Индуцированный морфогенез и биологическая трансформация ячменя (Hordeum vulgare L.) отечественных сортов

Сидоров, Евгений Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Индуцированный морфогенез и биологическая трансформация ячменя (Hordeum vulgare L.) отечественных сортов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Индуцированный морфогенез и биологическая трансформация ячменя (Hordeum vulgare L.) отечественных сортов"

На правах рукописи

MOJs&J '

Сидоров Евгений Александрович

Индуцированный морфогенез и биолистическая трансформация ячменя (Hordeum vulgare L.) отечественных сортов

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 k т 2009

Москва - 2009

003468980

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии растений Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии.

Научные руководители:

кандидат сельскохозяйственных наук Сергей Владимирович Долгов, кандидат биологических наук Мария Аркадьевна Чернобровкина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Илья Александрович Шилов, кандидат биологических наук Мария Николаевна Агафодорова

Ведущая организация:

Защита состоится

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

2009 года в

часов

на заседании диссертационного совета Д.006.027.01 при ГНУ ВНИИСБ РАСХН

по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 42.

Тел.: 7(495) 977 6544, факс: 7(495) 977 0947; e-mail: iab@iab.ac.ru

Автореферат разослан

2009 года.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИСБ РАСХН.

Ученый секретарь диссертационного совета

к.б.н. С.А. Меликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Объектом настоящих исследований является ячмень обыкновенный из семейства Злаковые (Gramineae). Данную культуру используют в качестве зернофуража, в крупяном производстве и пивоварении.

Ячмень занимает четвертое место в мире среди основных зерновых культур как по посевным площадям (57,6 млн. га), так и по объему производства зерна (133,2 млн. т), уступая лидерство таким культурам как пшеница, кукуруза и рис (данные Министерства сельского хозяйства США 2007-08 г.г.). Одним из основных производителей ячменя в мире является Россия. На ее долю приходится 17 % всех посевных площадей, занятых данной культурой, при этом доля нашей страны в мировом производстве зерна ячменя составляет около 12 %. Средняя урожайность ячменя в мире в прошлом году составила 2,3 т/га, в России же данная величина составляла 1,6 т/га при средней урожайности в Канаде 2,8 т/га, США 3,2 т/га, Китае 3,4 т/га (по данным Министерства сельского хозяйства США).

Одним из способов повышения урожайности любой культуры, в том числе и ячменя, является выведение новых высокотехнологичных сортов. Несмотря на то, что методами традиционной селекции удалось повысить урожайность ячменя, потенциал их дальнейшего применения лимитирован ограниченным природным разнообразием генотипов в пределах культуры и трудностями межвидовой гибридизации.

Возможность преодоления межвидовой несовместимости обеспечивает метод рекомбинантных ДНК, используемый в растениеводстве с 80-х годов прошлого столетия. Данная технология позволяет вовлекать в селекционный процесс гены практически любых организмов. На сегодняшний день трансгенные растения обеспечили рывок в эффективности сельского хозяйства и потому они оказались востребованы рынком, особенно в аграрно-индустриальных странах, где другие возможности повышения продуктивности себя уже практически исчерпали.

Анализ научных публикаций последних десятилетий в области трансформации

ячменя показывает, что данная культура является довольно сложным объектом

исследований и в условиях in vitro быстро теряет способность к регенерации. В

большинстве работ описываются случаи успешной биолистической или

агробактериальной трансформации ячменя модельных сортов (Golden Promise, Igri и др.), не имеющих хозяйственного значения. Лишь в последние годы стали появляться сообщения о вовлечении в процесс трансформации коммерчески ценных сортов ячменя. Однако для них до сих пор не удалось разработать высокотехнологичного протокола, обеспечивающего эффективную трансформацию.

В качестве селективного маркера при проведении работ по трансформации ячменя в подавляющем большинстве случаев применяется ген bar, обеспечивающий устойчивость к фосфинотрицину. Однако рядом исследователей, как при работе с ячменем, так и при работе с другими злаковыми культурами, отмечается регенерация большого числа нетрансгенных растений при селекции на данном агенте. Поэтому отбор в данном случае часто дополняется контролем за ростом и развитием трансгенной ткани с помощью различных репортерных генов (vidA, lac, gfp)-

При разработке системы трансформации также необходимо проведение тщательного изучения особенностей каждого вовлеченного в процесс сорта на всех этапах культивирования в условиях in vitro.

Целью наших исследований являлось изучение факторов, влияющих на эффективность индуцированного морфогенеза, и разработка методик регенерации и биолистической трансформации соматических тканей ячменя сортов отечественной селекции.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) Изучение особенностей индуцированного морфогенеза и разработка протокола эффективной регенерации растений из соматических тканей ячменя сортов отечественной селекции.

2) Оценка влияния физических параметров и биологических характеристик эксплантов на уровень транзиентной экспрессии гетерологичных генов при биолистической трансформации ячменя сортов отечественной селекции.

3) Молекулярно-биологический анализ присутствия гетерологичных последовательностей ДНК в геноме первичных трансформантов.

4) Изучение характера наследования перенесенных генов в потомстве трансгенных растений.

Научная новизна: впервые разработана эффективная система регенерации ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк (селекция КНИИСХ), позволяющая получать интактные растения с частотой 70-80 %. Определены оптимальные условия биолистической трансформации соматических тканей ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк с использованием определения интенсивности транзиентной экспрессии гена gfp в качестве критерия оценки эффективности трансформации.

Практическая значимость работы: разработанный нами протокол получения фертильных растений-регенерантов ячменя в культуре in vitro может быть использован при клеточной селекции, соматической гибридизации и генно-инженерных экспериментах с сортами ячменя отечественной селекции. С использованием разработанной методики биолистической трансформации хозяйственно-ценных сортов ячменя получены трансгенные линии, содержащие гетерологичный ген в геноме, что позволяет проводить дальнейшие исследования в области генетической трансформации. Полученные экспериментальные данные являются основой для планирования и проведения исследований, связанных с трансформацией ячменя или других злаковых культур.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературных источников, описания материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 24 рисунка. Библиографический список включает 202 источника, из них 190 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Растительный материал. В работе использованы три сорта ячменя отечественной селекции: Стимул, Виконт и Мамлюк. Все они характеризуются яровым типом развития. Донорные растения данных сортов выращивали в факторостатных условиях (день/ночь - 16/8 часов, температура днем 18-20°С, ночью 14-16°С) в оранжерее станции искусственного климата «Биотрон» ФИБХ РАН (г.

Пущино) с соблюдением всех необходимых агротехнических мероприятий. В качестве эксплантов использовали незрелые зародыши размером 0,5-1,5 мм, которые выделяли через 12-15 дней после опыления.

Каллусообразование и регенерация растений ячменя. Базовой средой для каллусообразования и регенерации являлась среда Мурасиге-Скуга (среда MS) (Murasighe and Skoog, 1962), дополненная фитогормонами (цитокинины и ауксины в различных концентрациях), а также биологическими добавками (гидролизат казеина; миоинозитол). Состав сред, использованных в эксперименте, приведен в таблице 1.

В опытах по изучению факторов, влияющих на частоту каллусообразования, чашки Петри с высаженными эксплантами помещали в термостат и выращивали каллусы в темноте при температуре 26°С. Способность к каплусообразованию у разных сортов ячменя оценивали в процентном отношении (количество эксплантов, образовавших каллус, из 100 высаженных эксплантов). Качество каллуса (морфологию) оценивали под микроскопом Leica MZ FLUI (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). Ориентир высшей оценки по морфологическим показателям был присвоен плотным каллусам с гладкой блестящей поверхностью. Самое низкое качество присвоено мягким или рыхлым обводненным полупрозрачным каллусам.

Через 4-5 недель культивирования на среде для каллусообразования экспланты, сформировавшие морфогенные каллусы, пересаживали на среды для регенерации. Чашки с пересаженными каллусами инкубировали при температуре 24°С и 16-часовом фотопериоде. Способность к регенерации побегов определяли в процентном отношении (количество каллусов с побегами к общему количеству каллусов, пересаженных на регенерационную среду).

Побеги укореняли на среде MS с уменьшенным вдвое содержанием солей и витаминов и добавлением 20 г/л сахарозы и 1 мг/л ИМК.

Биолистическая трансформация ячменя сортов отечественной селекции. В экспериментах по трансформации ячменя использовали векторную конструкцию psgfp-bar, содержащую ген gfp под промотором Act 1 риса (McElroy et al., 1990) и ген bar под промотором Ubi 1 кукурузы (Christensen et al., 1996). Схематическое

изображение плазмидного вектора psgfp-bar приводится на рис. 1 А.

Обстрел незрелых зародышей проводили на установке Biolistic™ PDS/1000 Helium System (BioRad, USA) (рис. 1Б).

Оптимизацию физических параметров трансформации проводили по следующим показателям: давление гелия в момент разрыва дисков; расстояние между стоп-экраном и мишенью; размер микроносителей, степень разрежения в камере. Расстояние между диском разрыва и макроносителем составляло 4 мм, между макроносителем и останавливающим экраном 11 мм. Осаждение плазмидной ДНК на микрочастицы золота проводили по Киккерту (Kikkert et al., 1993).

Из биологических параметров трансформации оценивали период прекультивации эксплантов перед процедурой обстрела. При этом использовали среду СМ-5 (табл. 1).

Осмотическую обработку эксплантов проводили за 4-6 часов до обстрела на среде MS с добавлением инозитола (100 мг/л ), гидролизата казеина (1 г/л ), 2,4-D (2,5 мг/л ), а также сорбитола (36,5 г/л) и маннитола (36,5 г/л) в качестве осмотических агентов. После обстрела экспланты дополнительно выдерживали на среде с осмотиками (12-16 ч), после чего проводили детекцию транзиентной экспрессии гена gfp под флуоресцентным микроскопом Leica MZ FLI1I (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany), укомплектованным фильтрами GFP Plus и GFP for plants. По уровню транзиентной экспрессии гена gfp проводили оценку параметров трансформации.

Прекультивацию незрелых зародышей осуществляли на среде для индукции каллусообразования (СМ-5); чашки с высаженными эксплантами помещали в термостат и выращивали каллусы в темноте при температуре 26°С. После прекультивации за 4-6 ч до обстрела зародыши перекладывали на среду, содержащую маннитол и сорбитол в концентрации 0,4 М. Обстрелянные зародыши перекладывали обратно на среду СМ-5 (см. табл. 1), содержащую в качестве селективного агента фосфинотрицин в концентрации 5 мг/л. Всего было обстреляно 29562 экспланта (сорта Стимул-12562 экспланта, Виконта-11774 экспланта и Мамлюка-5226 эксплантов).

Регенерацию предположительно трансгенных растений проводили на среде RM-5 (табл. 1) с добавлением фосфинотрицина в концентрации 5 мг/л. Регенерирующие

трансформанты укореняли на 1/2 MS с добавлением 20 г/л сахарозы, 1 мг/л ИМК и 1,5 мг/л фосфинотрицина.

Укоренившиеся регенераты высаживали в теплицу для адаптации к нестерильным условиям выращивания. Перед высадкой в грунт побеги отмывали от остатков агаризованной среды и высаживали в смесь, состоявшую из торфа и песка (3:1). В теплице поддерживалась температура в пределах 22-25°С днем и 18-19°С ночью, влажность 60-70%, освещенность 2500 люкс.

