Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация митохондрального генома сахарной свеклы и ее особенности у растений с разными типами цитоплазмы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация митохондрального генома сахарной свеклы и ее особенности у растений с разными типами цитоплазмы"

РОССИЙСКАЯ АКАДааШ НАУК ОРДЕНА ЛЕНИНА СИбИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

л

На правах рукописи УДК 576.316;577.113.4

ДИКАЛОВА Анна Эдуардовна

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГОША САХАРНОЙ СВЕКЛЫ И ЕЕ ОСОБЕННОСТИ У РАСТЕНИЙ С РАЗНЫМИ ТИПАМИ ЦИТОПЛАЗМ

Генетика - 03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск, 1992

*

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН

г.Новосибирск

Научный руководитель- доктор биологических наук, академик РАН

Р.И.Салганик, Институт цитологии и генетики СО РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Регинальд Александрович Цильке, Аграрный университет, г.Новосибирск

кандидат биологических наук, Ривкин Марк Иосифович, Институт цитологии и генетики СО РАН

Ведущая организация: Институт биоорганической химии СО РАН,

г.Новосибирск

Защита диссертации состоится ■¿у-, о г 1993г. на уГр&НШН заседании специализированного совета по защите диссертации на соискание ученой .степени доктора наук (Д-002.П.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференцзале Института по адресу: 630090 г.Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук . А.Д.Груздев

;.'. л г*, я...

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблею*. Структурная организация ядерного гоео--------------

ка растений, кек и шотшк исследована достаточно но.и, п роль нуклеосомной, нуклеомэрной и хромофорной укладок в кси-пактизацви ядерной ДНК хорошо известна. Однако организгцгя полиплоидного генома митохондрий, достигающего у растений до-вольйо больших размеров» относительно гзшзга »ягтохоидртй га-вотнкх, Села до последнего врэкохп изучена весьма слабо. Этэз обстоятельством определяется актуальность предпринятой работа з часта ез, nocBfficensott исследсгзгпгэ организация и упяковет иктохондри&шюго гзкома рзстанй на щлсюрэ сахвряой свекла.

Интерес к изучению митохондриальной ДНК(мтДНК) растений особенно возрос в последние годы, когда выяснилось, что геном митохондрий определяет такой важный признак еысшлх растений, как цитоплазматическая мужская стерильность (ЩС). Этот признак, проявляющийся в стерильности пыльцы, стойко передается по материнской линии при скрещивании с генотипами, шлвщзка в гомозиготном состоянии рецессивные ядерные генн, ответственные за фертильность. ЩС широко используется б цЕокко-семэноводческой практике, поскольку она заачгочшгэ упрощает и удешэвляет получение продуктаявнх гябрэдоз. обоо-пвчпвая контролируемые опыления. У объекта данного исслодопз-ния, ценной технической культурн - сахарной сеэклы - известка только два типа цитоплазм: нормальная (И) и стерильная(S). Исследование структурных отличий мтДНК и распологенае в згЛ генов у растений с N и S типом цитоплазм открывает возмсл:-ность быстрой дискриминации растений с ЩС.'

В настоящее время уе конев 90Х гибридов, вкразтваеик з производстве, получены на основе S цитоплаз?лы из одного источника, обнаруженного впервые у сахарной свеклы Оуэном. Это положение создает опасность массовой гибели растений в рэ-зультате потери резистентности к определенным видам вредителей (как это было в случае кукурузы с Т-типом ЦР.5С) или резким изменениям температуры, влажности и других факторов. Зтем определяется актуальность той части настоящей работы, которая посвящена поискам отличий в структуре мтДНК у форм сахарной свеклы с S типом цитоплазм и индукции их при культивировании клеток растений In vitro и у регенерирующих растений.

Даль ■ задачи исследования. Цель работы состояла в изучении структурной организации митохондриального генома сахарной свеклы, его особенностей, связанных со стерильностью и фер-тильностью растений, а также влиянием на структуру мтДНК процессов выращивания растительных клеток In vitro и регенеации.

Решались следующие задачи:

1) исследование уровней структурной организации митохондриального генома, обеспечение его компактизации;

2) выявление зависимости между типом цитоплазмы (N- нормальной и S- стерильной) сахарной свеклы и особенностями структуры мтДНК;

3) изучение полиморфизма структуры мтДНК в пределах каждого типа цитоплазм: N и S;

4) исследование мутабильности митохондриального генома -структурных перестроек его при выращивании клеток сахарной свеклы 1л vitro в каллусной и суспензионной культурах и далее в процессе регенерации, а также при спонтанной конверсии N типа цитоплазмы в S тип.

