Структурная организация повторяющихся последовательностей ДНК в геномах злаков

Вершинин, Александр Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурная организация повторяющихся последовательностей ДНК в геномах злаков
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация повторяющихся последовательностей ДНК в геномах злаков"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА СШИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи' УДК 575.113.1:576.316.7:577.21

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПОВТОРЯВШИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК В ГЕНОМАХ ЗЛАКОВ

Молекулярная генетика - 03.00.26

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Новосибирск, 1991

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики Сибирского

отделения АН СССР, г.Новосибирск.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Е.В.Ананьев доктор биологических наук В.А.Вахитов доктор биологических наук С.С.Малюта

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта АН СССР

Защита диссертации состоится "¿19" ¿¿Т^Л^г^Л^ iggi в " SP" часов на заседании специализированного совета Д 016.11.01 при Институте молекулярной биологии и генетики АН УССР по адресу: 252627, г.Киев-143, ул.акад.Заболотного, 150.

С материалами диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и генетики АН УССР.

Автореферат разослан

1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Т.И.Бужиевская

| Актуальность темы, молекулярный анализ структурной организации геномов эукариот в течении многих лет является одним из основных направлений современной генетики. В последнее десятилетие с развитием методов генной инзекерии, и в первую очередь клонирования отдельных последовательностей ДНК, интерес к этой проблеме eise более возрос. Повторяющиеся последовательности (ПП) ДНК являются самой интригующей частью генсма эукариот. Несмотря на то, что на их долю приходится большая часть тотальной ДНК, у злаков например до 70-75$ (FLAVELL, 1980)' непропорционально мало известно об их структурной организации, а тем более функциональной роли.

Из анализа геномной структуры таких объектов, как дрозофила, мышь, человек и др. к настоящему моменту мозно считать хорошо установленными следующие факты. Общепринятая является деление всей фракции повторяющейся ДНК на классы повторов двумя способами;

1.По кинетике реассоциации на высоко и умеренно ПП (соответственно, с числом копий в геноме -ю5-105 и меньше этой величины).

2.По способу организации на тандемно организованные и рассеянные по геному.

В последние годы отдельные последовательности ДНК стали широко использоваться в качестве молекулярных маркеров отдельных видов, геномов, хромосом и определенных участков хромосом и наибольший прогресс здесь достигнут в картировании генома человека.

Что касается генома злаков, то к началу данного исследования появилась первая работа, посвященная описанию структурной организации четырех l'licckc повторяющихся последовательностей (ВПП) у некоторых видов рода SECALE (BEDBROOK ET AL., 1980). .Практически ничего не было известно об организации отдельных, клонированных последовательностей этого класса у ячменя и пшеницы. Отсутствовали широкие системные исследования изменений копийности и структурной организации отдельных последовательностей ДНК у филогенетически связанных видов и под влиянием воздействия различных факторов на геном. Учитывая это, нами предпринята попытка частично восполнить пробел и ответить на ряд фундаментальных вопросов, касающихся организации ПП в геномах ряда видов злаков, а такяе

проследить за изменениями в структуре ГШ, которые происходят в течении многих лет и поколений при дивергенции видов, и быстрыми геномными изменениями, возникающими вследствии воздействия стрессовых факторов.

Цель и задачи работы. Настоящая работа посвящена выяснению основных закономерностей структурной организации различных семейств ПП в геномах злаков, в первую очередь в геноме ячменя

H.VULGARE; сравнительному анализу отдельных ВПП ДНК Н.VULGARE в геномах диких видов ячменя; изучению характера изменений, происходящих в организации ПП в процессе отдаленной гибридизации различных ВИДОВ HORDEUM X SECALE.

В конкретные задачи исследования входит:

I.Выявление особенностей структуры, хромосомальной локализации и межвидовой гетерогенности класса ВПП ДНК злаков, отличающих ее от класса умеренных повторов.

2.Идентификация различных семейств, составляющих класс высоких повторов Н.VULGARE- исследование их структурной организации в геноме, степени гомологии друг к другу; распространенности в геномах других видов злаков.

3.Сравнительное изучение структурной организации и количественного содержания отдельных ВПП ДНК Н.VULGARE в геномах диких видов рода HORDEUM! выявление последовательностей, проявляющих RFLP (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) и являющихся молекулярными маркерами геномов отдельных видов ячменя.

4.Молекулярный анализ геномов отдаленных гибридов, полученных при половой гибридизации различных видов HORDEUM X SECALE с помощью клонированных ПП; изучение возможностей идентификации родительских геномов в гибридном генотипе и возможных структурных перестроек, происходящих в них.

В ходе работы были обнаружены изменения в структурной организации ПП ДНК в геномах отдаленных гибридов, в связи с чем возникла задача:

5.Исследование возможных причин, обуславливающих изменения в структурной организации повторяющихся участков генома отдаленных гибридов. И в этой связи, изучение наличия в геномах

ячменя, ржи и пшеницы последовательностей, гомологичных известным мобильным элементам кукурузы; определение первичной структуры и контексный анализ участка генома Н.VULGARE» включающего в себя последовательность pHv 7161. маркирующую структурные изменения при отдаленной гибридизации.

Научная новизна и практическая ценность работы. Основным результатом данной работы является проведенное впервые широкое системное исследование структурной организации ПП ДНК ячменя и других видов злаков и характера ее изменений в процессе дивергенции видов и отдаленной гибридизации. Установлено, что класс ВПП злаков, кроме ранее известного характерного свойства (более высокого числа копий) отличается от УПП рядом других характеристик: особенностями первичной структуры, выражающимися в способности к ре-итерации, предпочтительной хромосомальной локализацией в прицент-ромерных и теломерных районах хромосом, большей межвидовой гетерогенностью.

Впервые детально охарактеризован класс .БПП ячменя Н.VULGARE. Получена представительная библиотека ВПП. Выделено 15 последовательностей ДНК, представляющих основные семейства, определены их длина, гомология друг к другу. Анализ геномной организации выявил две тандемно организованных последовательности, остальные рассеяны по геному в виде кластеров и имеют более сложную организацию. Три последовательности являются.родоспецифическими для рода HOR-DEUM, две - присутствуют в геноме ячменя и ржи и отсутствуют у пшеницы. Получена библиотека ВПП ДНК ржи S.CEREALE, в которой определены шесть родоспецифических для SECALE последовательностей. Выявленные родоспецифические последовательности являются молекулярными маркерами соответствующих родов и могут использоваться в различных исследованиях для идентификации геномов.

Проведенное впервые сравнительное изучение структурной организации и копийности отдельных ВПП у различных видов рода HORDEUM показало эффективность использования полученного нами набора ВПП для сравнительного RFLP-анализз видов и предварительного прогнозирования результатов межвидовых скрещиваний. Экспериментально подтверждено ранее высказанное предположение (BENNETT, SMITH,

1971), что изменения геномов в рода HORDEUM в процессе видообразования ело не за счет изменения общего содержания ДНК. а вследс-теии геномных перестроек.

ВперЕые проведен молекулярный анализ геномов гибридов НОК-deum X SECALE- полученных половой гибридизацией. Доказана гибридная природа генетического материала и постепенная элиминация ДНК ячмэня при бэкнросскровании гибридов на ропь. Показано, что при объединении родительских геномов в одной гибридной клетке в них идут процессы реорганизации генетического материала, в которых участвуют механизмы амплификации и делении определенных участков генома, а такте такие, о природе которых трудно сделать определенный вывод. Некоторые перестройки в гибридных геномах соответствуют геномный изменениям, наблюдаемым при дивергенции видов.

Изучение возкозности участия в структурных перестройках генома активируемых при стрессе отдаленной гибридизации криптичес-ких мобильных элементов позволило впервые показать наличие в геномах злаков последовательностей ДНК, гомологичных известному мобильному элементу кукурузы (Ds SH-M5933). Анализ первичной структуры Вам HI фрагмента генома Н.VULGARE- содержащего одну из самых распространенных в геноме последовательностей pHv 7161, подтвердил присутствие потенциально мобильных генетических элементов.

Использованный нами подход и выбор объектов позволили сделать ряд заключений, имеющих принципиальное значение для понимания фундаментальных проблем молекулярной организации генома эука-риот:

1.Геном ячменя и других видов злаков (рожь, пшеница) илеют тот же набор структурных элементов, который отличает геномы эукариот: простые тандемно организованные ГШ ДНК; мобильные генетические элементы (МГЭ); ПЛ. организованные сложным образом, кластерами рассеянные по геному.

2.Наряду с общими для эукариот закономерностями в структурной организации геном ячменя имеет свои характерные особенности, отличающие его дала от ближайшего рода SECALE.

Комплексное изучение структурной организации ПП злаков и ее изменений позволило экспериментально подтвердить их наиболее ха~

рактеркое общее свойство, состоящее в пластичности, способности к постоянному и быстрому обновлению генома. Скорость зтого процесса существенно повышается при стрессовых воздействиях на геном. Полученные результаты свидетельствуют в пользу направленного, запрограммированного характера этих изменений. Высказанные предположения могут составить основу концепции для развития нового направления в изучении повторяющихся элементов генома эукариот, которое мо.тет быть с,формулировано как молекулярный анализ механизмов быстрых геномных изменений, сравнение их с мехаж'змамн эволюционных преобразований геномов.

Отдельные клоны из полученных библиотек БПП Н.VULGARE и S.CEREALE могут быть использованы в практических работах по идентификации геномов различных видов злаков и гибридного материала. В ответ на запросы наши клоны переданы во многие Институты Советского Союза и других стран (СШ, Германия, Австралия, Индия, Новая Зеландия).

Апробация работы. Результаты настоящего исследования обсуя-дались и были представлены на 4-м и 5-м съездах БОГиС им.Н.И.Вавилова (Кишинев,1S32; Москва,1937), Всесоюзном рабочем совещании "Геном растений. Структура, экспрессия и модификация" (Уфа,1532), Всесоюзной научной конференции "Геном растений" (Черновцы,19S3), 5-м, 6-м, 7-м Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, .198.1,1937,1990), 2-й и 3-й Международной школе-конференции по генетике (Болгария,1934,1986), Всесоюзных совещаниях по структуре и функции хромосом (Пущино,1985, 1988), 9-м Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка,1987), Международных рабочих совещаниях по Программе 5.1.1.4. КП НТП СЭВ (Москва,1987,1988; Болгария,1989), XII Конгрессе EUCARPIA (Гетгинген, 5РГ.1Э89), Мездународной конференции по биотехнологии растений (Киев,1990), 5-й Всесоюзной школе "Молекулярные механизмы биологических процессов" (Минск, 1990), 6-м Международном симпозиуме по генетике ячменя (Хельсин-борг, Швеция,1991), 1-м Международном симпозиуме по пшеницеевым (Хельсинборг, Швеция, 1991 ).