Оценку устойчивости предположительно трансгенных растений к гербициду Basta™ проводили в теплице. Для этого использовали по два листа с каждого растения. Адаксиальную сторону верхней половины листа обрабатывали 1%-ным раствором гербицида Basta™ (Hoechst AG, Frankfurt, Germany) с помощью кисточки. Оценку степени повреждения листа производили через 5 дней после обработки.

Таблица 1. Состав питательных сред для калусообразования (СМ-1-СМ-5) и регенерации (RM1-RM-5)

Название среды Соли MS Витамины MS О N S tri к * Í О s ¡Z) з и Мальтоза, г/л Миоинозитол, мг/л Гидролизат казеина, г/л 2,4-Д, мг/л БАП, мг/л TDZ, мг/л Агар, г/л Я а

СМ-1 + + 0,025 30 - - 2,5 - - 8 5,8

СМ-2 + + 0,025 30 - - 5 - - 8 5,8

см-з + + 0,025 30 100 1 2,5 - - 8 5,8

СМ-4 + + 0,025 30 - - 2,5 0,5 - 8 5,8

СМ-5 + + 0,025 30 100 1 2,5 0,5 - 8 5,8

RM-1 + + 0,025 30 - - - 3 - 8 5,8

RM-2 + + 0,025 30 - - 0,2 2 - 8 5,8

RM-3 + + 0,025 30 - - - - 1 8 5,8

RM-4 + + 1,25 30 - - - 3 - 8 5,8

RM-5 + + 1,25 30 100 1 - 3 - 8 5,8

Анализ данных. Обработку экспериментальных данных проводили с применением основных статистических методов анализа (Рокицкий, 1973; Доспехов, 1979).

А) Б)

Рисунок 1. А - плазмидный вектор psgfp-bar\ Б - установка Biolistic™ PDS/1000 Helium System (BioRad, USA)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Изучение условий, влияющих на рост незрелых зародышей ячменя в

культуре т vitro

При биолистической трансформации целевые ткани (экспланты) подвержены ' целому ряду стрессов, например, физическое проникновение частиц золота или вольфрама, дегидратация при обработке осмотиками, контакт с селективными агентами. В связи с этим регенерация целого растения является одним из самых I критических этапов всей процедуры переноса гетерологичной ДНК, что требует проведения ряда экспериментов, направленных на разработку протокола эффективной и стабильной регенерации целых растений в культуре in vitro с частотой не ниже 70-80 %.

Поскольку способность к регенерации целых растений in vitro довольно часто рассматривается как генетическое свойство сорта, то выбор последнего является важным этапом всей работы.

В предыдущие годы в лаборатории генной инженерии растений ВНИИСБ РАСХН были проведены исследования, позволившие оценить регенерационные потенциалы некоторых сортов ячменя, приуроченных к разным экологическим регионам (Чернобровкина и др., 2004).

Дальнейшая экспериментальная работа проводилась с сортами Виконт, Мамлюк и Стимул селекции КНИИСХ. Следует отметить, что данные сорта ячменя по своей

регенерационной способности превосходили изученные ранее сорта.

Успешное достижение регенерации также напрямую связано с эффективностью каллусогенеза. Одним из условий формирования in vitro каллусов с высокой регенерационной способностью является тип используемого экспланта. В нашем случае это были незрелые зародыши размером 0,5-1,5 мм. На рисунке 2 показан весь цикл получения растений ячменя in vitro от выделения незрелых зародышей до укоренения побегов.

Известно, что для злаков характерно наличие двух типов каллусной ткани: 1) компактный, состоящий из мелких клеток, каллус коричневатого цвета с гладкой блестящей поверхностью, способный к регенерации; 2) рыхлый белый каллус с

крупными клетками, неспособный в большинстве случаев к дальнейшему развитию. Незрелые зародыши, выделенные в асептических условиях, выкладывали на среду так, чтобы щиток располагался сверху. Помещение же их на среду противоположной, осевой, стороной вверх приводило к образованию мягкого полупрозрачного каллуса, отличающегося низким морфогенным потенциалом (см. рис. 3).

а * ♦ % %

* д \ i * 1'

Рисунок 2. Каллусообразование и регенерация на незрелых зародышах ячменя: а -выделенные незрелые зародыши ячменя; б - каллусообразование на незрелых зародышах ячменя сорта Стимул (среда СМ-5); в - начало регенерации на морфогенном каллусе ячменя сорта Мамлюк (среда СМ-5); г - начало регенерации на морфогенном каллусе ячменя сорта Виконт (среда СМ-4); д - образование множественных побегов на морфогенном каллусе на регенерационной среде (сорт Виконт, среда ЯМ-5); е - укоренение образовавшихся регенерантов.

Во всех изученных вариантах культуральных сред в качестве источника углеводов использовали мальтозу. Рядом исследований было показано, что мальтоза оказывает положительное влияние на морфологию каллуса и регенерационные возможности ячменя (Чернобровкина и др., 2004; Mordhorst & Lorz, 1993; Wan & Lemaux, 1994; Dahleen & Bregitzer, 2002).

В качестве же источника ауксинов и цитокининов экспериментальные среды для каллусообразования содержали 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту) и 6-бензиламинопурин (6-БАП), соответственно. То, что 2,4-Д является оптимальным агентом для инициации дедифференциации клеток у злаковых культур, было отмечено ранее работами зарубежных ученых (Bregitzer, 1992; Bregitzer et al., 1995;

' Lemaux etal., 1998).

Частота каллусообразования в наших экспериментах на среде СМ-1 составляла 76%, 70% и 68% у Стимула, Виконта и Мамлюка, соответственно. Увеличение содержания 2,4-Д в среде СМ-2 приводило к образованию во всех вариантах в основном рыхлого, неморфогенного каллуса (рис. 4А).

Одновременное же присутствие 6-БАП и 2,4-Д в средах СМ-4 и СМ-5 приводило к увеличению частоты образования морфогенного каллуса. Причем различия между средами с содержанием 6-БАП и без него были существенны при Р=95 % (рис. 4А, табл. 2).

Рисунок 3. Образование неморфогенного каллуса (А) при ориентации незрелых зародышей ячменя осевой стороной вверх и морфогенного каллуса (Б) при ориентации незрелых зародышей щитковой стороной вверх (на примере сорта Мамлюк).

Результаты экспериментов по изучению факторов, влияющих на эффективность каллусообразования, приведены в таблице 2. По данным дисперсионного анализа различия между вариантами сред и сортов оказались существенны на 5 %-ном уровне значимости.

Наибольшая частота образования плотных каллусов с большим количеством морфогенных структур у всех сортов регистрировалась при использовании сред СМ-4 и СМ-5 (таблица 2). Особенности развития индуцированного морфогенеза ячменя сорта Стимул на среде СМ-5 показаны на рис. 4Б.

ч * ШШШ

• * Г*»**

А) МНН^ВШШ^Н^ВНН Б)

Рисунок 4. А) Особенности каллусообразования ячменя сорта Виконт на средах СМ-1, СМ-2, СМ-4 и СМ-5; Б) Пролиферация клеток каллусной ткани и индуцированный морфогенез на незрелых зародышах ячменя сорта Стимул (среда СМ-5) (1) - 1 день культивирования, 2) - 4 дня, 3) - 11 дней, 4) - 20 дней).

Таблица 2. Частота каллусообразования и качественные показатели каллусов ячменя исследованных сортов

СМ-1 СМ-2 см-з СМ-4 СМ-5

Стимул 76+*аЬсс1 72*аЬ 83+сс1еГ 96+1

Виконт 70+*аЬ 70*а 80+Ьсс1е 86+еГ§11

Мамлюк 68+*а 67*а 75+аЬс 84+defgh 91+Ы

Морфология каллуса: + - плотный, блестящий; * - обводненный, полупрозрачный. Одинаковыми буквами обозначены незначимо различающиеся варианты (Р=95 %).

Для продолжения экспериментов по выявлению факторов, влияющих на

эффективность регенерации побегов, в качестве исходной среды для инициализации

каллусогенеза была выбрана среда СМ-5 как наиболее перспективный вариант из всех исследованных.

Регенерационную способность ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк изучали на средах, приведенных в таблице 1 (RM-1-RM-5).

Было показано, что увеличение содержания цитокининов (6-БАП) в регенерационной среде по сравнению с каллусообразующей благоприятно сказывалось на процессах образования целых растений на эксплантах ячменя всех трех сортов. Сочетание же 2,4-Д и 6-БАП в среде RM-2 приводило к снижению эффективности регенерации.

В среде RM-3 в качестве источника цитокининов содержался тидиазурон (TDZ) в концентрации 1 мг/л. Исследованиями Шэна и др. (Shan et al., 2000) показано, что такое количество TDZ было оптимальным для регенерации ячменя. В наших исследованиях частота регенерации целых растений на среде с TDZ была довольно низкой. Однако при этом у сорта Виконт наблюдалось увеличение среднего числа побегов на один эксплант по сравнению с другими вариантами (рис. 5; табл. 3,4).

Таблица 3. Частота регенерации ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк

RM-1 RM-2 RM-3 RM-4 RM-5

Стимул 7ljk 54d 40bc 771 86m

Виконт 60ef 42c 28a 66h 7 lijk

Мамлюк 60f 41c 27a 66gh 72k

Одинаковыми буквами обозначены незначимо различающиеся варианты (Р=95 %).

Таблица 4. Количество побегов на один эксплант в зависимости от гормонального состава сред для регенерации ячменя

RM-1 RM-2 RM-3 RM-4 RM-5

Стимул 8,50 fghi 7,75defg 12,50 k 9,50 hi 11,50 jk

Виконт 6,75 bcd 5,75 b 9,75 i 6,25 be 8,00 defg

Мамлюк 7,25 cdef 4,25 a 9,00 ghi 7,00 bede 8,25 efgh

Одинаковыми буквами обозначены незначимо различающиеся варианты (Р=95 %).

Положительное действие на регенерационные процессы оказывало повышенное содержание меди в среде RM-5 (50-кратное увеличение по сравнению с базовой средой).

По итогам проведенных нами экспериментов, лучшей регенерационной средой является среда RM-5, отличающаяся повышенным уровнем ионов меди (50х) и содержавшая 6-БАП в концентрации 3 мг/л. В ее состав также входили гидролизат казеина и миоинозитол, которые, по мнению ряда исследователей, оказывают благоприятное действие на процессы роста и развития растительных эксплантов в условиях in vitro (Luhrs & Lorz, 1987; Wan & Lemaux, 1994; Castillo et al., 1998).

а ■T&JÍ / ^ Т ТА. J , \ VbUll V Ч б k ^ ^ 1 > i ^^ В- фы* < V <JF>

в Г

i # ^ У | VI J> NJ»' - ' fc . -r Ti i

Ú- / )

V«iv , > *

Рисунок 5. Регенерация сорта Виконт на различных регенерационных средах: а - на среде ЯМ-1; б - на среде RM-3; в - на среде RM-5; г-на среде RM-2.

' г ш * > ■ ^

\ . л 4 1 * ^ . /

* "*«3'

А)------------.-Б)

Рисунок 6. Регенерация ячменя сортов Стимул (А) и Мамлюк (Б) на среде RM-5.

