом оторн ой области коры больших полушарий. Она является своеобразным коллектором, через который проходят связи коры больших полушарий головного мозга с нижележащими структурами. Б

связи с этим при локализации гематомы в области внутренней капсулы нарушения двигательной сферы более выражены, чем при поражении соответствующих первичных двигательных зон коры. Нами было выдвинуто предположение о наличии также связи между этими структурами по типу диахизиса {поражение одной приводит к функциональным изменениям в другой).

В связи с этим через 21 день после операции моделирования геморрагического инсульта н области внутренней капсулы нами определялись изменения конфигурации и плотности распределения шипиков, наиболее лабильных при патологических воздействиях сгруктурах клетки, расположенных на апикальных дендритах пирамидных нейронов V слоя сенсомоторной области коры больших полушарий. В частности, подсчитывал ас ь плотность их распределения на 10 цм длины дендрита на расстоянии от 30 до 500 рм от тела клетки,

У крыс с экспериментальным геморрагическим инсультом наблюдалось достоверное снижение (по сравнению с л ожноопери ров энными животными) плотности распределения шипиков (рис. 5), кроме того, они становились более удлиненными и тонкими.

Рисунок 5. Плотность распределения шипиков на 10 им длины апикальных дендритов пирамидных нейронов У слоя коры болжих полушарий у ложнооперированных животных (п^-10) и животных с экспериментальным геморрагическим инсультом (п=1Щ через 21 день после операции; (* р<0,01),

1.4. Изменения поведения животных после моделирования геморрагического инсульта:

Характерной чертой динамики изменения ориентировочно-исследовательской активности штатных животных, определяемой в тесте «открытое поле», с течением времени являлось постепенное уменьшение числа посещенных квадратов и норковых движений и дальнейшая стабилизация этих параметров, начиная с 5-го опыта, на уровне 49±12% и 55±7% соответственно от исходного значения (рис. 6,

7).

Животные с экспериментальным геморрагическим инсультом в раннем послеоперационном периоде были малоподвижными, что выражалось в резком уменьшении всех регистрируемых показателей ориентировочно-исследовательской и двигательной активности в тесте "открытое поле": количестве посещенных квадратов (уменьшение на 90±7,4%), стоек, норковых движений. Затем, через 4-6 дней после операции, наблюдалось нарастание с максимумом на 21 день

ориентировочно-исследовательской и общей двигательной активности («гиперактивность») (рис, 6). Практически во всех случаях летальных исходов у животных перед смертью наблюдалась сильно выраженная ги пер активность.

1,6 1,6 1.4 1.2 1 0,8 0,6 0.4 0,2 0

j -0,2

Рисунок 6, Среднее количество квадратов, посменных в тесте «открытое пила» яажнооперировашшми животными '!'' 31) и инсультными (п- 30), нормированное по отношению к дооперационному уровню (><(Ш)

fio оси абпртс - дни '>,■:■ ■■> операции, п ходе коню/юй у крыс моделировался геморрагический инсульт, 17а оси ординат - нормированное по отношению к начальному тестированию число посещенных квадратов

1,6 --------— —■--1 - • пожноогтерн|»аамиь* —......

1 А--- -—¿г-"Инсультные - --- ■

т.г-----——=—--—к

О г 3 4 В 9 11 12 17 21

Рисунок 7. Среднее количество норковых движении, совершенных в тесте «открытое поле», ложнооперировоннымн животными (п~ 31) и инсультными (п= 30), нормированное по отношению к дооперационному уровню (*р<0.05)

По оси абсцисс - дни после операции, входе которой у крыс моделировался геморрагический инсульт, /7о оси ординат - нормированное по отношению к начаынолгу тестированию чисчо норковых движений

В гесте на тонкие шяипуяяционпые движения передней конечностью оценивались два показателя. Первый - общее число движений конечностью, совершенных в кормушку. Второй - отношение количества результативных движений ко всему числу движений конечностью (эффективность)- Показателем обученное™ животных являлось достижение показателем эффективности насыщения с небольшими флуктуациями вокруг константной величины.

У ложнооперированных контрольных животных с течением времени число движений в кормушку и эффективность этих движений в послеоперационном периоде оставалась неизменной (105±4% и 96±\4% соответственно) (рис. 8. 9).

Рисунок 8, Количество тонких манипуляционных движений, совершенных ложноопернрованными животными (п- 31) и инсультными (п= 30), нормированное по отношению к дооперациониому уровню (*р<0.05)

По оси абсцисс - дни после операции, входе которой у крыс моделировался геморрагический инсульт. По оси ординат - нормированное по отношению к начальном)' тестированию число тонких маннпуляционных движений.

1,6 1,4 1.2 1

I

0.8

0,6 0,4

о, г о

- пэжиоопермрованные -инсультные

•к

-----------4----■ г ' - "Х

<. г

Рисунок 9, Отношение количества результативных манипуляцчонных движении к общеиу количеству движении, совершенных ложнпоперированными животны.ми (п 31) и инсультными '/г 30), нормированное по отношению к дооперациониому уровню (*р<005).

По оси абсцисс -дни после операции, в ходе которой у крыс моделировался геморрагический инсульт. По оси ординат - нормированное по отношению к начальному тестированию отношение числа результативных маннпуляционных движений к общем}' 1а количеству,

У животных, у которых моделировался геморрагический инсульт, в послеоперационный период наблюдалось сначала снижение на 38±1%, общего числа движений конечностью, а на 29 день после операции увеличение на 39±1,3%, этих движений сверх нормы. При этом эффективность манипуляций не восстанавливалась до 21 дня после моделирования геморрагического инсульта.

V ложн ооп ериров энных крыс методом пассивного избегания навык торможения вырабатывался к 3-ему предъявлению избегаемого стимула. Этот процесс характеризовался возрастанием латентного времени перехода из светлого отсека экспериментальной камеры в темный, начиная с первого измерения, вплоть до достижения им, на 9 день после операции, максимального значения.

При исследовании динамики выработки рефлекса пассивного избегания у животных, перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, видно, что у них фаза увеличенной двигательной активности (гиперактивность, по данным «открытого ноля»), сопровождалась уменьшением длительности латентных

периодов (рис. 10). Можно предположить, что компенсация сниженной двигательной активности у крыс, перенесших геморрагический инсульт, происходила с явным подавлением тормозных процессов.

О 5 9 20

Рисунок 10, Нормированный ¿рафик величины латентного периода пассивного тбегания ложиоопгрировачных животных (п= 31) и инсультных (п~ 30), нормированное по отношению к дооперационному уровню. Пс> оси аЬсцисс - дни после операция, я ходе которой моделировался эхспериыентаяыыи геморрагическийМНфЯЫЛ, По оси ординат -величиналатентного периода. (р<0.01).

Таким обратом, функциональные последствия инсультного повреждения в области внутренней капсулы заключались в начальном угнетении ориентировочно-исследовательской и двигательной активности крыс, которая нарастала по 3 неделю включительно и переходила в пшерактивностъ (тест «открытое поле»), кроме того, отмечалось уменьшение латентного периода условного рефлекса пассивного избегания, что говорит о приобретенном нарушении тормозных процессов. Тонкие мани пуля ционные движения нарушались и к 3 неделе постинсультного периода полностью не компенсировались.

Можно предположить, что феномен гиперактивности, возникающий у крыс после операции моделирования геморрагического инсульта в области внутренней капсулы связан с гибелью мелких тормозных ГАМК-эргических нейронов, в основном составляющих стриатокапсуахриук» зону и реорганизацией связей между оставшимися нервными клетками.

Проявление гиперактивности может быть также связано с высокой интенс явностью дегенеративно-регенеративных процессов, протекающих в головном мозге животного после экспериментального воспроизведения геморрагическою инсульта. Известно, что повреждение и гибель нейронов, вызываемые инсультом, сопровождаются элиминацией синаптических контактов, что приводит, в частности, к повышенной реактивности постсинаптических элементов к экзогенным возбуждающим факторам.

2. Определение эффективности и специфики нейропротекторного действия вытяжки га коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, а также ее отдельных фракций на модели экспериментальной внутримозговой геморрагии.

Б нашей лаборатории было высказано предположение, что в результате геморрагического инсульта в коре больших полушарий головного мозга может происходить выработка ряда факторов, обладающих нейропротекторными свойствами (Батрак Г.Е., 1981). В настоящей работе после операции

моделирования геморрагического инсульта крысам в течение 10 дней внутр¡1 брюшинно и интраназально вводился супернатант гомогсната вытяжки из коры головного мозга свиней, успешно перенесших данную цереброваскулярпую патологию, также воспроизведенную экспериментально. Специфика проги во инсультного действия исследуемой вытяжки определялась по функциональным и структурным показателям в сравнении с ложнооперированными животными, животными, получавшими плацебо (изотонический ЫаС1) и с животными, получавшими препарат с доказанной эффективностью («Церебролизин»),

2.I. Специфика структурыых изменений при введении вытяжки крысам с экспериментальным геморрагическим инсультом.

Объем инсультного очага, регистрируемый на 21 день после моделирования экспериментального геморрагического инсульта, у животных, получавших вытяжку с предположительно противоинсультным действием, были значительно меньше но сравнению с животными, получавшими плацебо, что говорит о ее нейропротекторном действии (рис. 31).