Структура работы. Диссертация изложена в форме научного док-

лада. Материалы, использованные в диссертации, получены самостоятельно и в соавторстве с.группой сотрудников Института цитологии и генетики СО АН СССР т Е.А.Салиной, С.К.Свиташевым, Л.Л.Тимофе-еЕОй, С.А.Труновой, В.А.Толстых, В.В.Гулевич, В.В.Соловьевым, Т.А.Потаповой, В.А.Потаповым, сотрудниками Института молекулярной биологии и генетики АН УССР - В.Т.Соловьяном и В.А.Кунахом, сотрудником Центрального института генетики и исследования культурных растений (Гатерслебен, Германия) - Р.Кшастом. Всем коллегам автор выражает благодарность. Автор также глубоко признателен А.Г-Ромащенко за постоянное заинтересованное обсуждение результатов этой работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ВЫСОКО ПОВТОРЯЩЕИСЯ ДНК ЗЛАКОВ (8,10,12,19,21,23,26)*

К настоящему моменту не обнаружены качественные, принципиальные различия между элементами и структурой геномов растительных и животных клеток. Например, гены, кодирующие . растительные белки, так же как и гены животных, имеют интрон-экзонную структуру (Wilbot et al.»1982; Dennis et al.,1984), хотя, как и у животных, встречаются и случал отсутствия интронов, например в генах запасного белка кукурузы - зеина (Ни et al.,1982). Единственное отличие количественного характера состоит в более высоком содержании ПП ДНК в геноме растений. Особенно характерно это для злаков. В среднем на долю ПП приходится 75% суммарной ДНК злаков iflavell, 1980). Для сравнения у человека эта величина составляет 20$, у курицы 20-30, у быка 25-30, у мыши 40$. Вообще размер генома злаков (3,6-8,6 пг ДНК на гаплоидный геном, за немногими исключениями) существенно превышает таковой, например, у человека (3 пг).

По-видимому, имеет смысл всю эту массу ДНК каким-то образом классифицировать, разбить на группы или классы последоБательнос-

*- цифры соответствуют номерам работ в списке литературы.

тей с теми или иными общими свойствами, в настоящий момент стройной системы классификации нет и трудно ожидать ее создания, т.к. слипком велики сложность и разнообразие последовательностей днк. Однако некоторые попытки были сделаны.

В 70-х годах после работы (Britten, Kohne,1SS8) общепринятым становится деление суммарной ДНК на три больших кинетических класса по числу копий в геноме: высоко повторяющиеся, умеренно повторяющиеся и уникальные последовательности. Т.к. скорость ре-асссциации в значительной степени зависит от температуры и ионной силы раствора, а такие из-за произвольного выбора значений Сот (произведение концентрации ДНК на гремя реассоциации), такое деление представляется во многом условным. В последующие годы ПП все чаще классифицируют по способу организации з геноме на 1) простые, тацдемно организованные последовательности (меньзая часть повторов) и 2) повторы, организованные значительно сложнее, чередующееся с уникальными и/или негсмологичными повторяющимися. Оказалось, что последовательности первого типа имеют, как правило, очень Еысокую степень повторяемости в геноме и по кинетическим характеристикам могут быть отнесены к высоким позторам. Второй тип последовательностей часе всего составляют умеренные повторы. Как видно, разные способы деления повторов отражают различные свойства одних и тех же больших классов последовательностей.

В данном исследовании мы следовали традиционной классификации britten, Kohne и выделяли класс ВПП днк злаков (также как и класс УПП) согласно кинетике реассоциации ядерной днк при граничных значениях Сот-0,02- Выбор этой величины был обосновал результатами дополнительного исследования, которые будут.описаны далее. Задача данного раздела работы состояла в сравнительном исследовании некоторых характеристик классов ПП днк злаков. Предполагалось, что это будет способствовать более полному общему представлению об этих двух фракциях генома и их специфических особенностях.

1.1. Способность к реитерации ВПП ДНК злаков. (1,6,7)

Явление реитерации описано Корнбергом с соавт. (KORNBERG ET AL..1964), которые показали, что искусственные олигонуклеотиды,

состоящие из коротких повторяющихся единиц, в условиях реакции

ции и одноцепочечного смещения многократно копируются (реитериру-ют). Нами изучена способность к рейтерации классов высоких и умеренных повторов ДНК ржи S.CEREALE и пшеницы T.AESTIVUM, выделенных при различных граничных значениях Сот (0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,10). Оказалось, что у обоих видов при Сот=0,02 все реите-рирупцие последовательности отделяются от основной массы ДНК и входят в состав высоко повторяющейся фракции. О наличии реитера-ции судили по увеличению абсолютного количества ДНК и по увеличению процента включения метки.

Определение нуклеотидного состава ДНК пшеницы показало, что фракция высоких повторов обогащена содержанием А+Х нуклеотидов (А+Т/Г+Ц=1,55) по сравнению с исходной тотальной ДНК (AfT/Г+Ц =1,24). АТ-нуклеотиды в основном и вовлекаются в процесс реите-рации, что ведет к увеличению после реакции отношения AtT/Г+Ц в ВПП ДНК до 2,85.

'ник-трансляции" при 37 С в результате нескольких актов реплика-

,0,

1.2. Хромосомная локализация. (2,3,4,6)

в)

б )

\ i

Рис.1. Гибридизация ¡к эпи ПП ДНК на хромосомах злаков:

а).3Н-ВПП ДНК ржи;

б).3Н-БПП ДНК ячменя;

в).3Н-УПП ДНК рни.

Метод гибридизации in SITU позволил выявить особенности хромосомальной локализации ВП и УПП ДНК. На рис.i(а,б) показано, что основные сайты концентрации высоких повторов расположены в теломерных районах хромосом ржи и прицентромерных районах хромосом ячменя. Это совпадает с расположением гетерохроматиновых участков на соответствующих хромосомах. Для умеренных повторов отсутствуют предпочтительные сайты их локализации. Как видно на рис. 1(в) метка равномерно распределена по всем хромосомам ржи и их участкам. Такие же результаты получены с препаратами метафазных хромосом пшеницы и эгилопса.

1.3. Межвидовая гетерогенность отдельных классов ПП в геномах злаков. (3,9)

Оценка межвидовой гетерогенности различных классов ПП ДНК, выражающей процент общих (гомологичных) и видоспецифичных (или родоспецифичных) последовательностей, позволяет судить о процессах изменчивости геномов в процессе эволюции. Сравнительное изучение степени гетерогенности во фракции БП и УПП показало наличие в обоих классах общих для различных видов злаков и видоспеци-

фических последовательностей ДНК (табл.1). При этом выявились HQ'S

которые интересные особенности. При гибридизации Н-еысоких повторов пшеницы с суммарной ДНК ржи (прямая гибридизация) процентное содержание общих последовательностей между двумя видами вьпе (80,8*), чем при обратной гибридизации 3Н-высоких повторов ржи с суммарной ДНК пшеницы (54,7$). Несовпадение процента гомологии прямой и обратной гибридизации наблюдается во всех экспериментах,

проводимых с Н-высокими повторами злаков. Это различие может быть обусловлено двумя факторами:

1.Различным процентным содержанием общих для двух видов последовательностей в классе ВП. Такие различия могут возникать вслед-ствии разного числа актов амплификации, которые претерпела та или иная общая последовательность после дивергенции видов (FLAVELL.1982).

2.Различием между двумя геномами в процентном содержании видоспе-цифических семейств ВПП ДНК.

При межвидовой гибридизации УПП процент гомологии в прямой и

обратной реакции весьма близок во всех изученных случаях. Эти результаты указывают на большую гетерогенность класса БП. В нем в большей степени отражены все те процессы изменчивости в структуре и организации отдельных последовательностей ДНК, которые происходят с ними в течении длительного процесса формирования генома каздого конкретного вида. Подчеркнем, что под гетерогенностью в данном случае мы понимаем не большее число семейств, составляющих тот или иной класс повторов, а различие в проценте общих для двух видов последовательностей ДНК.

Обобщая результаты, представленные в этом разделе, можно сделать вывод, что два класса ПП ДНК злаков различаются между собой не только по известным общепринятым критериям, таким как представленность в геноме и способ организации, но и по особенностям первичной структуры, выражающимся в способности к реитерации, хромосомной локализации и межвидовой гетерогенности.

Таблица 1. Гибридизация Н-меченных высоких и умеренных повторов некоторых видов злаков с суммарной ДНК, иммобилизованной на нитроцеллюлозных фильтрах (%).

_Суммарная ДНК на фильтрах_

Повторы пшеница_рожь_ячмень_овес_

3Н-высокие

пшеница 100 80,8±3,3 62,4±4,9 24,8±1,6

рожь 54,7±4,1 100 60,4±4,3

ячмень 75,1±4,2 75,0±3,6 100 32,9±4,3

Н-умеренные

пшеница 100 80,0±4,5 71,9±3,7 35,2±2,4

рожь 76,0±3,5 100 57,8±4,5

ячмень 72,5±4,4 60,6±4,3 100 38,6±3,5

Примечание. В каждом отдельном опыте в случае гомологичной гибридизации 60% 3Н-повторов ДНК связывалось с суммарной фракцией. Уровень гомологичной гибридизации принимали за 100%. В таблице преставлены средние величины 3-9 измерений и даны границы доверительных интервалов при уровнях значимости Р-0,95 (Рокицкий,1967).

2. анализ отдельных высокоповторяпцихся последовательностей днк HORDEUM VULGARE С15,16,18,20,28)

В связи с разработкой и широким использованием в 80-х годах методов генной инженерии стало ясно, что отдельные классы повторяющейся ДНК злаков (как и вообще эукариот) представляют собой весьма гетерогенные наборы отдельных семейств последовательностей ДНК. Они отличаются между собой по многим характеристикам: по числу копий в геноме, структурной организации в геноме, особенностям первичной структуры и др. В том числе,вероятно, и по их функциональней роли. Кроме того, любая таксономичеекая единица, ес-тесткенно, имеет наряду с общими принципами, характерными для гексма эукариот, какие-то свои особенности в структурной организации ПЛ. Поэтому в соответствии с задачами исследования из всего семейства злаковых, которое составляют около 8000 видов и 500 родов (ЦБелев,197б), мы решили уделить особое внимание анализу фракции ЕПП ДНК ячменя Н.VULGARE по следующим соображениям:

1.К началу данного исследования геном ячменя на уровне отдельных ПП представлял собой совершенно неизученный объект.

