Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение некоторых структурных параметров ДНК семян злаков при прорастании

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изменение некоторых структурных параметров ДНК семян злаков при прорастании"

Е?гЗ/,И:П;ГП ОРИШЛ ТРУДНОГО Ш'ШОТО зшяг &>ъгАЯЛВше1 университет

па правах рукописи

ШЯАСГЕЬПН Л8(Т Александровна

УШ£ 547.963,3

ИЭЛЕКЗНЙЗ НЕХОТОШ СТРУКТУРНЫХ ПАРАМЕТРОВ

;ип: с25п1 злаков при прорастании

03.С0.С2 - ЕЮФЩШ.

А в 7 о р э ф з р а ч

дяссерталии на соискание ученой степени кандидата бяодогичэсклх наук

Ереван - Г992

Рабата наполнена ва Kaisips бйофиайкв бкедоипегкзго факультета Еревгкокого орхек:: Трудового Кошеного fsavssa гссу-а •огвекисго уЕвверсягога.

HSjVHS.;« рТКОЕСЯЕТйЛИ: ¡ДОКГОр ОйСЛОГЕЧВСКВХ K2JK,

профессор КАКОСЯН Г.А., доктор аяалогЕчаски:: наук,

шлевштк и.о.

О^ств.плгннб оппонозтя: доктор биологических наук,

црефзорор КАРА1ЖГЯН А.Т., •

кшуашаг бкологачески" наук ЗШРЯН P.A.

Бэдунее учразденяе - Армяиоквй седьсхсохозяйствонккй икс;; ту:'» лаборагорея генофонда рзегеквй.

Заката'лнссэрг&лгв состоится -г У— часоз за ааседанкв спшяадЕзяровзлиого о:

i

часоз за ааседанкв спшяадЕзвровзлисго совега К 055.0I.0S по врасуздениз ученой степоия капвгдата Скологл-чесг.их наук npz Ереванского ордена Трудового Красного Знамени государственном унвворсигвтз (3750-19, Ереван, ул. Мргавна, I, Ерэзавсквй госуннзэрсЕтет, йвологгчоскЕй факультет, кефедра олохвидо).

С дгеевргапгей устно ознакомляйся б ивблистекв университета.

'Автореферат рааоаяав "¿¡СI8S2 года.

Ученый секретарь еяеавадвзврованкого coest-u, k;jsz. бкел, наук, с.к.с,

О'"*'

ВВЕДЕНИЕ •

Актуальность проблемы. Исследование нуклеиновых кислот с чки зрения познания основ эволюционного процесса наследствен-сти и изменчивости весьма перспективно для использования гене-ческих закономерностей в селекпии пшениц. Решающая роль в и следовании биологии клетки принадлежит, несомненно, биофизичас-ч методам.

Подавляющее большинство возделываемых пшениц представляют 5ой естественные аллополиплояды. Их генотипы заключают ,в себе 1 ( Т.durum Deaf., T.dicoccum Schrank И др.) ИЛИ три (T.aes--um L.,Triticaiy ) разнокачественных генома я имеют геномные . эмулы ААВВ, ААВВДД и ААВВВВ согласно систематика Кяхара-Сирса. сочниками этих геномов были ближайшие дяплоидные сородича пше-ш - однозернянки (геном А), эгилопеы (геномы В я Д), а для !тикале еще и рола» (геном RB).

Как теперь установлено, с конкретными геномами пшениц свя-1ы важнейшие биологические свойства я хозяйственно-пенные [знаки сорта. В селекции на эти признаки все большее значение юбретает аллополиплоидная селекция - получение амфядиплоидоз 1наш с привлечением геномов от других видов, в том числе от диких сородичей. В связи с этим возникает необходимость разотки эффективных биофизических а биохимических методов идев-икапии геномов и геномного анализа амфидиплоидов пшеницы. .

Для решения этих задач, а также для уточнения вопросов эво-ии и филогении Triticum необходим сравнительный анализ -уктуры геномов пшенипы я ее ближайших сородичей. При этом бый интерес представляют гомология и отличительные черты ор-азапии ДНК этих видов, которая составляет молекулярную осно-генома. Немаловажной характеристикой в этом плане являются /ктурныо перестройки генома при развитии организма и сравни-ышй анализ характера этих изменений пшеница относительно ее зкородственных сородичей. В зтом направлении большие перспэк-i открывав? методы высокоразрешавдей термической денатурации , определение уровня метилирования и кинетики реассойкгшии ' исследуемых пшениц.

Цель и задачи .исследований. Цель, настоящей работы заклэта-. в том, чтобы методами термической денатурация я к«четгки

роассоциапии, по содераанию 5-метилпитозина (5-мЦ) и по изоллят-ному составу ДНК провеете сравнительный анализ структуры геномов пшеницы в ее бликаЯткх сородичей, в определить корреляцию различий от плоидности и формулы генома.