Рисунок П. Величина среднего объе,ма области инсультного повреждения, регистрируемая на 21 день опыта. Инсультные- контрольная оперированная группа, не поя}>чатиая лечения (п= '■ У; цытялска -геморрагический инсульт при терапевтическом воздействии вытяжки {п " !.5.' ложнооперированные -ложнооперированиые животные (*Р<0.01 « инсультные)

По оси ординат - объем повреждения вммЗ

Клиническая выраженность инсульта и особенности реабилитации зависят от степени сохранности нейронов в периинсультной области. Специфика протекторного действия исследуемой вытяжки оценивалась нами по величине относительной плотности мелких (площадь центрального сечения <100 цм2) нервных клеток в периинсультной зоне на фронтальных срезах мозга, окрашенных методом Ниссля.

При подсчете числа нейронов в острый период после моделирования инсульта было обнаружено статистически значимое различие между контрольной группой и группой животных, которым в течение 10 дней вводилась исследуемая вытяжка. Количество дегенерирующих нейронов было больше у животных с экспериментальным геморрагическим инсультом, которые получали плацебо (Рис.

л.* -

гл J

1А 1

и -■

7 4

^ \ 1.4 -

лохно-оперированны с

* Вытяжка Инсультные

Здяй

21 декь

Рисунок 12. Количество погибших е периинсулътной зояй мелких (ппощайь центрального сечения <100 ц//) нейронов (в процентах) но 3 и 21 день после операции у животных, получавших вытяжку из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт 'V 'V Р<0.01) •'!! 15) и животных, не получавших лечения (п= 15)

В кашей работе мы также проводили сравнение степени выраженности нейропротекторного действия вытяжки из коры больших полушарий толовного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт с фармакологически неактивной фракцией вытяжки и с препаратом с доказанной эффективностью («Церебролизином»). Их нейропротекгорная активность также определялась по величине относительна плотности мелких нейронов в периинсулътной зоне через 21 день после операции моделирования внутримозговой геморрагии. В результате проведенных экспериментов нами было показано (рис. 13), что ежедневное в течение 10 дней внутрибргошиннос введение вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, обладает более выраженным терапевтическим эффектом, чем введение «Церебролизина» или фракции той же вытяжки, не обладающей нецроцрогекторными свойствами.

Инсультные

Фракция 3 (неактивная)

"Церебролизин" Вытяжка

Ртлсун™ 13, в периянсуяыпноп зоне, мелких (тещадь центрального е^чкчич <JШ ^м')

нейронов (в процентах) на 21 день после операции у животных не получавших лечения (*Р<0.05) (п= 15), у животных, получавших фракцию вытяжки, не обладающую нейропротекторной активностью (п~ 7), у животных, получавших препарат «Церебролизин» с доказанной эффективностью (н- 11), у животных, получавших вытяжку из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт 'и - 15)

Поскольку дсндриты и ш и пики на них - наиболее чувствительные при многих патологических заболеваниях участки нервной клетки, то наиболее важной являлась проверка протекторного действия вытяжки именно на эти структуры.

Ежедневное, в течение 10 дней после операции комбинированное интраназальное и внутрибрю шинное введение супернатанта гомогената вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, стабилизировало плотность распределения шипиков на апикальных дендритах пирамидных нейронов V слоя сенсомоторной области корь: больших полушарий головного мозга (рис 14).

|

2

ш 3 § £< I I

ложноогсерированные

авщфовв ; инсультные

вытщка

*"7

Л

I

1 1

зо во 1зо гзо аао эзо зво 4зо 430

расстояние от тела клетки, мкм

Рисунок 14 Плотность распределения шипиков на Ю /ш длины апикальных дендритов пирамидных нейронов коры головного мозга животных, на 21 день после моделирования геморрагического инсульта у ложнооперированных животных (п'~ 10), животных с геморрагическим инсультом, получавших плацебо (л- /О),у жкеотнш с геморрагическим инсультом, получавших исследуемую вытяжку (п^ 7), (*р<0.05 кГ инсультные)

Стабилизация плотности распределения шипиков на апикальных дендритах пирамидных нейронов при действии вытяжки может говорить о наличии репаративных пластических перестроек в участках головного мозга, отдаленных от области поражения.

Таким образом, в опытах на белых крысах на модели экспериментальног о геморрагического инсульта исследована фармакологическая эффективность супернатанта гомогената вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт. По структурным и функциональным показателям было показано выраженное нейропротекторное действие данной вытяжки.

2.2. Функциональные показатели протекторного действия супернатанта гомогената вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт.

Из данных литературы известно, что в экспериментальных исследованиях динамики поведения животных при локализации повреждения в области внутренней капсулы зоны отмечались нарушения двигательной активности, точности движений, повышение тревожности, дефекты долговременной памяти. Однако следует заметить, что динамика этих изменений и ее связь с нарушениями структурной организации пораженных областей мозга остается малоизученной.

В наших исследованиях набор поведенческих методик включал в себя тесты: "открытое иоле" (исследование двигательной и ориентиров очно-исследовательской активности), на тонкие манипуляшкшные движения (в котором крыса доставала семсчки из кормушки через узко расставленные прутья решетки) и пассивное избегание (тест на сохранность тормозных процессов). Поведенческое тестирование проводили с 21 дня до и с 2 по 28 день после моделирования геморрагического инсульта.

В тесте поворота на наклонной плоскости, ходьбы по бревну, растопыривания пальцев конечностей на гладкой поверхности, но латентное™ падения из положения виса на турнике вычисляли коэффициент неврологического дефицита по Rosenberg G. (1990). с модификацией.

Неврологический дефицит, возникавший у крыс после моделирования геморрагического инсульта, снижался быстрее у животных, получавших исследуемую вытяжку, по сравнению с животными, получавшими плацебо (рис. 15).

2 1,5 1

0,5 0

-0,5

"I

- п вытяжка □ инсульт

6 10 I

Рисунок 15. Результаты неврологического тестирования животных с инсультом, получавших исследуемую вытяжку (п- П) и животных с инсультом, получавших плацебо (п= 30). По оси абсцисс дни после операции, по оси ординат - средний они, обратный выраженности нарушений. (* р<0.05/

Вытяжка обладала свойством ускорять процесс компенсации общей двигательной активности, сниженной после воспроизведения экспериментального геморрагического инсульта. При этом общая двигательная активность значительно возрастала в первые дни после операции до 6 дня, а затем к 12 дню достигала предоперационных значений, в отличие от инсультных крыс, получавших плацебо, у которых двигательная активность нарастала вплоть до 2 ] дня.

Следует отметить, что у животных, получавших исследуемую вытяжку, также наблюдалась гиперактивность. Однако эта гиперакгивность (оцениваемая в частности, по числу посещенных квадратов в тесте «открытое поле») достигала максимума уже на 6 день постинсультного периода, а затем нормализовывалась уже к 12-17 дню опыта (рис, 16). Число же "норковых" движений компенсировалось уже к 6 дню (рис. 17).

Рисунок 17. Среднее количество норковых движений, совершенных в тесте «открытое поле», нормированное по отношению к дооперационному уровню (*р<0 05 га инсультные) ложноопери/юванными животными 3;; инсультными ломотными, получавшие плацебо (п- 30), инсультными животными, получавшими исследуемую вытяжку (я= IV

По оси абсцисс - дни после операции, е ходе которой у крыс модеяироеалея геморрагический инсульт. По оси ординат - нормированное по отношению к начальному тестированию число норковых движений

Рисунок 16. Среднее количество квадратов, посещенных в тесте «открытое поле», нормированное по отношению к дооперационному уровню (*р<0.05 щ инсультные) ложнооперированными животные (п= 31), инсультными Ясивотыыми, получавшие плацебо (пш 30), инсультньши животными, получавшими исследуемую вытяжку (п= 17)

По оси абсцисс - йнк посче операции, в ходе которой у крыс моделировался геморрагический инсульт. По оси ординат - нормированное по отношению к начальному тестированию число посеи{ениых квадратов .1,6

Также при введении вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт крысам с моделью данной патологии, происходила компенсация как общего числа движений конечностью, так и эффективности манипуляции к 21 послеоперационному дню (Р<0,05) (рис, 18, 19).

Рисунок 18. Нормированное по отношению к предоперационному уровню количество тонких минипуляционных движений, совершенных ложнооперированнымн животными (п= 31), инсультными животными, получавшие плацебо (п= 30), инсультными животными, получавшими исследуемую вытяяску

(п~ ¡7)

По оси абсцисс дни после операции, и ходе которой у крыс моделировался геморрагический инсульт. По оси ординат - нормированное по отношению к начальному тестированию число тонких минипуляционных движений. (р<0,05 инсультные).

I 1.2 ^—- ЯфЮфапйрИр09йН№1в ■—£— инсультные ——высокие I— |

О 5 10 20

Рисунок 19. Нормированное к предоперационнаму уровню отношение количества результативных манипуляционных движении к общему количеству движений, совершенными ложнооперированнымн животными (п- 31). инсультными животными, получавшими плацебо (п= 30), инсультными животными, получавшими исследуемую вытяжку (п- 17)

По оси абсцисс - дни после операции, в ходе которой)' крыс моделировался геморрагический инсульт. По оси ординат - нормированное по отношению к начальному тестированию отношение число результативных манипуляционных движений к общему их количеству

Следует обратить особое внимание В а постинсуяыную динамику ориентировочно-исследовательской и „двигательной активности в сравнении с Динамикой латентного периода условного избегания у животных, получавших исследуемую вытяжку. Видно, что фаза повышешюей двигательной активности (в тесте «открытое поле» с 4 по 12 день после операции), которая потом нормализуется и не перерастает в гиперакгивноегь, у таких животных совпадает с динамичным увеличением латентного периода условной реакции пассивного избегания (рис. 20). Таким образом, можно предположить, что в процессе компенсации утраченных оперированными крысами функций, в условиях терапии исследуемой выгяжкой, сбалансированно происходит восстановление как

структур, обеспечивающих возбуждение, так и структур, обеспечивающих общее торможение, нарушенных в результате перенесенного инсульта.