Научная новизна. Впервые показано, что митохондриальный геном компактизован за счет образования комплексов ДИК с белками, формирующих структуры, подобные нуклеосомам, нуклеомерам и хроцомерам ядерных геномов эукариот.

Обнаружен полиморфизм по фрагментам рестрикции мтДНК у форм В.vulgaris в пределах каждого -N и S типов цитоплазм при наличии существенных различий между этими типами. Показано впервые, что отличия в структурах мтДНК сахарной свеклы с N и S типами цитоплазм затрагивают области митохондриальных г^нов atpA, СОВ, СОХИ и Ю)1, что позволяет четко дифференцировать фертильность или стерильность растений, а также выявлять полиморфизм среда форм сахарной свеклы с одним типом цитоплазмы, не проводя гибридологического анализа.

Установлено, что стерильные формы сахарной свеклы, используемые для производства гибридов в СНГ и странах Восточной Европы, как и стерильный формы из других регионов, характеризуются отсутствием миникольцевых мтДНК, имеющимся в нормальных цитоплазмах В.vulgaris.

Выявлены перестройки митохондриального генома в клетках каллусной и суспензионной культур стерильной сахарной свеклы

и при регенерации кз эмбриогеввого каллуса.

Обнаружено, что конверсии N цитоплазмы в S сопровождается перестройками митохондрнального генома, которые (независимо от структуры мтДНК исходных N цитоплазм) приводят к такой структуре мтДНК, которая характерна для всех ПМС форм. Практическая ценность. Практическая ценность работы состоит в том, что в ней предложены критерии и методы идентификации типов цитоплазм (N и S), а также выявления полиморфизма внутри кавдого из них, которые позволяют заменить дорогостоящий и длительный гибридологический анализ. Эти метода могут с успехом применяться при анализе семенного материала, при отборе родительских растений для производства гибридов с ценными хозяйственными признаками на селекционных станциях, и в научно-исследовательских лабораториях. Обнаружение перестроек мтДНК сахарной свеклы в процессе культивирования клеток и регенерации растений открывают перспективу получения новых типов митохондриальных геномов В.vulgaris в результате выращивания клеток In vitro.

Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на 5 сьезде ВОГиС им.Вавилова (Москва, 1987), на мэвдуна-родных симпозиумах ИСТА (Ленинград, 1987), "Структура митохондрнального генома высших растений" (Роскоф, Франция, 1988),"Биотехнология - 1990" (Олоноуц, ЧСФР, 1990), результаты докладывались на международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988), на II съезда Всесоюзного общества физиологов растений (Минск 1990). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Структура диссертации. Диссертация написана на iZI страницах машинописного текста, содержит ZC рисунков и 4 таблицы. Она состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов исследования н их обсуждения, списка цитируемой литературы.

Автор приносит искреннюю благодарность соавторам статей по теме диссертации: Дударовой H.A., Киселевой Е.В., Кубала-ковой М., Малецкому С.И., Христолюбовой Н.Б., Гилевой 'Л.П.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ В работе использовали: растения инбредных линий сахарной свеклы, полученные в лаборатории популяционной генетики ИЦиГ СО

РАН, семенной материал из коллекции этой лаборатории; суспензионные клеточные и каллусные культуры получены от' Кубалако-вой Ы.р Институт экспериментальной ботаники, Оломоуц, ЧСФР.

Выделение мтДНК из проростков сахарной свеклы вели по методике Si^nenkl et al. (1988), из корнеплодов - как описано Rogers and Bendich (1985) с некоторыми модификациями, из каллу сной и суспензионной культур по Dikalova et al. (1993). Клонирование, выделение плазмидной ДНК, введение метки в ДНК; электрофоретический анализ, рестрикцию, перенос фрагментов ДНК из агарозншс гелей, блот-гибридизацшо ДНК проводили как описано (Ыаниатис и др., 1984).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследование структуры ыитохоодрдального генома сахарной свекла с нормальной и стерильной цитоплазмами. Получение более детальной информации об организации и компактизации митохоядриального генома растений стало возможным благодаря комбинированному использованию биохимических методов и электронно-микроскопического анализа мтДНК.

Как показало исследование распластанных по методу Кляйн-Емидта препаратов,проведенное совместно с Е.В.Киселевой (лаборатория ультраструктур клетки ИЦиГ СО РАН) , мтДНК сахарной ■ свеклы, представляет собой полиплоидную популяции молекул, отличающихся по размерам и компактизации.