Из трех использованных нами сортов ярового ячменя по регенерационным способностям наиболее перспективным оказался сорт Стимул (рис. 6А). По регенерационной способности он превосходил сорта Виконт и Мамлюк во всех исследованных вариантах (рис. 5, 6Б), причем различия были существенны на 5%-ном уровне значимости (табл. 3).

2. Изучение факторов, влияющих на эффективность биолистической трансформации незрелых зародышей ячменя Физические факторы. Эффективность биолистической трансформации, помимо качества экспланта, зависит также от целого ряда параметров.

Оптимизацию физических параметров проводили по следующим показателям: давление дисков разрыва (450 psi (pounds per square inch - фунты на квадратный дюйм) (30,6 атм), 650 psi (44,2 атм), 900 psi (61,2 атм), 1100 psi (74,9 атм), 1350 psi (91,9 атм) и 1500 psi (102,1 атм)); расстояние между стоп-экраном и мишенью (3, 6, 9 и 12 см); степень разрежения воздуха в камере пушки (26, 27, 28, 29 дюймов ртутного столба (0,87, 0,90, 0,94 и 0,97 атм соответственно)); размер микроносителей (0,6 мкм и 1,0 мкм). Расстояние между диском разрыва и макроносителем составляло 4 мм, между макроносителем и останавливающим экраном 11 мм. Эффективность транзиентной экспрессии определяли по степени покрытия площади экспланта очагами с экспрессией репортерного гена gfp (рис. 7).

Влияние давления гелия на эффективность транзиентной экспрессии гена gfp. Величина давления гелия, определяющая силу, с которой частицы проникают в ткани экспланта, значительно влияла на уровень транзиентной экспрессии гена gfp в тканях незрелых зародышей ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк (низкий уровень транзиентной экспрессии гена gfp - <50 флуоресцирующих точек на эксплант; средний - 50-100; высокий - >100) (рис. 7).

Увеличение давления гелия с 450 psi до 1100 psi приводило к постепенному увеличению уровня транзиентной экспрессии гена gfp. При значениях давления 900 и 1100 psi около 20 % эксплантов имели высокий уровень экспрессии. Дальнейшее увеличение давления гелия приводило к снижению уровня транзиентной экспрессии из-за сильного повреждения тканей эксплантов (рис. 8). Для того чтобы избежать

чрезмерного повреждения клеток эксплантов, изучение остальных параметров биолистики проводили при давлении 900 psi.

А Б В Г

ц. л ^^Н

Рисунок 7. Уровень транзиентной экспрессии гена ^¡р в тканях щитка незрелых зародышей ячменя через 24 часа после обстрела; а - отсутствие экспрессии, б -низкий, в - средний, г - высокий.

Доля эксплантов с соответствую щим уровнем экспрессии, (%>

Давление при выстреле, (psi)

□ Высокий □ Средний □ Низкий

Рисунок 8. Влияние давления гелия на эффективность транзиентной экспрессии гена gfp в тканях щитка незрелых зародышей ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк через 24 часа после обстрела.

Влияние расстояния между останавливающим экраном и мишенью на эффективность транзиентной экспрессии гена gfp. Оптимизация расстояния между стоп-экранами и мишенями необходима для обеспечения равномерного распределения микроносителей, покрытых ДНК, на поверхности целевых тканей без их сильного повреждения (Russell et al., 1992; Tadesse et al., 2003).

Исследования показали, что оптимальным расстоянием между останавливающим экраном и эксплантом-мишенью было 6-9 см при давлении гелия 900 psi. (рис. 9А).

Слишком близкое расстояние до мишени (3 см) приводило к сильному повреждению тканей и снижению количества флуоресцирующих точек (результат экспрессии гена на поверхности экспланта. С увеличением расстояния до мишени до 12 см снижались скорость микрочастиц и глубина их проникновения, в связи с чем меньшее количество клеток оказывалось способным к интеграции чужеродной ДНК.

Влияние степени разрежения воздуха в камере на эффективность транзиентной экспрессии гена ^р. Степень разрежения воздуха в камере ' существенно влияет на ускорение микроносителей при прохождении расстояния от стоп-экранов до мишени (Рагуеег е( а1., 1998). При низком разрежении микрочастицы могут не достигать целевых тканей из-за сопротивления воздуха, находящегося в камере пушки. Нашими исследованиями показано увеличение транзиентной экспрессии гена при увеличении разрежения с 26 до 28 дюймов ртутного столба (рис. 9Б).

Рисунок 9. Влияние расстояния между останавливающими экранами и мишенью (А) и степени разрежения воздуха в камере (Б) на эффективность транзиентной | экспрессии гена ^р в ткани щитка незрелых зародышей ячменя через 24 часа после I обстрела; 1 - Стимул, 2 - Мамлюк, 3 - Виконт.

Влияние размера частиц на эффективность транзиентной экспрессии гена

Для переноса генетического материала мы использовали вольфрамовые

частицы двух наиболее распространенных калибров: N10 со средним диаметром

частицы 0,7 мкм и N17 со средним диаметром 1,1 мкм, а также частицы золота размером 0,6 мкм и 1,0 мкм. Теоретически, частицы меньшего размера должны обеспечивать более равномерное распределение ДНК по поверхности экспланта и меньше повреждать растительные клетки по сравнению с частицами большего размера, что, в свою очередь, должно положительно влиять на уровень транзиентной экспрессии и частоту регенерации трансгенных побегов.

Однако, результаты, представленные на рис. 10А, показывают, что уровень транзиентной экспрессии гена был выше при использовании частиц золота размером 1,0 мкм.

В результате же применения вольфрамовых частиц транзиентная экспрессия не была обнаружена вообще. Это могло быть обусловлено либо сильным повреждением клеток эксплантов вследствие гетерогенности размера и формы вольфрама, либо токсичностью вольфрама для некоторых типов клеток растений, либо окислением и деградацией ДНК (Запйж! е1 а1., 1993).

А)

>- 200 о!? ® 3 I 150 6 ! !

° & 5 100 53" я)

о о

& I 1 15°

||1| Ю0 I 5 5 *

§ г ч 5о

___р ГГ ГШ,

0.6 1 Размер микроносителей, мкм

Б)

1 7-9 12-14 20

Длительность прекультивации, сут

01 О? □.!

Рисунок 10. Влияние размера частиц золота (А) и длительности прекультивации незрелых зародышей ячменя (Б) на эффективность транзиентной экспрессии гена через 24 часа после обстрела эксплантов; 1 - Стимул, 2 - Мамлюк, 3 - Виконт.

Биологические факторы. Среди биологических параметров, влияющих на эффективность трансформации, наиболее важными являются тип эксплантов, их осмотическое состояние и длительность периода инкубации на культуральной среде до обстрела.

При проведении настоящих исследований во всех случаях осмотическую обработку незрелых зародышей ячменя проводили за 4 часа до обстрела (рис. 11Б).

Продолжительность же этапа прекультивации определяли опытным путем.

Рисунок 11. Прекультивация и обстрел незрелых зародышей ячменя: а -оптимальная стадия развития каллусных клеток для проведения биолистической трансформации; б - морфогенные каллусы, высаженные на осмотическую среду за 4 часа до обстрела; в, г - транзиентная экспрессия гена gfp в каллусных клетках.

Влияние стадии развития эксплантов на эффективность транзиентной экспрессии гена gfp. Оптимальная стадия развития эксплантов является очень важным фактором успешной трансформации, так как активно делящиеся клетки более восприимчивы к биолистическому способу доставки ДНК (Moore et al., 1994). Обстрел эксплантов на более ранних стадиях приводил к сильным механическим повреждениям их тканей.

Среди исследователей нет единого мнения относительно сроков прекультивации незрелых зародышей перед обстрелом частицами. Эти сроки сильно варьируют от одного дня (Barro и др., 1998) до трех недель (De Block et al., 1997).

Нами было установлено, что наиболее восприимчивыми к процессу внедрения гетерологичной ДНК оказались клетки эксплантов незрелых зародышей ячменя, прошедшие 12-14-дневную прекультивацию на среде для индукции каллусообразования перед процедурой обстрела (рис. 10Б, 11 А).

3. Биолистическая трансформация ячменя сортов отечественной селекции (Стимул, Виконт, Мамлюк)

В результате биолистической трансформации ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк по разработанным нами протоколам было получено 182 предположительно трансгенных регенеранта, прошедших селективный отбор на средах с фосфинотрицином (из них 88 регенерантов при использовании для обстрела зародышей ячменя сорта Стимул, 53 - сорта Виконт и 41 - сорта Мамлюк). К почвенным условиям теплицы было адаптировано 73 первичных трансформанта сорта Стимул, 42 первичных трансформанта сорта Виконт и 24 первичных трансформанта сорта Мамлюк (табл. 5).

Таблица 5. Результаты биолистической трансформации ярового ячменя

Кол-во обстрелянных эксплантов, (шт.) Кол-во Адаптация Кол-во растений, устойчивых/чув ствительных к гербициду Basta™

Сорта отселекти рованных регенеран тов, (шт.) погибли Г выжили ПЦР-анализ на наличие гена gfp(+/-)

Стимул 12562 88 15 73 6/67 0/73

Виконт 11774 53 11 42 0/42 0/42

Мамлюк 5226 41 17 24 0/24 0/24

Для обнаружения трансгенной вставки мы использовали метод полимеразной цепной реакции. При этом применяли праймеры, комплементарные участкам следующих элементов рекомбинантой ДНК: 1) промоторной области генов gfp (Act 1), bar (Ubi A-Ubi B)\ 2) актинового интрона гена gfp (Act 1 int); 3) собственно гена gfp (ëfP uP'gfP low), 4) собственно гена bar (barl-bar2, bar for-bar rev, bar up-bar low); и, наконец, 5) терминатора обоих генов (Nos).

При анализе наличия вставки гетерологичного гена методом ПЦР использование большинства из вышеуказанных комбинаций олигонуклеотидов приводило к амплификации большого количества неспецифических фрагментов. Это сильно затрудняло выявление какого-либо полиморфизма среди анализируемых генотипов.

Кроме того, очень часто отмечалась амплификация фрагментов с искомой молекулярной массой при использовании в качестве матрицы препаратов геномной ДНК из растений ячменя, не подвергавшихся процедуре трансформации (рис. 13-4).

Для оптимизации режима амплификации и избавления от образования неспецифических фрагментов в ходе реакции использовали следующие методы: меняли температуру и время отжига, количество циклов амплификации, добавляли в реакционную смесь 2% DMSO, использовали повышенную до 3,5 шМ концентрацию MgCl2, что должно было повысить точность работы ДНК-полимеразы.

Следует отметить, что изменение температуры и времени отжига праймеров, времени элонгации, уменьшение количества полимеразы и числа циклов амплификации, а также изменения в химическом составе реакционного буфера чаще всего не приводило к уменьшению числа неспецифических ПЦР-продуктов. Однако в результате проведенной работы по тестированию различных комбинаций праймеров удалось найти наиболее подходящий для идентификации гетерологичной вставки вариант: это пара праймеров gfp low-Act I-int. Режим амплификации при этом был следующим: 1) 95 °С- 2 мин (горячий старт - денатурация); [2) 94°С-30 сек (денатурация), 3) 62°С-45 сек (отжиг), 4) 72°С-40 сек (элонгация)] - количество циклов амплификации - 40; 5) 72°С-3 мин.