2.Так как одна из проблем, решаемых в данной работе, состоит в изучении структурной организации ПП в динамике - в процессе дивергенции видов и под влиянием стрессовых воздействий на геном -то адекватным объектом являются отдаленные гибрида. Такие гибриды, материнской формой которых служили различные виды ячменя, получены в нашем Институте Л.А.Першиной.

З.Эта же причина (п.2) послужила основанием для выбора высоко повторяющейся фракции ДНК, т.к. именно эта фракция является наиболее гетерогенной среди повторяющейся ДНК, о чем свидетельствуют результаты, представленные в 1 разделе, а также полученные на других объектах (hatch et al., 1976, bouchard et al., 1982, Jones, Flavell. 1982).- _

Наряду с детальным анализом фракции высокоповторяющейся ДНК Н.VULGARE мы изучили также отдельные ВПП ДНК ржи S.CEREALE ввиду того, что отцовской формой при получении отдаленных гибридов служили отдельные виды рода SECALE.

2.1. Библиотека клонов ВПП ДНК ячменя и рай. (15,28.33,35)

Наш были получены библиотеки клонов ВПП ДНК Н.VULGARE (сорт "Неполегающий") и S.cereale (сорт "Восточносибирская"). Клонирование проводили методом ГЦ-коннекторов по PsT-сайту в pBR 327 (MaKIATIS et AL., 1982) pe ассоциированных до Сот=0,02 и обработанных Sj-нуклеазой последовательностей из тотальной ДНК. Клоны с ыаксимальной силой сигнала при гибридизации, соответственно, с днк Н.vulgare и S.cereale были отобраны для дальнейшего анализа. Они представляют собой набор последовательностей, различающихся по длине (от 80 н.п. до 600 н.п.).

При анализе 17 отобранных клонов из библиотеки ВПП ДНК

H.vulgare нами были поставлены две задачи:

I.Изучить представленность этого набора клонов в близких к hordeum родах secale и triticum.

2.Среди выбранных клонов идентифицировать отдельные ВПП ДНК, составляющие класс высоких повторов Н.VULGARE и выявить последовательности, различающиеся по структурной организации в геноме. Результаты дот-гибридизации (по KAFATOS ET AL. ,1979) рекомбина-нтных плазмид, содержащих отдельные ВПП Н.VULGARE с суммарной ДНК T.AESTIVUM и S.cereale показали, что из 17 клонов 11 содержат последовательности, присутствующие также в геномах пшеницы и ржи, т.е. являются общими для этих трех родов. Из остальных, две последовательности (pHv7191, PHv7241) преставлены в геномах ячменя и ржи и отсутствуют или представлены незначительным числом копий в геноме пшеницы. Четыре последовательности (pHv7036, PHv7223, PHv7263, PHv7308) отсутствуют или представлены незначительным числом копий в геномах пшеницы и ржи, т.е. являются родоспецифи-ческими для ячменя, таким не способом из библиотеки клонов ВПП S.CEREALE были идентифицированы шесть клонов, содержащих родоспе-цифические последовательности для ржи (pSc7132, pSc7162, pSc7200, PSc7204, pSc7218, PSc7250). Были изучены некоторые характеристики этих клонов. С использованием пшенично-рканных дополненных линий было показано, что клоны pSc7200 и pSc7250 имеют тандемную организацию в геноме. При этом pSc7250 отсутствует во 2-ой хромосоме ржи, а количество копий pSc7200 значительно уменьшено в 4-й и 5-

хромосомах. Эти результаты были подтверждены и с помощью гибридизации in SITlb которая такге продемонстрировала, что основными сайтами локализации этих последовательностей являются теломерные районы хромосом. Таким образом, клонированные нами ВПП ДНК ржи отличаются от известных, полученных ранее последовательностей, иаприг/?р pSc74 (BEDRFtöOK ET al.,1980). я могут являться молекулярными маркерами отдельных хромосом

Далее, среди отобранных 17 клонов iL vulgare был выявлен клоп, phv7241> содержащий впп днк, тандемно организованную в геноме. Это подтверждается картиной блот-гибридизации (по southern,1975) суммарной ЛНК н.vulgare, обработанной рестр;пстазой hln'F 1 с °*"Р-ДНК pHv7241. Имеет место так называемая "лестница" фрагментов гибридиз^шш с расстоянием меяду ними примерно 600 н.п. и умекь-иениом гатепсивности сигнала с увеличением длины Фрагментов. Однако эта последовательность шлеет сложную тандемную организацию, т.к. наблюдается дополнительные фрагменты в 450 н.п. и 900 н.п. В этом случае, вероятно, большой повтор, имеющий тандемную органи- I заци» содержит внутри себя короткие подповторы. Такие сложные тандегио организованно пп были описаны в геноме рзи (bedbrook et al.,1980) и у многих других объектов.

Нами в геноме ячменя выявлепа и простая тандемно организованная последовательность. При блот-гибридизации суммарной ДНК ячменя, обработанной Sau ЗА. с 32-ДНК рТа! возникает типичная "лестница" с расстоянием между фрагментами гибридизации ~330 н.п. Клон pTal (metzlaff et al., 1986) представляет собой последовательность длиной 700 н.п., клонированную из "реликтовой" ДНК (Bedbrook et al.,1980) пшеницы и полученную нами от д-ра Метц-лаффа (Университет г.Халле, Германия). Короткий фрагмент лестницы элюировали из геля и клонировали в pBR 327 по вам hi-сайту. Полученный клон, pHvl» содержал нужную.последовательность и при блот-гибридизации с ДНК ячменя, пшеницы и ржи, обработанных различными рестриктазами (Sau ЗА, bam hi, tag i. hlnd iii и др.), давал одинаковую картину, типичную для тандемно организованной последовательности (рис.2). Число копий pHvl в геноме ячменя 105. Таким образом, нами клонирована простая тандемно организованная

12 3

ВПП ДНК, общая для различных видов злаков.

0.8 -

1.7 -

Остальные ВПП из нашего набора относятся к последовательностям, имеющим слоеную организацию, т.е. они соседствуют в геноме с уникальными или другими, негомологичными последовательностям;!. В то же время их

Рис.2. Блот-гибридазация Р-ДНК PHvi С суммарной ДНК Н.vulgare Ü), T.aestivum (2), S.cereale (3),обработанной ТАО I.

нельзя отнести к рассеянным по геному в виде отдельных

копий последовательностям по

типу ALU I повторов, т.к. они имеют ограниченное число

фрагментов гибридизации с суммарной ДНК при гидролизе 6-ти буквенными рестриктазами. Сравнительный анализ набора фрагментов, полученных при блот-гибридизации отдельных клонированных последовательностей ДНК и исходной фракции высоких повторов с ядерной ДНК ячменя, обработанной Вам HI, BGL И, HlND Ш, показал, что отобранные клоны охватывают все основные фрагменты гибридизации этой фракции ДНК. На основании результатов блот и дот-гнбридизации наших клонов с ДНК пшеницы, ряи и ячменя, а также прямых экспериментов по гибридизации их между собой обнаружено, что PHV7161. PHV7190, pHv7245 - высоко гомологичны, pHv7263 частично входит в состав более крупного фрагмента pHv7308.

Таким образом, выделено и охарактеризовано 15 последовательностей ДНК Н.vulgare, преставляющих основные семейства фракции высоких повторов. Три из них - pHv7036, PHV7223, pHv7308(pHv7263) - родоспецифичны, а pHv7191 и pHv7241 отсутствуют в геноме пшеницы. Две последовательности - pHvl и рН'/7241имеют тандемную организацию в геноме, остальные - более сложную. Вероятно, они рассеяны по геному в виде кластеров.

3. МЕЖВИДОВАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВПП ДНК В РОДЕ HORDEUM (18,20,24,23,31,34)

Полученную и проанализированную библиотеку клонов ВПП ДНК Н.VULGARE использовали для изучения числа копий и структурной организации у различных видов HORDEUM- Были выбраны сень видов,

H,VULGARE, H.BULBOSUM, Н.JUBATUM, H.MURINUM. Н.GENICULATUM, Н.TURKESTAN I CUM, H.BREVISUBULATUM. которые распространены на территории СССР и тлеют разную степень родства согласно данным систематики (Бахтеев,1976) и результатам анализа межвидовых скрещиваний (BOTHMER ЕТ AL.,1986). Задачами данного раздела было определить степень изменчивости:

I.В количественном содержании кинетических классов ПП и отдельных ВПП ДНК у разных видов HORDEUM.

2.В геномной организации ВПП и выявить последовательности, проявляющие RFLP (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов), что позволит использовать их в качестве молекулярных маркеров геномов отдельных видов ячменя. 3.1.Количественная оценка содержания кинетических классов и отдельных ВПП. (24,28)

Содержание разных классов ПП в геномах семи видов ячменя определено методом реассоциации ДНК (BRITTEN, K0HNE.1968) до значений Сот=0; 0,01; 0,1; 1,0; 10 в двух независимых экспериментах, в кавдом из которых ДНК после реассоциации подвергалась обработке Sj-нуклеазой в трех повторностях. У Н.GENICULATUM наблюдается наибольший процент ВПП, реассоциирующих до С0Т=0,01. H.BULBOSUM и H.BREVISUBULATUM отличаются от других видов более высоки»/ содержанием УПП (Сот ОТ 0,1 до 1,0). Кроме ТОГО, У Н.TURKESTANICUM наблюдается превышение количества ДНК, реассоциирующей от Сот=1 до Сот=Ю, относительно остальных шести видов ячменя и у H.MURINUM - относительно двух видов. В целом, несмотря на варьирование содержания отдельных фракций ПП, общее количество повторов, выделенных при Сот=Ю- существенно не различается.

Известно, что в семействе злаков варьирование между видами по количеству ДНК на гаплоидный геном может достигать 100%

(FURUTA, 1970). Показано, что межвидовые изменения происходят главным образом за счет БПП ДНК (BEDBROOK ET AL., 1980). Особенностью рода HORDEUM является отсутствие существенных межвидовых колебаний в содержании ДНК на гаплоидный геном (BENNETT, SMITH, 1971). Наше исследование повторяющейся фракции этого рода с помощью кинетики реассоциации ДНК в большинстве случаев не выявило существенных различий в суммарном содержании ПЛ. Между тем, количество последовательностей ДНК, входящих в состав определенных кинетических классов (СОТ ДО 0,01; от 0,1 до 1,0; от 1.0 до 10), неодинаково у изученных видов. Резкое увеличение доли определенного кинетического класса ДНК у вида (H.GENICULATUM содержит 13,4Ï ДНК, реассоциируюией при С0Т=0.01) говорит о появлении новых ви-доспецифических последовательностей в этом классе или разном уровне амплификации имеющихся.