Перед нами стояли следующие задачи:

1. Изучить термическую денатурацию ДНК злаков, получить Физические характеристики - Т^, дТ и ГЦ-содеряанве, а также определить степень различий по этим параметрам мевду сухими и прорастающими семенами злаков.

2. Получить дифференциальные кривые плавления (ДКП) сухих и прорастающих семян злаков в провести сравнительный анализ по профилям плавления.

3. Выявить зависимость физико-химических параметров от формулы генома семян злаков и динамику их изменений при прорастании семян.

4. Исследовать кинетику реассопиапии тотальных ДНК семян злаков с целью оценки общей структуры генома и выявить участки генома, ответственные за изменения физико-химических параметров при прорастании семян.

5. Провести сравнительный анализ изопл^гного состава ДНК сухих эмбрионов семян злаков к исследовать характер изменений этого состава при прорастании в с&язи с формулами геномов этих злаков. -

6. Провготя сравнительное исследование ДНК сухих эмбрионов семян злаков по содержанию 5-иЦ и выявить направленность этих изменений при прорастания семян.

Научная маботя. На примере нескольких ввдов и сор-

тов злаковых выявлены и рассмотрены различия физвко-хямических ларамзгров ДНК в зависимости от их сортовой или ввдовой принадлежности. Впервые исследовано содержание 5-мЦ на нескольких видах злаков:показано, что эта энзаыатическая модяфикапвя имеет ваяно? таксСЕСйичёское значение на примере сухих гкбргонов семян злаков. Также оценена возможность использования метода дифференциальных кривых плавления ДНК разных видов шаеншы и ее гибридов в исследовании различий или гомологии в структурах геномов злаков с точке зрения их систематики.

Результатами этих яесаадований выявлены различия в профилях плавления, уровне метвазврованяя, взопйитного в молекулярно-киазтзчэского состава ДНК сухах эмбрионов семян злаков. Показа-

о, что прорастание семян приводит к •глубоким перестройкам гено-а злаков, что я отображается на физико-химических параметрах с следованных нами ДНК. Выявлено, что эти изменения находятся определенной корреляции с метаболической активностью генома, вытекающие из нее структурные перестройки характерны для какого генома злака в зависимости от его плоидности и формулы.

С большой точностью-'*мотодом площадей", определен вааный аксономаческий параметр ДНК-сраднеа нуклеотидное содержание ДНК х).

Практическая значимость работы. Данные исследования имеют ак научную, так и практическую ценность. В научном плане данные э изменениям ДКЛ ДЕК, уровня метилирования л кинетики реассогш-зии при прорастания семян проливают свет на механизмы регуляция активалиа генома на ранивх стадиях онтогенеза растения и необ-эдимы для . дальнейшего прогресса в понимании основных пропес-зв его функционирования в клетке. Данные.исследования показали, го энзиматическая модификация генома (имеется в виду метилярова-1е ДНК по питозиновым остаткам), помимо таксономического -знача-ш, играет роль вторичного механизма регуляция рзпдакациа и :-анскраганш ДНК в клетке.

С другой стороны, эти исследования тлеют практическую зна-мость, тая кал они показали возможность применения биофизичес-!х методов, в частности метода плавления ДНК* как экспресс-тес-I геноглоз амфидиплоядов в селекции пшениц. Кроме того, данные следований о структуре ДНК могут быть полезны пря решении ря~ . вопросов эволюции, филогении я систематики рода тп+асиш.

Апробация работы. Материалы диссертации.докладывались на нференпяи, посвященной 70-лотию Вел. Окт. Рев., Тбилиси, 1987 , на Ш Республиканской конференции, посвященной проблемам фи-ко-химаческой-биологии а биотехнология, Ереван, Х58Э г., УП • нферэндии по сяектроскопаа биополимеров, Харьков, 1991 г..

Работа апробирована на совместном заседании кафедры биофаки и проблемной лаборатории биофизики субклеточных структур ологяческого факультета Ереванского госуниверситета 16 декаб-1991 г.

Публикадид. По материалам диссертации опубликовано шесть учных работ.

Объем работа. Работа язлскена на 127 страницах русского ма-

шинописного текста в содержит 9 таблиц в 22 рисунков. Список использованной литературы включает 244 наименования, в том числе 167 зарубежных источников.

Содешание работы. Работа состоит из введения, трех глав: I - Обзор литературы; П - Материалы и методы исследований; Ш -Результаты экспериментов и их обсуждение; Заключения, а также выводов и указателя литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение изолированных зародышей. Зародыши семян злаков -пшеницы трех сортов: Безостая-I, Армянка-60 в Воскеаск; тритикале сорта Сяс-1 клолбы сорта Арпи препарировали по методу Джон-стона и Штерна ( Johnstone ft Shtem,i957 ), а их жизнеспособность проверяли 01фапшванием нитросиним тетразолевым (Фирсова, 1978).