Размер амплифицируемого фрагмента составил 800 п.н. Последовательности праймеров:

Gfp low -5' TTA-CTT-GTA-CAG-CTC-GTC-CAT 3'

Actl int -5' GAA-TCC-CTC-AGC-ATT-GTT-CAT-CGG-TAG 3'.

На рисунке 13-3 показано, что при использовании данной пары праймеров и описанного режима амплификации нам удалось практически полностью избавиться от неспецифичных фрагментов.

После обстрела все экспланты на каждом этапе развития подвергались селективному воздействию со стороны фосфинотрицина. Однако, в конечном итоге, на селективной среде нами было получено большое количество растений-регенерантов, из которых лишь у шести была обнаружена трансгенная вставка гена

gfp (рис. 13-3). В результате обработки полученных шести ПЦР-положительных растений 1%-ным раствором гербицида Basta™ не было выявлено устойчивости к нему (рис. 12). Тем не менее, в тканях зерновок у этих линий отмечалась экспрессия гена gfp (рис. 13-2). Кроме того, мы также наблюдали флуоресцентное свечение в тканях эксплантов в условиях in vitro, характерное для экспрессирующегося гена gfp (рис. 13-1).

Рисунок 12. Изучение первичных трансформантов; А - адаптация первичных трансформантов к тепличным условиям; Б - обработка первичных трансформантов раствором гербицида Basta™.

Таблица 6. Анализ растений ячменя поколения Т1

Номер линии Количество семей в линии Общее количество растений (в линии), устойчивых к гербициду Basta™ Общее количество растений (в линии), чувствительных к гербициду Basta™ ПЦР-анализ на наличие геная/р(+/-)

1 4 0 44 0/44

2 7 0 90 0/90

3 10 0 142 0/142

4 8 0 102 0/102

5 8 0 123 0/123

6 2 0 39 0/39

Достоверность факта встраивания гена bar не удалось доказать ни с помощью ПЦР-анализа, ни с помощью наблюдения за фенотипической реакцией растений-трансформантов на их обработку гербицидом Bastaгм. Устойчивость к гербициду

Basta™ не наблюдалась и у потомства этих шести линий. С помощью полимеразной цепной реакции также не было обнаружено присутствие каких-либо рекомбинантных генов в геноме растений поколения Т1 (ни gfp, ни bar) (табл. 6).

! Рисунок 13. 1) - экспрессия гена gfp в каллусных клетках ячменя; 2) - сравнение свечения в ультрафиолетовом свете под микроскопом Leica MZ FLUÍ зерновок нетрансформированного растения (слева) и трансформированного растения ячменя (справа); 3) - ПЦР-анализ геномной ДНК, выделенной из растений потомства То трансгенных линий ячменя (сорт Стимул) с использованием праймерной пары gfp-low-Actl-int, где 1, 13 - маркер молекулярной массы (100 bp+1,5 kb), 2 - плазмида psgfp-bar, 3-8 линии трансгенного ячменя (сорт Стимул), 9 - трансгенная пшеница (положительный контроль), 10, 11 - нетрансгенный ячмень (отрицательный контроль), 12 - вода. Размер фрагмента 800 Ьр; 4) - ПЦР-анализ геномной ДНК, выделенной из растений потомства Т0 трансгенных линий ячменя (сорт Стимул), с использованием праймерной пары bar-l-bar-2, где 1 - маркер молекулярной массы (100 Ьр), 2-7 - линии трансгенного ячменя (сорт Стимул), 8 - плазмида psgfp-bar, 9 -нетрансгенный ячмень (отрицательный контроль), 10 - вода. Размер фрагмента -350 Ьр.

В результате проведенных исследований с использованием фосфинотрицина в качестве селективного агента имело место большое количество так называемых эскейпов (т.е. регенерация нетрансгенных растений, каким-либо образом избежавших действия селективного агента).

Возможно, регенерация растений, не содержащих фосфинотрицин ацетилтрансферазу, на селективной среде связана с тем, что данный фермент может накапливаться в клетках в результате транзиентной экспрессии гена bar сразу после обстрела и, в силу своей небольшой молекулярной массы, перемещаться по клеткам экспланта, тем самым придавая им некоторую устойчивость. Стабильного встраивания гена bar при этом могло и не произойти.

Также можно предположить, что отдельные клетки трансформированного каллуса с экспрессируемой стабильной вставкой гетерологичной ДНК могли обеспечивать регенерацию нетрансгенных побегов из соседних клеток, не

содержащих переносимый ген. При этом каллусные клетки со стабильной вставкой оказались неспособными к регенерации целых растений.

Таким образом, в результате наших исследований была разработана эффективная система регенерации растений ячменя отечественных сортов in vitro. Нам также удалось подобрать оптимальные биологические и физические параметры биолистической трансформации ячменя. Эффективность обстрела при этом определяли по уровню транзиентной экспрессии гена gfp.

Выводы

1. Разработана методика регенерации ячменя сортов отечественной селекции (Стимул, Виконт и Мамлюк) из соматических тканей незрелых зародышей с использованием индуцированного морфогенеза в условиях in vitro.

2. Получены интактные растения ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк, частота регенерации которых составляет 70-80 %, что является одним из важнейших факторов для достижения успешной трансформации.

3. Оптимизированы параметры биолистической трансформации соматических тканей ячменя сортов отечественной селекции (размер и вид микроносителей, величина давления в момент выстрела, разрежение в камере пушки, расстояние между останавливающим экраном и мишенью, период прекультивации эксплантов) с использованием интенсивности транзиентной экспрессии гена gfp в качестве критерия оценки эффективности трансформации.

4. Получены шесть трансгенных линий ячменя сорта Стимул с подтвержденной ПЦР-анализом вставкой гена gfp. В тканях зерновок данных линий наблюдалась экспрессия гена gfp.

5. Показана возможность встраивания гетерологичных генов в геном ячменя сортов отечественной селекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чернобровкина М.А., Сидоров Е.А., Баранов И.А., Харченко П.Н., Долгов С.В. Влияние параметров биолистической трансформации ярового ячменя (Hordeum vulgare L.) на уровень транзиентной экспрессии репортерного гена gfp II Известия РАН. Серия биологическая. 2007. № 6. С. 669-675.

2. Miroshnichenko D., Filippov М., Sidorov Е., Chernobrovkina М. and Dolgov S. А Dual Selection Scheme for Efficient Recovery of Transgenic Cereal Plants and for Identification of Hemi- and Homozygous Progenies // Abstracts of International Conference "Plant Transformation Technologies", Vienna, Austria, 4-7 February. 2007. p. 80.

Отпечатано в печатном салоне "Сервис Принт". Тираж 100 экз. Тел.: (495) 976-25-41 www.serviceprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сидоров, Евгений Александрович

Введение

1. Обзор литературных источников

1.1. Хозяйственно-биологические особенности ячменя(Hordeum vulgare L.)

1.2. Особенности регенерации ячменя в условиях in vitro

1.3. Методы трансформации растений

1.3.1. Агробактериальный метод трансформации растений

1.3.2. Методы прямого переноса ДНК

1.3.2.1. Электропор ация и ПЭГ-метод

1.3.2.2. Микроинъекции и упаковка ДНК в липосомы

1.3.2.3. Биолистический метод трансформации растений

1.4. Особенности трансформации злаковых культур

1.5. Особенности векторных конструкций, используемых для трансформации однодольных культур

1.5.1. Промотор

1.5.2. Интрон

1.5.3. Терминатор

1.5.4. Репортерный ген

1.5.5. Селективный ген 3 6 1.6 Основные направления генной инженерии ячменя 38 1.7. Заключение по обзору литературных источников

2. Экспериментальная часть

2.1. Материалы и методы

2.2. Результаты и обсуждение

2.2.1. Изучение условий, влияющих на рост незрелых зародышей в условиях in vitro

2.2.2. Изучение факторов, влияющих на эффективность биолистической трансформации ячменя сортов Виконт, Мамлюк и Стимул 70 2.2.2.1. Физические факторы

2.2.2.2. Биологические факторы

2.2.3. Биолистическая трансформация ячменя сортов отечественной селекции (Стимул, Виконт, Мамлюк), изучение первичных трансформантов (То) и их потомства (Т1)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Индуцированный морфогенез и биологическая трансформация ячменя (Hordeum vulgare L.) отечественных сортов"

Ряд важнейших проблем человечества — здоровье, обеспечение населения продуктами питания, охрана окружающей среды - в значительной степени определяется уровнем развития биологии. За последние десятилетия в этой области научного знания произошел настоящий прорыв: была доказана роль ДНК как основного носителя наследственной информации, выяснены молекулярные механизмы процессов хранения и передачи наследственной информации, разработаны технологии рекомбинантных ДНК. Все это привело к развитию различных областей науки, но, прежде всего, создало необходимые предпосылки для появления биотехнологии и генной инженерии, причем последняя по сути является одним из разделов биотехнологии.

В историческом смысле биотехнология возникла тогда, когда дрожжи были впервые использованы при производстве пива, а бактерии -для получения йогурта. В настоящее время биотехнологию можно определить как использование живых организмов, биологических систем и процессов для промышленного производства новых продуктов (сорта сельскохозяйственных растений и породы сельскохозяйственных животных, лекарственные препараты, вакцины, пищевые добавки и т.д.).

Одним из основных направлений биотехнологических экспериментов на растениях является создание новых высокопродуктивных сортов. В растения вводятся гены, обеспечивающие их устойчивость к насекомым-вредителям, вирусам, гербицидам и неблагоприятным условиям окружающей среды. Кроме того, проводятся эксперименты по использованию растений в качестве «биореакторов».

Перенос генов в растение представляет собой разновидность селекции. Только путь создания нового сорта гораздо короче, и преодолевается такое существенное ограничение классической селекции, как половая нес овместимость.

Молено привести три основных аргумента в пользу развития генетической инженерии растений. Во-первых, введение гена часто приводит к повышению сельскохозяйственной ценности и декоративных качеств культурных растений. Во-вторых, трансгенные растения могут служить живыми биореакторами при малозатратном производстве экономически важных белков или метаболитов. В-третьих, генетическая трансформация растений (трансгеноз) позволяет изучать действие генов в ходе развития растений и других биологических процессов (обратная генетика).

Однако, у ГМО (генетически модифицированных организмов) есть немало противников во всем мире. В случае использования трансгенных растений существует три типа потенциально возможных рисков: влияние на здоровье человека, перенос генов к другим видам, отдаленные экологические последствия. Вполне резонно согласиться с опасениями по поводу того, что сейчас трудно спрогнозировать отдаленные последствия влияния ГМО на окружающую среду. Следует также подчеркнуть, что за последний век вообще трудно найти примеры положительного влияния сельского хозяйства на экологическую среду. Вряд ли трансгенные растения смогут нанести больший вред природе, чем, скажем, бесконтрольное применение пестицидов или уничтожение лесов.

Таким образом, проблема разработки методов молекулярной селекции и создание трансгенных сортов основных сельскохозяйственных культур в России приобретает стратегическое значение с точки зрения продовольственной безопасности и независимости, а владение современными методами биотехнологии и диагностики растений является основой для предотвращения превращения России в свалку отходов биотехнологической индустрии развитых стран.