Рисунок 20, Нормированный график величины латентного периода пассивного избегшая ложнооперырованных .животных (к- il). инсультных животных, получавшие плацебо (п- 30), инсультных животных, получавших исследуемую вытнжку (п~ 17). По оси абсцисс - дни it операции, в ходе которой моделировался экспериментальный геморрагический инсульт. По оси ординат - изменения величины латентного периода. (р<0.05 vs инсультные)

Следует отметить также, что крысы, получавшие вытяжку из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, более успешно наращивали вес в послеоперационный период (рис. 21).

и.

1 А

Рисунок 21. Динамика изменения веса ложнооперированных животных (п= 31), инсультных животных, получавших тацебо (п- 30), инсультных животных, получавших иссчедуемую вытяжку (п- 17). По оси абсцисс - дни до и после операции. По оси ординат - нормированное по отношению ко дню операции значение въеа крыс. (*р<0.05).

Неравномерность динамики изменения веса у опытных животных объясняется эпизодами пищевой дспривацни, необходимой для тестирования крыс на сохранность тонких манипуляциошшх движений.

Элиминация функциональных последствий перенесенного инсульта нередко встречается и в клинической практике. Она может быть связана с функциональным восстановлением нейронов периинсультной зоны, с переобучением или из-за пластичных перестроек нервной ткани. Современные исследования с использованием гране краниальной магнитной стимуляции и функциональной МРТ подтверждают концепцию о ней р опл асти ч ности, как одном из возможных механизмов компенсации постинсультного двигательного дефицита. В частности, показано, что в результате перенесенного инсульта, затрагивающего первичную

двигательную кору головного мозга, координаты транскраниальной стимуляции, вызывающей приведение кисти, перемещаются в премоторную область. Использование стереотаксических методов выключения отдельных структур головного мозга (в частности, при локальном кровоизлиянии) может также явиться методической базой для экспериментального изучения особенностей пластичных репарационных перестроек (в том числе при лекарственной коррекции нейродегенерации)

Таким образом, при терапевтическом воздействии вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, наблюдалась компенсация сниженной двигательной активности и тонких манипуляционных движений животных к 2-3 неделе постинсультного периода Особенно следует выделить то, что фаза повышенной двигательной активности у этих крыс протекала на фоне сохранности тормозных процессов, что выражалось в увеличенности латентного периода условного рефлекса пассивного избегания

3 Действие отдельных фракций вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт

Нами было показано нейропротекторное действие вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт. Однако точно не известно, какое именно вещество (или вещества), входящие в состав этого поликомпонентного средства, определяют его фармакологическую активность Стоит задача выделения индивидуального вещества содержащегося в препарате, обладающего противоинсультным действием

Совместно с группой аналитической химии белка Института биоорганической химии РАН нами была предпринята попытка последовательного разделения исследуемой вытяжки При этом в экспериментах на белых 1фысах последовательно выделялась фракция вытяжки, обладающая максимальным противоинсультным действием, которая подвергалась дальнейшему разделения Было проведено 4 серии таких экспериментов, 4 последовательных фракционирования, и в результате нами была выделена субфракция, по данным хроматографического анализа состоящая из ограниченного числа компонентов, низкомолекулярных пептидов, молекулярной массой < 500 Да.

При дальнейшей попытке разделения нами был отмечен тот факт, что по динамике изменения поведения в тесте «открытое поле» и тесте на сохранность тонких манипуляционных движений, действие различных фракций вытяжки неодинаково.

Например, у животных, получавших фракцию с максимальным антиинсультным действием, как и при действии вытяжки, наблюдалась следующая динамика Сразу после операции животные были малоподвижными, однако затем развивалась гиперакгивность, которая достигала максимума уже на 6 постинсультный день, а затем угасала до нормальных значений уже к 12-17 дню опыта (рис 22)

У группы животных, получавших другую фракцию вытяжки, ориентировочно-исследовательская активность, определяемая по числу посещенных крысой квадратов в тесте «открытое поле», была ниже и не восстанавливалась вплоть до 21 дня после моделирования геморрагического

инсульта. При этом следует отмстить тот факт, что фаза повышенной двигательной активности, г итеративности, у таких животных отсутствовала.

Рисунок 22. Среднее количество квадратов, посещенных в тесте «открытое поле», ложноопериртанными животными (п"31). инсультными животными, получавшими плацебо (п=30), инсультными животные, получавшие разные фракции исследуемой вытяжки (п-7;8), нормированное по отношению к дооперационному уровню (*р<0.05; активная фракция фракция 2) По оси абсцисс - дни после операции, в ходе которой у крыс моделировался геморрагический инсульт. По оси ординат - нормированное по отношению к начальному тестированию число посещенных квадратов

В тестах на тонкие манииуляционные движения у групп животных, получавших фракции с максимальным антиинсультным действием происходила компенсация как общег о количества движений конечностью, так и эффективности манипуляции к 21 послеоперационному дню.

У групп животных, получавших фракции с минимальным антиинсультным действием, показатели были значительно хуже, чем у вышеописанных групп и по динамике были схожими, как и в тесте "открытое поле".

У остальных групп животных, получавших другие фракции и субфракции препарата, в тестах "открытое поле" и на гонкие мани пуляпиоиные движения наблюдались изменения поведег«ческой активности промежуточного характера, сходные с инсультным контролем или с группами, получавшими фракции, которые усугубляли течение инсультного состояния.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов нами была выделена фракция вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, обладающая максимальным пр оги яоинсультным действием, по данным хроматографического анализа состоящая из пяти компонентов. Продолжение данной работы является перспективным исследованием, целью которою может стать получение нового проти вой ису л ьтного моновещества.

выводы

1 При моделировании по разработанной методике геморрагического инсульта в области внутренней капсулы, морфологические изменения заключались в формировании очага инсультного поражения и прогрессирующей гибели нейронов в периинсультной зоне Устойчивость к дегенерации выше у нейронов с большим диаметром клеточного тела и не зависит от их гистохимического субтипа

2 В отдаленных областях мозга, связанных с областью поражения, наблюдались нейродегенеративные изменения, которые, в частности, выражались в уменьшении количества шипиков на апикальных дендритах пирамидных нейронов V слоя сенсомоторной зоны коры больших полушарий головного мозга

3 Функциональные последствия экспериментального геморрагического инсульта в области внутренней капсулы заключались в начальном угнетении ориентировочно-исследовательской и двигательной активности крыс, которая нарастала по 3 неделю включительно и переходила в гиперактивность (тест «открытое поле») Нарушение тормозных процессов также выражалось в снижении латентного периода условного рефлекса пассивного избегания. Тонкие манипуляционные движения нарушались и к 3 неделе постинсультного периода полностью не восстанавливались

4 Специфика протекторного действия вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, заключается в увеличении резистентности мелких нейронов и в купировании нейродегенеративных процессов в отдельных компонентах нервной клетки (в частности, в дендритических шипиках), что приводило к компенсации сниженной ориентировочно-исследовательской, двигательной активности и тонких манипуляционных движений ко 2-3 неделе постинсультного периода Особенно следует выделить то, что фаза повышенной двигательной активности у этих крыс протекала на фоне сохранности тормозных процессов, что выражалось в увеличенности латентного периода условного рефлекса пассивного избегания

5 Показано, что вытяжка из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, обладает выраженным нейропротекторным действием, а ее некоторые фракции и субфракции перспективны для дальнейшего изучения с целью получения нового противоинсультного моновещества

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 Исследования сохранности функции различения сложных зрительных стимулов у крыс после экстирпации идентифицированного участка «Зоны Лешли» Тезисы молодежной научной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения академика М Н Ливанова М,1997 С 12-13.

2. Феномен локализации высших ассоциативных функций в коре головного мозга крысы («зона Лешли») функциональная топология,

цитоархитектонические особенности и внутрикортикальные связи Материалы конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» М, 1998. С. 85-86

3. Методы изучения изменения функции различения сложных зрительных стимулов после экстирпации идентифицированного участка коры больших полушарий головного мозга крыс Тезисы XVII съезда Всероссийского физиологического общества имени И П Павлова Ростов-на-Дону, 1998 С 64-65. (Совместно с А О Сапецким)

4 Анализ и синтез сложных зрительных стимулов нормальным и поврежденным мозгом 1фысы В сб "Конференция молодых ученых по проблемам высшей нервной деятельности, посвященная 90-летию со дня рождения чл -корр АН и АПН СССР Л Г. Воронина". М, Изд-во "Российское психологическое общество", 1998 С 31-32 (Совместно с А О Сапецким)

5 Структурно-функциональные особенности выработки условного рефлекса на сложные зрительные стимулы Тезисы второй российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии, экспериментальной и клинической медицины» Орел, 2001. С 61-62

6 Experimental hemorrhagic stroke treatment by bram-denved factors m rats 11th Nordic Meeting on Cerebrovascular Diseases, Kuopio, Finland, 2001, В12, p 98 (Совместно с A N Makarenko, N S Kositzyn, M M Svmov, N V Pasikova)

7. Коррекция последствий гипоксических состояний факторами, выделенными из коры больших полушарий мозга. Материалы III Всероссийской конференции «Гипоксия механизмы, адаптация, коррекция», Москва, 2002 С 78 (Совместно с А Н Макаренко, Н С. Косицыным, И В Назимовым, ММ Свиновым)

8 Модель геморрагического инсульта и выделение пептидных факторов для восстановления структуры и функции мозга Колосовские чтения - 2002 IV Международная конференция по функциональной нейроморфологии СПб, 2002 с.52-53. (Совместно с АН Макаренко, НС. Косицыным, ИВ. Назимовым, М М. Свиновым)

9 Коррекция последствий церебрального инсульта факторами, выделенными из коры больших полушарий мозга Материалы IV Международной конференции по восстановительной медицине (реабилитологии). Москва, 2002 С 56 (Совместно с АН Макаренко, НС Косицыным, ИВ Назимовым,ММ Свиновым)

10 Endogenous bram-denvated factors ш hemorrhagic stroke treatments XVth International Congress of Neuropathology Turin, Italy, 2003 P 87 (Совместно с A N. Makarenko, N S Kositzyn, M M Svinov, N V Pasikova).