Получение проростков. Для исследования использовали элят-• ные семена, проращиваемые в термостате при 25-27 °С в течение трех и четырех суток-

Выделение ДНК.К растертому в ступке материалу добавляли буфер, содеркащий 0,15 M Nací, 0,1 M ЭДТА, 0,015 M цитрат Na , 0,1 M трис-аминометан и 0,1% Тритон Х-100, рН 8,2-8,4 и далее по методу С Marmur,i96l ). Далее полученные препараты очищали от примесей РНК, белка и полисахаридов до методу ( vardevan-yan,Tiratsuyan,1983 ).

Плавление ДНК. Плавление ДНК проводили на спектрофотометре Urícbb sp 8-юо в 0,1 «ssc . Нагрев осуществляли с помощью температурного црограммнвка с линейной скоростью нарастания ; 0,25 град/мин. Поглощение регистрировали на програвиируемом калькуляторе НР-97 s i/o. Точность определения температуры составляла ¿0,05 °С, оптической плотности ¿5«I0""^ ОЕ. Кривые плавления каадого црепарата снимались 12-15 раз. В экспериментах использовались 10 мм кварцевые кюветы с плотно притертыми теф-лоиозыми пробками.

' Дифференпиальные крише плавления/ДКП/были получены путем численного дифференцирования нормированных кривых плавления с использованием специально разработанной программы.

Кинетика реасоопиапии ДНК. Для исследования кинетики реас-сопиалии растворы ДНК в ОД. ssc в течение 15 мин насыщали ге-

!ем, обрабатывали ультразвуком в трубчатом излучателе ультра-зукового дезинтегратора УЗДН-I в течение 10 мин при частоте > кГп, 2,5 вт/см2 (Беридзе, 1978). Концентрация ДНК составля-1 I мг/мл. Препараты ДНК помещали в кварцевые кюветы, наноси-■1 на них тонким слоем вазелиновое масло, закрывали тефлоновой робкой и денатурировали в электрическом нагревателе SP -876. эсле денатурации кюветы выдерживали(15 мин] в воздушном термо-гате при НО °С в течение 15 мин я затем их быстро помещали об-1тно в кювет од ержатель спектрофотометра Unicam sp е-юо , тем-эратура которого была уже оптимальна (на 25°С меньше Т^) для ассоциации данного препарата ДНК. Оптическую плотность регяст-фовали на программируемом калькуляторе HP-97S 1/0.

Термическое фракционирование ДНК на колонках ГАП. Фрагмен-5рованную в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-I ДНК растворя-s В 0,01 М натрий-фосфатном буфере (НФБ), рН 6,8 в расчете I '/мл и удаляли из раствора воздух в вакууме. Полученные после той обработки фрагменты ДНК имели молекулярный вес 0,5 х 10ь , шьтон. ; ' - ' , '

Фрагментированную ДНК злаков затем фракционировали термички по составу на колонках гядроксиапатита ГАП по методу (Main А.Л., 1972).•

Хооматогоайическов определение нчклеотадного состава ДНК ■ 1акрв. Высушенные препараты ДНК гидролизовали 87$ муравьаной . юлотой в запаянных ампулах. Основания разделяли о помощью дву->атной восходящей хроматографии на бумаге Filtrak : в системе -бутанол-вода - 25%тцоп в соотношения 60:10:0,Г и определя-I спектрофотометрически (Васильев и др., IS72).

Определение среднего Щ-содеряания ДНК методом плавления. Среднее ГЦ-содержание блоков ДНК (х) определяли по формуле:

х = I--

■ % - тАТ , ' ( ■•■...'■;

;е S- площадь под интегральной кривой плавления ДНК, которая .ссчитана в интервале от ТАТ да Тщ, ТАТ и тщ - теулературы :авления поли -dAT я поли-лП^ гомополимегов^соответственно Ver!}evan?nn,i983 ) JU-содержание определяли-й-долях ДИК, нахэ- • щихся в выбранных температурных зонах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Исследование параметров плавленая ДНК злаков при прорастания

Нуклеотидное содержание ДНК является одной из фундаментальных характеристик ДНК и успешно используется в решении ряда такс номических задач. В сочетании с другими важнейшими характеристик ми оно может явиться четким критерием принадлежности организма к той или иной таксономической группе. Эти характеристики генетического материала, в особенности взятые в комплексе с другими признаками организма, способны оказаться одними из наиболее пенных л могут быть использованы для решения многих задач.