Основная высокомолекулярная ДНК представлена гигантскими кольцевыми молекулами с контурной длиной 130-160 мкм (403-49S тпн). Эти значения близки к оценкам ее размеров, полученным с помощью космидного картирования (Brears et al., 1988). Электронно-микроскопический анализ выявил в ней структуры подобные хромомэрам, характерным для ядерного хроматина гшвотных(Plnon et al. 1976) и растений (Горунг и др., 1986), а такие хромо-меро-подобным структурам прокариот (Olszewska Tait, 1980). Это связанные между собой и отдельно лежащие глобулы размером 150-220 нм. В результате декомпактизации они приобретают вид гигантских молекул, состоящих из связанных мевду собой розет-коподобшх структур. Эти структуры содержат петли ДНК (0,61,5 мкм), скрепленные в центре белковой глобулой диаметром 60 нм, прочно связанной с ДНК, удаляемой только дополнительной обработкой препаратов протеиназой К.

На препаратах мтДНК сахарной свеклы были выявлены фибриллы мтДНК, состоящие из регулярно расположённых глобул размером около 30 нм и фибриллы с глобулами в 12-14 км. Эти структуры гомологичны нуклеомерач и нуклвосомам ядерной хромосомной ДНК животных и растений (Kornberg, 1974) и нуклеокэ-роподобным глобулам ДНК прокариот (Griffith, 1976). Очевидно, что структуры митохондриального генома, обнаруженные наст у В.vulgaris, служат компактизации генома, хотя , вероятно, ещэ решают и иные задачи.

Помимо огоромннх кольцевых молекул з препаратах мтДНК сахарной свеклы содержатся большие субгеномные ДНК с контурной длиной 2-5 нм. Способы их компактизации, как показала наши исследования, сходны с теми, которые выявлялись при изучении основной высокомолекулярной мтДНК. Причиной образования таких субгеномных и возможно также плазмвдоподобных молекул, как считают (Lonsdale et al., 1988), являются внутри- и межмолекулярные рекомбинации по повторам в мтДНК.

Плазмидоподобные мтДНК обнаруживаются на препаратах в виде суперспирализованных кольцевых молекул размером 0,2-1,5 мкм, которые после обработки SI нуклеазой превращаются в рэ-лаксированные кольцевые молекулы, большая часть которых имеет контурную длину 1-10 мкм. Сходные субгеномные кольцевые молекулы обнаружены в составе митохондриальных геномов других высших растений. Имеется такие вторая подгруппа плазмидоподо-бных ДНК: эти молекулы выявляются в суперспирализованном состоянии в виде небольших компактных частиц. После обработки SI нуклеазой они приобретают вид линейных, кольцевых ДНК, среди которых подавляющее большинство имеет размер 0,4-0,5 шоз (1,3-1,55 тпн). Показано, что N и S цитоплазмы отличаются набором миникольцевых молекул. Нормальные цитоплазмы Beta vulgaris содержали два или три типа плазмидоподобных ДНК размером 0,5; 0,4 и 0,3 мкм, а стерильные только один тип мини-колец размером 0,5 мкм, что хорошо согласуется с ранее полученными нами данными электрофоретического анализа мтДНК (DucLareva et al., 1988,1989).

Таким образом, результаты настоящей работы свидетельствуют о нуклеосомном, нуклеомерном' и хромомерном уровнях компактизации мтДНК.. Фибриллы ДНК затем образуют петли, органи-

зованные в розетки с меньшими петлями. Считают, что подобный способ упаковки позволяет автономно реплицировать ДНК в петлях розеток, и, следовательно, автономно регулировать транскрипцию дискретных доменов ДНК в митохондриальном геноме (Salganlk et al., 1991). Полученные данные свидетельствуют о существовании общего, по-видимому, способа упаковки ДНК ядерных и митохондриальных геномов растений.

2. Сравнительный анализ набора плазиидоподобных молекул итДНК оахашой свеклы с разными типами цитоплазм. Наличие плазиидоподобных молекул мтДНК и специфичность их набора у В.vulgaris с разным типом цитоплазм были показаны также методом электро-форетического анализа мтДНК. В качестве образцов мтДНК N цитоплазм было взято 30 линий из коллекции лаборатории популя-ционной генетики растений ИЦиГ СО РАН. Как источники S цитоплазм взяты стерильные линии, полученные на разных селекционных станциях, происхождение которых указано в таблицах.

Результаты электрофоретического анализа мтДНК в 1,5% агарозном геле показали, что все исследованные мтДНК линий сахарной свеклы с N цитоплазмой содержали помимо высокомолекулярной ДНК две или три (в зависимости от линии) низкомолекулярные фракции в нижней части агарозного геля. По изменению электрофоретической подвижности этих фракций при обработке мтДНК в разных условиях SI нуклеазой, было показано, что они представлены суперспирализованными молекулами размером 1,6; 1,4 и 1,3 тпн. Полученные данные были подтверждены электронно-микроскопическим анализом элюированных из геля низкомолекулярных мтДНК. При электронно-микроскопическом анализе наганных препаратов мтДНК также были обнаружены эти молекулы.