11 Исследование антиинсультного действия отдельных фракций вытяжки из коры больших полушарий при экспериментальном геморрагическом инсульте у крыс XVI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» 2004 С 79

12 Коррекция ишемического состояния факторами, выделенными из головного мозга животных, перенесших геморрагический инсульт 3-ий Российский конгресс по патофизиологии Тез докл 2004 Стр 214-215 (Совместно с Н.С Косицыным, А Н Макаренко, И В. Назимовым, М М Свиновым)

13. Структурно-функциональные аспекты терапевтического действия корковых нейротрофических факторов при экспериментальном геморрагическом инсульте. Материалы конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» М, 2004 С 107

14 Структурно-функциональные перестройки в конечном мозге при экспериментальном инсульте В сборнике "Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга" 2005 Изд "ИКАР", Стр 149-151 (Совместно с Н С Косицыным, М М. Свиновым)

15 Идентификация новых факторов, оказывающих нейропротекгорное действие при коррекции гипоксических состояний головного мозга IV Российская конференция "Гипоксия механизмы, адаптация, коррекция" // В кн. Гипоксия- механизмы, адаптация, коррекция М/РАМН, ГУ НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН 2005 С58-59. (Совместно с НС Косицыным, ММ Свиновым, А.Н Макаренко, ИВ Назимовым, ОЮ Абакумовой, СВ. Божеваловой)

16 Метод экспериментального инсульта как способ исследования структуры и функции мозга в норме и патологии // Проблемы нейрокибернетики (Материалы 14-ой Международной конференции по нейрокибернетике, посвященной 60-летаю победы советского народа в Великой Отечественной войне и 90-летию Ростовского государственного университета) - Ростов-на-Дону, 2005, т. 2 - с. 251-252. (Совместно с Н.С. Косицыным, М.М Свиновым, А Н Макаренко, С В Божеваловой)

17 Сравнительное изучение антиинсультной активности отдельных субфракций средства «Церебрал» в опытах на белых крысах Экспериментальная и клиническая фармакология 2005,68(2) 15-20 (Совместно с А Н Макаренко, Н.С. Косицыным, И В Назимовым, М М. Свиновым, Н В Пасиковой)

18 Характеристика возрастной реакции животных на воздействие лекарственных препаратов с использованием метода корреляционных матриц В сб. «Общество, государство и медицина для пожилых и инвалидов» М, 2005 С 122-124 (Совместно с НИ. Шейной, НГ. Ивановым, ЭХ Скрябиной)

19 Эффективность применения пептидов гидролизата мозга при моделировании церебрального геморрагического инсульта. Экспериментальная и клиническая фармакология 2006 Т. 69, № 6 С 27-30 (Совместно с Н.С Косицыным, М М Свиновым, С.В Божеваловой, А.М. Яблонской)

20 Идентификация и механизм действия новых факторов, оказывающих нейропротекгорное действие при коррекции ишемических состояний головного мозга Материалы международной конференции "Колосовские чтения - 2006" СПб 2006 С 35-36

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 22 02 2007 г Формат 60x90 1/16 Уел печл 2,0 Тираж 120 экз Заказ 089 Тел 939-3890 Тел./факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им МВ Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Голобородько, Евгений Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эпидемиология инсульта.

1.2. Специфика дегенеративных изменений в перифокальной области геморрагического инсульта.

1.3. Постинсультные изменения в отдаленных областях мозга.

1.4. Дегенеративные изменения в отростках нервной клетки.

1.5. Способы моделирования геморрагического инсульта у мелких лабораторных животных (крыс).

1.6. Морфологические и функциональные последствия геморрагического инсульта в области внутренней капсулы.

1.8. Нейропротекторы.

1.9. Эндогенная нейропротекция и нейротрофические факторы головного мозга.

1.10. Протекторные свойства вытяжки из коры больших полушарий головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Структурно-функциональная характеристика нейродегенеративных процессов при экспериментальном геморрагическом инсульте.

3.1.1. Структурные изменения в очаге инсульта.

3.1.2. Структурные изменения в периинсулътной зоне.

3.1.3. Структурные изменения в отдаленных областях мозга.

3.1.4. Изменения поведения животных после моделирования геморрагического инсульта.

3.2. Определение эффективности и специфики нейропротекторного действия вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, а также ее отдельных фракций на модели экспериментальной внутримозговой геморрагии.

3.2.1. Специфика структурных изменений при введении вытяэ/ски крысам с экспериментальным геморрагическим инсультом.

3.2.2. Функциональные показатели протекторного действия супернатанта гомогената вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт.

3.3. Действие отдельных фракций вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные аспекты терапевтического действия корковых нейротрофических факторов при экспериментальном геморрагическом инсульте"

Актуальность проблемы. Методический арсенал, сформировавшийся: в современной нейробиологии, позволяет достаточно полно изучать особенности возникновения и развития процесса нейродегенерации. Одним из способов изучения структуры и. функции. мозга в норме и патологии"является использование экспериментальных моделей заболеваний, в основе которых лежит поражение структурных элементов нервной- ткани [64, 90]. Частной задачей таких исследований является поиск лекарственных средств, обладающих нейропротекторным эффектом, которые могут применяться при коррекции поражений ткани мозга.

Сосудистые заболевания головного мозга среди всех причин смерти населения вышли в России на, второе место (после кардиоваскулярных заболеваний), а также на, первое место, как причина? стойкой утраты трудоспособности: 10% больных становятся тяжелыми инвалидами, многие из них. нуждаются впосторонней помощи [23].

Среди них выделяют инсульт, ишемический (в основе его патогенеза лежит резкое снижение притока крови) и геморрагический (вследствие внутримозгового кровоизлияния). По данным международных мультицентровых исследований, преобладают ишемические поражения- мозга (соотношение ишемического и геморрагического инсультов составляет в среднем 85% и 15%) [7]. Однако геморрагическая форма протекает более тяжело, чем ишемическая; характеризуется более высокой смертностью (50% всех заболевших), трудностью реабилитации и более высокой степенью инвалидизации больных (88%). К концу первого года после инсульта из-за протекающих в головном мозге постинсультных изменений летальность увеличивается еще на 12-15%.

При геморрагическом инсульте происходит прорыв крови в вещество мозга и образование внутримозговой гематомы («ядра» инсульта), места тотальной деструкции нервной ткани. Прямое механическое сдавливание мозга вокруг гематомы и некоторое влияние вазоконстрикторных веществ в излившейся крови приводят к нарушению кровоснабжения окружающей нервной ткани [125]. Таким образом, внутримозговую гематому окружает периинсультная зона пенумбра, в 3 которой инициируется ряд процессов, приводящих в прогрессирующей гибели структурных элементов нервной ткани [127]. Последние исследования позволили раскрыть ряд общих механизмов гибели нервных клеток, лежащих в базисе не только инсульта, но и ряда нейродегенеративных заболеваний. К этим механизмам относят «эксайтотоксичность» - токсическое действие на нейроны повышенных концентраций возбуждающих аминокислот, «оксидантный стресс» - повреждение мембран нейронов активными формами свободных радикалов кислорода и продуктов перекисного окисления липидов, а также инициация апоптоза [45,94]. Нейропротекция поражений структурных элементов нервной ткани в пенумбре, направленная на увеличение их выживаемости, снижает выраженность функциональных последствий кровоизлияния.

Наиболее часто встречаемое место локализации гематом стриатокапсулярная зона [76, 91]. Внутренняя капсула, входящая в ее состав, является своеобразным коллектором, через который проходят связи коры больших полушарий головного мозга с нижележащими структурами. В связи с этим при локализации гематомы в области внутренней капсулы нарушения двигательной сферы более выражены, чем при поражении соответствующих первичных двигательных зон коры.

Область внутренней капсулы в комплексе с другими структурами мозга почти всегда подвергается патологическому воздействию и при моделировании экспериментальной гипоксии/ишемии (окклюзия средней мозговой артерии, перинатальная асфиксия) [49, 50, 59]. Кроме того, известно, что нейроны стриатокапсулярной зоны являются высокочувствительными к гипоксическому/ишемическому воздействию клеточными структурами головного мозга [105, 114]. Несмотря на это, большинство экспериментальных работ по изучению постинсультных дегенеративных процессов" проводятся на примере других структур, в частности, полей СА1 и САЗ гиппокампа. В одном из наиболее известных обзоров по ишемии [104], процесс дегенерации структурных элементов нервной ткани описан на их примере. Особенности морфологических изменений в других областях мозга, в частности, в области внутренней капсулы, остаются малоизученными. Кроме этого, данные о структурных изменениях в области внутренней капсулы, возникающих вследствие экспериментального геморрагического, а не ишемического инсульта, практически отсутствуют. В связи с этим изучение особенностей структурных изменений и динамики функциональных последствий в результате моделирования локального поражения в области внутренней капсулы представляется особенно актуальным.