: Одним из наиболее точных и простых в использовании для реше ния такого рода задач является метод термической денатурации ДНК с помощьв которого можно точно вычислить Щ-содержание ДНК иссле дуемого объекта. Этим методом нами были исследованы ДНК сухих эмбрионов семян трех сортов пшениц, а такяе до одному сорту триг: кале и полбы. Вычисленные значения 1Ц-содеряания исследуемых ДНК злаков, а такяе параметры плавления этих ДНК приведены в табл.1.

Таблица I .

Характеристика ДНК сухшс эмбрионов семян злаков по параметрам плавления

ц/н Источник Формула - генома Т Апл в град. Ш

I. Безостая-1 ААВВДЦ 73,7±0,2 II, в 49,0

2. Воскеаск ААВВДД 73,0±0,3 12,1 47,1

3. Армянка-60 ААВВДД 72,3^0,2 12,2 46,0

4. Сис-1 ААВВЕЕ 72,§¿0,1 12,0 47,0

5. Арпи ААВВ 74,3±Р,2 12,3 50,1

Как видно из значений, представленных в табл.1, исследуемые злаки различаются по содержанию 1Ц-пар в ДНК. Как и следовало озы дать, температуры плавления повышаются с возрастанием ПЬсодержа-ния. Наиболее примечательно в этих данных, что пшеницы, имея одинаковые формулы генома, различаются по параметрам плавления. Наибольшего значения ГО-содержание достигает у ДНК полбы, температу-

1 плавления которой наивысшая среди-исследуемых злаков. Наибо-)в полную информацию о структуре ДНК злаков я различиях между 1ми дает дифференцирование нормированных кривых плавления.

Нами были получены дифференциальные кривые плавления для К исследуемых объектов. Профили плавления ДНК сухих и-пророс-гас семян злаков представлены по блокам в табл.2.

Таблица 2

Количество денатурировавшей ДНК сухих эмбрионов и проростков семян злаков в %, распределенной по температурным зонам

н Источник ДНК г' , Температурная зона в °С

до 65 65-70 70-75 75-80 80-86 выше •'•■'' ' 85

Безостая-1 сухие проростки 3,30 17,61 41,02 25,53 10,32 3,32 1,6 11,41 31,32 30,84 12,44 10,53

Воскеаск сухие проростки 4,72 10,22 37,60 25,35 15,01 6,27 3,71 18,00 35,49 19,47 14,53 7,77

Армянка-60 сухие проростки 14,34 24,76 30,77 19,04 7,69 3,37

Арпя (полба)сухив проростки 0,61 . 2,89 33,69 35,19 17,10 10,41 9,186 27,55 34,59 15,49 7,5 5,67

Сис-1 ' (тритик.) сухие проростки 2,64 12,64 37;90 26,20 13,30 7,25 22,66 47,22 19,71 5,19 3,39 1,47

Ошибка для каздого значения не приводятся: оня составляют 1,5-2?.

Из ДКП ДНК трех сортов гадонип' видно, что они, имея одинако-I формулу генома, различаются по составу оснований блоков, а же по температурам -плавления, интервалам плавления ДНК я по мам 'дифференциальных кривых плавления, (табл.1 и 2). Получен- различия меаду- гексаплошшыма пшеницами наводит на мысль о , что источниками происхождения их геномов А, В, Д , воз-но,были разные лизинга, что отразилось на структуре я харак-е плавления: их ДйС.

Различия мр-гду тритикале я гохбой связаны с появлением но-

вого по качеству ЕЕ генома, который привносит увеличение низкотемпературного пика плавление и общее понижение температуры плавления. Из этих данных следует вывод, что геному ЕВ присуще количественное преобладание блоков с большим содержанием АТ-пао.

Таким образом, выявлены внутривидовые различия между пшеницами со схожими формулами генома по параметрам плавления - Т^, дТ, среднему ТЦ-содерканию и профилям ДКЛ ДНК. Также были обнаружены межвидовые различия в пределах подтрибы 'Тгз.сэ.сз.пае и установлена корреляпия параметров плавления от плоидностя и формулы генома злака.

60 70 80 90 Т°С

Для исследования физических параметров ДНК й динамики изменений при прорастании семян нами был выбран один сорт пшени-пы - сорт Боскеаск, а также тритикале и полба. Они различаются маж собой как по физическим параметрам ДНК сухих эмбрионов, так и йо плоидности и формулам геномов. Чтобы установить подавляются эти различия мааду ними или, наоборот, усиливаются при прорастании, нами били исследованы ДНК из трех- и четырехдневных проростков семян. Дифференциальные кривые плавления ДНК сухих эмбрионов и 3-»4-дн. проростков пшеницы сорта Боскеаск представлены на рис.1 л имеют свой характерный профиль, отличный от профилей ДНК полбы в тритикале. .