Электрофоретичвский анализ тотальных препаратов мтДНК, разных стерильных линий сахарной свеклы показал, что в митохондриальном геноме всех исследованных стерильных форм имеется только один тип миникольцевых молекул - размером 1,6 тпн, а миникольца размером 1,3 и 1,4 тпн отсутствуют.

Данные о содержании миникольцевых молекул в мтДНК различных исследованных форм сахарной свеклы с N и S цитоплазмами приведены в таблицах ! и 2. Полученные результаты относительно состава плазмидоподобных мтДНК N и S цитоплазм согласуются с данными других исследователей (Powling, 1981; Hansen «с

- б -

ТАБЛИЦА I

--------------Исследованные стерильные форш сахарной свеклы,

их происхождение и состав плазындоподобных молекул

Линия Происхождение цитоплазмы типы миниколь-цевых мтДНК.тпн

1.6 м 1,3

Ю357 Селекция Всероссийского НИИ сахарной свеклы +

(мсСОАН-31 Стерильная форма на основе цитоплазмы селекции НИИ свекловодства, Клей Ванцлебен + - —

33138 Селекция Уладовской опытной селекционной станции + - -

3576 Селекция Всероссийского НИИ сахарной свеклы + - -

35169 Селекция Всесоюзного НИИ сахарной свеклы + - -

30357 Селекция Всероссийского НИИ сахарной свеклы + - -

22003 Селекция Чешской селекционной станции Кралице на Гане + - -

Зонохилл Стерильная форма из сорта Монохилл + - -

{мс8ЬС-91 Стерильная форма на основе цитоплазмы селекции НИИ свекловодства, Клей Ванцлебен +

1Мс-Янаш-1а Стерильная форма I из сорта Янаш I + - -

дас-Янаш-1б Стерильная форма 2 из сорта Янаш I + - -

{Мс-Янат-3 Стерильная форма из сорта Янаш 3 • + - -

<скС0АН-104-1 Стерильная форма, выделенная из линии С0АН-104 с N цитоплазмой, подлинна I + - -

(скС0АН-104-2 Стерильная форма, выделенная из линии С0АН-104 с N цитоплазмой, подлинна 2 + - ' -

«ск31С0АН-98 Стерильная форма , выделенная из линии СОАН-98 с N цитоплазмой линии СОАН-31 + - -

«с„Рек43-13 к Стерильная форма из инбредной линии с N цитоплазмой линии СОАН-22 + — -

ТАБЛИЦА 2 Исследованные линии сахарной свеклы, вх происхождение, состав плазмидоподобных молекул и тип цитоплазш

Линия Происхождение цитоплазмы Тип цито- Типы миникольцс мтДНК, тпн

плазмы 1.6 1,4 ]

СОАН-Ш СОАН-76 Сорт Рамонская 09 селекционной станции ВНШСС + + + +

СОАН-114 Сорт Белоцерковская-45, Белоцерковская селекционная станция N1 + +

СОАН-33 Синтетическая популяция лаборатории популяционной генетики ИЦиГ СО РАН + +

СОАН-15 СОАН-16 СОАН-17 Сорт Первомайская 028 + + . + + + +

СОАН-31 Сорт Уладовская односемянная + +

СОАН-22 Сорт Рамонская 09 + +

СОАН-98 СОАН-99 С0АН-102 С0АН-103 С0АН-104 СОАН-112 СОАН-ИЗ Популяция Ср/20 Рамонской селекционной станции, селекционер Голев И.Ф. N2 + + + + + + + + + + + +

СОАН-110 Сорт Немерчанской селекционной станции + +

[сОАН-241 СОАН-252 СОАН-262 СОАН-234 СОАН-243 Популяция ГДР 140364 N3 + + + + + + + + +

СОАН-742 Популяция ГДР 140361 + +

|С0АН-30 Ялтушковская односемянная + +

Marker, 1984; Thomas, 1986). Однако их исследования проводились на селекционных материалах США, стран Западной Европы и Японии, использугадих один и тот же источник стерильности, выявленной Оуэном в 1942 году. В странах Восточной Европы и в нашей стране в рамках национальных программ селекции гибридных сортов свеклы используются собственные источники стерильности, найденные в различных сортах-популяциях (Иорданский. Лутков, 1966, Балков, Малецкий и др. 1991). В настоящей работе впервые показано, что стерильные формы сахарной свеклы, используемые для производства гибридов в СНГ и странах Восточной Европы, характеризуются отсутствием миникольцевых молекул ДНК, специфичных для N цитоплазм, и по набору.плазмидо-подобных молекул не отличаются от цитоплазмы Оуэна.