Более детальный анализ процессов изменчивости в повторяющейся ДНК возможен с использованием отдельных клонированных последовательностей. Количественная оценка числа копий была сделана для некоторых последовательностей, имеющих характерные особенности (рис.3). Последовательности pHv7161, PHv7179, PHv7191 предварительно оценивались как самые распространенные в геноме Н.VULGARE, PHv7223 является родоспецифической, pHv7290 подобна предыдущей по структурной организации и рНу7241 имеет тандемнуо организацию и присутствует в геномах ячменя и ржи и отсутствует в пшенице. Отношение числа копий последовательности, определенного в "жестких" условиях отмывки фильтров (т=65°С) к числу копий, определенному в "мягких" условиях (50°С), отражает соотношение дуплексов с высокой степенью гомологии и дуплексов, содержащих до 15-18« нуклео-тидных замен, т.к. снижение температуры отмывки на 1°С соответствует 1,0-1.2$ нуклеотидных замен (WANG, KALLENBACH,1971).

Результаты оценки числа копий показывают, что наиболее распространенными последовательностями в геноме ячменя являются pHv 7191 и pHv7161. число копий которых 2,5-3,0.1О5 в мягких условиях отмывки. Это составляет около Ii генома и примерно на порядок меньше количества копий наиболее распространенных последовательностей в-геноме ржи (BEDBROOK ET AL., 1980)- PHv?161 максимально

Рис.3. Число копий (N) некоторых ВПП ДНК Н.vulgare на гаплоидный геном видов hordeum- Порядок видов здесь и на рис. 4-6: 1~Н.vulgare. 2-H.bulbosum, З-H.jubatum» 4-H.gehiculatum. 5-H.brevisubu-latum, 6-h.turkestanicum, 7-h.murinum. Жирная линия соответствует "жестким" условиям отмывки (т°=65°С), тонкая - "мягким" условиям (т°=50°С).

представлена у диких видов в противоположность геному Н.VULGARE> где максимальное число копий приходится на pHv7191- Характерной особенностью pHv7191 является наибольшее содержание (около 80%) последовательностей ДНК с высокой степенью гомологии в геноме Н.VULGARE (рис.3), количество которых более чем в 15 раз превосходит содержание аналогичных последовательностей у других видов ячменя. Это указывает, что pHv7191 амплифицировала в геноме Н. VULGARE позднее других ВПП. PHV7161 является более древней последовательностью, т.к. в отличии от pHv7191 встречается у всех изученных злак и возникла, по-видимому, в их общем предке. У диких видов H0RDEUM число копий всех шести проанализированных последо-

т.п.н.

вательностей уменьшено по сравнению с Н.vulgare- Родоспецифическая последовательность pHv7223 имеет наименьшее число копий. Во всех случаях ближе других видов к Н.vulgare находится Н.bulbosum. Остальные пять диких видов в большей степени отличаются от Н.vulGARE и незначительно различаются между собой, особенно по проценту дуплексов с высокой степенью гомологии.

3.2.Геномная организация ВПП в роде HORDEUM.(24,25,28,31,33,34) 4 5 6 7 Сравнение спект-

ров блот-гибридизации тандемно организованных в геноме Н.vulgare последовательностей pHvl и pHv7241 показало сохранение этого способа организации в геномах остальных видов ячменя. При этом спектр простого тандема pHvl был идентичен у всех видов, а спектр более сложного pHv7241 характеризуется существенными колебаниями в в интенсивности отдельных фрагментов гибридизации у диких видов (рис.4).

Картина сравнения блот-гибридизации сложно организованных ГОТ представлена на рис.5. В спектре фрагментов pHv7161 можно выделить три наиболее характерных, длиной 1,1; 1,5 и 1,8 т.н.п., в разной степени представленных в геномах отдельных видов. Увеличение/ослабление относительной силы сигнала отдельных фрагментов является хорошей иллюстрацией процессов амшшфикации/делеции. проходивших в ходе дивергенции видов. Сложно организованные ПП могут соседствовать в различных участках генома с различными не~ гомологичными ПП. Например, pHv7161 имеет общие фрагменты гибри

0.45-

32,

Рис.4. Блот-гибридизация Р-ДНК pHv?241 с ДНК видов HORDEUM- обработанной HlNF I.

.1!. 12 3 4 5 6 7

12 3 4 5 6 7

11.5

О ritl*3

V- '".»

1.71.1 -

СЗ'Э л в» с»

б)

' ш

в)

Рис.5. Блот-гибридизация 32р-ДНК pHv7161 (а), pHv7191 (б) и pHv 7179 (в) с ДНК видов HORDEUM. обработанной Bgl И.

дизации как с pHv7302, так и с pHv7036, PHV7179 и pHv 7191-ДРУГОй самой распространенной последовательностью. Такие чередования ПП должны образовывать протяженные участки повторов в геноме.

Н.vulgare и H.bulbosum имеют более близкие по длине фрагменты гибридизации семейства рНу719Ьчем остальные пять видов, длина фрагментов гибридизации которых существенно меньше. pHv7191 представляет яркий пример амплификации, копийность ее в геноме н.vulgare почти на два порядка выше, чем в геномах диких видов. Следует отметить полную идентичность спектров гибридизации pHv7161 и

5 6 7

т.H.H.

1 2 3 4 5 6 7

а)

- 4.5 -

- 2.7 -

- 1.8 -

- 0.9 -б)

32г

Рис.6. Блот-гибридизация р-ДНК pHv7053 (а) и pHv 7223 (б) с ДНК видов HORDEUM- обработанной HlNDHI.

PHV7191 У Н. BREVISUBULA-TUM и н.TURKESTAN I CUM И отличие спектра H.BULBOSUM от других видов, в том числе и от Н. VULGARE.

Последовательности

тельности pHv7053, pHv7223. pHv7290 и fHv7293 гибридизуются с фрагментами обработанной HlND HI ДНКН.VULGARE, регулярно различавшимися по длине на 900 н.п. (рис.6). Однако, нет оснований утверждать о полной гомологии этих последовательностей, т.к. при обработке другими рестриктазами они выявляют различный спектр фрагментов и отличаются по степени повторяемости в геноме злаковых. RFLP-ана^лиз с помощью этой группы последовательностей указывает На более близкое родство Н.VULGARE С H.BULBOSUM И Н.TURKESTANIсим с Н.BREVISUBULATUM. В геноме H.MURINUM данные последовательности представлены в очень небольшом количестве (рис.5,6). pHv7223, PHv7290 и pHv7197 в "жестких" условиях отмывки обнаруживают фрагменты гибридизации только с ДНК Н.VULGARE и H.BULBOSUM- Тем самым они могут служить удобными молекулярными маркерами данных видов. Все другие наши последовательности также могут быть использованы для этой цели, т.к. в большинстве случаев проявляют RFLP-

Мы уже упоминали, что BENNETT и SMITH (1971), измерив содержание суммарной ДНК у 17 диких видов HORDEUM и 5 сортов культурного ячменя, установили, что по этому показателю род HORDEUM. в отличии от многих других родов растений, является очень стабильным и не показывает достоверно значимых вариаций. Они полагают, что изменения геномов в роде в процессе видообразования шли за счет геномных перестроек. Наши результаты по RFLP-анализу ДНК семи видов с использованием ВПП являются хорошим подтверждением этого положения. За исключением двух видов, Н.TURKESTANICUM и

H.BREVISUBULATUM. которые не показали вообще никаких отличий друг от друга, для всех остальных видов существуют свои особенности в структурной организации и копийности тех или иных ВПП. Согласно степени этих вариаций мы полагаем, что изученные виды можно классифицировать в следущие группы:

I. Н.VULGARE. H.BULBOSUM.

2. H.BREVISUBULATUM, H.TURKESTANICUM.

3. H.GENICULATUM, H.JUBATUM.

4. H.MARINUM.

Вопрос о возможной функциональной роли ПП является в настоящий момент в высшей степени дискуссионным. В числе прочих неодно-

I )

кратно высказывались. предположения о возможном участии Ш в поддержании конформации хромосом и в хромосомном спаривании (FLA-vell.1980; Jones, Flavell, 1982). прямых подтверждений этих предположений пока не получено. Поэтому представляло интерес сравнить наши результаты этой части работы с результатами по получению и исследованию межвидовых гибридов в роде hordeum (VON bothmer ЕТ al., 1983,1986). Анализируя способность скрещиваться и давать потомство среди 39 комбинаций различных видов hordeum> а также поведение хромосом в ходе мейоза у гибридов, авторы различают четыре "основных" генома, они приходят к выводу, что h.vulgare и н. BULBOSUM обладают одинаковым геномом "I", h.marinum и h.murinum имеют различные геномы ("X" и "У", соответственно), а все другие виды - один и тот re или несколько модифицированный геном "Н". Мейотическое спаривание, изученное ими у 13 комбинаций, было низким, за исключением гибридов h.vulgare x н.bulbosum. к сожалению, комбинация H.BREVISUBULATUM X Н.TURKESTANICUM не изучалась, но некоторые авторы считают, что это один вид (Цвелев,1976; VON ВОТ-HMER ЕТ AL.,1989). Мы полагаем, что имеет место хорошее соответс твие между этими данными и нашими результатами по изучению копий-ности и геномной организации ВПП у семи видов h0rdeum. Тем самым нал набор впп может использоваться для предварительного прогнозирования результатов межвидовых скрещиваний.

4. молекулярный анализ отдаленных гибридов HORDEUM x SECALE

(5,11,19,22,25,32)

Видоспецифическая организация повторяющейся днк любого вида формировалась на протяжении миллионов лет и поколений. Однако, как стало ясно в последние годы,, процессы, изменяющие копийность и структурную организацию отдельных последовательностей днк, могут протекать очень быстро и обновлять геном на протяжении жизни | одного поколения и его потомков ("быстрые геномные изменения"). Столь высокую способность к обновлению лучше всего определить таким термином, как пластичность растительных геномов (walbot, CuLLIS, 1985). В пластичности растительных геномов заключен важный

резерв для адаптации к меняющимся внешним окружающим условиям и к изменениям внутренней генотипической среды. К одной из форм стресса Мак-Клинток (McClintock.1984) относит отдаленную гибридизацию. Она полагает, что при скрещивании отдаленных видов и родов растений гибридный геном попадает в необычную генотипическую среду, которая вызывает различные изменения и перестройки на уровне геномов и отдельных хромосом. Однако, практически ничего не известно об изменениях на уровне отдельных последовательностей ДНК, происходящих в этих условиях. Отдаленная гибридизация была выбрана нами в качестве модели еще и потому, что сейчас это направление в создании новых форм растений получает все большее развитие наряду с генной инженерией, гибридизацией соматических клеток, соыаклональной изменчивостью. Для всех этих направлений можно выделить две проблемы, имеющие универсальный характер:

1.Проблема идентификации генетического материала.