ДКЛ ДНК трехдневных проростков пшеницы смещено в область высоких температур Т=76,5°С, хотя начало кривой плавления сме-

0.1

0,05

Рис.1. ДКЛ ДНК семян пшеницы сорта Боскеаск

— сухих эмбрионов

—-3-дн.проростков

•—4-дн. проростков

ю в область низких температур по сравнению с ДИ сухих змб-знов. Общее уширение кривой плавления свидетельствует об уЕвгении гетерогенности, усиления процессов, приводящих к глубо-I перестройкам структуры ДНК. В подтверждение сказанного, в исти высоких температур (90-95°С) появляются три небсльсих са с высоким содержанием ПЬпар, что характерно для ГЦ-бога-1 сателлитной ДНК (Ерагвадзе, 1983), а в области низких те;.:ле-?ур появляется маленький пик. Об общем увеличении гетерогенно-I ДНК по составу свидетельствует тог факт,, что дТ от. 12,1°0 зличиваетоя до 12,9°С для трехдневных проростков, а Щ-содер-1ие увеличилось от 47,1% до 50,0/4. К четвертое дню прорас-1йя эти изменения становятся более выраженнее, но носят не-ш>ко иной характер. Об изменениях параметров ДНК остальных 1Ков можно судить по данным, приведенным в табл.2 и 3.

\ Таблица 3

1 Источник Тцд (в град) 1 дТ (в град) Щ в %

Пленила . 3 дн. 76,5+0,2 . 12,9 50,0

4 дЗ. 70,15^0,3 12,75 41,1.

. Тритикале • 3 дн. 74+0,1 ; 10,5 50,3

4 дн. '..". 71±Р,2 11,5 42,7

Полба 3 дн. 71.4+0,3 12,5 44,1

4 дн. 72.4±0,2 12 46,5

Во всех случаях при прорастания происходят структурные из-ения ДНК,такие, как изменение соотношения молекулярных полу-. лй, выплавление участков с различной природой стабилизации.

Таким образом, обобщая все вышеизложенное, можно констати-ать, что геномная формула наряду с сортовой принадлежностью ковых имеет определенную корреляцию с параметрами плавления, орые могут играть важную роль в выявлении молекулярных харак-истик ДНК новых сортов пшениц, и вклад тех или иных молеку-них популяпйЯ может по разному проявляться на ранних стадиях растания.

' Получение ДКП ДНК для проростков злаков позволило судить о амике изменений в геномах злаков при его активации и выяснить.

зависит ля это каким-либо образом от-формулы генома данного раз-гения. Нагла было сделано предположение, что эти смещения еггязаяы с присутствием совершенно новой формулы генома Ей в -три-(АВ2), в отлетав .от гексаплоидной пшеницы - АВД или тат-рапдолдной полбы - АЗ. Данные по динамике изменений термической денатурация дам ДНЯ трех видов злаковых приведены в виде дааг-ра.\?л на рис.2-, указывающих на-особенности генома и его изменений, проясходящах при прорастании семян. •

Ряс.2. Диаграммы динамики изменений Твд в зависимости от времени прорастания семян: а - пшениш, б - тритикале, в - полбы.

2 3 су-кат)

Как видно из диаграмм , для представителей гексаплоидной секции характерна сходная зависимость от прорастания. Возможно, это связано с отсутствием у тетраплоидной полбы третьего генома-ДД, СО ила КЗ. С другой стороны, эти различия в температурах плавления, возможно, обусловлены недометилированностьо синтезаро-ванной й* поуо ДНК. Поэтому нам представилось весьма важным исследовать геномы злаков иными методами и выяснить уровни метилирования, молекулярные популяция и азоплитный состав,'данные ."' которых йогу? в некоторой степени объяснить выявленные закономерности изменений параметров плавления при прорастании семян злаков. ; •-, ' ' .г': - "■'.

- 13 -

2. Исследование кинетики реассониапии ДНК злаков. Из экспериментов по термической денатурации ДНК семян злаков были выявлены различия между ними.. Для выяснения, какие кз фракций наяЗо-нее подвержены изменениям, нами были проведены сравнительные гсследования ДНК сухих эмбрионов семян-по кинетике реассэпиа^::;!.

Данные исследований приведены на ряс.З.

20 ио

60

5> 80

100

' ■ ■ » 11 ■■ 1 ■*■ —............' 1 Р

Ю- ю-1 10° 1 о"1 Ю2 Ю5 ■■104'с6*сМОкь-еек/л>

Рис.З. Кривые кинетики реассопиаши ДНК сухих эмбрионов полбы С-4-»-), тритикале ), пиенгаы ( п а ■ )

и ДНК Е.соИ С ———— ).

Как видно яз приведенных нэ рис.3 данных, тотальные ДНК лаковых несколько различаются по кинетике рёассоциапиа. ОооЗен-

тп—4

меж-

э четко эти различия наблюдаются в области С0 1= 10 "-10 у ДНК полбы и пшеницы. ДНК тритикале,занимает промежуточное по-эжение. Сложность генома полбы составляет 5,8 х 10' п.н., трп-икале-1,9 х'Ю9 п.н., а шениш - 7,88 х 10 п.н.