Полученные данные позволяют предположить, что дополнительные миникольцевые молекулы в составе мтДНК N цитоплазм, отсутствующие в S цитоплазме стерильных растений, каким-то образом вовлекаются в проявление признака ЦМС у В.vulgaris. Становится очевидным, что по результатам анализа содержания плазмидоподобных молекул можно дифференцировать N и S цитоплазмы сахарной свеклы.

3.Сравнительное исследование основной высоксаолекулярноЗ мтДНК нормальных и стерильных цитоплазм сахарной свеклы реет -ршщиоиныы и гибридизационныы анализом. В результате рестр:ж-ционного анализа ферментами Eco RI, Ваш HI, Hind. III, Sal I мтДНК II стерильных форм и 24 линий сахарной свеклы с N цитоплазмой было обнаружено, что независимо от использованной эндонуклеазн, мтДНК стерильных линий всегда сущёственно отличается от мтДНК своих фертильных аналогов и других растений с N цитоплазмой. Впервые таким образом были выявлены отличия между ЦМС линиями В. vulgaris L.(Дударова и др., 1989). Линии 83138 (Уладовская опытная селекционная станция) и 8576 (Всероссийский НИИ сахарной свеклы и сахара) отличаются по картинам рестрикции мтДНК между собой; они отличаются от мтДКК ЩС линии, полученной в HШ свекловодства, Клей Ванцлебен, ГДР, по нескольким Ваш HI, Sal I и Eco RI фрагментам рестрикции, а также по картине гибридизации с ДНК клонированных митохонд-риальных генов atpA и СОХИ (рис.1 ). Данные линии не отличались по составу плазмидоподобных молекул - все они содержали

I

6 I

тли

AtP A

S| h Ъ m

N? N3

5.03.63.0-

COX II

1» Si 4 S3 N,N3 PC CSC

ND I

тпн ^ P С CSC

6.0-

s

X6- ф

X5-

Рис.1. Результаты блот-гибридизации рестриктированной Bam HI мтДНК растений стерильных линий мсСОАН-31 (Sj), 83138 (S2), 8576(S3); растения линии с ДОС 22003 (Р), клеток каллусной (С) и суспензионной (CSC) культур, полученных из этого растения; сахарной свеклы с N цитоплазмой: линий C0AH-3I (Nj), C0AH-I04 (N2), СОАН-252 (Ng)

с клонированными митохондриальными генами atpA, COXII и KDI.

миникольцо размером 1,6 тпн. Однако, как показал гибридологический анализ, проведенный сотрудниками лаборатории популя----------------------

ционной генетики ИЦиГ СО РАН, эти цитоплазмы, несмотря на отличия в структуре мтДНК, не являлись новыми типами ДОС, поскольку линии закрепители для них были те же, что и для цитоплазмы Оуэна. То есть выявлен полиморфизм среди одного S типа цитоплазмы.

Задача поиска новых стерильных цитоплазм возникает в связи с ограниченностью и, следовательно, уязвимостью селекционной базы сахарной свеклы с ДОС. В то же время выяснение степени полиморфизма нормальных цитоплазм также имеет большое значение в селекционно-семеноводческой практике при создании сортов и линий В.vulgaris с ценными признаками.

В результате анализа 24 линий сахарной свеклы с N цитоплазмой (коллекция лаборатории популяционной генетики ИЦиГ СО РАН) рестрикцией ферментами Bam HI, Hind III, Eco RI (рис.2) с последующим электрофорезом, было показано, что они делятся по структуре мтДНК на три группы. В пределах каждой группы первичная структура мтДНК растений с N цитоплазмой, по-видимому, весьма сходная, причем в этих группах наблюдается примерно одинаковый состав миникольцевых молекул. Все исследованные N цитоплазмы фертильных растений существенно отличаются от стерильных по первичной структуре мтДНК. Полученные данные могут указывать с одной стороны на высокую скорость мутирования мтДНК N цитоплазм, с другой стороны могут свидетельствовать о происхождении N"цитоплазм из разных источников. Это подтверждается тем, что линии из одной популяции и полученные на одной селекционной станции попадают,как правило, в одну группу нормальных цитоплазм (таблица 2).