Существует несколько способов получения трансгенных растений (агробактериальная трансформация, биолистическая трансформация, электропорация, микроинъекции и т.д.). Следует отметить, что первые два метода трансформации являются наиболее часто используемыми.

Системы переноса генов с помощью Agrobacterium tumefaciens эффективно работают только в случае некоторых видов растений. В частности, однодольные растения, включая основные зерновые культуры, практически не трансформируются A. tumifaciens. И если в результате модификации методики и при строгом контроле за условиями проведения опытов удалось добиться успешной агробактериальной трансформации риса и кукурузы некоторых сортов, то для большинства других видов зерновых растений основным методом переноса генов остается метод биолистической трансформации. К таковым относится и ячмень, являющийся важной продовольственной культурой. Следует отметить, что клетки и ткани данной культуры при проведении работ в условиях in vitro с большим трудом поддаются регенерации и генетической трансформации. В1 связи с этим работ, описывающих успешную трансформацию ячменя, немного. Кроме того, большинство из них содержит данные о трансформации так называемых модельных сортов, не имеющих какого-либо коммерческого значения в настоящее время.

Целью наших исследований являлось изучение факторов, влияющих на эффективность индуцированного морфогенеза и биолистической трансформации соматических тканей ячменя сортов отечественной селекции.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

4) Изучение характера наследования перенесенных генов в потомстве трансгенных растений.

Научная новизна: впервые разработана эффективная система регенерации ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк (селекция КНИИСХ), позволяющая получать интактные растения с частотой 70-80 %. Определены оптимальные условия биолистической трансформации соматических тканей ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк с использованием интенсивности транзиентной экспрессии гена gfp в качестве критерия оценки эффективности трансформации.

Данная работа была выполнена в лаборатории генной инженерии растений ГНУ ВНИИСБ РАСХН под руководством в.н.с. к.б.н. М.А. Чернобровкиной и заведующего лабораторией к.с.-х.н. C.B. Долгова.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Сидоров, Евгений Александрович

Выводы

2. Получены интактные растения ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк, частота регенерации которых составляет 70-80 % , что является одним из важнейших факторов для достижения успешной трансформации.

5. Показана возможность встраивания гетерологичных генов в геном ячменя сортов отечественной селекции.

Заключение t

Проведенные нами эксперименты показали, что эффективность регенерации целых зеленых растений в культуре in vitro в значительной степени зависит от генотипа. Исследования регенерационного потенциала трех отечественных сортов ячменя (Стимул, Виконт и Мамлюк) продемонстрировали значительные различия между ними. Из протестированных в условиях in vitro сортов наиболее высокой регенерационной способностью обладал сорт Стимул.

В результате проведенных исследований по оптимизации состава питательных сред установлено, что оптимальной средой для каллусообразования является среда, составленная на основе прописи Мурисиге-Скуга (MS) и дополненная миоинозитолом (100 мг/л), гидролизатом казеина (1000 мг/л), 2,4-Д (2,5 мг/л) и 6-БАП (0,5 мг/л), а регенерационной средой, позволившей получить наиболее высокие результаты - среда RM-5, составленная на основе MS и дополненная миоинозитолом (100 мг/л), гидролизатом казеина (1000 мг/л), CUSO4X5H2O (1,25 мг/л) и 6-БАП (3 мг/л). Применение тидиазурона в качестве источника цитокининов в среде RM-3 приводило к снижению частоты образования растений-регенерантов, но увеличивало число побегов на отдельном экспланте. Положительный эффект на процессы регенерации наблюдался при повышении (в 50 раз по сравнению с рекомендуемым по прописи MS) уровня содержания в питательной среде ионов меди.

Таким образом, нами была разработана регенерационная система, позволяющая получать интактные растения в культуре in vitro с частотой 7080% (рис. 24). j

Кроме того, в ходе данных исследований мы изучали различные факторы, влияющие на эффективность биолистической трансформации ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк (давление гелия, при котором происходит разрыв дисков, разряжение воздуха в камере пушки, расстояние

1 этап (выделение зародышей через 10-15 дней после опыления; размер зародышей 0,5-1,5 мм; зародыши высаживались на среду СМ-5 (основа МБ + мальтоза (30 г/л) + инозитол (100 мг/л) + гидролизат казеина (1 г/л) + 2,4-Д (2,5 мг/л) + 6-БАП (0,5 мг/л)).

2 этап (образование морфогенного каллуса (среда СМ-5) в темноте при 1°=26°С; продолжительность периода - 20-25 дней). W

1St

3 этап (активная регенерация побегов на среде КМ-5 (основа МБ + мальтоза (30 г/л) + инозитол (100 мг/л) + гидролизат казеина (1 г/л) + Си504х5Н20 (1,25 мг/л) + 6-БАП (3 мг/л) на свету при {°=20°С; продолжительность -15-20 дней)).

4 этап (укоренение побегов на среде RtM (1/2 основы MS + сахароза (20 г/л) + ИМК (1 мг/л), на свету при t°=20°C; продолжительность -10-12 дней)).

Рисунок 24. Оптимизированный протокол получения растений-регенерантов ячменя в условиях in vitro. между останавливающим экраном и мишенью, материал (золото/вольфрам) и размер микроносителей, время и способы прекультивации эксплантов перед процедурой обстрела). Оптимальная эффективность переноса гетерологичной ДНК в клетки растений достигается при определенном соотношении между силой проникновения- частиц и степенью поранения ткани-мишени. Наиболее эффективная транзиентная экспрессия гена gfp при трансформации ячменя методом биобаллистики достигалась при соблюдении следующих условий: использование частиц, золота размером 1,0 мкм для избежания повреждений растительных клеток; проведение обстрела хозяйственно ценных сортов при давлении гелия 900-1100 psi и разряжении в камере 28-29 дюймов, ртутного столба; помещение чашки с эксплантами на расстояние- 6-9 см между останавливающим экраном и мишенью; перенос гетерологичной ДНК в активно дeлящиecяv клетки после периода прекультивации, составлявшего в среднем 12-14 дней на оптимизированной нами ранее среде для регенерации побегов.,

В3 ходе экспериментов по биолистической трансформации нами, было получено шесть первичных трансформантов • ячменя сорта Стимул, содержащих ген gfp. Геномная вставка была подтверждена ПЦР-анализом с праймерами Actl-int-GFP-low. При помощи* флуоресцентной^ микроскопии* в тканях зерновок этих линий было зафиксировано зеленое свечение, характерное для активно экспрессирующегося гена gfp. Наличие же гена bar нам обнаружить не удалось ни при помощи фенотипических наблюдений за реакцией протрансформированных растений на обработку гербицидом Basta™, ни при помощи ПЦР-анализа из-за образования значительного количества неспецифических продуктов реакции амплификации, что может быть связано с наличием в геноме ячменя последовательностей ДНК, гомологичных к последовательностям применяемых праймеров.

Таким-образом, мы не можем достоверно утверждать о присутствии гена bar в геноме полученных нами растений, хотя все они прошли отбор на среде с достаточно высокой концентрацией селективного агента (5 мг/л фосфинотрицина). Однако рядом исследователей отмечено большое количество эскейпов, характерное для данного типа селекции.

Потомство от шести ПЦР-положительных по гену gfp первичных трансформантов также оказалось чувствительным к Basta™. Помимо этого, ПЦР-анализ ДНК, выделенной из листового материала, показал отсутствие в их геноме каких-либо гетерологичных вставок.

Анализ полученных нами экспериментальных данных и литературных источников позволяет сделать вывод о том, что ячмень является одним из самых сложных объектов среди злаковых культур для генно-инженерных исследований. Система действительно стабильной трансформации данной культуры была разработана, главным образом, для таких модельных сортов, как Golden Promise, Igri и Hymalaya. Лишь в последние годы стали появляться сообщения о вовлечении в процесс трансформации коммерческих сортов ячменя. Однако до сих пор не удалось разработать для них высокотехнологичного протокола для эффективной трансформации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сидоров, Евгений Александрович, Москва

1. Горшкова В.А., Рымаръ В.Т. «Яровой ячмень» // Каменная степь. 1984. С. 301-310.

2. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта // М. «Колос». 1979. С. 220302.

3. Козырева О.Г. Дунаева С.Е. Генетика и регенерация в культуре in vitro злаков //Генетика. № 10. С. 1432-1440.

4. Посыпанов Г.С., Долгодворов В.Е., Коренев Г.В. и др. Растениеводство //М. «Колос». 1997. С. 151-153, 163-167.

5. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика // Минск. «Вышэйша школа». 1973. С. 80-107, 187-269.

6. Селъдимирова OA., Катасонова A.A. Цито-гистологический статус незрелого зародыша яровой мягкой пшеницы в фазе развития, оптимальной для формирования морфогенного каллуса in vitro // Цитология. 2006. Т. 48. №9. С. 797.

7. Филиппов М.В., Мирошниченко Д.Н., Берниковская Д.И., Долгов C.B. Подбор оптимальных параметров баллистической трансформации генома мягкой пшеницы // Сельскохозяйственная биология. 2006. Т.1. С. 67-73.

8. Филиппов М.В., Мирошниченко Д.Н., Славоохотова A.A., Дотов C.B. Разработка системы трансформации и получение форм пшеницы (Triticum aestivum L.), устойчивых к гербициду // Достижения науки и техники АПК. 2004. Т.1. С. 10-12.

9. Шаяхметов И.Ф. Роль генотипа и состава среды в формировании морфогенного каллуса пшеницы // Вестник Башкирского университета. 2001. №2. С. 178-180.

10. Шевелуха B.C., Е.А. Калашникова Е.А., Дегтярев С.В. и др. Сельскохозяйственная биотехнология // 1998. М., Высшая школа. С. 154-212.

11. Ahlandsberg S., Sathish P., Sun С. et al. Green fluorescent protein as a reporter system in the transformation of barley cultivar // Physiologia Plantarum. 1999. V. 107. P. 194-200.

12. Altpeter F, Baisakh N. Beachy R. et al. Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities // Molecular Breeding. 2005. V. 15. P. 305-327.

13. Altpeter F., Vasil V., Srivastava V. et al. Accelerated production of transgenic wheat {Triticum aeslivum L.) plants // Plant Cell Reports. 1996. V. 16. P. 12-17.

14. Altpeter F., Xu J., Ahmed S. Generation of large numbers of independently transformed fertile perennial ryegrass (Lolium perenne L.) plants of forage-and turf-type cultivars // Molecular Breeding. 2000. V. 6. P. 519-528.

15. Baeksted Holme /., Brinch-Pedersen H., Lange M. et al. Transfonnation of different barley (Hordeum vulgare L.) cultivars by Agrobacterium lumefaciens infection of in vitro cultured ovules // Plant Cell Reports. 2008. V. 27. P. 18331840.

16. Baruah-Wolff J., Harwood W.A., Lonsdale D.A. et al Luciferase as a reporter gene for transformation studies in rice (Oryza sativa L.) // Plant Cell Reports. 1999. V. 18. P. 715-720.

17. Bellucci M., De Marchis K, Manmicci R. et al. Jellyfish green fluorescent protein as a useful, reporter for transient expression and stable transformation in Medicago sativa L. // Plant Cell Reports. 2003. V. 22. P. 328-337.

18. Bregitzer P. Plant regeneration and callus type in barley: effect of genotype and culture medium// Crop Science. 1992. V. 32. P. 1108-1112.

