Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ повторяющеймя ДНК видов Hordeum L.

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ повторяющеймя ДНК видов Hordeum L."

7 0 ь 9 й

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

САЛИНА Елена Артемовна

УДК 577.21:575.113.1.

АНАЛИЗ ПОВТОРЯЮЩЕЙСЯ ДНК ВЩОВ ШЖБЕШ Ь..

Генетика - 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск-1990

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО АН СОСР, г.Новосибирск

Научный руководитель - кандидат биологических наук, старший

научный сотрудник А.В.Вершинин, Институт цитологии и генетики СО АН СССР, г.Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший

научный сотрудник Е.В.Ананьев, Институт общей генетики АН СССР, г.Москва

доктор биологических наук, старший научный сотрудник О.Л.Серов, Институт цитологии и генетики СО АН СССР, г.Новосибирск

Ведущая организация - Институт генетики и цитологии АН БССР,

г.Минск

Г)

СЗащита диссертации состоится "¿О" ¿¿¿¿¿ы- 1990 г. на /¿¿^У заседании Специализированного совета по

защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте цитологии и генетики СО АН СССР (Д-002.11.01) в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО АН СССР.

Автореферат разослан ¿¿¿¿/1ё-/и.( 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

КНъ н.Б.Христолюбова

"^'''Актуальность проблемы. Повторящаяся фракция ДНК составляет бо.-ь--^-тэуц часть генома растений, например, 70-75% у злаковых (Flavell, 19S0). Структура, организация и функции большей части повторов ецз не изучены. Работы, в которых проведен наиболее детальный анализ структурной организации отдельных семейств повторов, ышолненц в основном па млекопитающих и дрозофиле. Они позволили впервые конкретизировать функции некоторых некодирупцих последовательностей ДНК, повторенных в геноме 105-106 раз, а именно: поддержание структурной организации ядра (Neuer-Hitsche et al., 19S8), регуляция транскрипционных процессов (Rogers, 1985). Информация об организации высоко повторяпЕихся последовательностей ДНК в геноме растений отрывочна и фрагментарна. Наиболее детально фракция высоких повторов изучена у рода Seeale (Bedbrook et al., 1980). Четыре семейства, практически полностью характеризующие эту фракцию ДНК рни с числом копий 7.4 х 10^ -1.0 х 10®, тандемно организованы и расположены предпочтительно в теломерах хромосом. Каадая хромосома имеет специфические особенности локализации этих семейств. Другой тип высоких повторов - рассеянные по геному последовательности - у растений практически не изучены. У рода Hordeuni, такке как и у большинства других растительных объектов фракция высоких повторов охарактеризована лишь частично: изучена структурная организация сателлитной ДНК Hordeum vulgare (Dennis et al., 1980), получены клонотеки повторяющихся последовательностей ДНК, ведется поиск и анализ видоспецифичных повторов (Ананьев и др., 1986, Junghans and Metzlaff, 1988).

Изучение особенностей структурной организации высоко повторяющейся ДНК видов Hordeum L. позволит расширить представление о молекулярной организации генома ячменя, о роли повторяющейся фракции в функционировании и эволюции генома растений. В то eg время, такая информация необходима для идентификации линий, сортов, видов, гибридного материала с помощью отдельных повторяющихся последовательностей ДНК в качестве молекулярных маркеров. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение повторяющейся ДНК видов Hordeum L., особеностей структурной организации высоко повторяющихся последовательностей у отдельных видов этого рода, механизмов ее изменчивости в процессе дивергенции видов.

Непосредственными задачами исследования являлись:!) Поиск

дополнительного критерия для разделения гетерогенных по составу повторяющихся последовательностей ДНК на фракции высоких и умеренных повторов; 2) Получение и анализ библиотеки клонов высоко пов-торяпцейся ДНК Hordeum vulgare; 3) Изучение кинетики реассоциации повторяющейся фракции ДНК некоторых видов рода Horde™; 4) Анализ структурной организации и количественного содержания высоко повторяющихся последовательностей ДНК н.vulgare в геномах различных видов и сортов ячменя; 5) Изучение первичной структуры участка генома н.vulgare, содержащего наиболее распространенную последовательность ДНК видов Hordeum L..

Научная новизна. Предложен дополнительный критерий, учитывающий особенности структурной организации ДНК, для выбора граничного значения Cot между фракциями высоко и умеренно повторяющейся ДНК.

Получена библиотека клонов высоко повторяющихся последовательностей, практически полностью характеризующих фракцию ДНК Н.vulgare, реассоциирующую до Cot=0,02.

Выявлены особенности структурной организации высоко повторяю-вдхся последовательностей ДНК у ряда видов рода Hordeum.