Из данных по кинетике реассопиацпя можно заключить, что ос-эвные различия между ДНК злаков наблюдаются во фракции умерен-, ;х повторов, содержащих регуляторные гены я объясняй» с точки эения состава формулы генома, -поскольку у тетраплоидноЛ полбы сравненей с гёксаплэидной. пшеницей отсутствует третей гепой -

Л геном, отличающийся.высокой концентрацией ДНК на единицу длина хромосомы, от остальных геномов ( Nishikawa,i969 ). O aoBirat нием елоидностл генома возрастает количество повторяющихся поел довательностей. Поляплоидизапия генома способна приводить к уве личению скорости накопления нуклеотидных замен в ДНК, что, по-е дкмоыу, происходит из-за уменьшения давления отбора на мультиге ные системы полиплоидного генома.

Итак, представленные кривые кинетики реассопиапии свидетел ствуют, что большая часть ДНК пшеницы и полбы представлена повт ряюяяыися последовательностями при CQt = IO'V а меньшая - уника нша последовательностями. Во фракциях повторяющихся последоват ностей обнаружена высокоповторяющаяся подфракпяя с CQt = Ю-2 или сателлятная ДНК. Эта фракция составляет 8-165? генома. Общая доля повторяющихся последовательностей генома составляет 68-70',? и 78-82% для тетра- и гексаплоидных соответственно.

Кинетические группы последовательностей составляют фракции генома, выполняющие различные функций в генетической системе ( Britten,1969 ).В состав повторяющихся последовательностей в*о дят гены,. регулирующие активность генома на уровне транскрипции (Георгиев, 1973). Вероятно, растения в процессе эволюции закре пили в геноме большое количество регуляторных реакций в ответ н изменяющиеся условия среда.

В наших исследованиях било весьма важнымвыяснить по каким именно последовательностямразличаются геномы злаков, чтобы объ копить различия в профилях кривых. Из исследований следует, что появление пиков как в высокотемпературных, так и в областях низ кгх температур,обусловлено наличием большого количества повторо Изменения пиков на профилях плавления ДНК проростков свидетельствуют о происходящих в клетках метаболических процессах в пери од активапии, поскольку соответствующие пикам участки представляют собой повторяющиеся последовательности, содержащие регули-рушие активность ге^нав ^ены. Чтобы удостовериться в этом, нами были проведены сравнительные исследования кинетики реассопиа паи ДНК 3-дневных проростков злаков.

Как показали исследования, для веех трех видов злаков хара терно увеличвайе количества повторяющихся последовательностей н третьи еуткидрорастания, Таяое возрастание количеств» определе ных фракций было ввявлево ранее на ДКП ДНК^ввде пика в облает высоких температур, из чего следует вывод об их высоком ГЦ-соде

у». . -а

шии, что такжо согласуется с полученными нами далее данны:.:и гиперметилировании этой ДНК на третьи сутки за счет этих Гц-гатых последовательностей.

Таким образом, при запуске механизмов активации генома на рвых стадиях развития растения происходит дифференциальная пликапия отдельных генных участков, характер которой находат-в тесной связи с генетическими особенностями данного вида и сорта исследуемого растения.

3. Сравнительное исследование изоплитного состава ДНК су-у эмбрионов й проростков семян злаков. С целью выяснения язо-атного состава ДНК злаков и их сравнительного 'состава были введены исследования термического фракционирования ДНК сухих Зрионов и проростков семян злаков на колонках ГАП..Как видно диаграмм, приведенных на рис.4, элюируемые фракции фрагменти-аанной ДНК из сухих зародышей всех трех видов злаковых, резко шичаются между собой по изоплитному составу ДНК.

Этот факт подтверждает, наши данные по термической денатура-ДНК злаковых, указывающих на то, что имеются различия между альными ДНК из сухих эмбрионов злаковых как с одинаковой, так различной геномной формулой.

Далее, нами были проведены исследования изоплитной гетероген-ги ДНК проростков семян злаковых для выяснения динамики, по-1ьку прорастание сопровождается значительна.: изменением сред> ГЦ-содержания, а .исследуемые нами сорта тритикале и полбы >сятся к генетически разным видам. Результаты этих ясследова-представлены На рис.4 в виде заштрихованных столбиков.

Как явствует из данных, обнаруживается существенная разнзпа-»держании-сходных изоплит (вымываемых при одинаковых темпера-;х) между вышеуказанными злаками. Наиболее существенная разни-бнаружявается между язоплитами,-вымываемыми в интервале тем-тур 55-70°С.

Определенные различия выявляются также в высокотемпературной стя. Вероятно, все указанные различия обусловлены разницей рмулах геномов исследуемых злаков.