19. Bregitzer P., Campbell R.D., Wu Y. Plant regeneration from barley callus: effects of 2,4-dichlorphenoxyacetic acid and phenylacetic acid // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1995. V. 43. P. 229-235.

20. Bregitzer P., Dahleen L.S., Campbell R.D. Enhancement of plant regeneration from embryogenic callus of commercial barley cultivars // Plant Cell Reports. 1998. V. 17. P. 941-945.

21. Bregitzer P., Lemaux P.G., YuX-H. Transposons and meristematic cultures: Tools to improve transgene stability, agronomic performance, and consumer acceptance // In: Proceedings of National Fusarium Head Blight Forum. Bloomington, MN. 2003. P. 5.

22. Brettschneider R., Becker D., Lorz H. Efficient transformation of scutellar tissue of immature maize embryos // Theoretical and Applied Genetics. 1997. V. 94. P. 737-748.

23. Cabanas M.J., Vázquez D., Modolell J. Dual interference of hygromycin B with ribosomal translocation and with aminoacyl-tRNA recognition // European Journal of Biochemistry. 1978. V. 87. P. 21-27.

24. Callis J, FrommM., Walbot V. Introns increase gene expression in cultured maize cells // Genes & Development. 1987. V. 1. P. 1183-1200.

25. Castillo A.M., Egana B., Sanz J.M. Somatic embryogenesis and plant regeneration from barley cultivars grown in Spain // Plant Cell Reports. 1998. V. 17. P. 902-906.

26. Caswel K.L., Leung N.L., Chibbar R.N. An efficient method for in vitro regeneration from immature inflorescence explants of Canadian wheat cultivars 11 Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2000. V. 60. P. 69-73.

27. Chan M.T., Lee T.M., Chang H.H. Transformation of indica rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens II Plant Cell Physiology. 1992. V. 33. P. 577-583.

28. Chang Y., von Zitzewitz J., Hayes P.M. et al. High frequency plant regeneration from immature embryos of an elite barley cultivar (Hordeum vulgare L. cv. Morex) // Plant Cell Reports. 2003. V. 21. P. 733-738.

29. Chawla H.S. Introduction to Plant Biotechnology // Science Publishers. 2002. P. 363-364.

30. Chen L., Marmey P., Taylor N.J. Expression and inheritance of multiple transgenes in rice plants // Nature Biotechnology. 1998. V. 16. P. 10601064.

31. Cheng M., Fry J.E., Pang S. et al. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens // Plant Physiology. 1997. V. 115. P. 971980.

32. Cheng T.Y., Smith H.H. Organogenesis from callus culture of Hordeum vulgare L. // Planta. 1975. V. 123. P. 307-310.

33. Chia T.-F., Chan Y.-S., Chua N.-H. The firefly luciferase gene as a noninvasive reporter for Dendrobium transformation // Plant Journal. 1994. V. 6. P. 441-446.

34. Cho M.-J., Choi H. W., Buchanan B.B. et al. Inheritance of tissue-specific expression of barley hordein promoter-uidA fusions in transgenic barlety plants // Theoretical and Applied Genetics. 1999. V. 98. P. 1253-1262.

35. Cho M.-J., Ha C.D., Lemaux P.G. Production of transgenic tall fescue and red fescue plants by particle bombardment of mature seed-derived highly regenerative tissues // Plant Cell Reports. 2000. V. 19. P. 1084-1089.

36. Christensen, A.H., Quail, P.H. Sequence analysis and transcriptional regulation by heat shock of polyubiquitin transcripts from maize // Plant Molecular Biology. 1989. V. 12. P. 619 632.

37. Christensen A.H., Quail P.H. Ubiquitin promoter-based vectors for highlevel expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants // Transgenic Research. 1996. V. 5. P. 213-218.

38. Christou P., McCabe D.E., Swain W.F. Stable transformation of soybean callus by DNA coated particles // Plant Physiology. 1988. V. 87. P. 671-674.

39. Conger B. V., Hanning G.E., Gray D.J. Direct embryogenesis from mesophyll cells of orchardgrass // Science. 1983. V. 221. P. 850-851.

40. CornejoM.J., Luth D., Blankenship K.M. et al. Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic rice // Plant Molecular Biology. 1993. V. 23. P. 567581.

41. Crossway A., Oakes J. V., Irvine J.M. et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts // Molecular and General Genetics. 1985. V. 202. P. 179-85.

42. Dahleen L.S. Improved plant regeneration from barley cultures callus by increased copper levels // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1995. V. 43. P. 267-269.

43. Dahleen L.S. Donor-Plant environment effects on regeneration from barley embryo-derived callus I I Crop Science. 1999. V. 39. P. 682-685.

44. Dahleen L.S., Bregitzer P. An improved media system for regeneration rates barley immature embryo-derived callus cultures of commercial cultivars // Crop Science. 2002. V. 42. P. 934-938.

45. Dahleen L.S., Manoharan M. Transformation of barley with two antifungal genes // In: Proceedings of National Fusarium Head Blight Forum. Bloomington, MN. 2003. P. 12.

46. Dahleen L.S., Okubara P.A., Blechl A.E. Transgenic Approaches to Combat Fusarium Head Blight in Wheat and Barley // Crop Science. 2001. V. 41. P. 628-637.

47. Dale P.J., Deambrogio E. A comparison of callus induction and plant regeneration from different explants of Hordeum vulgare II Z. pflanzenphysiol. 1979. V. 94. P. 65-77.

48. Davis S.J., Viestra RD. Soluble, highly fluorescent protein (GFP) for use in higher plants I I Plant Molecular Biology. 1998. V. 36. P. 521-528.

49. De Block M, Debrower D., Moens T. The development of a nuclear male sterility system in wheat. Expression of the bamase gene under the control of tapetum specific promoters // Theoretical and Applied Genetics. 1997. V. 95. P. 125-131.

50. De Greve H., Leemans J., Hernalsteens J.P. et al. Regeneration of normal and fertile plants that express octopine synthase, from tobacco crown galls after deletion of tumour-controlling functions // Nature. 1982. V. 300. P. 752-755.

51. Elliott A. R., Campbell J. A., Brettell R. I. S. et al. Agrobacterium-mediated transformation of sugarcane using GFP as a screenable marker // Australian Journal of Plant Physiology. 1998. V. 25. P. 739-743.

52. Elliot A.R, Campbell J.A., Dugdale B. et al. Green fluorescent protein facilitates rapid in vivo detection of genetically transformed plant cells // Plant Cell Reports. 1999. V. 18. P. 707-714.

53. Fernandez S., Michaux-Ferriere N., Coumans M. The embryogenic response of immature embryo culture of durum wheat (Triticum durum Desf.):histology and improvement by AgN03 // Plant Growth Regulation. 1999. V. 28. P. 147-155.

54. Filippov M., Miroshnichenko D., Vernikovskaya D., Dolgov S. The effect of auxins, time exposure to auxin and genotypes on somatic embryogenesis from mature embryos of wheat // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2006. V. 84. P. 192-201.

55. Finer J.J., Vain P., Jones M.W. Development of particle inflow gun for DNA delivery to plant cells // Plant Cell Reports. 1992. V. 11. P. 323-328.

56. Fromm M.E., Taylor L.P., Walbot V. Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation // Nature. 1986. V. 319. P. 791-793.

57. Funatsuki H., Kuroda M, Lazzeri P.A. Fertile transgenic barley generated by direct DNA transfer to protoplasts // Theoretical and Applied Genetics. 1995. V. 91. P. 707-712.

58. Ghorbel R, Juarez J., Navarro L. et al. Green fluorescent protein as a screenable marker to increase the efficiency of generating transgenic woody fruit plants // Theoretical and Applied Genetics. 1999. V. 99. P. 350-358.

59. Gonzalez A., Jiménez A., Vázquez D. et al. Studies on the mode of action of hygromycin B, an inhibitor of translocation in eukaryotes // Biochem. Biophys. Acta. 1978. V. 521. P. 459-469.

60. Gordon-Kamm W.J., Spencer T.M., Mangana M.L. et al. Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants // The Plant Cell. 1990. V.2. P. 603-618.

61. Hagio T., Hirabayashi T., Machii H. et al. Production of fertile transgenic barley (Hordeum vulgare L.) plants using the hygromycin-resistance marker // Plant Cell Reports. 1995. V. 14. P. 329-334.

62. Halfhill M.D:, Richards H.A., Mabon SA. et al. Expression of GFP and Bt transgenes in Brassica napus and hybridization and introgression with Brassica rapa II Theoretical and Applied Genetics. 2001. V. 103. P. 659667.

63. Hanzel J, Miller J., Brinkmann M. et al. Genotype and media effects on callus formation and regeneration in barley // Crop Science. 1985. V. 25. P. 27-31.

64. Harper B.K., Mabon S.A., Leffel S.M. et al. Green fluorescent protein as a marker for expression of a second gene in transgenic plants JI Nature Biotechnology. 1999. V. 17. P. 1125-1129.

65. Harwood W.A., Ross S.M., Cilento P. et al. The effect of DNA/gold particle preparation technique, and particle bombardment device, on the transformation of barley {Hordeum vulgare L.) // Euphytica. 2000. V. 111. P. 67-76.

66. Harwood W.A, Ross S.M., Bulley S.M. et al. Use of the firefly luciferase gene in a barley (Hordeum vulgare L.) transformation system // Plant Cell Reports. 2002. V. 21. P. 320-326.

67. Haseloff J., Amos B. GFP in plants I I Trends Genetics. 1995. № 11. P. 328329.

68. Hellens R., Mullineaux P., Klee H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors // Trends in plant science. 2000. V. 5. P. 446-451.

69. Horvath H., Huang J., Wong O. et al. The production of recombinant proteins in transgenic barley grains // PNAS. 2000. V. 97. P. 1914-1919.

70. Hu W., Cheng C.-L. Expression of Aequorea green fluorescent protein in plant cells // FEBS Letters. 1995. V. 369. P. 331-334.

71. Hu T., Metz S., Chay C. et al. Agrobacterium-mediated large-scale transformation of wheat (Triticum aestivum L.) using glyphosate selection // Plant Cell Reports. 2003. V. 21. P. 1010-1019.

72. Hudson L.C., Chamberlain D., Stewart-Jr. C.N. GFP-tagged pollen to monitor pollen flow of transgenic plants // Molecular Ecology Notes: 2001. V. l.P. 321-324.

73. Hunold R., Bronner R., Hahne G. Early events in microprojectiles bombardment: cell viability and particle location // Plant Journal. 1994. V. 5. P. 593-604.

74. Ishida Y., Saito H., Ohta S. et al. High efficiency transformation, of maize (Zca mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens II Nature Biotechnology. 1996. V. 14. P. 745-750.

75. Jacobsen J., Matthews P., Abbott D. et al. Barley transformation breeding: further progress and remaining problems // Proc. 9th Austral. Barley Techn. Symp. 1999. P. 18-19.

76. Jahne A., Becker D., Brettschneider R. et al. Regeneration of transgenic, microspore-derived fertile barley // Theoretical and Applied Genetics. 1994. V. 89. P. 525-533.

77. Jang I.-C., Nahm B.H., Kim J.-K. Subcellular targeting of green fluorescent protein to plastids in transgenic rice plants provides a high-level expression system // Molecular Breeding. 1999. V. 5. P. 453-461.