Большее число существующих методов моделирования геморрагического инсульта, по мнению Gharbawie (2006) [43], не дает возможность проводить изучение динамики улучшения функционального статуса животных в кратчайшие сроки после операции. Модель локального экспериментального геморрагического инсульта, позволяющая проводить такую оценку, может также стать и моделью для доклинических испытаний лекарственных средств, обладающих протекторными свойствами [2].

Из практики нервных болезней известно, что возникающий в ходе перенесенного инсульта неврологический дефицит не всегда напрямую связан с пораженной областью. Описаны случаи возникновения клинически значимых симптомов и синдромов, связанных с функциональными изменениями в удаленных зонах мозга по типу диахизиса [40]. Диахизис - частный случай пластичности мозга, феномен, обозначающий появление функциональных изменений в областях мозга анатомически или функционально связанных с патологическим очагом (в результате снижения афферентного притока из разрушенной области) [44]. По мнению Paradowski В. (2005) возникновение изменений по типу диахизиса является неотъемлемой частью генеза многих нейродегенеративных заболеваний [99]. Кроме этого, в настоящее время рядом авторов предлагается использование клинической оценки диахизиса в практической неврологии [36]. Таким образом, актуальной представляется задача оценки наличия и выраженности структурных изменений в связанных с инсультным очагом (внутренняя капсула) анатомическими связями отдаленных областях (кора больших полушарий головного мозга).

Принимая во внимание полимодальную картину геморрагического инсульта, для его лекарственной коррекции, по мнению White et al. (2000), необходим политерапевтический подход, направленный кроме увеличения выживаемости нейронов на инициацию пластичных перестроек в здоровой ткани, приводящих к компенсации приобретенного неврологического дефицита [127]. Возможно, поэтому ни один из используемых в настоящее время при лечении инсульта узкоспециализированных лекарственных препаратов (по данным American Heart Association, 1997), не обладает клинически выраженными нейропротекторными свойствами [102].

Качественно новым подходом к лечению геморрагического инсульта может стать использование нейротрофических факторов мозга [98]. Нейротрофины -эндогенные пептиды головного мозга, участвующие в контроле процессов физиологического развития нейронов, сохранения структурной и функциональной целостности нервных или глиальных клеток. Различные факторы роста, обеспечивающие трофическую поддержку нейронов, проявляют защитное действие на моделях повреждения нейронов in vitro [57]. Существенной представляется нейропротекторная роль нейротрофинов в процессах, связанных с дегенерацией нервной ткани [34]. Однако, в настоящее время ни один из препаратов, обладающих нейротрофической активностью не введен в клиническую практику. Одна из причин заключается в том, что такие молекулы не в состоянии проникать через гематоэнцефалический барьер. С этим связана необходимость применения инвазивных терапевтических стратегий, например, инфузии препарата, непосредственно в желудочки головного мозга.

Будучи высоколабильным образованием, кора больших полушарий головного мозга при определенных условиях может повышать лабильность подкорковых центров [1, 8, 21]. В связи с этим было высказано предположение, что при действии экстремальных или патологических факторов в коре больших полушарий головного мозга может происходить индукция выработки ряда факторов, обладающих протекторными свойствами [3]. Из данных литературы известно, что нейротрофины и пептидные факторы активно синтезируются при экспериментальной мозговой травме и внутримозговой геморрагии [67,110,130]. В ходе предварительно проделанной работы в нашей лаборатории была разработана методика получения вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт [15]. В дальнейшем, было показано, что на модели культуры нейронов in vitro эта вытяжка увеличивала выработку мРНК ФРН и синтез этого нейротрофического фактора [17]. В настоящем исследовании на модели экспериментального геморрагического инсульта в области внутренней капсулы нами также оценивалась выраженность нейропротекторного эффекта вытяжки из коры головного мозга животных успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, что может явиться основой для разработки нового лекарственного средства для , терапевтической коррекции постинсультных состояний головного мозга.

Цель работы: структурно-функциональный анализ нейропротекторного действия вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, на модели данной цереброваскулярной патологии.

Задачи работы:

1. Структурная характеристика особенностей нейродегенеративных процессов при экспериментальном геморрагическом инсульте.

2. Оценка функциональных последствий моделирования локального кровоизлияния в области внутренней капсулы.

3. Структурно-функциональная характеристика эффективности и особенностей нейропротекторного действия вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, на модели данной патологии.

4. Исследование выраженности противоинсультного действия отдельных фракций исследуемой вытяжки.

Положения, выносимые на защиту:

1. На модели экспериментального геморрагического инсульта показано, что нейродегенерация в периинсультной зоне заключается в прогрессирующей дегенерации нейронов и их отростков. Наиболее уязвимыми клеточными структурами являются мелкие нейроны вне зависимости от их гистохимического субтипа.

2. Функциональные изменения, происходящие после моделирования геморрагического инсульта обусловлены как гибелью нейронов в периинсультной зоне, так и дегенеративными изменениями в отдаленных областях головного мозга (кора больших полушарий), связанных с зоной поражения.

3. Вытяжка из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, обладает эффективным противоинсультным действием, приводящим к компенсации функциональных последствий инсульта, оказывая нейропротекторное действие в периинсультной зоне и купируя нейродегенеративные процессы в отдельных компонентах нервной клетки в отдаленных областях головного мозга (кора больших полушарий), связанных с зоной поражения. Обоснована перспективность ее дальнейшего фракционирования с целью выделения нового противоинсультного моновещества.

Научная новизна работы: В ходе проведенных исследований нами впервые было показано, что уровень гибели нейронов в областях мозга, прилежащих к очагу экспериментального геморрагического инсульта в большей степени зависит от размеров их клеточных тел. Уже через 24 часа после операции наблюдалось достоверное снижение количества в основном мелких нейронов в периинсультной области, которое продолжало снижаться вплоть до 21 дня после операции. Нами также было выявлено отсутствие корреляционной взаимосвязи между типологической принадлежностью нейронов, определяемой методом иммуногистохимического анализа, и величиной их гибели в пенумбре экспериментального геморрагического инсульта.

При моделировании геморрагического инсульта в области внутренней капсулы нами были описаны морфологические изменения в области головного мозга, отдаленной от очага инсульта (кора больших полушарий). Так, при локализации гематомы в области внутренней капсулы, нами наблюдалось снижение числа шипиков на апикальных дендритах пирамидных нейронов V слоя сенсомоторной коры больших полушарий головного мозга.

Изменения структурных компонентов нервной ткани при моделировании локального кровоизлияния в области внутренней капсулы приводили к следующим функциональным последствиям: в начальном угнетении ориентировочно-исследовательской и двигательной активности крыс, которая нарастала по 3 неделю включительно и переходила в гиперактивность (тест «открытое поле»). Двигательная гиперактивность крыс совпадала со снижением латентного периода условного рефлекса пассивного избегания, что говорило о нарушении тормозных процессов. Тонкие манипуляционные движения нарушались и к 3 неделе постинсультного периода полностью не восстанавливались.

По динамике морфологических и поведенческих последствий локального кровоизлияния в области внутренней капсулы была показана эффективность применения в качестве терапевтического средства, обладающего выраженными нейропротекторными и нейромодуляторными свойствами, . вытяжки из коры больших полушарий головного мозга животных, успешно перенесших геморрагический инсульт. Нами было проведено четыре серии экспериментов по фракционированию вытяжки с последовательным выделением фракции, обладающей наиболее выраженным протекторным действием, для дальнейшего разделения. В результате была получена субфракция, состоящая из ограниченного числа компонентов, которая перспективна для выделения нового моновещества, обладающего протекторными свойствами.

Полученные данные позволяют расширить существующие представления о нейродегенеративных изменениях, протекающих при геморрагическом инсульте. Они также позволяют подтвердить гипотезу о противоинсультном, в частности, нейропротекторном действии вытяжки из коры больших полушарий головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт и показывают перспективность ее последовательного фракционирования с целью получения нового противоинсультного моновещества. Кроме того, полученные данные позволяют расширить представления о функционировании коры больших полушарий головного мозга при экстремальных воздействиях и различных видах патологии.

Практическая ценность работы. Вытяжка из коры больших полушарий головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, обладающая (по результатам настоящего исследования) выраженным нейропротекторным эффектом, может найти применение в клинической неврологии в качестве терапевтического средства при лечении геморрагического инсульта. Полученные данные о нейропротекторном действии отдельных компонентов вытяжки позволяют сделать заключение о перспективности продолжения данной работы с целью получения нового моновещества, которое также может найти применение в практической медицине. Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс кафедры высшей нервной деятельности МГУ, анатомии и физиологии МГПУ.

Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на Конференции молодых ученых по проблемам высшей нервной деятельности, посвященной 90-летию со дня рождения чл.-корр. АН и АПН СССР Л.Г. Воронина (Москва, 1998); Второй российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии, экспериментальной и клинической медицины» (Орел, 2001); XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004); Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004) (работа отмечена дипломом конференции); 14-ой Международной конференции по нейрокибернетике, посвященной 60-летию победы советского народа в Великой Отечественной войне и 90-летию Ростовского государственного университета (Ростов-на-Дону, 2005); Международной конференции "Колосовские чтения - 2006" (Санкт-Петербург, 2006) и на научных конференциях молодых ученых Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН в 2002, 2003, 2004, 2005 и 2006 гг.

Результаты работы были использованы в докладе на Общем собрании ОБН РАН, 2006 и представлены к публикации в сборнике-справочнике «Отделение биологических наук РАН в 2005 году. Основные результаты научных исследований».