Таким образом, впервые выявлен полиморфизм по первичной структуре мтДНК разных линий В.vulgaris с N и S цитоплазмами, при этом наибольшая степень полиморфизма наблюдается у растений с N цитоплазмами и слабее у растений с S цитоплазмами. Наши данные свидетельствуют о том, что рестрикционный анализ мтДНК с использованием ферментов Вага HI, Eco RI, Sal I и Hind III позволяет четко дифференцировать N и S цитоплазмы.

Для того чтобы исследовать структурные особенности мито-хондриального генома сахарной свеклы, связанные с возникнове-

n^ s Sj Sca M» Hi s ^ s s^ ™н

- 9.4

'5.1 4.5

-3.5

■2.0 ■ 1.9

• 1.6

. 1.4

Рис.2 Электрофорез в 0,8% агарозном геле мтДНК форм сахарной свеклы с ЦМС: мсСОАН-31(S), конвертантных растений мскС0АН-104-1(ScI ), MCKPeK43-I3(Sc2); линий с N цитоплазмами: C0AH-3I(Nj ), C0AH-I04(N2), СОАН-252(N3 ) -показаны только специфичные Eco RI фрагменты мтДНК (А) Влот-гибридизация тех же мтДНК, рестриктированных ферментом EcoRI, с клонированными генами COXII(B) и ND1(C)

нием ВМС, а также для выявления полиморфизма среди стерильных и фертильных линий Beta vulgaris, изучалась локализация мито-хондриальных генов субъединиц I и II цитохромоксидазы (COXI и COXII), апоцитохрома в (СОВ), а-субъединицы Fj-АТФазного комплекса (atpA), субъединицы I НАДН-дегидрогеназы (NDI), генов 26S, 5S и I8S рРНК (ггп2б, гтп5+18) на рестрикционных профилях мтДНК. Используя в качестве зондов соответствующие клонированные гены, мы впервые использовали гены atpA, СОХИ, СОВ, N11 в качестве генетических маркеров цитоплазм Beta vulgaris и показали, что стерильные растения отличаются от фертильных

по локализации последовательностей этих генов на Bam HI

(рте;I)¿i Iílnd III, а тсют гопсв М1 и С0Х1Гка Есо RI(рис.2)--------------

рестрикциоиных профилях мтДНК. Кроме того, блот-гибридизация с atpA, Ndl, C0XII, ггп26 зондами выявляет различия среда Н цитоплазм при рестрикции их мтДНК ферментам; Bern HI (рис.1) и Hind ill, что совпадает с результатами рестрикционного анализа по полиморфизму нормальных цитоплазм. Вариации среди ото-рильных форм были выявлены при гибридизации рестриктировагаюй Sal I и Ваш HI (рис.1) мтДНК с генами atpA, C0XII.

Таким образом, для даскрш^анаиаа N и S вдтсшшел 2йшо использовать чувствительный метод гибридизации мтДНГС сахарной свеклы, рестриктированной эндонуклеазами Bam HI, Eco RI и HindlII с генами atpA, COXII, Ndl и ттп2б, а также рестриктированной Bam HI и Sal I- с генами СОВ и atpA. Впервые с помощью блот-гибридизации с белок кодирующими митохоядриальныма генами показано, что изменения в организации мтДНН В.vulgaris с ВДС сопряжены с перестройками мтДНК в районах этих гепов.

, ЧТО МЛСЗ^ЭСТВЭННЫв перестройки, ПрОКОА^»»ntftfO-очевидно, в результате рекомбкнэциошмх событаг? :$ шрмкаэд.-э-ся в изменении локализации ряда митожокдрзалг-нкх psitai кя рчетрикшгонных профилях, приводят к изменению -tx э:ссире сыти и возникновению стерильного фэнотип.ч.

4. Наивнеиия в структур« нтЛНК оа^-дитой езезл» пра саэптаявеа конверсии к "-т;;рчлы!оо':;;. Явления рэзереш я конверсии тчпзв цитоплазм (К —«• S или S —»И) могут слузяъ моделью для изучения молекулярных ос"ов признака ШС: пол этой появляется возможность выяснить, какие изменения в структуре мтДНН сопровождает изменения фенотипа растения.