Определена первичная структура участка генома н.vulgare (BamHl фрагмента), содержащего наиболее распространенную последовательность ДНК видов Hordeum Ь...

Описана область ДНК в составе BamHl фрагмента, особенности первичной структуры которой характерны для мобильных элементов растений.

Практическая ценность. Показана принципиальная возможность использования клонированных высоко повторяющихся последовательностей ДНК ячменя в качестве зондов при изучении полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (rflp - анализ) для идентификации геномов изученных видов ячменя в различных гибридных комбинациях, а также для уточнения филогенетических отношений внутри рода Hordeum. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ. Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на iv и у съездах ВОГиС им.н.и.Вавилова (Кишинев, 1982, Москва, 1987), на Всесоюзной конференции "Геном растений" (Уфа, 1982, Черновцы, 1983), на V и vil Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1983, 1990), на ix Всесоюзном симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" (Черноголовка, 1987), на xii международном конгрессе eucaepia (ФРГ, Геттен-

ген, 1989).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав и выводов. Текст диссертации содержит 145 страниц, включая II таблиц и 18 рисунков. В списке литературы 203 наименования, из них 31 отечественный и 172 иностранных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В качестве объекта исследования были взяты 4 сорта ячменя (Hordeum vulgare I.: "Неполегающий", "Винер", "Галина", "София") и 6 тетраплоидных видов Hordeum L. (H.bulbosu.-n X., H.jubatum Ъ., H.geniculatum All., H.brevisubulatun Link., H.turkestanicum Nev-ski., H.murinum L.), полученные из различных ботанических садов СССР и других стран, а также рожь (Seeale cereale, сорт "ВосточноСибирская") и пшеница (Triticim aeetivura, сорт "Новосибирская

ДНК выделяли из этиолированных проростков по методу (Kislev and Rubenstein, 1980) с некоторыми модификациями. Фракционирование ДНК по скорости реассоциации осуществляли с помощью хроматографет на гидроксиапатите и с применением s^-нуклеазной обработки (Britten and Kohne, 1968). Нуклеотидный состав ДНК определяли методом ферментативного гидролиза (Дэвидсон, IS68).

Реакцию ник-трансляции (Rigby et al., 1977) проводили при I8-S0°c для включения меченных дезоксинуклеотидтрифосфатов d препараты ДНК и при 37°с для выявления многократной репликации отдельных коротких участков ДНК.(реитерации) (Kornberg et.al., 1964).

Клонирование высоко повторяющихся последовательностей ДНК Hordeum vulgare, реассоциированных до Cot = 0.02 и обработанных S.J — нуклеазой, проводили методом сс- коннекторов по Pst- сайту в PBR327 (Маниатис и др. 1984). Скрининг клонов осуществляли по методу (Grunatein and Hogness, 1975). Для выделения плазмидной ДНК" использовали метод щелочного лизиса (Birnboim and Doly, 1979). Рестрикцию, электрофорез, блот-гибридизацию по Саузерну проводили как описано (Маниатис и др., 1984). Количественное содержание клонированных последовательностей в геномах различных видов злаковых определяли методом дот-гибридизации (Kafatos et al., 1979).

Определение нуклеотидной последовательности ДНК осуществляли по методу Максама-Гилберта (Maxam and Gilbert, 1980) с модификацией для твердой фазы (Чувпило и Кравченко, 1983).

Изучение особенностей структурно-функциональной организации нуклеотидной последовательности было проведено с помощью пакета

программ "Контекст" (Соловьев и Рогозин, 1986).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ I. Способность к реитерации как дополнительный критерий для выбора граничного значения Cot между фракциями высоких и умеренных повторов. Явление реитерации было описано Корнбергом с соавт. (Kornberg et.al., 1964), которые показали, что искусственные оли-гонуклеотиды, состоящие из коротких повторяющихся единиц в условиях реакции "ник-трансляции" при 37°С в результате нескольких актов репликации и одноцепочечного смещения многократно копируются (реи-терщзуют). Изучение способности к реитерации повторяющихся последовательностей ДНК ржи (табл.1) и пшеницы (аналогичные результаты) показало, что при Cot= 0,02 все реитерирупцие последовательности отделяются от основной массы ДНК и входят в состав высоко повторяющейся фракции ДНК. О наличие реитерации судили по увеличению абсолютного количества ДНК (исходное количество ДНК принималось за IC03) и по увеличению процента включения метки.

Таблица I. Определение граничного значения CQt для разделения фршсдай повторяющейся ДНК злаковых.