Диссертация апробирована на совместном заседании группы ультраструктурных и цитохимических основ условного рефлекса, лаборатории функциональной нейроморфологии, группы общей физиологии временных связей, группы экспериментальной патологии и терапии ВНД Института 29 ноября 2006 года.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, из них 2 статьи в реферируемых журналах.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Голобородько, Евгений Владимирович

выводы Г. При моделировании по разработанной методике геморрагического инсульта в области внутренней капсулы, морфологические изменения заключались в формировании очага инсультного поражения и прогрессирующей гибели нейронов в периинсультной зоне. Устойчивость к дегенерации выше у нейронов с большим диаметром клеточного тела и не зависит от их гистохимического субтипа:

2. В отдаленных областях мозга, связанных с областью поражения, наблюдались нейродегенеративные изменения, которые, в частности, выражались в уменьшении количества шипиков на апикальных дендритах пирамидных нейронов V слоя? сенсомоторной зоны коры больших полушарий головного мозга.

3. Функциональные последствия экспериментального геморрагического инсульта в области внутренней капсулы заключались в начальном угнетении ориентировочно-исследовательской и двигательной активности: крыс, которая? нарастала по 3 неделю включительно и переходила в гиперактивность (тест «открытое поле»). Нарушение тормозных процессов также выражалось в снижении латентного периода условного рефлекса пассивного избегания. Тонкие манипуляционные движения нарушались и к 3 неделе постинсультного периода полностью не восстанавливались.

4. Специфика протекторного действия вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, заключается в увеличении резистентности мелких нейронов и в купировании нейродегенеративных процессов в отдельных компонентах | нервной клетки (в частности, в дендритических шипиках), что приводило к j компенсации сниженной ориентировочно-исследовательской, двигательной активности и тонких манипуляционных движений ко 2-3 неделе постинсультного периода. Особенно следует выделить то, что фаза повышенной двигательной активности у этих крыс протекала на фоне сохранности тормозных процессов, что выражалось в увеличенности латентного периода условного рефлекса пассивного избегания.

5. Показано, что вытяжка из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт, обладает выраженным нейропротекторным действием, а ее некоторые фракции и субфракции перспективны для дальнейшего изучения с целью получения нового противоинсультного моновещества. I I

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сосудистые заболевания головного мозга среди всех причин смерти населения вышли в России на второе место (после кардиоваскулярных заболеваний), а также на первое место, как , причина стойкой утраты трудоспособности. В России ежегодно происходит более 400 тысяч инсультов, летальность при которых достигает 35%. Актуальной до сих пор остается задача . выяснения механизмов нейродегенерации при инсульте и поиск возможных стратегий ее коррекции.

В результате проведенных исследований нами были выделены структурно-функциональные особенности дегенеративных процессов при экспериментальном геморрагическом-инсульте. Моделирование геморрагического инсульта в области внутренней капсулы приводило к изменению следующих функциональных показателей: гиперактивность в тесте «открытое поле», снижение точности тонких манипуляционных движений. Следует отметить, что гиперактивность сопровождалась нарушением тормозных процессов (регистрируемых как реакция пассивного избегания). Кроме этого, нами были описаны морфологические изменения в пенумбре экспериментального инсульта. Дегенерация нейронов в периинсультной зоне отмечается уже через 24 часа после операции и носит динамический характер (усиливается с течением времени). Гибель нейронов не зависит от их субтипа, определяемого методом иммуногистохимического окрашивания. В большей степени она выражено среди нейронов с небольшим размером клеточного тела. Нами также было показано, что моделирование инсульта в области внутренней капсулы приводит к морфологически изменениям в I отдаленных областях мозга (в сенсомоторной области коры больших полушарий), которые выражались в изменении формы и уменьшении плотности распределения шипиков на апикальных дендритах пирамидных нейронов V слоя этого участка; коры.

Показано, что ежедневное интраназальное введение в течение 10 суток после создания геморрагического инсульта супернатанта гомогената вытяжки из коры больших полушарий животных, успешно перенесших данную патологию, приводило к снижению выраженности неврологического дефицита, восстановлению ориентировочно-исследовательской, двигательной активности и к восстановлению тонких манипуляционных движений к 3 неделе постинсультного периода, причем это восстановление происходило на фоне сохранности тормозных процессов. Она уменьшала объем повреждения в области геморрагического инсульта, уменьшала гибель нейронов малого размера в периинсультной области, восстанавливала форму и число шипиков на апикальных дендритах пирамидных нейронов V слоя сенсомоторной области коры больших полушарий головного мозга.

Нами была показана возможность последовательного фракционирования вытяжки из коры головного мозга животных, успешно перенесших экспериментальный геморрагический инсульт. Положительное антиинсультное действие фракции, выбранной для дальнейшего фракционирования и состоящей из ограниченного числа компонентов, представляет наибольший интерес для фармакологов и фармацевтов в плане выделения, очистки, идентификации и последующего биотехнологического этапа получения антиинсультного фактора, обладающего действием, усиливающим синтез и секрецию NGF, и, по-видимому, других нейротрофинов и пептидных факторов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Голобородько, Евгений Владимирович,

1. Анохин П.К. Нейрофизиологические основы электрической активности коры головного мозга. В кн.: Современные проблемы электрофизиологических исследований нервной системы. М.: Медицина, 1964, с. 132-163.

2. Ашмарин И.П., Каменский А.А., Сарычева Н.Ю., Батурина Е.Ю. Интраназальное введение регуляторных пептидов. Вестн. Акад. Мед. Наук СССР. 1988; (10):43-8.

3. Батрак Г.Е., Закопка В.М., Колесниченко Г.Г., Макаренко А.Н. О возможности направленного повышения выносливости организма в условиях наркоза. В кн.: Тезисы докл. IV съезда фармакологов УССР. Тернополь, 1981, с. 13.

4. Батрак Г.Е., Хрусталев С.И., Макаренко А.Н. Влияние орбитофронтальной зоны коры больших полушарий головного мозга кошки на устойчивость к эфирному наркозу супраоптического ядра гипоталамуса. Фармакол. токсиколог. (1981). Январь-февраль;44(1):25-30

5. Большая советская энциклопедия / Гл. ред. А. М. Прохоров. —3-е изд. — М;: Сов. энциклопедия, 1973.

6. Гомазков О. А. Нейротрофические факторы мозга. Справочно информационное издание. Электронная версия. М .2004.

7. Завалишин И.А., Захарова М.Н. Гибель нейрона кардинальная проблема неврологии и психиатрии. Вестн. РАМН. - 1999. - №1. - С. 28-33.

8. Казаков В.Н., Кравцов П.Я. Реакции нейронов ядер гипоталамуса на раздражение фронтобазальных отделов неокортекса. Нейрофизиология, 1978, 10, №1, с. 44-53.

9. КонвайВ. Д. Актуальные проблемы неврологии.-Омск, 1997.

10. Косицын Н.С., Свинов М.М. Структурный анализ реактивности плексиморфного слоя коры мозга при действии экстремальных факторов. Бюлл. экспер. биол. и мед., 1990, 109, 5, с.486-489.

11. Костомарова М.С., Никифоров Б.М., Руденко И.Я., и др. Всероссийский съезд невропатологов и психиатров, 4-й. -М., 1980. -Т.З. С.159-162.

12. Легнер Э.Н., Бибелейшвили Ш.И. Электрическая активность головного мозга при экспериментальной модели геморрагического инсульта.// Электрофизиология нервной системы. Ростов-на-Дону: Из-во РГУ. 1963. С.226.

13. Лорина Л. Нетравматические внутримозговые гематомы. Конспект врача. Наука. 2001. №80.

14. Макаренко А.Н. Архив психиатрии. (1998). 3(18), 138-143

15. Макаренко А.Н. Изучение и анализ протекторных свойств экстракта неокортекса при действии токсических доз гексеналового наркоза. Фармакол. токсикол. 1991. Сентябрь-октябрь; 54(5): 16-7.

16. Макаренко А.Н., Васильева И.Г. Нейроактивирующий механизм действия нового трофинотропина Церебрал. Эксперим. клинич. фармакология. 2004. Июль-Август;67(4): 12-5.

17. Макаренко А.Н., Косицын Н.С., Свинов М.М., Пасикова Н.В. Метод моделирования локального кровоизлияния в различные структуры головного мозга экспериментальных животных. ЖВНД. 2002. Ноябрь-Декабрь; 52(6):765-8.

18. Павлов И.П. Краткий очерк высшей нервной деятельности. Полн. собр. соч.: В 5-и т. -М. -Л.: Изд-во АН СССР, 1951. Т. 3, кн. 2, с. 106-126.

19. Скворцова В .Нейропротективная терапия ишемического инсульта . Врач . 2004;(6).

20. Скворцова В.И., Крылов В.В. Геморрагический инсульт. М. 2005. 196 с.

21. Albin, R. L., Young, А. В., Penney, J. В. The functional anatomy of basal ganglia disorders. Trends Neurosci. 1989. 12:366-375

22. Arnold A.C. Pathogenesis of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. J Neuroophthalmol. 2003 Jun; 23(2): 157-63.

23. Asada H. , Ip N., Pan L. , Razack N. , Parfitt M., Plunkett R. Journal of Neuroscience Research 2004 Volume 40, Issue 1 , Pages 22-30

24. Ballock R., Mendelow A., Bone J. et al. Cerebral blood flow and C02 responsiveness as an indicator of collateral reserve capacity in patients with carotid artery disease. Brit. J. Surg., 1985, 72,348-351.