2.Реакция генома на новое генотипическое окружение.

В этом разделе работы мы попытались изучить эти проблемы на примере гибридов различных видов HoRUEliM X SECALE. 4.1. Идентификация родительского генетического материала у

гибридов. (Доказательство гибридности отдаленных гибридов).

(5,11,22,32)

Нами были исследованы следующие гибридные комбинации: 1 )стерильный гибрид, полученный в результате скрещивания диплоидных видов Н.VULGARE (сорт "Неполегающий") и S.kuprijanovii (2n=14); 2)гибриды F^ между тетраплоидными видами H.geniculatum и S.cereaLE (сорт "Саратовская", 2n=28) и последующие беккроссы с диплоидной рожью S.CEREALE (2n=14). Беккроссы имеют 21 хромосому (Нуме-рова и др.1990); 3)беккроссы первого и второго поколения (ВС1 и ВС2) от скрещивания гибридов H.jubatum x S.cereale (2n=28) с диплоидной рожью S.CEREALE (2N=14).

Для доказательства того, что геном гибридных растений действительно гибриден, мы использовали родоспецифичные для каждого родителя ПП ДНК (pHv7036, PHv7223 - родоспецифичные для HORDEUM и pSc7147. pSc7200 - родоспецифичные для SECALE). На рис.7 показано, что и ячменные, и ржанные родоспецифичные последовательности

2.11.9-

«е

а©

34567 1234567

Рис.7. Блот-гибриди-зация родоспецифкче-ских для SECALE ^Р-ЛНК (PSC7147. PSC7200 -а,б) и для HORDEUM (PHv7036. PHv7223-B,D на ДНК: 1-Н.VULGARE, 4 5 6 7 2-Н.VULGARE X S.KUP-RIJANOVII, 3-S.KUPRI-цо . janovii, 4-H.GENICU-

latum, 5-H.genicula-tum x S.cereale (pl), 6-H.geniculatum x s. cereale (P2), 7~S.cereale. Геномная ДНК обработана HlND 1П (а,б,г) и ВамШ (в), pl и р2 - различные растения.

1 2 3 4 5 6 7

4,7-

г.в- «á '

присутствуют в гибридном геноме и не изменяют своей структурной организации относительно родительских видов.

Метод блот-гибридизации клонированных ПП, как родоспецифн -ческих, так и общих, дает возможность также однозначно различить геномы гибридов Fj от геномов беккроссов на рожь (bcj). Как видно на рис.8 интенсивность фрагментов гибридизации, характерных для ДНК ячменя у ВСj уменьшается по сравнении с Fj. а интенсивность фрагментов, характерных для ДНК р.ти, увеличивается. Наши методы позволяют также заф:пссировать процесс элиминации хромосом ячменя 7 8 9 10 11

яр

Рис.8. Блат-гибридизация -Р ДНК PHV7161 с геномной ДНК (7-11), обработанной Bgl î: 7-H.jubatum, 8-S. cereale, 9-11-H.jubatum X S.CEREale (bct, bc2pl, HCgpS). Стрелкой указан фрагмент, характерный для ячменя и исчезавший у беккроссов второго псколену.л.

1 ,1-0'-»^ -

4,5-

в ВС2 по сравнению с ВС^ по полному исчезновению фрагментов, ха-. рактерных для ДНК ячменя. Эти результаты свидетельствуют о том, что используемые наш наборы клонированных ПП являются удобным инструментом для идентификации и маркирования гибридных геномов, позволяя при этом количественно оценить удельный вклад каждого из родителей. В этом заключается возможное практическое приложение данной работы.

4.2. Структурная организация ПП в геномах отдаленных гибридов.

(22,25,32)

При изучении геномов отдаленных гибридов" кроме проблемы идентификации родительского генетического материала нас интересовал другой вопрос, имеющий фундаментальное научное значение. Действительно ли, как предполагала МажКлинток, при отдаленной гибридизации в составляющих гибридный генотип родительских геномах происходят процессы реорганизации с участием известных механизмов амплификации, делеции, транслокации и др.? Как было показано в предыдущем разделе родоспецкфические, ПП присутствуют в гибридных геномах и не изменяют своей структурной организации. Однако родо-специфические последовательности составляют лишь небольшую часть полученного наш набора ПП Н.VULGARE (раздел 2). Поэтому предста вляло интерес изучить геномную организацию общих для различных родов последовательностей, более древнего эволюционного происхождения.

Из проанализированных нами 16 растений гибридов H.GENICULA-TUM X S.CEREALE И H. JUBATUM X S.CEREALE в Двух случаях зафиксировано исчезновение фрагментов гибридизации, что указывает на возможные делеции участков генома в гибридных растениях. При этом в одном случае (ВС^) исчезают фрагменты, характерные для ДНК ячменя, а в другом (Fj) - для ДНК ржи (рис.9). Цитологический анализ показал, что в ядрах клеток гибридных растений не отмечается видимых структурных нарушений.

В последние годы неоднократно появлялись сообщения об амплификации или делеции отдельных участков родительских геномов при отдаленной соматической или половой гибридизации (MOORE, SlNK> 1988; LAPITAN ET AL-, 1988). Представленные нами результаты нахо-

1 2 3 * 5 S' ?• :

2,81,7- ¡

32r

1 2

S8W

? «

3 b

1,1-í 0,8-j

Fïic.9. Плот-гибридизация 00Р-днк PHV7293 (а) и pHv7l6l (б) с ге-комной ДКК (1-7), обработанной Хва I (а) и ALU 1 (б): 1-Н.GENICULATE!, 2-S.CEREALE, 3-7-H.GENICULATUM X S.CEREALE (34^2, 4-ВС,Р2, 5-FjP3, 6-BCjP3, 7-FjP4). Стрелкой указан фрагмент: a - характерный для ДКК рзи и исчезающий у одного из растений F*• б - характерный для ДКК ячменя и исчезающий у одного из ВС,.

дятся з русле этих работ. Значительно pese отмечаются транслокации или другие типы структурных преобразований. На спектрах блот-гибридизации о них можно судить по исчезновению одних фрагментов и появлению новых. Описаны случаи тралслокации целых плеч хромосом у твднично-ржаных дополненных леей (May, Appels, 1980), которые такяе являются продуктом отдаленной гибридизации. У гибридов кукуруза х трипсакум было, отмечено появление нового фрагмента рибосомальной ДНК, отсутствующего у родительских зидов (Lin LT al.,1985).

Перестройки генетического материала з гибридных г?н:::'ах которые не описываются просто процессами амплификации и делзц,'.;!, бшш обнаружены нами в ДНК, зыделешшх из '.Ччосроссяид 'cao:?;» ВС.. Стоит отметить, что НС, от скрещивания шо'гкдоз Н. ;t."JATUM S.cereale на рогь и следующее поколение зс„ (.Ч'-гго три ритэкип не имеют качественных различий в своих спекгрзх гпбрг'.пзгц::": сравнению с родительскими видсг;л.

12 3 4 5

Рис. 10. Блот-гибридизация 32р-ДНК pHv7161 (а) и pHv7191 (б) с.геномной ДНК, обработанной bgl II: 1 -H.genIculatum, 2-H.geniculatuh X s.cereale (2-bc^Pl, 3-bc2P2), 4-s.cereale, 5-H.jubatum.

Особый интерес представляют беккроссные растения, полученные от скрещивания гибрида F^ H.GENICULATUM х S.CEREALE с рожью. На рис.Ю представлены их спектры гибридизации с наиболее распространенными в геноме ячменя последовательностями pHv7161 и pHv 7191. В случае обработки ДНК рестриктазой BGL П У 1-го беккрос-сного растения (pl) отмечено исчезновение фрагмента гибридизации длиной 4,2 т.н.п., присутствующего у H.GENICULATUM, и появление нового - 6,2 т.н.п. При'обработке другими рестриктазами также отмечаются появления новых фрагментов различной длины. У 2-го бек-кроссного растения (р2) картина гибридизации с любой из использованного нами набора последовательностей представляет сумму фрагментов, характерных для каждого родителя, pl в отличии от р2 показывает качественные различия и в спектре гибридизации с другой последовательностью - pHv7191. Здесь вместо двух коротких фрагментов длиной 1 т.н.п. и 1,25 т.н.п. и характерных, соответственно, для ДНК ржи и ячменя в спектре гибрида отмечается один фрагмент промежуточной длины - 1,15 т.н.п.

Изменения в спектре гибридизации pl относительно родительских видов отмечается также при использовании других клонированных последовательностей - pHv7179, PHv7293. По-видимому, структурные перестройки затрагивают относительно протяженный участок

генома, насыщенный ПЛ.

Исключительно важным представляется тот факт, что для большинства проверенных рестриктаз и клонов новые фрагменты, появляющиеся в спектре pi, также отмечены в спектрах гибридизации ДНК другого дикого вида ячменя - Н.jubatum (рис.10). Однако, при гибридизации PHV7161 с ДНК, обработанными рестриктазой Rsa Ь картина блот-гибридизации pi отличается как от обоих родительских видов, так и от спектра Н.JUBATUM. Можно предположить, что выявленные у беккросса pi изменения структурной организации могут быть связаны с существованием внутрипопуляционного полиморфизма у родительских видов и в скрещивание было взято растение с редким биотипом. Присутствие разных биотипов у ряда диких видов ячменя, отличающихся по геномной организации ПП, было показано (GUPTA ЕТ al.,1989). Для проверки этого предположения ДНК из 30 индивидуальных растений тех популяций каждого родительского вида, что были использованы в скрещиваниях, гибридизовали со всем набором клонов. Была выявлена полная идентичность спектров гибридизации ДНК для всех растений каждого вида. Эти данные указывают на возникновение в процессе отдаленней гибридизации качественно новой организации соответствующих участков генома у некоторых гибридных растений. При этом происходящие изменения частично совпадают с теми, что происходят в процессе дивергенции видов. Подобная закономерность также была выявлена при цитогенетическом анализе внутривидовых гибридов ячменя (Бадаев,1989). Новые точечные блоки С-гетерохромат1ша появлялись не в случайных местах на хромосомах, а в позициях, характерных для видового кариегкпа ячменя.

Суммируя результаты, представленные в данном разделе, можно утверждать, что полученные нами наборы клонированных ПП ячменя и ржи весьма перспективны для изучения геномов отдаленных гибридов. С их помощью доказана гибридная природа генетического материала и постепенная элиминация ДНК ячменя при беккроссировании гибридов на роль. Показано, что при объединении родительских геномов в одной гибридной клетки в них идут процессы реорганизации генетического материала, которые включают в себя как амплификации и делеции определенных участков генома, так и механизмы, о природе

которых трудно сделать определенный вывод.

5. ПОВТОРЯЩИЕСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК С ХАРАКТЕРИСТИКАМИ МОБИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ (13,17,27,28,29)

Результаты изучения геномов отдаленных гибридов HORDEUM X SECALE и прежде-всего обнаруженные наш изменения в структурной организации генетического материала гибридов поставили вопрос о возможных причинах и механизмах, лежащих в основе этого процесса. В качестве объяснений мы рассматриваем два предположения:

1.Изменение степени метилирования ДНК гибридов.

2.Транслокации различных по протяженности участков генома родительских видов вследствии активации криптических мобильных элементов.

Что касается первого предположения, то в литературе описаны изменения в степени метилирования ДНК в клетках растительных тканей при культивировании их in VITRO (Хвырлева и др.,1986; BROWN, 1989 ; ANDERSON ET al., 1990), что также, как и отдаленная гибридизация, является одним из стрессовых факторов. Кроме упомянутых в разделе 4 мы использовали ряд других рестриктаз и ПП в экспериментах по блот-гибридизацки ДНК родительских видов и ВС^ гибридов H.GENICULATUM X S.CEREALE- Большинство из рестриктаз, при обработке которыми выявляются различия, чувствительны к метилированию (например BGL П. BGL I, ХВА !)• Однако, нами были использованы и рестриктазы, например Rsa I. для которых не описана чувствительность к метилированию, но которые также давали различия в спектрах блот-гибридизации. Поэтому определенно можно сказать только то, что если имеет место различная степень метилирования гибридной и родительской ДНК, то не только ею объясняются возникающие изменения. В связи с этим значительно большее внимание мы уделили исследованию правомочности второго предположения. 5.1. Наличие в геномах злаков ПП, гомологичных мобильному Ds-эле-

менту кукурузы. (13,17)

Непрерывно растущий поток информации о мобильных генетических элементах (МГЭ) дает основание полагать, что значительная

часть генома зукариот является нестабильной, т.е. способна под влиянием определенных факторов перемещаться. В силу некоторых причин, о которых упоминает Хесин (1986), до последнего времени кукуруза была монополистом МГЭ среди растительного царства. В настоящий момент МГЭ обнаружены у многих других видов растений. Однако, к началу нашего исследования не было прямых данных о присутствии МГЭ в геномах таких видов злаков, как пшеница, ячмень, рожь. Поэтому для обоснованности второго предположения, мы полагали, прежде всего , необходимо было показать принципиальное наличие МГЭ у объектов нашего исследования.

В качестве зонда был использован Ds-контролирующий элемент кукурузы (GEISER ЕТ AL. ,1982). Он был вырезан с помощью ВАМ HI из рекомбинантной плазмиды, полученной на основе pBR 322 и любезно предоставленной проф.п.старлингером (Кельн, Германия). Этот Ds-элемент представляет собой участок локуса SHRUNKEN длиной 2,7 т.н.п., выделенный из мутантной линии кукурузы SH-M5933 (GEISER ЕТ AL., 1982). Присутствие Ds-подобных последовательностей в геномах различных видов и сортов пшеницы, ячменя и ржи проверяли методом дот-гибридизации. Количественная оценка этих экспериментов приведена в табл.?. Видно, что в геномах изученных, злаков содержится примерно от одной до трех сотен Ds-подобных последовательностей (в зависимости от вида и условий гибридизации), что примерно на порядок меньше содержания их в геноме кукурузы. При этом различия между родами TRITICUM, SECALE и HORDEUM невелики. Существенное уменьшение (в среднем в 2 раза) числа копий в жестких условиях отмывки фильтров указывает на то, что в .геномах злаков присутствует довольно значительное количество Ds-подобных последовательностей, имеющих различную степень гомологии к Ds SH-М5933, в том числе и довольно низкую.

Степень соответствия первичной структуры многочисленных Ds-подобных последовательностей первичной структуре Ds-3JieM9HTa из лок'са SH-M5933 можно выявить при сравнении кривых плавления ДНК-дуллексов, образованных при гибридизации Ds-элемента с ДНК различных видов злаков. Из данных табл.2 видно, что Тп„ ДНК пшеницы, ржи и ячменя не показывают достоверных различий между собой

Таблица-2. Число копий и Тпл Ds-подобных последовательностей в геномах злаков.

число копийж

Вид

Геном Мягкие уело- Жесткие ус- Потери Т °С вия отмывки ловия отмы- %

пл

Т.MONOCCOCUM А

Т.DICCOCUM AB

T.TIMOPHEEVI AG

T.aestivum ABD

S.CEREALE

119

83 218 337 160

57 43 94 155 70

48 52

43 46 46 45 48 45.5

H.VULGARE "VlNER"

185

Z.mays

Ds sh-M5933

1950

10 54

ж-число копий определено как среднее значение результатов а-ь экспериментов. Мягким условиям отмывки соответствует температура 20 С жестким - 55 с.

и существенно ниже Тпл Ds-элемента (на 8-9°), имея по сравнению с ним 9-11$ замен нуклеотидов. Кривые плавления Ds-подобных дуплексов в ДНК пшеницы, ржи и ячменя подобны и показывают значительно более резкий подъем при низких температурах. Такой характер кривой должен быть следствием значительной гетерогенности по степени гомологии Ds-подобных последовательностей и/или полидисперсности по длине.

Исходя из полученных нами данных, можно утверждать о наличии в геномах изученных злаков набора Ds-подобных последовательностей, гетерогенных по длине и степени гомологии к Ds-элементу из локуса SH-M5933 кукурузы. Тем самым в геномах злаков должны присутствовать потенциально мобильные последовательности ДНК. 5.2. Особенности первичной структуры Вам н1-Фрагмента генома

н.vulgare. (27,28,29)

Все мобильные элементы растений имеют характерные общие особенности в своей структуре (обзоры Хесин,1986; FED0R0FF, 1989) ■ К ним следует отнести: наличие на концах МГЭ инвертированных повто-

с-а с-о

Т-А I о

т о т-А

A-Î 0-0

с-а т

Т-А с-о

о-с т-л

с л о-с

Т-А Т-А

92 СССЛ-ТССС 571 356 TCCCT-AÏCCC 571

Рис.11. Специфические особенности первичной структуры ВАМ HI-фрагмента: а)-локализация субповторов; б)-локализация палиндромов и инвертированных повторов, фланкированных прямыми повторами; в)-потенциальше функциональные сайты:( г~~\)-бсксы для РНК-полиме-разы ix, {'■ чт-лптгг для рнк-полимеразы iii, ( =я )-знхансеро-подобные последовательности, (Л )-сигнал полиаденилирования; г)-район, содержащий инвертированные повторы на концах, ограниченные короткими прямыми повторами 1 и 2.

ров, ограниченных короткими прямыми повторами; насыщенность МГЭ короткими прямыми и инвертированными повторами; наличие открытых рамок считывания; значительные отклонения гц-состава от среднего ГЦ-состава генома (PoHLMAN ET AL., 1984)- что указывает на их чужеродное происхождение.

Для дальнейшего подтверждения наличия в геноме злаков потенциально мобильных последовательностей ДНК и изучения возможности участия их в структурных изменениях генетического материала гибридов мы исследовали первичную' структуру ВАМ HI-фрагмента генома н.vulgare. Этот фрагмент длиной 999 н.п. назвали вам hi-фрагментом, так как он входит в состав повторяющихся единиц, вырезаемых при обработке ДНК н.vulgare рестриктазой Вам hi- Он содержит последовательности pHv 7245, pHv 7302 и одну из наиболее распрост-

ранеичих г геноме ячменя рНУ 7161. которая дает различия в спектрах блот-гибридисацпи родительских видов и гибридов. Мы не будем приводить весь анализ первичной структуры этого фрагмента (Салина и др.,1990), отметим только наиболее интересующие нас здесь моменты. Анализ первичной структуры выявил короткие субповторы трех типов - А, В, С, которые неравномерно представлены в различных частях фрагмента (рис.11а). Каждый тип субповторов состоит из повторяющихся единиц длиной 12-17 н.п., которые более чем на 65$ гомологичны определенному консенсусу. Сравнение консенсусов А и В типов (58? гомологии) и их организация в ВАМЧН1-фрагменте говорит о возможном происхождении их из одной повторяющейся единицы. Расположение А и В субповторов в левой части фрагмента (от 50 до 600 н.п.), а С субповторов в правой части (от 600 до 9Э9 н.п.) указывает на сложную организацию ВАМ Ш повторяющихся единиц.

Фрагмент обогащен инвертированными повторами. Особо следует выделить тот факт, что два инвертированных повтора длиной 16 н.п. (в позициях 95 н.п. и 568 н.п.) и 12 н.п. (в позициях 360 н.п. и 567 н.п.) ограничены прямыми короткими повторами (рис. Ив,г). Вся область (95 н.п.-56в н.п.) Вам Ш-Фрагмента ДНК (рис.116,в) кроме того имеет следующие особенности: содержит субповторы а и В типа и граничит с субповторами С типа; насыщена сигналами инициации транскрипции для РНК-полимераз; содержит открытую рамку считывания; обладает внутренней структурой, отличной от соседних областей. Как видно, присутствуют все характерные черты МГЭ, перечисленные в начале раздела. Поэтому в распространении по геному данного фрагмента ДНК, вероятно, существенную роль играли механизмы транспозиции, хотя гомологии с прямыми и инвертированными концевыми повторами известных МГЭ найдено не было.

6. заключение (14,23,25,26,30,31)

Исследования структурной организации ПП ДНК эукариот были начаты с развитием методов генной инженерии и продолжаются второе десятилетие. Большинство работ следует основной стратегии: выделение отдельных семейств повторов, детальный анализ и описание их

геномной организации, первичной структуры и других характеристик. Наше исследование развивалось в другом направлении. Мы полагали, что прежде чем переходить к изучению отдельных семейств или определенных участков генома, полезно дать некую общую характеристику целого класса повторов, состоящего из довольно значительного набора отдельных семейств.