Вац

Cot

% прореассоциировавшей ДНК

Количество ДНК после реакции, % к исходному

Включение метки, %

Наличие рей-терации во фракции умеренных повторов

S.cereale

0,01 0.02 0.03 0,04 0.10

6.5 9.4 13.1 15.0 20,8

0,7 1,1

1.4

1.5

2.3

161 ± 15 128 ± 11 100 100 100

115

72 30 30 30

Определение нуклеотидного состава реитерирующих последовательностей на примере пшеницы показало, что фракция высоких повторов (A+T/G+C=1,55) по сравнению с исходной ДНК (А+т/с+с=1,24) обогащена содержанием А+Т нуклеотидов, которые в основном и вовлекаются в процесс реитерации, приводя к увеличению отношения a+t/g+c до 2,85. Однако, если бы прирост ДНК происходил только за счет А+Т нуклеотидов, то отношение А+T/G+c должно было равняться 21.

При разграничении фракций высоких и умеренных повторов исследователи выбирали значения Cot произвольно, в основном в интервале

от 0,01 до 0,1, что приводило к неоднозначной оценке гетерогенности повторяющихся последовательностей, входящих в состав этих фракция. В связи с этим нам представляется возможным использовать явление реитерации в качестве дополнительного критерия при выборе граничного значения Cot. Учитывая результаты, полученные для ДНК пшеницы и ржи (табл.1), а также данные Флейвелла с соавт. (Flavell et.al., 1977) о значительном сходстве кривых реассоциащш гпаентш (Т.ae3tivum), ржи (S.aereale), ячменя (Н.vulgare) и овса (A.sativa), в дальнейшей работе разделение фракции высоких и умеренных повторов этих видов проводили при Cot= 0,02.

2 Особенности структурной организации высоко повторякцихся последовательностей. Для более детального анализа фракции высоких повторов была получена библиотека клонов последовательностей ДКК н. vulgare (сорт "Неполеганшй"), ре ассоциирующих до Cot=0,02. 17 слонов с максимальной силой сигнала при гибридизации с ДНК Н.vulgare были отобраны для дальнейшего анализа. Эти клоны представляют собой набор последовательностей, различапцихся по длине (от 80 п.н. до 600 п.н.) и представленности в геномах пшеницы (T.aesti-vra), ргз! (S.cereale) и ячменя (Н. vulgare) (по результатам дот-гибридизации рекомбинантшх плазмид с суммарной ДНК этих видов) (табл.2).

Тпб.т/.иа 2. Длина и родоспецифичность клонлротзакних последовательностей ДНК ячмек".

Роког.'бинвнтнне Длина Рекомбшачтше Длина

плоггжЕи всташгк плазмидн вставки

в п.н. в п.н.

рН\'7036~ 190 pHv72411 600

pHv7053„ 350 pHv7245 580

pHv716 í„ 530 pHv7247, 450

pHv7179, 600 pHv7263, 130

pHv7190,, 450 pHv7290 290

pHv7191 430 pHv7293, 590

pHv7197 200 pHv7302, 510

pHv7220P 150 pHv7308 310

pHv7223 350

* - наиболее многократно повторенные в геноме н.vulgare (максимальная сила сигнала при дот-гибридизации);

1- отсутствуют или представлены незначительным числом копий в геноме T.aestivum;

2- отсутствуют или представлены незначительным числом копий в геномах T.aestivum и S.cereale.

сфавнительный анализ набора фрагментов, полученных при блот-гнбридизации отдельных клонированных последовательностей ДНК и исходной суммарной фракцией высоких повторов с ядерной ДНК н.vulgare, обработанной рестриктазами BamHI, Bglll, Hindlll, показал, что отобранные клоны охватывают все основные фрагменты гибридизации данной фракции ДНК.

На основании результатов блот- и дот-гибридизации рекомби-нантных плазмид с ДНК пшеницы, рзи и ячменя (табл.2), а также пря-шх экспериментов по гибридизации клонированных последовательностей кеяду собой было отмечено, что pHv7l61, pHv7190, pHv7245 - высоко гомологичны, pHv7263 частично входит в состав более крупного фрагмента pHv7308.

Таким образом выделено и охарактеризовано 14 последовательностей ДНК н.vulgare, представляющих основные семейства фракции высоких повторов. Три из них - pHv7036, pHv7223, pHv7308 (pHv 7263) - poдоспецифичны, a pHv7191 и pHv724l отсутствуют в геноме клзницы (T.aestivum).

Наличие тандемно организованных повторов в геноме ячменя проварили методом неполного гидролиза ядерной ДНК Н.vulgare набором рестриктаз. которые по предварительным экспериментам выявляли или Еэбольыое число, или регулярно отличающиеся на определенную длину фрагменты гибридизации. Обнаруяено, что только одна последовательность pHv724l имеет тандемную организацию в геноме с Hin.fi- повторяющейся единицей кратной 0.6 т.п.н. и 0.45 т.п.н..

3. Меквкдовая изменчивость структурной организации высоких повторов рода Hordeum. Библиотеку клонов высоко повторяющейся ДНК Н.vulgare использовали для изучения структурной организации повто-рягщейся ДНК у различных видов Hordeum. Были выбраны виды, которые произрастают на территории СССР и имеют разную степень родства согласно данным систематики (Бахтеев, 1976 ) и результатам анализа к:э2видового скрещивания (Bothmer, 1986).

Сравнительный анализ кинетики реассоциации этих видов показал, что хотя содержание отдельных кинетических классов варьирует, содержание суммарной фракции повторов, выделенной при Cot= ю, существенно не различается.

Анализ структурной организации повторяющейся ДНК включал определение количественного содержания отдельных клонированных последовательностей, изучение полиморфизма длины рестрикциошшх фраг-

ментов (RFLP- анализ) у различных сортов и зидов ячменя.

3 4 5 Рис.1. Число копий (H) pHv7l61(a), pHv7191(6), pHv7179(b), pHv-7241(г), pHv7223(fl). pHv7290(e) на гаплоидный геном H.vulgare (1), H.bulbosum (2), H.jubatum (3). ■ H.geniculatum (4), H.brevisufculatua (5), H.turkestanicuro (6), H.rnurimwi (7). tOTM= 65 С ( ■ ■), tOTM= 50 С (-).

Границы доверительных интервалов при_2роБне значимости Р=0,05 рсл-т: ха ± 0,45. хб ± 0,37, хв ± 0,35, Хр ± 0,32, хд ± 0,5, хе ±

0.54.

Определение числа копий (рис.1) отдельных последовательностей ДНК подтвердило ранее полученные результаты о различной представленности данных последовательностей в геноме н.vulgare (табл.2). pHv7161 и pHv7191 повторены 1-2 х 10® раз, что составляет в кпялом случае примерно 1-1,5 % генома н.vulgare. В значительно меньшей степени представлена в геноме данного вида родоспецифичная последовательность pHv7223, содеряание которой не превышает 0,2-0,4?. Остальные две родоспецифичные последовательности pHv7036 и pHv7308 имеют приблизительно такое же число копий на геном (согласно данным дот-гибридизации рекомбинантных плазмид с ядерной ДНК н.vulgare). Количественное содержание pHv724l, имеющей тандемную организацию в геноме также невысоко (0,3-0,6%). Оценка количественного

S.II.H. '1 2 3 4 5 6 7 a)

s.п.H. 1 2 3 4 5 6 7

i> i ■«»

1.7 -

- 0,8 -

СЭ

в) 1234567 г) 1234567

0,8

2,4 -1,8 -

1.2 -0,9 -0,6 -

0,45 - «a i

f¡| oto о p Li Ct.

д)

1 2 3 4 5 6 7

e) 1 2 3 4 5 6 7

s)

1 2 3 4 5 6 7

■V

- 4,5 -

- 2,7 -

- 1,8 -

- 0,9 -3)

- 2,8 -

- 1,7 -

1 2 3 4 5 6 7

яр

Рис.2. Блот-гибридизация (Р' )-меченных pHv7l91(a), pHv7179(6), pHv71ö1(В), pHv7241(г), pHv7053(pHv7293) (Д). pHv?223(pHv7290)(e), pHv7247(s), pHv7197(3) С ядерной ДНК H.vulgare(1), H.bulbosum(2), Н.jubatum(3). H.geniculatum(4), H.brevisubulatum(5}, H.turkestani-cum(6), H.murinum(7), обработанной ресгриктазами BgllI(a,6,B,s), Hinil(r), Н1псИ11(д,е,з).

содержания еысоких повторов проводилась как в "жестких" условиях отмывки фильтров (65°С), так и в "мягких" (50°С), что отражает соотношение дуплексов с высокой степенью гомологии и дуплексов, содержащих до 15-18% нуклеотидных замен. Характерной особенностью pHv7191 является наибольшее содержание (около 80%) последовательностей ДНК с высокой степенью гомологии в геноме Н.vulgare (рис. I), количество которых более чем в 15 раз превосходит содержание аналогичных последовательностей других видов ячменя. Полученные результаты говорят о том, что pHv7191 амплифицировала в геноме Н.vulgare позднее других высоких повторов рода Hordeum.

Наиболее распространенной последовательностью в геномах изученных видов рода Hordeum является pHv7l6i. RFbP-анализ показал что спектр фрагментов гибридизации pHv7161 при обработке геномной ДНК рестриктазой Bglll довольно близок у изученных видов за исключением H.bulbosum (рис.2в). Можно выделить три наиболее характерных Bglll фрагмента ДНК длиной I.I. 1.5, 1.8 т.п.н., в разной степени представленных у различных видов ячменя. В более крупных фрагментах ДНК, вырезаемых при обработке ДНК Н.vulgare Bglll и BamHl рестриктазами помимо последовательности pHv7i6l располагаются и pHv7179, pHv7191 (рис.2а,б,в). Использование pHv7179 и pHv 7191 в RFlP-анализе различных видов ячменя позволило отметить близость геномов H.brevisubulatum и Н.turkestanicum, а в случае pHv . 7179 и геномов H.jubatum и H.geniculatum.

pHv7053, pHv7223, pHv7290, pHv7293 при обработке ДНК Н.vulgare и H.bulbosum Hindin рестриктазой гибридизуются с одинаковым набором фрагментов ДНК, которые регулярно отличаются по длине на 900 п.н. (рис.2д,е). Однако, эти последовательности не гомологичны, так как при обработке другими рестриктазами они выявляют различный спектр фрагментов гибридизации и отличаются по степени повторяемости в геноме злаковых. RFLP- анализ различных видов ячменя с помощью этой группы последовательностей указывает на более близкое родство н.vulgare с H.bulbosum и н.turkestanicum с H.brevisubulatum. В геноме H.murinum изученные последовательности представлены в очень небольшом количестве (рис.1,2).

pHv7241> pHv7197, pHv7247 имеют индивидуальный спектр фрагментов гибридизации при обработке ДНК Н.vulgare различными рест-риктазами (рис.2г,к,з). Одна из них pHv7241 имеет тандемную организацию в геноме, которая сохраняется у всех изученных видов ячменя, хотя интенсивность полос гибридизации меняется. По некоторым различиям в интенсивности и длине фрагментов гибридизации pHv724l, pHv7l97, pHv7247 виды ячменя мояяо разделить на две группы. В первую входят Н.vulgare и H.bulbosum, а во вторую все остальные виды Hordeum.

В целом спектры блот-гибридизаций и результаты дот-анализа различных семейств высоких повторов дают примеры многочисленных перестроек, происходивших у разных видов Hordeum в процессе эволюции. В то же время RFLP- анализ не выявил межсортовых различий в структурной организации высоко повторяющейся ДНК н.vulgare. 4. Анализ первичной структуры BamHl фрагмента ДНК.

Была определена первичная структура наиболее распространенной среди изученных видов Hordeum последовательности pHv7i6l, гомологичной ей - pHv7245, и соседствующей с ней в ряде фрагментов ДНК, вырезаемых BamHl и Bglil рестриктазами - pHv7302.

Последовательности pHv716i, pHv7245 и pHv7302 были субклони-рованы в плазмиду pSSCl (Кузнеделов и др., 1986) по Pst - сайту и полученные рекомбинантные плазмиды pHvi6i, pHv245, pHv302 использованы для определения первичной структуры встроенных последовательностей по двум цепям ДНК. Фрагмент ДНК, составленный из клонированных последовательностей, ш назвали BamHl фрагментом, так как он входит в состав повторяющихся единиц, вырезаемых при обработке ДНК н.vulgare BamHl рестриктазой. Длина BamHl фрагмента составляет 999 п.н.. Его первичная структура представлена на рис.3.

pHv245 (длина вставки 519 п.н.) и pHv302 (486 п.н.) имеют общий участок длиной всего в 6 п.н., последовательности pHv245 и pHv161 (длина вставки 489 п.н.) - 335 п.н., pHvl6l и pHv302 - 160 п.н.. Дивергенция последовательностей в областях перекрывания составляет 5,5% во втором случае и 6% в третьем.

Анализ первичной структуры показал отсутствие внутренней тандемной организации BamHl фрагмента ДНК и выявил короткие субповторы трех типов - А,В,С, которые неравномерно представлены в различных частях фрагмента (рис.4). Каждый тип субповторов состоит из повторяющихся единиц длиной 12-17 п.н., которые более чем на

i ctgtctcaccagcccactaagggctggtgtggcaccccaaacgcccatgggcttccccgg

------------------------------------------------------------ OHv 245

s i ggtgggtgccccccccggtgaactcccggaacccattxgtcattcccggjaSätt^cccgg

1

1 21 taactccgaaaaccttccggtaatcaaccajata^ctcaaatacgcataaaacaacgtcg

^tÄTst

[~^?ATCgÄ!rrA(^GGGAC<TÜGAAGCCCATATTGGATCCTACATATCTACGA

1 81 aaccttaagtgtgcagaccctgcgggttcgagaagtätbtagacatgacccgagagactc

------------------------------------------------------------ OHv245

__А_T_С_ OHv 16 1

24 1 CTCGGT ~

зо i agatctttatcatttgaacctcagtgccaaggattcatataatcccgtAtStcattccct

__с_

_Bg* в %

361 ttgtccttc^ggtatgttacttgcccgaJgattcgatcIgtcagtatccgcatacctatttca _t_t g__

_ Box А 5

42 1 A nCTCGTTT/JCCGOCAAGTÍ tTCTTTACTCC'TTCCG^A ATA.CAAGATCCCOCAACTTACAC

__tg_а_

48 1 TTA ACTTACATTGCTTGCAAGGCTTGTGTGTGATGTTGTATTACCGAGTGGGCCCCGAGA

----------------------------------------------------------------------------DHV 245

_С_С_Л_А_T__DH v 1 6 1

..........................................................OHV302

541 TACCTCTCCGTCA£ACJ3GAGTGACAAATCCCAGTCTTGATCCATACTAACTCAACTAACA _T_<--" * 'Ä_G_G_

601 CCTTCGGAGATACCTGTAGAGCATCTTTATAGTCACCCAGTTATGTTGCGACGTTTGATA

_с_t_а_g_

f. 6 I CACACAAAGCATTCCTCCGGTGTCAGTGAGTTATATGATCTCATGGTCATAGGAATAAAT

721 ACTTGACACGCAAAAAACAGTAGCAACAAAATGACACGATCAACATGCGACTTCTATTAG 781 TTTGGGTCAGTCCATCGCGATTCTCCTAATGACGTGATCTAGTTATCAAGCAACAACACT Я4I TTGTTCATAATCAGAAGACACTGACTATCTTTGATCAACTGGCTAGCCAACTAGAGGCTT

4Q1 GCTAGGGACGGTGTTTTGTCTATG^ATCCACACATGTAAATGAGTCTTCATTCAATACAA

........................................................ о 4 v 3 О 2

1 TTATAGCATGGATAATAAACGATTATCTTGATACAGGAA

-л- a/'w- 6. f" B- 7 " r- WT.-UA-л, c=- e, ----к,

3

Рис.3. Первичная структура BamHI фрагмента ДНК H.vulgare. Потенциальные функциональные сайты, найденгше по первой цепи: "СЛАТ" (а) и "ХАТА" (б) боксы, открытая рамка считывания (в), стоп-кодон (г), участки полиаденилирования (д); по второй цепи: сигнал инициации транскрипции РНК-полимерпзой III (е), энхансерная последовательность типа SY40 (а). Отмечены инвертированные повторы, ограниченные короткими прямыми повторами (з).

65% гомологичны определенному консенсусу. Сравнение консенсусов А и В типов (58% гомологии) и их организации в ВашН1 фрагменте ДНК (рис.4), говорит о возможном происхождении консенсусов из одной повторяшейся единицы. Расположение А,В субповторов в левой части фрагмента (от 50 до 600 п.н.), а С субповторов в правой части (от 600 до 999 п. н.) указывает на сложную организацию ВашН1 повторяющихся единиц.

а) в)

С. Д-^ЕЗ-Р АЛ

е. 4.л

4.4. 4 е. ел.

1 ч-л

в)

О

о-с

с а

0 (I

с-с с-а

1 о а-т

с-а

т-а

5-0 о а т-а

т-а ссса-тссс

571

а

356

с-е т о

т-л

0-я

т

с-й т-а й-С

1-1 т-а

тссст-атссс

е- -е.е

57';

Рис.4. Расположение субповторов (а), палиндромов (б) и потенциальных функциональных участков (в) (см.также рис.з) вдоль ВалШ фрагмента ДЬ2*._

Область ВашН1 фрагмента I или 2 (б,г) имеет на концах инвертированные повторы, ограниченные короткими прямыми повторам;!.

Анализ первичной структуры ДНК ВатН1 фрагмента указал такке на обогащение его инвертированными повторами. Отмечено более 35 таких повторов с энергией формирования двойных спиралей >-10, из них 15 повторов образуют палиндромные структуры, расположенные преимущественно в начале и в середине фрагмента (рис.46). Насыщенность палиндромами и инвертированными повторами может обусловливать формирование вторичной структуры ДНК и РНК ВатНХ фрагмента. Обращает на себя внимание тот факт, что два инвертированных повтора длиной 16 п.н. (95 п.н., 568 п.н.) и 12 п.н. (360 п.н., 567 п.н.) ограничены прямыми короткими повторами (рис.4в,г). Подобные

структуры характерны длл мобильных элементов растений (Хесин, 1985, Saedler and Nevers, 1985). Однако гомологии С прямыми и инвертированными концевыми повторами известных мобильных генетических элементов найдено не было. Область 95 - 568 п.н. содержит субповторы А и В типа и граничит с субповторами С типа.

Анализ нуклеотидной последовательности с помощью программы "SITE" выявил в ее составе потенциальные функциональные сайты, имеющие статистически значимую гомологию с известными регуляторны-элементами эукариот (рис.3). Следует отметить насыщенность области 95 -568 п.н. сигналами инициации транскрипции для РНК - по-лимеразы II (5 блоков) и РНК - полимеразы III (I блок) (рис.3,4). Не исключено, что некоторые из указанных блоков действительно при нимают участие в транскрипционных процессах, гак как для Alu -повторов млекопитающих, например, показана инициация транскрипции РНК-полимеразой III с таких потенциальных сайтов (Rogers, 1985).

При изучении распределения потенциальных функциональных сайтов относительно друг друга, обращает на себя внимание определенная закономерность в расположении следующих элементов (рис.3): "СААТ" и "TATA" боксы (I или 2), затем открытая рамка считывания с ATG кодоном длиной 294 п.н. или 210 п. н, (по последовательности pHv245) и в полонениях 714 п.н. и 974 п.н. участки полиаденилиро-вания. Хотя трансляция всех BamHl повторов маловероятна, однако в данный момент ее нельзя полностью исключить для отдельных высоко повторяющихся последовательностей ДНК Н.vulgare.

Следует отметить, что область (95-568 п.н.) BamHI фрагмента ДНК, имеющая инвертированные повторы на концах, ограниченные короткими прямыми повтора™, насыщена сигналами инициации транскрипции для РНК-полимераз, содерзит открытую рамку считывания и обладает внутренней структурой, отличной от соседствующих областей. Не исключено, что в распространении по геному данного фрагмента ДНК существенную роль играли механизмы транспозиции.

Сравнение первичной структуры изученных последовательностей с известны!.™ к настоящему времени повторами ДНК различных видов растений не выявило выразенных гомологий (>65$) с BarnHl фрагментом, за исключением отдельных нерегулярных участков ДНК длиной 30-40 п.н. Таким образом, нами описан ноеый повторяющийся элемент из фракции ЕПП ДНК растений.

ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ высоко повторяющихся последовательностей ДНК видов Hordeum выявил много общего, но также указал и на определенные особенности в структуре, организации и эволюции этой фракции ячменя относительно наиболее близкого к Hordeum Ъ. рода.Seeale, у которого геномная организация высоких повторов изучена довольно детально.

1. Эта фракция ДНК н.vulgare содержит большее количество семейств повторов. Среди них отсутствуют последовательности такой высокой степени повторяемости, как у ржи. Нами было описано 14 последовательностей ДНК, которые довольно полно характеризуют фракцию ДНК, реассоциирувдую до Cot=0,02, и составляют 4-8% генома Hordeum vulgare. У ржи 4 семейства высоких повторов охватывают 8-12% генома (Bedt)rook et .al., 1980). Копийность наиболее распространенных последовательностей ДНК Н.vulgare pHv7191. pHv716l не превышает 2 х Ю5 (рис.8).

2. Из всех изученных высоко повторяющихся последовательностей ДНК

Н.vulgare только pHv7241 имеет тандемную организацию (0,3-0,6% генома). Возможно нам не удалось выявить другие последовательности организованные подобным образом. Трудности в обнаружении тандемных высоко повторяющихся последовательностей ДНК говорят о том, что в геноме н.vulgare они представлены в значительно меньшей степени, чем в геноме S.cereale.

3. Три родоспецифичных последовательности ДНК ячменя pHv7036,pHv 7223 и pHv7263 (табл.2, рис.1) представлены примерно одинаковым числом копий (около 6 х Ю4) и характеризуют около 0,4-1% генома н.vulgare. В то же время родоспецифичные семейства составляют основную часть высоких повторов ржи (5,5-9,5% геномной ДНК) при этом степень повторяемости одного из них ("480") достигает 10®. Следует учесть, что в наших условиях родоспецифичные последовательности

Н.vulgare длиной менее 150 п.н. не выявляются. Суммируя результаты наших исследований и данные Йангханса и Метцлаффа (Junghans and Metzlaif, 1988) следует отметить более короткую длину родоспецифичных последовательностей ячменя относительно аналогичных после-довательностй ржи.

RPIP-анализ 10 высоко повторяющихся последовательностей ДНК позволил оценить близость геномов видов Hordeum L. По таким показателям как подобие спектров фрагментов гибридизации и количест-

венное содержание клонированных последовательностей ДНК изученные нами виды следует классифицировать в следующие группы: I) н.vulgare, H.bulbosum; 2) H.jubatum, H.geniculatum; 3) H.turkestanicum,

H.brevisubulatum; 4) H.murinum.

Эти результаты хорошо согласуются с имеющимися в настоящее время взглядами на систематику рода Hordeum L. ( Еахтеев, 1976; Bothmer et al.,1987; Jorgensen, 1986), что дает основание считать использованные методы перспективными для уточнения филогенетических отношений этого рода. Кроме того, RFLP-анализ при использовании в качестве зонда высоко повторяющихся последовательностей ДНК выявляет индивидуальный набор фрагментов гибридизации у изученных видов (исключение составляют H.brevisubulatum и Н.turkestanicum, которые некоторые исследователи считают подвидами одного вида Н. brevisubulatum (Bothmer et.al.,1987)). Таким образом, полученный набор высоких повторов можно использовать в качестве молекулярных маркеров в KFLP-анализе для идентификации видов Hordeum.

ВЫВОДЫ

I. Показано, что фракция ДНК пшеницы и ржи, реассоциирующая до Cot <0,02, содержит последовательности ДНК, которые в условиях реакции ник-трансляции при 37°С многократно копируются (реитерируют). При этом отношение A+T/G+C увеличивается от 1,55 до 2,85. Предложено использовать это свойство отдельных повторяющихся последовательностей ДНК в качестве дополнительного критерия для выбора значения Cot при выделении фракции высоко повторяющихся последовательностей ДНК пшеницы (T.aestivum), ржи (S.cereale) и ячменя (Н.vulgare).

2. Выделено и проанализировано 14 последовательностей ДНК, практически полностью характеризующих фракцию высоких повторов Hordeum vulgare, реассоциирующую до Cot= 0,02. Из них три - pHv7036, pHv 7223, pHv7308 - родоспецифичны, a pHv7191 pHv7241 отсутствуют в геноме пшеницы (T.aestivum). Копийность наиболее распространенных последовательностей pHv?i9i, pHv7l6i не превышает 2 х 10 . Одно семейство повторов pHv724l с числом копий 10^ на гаплоидный геном имеет тандемную организацию.

3. Выявлен полиморфизм длины рестрикционных фрагментов высоко повторяющейся ДНК семи видов рода Hordeum. Показано, что клонированные высоко повторяющиеся последовательности ДНК можно использовать в качестве зондов в RFlP-анализе для уточнения филогенетических

связей изученных видов рода Hordeum, а такие для идентификации этих видов.

4. Изучена первичная структура последовательностей pHv7161, pHv 7245, pHv7302 входящих в состав ВапИХ фрагмента ДНК. Показано присутствие в данном фрагменте потенциальных участков транскрипции для РНК-полимеразы II и III, открытой рамки считывания с ATG-г.одо-ном длиной 294 п.н., участков полиаденилирования. Порядок расположения таких участков соответствует взаимному расположению аналогичных структур, необходимых для трансляции ДНК.

5. Отмечена область ВалМ фрагмента от 95 п.н. до 568 п.н., которая содержит инвертированные повторы на концах, ограниченные короткими прямыми повторами, сигналы инициации транскрипции для РНК полкмераз, открытую рачку считывания и обладает внутренней структурой, отличной от прилегающих областей. Организация данной области имеет ряд общих черт со структурой известных мобильных элементов растений.

Основные работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Шумный В.К., Вершинин A.B., Салина Е.А., Потапова Т.А., Потапов В.А. Повторяющиеся последовательности ДНК злаков: локализация их in situ и критерий для разделения 2-х кинетических классов // Геном растений. Структура и экспрессия.- Уфа, 1983.- С.100-109.

2. Вершинин A.B., Салина Е.А., Толстых В.А., Потапов В.А., Шумный В.К. Изучение реитерирупцих последовательностей ДНК некоторых видов злаков // Изв.Сиб.отд.АН СССР.Сер.Биол.науки,Вып.2,- 1984.-N13.- С.47-52.

3. Салина Е.А., Свиташев С.К., Вершинин A.B., Шумный В.К. Гетерогенность быстро и умеренно реассоциирупцей ДНК злаков // Докл.АН СССР,- 1984.- Т.279.- N4.- С.994-997.

4. Салина Е.А., Вершинин A.B., Свиташев С.К., Шумный В.К. Получение и анализ библиотеки клонов часто повторяющейся ДНК ячменя // Докл.АН СССР.- 1986,- Т.288.- N2.- С.478-481.

5. Салина Е.А., Тимофеева Л.Л., Вершинин A.B. Межвидовая изменчивость в организации повторяющихся последовательностей ДНК рода Hordeum // Генетика.- 1989,- Т.25.- N4.- С.595-604.

6. Салина Е.А., Соловьев В.В., Гулевич В.В., Вершинин A.B. Геномная организация и первичная структура BamHi фрагмента высоко повторяющейся ДНК Hordeum vulgare // Мол.биология.- 1990.- Т.24.- N3.