25. Bergeron M, Gidday JM, Yu AY, Semenza GL, Ferriero DM & Sharp FR. (2000) Role of hypoxia-inducible factor-1 in hypoxia-induced ischemic tolerance in neonatal rat brain. Ann Neurol 48: 285-296.

26. Bredesen D. Neuronal apoptosis: genetic and biochemical modulation. Apoptosis П: The molecular basis of apoptosis in disease. Ed Tomei L. D., Cope F. 1994. Cold Spring Harbor Lab. Press p. 397-421.

27. Calabresi P, De Murtas M, Bernardi G (1997) The neostriatum beyond the motor function: Experimental and clinical evidence. Neuroscience 78:39-60.

28. Chukwudelunzu F., Meschia J., Graff-Radford N., Lucas J. Extensive metabolic and neuropsychological abnormalities associated with discrete infarction of the genu of the internal capsule. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2001;71:658-662

29. Chung CS, Caplan LR, SongHJ. Brain. 2000. V. 123. P. 1850-1862.

30. Dechant G, Neumann H. Neurotrophins. Adv Exp Med Biol. 2002;5 3:303-334.

31. Domino E.F., Minoshima S., Guthrie S.K., Ohl L., Ni L., Koeppe R.A., Cross D.J., Zubieta J. Effects of nicotine on regional cerebral glucose metabolism in awake resting tobacco smokers. Neuroscience. 2000. V. 101. P. 277-282.

32. Duffau H. Brain plasticity: from pathophysiological mechanisms to therapeutic applications. J Clin Neurosci. 2006 Nov; 13(9):885-97.

33. Dupuis F, Atkinson J, Liminana P, Chillon J. Captopril improves cerebrovascular structure and function in old hypertensive rats. J Pharmacol. 2005 Feb;144(3):349-56.

34. Felberg R., Grotta J., Shirzadi A., Strong R, Narayana P, Hill-Felberg S., Aronowski J. Cell death in experimental intracerebral hemorrhage: the "black hole" model of hemorrhagic damage. Ann Neurol. 2002; 51: 517-524.

35. Fishbein L., O'Brien P., Hutson A., Theriaque D., Stacpoole P.W., Flotte T. Pharmacokinetics and pharmacodynamic effects of nicotine nasal spray devices on cardiovascular and pulmonary function. J. Investig. Med. 2000. V. 48. P. 435-445.

36. Flint AC, Naley MC, Wright CB. Ataxic hemiparesis from strategic frontal white matter infarction with crossed cerebellar diaschisis. Stroke. 2006 Jan;37(l):el-2.

37. Frost S.B., Barbay S., Mumert M.L., Stowe A.M., Nudo R.J. An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat. Behav Brain Res. 2006 May 15; 169(2) :206-11.

38. Fujii J. Spontaneous Stroke in Renovascular Hypertensive Rats. Stroke, 1999;30:695-696.

39. Gharbawie OA, Whishaw IQ. Parallel stages of learning and recovery of-skilled reaching after motor cortex stroke: "oppositions" organize normal and compensatory movements. Behav Brain Res. 2006 Dec 15;175(2):249-62.

40. Glickstein S., Golanov E., Donald J. Reis Intrinsic Neurons of Fastigial Nucleus Mediate Neurogenic Neuroprotection against Excitotoxic and Ischemic Neuronal Injury in Rat. The Journal ofNeuroscience, May 15,1999, 19(10):4142-4154

41. Goldstein L, Teng ZP, Zeserson E, Patel M, Regan RF. 2003. Hemin induces an iron-dependent, oxidative injury to human neuron-like cells. J Neurosci Res 73: 113-121.

42. Gonzales C. and Kolb B. European Journal ofNeuroscience. 2003. V.18. P. 19501962.

43. Harris K.M., Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Curr. Opin. Neurobiol. 1999. V. 9. P. 343-348.

44. Hasbani M., Schlief M., Fisher D., Goldberg M. Dendritic spines lost during glutamate receptor activation reemerge of original sites of synaptic contact. Neuroscience. 1993. V. 55(2). P. 473-490.

45. He Z, Yamawaki T, Yang S, Day AL, Simpkins JW, Naritomi H. Experimental model of small deep infarcts involving the hypothalamus in rats: changes in body temperature and postural reflex. Stroke. 1999 Dec;30(12):2743-51

46. He Z, Yang SH, Naritomi H, Yamawaki T, Liu Q, King MA, Day AL, Simpkins JW. Definition of the anterior choroidal artery territory in rats using intraluminal occluding technique. J Neurol Sci. 2000 Dec 15; 182(1): 16-28.

47. Herdegen F., Skene P, Bauhr M. The c-Jun transcription factor-bipotential mediator of neuronal death, survival and regeneration. TINS, 1997. v. 20, p. 227-231

48. Hill A, Volpe JJ (1981) Seizures, hypoxic-ischemic brain injury, and intraventricular hemorrhage in the newborn. Ann Neurol 10:109-121.

49. Hinkle J.L., Bowman L. Neuroprotection for ischemic stroke. J Neurosci Nurs. 2003 Apr;35(2): 114-8.

50. Hogan R., Baringer J., Prusiner S. Scrapie infection diminishes spines and increases varicosities of dendrites in hamsters: a quantitative Golgi analysis. J. Neuropathol. Exp. Neurol. V. 46 (1987). P.461-473.

51. Holmes, W.R. . Is the function of dendritic spines to concentrate calcium? Brain Research. 1990. V. 519 P. 338-342.

52. Hutter-Paier В., Grygar E., Temmel I., Windisch M. J. Neural. Transm. (1998) 53:363-372.

53. Hutter-Paier В., Steiner E., Windisch M. J. Neural. Transm. (1998) 53:351-361.

54. Iadecola, C. Trends Neurosci. 1997.20, 132-139

55. Iizuka H, Sakatani K, Young W. Corticofugal axonal degeneration in rats after middle cerebral artery occlusion. Stroke. 1989 0ct;20(10):1396-402.

56. Jahn S.D., Conway E.M., Collen D., Carmeliet P. Molecular mechanisms of blood vessel growth. Cardiovasc Res. 2001 Feb 16;49(3):507-21.i I

57. Jiang Y., Wu J., Keep R, Hua Y., Hoff J., Xi G. Hypoxia-Inducible Factor-1 Accumulation in the Brain After Experimental Intracerebral Hemorrhage. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism (2002) 22, 689-696

58. John C., Spacek J., Kristen M. Dendritic spine pathology. Journal of Neurophysiology. 1999.

59. Katsura K., Kristian T. and Siesjo B. Biochem. Soc.Trans. 1994. 22, 991-996

60. Kawamata Т., Alexis N.E., Dietrich W.D., Finklestein S.P. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1996. V 16. P. 542-547.

61. Kenneth R. Wagner, PhD Modeling Intracerebal Hemorrhage Stroke. 2007;38:753.

62. Keyser J., Suiter G., Luiten P. Trends Neurosci 1999. 22:535-540

63. Kietzmann T, Roth U & Jungermann K. (1999) Induction of the plasminogen activator inhibitor-1 gene expression by mild hypoxia via a hypoxia response element binding the hypoxia-inducible factor-1 in rat hepatocytes. Blood 94: 4177-4185.

64. Koch. C., Zador. A. The function of dendritic spines: Devices subserving biochemical rather than electrical compartmentalization. Journal of Neuroscience. 1993. V. 13(2). P. 413-422.

65. Kohlhauser C, Kaehler S, Mosgoeller W, Singewald N, Kouvelas D, Prast H, Hoeger H, Lubec В (1999) Histological changes and neurotransmitter levels three months following perinatal asphyxia in the rat. Life Sci 64:2109-2124.

66. Kohlhauser C, Mosgoeller W, Hoeger H, Lubec G, Lubec В (1999). Cholinergic, monoaminergic and glutamatergic changes following perinatal asphyxia in the rat. Cell Mol Life Sci 55:1491-1501.

67. Kornblum Ш, Araujo DM, Annala AJ, Tatsukawa KJ, Phelps ME, Gherry SR. In vivo imaging of neuronal activation and plasticity in the rat brain by high resolution positron emission tomography (microPET). Nat Biotechnol. 2000;18:655-660.

68. Kidwell C.,Saver J.,Mattiello J.,Warach S., Liebeskind D.,Starkman S.,Vespa P.,Villablanca J.,Martin N;,Frazee J.,Alger J. Diffusion-perfusion MR evaluation of perihematomal injury in hyperacute intracerebral; hemorrhage. Neurology 2001;57:1611-1617.

69. Lee KR, Betz AL, Keep RF, Chenevert TL,.Kim'S & Hoff JT. (1995) Intracerebral infusion of thrombin as a cause of bram edema. JNeurosurg 83: 1045-1050;

70. Lee KR, Betz AL, Kim S, Keep RF & Hoff JT. (1996a) The role of the coagulation , cascade in ' brain edema formation after intracerebral hemorrhage. Acta Neurochirurgica (Wien) 138: 396-400.

71. Lee KR, Colon GP, Betz AL, Keep RF, Kim S & Hoff JT. (1996b) Edema from intracerebral hemorrhage: the role of thrombin. JNeurosurg 84: 91-96.

72. Lee M.Y., H.D. Hofmann and M. Kirsch, Expression of ciliary neurotrophic factor receptor-a messenger RNA in neonatal and adult rat brain: an in situ hybridization study, Neuroscience 77 (1997), pp. 233-246

73. Lehning E.J., Balaban C.D., Ross J.F., Reid M.A., LoPachin R.M. Acrylamide neuropathy, Spatiotemporal characteristics of nerve cell damage in rat cerebellum. Neurotoxicology. 2002. V. 23(3). P. 397-414.