В процессе исследования появились работы, посвященные анализу целого ряда семейств ПП ржи (BEDBROOK ET AL. ,1980a,B; JONES, FLAVELL, 1982a,в) и льна (CULLIS, CLEARY, 1986a,в), Оригинальность нашего подхода заключается в том, что подробная характеристика класса ВПП злаков и, в частности, Н.VULGARE, дается в сочетании с широким системным исследованием геномной организации отдельных семейств этого класса в динамике, под влиянием двух факторов -дивергенции различных видов HORDEUM и стресса отдаленной гибридизации. Это дает возможность сравнить результаты влияния этих факторов с целью поиска общих закономерностей в изменениях структурной организации ПП. В качестве основного объекта нашего исследования был выбран ячмень - один из наиболее распространенных и важных в практическом отношении злаков. Кроме того, были использованы и ряд других видов злаков. Это позволило нам выявить как .специфические особенности в организации ПП у ячменя, так и общие закономерности, характерные для всего семейства злаков. К началу, данной работы исследовшшя молекулярной структуры генома ячменя на уровне отдельных последовательностей ДНК отсутствовали. В пос-■ ледние годы они появились (Ананьев и др.,1386; Белостопкий и др., 19so; Junghahs. Metzlaff, 1988; Sonina et al.,1383; Gupta st al.. 1989; Molnar et al. , 1989; Belostotsky et al.,1990; Hueros et al.,1990). следует отметить, что наша и перечисленные работы не повторяют, а взаимодополняют друг друга. В результате, род horde-UM относительно повторяющейся части генома является в настоящий момент наиболее изученным среди злаков.

Из результатов нашей работы следует, что класс ВПП ДНК злаков имеет характерные признаки, отличающие его от УПП, и представляет собой набор различи:,ix семейств последовательностей. Детальный анализ этого класса повторов у ячменя позволил выявить как

общие с другими родами злаков, так и специфические характеристики. К первым следует отнести:

а).Отсутствие существенных различий по общему количеству в геномах.

б).Наличие как простых тандемно организованных повторов, так и перемежающихся с другими повторяющимися и уникальными последовательностями.

Специфические для ячменя характеристики ВПП выявляются при сравнении с другим хорошо изученным родом злаков - secale (Bedbrook et al.,1980; Jones, Flavell, 1982a,в):

1).Фракция ВПП Н.VULGARE более гетерогенна. Нами описано 15 семейств, которые составляют 6-8% генома. У ржи 4 семейства охватывают 8-12% генома. Копийность наиболее распространенных последовательностей в геноме Н.VULGARE не превышает 2.10 , тогда как у ржи число копий самой представительной последовательности на порядок больше.

2).Из всего набора изученных высоких повторов Н.VULGARE только два pHv 1 и pHv 7241 имеют тандемную организацию (суммарное содержание 1.3-1.6Í генома). У ржи все охарактеризованные семейства тандемно организованы, но три из них являются сложными тандемами, т.е. имеют внутри себя субповторы.

3).Три родоспецифических семейства ВПП ДНК ячменя представлены примерно одинаковым числом копий (~6.104) и составляют 0,4-1,0 % генома. Тогда как родоспецифические семейства составляют основную часть высоких повторов ржи, 5,5-9,5$ геномной ДНК.

На основании этого сравнения можно сделать еьшод о том, что эволюционные изменения повторяющейся ДНК рода HORDEUM сопровождались более низким уровнем амплификации последовательностей. Это подтверждает точку зрения BENNETT, SMITH (1971) о том, что эволюция рода HORDEUM шла без каких-либо значимых изменений в количестве ДНК, а в основном за счет внутригеномных перестроек. Из этого положения следует следствие о возможной роли повторяющейся ДНК, которое может в значительной степени объяснить и объединить наши результаты по изучению геномной организации ВПП у различных видов HORDEUM и отдаленных гибридов HORDEUM X SECALE. Оно заключается в том, что пластичность, способность к постоянному и быстрому изме-

нению (обновлению) '- наиболее характерное свойство ВПП ДНК злаков. В последние годы накапливается все больше экспериментальных данных в пользу концепции (flavell,1982; walbot, cullis.1985), что геном растительной клетки постоянно находится в состоянии "flux" или "turnover" - постоянного потока обновления, который происходит в процессе эволюции л который.существенно ускоряется, когда клетка или организм попадают в стрессовые условия. При этом, по-видимому, активируются различные молекулярные механизмы реорганизации генома: амплификации, делеции, транспозиции, изменение степени метилирования и другие„ еще неизвестной природы. Как свидетельствуют наши данные. ПП ДНК, весьма вероятно, играют в этом потоке обновления ведущую роль. В пользу такого вывода говорят и многочисленные данные о геномных реорганизациях и участии в них ПП, полученные при воздействии на растительные клетки другого стрессового фактора - условий культивирования in vitro (Cul— lis, Cleary. 1986: Zheng et al.,1987; Cuzzoni et al.,1989). такие ' результаты получены и с нашим участием (Соловьян и др.,1986).

В связи с этим важнейшим является вопрос: происходят ли изменения, ведущие к обновлению генома, хаотично, стихийно, создавая большое разнообразие генетических вариантов, из которых впоследствии отбираются самые подходящие, или же эти изменения имеют элемент направленности, предопределенности, присутствующей в самой структуре генома. Очевидно, что в клетке существуют оба пути. О механизмах и роли первого из них (мутаций) известно очень много. Отметим, что этот путь медленный и вклад его в изменение структуры повторяющейся ДНК может быть зарегистрирован, как правило, в процессе эволюционных преобразований. В случае необходимости быстрого реагирования на меняющиеся условия внешней среды или другие стрессовые факторы в растительной клетке запускаются механизмы второго пути, которые можно было бы назвать механизмами быстрого реагирования. Мы полагаем, что .наши результаты, указывающие, что некоторые перестройки в гибридных геномах частично воспроизводят те геномные различия, что наблюдаются при дивергенции видов, свидетельствуют в пользу направленного, запрограммированного характера геномных изменений. О том же говорят и ре-

зультаты сравнения изменений одного и того не набора ПП ДНК у разных генотрофов льна и у нормальной и культивируемой in vitro ткани (cullis, 1986). Автор пришел к выводу, что они подобны и вызываются одними и теми же механизмами. Предполагается, что в геноме существуют определенные локусы, ответственные за контроль ответа растения на стресс (cullis, creissen,1987). При этом важно подчеркнуть, что, по-видимому, не все мономеры, составляющие семейство ПП, могут быть в одинаковой степени лабильны. На это указывают наши данные по изменению только одного фрагмента гибридизации у гибридов. Доля таких последовательностей, степень их изменчивости и другие параметры должны определяться локусами "стрессового ответа". Еще одно экспериментальное подтверждение получено в работе Roth et al.(1989). Они обнаружили, что при культивировании клеток соевых бобов хм vitro вновь возникающие аллельные варианты в различных локусах являются почти всегда теш же, что и ранее найденные и охарактеризованные у других сортов.

Одна из основных трудностей заключается в интерпретации обнаруживаемых изменений в геномной организации и числе копий повторов из-за отсутствия прямой связи с фенотипическими признаками. В последнее время показано существенное значение запрограммированных генных перестроек в изменении экспрессии кодирующих участков ДНК у одноклеточных организмов и для создания разнообразия посредством пересортировки генных сегментов, например в случае образования иммуноглобулинов у млекопитающих (borst, greaves, 1987). Обнаружена прямая связь между отсутствием короткой тандем-но организованной ПП и снижением выживаемости у линий дрозофилы (Uu et al.,1989). Такого рода данных пока немного. Но все более обоснованным становится положение, что вновь возникающие комбинации повторяющихся элементов генома, повышая его пластичность, тем самым повышают возможности выбора оптимальных для адаптации и выживания комбинаций. По меткому замечанию Флейвелла (flavell, 1989) "комбинация ПП и всех ферментов, способных реагировать на эти комбинации, является биологическим динамитом".

выводы

1. Фракция повторяющейся ДНК ячменя и других видов злаков содержит набор структурных элементов, характерных для генома эу-кариот: простые тандемно организованные последовательности, последовательности, тлеющие структурные особенности мобильных эле-?/.ентов, последовательности со сложной организацией, перемежающиеся с другими повторяющимися или уникальными последовательностями. Геном ячменя имеет особенности, отличающие его от эволюционно наиболее близкого рода SECALE:

а). Более гетерогенный набор семейств ЕПП.

б). Меньшее число тандемно организованных последовательностей и, соответственно, пониженное общее содержание их в геноме.

в). Меньшее число родоспецифических семейств ВПП и, соответственно, пониженное общее содержание их в геноме.

2. Фракция ВПП ДНК злаков, креме более высокого числа копий составляющих ее .семейств последовательностей, имеет другие общие свойства, отличающие ее от УПП: особенности первичней структуры, определяющие способность к реитерации; различия в степени межвидовой гетерогенности; предпочтительную локализацию в прнцентро-м.ерных и теломеркых районах хромосом.

3. Созданы библиотеки ВПП ДНК Н.VULGARE и S.CEREALE. Охарактеризовано 15 последовательностей ДНК ячменя, представляющих основные семейства фракции высоких повторов, определена их длина, гомология друг к другу, геномная организация, среди них ~чярлэ]:н

3 родоспецифические последовательности для HORDEL'!!, еще две присутствуют у ржи, но отсутствуют в геноме пшеницы.-В библиотеке ВПП ржи выявлены 6 родоспецифических последовательностей для SECALE. Все клонированные последовательности, показывающие RFLP, являются молекулярными маркерами соответствующих видов и могут использоваться в различных исследованиях для идентификации геномов.

4. Проведено сравнительное исследование структурной организации и числа копий ВПП ДНК у семи видов рода HoSfCEUM. Подтверждено ранее высказанное предположеше (REMETÍ, SíüTH, 197.1) > что

изменение геномов в роде HoRDEUM в процессе видообразования шло не за счет изменения общего содержания ДНК, а вследствии геномных перестроек. Показано участие в них механизмов амплификации и де-леции. Продемонстрирована эффективность использования охарактеризованного набора ВПП для RFLP-анализа различных видов HoRDEUM и предварительного прогнозирования результатов межвидовых скрещиваний.

5. Проведен молекулярный анализ геномов отдаленных гибридов HORDEUM X SECALE с использованием наборов ВПП ДНК Н.VULGARE и S.CEREALE. Доказана гибридная природа генетического материала и постепенная элиминация ДНК ячменя при бэккроссировании гибридоЕ на рожь. Установлено, что наши наборы клонированных ВШ являются удобным инструментом для идентификации и маркирования гибридных геномов и позволяют оценить удельный вклад каждого из родителей.

6. Изучено влияние стрессового фактора - отдаленной гибридизации - на молекулярную организацию геномов отдаленных гибридов. Родоспецифические для HORDEUM и SECALE ПП ДНК не претерпевают структурных изменений в геномах гибридов. Тем не менее, при объединении родительских геномов в одной гибридной клетке в них идут процессы реорганизации генетического материала, в которых, вероятно, участвуют различные молекулярные механизмы. Это выявлено при блот-гибридизации четырех общих для злаков, эволюционно более древних ГШ (рН'/7161. PHv7191. PHv7179, PHv7293) на ДНК родительских видов и гибридов Fj и BC1 H.GENICULATUM X S.CEREALE и

H.JUBATUM х S.CEREALE, обработанных различными ресгриктазами. Структурные перестройки затрагивают относительно протяженный участок генома, насыщенный ПЛ. Полученные результаты указывают на возникновение в процессе отдаленной гибридизации качественно новой организации соответствующих участков генома у некоторых гибридных растений.