В работе исследовали структуру мтДйг* ^гералкшх рзстесйг В. vulgaris, спонтанно конвертировавших из фэртилышх растений с N цитоплазмой линий СОАН-22, СОАН-31, C0AH-I04. Сравнительный электрофоретический анализ мтДНК, ввделенных из сахарной свеклы родительских, растений л спонтанны д. чонвертапт'.-?. обнаружил их различия по составу хетжильцепих мелея?*: мтДНК» У конзертантов, как и у других растеняй стерильных лажП имелся только один тип плазкидоподобных молекул размером 1,6 тпн, исчезало миникольцо размером 1,4 тхш, присутствующее в исходных N цитоплазмах. Гибридизационный анализ с использсза-

нием в качестве радиоактивного зонда данного клонированного миникольца подтвердил его отсутствие среди миникольцевых молекул мтДНК конвертантов и то, что оно не. встраивается в основной митохондриальный геном, как это происходит с плазмидо-подобными молекулами SI и S2 у фертильных ревертантов кукурузы с ЦМС S-типа (Kemble, Мапз, 1983). Вероятно, исчезновение этого миникольца связано с нарушениями его автономной репликации. Однако, нет достаточных оснований считать его элиминацию обязательным условием конверсии цитоплазмы N- в S- тип у B.vulgarla и тем более ее причиной (Dudareva et al., 1990).

При спонтанной смене фертильного фенотипа на стерильный (N—S), определяемый цитоплазматическими факторами, происходят перестройки в основной мтДНК N типа, делающие ее подобной мтДНК S типа. Так, рестрикционный анализ ферментами Bam HI, Eco RI (рис.I) и Hind. Ill показал, что мтДНК конвертантов сильно отличаются от мтДНК растений родительских линий и практически идентичны мтДНК других стерильных форм B.vulgarla, хотя родительские N цитоплазмы имеют существенно отличающуюся первичную структуру мтДНК. Как было выявлено сравнительным блот-гибридизационным анализом мтДНК конвертантов и растений исходных линий с клонированными генами, такая реорганизация генома привела к изменению локализации митохондриальных генов atpA, СОВ, СОХИ и гта2б(рис.1,2). Все конвертанты имели практически идентичные профили рестрикции мтДНК, как и стерильные растения сахарной свеклы с цитоплазмой Оуэна, хотя блот-гибридизация с клонированными генами митохондрий ггп2б и C0XII выявила более четко небольшие отличия мевду ниш.

Перестройки генома митохондрий B.vulgarla при конверсии N цитоплазмы к S, являются, по-видимому, результатом рекомби--национных событий в мтДНК фертильных растений. О возможности рекомбинаций по повторяющимся последовательностям в геноме митохондрий сахарной свеклы сообщалось ранее (Lonsdale et al., 1988). Существует, вероятно, довольно жесткая предетер-минированность перестроек мтДНК конвертантов, которая объясняется несколькими причинами: расположением повторов в мтДНК, влиянием ядерного генома и селектирующими факторами, при этом, очевидно, более жизнеспособными оказываются митохондрии с мтДНК, характерными для S типа цитоплазм, остальные же ре-

комбинационные варианты генома митохондрий, затрагивающие

------------другие признаки и жизненно важные системы, элиминируются.---------------------

5. Исследование перестроек ыитохондриального генома сахарной свеклы в клетках каллусной и суспензионной культур а также в

процессе регенерации. В работе анализировались изменения структуры митохондриального генома В.vulgaris, происходящие при культивировании клеток и при регенерации растений из каллуса, что важно для получения новых типов митохондриальных геномов. С помощью рестрикции мтДНК эндонуклеазой BamH I были выявлены различия в структуре мтДНК клеток каллуса и исходного растения. Обнаружены также множественные перестройки в митохондриальном геноме клеток суспензионной культуры, полученной из данного каллуса. Часть этих изменений подобна перестройкам в мтДНК клеток каллуса, а часть возникла йе novo, как изменения в участках генов C0XII и NDI, выявленные при блот-гибридизации (рис.1).

Одним из существенных результатов является обнаружение одного регенеранта из 18 исследованных с измененной структурой митохондриального генома. МтДНК этого растения имеет отличные от мтДНК других растений-регенерантов и исходного растения Bam HI и EcoR I рестрикционные профили. Вазою подчеркнуть, что данный отличный по мтДНК регенерант как и все остальные был стерильным. Это обстоятельство особенно ценно, так как получение стерильного регенеранта с измененным митохонд-риальным геномом указывает на возможность создания ДОС линий с новой стерильной цитоплазмой.

В нашем эксперименте мтДНК каллуса, клеток 'суспензионной культуры, всех исследованных регенерантов как и мтДНК исходного растения содержали характерный только для S цитоплазм состав миникольцевых молекул - миникольцо размером 1,6 тпн. Таким образом, только высокомолекулярная мтДНК сахарной свеклы подверглась .перестройкам в процессе культивирования клеток, и регенерации.

Представляется вероятным, что индуктором перестроек генома митохондрий при культивировании клеток являются необычные стрессовые для клеток растений условия среды. При этом на мембранах клеток может происходить образование супероксидра-дикалов, которые, в свою очередь, могут индуцировать двуните-

вые разрывы ДНК, водущиэ к геномным перестройкам.