Таким образом, качественный и количественный состав отдель-изоплит несет в себе существенную информацию как о геноме ячных сортов, так и изменениях его состава при прорастании 1.

- IS -

20

РЬ m

20

o0

Э-0

I

УЛ

1

50

Рас.4. Диаграммы, отображающие /t-ный выход элюированной с ГАП ЛКК ;П сухих эмбрионов и Йпроростков семян I - ПЕеняпы, 2 - тритикале, 3 - полбы.

4. Ачаязз уровней метилирования злаков.

Метилирование ДНК существенно влияет как на структуру са-ыой ЛНК, так и нз взаимодействие с различными белками. Поэтому метилирование ДНК может быть решатаяы для точности эффективност многих генетических процессов. Примечательно, что у видов в пре долах отдельных классов, семейств и родов однодольных растений выявляется заметные различия содержания т5с в ДНК (Ваныаик, I3E65. Пря прорастании семян хлопчатника и пшенипы уровень метя дарования изменяется (Ваншин, 1972. 1963). Логическим продолже нием исследований структуры ДНК злаков было определение уровней метилирования-'сравниваемых геномов. Данные наших исследований приведены в табл.4. \

Из данных следует., что по уровням метилирования злаки различается. Различна по количественному содержанию я^с свидетель стЕуют о таксономическом значения этой энзиматической модифика-

1. Кроме того, суммарная ДНК проростков как по уровню метлли-эания, так в по Щ-содержаншо резко отличается от ДНК сухкх ¡¡ян.

• Таблипа 4

Содержание »^с д Хдд ДНК сухих и прорастающих семян

злаковых

гочник ДНЕ Формула генома Условия. опыта »''с, мол % Г+Ц+ т'с

типа ; ААВВДД сухие пророст. 4,6±0,7 5,3+0,42 "47,1 50,0 73,0+0,3 76,5+0,2

1тикале ААВВ52 сухие пророст. . 3,7+0,6 4,7+0,5 47,0 50,3 72,8+0,1 74,0+0,1

[ба ААВВ . сухие пророст. 2,3+0,49 6,8+0,6 50,1 44.1 74,3+0,2 ' 71,4+0,3

Таким образом, уровень метилирования ДНК в сухих эмбрионах •ян злаков меньше, чем в прорастающих. Эти изменения в уровне ■илирования ДНК в процессе онтогенеза могут быть обусловлены ¡личными причинами: во-первых, интенсификацией синтеза ДНК в »растающих семенах, во-вторых, по мере прорастания в семенах »исходит активирование и синтез ДНК-метилаз. Наконец, гяперме-шрование ДНК при прорастании семян, в частности полбы, может осматриваться в качестве механизма диффереяхиальной травскрип-I в дифференцирующихся растительных клетках, являясь одним из ювий включения или выключения отдельных генов, индивидуально I разной степени проявляющееся в зависимости от шгокдности и >мулы генома,

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эволюция ДНК злаковых - это чрезвычайно сложный я ка сегод-ший день недостаточно изученный вопрос. Исследование влияния третных факторов эволюции на процесс видообразования, дальне]^ ! исследования факторов эволюции генотипов могут создать благо-[ятные-предпосылки для более глубокого•сопоставления процессов ¡лзспия фенотипов и генотипов. Развитие этой областа мзлекуляр-! биологии позволит создать в недалеком будущем целостную тео-з эволюции геномов растений, которая станет важной составляю-

сей общей теории эволюпза.

В цропессе онтогенеза растений происходят не только количе венные изменения (Сиволап, 1988), но и качественные, такие как метилирование остатков питозяна и аденина (Ванюшин, IS88). Метилирование питозиновых остатков ДНК у эукариот связывают с регул, пяей экспрессии генов я клеточной дифференпировкоЯ, однако до czx пор не ясен механизм реализации этих биологических функций ] зукариотической клетке.

Генетическая функция "избыточного" метилирования питозинов! остатков ДНК растений, возможно, может реализовываться через 6oj Гун кэкформапионную лабильность соответствующих участков ДНК по; влиянием условий существования клетки, чем у других эукариот. В клетке метилированные остатки могут облегчить конформационные B-z переходы таких участков ДНК, Поскольку переход в z -конфор-мапгю может быть одним из условий инициации репликации и транскрипции ( Kolata,1983; Van Helden,1983 ),TO избыточное метилирс эанае ДНК можно рассматривать как механизм существенно облегчающий "реакцию" клетки на изменение условий существования. Нами проведены исследования ДНК в таком ракурсе для представителей подтрибы Triticinae .. В то же время исследования на одном представителе не могут дать ответ о механизме регуляции репликации и дкчференаяровкя. Исследования одновременно нескольких представителей позволили в некоторой степени пролить свет на механизм реп ликапии г.рк инициации генома прорастающего семени. В то же время сравнительные исследования позволили сделать некоторые выводы и в таксономическом аспекте.