7. Исследована возможность участия в структурных перестройках генома активируемых при стрессе отдаленной гибридизации крип-тических мобильных элементов. Установлено присутствие в геномах злаков набора Ds-подобных последовательностей, гетерогенных по длине и степени гомологии к Ds-элементу из локуса SH-M5933 куку-

рузы. Анализ первичной структуры ВАМ HI"Фрагмента генома Н.VULGARE» содержащего последовательность pHv7161, подтвердил присутствие в нем всех характерных особенностей структуры известных мобильных элементов растений.

8. На основании комплексного изучения структурной организации ПП ДНК злаков и ее динамики экспериментально обоснованно их наиболее характерное общее свойство, состоящее в пластичности, способности к постоянному и быстрому изменению (обновлению) генома. При этом не все последовательности, составляющие семейство ПП, могут быть в одинаковой степени "Лабильны. Б спектре блот-гибридизации ДНК гибридов изменению подвергся только один фрагмент. Полученные результаты свидетельствуют, что скорость этого процесса существенно повышается при стрессовых воздействиях на геном. Выявленные перестройки в структурной организации ПП у гибридов частично совпадают с теми геномными различиями, что наблюдаются при дивергенции видов. Это свидетельствует в пользу концепции о направленном, запрограммированном характере быстрых геномных изменений.

СПИСОК работ, опубликованных по теме диссертации

1. Вершинин A.B., Потапов В.А., Салина Е.А., Шумный В.К. Разделение повторяющихся последовательностей ДНК злаков по их способности к реитерации //4-й съезд ВОГиС им.Н.И.Вавилова. Тезисы стендовых сообщений. Кишинев, 1981, с.46-47.

2. Вершинин A.B., Потапоаа т.А., Потапов В.А., Салина Е.А., Шу1шый В.К. Изучение умэренноповторяющихся последовательностей ДНК некоторых видов злаков методом гибридизации in SITU // Доклады АН СССР, 1982, Т."265, N1. С.202-205.

3. Вершинин A.B., Салина Е.А., Сгиташев С.К. Быстрые и умеренные повторы ДНК злаков: локализация на хромосомах и количественные-соотношения // Тезисы Всесоюзной конференции "Геном растений". Черновцы, 1983, с.14.

4. Вершинин A.B., Салина Е.А., Свиташев С.К., Потапова Т.А., Уум-

ный B.k. Изучение быстрых и умеренных повторов ДНК злаков методами гибридизации // 5-й Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов". Тезисы докладов. Москва, 1583, с.94-95.

5. Шумный В.К. , Першина Л.А. , Вершинин A.B. Перспективы использования методов отдаленной гибридизации, культуры тканьй и генной инженерии у злаковых // 5-Я Бее союзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетичеггл" процессов". Тезисы докладов. Москва, 1983, с. 125.

6. Шумный В.К. , Вершшгин A.B.. Салина Е.А., Потапова Т.А., Потапов В.А. Повторяющиеся последовательности ДНК злаков:локализация in SITU и критерий для разделения двух кинетических классов // Геном растений. Структура и экспрессия. Уфа, 1983, с.100-109.

7. Вершинин A.B., Салина Е.А., Толстых В.А., Потапов В.А., Шумный В.К. Изучение реитерирукшх последовательностей ДНК некоторых видов злаков П Известия СО АН СССР, серия биологическая, 1984, Т.13, N2, С.47-52.

8. Вершинин A.B. Структурно-функциональная организация генома злаков // Сельскохозяйственная биология, 1984, N10, с.70-78.

9. Салина Е.А., Свиташев С.К., Вершинин A.B., Шумный В.К. Гетерогенность быстро и умеренно реассоциируюцей ДНК злаков // Доклады АН СССР, 1984, Т.279, N4, с.994-997.

10- Вершинин а.Б. Структурная организация генома злаков // Материалы 2-й Международной школы-конференции по генетике. г.София, Болгария, 1935. с.59-62.

11. Шумный В.К., Першина Л.А., Вершинин A.B. Методы получения и анализа межвидовых и межродовых гибридов ячменя // Молекулярные механизмы генетических процессов. Москва, 1985, с.266-282.

12. Вершинин А.Е. Использование генноинженерных методов в селекции растений // Сельскохозяйственная биология, 1985, N7, с.105-110.

13. Вершинин А.Е.. Салина Е.А., Свиташев С.К., Шумный В.К. Распространенность Ds-подобных последовательностей в геномах злаков // Доклады АН СССР, 1986, т.286, N2, с.440-443.

14. Сгл'^Ъль Б.Т.. Кунах В.А., Вершинин A.B., Шумный В.К. Сравне-

ште степени гомологии ДНК и количества побтспсеихся последо-ва толыюстей У i-итлктногс растега'я и культизируемих клеток RAUVOLFIA SERPENTINA BENTH./' Доклады АН СССР, 1936, т.287, fj.l, с.998-1 ООО.

15. Салит Е.А., Берзяшан А.В., с.к., Шумный В. К. Получи -нке и анализ клонов частопсвао; лше? ся ДНК л"мзня // Доклады АН СССР, 193S , т. 288, [.'2, с . .¡80.

16. свитагев С.К., всрвиппв А.В.. Сатина Е.А.. Пуг'льл"! В.К., выягли 1шз и анализ аидоспвцифичкых повторяющихся последозателькост.:-". ДНК пшеницы // 6-й Всесоюзный симпозиум ''Молекулярные мэ::али'..т"л генетических процессов". докладов. Москва, 1037, с. 139.

17. Vershinin Л.V.. Salina L.A., F/itashev S.K.. 2нш;.т/ Y.F. Thk

OCCURRENCE OF DS~LIKE SEOUENCES IN CEREAL GENOMES // TlIEOR.

Appl. Genet.. 1987, 7.73. N2. p.428-432. .

18. сашша Е.А., Тимофеева л.л., свитавев С.К., Вершинин А.В. Структурная организация частспсзторявкейся ДНК генома рода HORDEUM 'I 3-й Всесоюзтшй симпозиум "Структура и функции клеточного ядра ". Тезисы докладов. Черноголовка, 1357, с.125.

19. Вершинин А.В. Повторяющиеся элементы генома злаков // 5-й Вся-союз1Шй съезд ВОГиС им.Н.!1.Вавилова. Тезисы докладов. Москва, 1987, Т.5, С.137.

20. Салила Е.А., Вершинин А.В., Тимофеева Л.Л., Свитапез С.К. , Шумный В.К. Структурная организация частоновторяюшейся ДНК родз HORDEUM // 5-й Всесоюзный съезд ВОГиС им.Н.И.Вавилова. Тезисы докладов. Москва, 1937, т.1, с.246.

21. Vershin'I.n' Л.У. Repetitive elfments of the cereal genome // Материалы 3-й Международной школы конференции по генетике, г. София, Болгария, 1987. с.31 .16.

22. Свиташев С.К., Вершинин А.В., Першина Л.А., Салина Е.А., Шумный В.К. Анализ геномов гибридов HORDEUM X SECALE // Доклады АН СССР, 1983, т.298, N2. с.480-483.

23. shumny V.K.. Vershinin A.V. Genome organization in plant cells: is repetitive DNA redundant? // In:"Advances in Cell and Chromosome Research". (Eds: Sharma 8 Sharma). Oxford & IBH Publishing Co., Calcutta, 1989, p.47-72.

24. Салина Е.А., Тимофеева ji.ji.. Вершинин А.В. Межвидовая изменчивость в организации повторяющихся последовательностей рода HORDEUM // Генетика, 1989, Т.25, N4. с.595-604.

25. vershinin A.V., salinae.A., svitashev S.K., tlmofeeva L.L. The study of the repetitive DNA sequences of Hordeum genus and

hordeum x secale hybrids //science for plant breeding. book of

Poster Abstracts, part п. xh EUCARPIA Congress, Gettingen. Germany F.R., 1989, N30-2. 26- Шумный В.К., Вершинин А.в. Организация генома в растительных клетках: является ли повторяющаяся ДНК лишней? // Структурно-функциональная организация генома. Новосибирск, "Наука", 1989, С.115-149.

27. Салина Е.А., Соловьев В.В., Вершинин А.В. Геномная организация и первичная структура ВАМ HI-Фрагмента высоко повторяющейся ДНК HORDEUM VULGARE // 7-Й Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов". Тезисы докладов. Москва, 1990, с.172.

28. vershinin А.V., salina е.А. . soloviev V.V., TlMOFEEVA L.L. Genomic organization, evolution and structural peculiarities

of highly repetitive DNA of hordeum vulgare // genome, 1990, v. 33. N3. P.441-449.

29. Салина E.A., Соловьев В.В., Гулевич В.В., Вершинин А.В. Геномная организация и первичная структура ВАМ HI фрагмента высоко-повторяющейся ДНК HORDEUM VULGARE // Мол. биология, 1990, Т.24, N3, С.729-735.

30. vershinin а.v., svitashev s.k. . salina е.а. genomic changes during evolution and remote hybridization: is there any con-

netion? // Barley Genetics VI. Helsingborg. Sweden, 1991, v. 1. P.94-96.

31. Salina E.A., Vershinin A.V., Timofeeva L.L. Structural peculiarities of repeatitive DNA of Hordeum species // Barley Genetics VI. Helsingborg. Sweden, 1991, v.l, p. 163-165.

32. Svitashev S.K., Vershinin A.V.. Trunova S.A., Pershina L.A., Shumny V.K. Molecular analysis of the genomes of Hordeum x Secale remote hybrids // Barley Genetics VI, Helsingborg,

Sweden. 1991, v.l. p. 167-169.

33. Vershinin A.V.. Salina E.A. Tandemly arranged repeatitive DNA

sequence is common for triticeae // abstracts of ith international Triticeae Symposium. Helsingborg, Sweden, 1991, P2.14.

34. Salina E.A., Vershinin A.V., Timofeeva L.L. Utility of highly

repeated sequences for rflp analysis of hcrdeum species //

Abstracts of 1th International Triticeae Symposium. Helsingborg, Sweden, 1991, L2.4.

35. Kynast R., Vershinin A. Organization and chromosomal localization of genome specific repetitive DNA-seouences in rye //

Programme of 1th International Triticeae Symfosium. Helsingborg, Sweden, 1991, P.2.17, p.15.

Информация о работе

Вершинин, Александр Васильевич
доктора биологических наук
Новосибирск, 1991
ВАК 03.00.26

Автореферат

Похожие работы