74. Lim JS et al. J. of Nuclear Medicine, 1998, Vol 39, 12 2044-2047

75. Lipton P. Ischemic Cell Death in Brain Neurons. Physiological reviews. 1999. Vol. 79, № 4, October. 1431-1568.

76. Lipton S., Rosenberg P. Excitatory amino acids as a final common pathway for neurologic disorders. (1994) N. Engl. J. Med. 330, 613-622.

77. Lloyd С .J., Airedy Т., Lowry J.C. Intranasal midazolam as an alternative to general anaesthesia in the management of children with oral and maxillofacial trauma. Br. J. Oral Maxillofac. Surg. 2000. V. 38. P. 593-595.

78. Lu A., Tang Y., Ran R., Ardizzone Т., Wagner K., Sharp F. Brain genomics of intracerebral hemorrhage. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism (2006) 26, 230-252.

79. Luk K., Sadikot A. (2001) GABA promotes survival but not proliferation of parvalbumin- immunoreactive interneurons in rodent neostriatum: an in vivo study with stereology. Neuroscience 104: 93-103.

80. MacLellan CL, Gyawali S, Colbourne F. Skilled reaching impairments follow intrastriatal hemorrhagic stroke in rats. Behav Brain Res. 2006 Nov 25;175(l):82-9.

81. Masuda T, Hida H, Kanda Y, Aihara N, Ohta K, Yamada K5 Nishino H. Oral administration of metal chelator ameliorates motor dysfunction after a small hemorrhage near the internal capsule in rat. JNeurosci Res. 2007 Jan;85(l):213-22.

82. Mattson M. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2000. №1, 120-130.

83. Nakamura T, Keep R, Hua Y, Park J, Itano T, Nagao S, Hoff J, Xi G. Intracerebral hemorrhage induces edema and oxidative stress and alters N-methyl-D-aspartate receptor subunits expression. Acta Neurochirurgia Supply. 2005;95:421-4.

84. Nakamura F, Xi G, Schallert T, Hoff JT, Keep RF. Intracerebral hemorrhage in mice: Model characterization and application for genetically modified mice. J Cerebral Blood Flow Metab. 2004;24:487-494.

85. Nakayama, Aoki Y., Niitsu H. Studies on the mechanisms responsible for the formation of focal swellings on neuronal processes using a novel in vitro model of. axonal injury. Neurotrauma. 2001. V. 18. P. 545-554.

86. Nath FP, Kelly PT, Jenkins A, Mendelow AD, Graham DI & Teasdale GM. (1987) Effects of experimental intracerebral hemorrhage on blood, flow, capillary permeability, and histochemistry. J Neurosurg 66: 555-562.

87. Nicole O; et al. Neuroprotection mediated by glial cell line-derived neurotrophic factor: involvement of a reduction of NMDA-induced calcium influx by the mitogen-activated protein kinase pathway. J Neurosci,2001 ;2 (9):3024-3033.

88. Paradowski B, PawlikB'. Diaschisis phenomenon in different neurological diseases. WiadLek. 2005;58(ll-12):675-7.

89. Pascual A., Lopez-Mut J.,. Benlloch J, Chamarro R., Soler J,Lainez M. Perfiisibn-weighted magnetic resonance imaging in acute intracerebral hemorrhage at baseline and during the 1st and 2nd week:a longitudinal study. Cerebrovasc Dis 2007;23:6 -13.

90. Patel TR, Schielke GP, Hoff JT, Keep RF, Lorris Betz A. Comparison of cerebral blood flow and injury followmg mtracerebral and subdural hematoma in the rat. Brain Res. 1999 May 22;829(l-2): 125-33.

91. Pessin M.5 Adams H., Adams R., Fisher M., Furlan A., Hacke W., Haley E., Hazinski M., Helgason C., Higashida R., Koroshetz W., Marler J., Ornato J. Acute Interventions. Stroke. 1997;28:1518-1521.

92. Pitts KR, Stiko A, Buetow B, Lott F, Guo P, Virca D, Toombs CF. Washout of heme-containing proteins dramatically improves tetrazolium-based infarct staining. J Pharmacol Toxicol Methods. 2007 Mar-Apr;55(2):201-8.

93. Priorities for Clinical Research. in Intracerebral Hemorrhage. Report From a National Institute of Neurological Disorders and Stroke Workshop. Stroke. 2005;36:e23.

94. Pulsinelli WA, Brierley JB, Plum F. Temporal profile of neuronal damage: in a model of transient forebrain ischemia. Ann Neurol. 1982 May; 11(5):491-8.

95. Rabizadeh S., Ghj., Zhong 1. et al. Induction of apoptosis by the low-affinity NGF receptor. Science 1993, v.,261, p. 345-34

96. Ramon-Moliner E. The morphology of dendrites// In: The Structure and Function of Nervous Tissue. Academic Press, NY. 1968. V. I (ed. G.H. Bourne). P. 205-267.

97. Reinprecht K., Hutter-Paier В., Crailsheim K. J. Neural. Transm. (1998) 53:373384.

98. Rolfs A, Kvietikova I, Gassmann M & Wenger RH. (1997) Oxygen-regulated transferrin expression is mediated by hypoxia-inducible factor-1. J Biol Chem 272: 20055-20062.

99. Rosenberg GA, Kornfeld M, Estrada E, Kelley RO, Liotta LA, Stetler-Stevenson WG. TIMP-2 reduces proteolytic opening of blood-brain barrier by type IV collagenase. Brain Res. 1992 Apr 3;576(2):203-7.

100. Rosenberg G., Mun-Bryce S, Wesley M, et al. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke. 1990;21:801- 807.

101. Rothwell, N.J., Hopkins, S.J. Trends Neurosci. 1995. 18, 130-136

102. Ruscher K, Isaev N, Trendelenburg G, Weih M, lurato L, Meisel A & Dirnagl U. (1998) Induction of hypoxia inducible factor 1 by oxygen glucose deprivation is attenuated by hypoxic preconditioning in rat cultured neurons. Neurosci Lett 254: 117-120.

103. Schabitz WR, Li F, Fisher M. The N-methyl-D-aspartate antagonist CNS 1102 protects cerebral gray and white matter from ischemic injury following temporary focal ischemia in rats. Stroke. 2000 Jul;31(7):1709-14.

104. Schaub RT, Anders D, Golz G, Gohringer K, Hellweg R. Serum nerve growth factor concentration and its role in the preclinical stage of dementia. Am J Psychiatry. 2002. V. 159(7). P. 1227-1229.

105. Schellinger P.,Fiebach J.,Hoffmann K, Becker K,Orakcioglu B,Kollmar RJuttler E, Schramm P,Schwab S,Sartor K,Hacke W. Stroke MRI in intracerebral hemorrhage: is there a perihemorrhagic penumbra? Stroke 2003;34:1674 -1679.

106. Shepherd, G.M. The dendritic spine: a multifunctional integrative unit. Journal of Neurophysiology. 1996 V. 75(6). P. 2197-210.

107. Shimizu S., Eguchi Y., Kamiike W. et al. Retardation of chemical hypoxia-induced necrotic cell common mediators in apoptotic and necrotic signal transductions. Oncogene. 1996, v. 12, p. 2045-2050.

108. Shirasaki Y, Kanazawa Y, Morishima Y, Makino M Involvement of calmodulin in neuronal cell death Brain Res. 2006 Apr 14; 1083(1): 189-95

109. Tacchini L, Bianchi L, Bernelli-Zazzera A & Cairo G. (1999) Transferrin receptor induction by hypoxia: KF-1-mediated transcriptional activation and cell-specific post-transcriptional regulation. J Biol Chem 274:24142-24146.

110. Ulrich D., Iadecola C., Moskowitz A. Trends Neurosci. (1999) 22, 391-397.

111. Wang GL, Jiang BH, Rue EA & Semenza GL. (1995) Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular 02 tension. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 5510-5514.

112. Warach S. Editorial Comment—Is There a Perihematomal Ischemic Penumbra? More Questions and an Overlooked Clue. Stroke. 2003; 34:1680.

113. Whishaw I.Q., O'Connor W.T., Dunnett S.B. Brain, № 109, 805-843 (1986).

114. White ВС, Sullivan JM, DeGracia DJ, OTSTeil BJ, Neumar RW, Grossman L, et al. Brain ischemia and reperfiision: molecular mechanisms of neuronal injury. J Neurol Sci. 2000; 1 79(S 1-2): 1-33.

115. Windisch M., Gschanes A., Hutter-Paier B. J Neural. Transm. 1996. V. 53. P. 289298.

116. Wood N. I. Behav. Brain Res. 1996. V. 78. P. 113-120.

117. Xue, M., Del Bigio, M. R., Muizelaar, J. P. (2000). Intracortical Hemorrhage Injury in Rats: Relationship Between Blood Fractions and Brain Cell Death Editorial Comment: Relationship Between Blood Fractions and Brain Cell Death. Stroke 31: 1721-1727

118. Yonemori F., Yamada H., Yamaguchi Т., Uemura A. and Tamura A. //J. Cereb. Blood Flow Metab. 1996. V. 16. P. 973-980.Keyser JD,Suiter G, Luiten PG (1999)

119. Trends Neurosci 22:535-540

120. Zhang, R. et al. Brain Res. 1998. 785,207-214

121. Zhao X, Wang Y,Wang C, Li S ,Wang Y, Yang Z. Quantitative evaluation for secondary injury to perihematoma of hypertensive cerebral hemorrhage by functional MR and correlation analysis with ischemic factors. Neurol Res 2006;28:66 -70.