78. Jarl C.I. Plant regeneration and transient expression after particle bombardment of different barley {Hordeum vulgare L.) genotypes // Hereditas. 1999. V. 130. P. 83-87.

79. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. GUS fusions: P-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants // EMBO Journal. 1987. V. 6. P. 3901-3907.

80. Jentsch S. The ubiquitin-conjugation system // Annual Review of Genetics. 1992. V. 26. P. 179-207.

81. Jiang W., Cho M.J., Lemaux P.G. Improved callus quality and prolonged regenerability in model and recalcitrant barley {Hordeum vulgare L.) cultivars // Plant Biotechnology. 1998. V. 15. P. 323-346.

82. Jordan M.C. Green fluorescent protein as visual marker for wheat transformation//Plant Cell Reports. 2000. V. 19. P. 1069-1075.

83. Kaeppler H.F., Menon G.K., Skadsen R.W. et al. Transgenic oat plants via visual selection of cells expressing green fluorescent protein I I Plant Cell Reports. 2000. V. 19. P. 661-666.

84. Karp A. Origins, causes and uses of variation in plant tissue cultures I I In Vasil I.K., Thorpe T.A. (eds.) Plant cell and tissue culture. Kluwer, Dordrecht. 1994: P. 139-151.

85. Ke X.-Y., McCormac A.C., Harvey A. et al. Manipulation of discriminatory T-DNA delivery by Agrobacterium into cells of immature embryos of barley and wheat I I Euphytica. 2002. V. 126. P. 333-343.

86. Khanna H.K., Raina S.K. Elite indica transgenic rice plants expressing modified CrylAc endotoxin of Bacillus thuringiensis show enhanced resistance to yellow stem borer {Scirpophaga incertulas) II Transgenic Research. 2002. V. 11. P. 411-423.

87. Kikkert J.R. The Biolistic® PDS-1000/He device. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 1993. V. 33. P. 221-226.

88. King S.P., Kasha K.J. Optimising somatic embryogenesis and particle bombardment of barley {Hordeum vulgare L.) immature embryos. In vitro Cell Development and Biology of Plant. 1994. V. 30. P. 117-123.

89. Klein T.M., Wolf E.D., Wu R. et al. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature. 1987. V. 327. P. 70-73.

90. Klein T.M., Jones T.J. Methods of genetic transformation: the gene gun. In: Vasil IK (ed) Molecular Improvement of Cereal Crop. Kluwer Academic. London. 1999. P. 21-42.

91. Klcova L., Havrlentova M, Farago J. Cultivar and environmental conditions affect the morphogenic ability of barley {Hordeum vulgare L.) scutellum derived calli // Biologia. Bratislava. 2004. № 59/4. P. 501-504.

92. Kohli A., Gahakwa D., Vain P. et al. Transgene expression in rice engineered through particle bombardment: molecular factors controlling stable expression and transgene silencing // Planta. 1999. V. 208. P. 88-97.

93. Koprek T., Haensch R., Nerlich A. et al. Fertile transgenic barley of different cultivars obtained by adjustment of bombardment conditions to tissue response // Plant Sciences. 1996. V. 119. P. 79-91.

94. Koziel M.G., Carozzi N.B., Desai N. Optimizing expression of transgenes with an emphasis on post-transcriptional events // Plant Molecular Biology. 1996. V. 32. P. 393-405.

95. Krens F.A., Molendijk L., Wullems G.J. In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature. 1982. V. 296. P. 72-74.

96. Krysiak C., Mazu's B., Buchowicz J. Generation of DNA double-strand breaks and inhibition of somatic embryogenesis by tungsten microparticles in wheat// Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1999. V. 58. P. 163-170.

97. Kumpatla S.P., Hall T.C. Recurrent onset of epigenetic silencing in rice harboring multi-copy transgene//Plant Journal. 1998. V. 14. P. 129-135.

98. Leckband G., Lorz H. Transformation and expression of a stilbene synthase gene of Vitis vinifera L. in barley and wheat for increased fungal resistance // Theoretical and Applied Genetics. 1998. V. 96. P. 1004-1012.

99. Leffel S.M., Mabon S.A., Stewart C.N.-Jr. Applications of green fluorescent protein in plants // Biotechniques. 1997. V. 23. P. 912-918.

100. Lemaux P.G., Cho M.J. Compositions and methods for plant transformation and regeneration II U.S. Patent. 2001. № 6.235.529.

101. Lemaux P.G., Cho M.-J., Zhang S. et al. Transgenic cereals: Hordeum vulgare L. (barley) // In: Molecular Improvement of Cereal Crops. Ed. I.K.Vasil. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, Netherlands. 1998. P. 255-316.

102. Lemaux P., Cho M.J., Zhang S. et al. Transgenic cereals: Hordeum vulgare (barley) // In: Vasil I.K. (ed). Molecular improvement of cereal crop. Kluwer Academic. London. 1999. P. 255-316.

103. Lidon F.Cm., Da Graca Barreiro M., Santos Enriques F. Interactions between biomass production and ethylene biosynthesis in copper treated rice // Journal of Plant Nutrition. 1995. V. 18. P. 1301-1314.

104. Lonsdale D.M., Lindup S., Moisan L.J. et ah Using firefly luciferase to identify the transition from transient to stable expression in bombarded wheat scutellar tissue // Physiologia Plantarum. 1998. V. 102. P: 447-453.

105. Luehrsen K.R.; Walbot V. Intron enhancement of gene expression and the splicing efficiency of introns in maize cells // Molecular and General Genetics. 1991. V. 225. P. 81-93.

106. Luhrs R., Lorz H. Plant regeneration in vitrofrom embryogenic cultures of spring- and winter-type barley, Hordeum vulgare L. // Theoretical and Applied Genetics. 1987. V. 75. P. 16-25.

107. Magnusson I., Bornmann C.H. Anatomical observation on somatic embryogenesis from scutellar tissues of immature zygotic embryos of Triticum aestivum II Physiologia Plantarum. 1985. V. 63. P. 137-145.

108. Matthews P.R., Wang M.-B., Waterhouse P.M. et al. Marker gene elimination from transgenic barley, using co-transformation with adjacent 'twin T-DNAs' on a standard Agrobacterium transformation vector // Molecular Breding. 2001. V. 7. P. 195-202.

109. McCormac A.C., Wu H., Bao M. et al. The use of visual marker genes as cell-specific reporters ofAgrobacterium-mediated T-DNA delivery to wheat (Triticum aestivum L.) and barley (Hordeum vulgare L.) // Euphytica. 1998. V. 99. P. 17-25.

110. McElroy D., Zhang W., Cao J. et al. Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation // Plant Cell. 1990. V. 2. P. 163-171.

111. McElroy D., Blowers A.D., Jenes B. et al. Construction of expression vectors based on the rice actin 1 (ActJ) 5' region for use in monocot transformation //Molecular and General Genetics. 1991. V. 231. P. 150-160.

112. McGrath P.F., Vincent J.R., Lei C.-H. et al. Coat protein-mediated resistance to isolates of barley yellow dwarf in oats and barley // European Journal of Plant Pathology. 1997. V. 103. P. 695-710.

113. Miflin B.J. Crop biotechnology: Where is now? // Plant Physiology. 2000. V.j123. P. 17.

114. Molinier J., Himber C., Hahne G. Use of green fluorescent protein for detection of transformed shoots and homozygous offspring // Plant Cell Reports. 2000. V. 19. P. 219-223.

115. Moore P.J., Moore A.J., Collins G.B. Genotypic and developmental regulation of transient expression of a reporter gene in soybean zygotic cotyledons//Plant Cell Reports. 1994. V. 13. P. 556-560.

116. Mordhorst A.P., Lorz H. Embryogenesis and development of isolated barley {Hordeum vulgare L.) microspores are influenced by the amount and composition of nitrogen sources in cultyre media // Journal of Plant Physiology. 1993. V. 142. P. 485-492.

117. Morris P.C., Bryce J.H. Cereal Biotechnology // CRC Press. 2000. P. 278-307.

118. Mudge S.R., Lewis-Henderson W.R., Birch R.G. Comparison of Vibrio and firefly luciferases as reporter gene systems for use in bacteria and plants. Australian Journal of Plant Physiology. 1996. V. 23. P. 75-83.

119. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum. V. 15. P. 473-497.

120. Murray F., Brettell R, Matthews P. et al. Comparison of Agrobacterium-mediated transformation of four barley cultivars using the gfp and gus reporter genes // Plant Cell Reports. 2003. V. 22. P. 397-402.

121. Nehra N.S., Chibbar R.N., Leung N. et al. Self-fertile transgenic wheat plants regenerated from isolated scutellar tissues from microprojectile bombardment with two distinct gene constructs // Plant Journal. 1994. V. 5. P. 285-297.

122. Nhut D.T., Le B.V., Van K.T.T. Somatic embiyogenesis and direct shoot regeneration of rice (Oryza sativa L.) using thin cell layer culture of apical meristematic tissue // Journal of plant physiology. 2000. V. 157. P. 559-565.

123. Niedz R.F., Sussman M.R, Satterlee J.S. Green fluorescent protein: an in vivo reporter of plant gene expression I I Plant Cell. Reports. 1995.V. 14. P. 403-406.

124. Norris S.R., Meyer S.E., Callis J. The intron of Arabidopsis thaliana polyubiquitin genes is conserved in location and is a quantitative determinant of chimeric gene expression // Plant Molecular Biology. 1993. V. 21. P. 895-906.

125. Nuutila A.M., Hamalainen J., Mannonen L. Optimization of media nitrogen and copper concentration for regeneration of green plants from polyembryogenic cultures of barley (Hordeum vulgare L.) // Plant Science. 2000. V. 151. P. 85-92.

126. Nuutila A.M., Ritala A., Skadsen RW. Expression of fungal thermotolerant endo-l,4-P-glucanase in transgenic barley seeds during germination // Plant Molecular Biology. 1999. V. 41. P. 777-783.

127. Oka S., Saito N., Kawaguchi H. Histological observations on initiation and morphogenesis in immature and mature embryo derived callus of barley (Hordeum vulgare L.) // Annals of Botany. 1995. V. 76. P. 487-492.

128. Oldach K.H., Morgenstern A., Roiher S. et al. Efficient in vitro plant regeneration from immature zygotic embryos of pearl millet Pennisetum glaucum (L.) R. Br. and Sorghum bicolor (L.) Moench. // Plant Cell Reports. 2001'. V. 20. P. 416-421.

129. Chv D. W., Wood K. V., De Luca M. et al. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants // Science. 1986. V. 234. P. 856-859.

130. Padgette S.R, Kolacz K.H., Delannay X. et al. Development, identification, and characterization of a glyphosphate-tolerant soybean line // Crop Science. 1995. V. 35. P. 1461-1467.

131. Parveez G.K.A., Chowdhur M.K.U., Saleh N.M. Biological parameters affecting transient gus gene expression in oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) embryogenic calli via microprojectile bombardment // Industrial Crops and Products. 1998. V. 8. P. 7-27.

132. Patel M, Johnson J.S., Brettell R.I.S. et al. Transgenic barley expressing a fungal xylanase gene in the endosperm of developing grains // Molecular Breeding. 2000. V. 6. P. 113-123.