• выводы:

1. На основании результатов по плавлению ДНК сухих зародышей трех сортов гексашгоидных пшениц, тритикале и полбы выявлены как внутривидовые, так я межвидовые различия. Показана возможность использования метода плавления в: выявлении внутривидовых и межвидовых различий и филогенетического родства злаковых.

2. Показана возможность применения принципиально нового спо-сэ'а "получения ЛКП^позваштвцего выявить экстремумы на кривой. Проведен детальный анализ ДКП ДНК сухих зародышей пяти'представителей .злаковых,, даюиий возможность.судить о вкладе того или иног( генома (ДД или 22) в гексаплоидный геном злаков..

3. Показано, что1 динаг/.кка язкенеш& ризи"еск;:х пат>ат.:ето:е, К при прорастании п:,:еет схожую гаконсч^рнссть для гскгапло;:;:-х представителей и »яузэ для представят злей тстраплокдпо.': секи, страгакдая сложность (тетрадловдшЗ,' геко&плосдккО у. с?е-d генома.

. 4. По результатам изучения кинетики роаасо-пе-:;:;; ?ста.т, К злаков выявлено, что относительное сзлерйзшз ncrjec-"::.;;:::" следовзтельнэстей и сателлитной фраки;:;: з ДНК полипl;;-в пшенипы вило, чем в ДЕК тетраллойдязй полей.

Данные по кинетике реасссакавхя позволят:: г чключкть, что spx зрастании у всех трех йсслодуеикх злакез н '0".:;.:аетсл определи:-:-т тенденция к увеличению ¿ракппн погггорлкопхея послсдозктелько-

п. Выявлены различал в изоплзтзом coct&se кекду тэт:_~ък:,-:."н v из сухих окс'рконов в прорастахз'хих семян злаке::. Указанное 5лйчзя обусловлены как пяоядносяыэ гс-йомов, так и '0!!э:,-ннх формулах. .

G. На оснсганки да:п:;;х по ояг^зделенкэ уровне:: метилирован::-;иленц различил по содортакн-з г:лакоа, ГЬ'лплаете;:

■пьркос увеличение урзрпя ^етилгооьапил JZ21 при прорастании пе-I. Порченные данное .сзгдотедьстз;";?, что степзнь петплироо:;-

являясь важным так^овоккчеекп« прискоком сухих' гдред;;-}, является показателей функционально;! едтагнзетй раститеннннл ток, который определенным otpaoo;,: сБлаан о клетстс:! nci.iopeH-ог-ггой и' формулой генома, •

Осиоьпоо 'содержанке дисссртаайп кзлзасекэ в слодупж публикациям

'.'лкасоекя;! Л.А., Вардеванян И.О., Сн:.:онлк Л.Г., Панослн Г.А. К иосяедоваякэ ¡¡екзторнх струк?ургкх' ссобенлзсте» ¿17: аса:-:>-5ЫХ. - Бнол. г.. лрмэняи, 1959, т.42, G, c.55I-55ä. ."ннасбекяи Л.Л., Вардеванян И.О., Вардапетдн Г.Р., Пи;: сед; ?.п. Особенности распределения ловторзнцпхея последовательностей в геноме злаковых. - Тез. докл. £ Республ. коне;. "Достх- • •:ен;н; флзпно-хииическей биологии и биотехнологии и пут;: их :недрения", Ереван, I9B9. с.31-32.

'ипасбекян Л,Л., Вардеванян И.О., Пзкзсяя Г.А. Sarmen:.;ocr:; геяоторзх молокулярных характеристик ДНК зляконих от ic-щг-'

::.таа. - Ваолзявческза наука, 1591, :г II, с.161-165.

Л.Л., Зардезанян П.О., Наноси Г.А. Зависимость некоторых параметров ДНК от сор?,;;'ды генома злаковых. - Тез. дскл. УП ксяф. по спеятроскояяа биополимеров, Харькзз, 1391,

С - -¿.СО .

5. КзкагЗвхяи Л.А., Данледян И.С., Гарябян Д.В., Еардеванян И.О., Еаносяя Г.А. Различая з уровнях метилирования я пара-котрзз плавленгя 22К в сухих л прорастающих семенах злаковых.

- Еасл. ж. Арменаг, 1332, т.4.5, 5 1.

6, Млпасбекян Л.А., Вгрдеванян И.О., Паносян Г.А. Изменения в молекулярной структуре ДНК семян маковых при. прорастании.

- Блодогическае науки, 1952, з печати,

Подписанопечати 31.01.92г. форма? бум.60x641/16 1,0 пвч.л. За».С4 тиран 100 - - ■

ООП Арм СХИ ул.Теряна 74