Таким образом, результаты данной части работы указывают на реальную возможность получения новых типов митохондриаль-ных геномов сахарной свеклы на основе использования методики культивирования клеток.

ШВОДЬ!

1 .При исследовании структуры митохондриального генома сахарной свеклы показано впервые, что мтДНК высших растений находится в комплексе с белками и компактизована за счет образования структур, подобных нуклеосомам, нуклеомерам и хромоме-рам ядерного хроматина.

2.Показано, что стерильные формы, используемые для производства гибридов в СНГ и странах Восточной Европы, как и стерильные формы из других регионов, характеризуются отсутствием ш-никольцевых молекул ДНК, свойственных нормальным цитоплазмам.

3.Установлено, что мтДНК нормальных и стерильных цитоплазм сахарной свеклы существенно отличаются по Вал HI, Eco RI, Hind. III, Sal I рестрикционным профилям. Полиморфизм в структуре мтДНК обнаружен у форм Beta vulgaris L. с Ii типом цитоплазмы и в меньшей степени у стерильных форм.

4.Обнаружено впервые, что изменения в структуре ытДНК сахарной свеклы с ЩС затрагивают области митохондрналышх генов atpA, СОВ, COXII, Ndl, ггп2б, что дает возможность дифференцировать фертильность или стерильность растений, а также выявлять полиморфизм среди форм сахарной свеклы с одним типом цитоплазмы (N или S), не проводя гибридологического анализа.

5.Выращивание клеток сахарной свеклы в суспензионной и каллу-сной культурах сопровождается многочисленными перестройками митохондриального генома, вызванными, вероятно, стрессовыми условиями содержания их in vitro, небольшая часть таких перестроек обнаружена в одном из 18 растений-регенерантов.

6. Обнаружено, что спонтанные конверсии нормальной цитоплазмы к стерильной сопровождаются многочисленными перестройками митохондриального генома, характерными для всех стерильных цитоплазм.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЙЙ5 ДИССЕРТАЦИИ

I.Dudareva N.A., BoyarintBeva (Dikalova) A.B., Maletsky S.I., Salganik R.I. A study of mitochondrial DNA structure for identification of the cytoplasmic male-sterile plasmotypes In sugar beet // Material 3th International Symposium ISTA, Leningrad, 1987. pp.244-249.

2.Salganik R.I., Dudareva N.A., Kiseleva E.V., Rristolyubova N.B., Popoveky A.V., Dikalova A.B. Molecular organization and functioning of the mitochondrial genome of Beta vulgaris L. // 3d International Workshop on the Mitochondrial Genome of Higher Planta, Roscoff, 1988, p.60.

3. Dudareva N. A., Kiseleva E.V., Dikalova A.B., Krietolyubova N.B., Salganik R.I. Structural organization of sugar beet mitochondrial and dloroplaat genomes // Genome, 1988, vol.30, suppl. 1, p.32.

4.Dudareva N.A., Kieeleva E.V., Boyarinteeva (Dikalova) A.K., MayBtrenko A.C., Krietolyubova N.B., Salganik R.I. Structuré of the mitochondrial genome of Beta vulgaris I.// Theor.Appl.Genet., 1988, vol.76, N 5, pp.753-759.

5. Кисе лева E.B., Дударева H.A., Бояринцева (Дикалова) А.Э., Майстренко А.Г., Христолюбова Н.Б., Селгашпс Р.И. Структурный анализ митохондриалъкого генома Beta vulgaris Ii.// Биополимеры и клетка, 1988, т.4, N6, с.321-328.

6.Дударева H.A., Бояринцева (Дикелова) А.Э., Малецкий С.И., Киселева Е.В., Христолюбова Н.Б., Салгаких Р.И. Срабылпелъное исследование структуры лилюхсндр~!П.'.ъних геномов фертиъных и стерильных форм Beta vulgaris Ъ. // Генетика, 1988, т.24, N12, с.2164-2171.

7.Дударева H.A., Дикалова А.Э., Малецкий С.И., Гилева И.П., Салганик Р.И. Изменения в структуре митохондриалъной ДНК, связанные с возникновением иитоплазматической мужской стершъности //Докл.Акад. Наук СССР,1939, т.308, N5, с.1255-1258.

8.Dikalova A.B., Dudareva N.A., Kubalakova M., Salganik R.I.

Rearrangements in the sugar beet mltohondrtal DNA induced by cell suspension, callus cultures and regeneration // Theor.Appl.Genet., 1993, in press.