133. Pawlowski W.P., Somers D.A. Transgenic DNA integrated into the oat genome is frequently interspersed by host DNA // Proceedings of National Academy of Sciences. 1998. V. 95. P. 12106-12110.

134. Paszkowski J.; Peterhans A.; Bilang R et al. Expression in transgenic tobacco of the bacterial neomycin phosphotransferase gene modified by intron insertions of various sizes // Plant Molecular Biology. 1992. V. 19. P. 825-836.

135. Pedrosa L.P., Vasill.K. Optimization of somatic embryogenesis and long-term regeneration in callus cultures of diploperennial Teosinte {Zea diploperennis litis, Doebley & Guzman) // Maydica. 1996. V. 41. P. 333-348.

136. Ponappa T., Brzozowski A.E., Finer J.J. Transient expression and stable transformation of soybean using jellyfish green fluorescent protein (GFP) // Plant Cell Reports. 2000. V. 19. P. 6-12.

137. Prasher D.C. Using GFP to see the light // Trends Genetics. 1995. V. 11. P. 320-323.

138. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W. et al. Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein // Gene. 1992. V. 111. P. 229233.

139. Purnhauser L., Gyulai G. Effect of copper on shoot and Root regeneration in wheat, triticale, rape and tobaco tissue cultures // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1993. V. 35. P. 131-139.

140. QuaedvliegN.E.M., Schlaman H.R.M., Admiraal P.C. et al. Fusions between green fluorescent protein and P-glucuronidase as sensitive and vital bifiinctional reporters in plants // Plant Molecular Biology. 1998. V. 38. P. 861-873.

141. Rasco-Gaunt S., Riley A., Barcelo P. et al. Analysis of particle bombardment parameters to optimise DNA delivery into wheat tissues // Plant Cell Reports. 1999. V. 19. P. 118-127.

142. Rechsteiner M. Natural substrates of the ubiquitin proteolytic pathway // Cell. 1991. V. 66. P. 615-618.

143. Register J.C., Peterson D.J., Bell P.J. et al. Structure and function of selectable and non-selectable transgenes in maize after introduction by particle bombardment // Plant Molecular Biology. 1994. V. 25. P. 951-961.

144. RepellinA., BagaM., Jauhar P.P. Genetic enrichment of cereal crops via alien gene transfer: New challenges // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2001. V. 64. P. 159-183.

145. Rhodes C.A., Pierce D.A., Mettler I.J. et al. Genetically transformed maize plants from protoplasts // Science. 1988. V. 240. P. 204-207.

146. Richards H.A., Halftiill M.D., Millwood R.J. et al. Quantitative GFP fluorescence as an indicator of recombinant protein synthesis in transgenic plants // Plant Cell Reports. 2003. V. 22. P. 117-121.

147. Richards H.A., Ruda V.A., Sun H. et al. Construction of GFP-BAR plasmid and its use for switchgrass transformation // Plant Cell Reports. 2001. V. 20. P. 48-54.

148. Rogers S.O. Benedich A.J. Extraction of total cellular DNA from plants, algae and fungi // In: S.B. Gelvin, R.A. Schilperoort (eds.) Plan Molecular Biology Manual. Dordrecht. Kluwer Academic Press. 1994. P. D 1-8.

149. Rose A.B., Beliakoff J.A. Intron-mediated enhancement of gene expression independent of unique intron sequences and splicing // Plant Physiology. 2000. V. 122. P. 535-542.

150. Russell J.A., Roy M.K., Sanford J.C. Physical trauma and tungsten toxicity reduce the efficiency of biolistic transformation // Plant Physiology. 1992. V. 98. P. 1050-1056.

151. Ryan A.B., Castillo A.M., Valles M.P. et al. Dessicated double-haploid embryos obtained from microspore culture of barley cv. Igri // Plant Cell Reports. 1999. V. 18. P. 924-928.

152. Sanford J.C. The biolistic process // Trends Biotechnology. 1988. V. 6. P. 299-302.

153. Sanford J.C., Wolf E.D., Allen N.K. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor // US Patent #4945050. 1990.

154. Sanford J.C., Smith F.D., Russell J.A. Optimizing the biolistic process for different biological applications // Methods Enzymology. 1993. V. 217. P. 483-509.

155. Schmitt F., Oakeley E.J., Jost J.P. Antibiotics induce genome-wide hypermethylation in cultured Nicotiana tabacum plants // Journal of Biological Chemistry. 1997. V. 272: 1534-1540.

156. Schrott M. Selectable marker and reporte genes // In: Potrykus T., Spangenbert Ed. Gene Transfer to Plants. Springer Verlag. Berlin. 1995. P. 325-336.

157. Scult C.P., Zubko E., Meyer P. Techniques for the removal of marker genes from transgenic plants // Biochemistry. 2002. № 84. P. 1119-1126.

158. Shan X., Li D., Ou R Thidiazuron promotes in vitro regeneration of wheat and barley // In vitro Cellular and Developmental Biology. 2000. V. 36. P. 207210.

159. Sharma V.K., Hansch R, Mendel R.R et al. Mature embryo axis-based high frequency somatic embryogenesis and plant regeneration from multirle cultivars of barley (Hordeum vulgare L.) // Journal of Experimental Botany. 2005b. V. 56. P. 1913-1922.

160. Sheen J., Hwang S.B., Niwa Y. et al. Green fluorescent protein as a new vital marker for in plant cells // Plant Journal. 1995. V. 8. P. 777-784.

161. Shimamoto K.} Terada R, Izawa T., Fujimoto H., Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts // Nature. 1989. V. 338. P. 274-276.

162. Shillito R. Methods of genetic transformation: electroporation and polyethilene treatment // In: Vasil I.K. (ed.) Molecular improvement of cereal crop. Kluwer Academic. London. 1999. P. 9-20.

163. Siderov V.A., Kasten D., Pang S.-Z. et al. Stable chloroplast transformation in potato: use of green fluorescent protein as a plastid marker // Plant Journal. 1999. V. 19. P. 209-216.

164. Stewart C.N.-Jr. The utility of green fluorescent protein in transgenic plants // Plant Cell Reports. 2001. V. 20. P. 376-382.

165. Stiff C.M., Kilian A, Zhou H. et al Stable transformation of barley callus using biolistic particle bombardment and the phosphinotricin acetyltransferase (bar) gene // Plant, Cell, Tissue and Organ Culture. 1995. V. 40. P. 243-248.

166. Stoger E., Williams S., Keen D. et al. Molecular characteristics of transgenic wheat and the effect on transgene expression // Transgenic Research. 1998 V. 7. P. 463-471.

167. Svitashev S., Ananiev E., Pawlowski W.P. et al. Association of transgene integration sites with chromosome rearrangements in hexaploid oat // Theoretical and Applied Genetics. 2000. V. 100. P. 872-880.

168. Tadesse Y., Sagi L., Swennen R et al. Optimisation of transformation conditions and production of transgenic sorghum {Sorghum bicolor) via microparticle bombardment // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2003. V. 75. P; 1-18.

169. Terada R, Shimamoto K Expression of CaMV35S-GUS gene in transgenic rice plants // Molecular and General Genetics. 1990. V. 220. P. 389-392.

170. Tian L., Levee V., Mentag R et al. Green fluorescent protein as a tool for monitoring transgene expression in forest tree species // Tree Physiology. 1999. № 19. P. 541-546.

171. Tingay S., McElroy D., Kalla R. et al. Agrobacterium (umefaciens-mediated barley transformation // Plant Journal. 1997.'V. 11. P. 1369-1376.

172. Travella S., Ross S.M., Harden J. el al A comparison of transgenic barley lines produced by particle bombardment and Agrobacterium-mediated techniques // Plant Cell Reports. 2005. V. 23. P. 780-789.

173. Trifonova A., Madsen S., Olesen A. Agrobacterium-mediated transgene delivery and integration into barley under a range of in vitro culture conditions// Plant Science. 2001. V. 161. P. 871-880.

174. Tzfira T., Citovsky V. The Agrobacterium-Plant Cell interaction. Taking biology lessons from a bag II Plant Physiology. 2003. V. 133. P. 943-947.

175. Vain P., Finer K.R, Engler D.E. et al. Intron-mediated enhancement of gene expression in maize (Zea mays L.) and bluegrass (Poa pratensis L.) // Plant Cell Reports. 1996. V. 15. P. 489-494.

176. Vain P., Worland B., Kohli A. The green fluorescent protein (GFP) as a vital screenable marker in rice transformation // Theoretical and Applied Genetics. 2000. V. 96. P. 164-169.

177. Valentine L. Agrobacterium tumefaciens and the plant: The David and Goliaf of Modern Genetics // Plant Physiology. 2003. V. 133. P. 948-955.

178. Van der Geest A. H. M, Petolino J. F. Expression of a modified green fluorescent protein gene in transgenic maize plants and progeny // Plant Cell Reports. 1998. V. 17. P. 760-764.

179. Vasil V, Castillo A.M., Fromm M.E. et al. Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogneic callus // Biotechnology. 1992. V. 10. P. 667-674.

180. Wan Y., Lemaux P.G. Generation of large numbers of independently transformed fertile barley plants // Plant Physiology. 1994. V. 104. P. 37-48.

181. Weigel R.C.J., Hughes K.W. Long-term regeneration by, somatic embryogenesis in barley (Hordeum vulgare L.) tissue cultures derived from apical meristem explants // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1985. V. 5. P. 151-162.

182. Weir B., Gu X., Wang M. et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of wheat using suspension cells as model system and green fluorescent protein as a visual marker // Australian Journal of Plant Physiology. 2001. V. 28. P. 807-818.

183. Welsh S., Kay S.A. Reporter gene expression for monitoring gene transfer // Current Opinion on Biotechnology. 1997. V. 8. P. 617-622.

184. Wilmhelson A., P.T. Kallio, K.-M. Oksman-Caldentey et al. Heterologous expression of Vitreoscilla haemoglobinin barley {Hordeum vulgare) II Plant Cell Reports. 2007. V. 26. P: 1773-1783.

185. Yao Q.A., Kasha K.J. Potential of biolistic transformation of barley microspores based on viability and transient p-glucoronidase activity // Genome. 1997. V. 40. P. 639-643.

186. Yu H., Kumar P. P. Post-transcriptional gene silencing in plants by RNA // Plant Cell Reports. 2003. V. 22. P. 167-174.

187. Zhang W., Wu R. Efficient regeneration of transgenic plants from rice protoplasts and correctly regulated expression of the foreign genes in plants // Theoretical and Applied Genetics. 1988. V. 76. P. 835-840.

188. ZiauddinA., Kasha KJ. Long-term callus cultures of diploid barley {Hordeum vulgare L.) I. Auxin effects on culture initiation and maintenance // Euphytica. 1990a. V. 48. P. 171-176.

189. Ziauddin A., Kasha K.J. Long-term callus cultures of diploid barley {Hordeum vulgare L.) II. Effect of auxins on chromosomal status of cultures and regeneration of plants // Euphytica. 1990b. V. 48. P. 279-286.

190. Zupan J., Mulh T.R., Draper O. et al. The transfer of DNA from Agrobacterium tumrfaciens into plants: a feast of fundamental insights // Plant Journal. 2000. V. 23. P. 11-28.

Информация о работе

Сидоров, Евгений Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Индуцированный морфогенез и биологическая трансформация ячменя (Hordeum vulgare L.) отечественных сортов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы