Структурная организация и особенности экспрессии генов CPLX2 и MAP1B, активно функционирующих в мозге человека

Раевская, Наталья Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурная организация и особенности экспрессии генов CPLX2 и MAP1B, активно функционирующих в мозге человека
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация и особенности экспрессии генов CPLX2 и MAP1B, активно функционирующих в мозге человека"

На правах рукописи

0030G310Э

РАЕВСКАЯ НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ CPLX2 И MAPI В, АКТИВНО ФУНКЦИОНИРУЮЩИХ В МОЗГЕ ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 МАЙ 2007

МОСКВА - 2007

003063109

Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Института молекулярной генетики РАН (зав. лабораторией, доктор биологических наук, профессор С.А. Лимборская).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Л В Дергунова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В В. Носиков кандидат биологических наук Н С Куприянова

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН Защита состоится " 2007 г в часов

на заседании Диссертационного совета Д 21701301 при ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" по адресу 117545, г Москва, 1-й Дорожный проезд, 1 Факс (495)315-05-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУП "ГосНИИ генетика"

Автореферат разослан " 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Заиграева Г.Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Изучение структурно-функциональных свойств генов и особенностей регуляции их экспрессии относится к числу наиболее актуальных направлений современной молекулярной биологии К настоящему моменту определены полные нуклеотидные последовательности геномов нескольких сотен различных биологических объектов, включая человека В связи с этим чрезвычайно важную роль стали играть компьютерные методы хранения и анализа информации Секвенирование геномных последовательностей, а также множества клонов кДНК из тканеспецифических клонотек привело к созданию банков данных накопленной информации, открывших широкую возможность для изучения структурно-функциональной организации транскрибируемых генов Постоянно расширяющиеся базы данных позволяют осуществлять быстрый сравнительный анализ вновь появляющихся последовательностей и существенно облегчать формулировку предположений относительно их функциональной роли на основе сравнительного структурного анализа (Свердлов, 2000) Компьютерные методы анализа информации, накопленной в базах данных секвенированных генов и экспрессирующихся

последовательностей, открыли возможность выявления огромного числа неизвестных ранее генов, позволили уточнить экзон-интронную структуру, наличие альтернативных продуктов транскрипции, определить тканеспецифичность экспрессии многих уже описанных генов

Информация о последовательностях и одновременно разработанные новые технологии анализа экспрессии генов стали мощным инструментом для исследования генов, работающих в такой сложной структуре как мозг Отличительным и уникальным свойством этого органа является присутствие в нем наибольшего по сравнению с другими тканями числа морфологически и функционально различающихся клеточных популяций, осуществляющих разнообразные функции, для реализации которых требуется множество белков - продуктов экспрессии огромного числа генов По предварительным данным общее число генов человека составляет около 30 ООО, большая часть из которых функционирует в мозге Изучение структурной организации генов, активно экспрессирующихся в мозге, является актуальным и фундаментально значимым для понимания молекулярно-биологических процессов, определяющих его нормальное функционирование В дальнейшем это позволит исследовать роль генов, а также кодируемых ими белков в молекулярных механизмах, лежащих в основе многих заболеваний нервной системы

Цель и задачи исследования

Ранее для обнаружения генов, специфически экспрессирующихся в мозге человека, на основе фракции полиаденилированной мРНК различных отделов головного мозга человека в нашей лаборатории были получены клонотеки кДНК Дифференциальный скрининг клонотек позволил отобрать несколько клонов, в том числе Hfbl (клон № 1 из клонотеки кДНК лобной коры головного мозга человека, human forebram) и НшоЬЗ (клон № 3 из клонотеки кДНК продолговатого мозга человека, human medulla oblongata), последовательности которых показали преимущественную экспрессию в головном мозге человека (Буякова и соавт, 1992)

В целях выявления и идентификации генов, активных в тканях головного мозга человека и включающих последовательности Hfbl и НтоЬЗ, а также для исследования их структурной организации и особенностей функционирования были поставлены следующие задачи

• Определить первичную структуру экспрессирующейся последовательности НтоЬЗ

• Сравнить секвенированные участки Hfbl и НтоЬЗ с последовательностями ранее изученных генов

• Охарактеризовать структурную организацию генов, включающих последовательности HibI (CPLX2) и НтоЬЗ (MAPI В)

• Исследовать in silico промоторные области, а также 5'- и 3'-нетранслируемые области транскриптов гена CPLX2, включающих последовательность Hfbl

• Оценить уровень экспрессии транскриптов гена CPLX2 в отделах мозга человека и крысы

• Провести сравнительный анализ структурно-функциональной организации мРНК гена CPLX2 человека с транскриптами соответствующего гена мыши и крысы

Научная новизна и практическая ценность работы

соответствующего белка в организме Впервые исследована представленность транскриптов гена в разных отделах мозга человека и крысы Впервые проведен сравнительный анализ нетранслируемых участков мРНК комплексина 2 между различными видами млекопитающих, обнаружено высокое сходство их организации

Изучение клонированной последовательности НтоЬЗ позволило уточнить структурную организацию З'-концевого участка гена МАР1В человека, а также особенности строения З'-НТО его транскриптов Показано, что изучаемый ген экспрессируется в мозге, почке и скелетной мышце человека В почке и скелетной мышце также обнаружены новые варианты транскриптов гена MAPI В

Результаты исследования, позволившие уточнить структуру генов CPLX2 и МАР1В, представляют большой интерес с позиции определения вклада анализируемых генов и их белковых продуктов в осуществление процессов, протекающих в головном мозге, в том числе и при патологических состояниях

Сведения о характере экспрессии исследуемых генов CPLX2 и MAPI В в отдельных тканях могут представлять интерес с точки зрения изучения дальнейшей роли одноименных белков, а также механизмов их взаимодействия с другими белками в исследуемых тканях в норме и при патологии

Место проведения работы

Работа была выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Института молекулярной генетики РАН Отдельные эксперименты выполнены в Лаборатории сравнительной генетики животных Института общей генетики им Н И Вавилова РАН, а также в Центре коллективного пользования «Геном» Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Апробация работы

Основные положения работы были представлены на III конференции молодых ученых России "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (1998, Москва, Россия), ежегодных конференциях "Геном человека" (1998, 1999, Черноголовка, Россия), 2-м съезде Российского общества

медицинских генетиков (2000, Курск, Россия), школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (2000, Пущино, Россия), III съезде биохимического общества (2002, Санкт-Петербург, Россия), Human Genome Meeting (2002, Scanghai, China), конференциях Американского общества генетиков человека (1997, 1998, 2000, 2001) и Европейского общества генетиков человека (2002, 2005) Диссертационная работа была апробирована на заседании Ученого совета Института молекулярной генетики РАН 19 марта 2007 г и на заседании секции "Молекулярная биология" Ученого Совета ФГУП ТосНИИ генетика" 5 апреля 2007 г

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них - 5 статей и 14 материалов симпозиумов и конференций

Структура и объем работы

Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы Материалы диссертации изложены на fyß страницах машинописного текста, содержат 20 рисунков и 8 таблиц Список литературы включает 250 источников

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первичную структуру клона НтоЬЗ определяли методом Сэнгера, размер секвенированного участка составил 1420 н Последовательность Hfbl была секвенирована ранее, ее длина составляла 985 н (Буякова и соавт, 1992) Использование картирующей панели соматических гибридных клеток типа "человек-грызун" позволило локализовать последовательности Hfbl и НтоЬЗ на хромосоме 5 человека Сравнение Hfbl и НтоЬЗ с последовательностями, депонированными в базе данных ГенБанк (GenBank, сервер NCBI, http //www nebí nlm nih gov/) не выявило какой-либо гомологии с известными ранее генами и позволило считать, что мы имеем дело с новыми генами или с неописанными ранее участками известных генов. Отсутствие протяженных рамок считывания в первичной структуре этих последовательностей, а также тот факт, что они были отобраны из клонотек кДНК, полученных с использованием олиго(с1Т)-праймеров, свидетельствовало об их принадлежности З'-нетранслируемым областям мРНК

1. Нозерн-гибридизация ДНК клопов Hfbl и НтоЬЗ.

Особенности экспрессии последовательностей Hfbl и НтоЬЗ в тканях человека исследовали методом Нозерн-гибридизации ДНК меченой рекомбинантной плазмиды, содержащей вставку Hfbl, гибридизовали с

суммарными полиаденилированны ми мРНК, выделенными из мозжечка, таламуса, почки, легкого и скелетной мышцы человека (рис. 1А). При

А 1 2 3 4 5 Б

28S-

18S-- W

Рис.1. Нозерн-гибридизация 32Р-меченоЙ клонов Hfbl (А) и НтиоЬЗ (Б) с лоли(А+)РНК различных тканей человека. (А) ] - мозжечок, 2 - таламус, 3 - почка,4 - легкое, 5 - скелетная мышца. (Б) 1 - мозжечок, 2 - лобная кора, 3 - почка, 4 - скелетная мышца. 2SS n18S - рибосомальная РНК.

гибридизации в препаратах PI4K, полученных из отделов мозга, выявлены транскрипты, размер которых составлял около 5 т.п.н. В препаратах мРНК из почки, легкого и скелетной мышцы гибридизацйонный сигнал отсутствовал.

Нозерн-гибридизация клона НтоЬЗ с суммарными полиаденилированными мРНК мозжечка и лобной коры человека позволила обнаружить транскрипт, размер которого существенно превышал 5 т.п.н. В препаратах мРНК почки присутствовал транскрипт большего размера, в то время как в мышечной ткани детектировали оба транскрипта (рис. 1 Б). При гибридизации ДНК клона с мРНК легкого, печени и селезенки гибридизационный сигнал не выявлялся, что свидетельствовало об отсу тствии или низком уровне транскрипции исследуемой последовательности в данных тканях (данные не представлены).

2. Последовательность НшоЬЗ входит в состав З'-нетранслируемой

области мРНК гена MAPI В человека.

Сравнение мозгоспецифичесхой последовательности НтоЬЗ с последовательностями, депонированными в базе данных ГенБанк, наряду с большим количеством анонимных гомологичных EST выявило совпадение с ДНК геномного клона, включающего участок хромосомы 5 человека (ГенБанк, .4« АСО 12609). Эти результаты позволили предположить, что исследуемый нами ген или его часть локализуется в последовательности данного геномного клона. Сравнение участков клона АС012609, прилежащих к области перекрытия с НшоЬЗ, выявило в базе данных ГенБанк большое количество

12 3 4

ДНК последовательностей

EST, совпадающих с областью, примыкающей к 5'-концу НшоЬЗ, в то время как полностью отсутствовали последовательности, гомологичные участку, находящемуся сразу за его 3'-концом Обнаруженная транскрипционная активность исследуемого участка генома свидетельствовала о совпадении 3'-конца НшоЬЗ с 3'-концом транскрипта соответствующего гена В пользу данного предположения служил тот факт, что на расстоянии 26 нуклеотидов от поли(А)-конца НшоЬЗ расположен канонический участок полиаденилирования ААТААА Дальнейший поиск гомологичных последовательностей показал, что на расстоянии 1130 н от области перекрытия с 5'-концом НшоЬЗ заканчивался участок, совпадающий с 3'-концом мРНК МАР1В человека Полученные результаты, а также выявленное высокое сходство НшоЬЗ с последовательностью участка геномного клона мыши (ГенБанк, № AF115776), 5'-концевая область которого включала 3'-нетранслируемую область гена MAP IB (Meixner et al, 1999), позволили предположить, что НшоЬЗ входит в состав З'-нетранслируемой области (3'-НТО) мРНК MAPI В человека

Для доказательства нашего предположения был проведен анализ экспрессии гена МАР1В методом ОТ-ПЦР. В препаратах кДНК мозжечка человека были выявлены протяженные продукты, 5'-концевые участки которых совпадали с последовательностью MAPI В, а 3'-концевые участки - с последовательностью НшоЬЗ или с геномной ДНК, прилежащей к ее 5'-концу (рис 2) Существование таких транскриптов свидетельствовало, что НшоЬЗ входит в состав З'-НТО мРНК гена MAP 1В человека Об отсутствии примеси геномной ДНК в препаратах кДНК свидетельствовали контрольные эксперименты, когда в качестве матрицы для ПЦР использовали мРНК без предварительной ревертазной реакции В этих экспериментах для всех пар праймеров продукты амплификации отсутствовали (рис 2Б, дорожки 3).

К моменту нашего исследования структурная организация гена МАР1В человека была установлена Lien и соавт (Lien et al ,1994) Общий размер гена, состоящего из семи экзонов и шести интронов, составлял 101 тпн Нуклеотидная последовательность мРНК МАР1В человека (ГенБанк, № L06237) была определена в результате секвенирования нескольких перекрывающихся клонов кДНК, ее размер составлял 9416 нуклеотидов, а длина З'-НТО - 1787 н Выявленные два альтернативных варианта мРНК MAP 1В человека различались 5 '-концевыми участками и имели совпадающие З'-НТО, при этом размер 3'-фланкирующего экзона гена MAPI В человека составлял 1950 пн (Lien et al ,1994) Как показали результаты нашего исследования, размер З'-НТО транскриптов гена MAP 1В человека существенно превышает аналогичный участок описанных ранее мРНК и

1 т. п. п.

ЛСО!02609

РЗ

р4 pj

pfi

I F- I I НшоЬЗ iTWJ.«;

Р6

MAPI В (IM337J

РЗ •э— РЗ •э—

¥>4

р5

Рб

Р4/Р6

P3/PS РЗ/Р6

Г1 г з1^г гм 2 з

1 - кДНК мозжечка

2 -ДНК геномного клона

3 - мРНК мозжечка

Рис.2. Анализ протяженной 3'-нетранс лиру емой области трав скрипта в гена МАР1В человека с помощью ОТ-Г1ЦР: (А) Схематическое изображение локализации прайм еров РЗ, Р4, Р5, Р6 относительно последовательностей ACO 102609, мРНК MAP 1В и НшоЬЗ. Участки между прай мерами соответствуют размерам ожидаемых продуктов амплификации кДНК мозжечка. Направление стрелок указывает ориентацию праймеров в направлении 5'-3'. (Б) Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР, полученных на кДНК мозжечка (1), Д1-ПС геномного клона (2) и тотальной РНК (3); Маркер - продукты гидролиза ДНК фага к рсстриктазой Pstl.

составляет 4330 н. Conocí аадеиме нухяеотидиой после дотат « лънсста выявленных нами вариантов мРНК MAPI В с ДНК геномного аналога (ГенБанк, № ACO 12609) позволило определить длину последнего экзона данного гена -4484 п.н. На основании полученных результатов и имеющихся в базах данных ГенБанк последовательностей EST и мРНК МАР1В человека (ГенБанк, М» NMJ4)5909, NM_032Ü\0), методом in sitico нами были сконструированы контиги, соответствующие альтернативным вариантам транскриптов гена МАР1В человека. Они зарегистрированы в базе данных EMBL-Data Bank под А'с>№ BN001084 и BN001085, Таким образом, исследование НшоЬЗ позволило определить новый участок 3'-концевого экзона гена MAPI В и, тем самым, уточнить его структуру.

3. Идентификация геномного клона, содержащего последовательность Н1Ы.

Для исстедования структурной организации гена, в состав которого входит последовательность Hfbl, мы использовали космидную клонотеку ДНК хромосомы 5 человека, любезно предоставленную Е И Фроловой (Институт биоорганической химии им М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН) Из космидной клонотеки отбирали клоны, гибридизующиеся с Hfbl Размер участка хромосомы 5, содержащейся в клоне 11-7, превышал 20 тпн Рестриктазное картирование и Саузерн-гибридизация фрагментов вставки клона с 32Р меченой последовательностью Hfbl позволили выделить участок ДНК, совпадающий с Hfbl Была определена нуклеотидная последовательность этого участка, а также фрагментов, прилежащих к его 3'- и 5'-концам, общий размер секвенированного фрагмента, обозначенного нами как Ghfb (т е геномный аналог клона Hfbl), составил 5480 пн Последовательность Ghfb депонировали в базе данных ГенБанк под номером AF318943

4. In silico анализ геномного клона Ghfb.

Сопоставление секвенированного фрагмента геномного клона Ghfb с последовательностями, депонированными в базе данных ГенБанк, позволило нам выявить ряд EST, высокогомологичных области, совпадающей с Hfbl, а также участку ДНК, прилежащему к ее 5'-концу (рис 3) Наибольшее количество EST совпадало с 3'-концевой областью Hfbl, в то же время в базе данных EST ГенБанк наблюдалось отсутствие транскрибируемых последовательностей, гомологичных участку, расположенному сразу за З'-концом Hfbl Полученные результаты свидетельствовали о совпадении 3'-конца Hfbl с З'-концом транскрипта соответствующего гена Кроме того, 5'-концевая область секвенированного геномного клона показала 100% гомологию с тремя участками (в интервале с 341 по 933 н) мРНК комплексина 2 человека Это позволило предположить, что секвенированный фрагмент геномного клона представляет собой неописанный ранее участок, возможно, соответствующий одному из вариантов З'-нетранслируемой области мРНК гена комплексина 2 человека Представленная в тот момент времени в базе данных ГенБанк мРНК комплексина 2 имела длину 940 н (ГенБанк, № U35100) Суммирование данной величины с длиной выявленной нами З'-нетранслируемой области (около 4 тпн) давало продукт размером около 5 тпн, что соответствовало длине транскрипта, полученного при Нозерн-гибридизации ДНК клона Hfbl с суммарными полиаденилированными РНК из различных отделов головного мозга человека (рис 1А) Обнаруженные в базах данных ГенБанк последовательности EST ALI 19131 и AW896858, 5'-концы а 2,

которых совпадали с 3'-концом мРНК комплексина 3'-концы - с геномной последовательностью вНЛ, подтверждали данное предположение (рис 3) 1 т п п

I I

5, Ghfb (АШ8943)

* | ■■■■-. , | | I , g

1 2 3 4 5

комплексин 2 HfM

(NM_006650) HTOl (YIS167)

Рис.З. Сопоставление секвенированного участка геномного клона Ghfbl с нуклеотидными последовательностями мРНК комплексина 2 (NM_006650), Hfbl (Y15167) и EST, представленными в базе данных ГенБанк

5. Выявление протяженной З'-НТО мРНК CPLX2.

Доказательством наличия у мРНК комплексина протяженного 3'-нетранслируемого участка служит анализ экспрессии данного гена с помощью ОТ-ПЦР В качестве матрицы для ПЦР использовали кДНК, полученную методом обратной транскрипции мРНК мозжечка человека Пары праймеров были составлены таким образом, что один из них соответствовал мРНК комплексина 2, другой - участку ДНК геномного клона Ghfb (рис 4А) Размеры полученных продуктов ОТ-ПЦР совпадали с размерами продуктов ПЦР ДНК геномного клона и соответствовали ожидаемым 2,9 т п н -праймеры C3/G7, 2,3 т п н - C3/G6, 1,2 тпн - C2/G5, 0,7 тпн - C3/G3 (рис 4Б) В то же время, при амплификации кДНК мозжечка и ДНК геномного клона в присутствии других пар праймеров (С1/С4, C1/G1) наблюдали продукты разной длины В случае пары праймеров С1/С4 размер ПЦР-продуктов кДНК составлял 0,6 т п н и 1,3 т п н для ДНК геномного клона, в присутствии C1/G1 - 0,9 и 2,0 т п н соответственно (рис 4В) Различия в длине

1 ГП.П.Н.

S'i

Ghfb (AF31S943)

C4 С] G3G5

G6 G~

комплектна 2 £a£»

(NM OMSÖ). _

C1 _ ___С 4

c: •э-

c3/g7 c3'gsc2/g5 c3.g3 I - "Ii-Ii-Ii-1

f 2 1 2 1 2 1 2 M

— 1,1 ™ —1,0

- —0,8 --0,6

— « « I ■■

н£ы

— G6

сз G7 -е*

ct/c4 c1/61 I-II-1

M 1 2 1 2 M

2.0 ~ j| ^ 7

0,8— * 0,5 —

Рис, 4. Анализ З'-НТО мРНК комплексина 2 человека: схематическое изображение мест локализации прайм еров С1-С4, Gl, G3, G5-G7 относительно нуклеотидных последовательностей мРНК комплексина 2 и Ghfb, а также участков между прайм ерам и, соответствующих размерам ожидаемых продуктов амплификации кДНК мозжечка. Направление стрелок соответствует ориентации праймеров 5'-3\ (Б, В) Электрофоре граммы продуктов ОТ-ПЦР, полученных на ДНК геномного клона (I) и кДНК мозжечка (2), Маркеры -продукты гидролиза ДНК фага X рестриктазами Pst /(М, М2) и Hindlll и EcoRl (Ml).

продуктов ГЩР в этом опыте свидетельствовали о присутствии нитрона в исследуемом гене, а также служили косвенным доказательством отсутствия примеси геномной ДНК в препаратах кДНК. Таким образом, в препаратах МРНК присутствовали протяженные транскрипты. 5'-концевые участки которых совпадали с последовательностью мРНК комплексина 2, а 3'-концевые участки - с последовательностью Ghfb.

6. физическое картирование Ghfb в геноме человека.

Для уточнения места локализации последовательности Ghfb в геноме человека совместно с сотрудниками Лаборатории сравнительной генетики животных под руководством Г.Е.Сулимовой (Институт общей генетики им.

НИ Вавилова РАН) был проведен скрининг панели ДНК индивидуальных клонов радиационных гибридов соматических клеток (человек-хомяк) GeneBndge 4 методом ПЦР с использованием праймеров, специфичных к Ghfb Сопоставление результатов скрининга с данными по локализации генов, представленными в базе данных Центра геномных исследований Института Уайтхэд (США) показало, что последовательность Ghfb располагается дистальнее маркеров рабочей рамки WI-6737 и AFMA109XA5 на 3,77 cR и 3,87 cR (LOD балл = 2 78), соответственно Таким образом, последовательность Ghfb локализована в области 533,07 -537,37 cR хромосомы 5 (среднее значение - 535,2 cR) в соответствии с RH-картой этой хромосомы, построенной в Институте Уайтхэд (WI-RH-карта) В том же интервале и практически в том же месте в пределах точности метода (636,91 CR3000) находится ген комплексина 2 человека (CPLX2), что подтверждает расположение Hfbl вблизи этого гена

7. Анализ in silico мРНК гена CPLX2 человека.

Выявление протяженной З'-нетранслируемой области мРНК гена CPLX2 человека, в состав которой входит последовательность Hfbl, свидетельствовало о значительно большей длине транскриптов гена CPLX2 и необходимости уточнения организации данного гена Для уточнения структуры 5'- и 3'- концов транскриптов гена CPLX 2 человека нами был проведен анализ in silico баз данных ГенБанка (NR, EST) В качестве «виртуальной пробы» использовали последовательность мРНК CPLX2 (ГенБанк, № NM_0066500) Огромное число перекрывающихся последовательностей EST формировало контиг, удлиняющий мРНК CPLX2 в 3'-направлении на 3794 нуклеотида Формируемый контиг (области перекрытия между отдельными EST составили не менее 50 нуклеотидов) совпадал с участком геномного клона AF318943, включающего последовательность Hfbl, и подтверждал наличие протяженной З'-НТО у транскриптов этого гена (рис 5) Число последовательностей, гомологичных 5'-концевой области мРНК комплексина, было существенно меньше Два EST клона (ГенБанк, М» AL707430, ВР200227), полученных из библиотеки кДНК мозга человека, имели сходство 97% и 99 % с участками с 8 по 258 и с 8 по 179 н мРНК CPLX2 соответственно, удлинив исследуемый транскрипт в 5'-направлении на 80 нуклеотидов Три перекрывающихся EST клона (ГенБанк, №№ AL118919, BQ716337, ВР199904) имели сходство более 97% с мРНК CPLX2 в области перекрытия, начинающейся с 256 н и, следовательно, также принадлежали этому гену Однако они отличались от нее сходными между собой 5'-концевыми участками (рис 5). Эти результаты позволили предположить существование альтернативного транскрипта гена CPLX2, 5'-концевая часть которого отличается от известной ранее последовательности мРНК комплексина 2 На основании полученных данных

933 NMJ06650

(Human CPLX2 тРШ)

li_i_^ii80 AF313943

1 88 259 338 - Y 15167 (Н/Ы)

LJS_ i i A L707430

LJ2_-3 BP20022 7

LJg_L71 BQ716337

1 79 417

T i i AL118919

1 221 559 БР199904

1 „■■ 4807 BN000499 (CPLX2_vl)

} i i ,:< BN000500 (CPLX2_v2)

Рис.5. Сравнение мРНК CPLX2 (NM_006650) с последовательностями из базы данных EST и NR ГенБанка Показаны несколько кДНК клонов, полученных на основе мРНК мозга и высокогомологичных NM_006650 Стрелками указано местоположение интронов на геномной последовательности AF318943 BN000499 и BN000500 - сконструированные in sihco контиги, представляющие гипотетические варианты транскриптов гена CPLX2

нами были сконструированы контиги, представляющие первичную структуру двух транскриптов гена CPLX2 человека, различающихся между собой 5'-концевыми участками (рис 5) В базах данных EMBL-Data Bank они зарегистрированы под номерами BN000499 и BN000500 Контиги BN000499 и BN000500 имеют длину 4807 и 4691 н и различаются участками 5'-НТО длиной 338 и 222 н соответственно Совпадающая область транскриптов включает участок 5'-НТО (88 н ), кодирующую область (405 н) и протяженную 3'-НТО (3976 н)

8. Экзон-интронная организация гена CPLX2 человека.

Сопоставление сконструированных контигов BN000499 и BN000500 с геномными последовательностями хромосомы 5 человека из базы данных ГенБанк (HTGS) позволило нам уточнить длину всех выявленных экзонов и интронов гена CPLX2, а также определить канонические динуклеотиды AG/GT, фланкирующие его экзон-интронные границы (табл 1) Структурная организация гена CPLX2 и его транскриптов CPLX2 схематически представлена на рис 6 Контиг BN000499 включает экзоны I-V, а длина соответствующей ему транскрипционной единицы составляет 87,5 т п н Контиг BN000500 вместо экзонов I и II содержит последовательность, обозначенную как экзон А,

Таблица 1. Экзон-интронные границы гена СРЬХ2 человека Консервативные нуклеотиды ag и gt на концах интроиов подчеркнуты

Экзон 5' донорный сайт Интрон 3' акцепторный

№ размер сплайсинга, размер сайт сплайсинга,

(по) экзон/интрон (по) интрон/экзон

I* 258 CAACAG/fittcgt 12217 ctccag/GAAGGT

II 80 GCAAAG/gtaagg 69603 ctgcag/GTTGTC

А* 222 CGCCAG/gtcggt 6947 ctgcag/GTTGTC

III 119 TTGGAG/gtgagg 137 tcgtag/GGGCCA

IV 176 GATAAG/gtcagc 764 ccccag/TATGGG

V 4171

локализованную внутри интрона II на расстоянии 7 т п н от экзона III, длина транскрипционной единицы составляет при этом 12,5 тпн Перекрывающаяся область контигов начинается с экзона 1П и включает экзоны IV и V (рис 6)

87.5 т.п.и.

ПЛт.п.н.

i и i .„I... ,..,.....,,,....... П *v... v

CPLX2 vi

a i '" 1 ' 1 "" " i'""1 41 " i | !v v

CPLX2 v2

Рис.6. Структурная организация гена CPLX2 человека и его транскриптов Экзоны I—V и А представлены в виде прямоугольников, интроны - в виде прерывистых линий, отмечен вариант сплайсинга Кодирующая область окрашена серым цветом Указан размер каждой транскрипционной единицы

9. Выявление двух вариантов транскриптов CPLX2 в клетках мозга человека.

Присутствие в клетках мозга двух типов транскриптов, различающихся 5'-флангом и включающих совпадающую протяженную З'-НТО, подтверждали методом ОТ-ПЦР В реакции ПЦР использовали комбинации пар праймеров, позволяющие получить перекрывающиеся продукты амплификации, свидетельствовующие о структуре предполагаемых транскриптов, а также о наличии возможных альтернативных продуктов (рис 7А) При электрофорезе продуктов амплификации кДНК мозжечка в агарозном геле нами были выявлены фрагменты ожидаемых размеров. F1/R1 - 396 н, F2/R2 - 709 и, F3/R3 - 972 н , F4/R3 - 777 н , F5/R4 -1410 н , F6/R5 - 1522 н F7/R6 - 304 н

ft w-

ir:

*- <4 со о л

ОС tt и DC £

т- (VI fi V in Ii

IL IL |L IL iL IL

I Ii I I I I II in

12 3 4 5 ö 7 M

Рис.7. Идентификация трап скриптов гена CPLX2 в клетках мозга с помощью ОТ-ПЦР. Электрофорез продуктов ПЦР в 6% полиакриламидном геле. Размер рестрикциоиных фрагментов указан в Нуклеотидах. (А) Локализация и направление праЙмеров F1-F8, R1-R7; размеры ожидаемых продуктов амплификации показаны Схематически, Праймеры и продукты амплификации, общие для обоих типов транскриптон, расположены относительно транскрипта 1 (CPLX2_y\). (Б) Продукты амплификации, специфичные для транскрипта CPLX2_vl (дорожки 1, 2) и общие для транскриптов CPLX2_v\ и CPLX2jv2 (дорожки 3, 5, б, 7). Дорожка 4 (положительный контроль) - продукт амплификации, полученный на геномной ДНК, (В), Продукты амплификации, специфичные для транскрипта CPLX2_v2 (дорожки 1, 2). Маркеры - ДНК фага X, обработанная ферментами Pst I (Ml) и HindUI и EcoRJ (М2).

F8/R7 - 640 и. Выявленные продукты амплификации к ДНК, полученные при комбинации прямых праймеров, комплементарных экзонам I, El (транскрипт BN000499) или А (транскрипт BN000500) с обратными праймерами, соответствующими перекрывающейся области транскриптов

0,514 0,448

0,339

0,264 0,248

г-СС К

t-« 5

U. IL

i—II—I

1 2 М

1,093 0,805

(экзоны III-V) подтверждали присутствие в препаратах мРНК мозжечка двух типов транскриптов, различающихся 5'-флангом (рис 7Б, дорожки 1-3, рис 7В, дорожки 1-2) Перекрывающиеся последовательности продуктов ПЦР также подтверждали существование у обоих транскриптов протяженной 3'-нетранслируемой области (рис 7Б, дорожки 5-7) Выявление в каждой реакции амплификации только одного продукта свидетельствовало об отсутствии других альтернативных вариантов транскриптов данного гена, кроме обнаруженных вариантов мРНК В контрольном эксперименте при использовании в качестве матрицы геномной ДНК в присутствии пары праймеров F3/R3 размер полученного продукта (1873 н) существенно превышал аналогичный на кДНК мозжечка (972 н), что подтверждало присутствие интронов в этом участке гена и косвенно свидетельствовало об отсутствии примесей геномной ДНК в препаратах кДНК (рис 7Б, дорожка 4)

10. Исследование промоторных областей гена CPLX2.

Идентификация в мозжечке человека двух типов транскриптов гена CPLX2, различающихся 5'-НТО, предполагает использование альтернативных промоторов для инициации их транскрипции Проведенный нами анализ ш silico геномных последовательностей, фланкирующих 5'-концы экзонов I и А гена CPLX2, показал наличие промоторных областей, расположенных непосредственно перед ними и разделенных в геноме участком ДНК длиной 74 т п н Эти области не содержат канонические последовательности (TATA, ССААТ, CpG островки), представляющие известные z/ис-действующие промоторные элементы, а включают множество сайтов связывания с различными белковыми факторами, в том числе API, AhR, AREB6, NRF1, Nkx 2 5, NF1, MOK-2, MZF1 и др Взаимодействуя с соответствующими транскрипционными факторами, эти сайты могут потенциально участвовать в регуляции транскрипции широкого спектра генов (Arranz et al, 1994, Benekli et al, 2003) Не исключено, что обнаруженные элементы связывания транскрипционных факторов могут потенциально участвовать в регуляции инициации транскрипции исследуемого гена и обеспечении многообразия механизмов контроля его функционирования Отличительной особенностью проксимального промотора гена CPLX2 является наличие протяженного GA-богатого повтора, который потенциально может участвовать в активации транскрипции многих генов как в присутствии, так и в отсутствии функционального ТАТА-элемента (Levemer et al, 2000, Aguilera et al, 2003, Kotite et al, 2003) По другим источникам, в промоторах генов, не имеющих ТАТА-бокса, GA-повторы являются необходимыми для инициации транскрипции (Wyse et al, 2000) Таким образом, можно ожидать, что

обнаруженный GA-повтор также активно участвует в транскрипции гена CPLX2

11. Определение точек инициации транскрипции гена CPLX2.

Точки старта транскрипции гена CPLX2 определяли методом удлинения праймера в 5'-направлении на препаратах поли(А)+-мРНК мозжечка человека В реакции использовали праймеры R8 и R9, специфичные экзонам 1 и А Продукты реакции, фракционированные в 8%-ном денатурирующем полиакриламидном геле, на радиоавтографе были обнаружены в виде нескольких радиоактивных сигналов (рис 8А) Электрофорез в геле с высоким разрешением позволил уточнить размер двух продуктов реакции, специфичных экзону1(74 и 115 н)и трех продуктов, специфичных экзону А (86, 87и 111 н) (рис 8Б, дорожки 1, 2) Длину наиболее протяженных продуктов реакции удлинения праймера R9 (307 и 238 н ), не выявляемых в секвенирующем геле, определяли с помощью программы BioDocAnalyse (Biometra, Германия) Идентичные результаты получены нами в экспериментах с полиаденилированными фракциями мРНК гиппокампа и лобной коры человека (данные не представлены) Таким образом, для каждого из альтернативных вариантов транскриптов гена CPLX2 выявлено несколько мест инициации синтеза

Известно, что многие промоторы, не содержащие ТАТА-бокс, способны к инициации транскрипции с нескольких сайтов (Bender et al, 1986, Stutz et al, 1998) Возможно, отсутствие ТАТА-бокса в промоторных областях гена CPLX2 послужило причиной наличия нескольких мест инициации транскрипции Отсутствие TATA последовательности описано для генов домашнего хозяйства или 'housekeeping' генов, в число которых входят онкогены, гены факторов роста и др (Bender and Kuehl, 1986, Stayner et al, 1998) По некоторым данным, такая особенность наблюдается у генов, высоко экспрессирующихся в мозге (Sutchffe et al, 1988)

12. In sihco идентификация транскриптов комплексипа 2 мыши. Эволюционный консерватизм транскриптов гена комплексипа 2.

Сопоставление мРНК комплексина 2 мыши (ГенБанк, № NM_009946) с нуклеотидными последовательностями из баз данных EST мыши ГенБанка с помощью программы BLAST также позволило нам выявить огромное количество перекрывающихся EST и сконструировать два кДНК контига, которые были зарегистрированы в базах данных EMBL-Data Bank (№№ BN000501 и BN000502) Эти контиги представляют первичную структуру двух транскриптов гена комплексина 1 мыши Они различаются участками 5'-НТО длиной 350 и 227 н и совпадают на участке длиной 4589 н, включающей

, К8Г__

I | | У I СР1Х2_\>1 К»*,_

М VI \2

311249-

307

200 - ф 238

151-

-87 86 = 74

Рис.8, Определение точек старта транскрипции методом удлинения прайм ера в 5'-направлении. Стрелками указаны продукты реакции, получение на поли(А') РНК мозжечка человека с праймеров Я8 (дорожка VI) и Я9 (дорожка \'2), специфичных экзонам I и А соответственно. Светлыми и темными стрелками обозначены продукты, полученные с гран скриптов 8^00499 и ВЫ000500, соответственно; размер фрагментов указан в нуклеотидах. (А) Электрофорез с низким разрешением. Продукты реакции, фракционированные в 8% пол и акри лам идиом геле. М, маркер фХ174Х174/#/>гП. (Б) Электрофорез продуктов реакции в 8% ПААГ (высокое разрешение), в; А; Т; С - маркерные дорожки, соответствующие продуктам секвснирования ДНК плазмиды риС18.

участок 5'-НТО (88 н,), кодирующую область (405 н.), а также З'-НТО (4096 п.), содержащую протяженный О А-богатый повтор.

Сравнение кДНК контигов, представляющих первичную структуру транскриптов гена комплексина 2 человека и мыши, помимо консерватизма длины их З'-НТО (около 4 т.п.н.) и высокой гомологии кодирующей области (92%) выявило сходство последовательностей 5'-НТО пар контигов ВN00049000501 и ВN000500,^N000502 90% и 83% соответственно.

Сравнение З'-НТО сконструированных транскриптов гена комплексина 2 человека и мыши позволило нам обнаружить шесть высоко гомологичных участков длиной от 40 до 416 н., сходство которых превышало 83%. Наибольшая степень гомологии выявлена в участках, фланкирующих 3'-концевые области транскриптов (табл.2). В таблице представлены также

Таблица 2. Сравнение участков 3'-концевых последовательностей мРНК комплексина 2 человека и мыши с последовательностями EST базы данных ГенБанк

Объект

Нуклеотидная последовательность З'фланга

№ кДНК

Homo sapiens Mus musculus Rattus norvegicus Sus scrofa Bos taurus

1 1 1 1 1

60 60

59 61

117

118 118 118 117

177 177 177 177 176

CCATCCTGCCCCCGTGGGGGAT-CCCCTTTCCCACATCCGTGCTGTGTCATTGTTGCTCT 59 CCATCCTGCTCATGTAGGGGAA-CCTCTTTCCCACAACTGTGCTGTGTCCTTGTTGCTCT 59 CCATCCTGCTCATGTAGGG-AA-CCTCTTTCCCACAACTGTGCTCTGTCCTTGTTGCTCT 5 8 CCATCCTGCTCGCACGGGGGGGATCCCTTTCCCACATCTGTGCTGTGTCCTTGTTGCTCT 6 0 CCATCCTACCCATGTGGGGGAG-CCCCTTCCCCACCTCTGTGCTGTGTCCTTGTTGCTCT 5 9

******* * *

* *** *****

* ***** **** **********

GCTTCCTTTCAATGTGTCAGTGCCTGGGGGGAGGGGAGGAGCACCCCCTCAGC---CCCC 116

GCTTCCTTTAAATGTGTCAGTCTCTGGGGG-AGGGGAGGGCCACGCCCCCCGA-ACTCCC 117 GCTTCCTTTAAATGTGTCAGTCTCTGGGGG-AGGGGAGGGCCACCCCCCCAAGCACTCCC 117

GCTTCCTTTAAATGTGTCAGTGCCTGGGGGGAGGGGAGGGGTGCCCCCCCGAC---CCCC 117

GCTTCCTTTAAATGTGTCAGTGCCTGGGGGGAGGGGAGGGGCACCCCTTCATG---CCCC 116

********* ***********

******* ********

CTGAACCTGACCAAAAGCCATGGCTGTTGCTCCCCCCTTTGTATGATGCAAATGCTGAAA 176 TTGAACCTGACCAAAAGCCATGGCCGT-GCTCCCCACTTTGTATGATGCAAATGCTAAGA 176 TTGAACCTGACCAAAAGCCATGGCCGT-GCTCCCCACTTTGTATGATGCAAATGCTAAGA 176 CTGAACCTGACCAAAAGCCATGGCTGTTGTTCCCCC-TTTGTATGATGCAGATGCTAAGA 17 6

CTGAACCTGACCAAAAGCCATGGCTGTTGCTCCCCC-TTTGTATGACGCAGATGCTAAGA 17 5 *********************** ** * ***** ********* *** ***** * *

TG---TACAAAATCAACCATGACAACAAROAAAAA-GACCTTGTACAGCA 222

TGATGTACAAAACCAACCATGATGACAASG»JVAAA-GACCTTGTACAGCA 225 TGATGTACAAAACCAACCATGACGACA^.GAJLAAAAGACCTTGTACAGCA 226 TG---TACCAAACCAACCATGACAACAAAGAAAAA—ACCTTGTACAGCA 221

TG---TACCAAACCAACCATGACA-CAA^GAAAAG—ACCTTGTACAG-- 217

** *** *** ********* ********* ***********

BN000499 BN000501 BG372752 BX666273 AV592335

BN000499 BN000501 BG372752 BX666273 АУ592335

BN000499 BN000501 BG372752 BX666273 AV592335

последовательности клонов анонимных EST крысы, свиньи и быка, высокое сходство которых с последовательностью З'-НТО транскриптов мыши и человека позволяет предположить их принадлежность 3'-концам транскриптов гена комплексина 2 у этих организмов Отличительной особенностью всех представленных последовательностей является отсутствие канонического сайта полиаденилирования ААТААА и наличие гексануклеотида AAGAAA Участие AAGAAA в полиаденилировании нескольких типов мРНК описано для многих генов Так, например, выявлена его роль в полиаденилировании мРНК одного из вариантов генов тяжелой цепи иммуноглобулина Е мыши, мРНК, кодирующих стерол-альфа-диметилазу свиньи и эндопероксид Н синтазу человека (Anand et al, 1997, Kojima et al, 2000) Высокий консерватизм функциональных участков этой области, свидетельствует, по видимому, об их определяющей роли в полиаденилировании транскриптов комплексина 2

Ген комплексина 2 крысы представлен в базе данных ГенБанк последовательностями D70816 (912 н) и U35099 (900 н), кодирующими один и тот же белок, но различающимися участками 5'-НТО Отсутствие достаточного количества секвенированных последовательностей в базе данных EST не позволяет в данный момент сконструировать полноразмерные транскрипты гена комплексина 2 крысы Однако высокое сходство последовательностей U35099 и D70816 с контигами BN000499 и BN000500 соответственно позволяет предположить, что они, по-видимому, представляют фрагменты двух вариантов транскриптов гена комплексина 2 крысы - Cplx2_vl и Cplx2_y2, сходных с альтернативными транскриптами человека CPLX2_vl и CPLX2_v2

13. Исследование уровня экспрессии транскриптов гена комплексина 2 в отделах мозга человека и крысы.

Для выявления в тканях человека транскриптов, соответствующих сконструированным контигам BN000499 и BN000500, применяли метод ОТ-ПЦР В качестве матрицы использовали кДНК, полученные на препаратах тотальной мРНК мозжечка, лобной коры, гиппокампа, селезенки, лимфатического узла, печени, почки и легкого человека На электрофореграмме оба варианта транскриптов детектируются во всех исследуемых областях мозга, тогда как в селезенке, лимфатическом узле, печени, почке и легком они не выявлены, подтверждая мозгоспецифический характер экспрессии данного гена (рис 9А)

Для сравнения уровня экспрессии выявленных транскриптов в лобной коре, мозжечке и гиппокампе человека нами был использован полуколичественный анализ, основанный на ОТ-ПЦР Для его проведения были подобраны условия ПЦР, позволяющие сравнивать представленность

# af ~

3 $

г «

1 £ > § I itgg8s i

CPLX2_\ 1__

CPLX2_\-2___

G4PDH____

■ "09 п и. -696 П.И -5~0 п.н.

* •

S 5" «f

f.l

Cplx2_yí----»-132 п.н.

CpLvZ v2 _ —..... i"2 п.н

gfipdli----4- 18S п н.

мозжечок кора гштпокамп

Э 14 8

9 -Í? 1-2 Е н

р.

& и 06

§ в

«В 06 t I 04

в 9

X и

д,

□ Ср1х2_\1 шСрШ_у1

мозжечок кора гштокамп

Рис.9. Анализ экспрессии транскриптов комплексина 2 в отделах мозга человека (А) и крысы (Б) Верхняя часть электрофорез в 1,5% агарозном геле продуктов амплификации кДНК мозжечка человека с использованием пар праймеров F2/R2 (CPLX2_v\) и F7/R2 (CPLX2_v2) и кДНК мозга крысы с парами праймеров F9/R10 (Cplx2_yl) и F10/R10 (Cplx2_y2) Внутренний контроль - продукты амплификации тех же кДНК с праймерами для GAPDH Нижняя часть диаграммы характеризует относительное содержание транскриптов комплексина 2 человека и крысы Данные проанализированы статистически с использованием и-теста Mann-Wlutney Различия в экспрессии транскриптов комплексина 2 в коре и гиппокампе человека и транскриптов комплексина 2 в мозжечке ч гиппокампе крысы являются статистически значимыми (* Р < 0,05)

транскриптов гена CPLX2 в отделах мозга Число циклов, количество матрицы и температурные условия были оптимизированы для получения детектируемого количества продукта ПЦР на стадии экспоненциального роста В качестве эндогенного контроля использовали ген GAPDH, характеризующийся постоянной экспрессией в разных тканях ("housekeeping gene") После амплификации продукты ПЦР фракционировали в 6%-ном ПААГ, сканировали и количественно оценивали с помощью программы ImageQuant Для вычисления относительного содержания транскрипта гена CPLX2 в тканях мозга определяли отношение интенсивности сигнала соответствующего продукта ПЦР к интенсивности продукта гена GAPDH

Результаты исследования уровня экспрессии альтернативных транскриптов гена CPLX2 в отделах мозга человека представлены на диаграмме (рис 9А) Высокое содержание транскриптов CPLX2_v2 наблюдается во всех анализируемых областях мозга человека, в то время как транскрипты CPLX2_vl на высоком уровне детектируются в мозжечке и менее представлены в коре и гиппокампе Различия в относительном содержании транскриптов CPLX_vl и CPLX_v2 в коре и гиппокампе являются статистически значимыми (u-test Mann-Yutney)

Метод ОТ-ПЦР был также использован для определения относительного содержания транскриптов гена комплексина 2 в образцах кДНК мозжечка, лобной коры и гиппокампа крысы (рис 9Б) На представленной диаграмме высокий уровень экспрессии транскриптов Cplx_v2, инициируемых проксимальным промотором, отмечается в мозжечке и лобной коре, тогда как в гиппокампе он значительно ниже В этом отделе мозга крысы наблюдается высокий уровень экспрессии транскриптов Cplx_vl, соответствующих экзонам I-V Поскольку каждый из исследованных нами отделов мозга отличается многообразием клеточной организации и особенностями функционирования, то наблюдаемая дифференциальная представленность альтернативных вариантов транскриптов гена комплексина 2 скорее всего обусловлена специфичностью экспрессии данного гена внутри отдельных нейрональных популяций, формирующих эти структуры

выводы

1 Последовательность НшоЬЗ, полученная из клонотеки кДНК продолговатого мозга человека и локализованная на хромосоме 5, входит в состав протяженной З'-нетранслируемой области мРНК MAPI В человека размером 4330 н , что существенно превышает величину З'-НТО описанных ранее мРНК MAPI В

2 По результатам in vitro и in silico экспериментов последовательность Hfbl, полученная из клонотеки кДНК лобной коры человека и локализованная на хромосоме 5, входит в состав протяженной З'-нетранслируемой области мРНК гена комплексина 2 (CPLX2) человека

3 Охарактеризована экзон-интронная организация гена CPLX2 человека Показано, что общая длина гена CPLX2, включающего 6 экзонов и 5 интронов, составляет 87,5 т п н

4 Установлено, что в результате альтернативного сплайсинга ген CPLX2 экспрессируется с образованием двух вариантов мРНК, различающихся участками 5'-нетранслируемых областей Последовательность одного из них включает экзоны I, И, III, IV и V, последовательность другого не содержит экзоны I и И, а вместо них включает дополнительный экзон А

5 Анализ ш silico показал наличие в гене CPLX2 двух промоторных областей, расположенных непосредственно перед экзонами I и А Альтернативные промоторы разделены в геноме участком ДНК длиной 74 тп н

6 Регуляция экспрессии гена CPLX2 осуществляется предположительно за счет использования альтернативных промоторов и синтеза альтернативно сплайсируемых вариантов гена

7 Ген CPLX2 экспрессируется в головном мозге, что согласуется с функциональной ролью одноименного нейрон-специфического белка, участвующего в передаче нейромедиаторов в синаптическую щель Альтернативные варианты транскриптов комплексина 2 в разных отделах мозга человека и крысы представлены в разных соотношениях.

8 Наряду с эволюционным консерватизмом кодирующих областей гена CPLX2 у человека, мыши и крысы обнаружено высокое сходство организации его нетранслируемых областей

Результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

Статьи

1. Дергунова Л В , Владыченская И П, Раевская Н М, Полукарова Л Г, Леликова Г П, Лимборская С А Особенности структуры, экспрессии и хромосомная локализация нуклеотидных последовательностей НшоЬЗ и НшоЬЗЗ, полученных из библиотеки кДНК продолговатого мозга человека //Молекулярная биология 1998 Т 32 №2 С 249-254

2 Дергунова Л В , Раевская Н М, Владыченская И П, Полтараус А Б , Климов Е А , Сулимова Г Е , Лимборская С А Мозгоспецифическая последовательность Hfbl входит в состав протяженной 3'-нетранслируемой области гена комплексина 2 человека новые данные m vitro и in silico экспериментов // Молекулярная биология 2001 Т 35 № 5 С 778-786

3 Дергунова Л В , Раевская Н М , Владыченская И П, Лимборская С А Структурно-функциональный анализ кДНК последовательностей Hfbl, НшоЬЗ и НшоЬЗЗ как пример исследования мозгоспецифических генов человека//Молекулярная биология 2003 Т 37 №2 С 315-324

4 Dergunova L V , Raevskaya N М, Vladychenskaya IР , Limborska S A НшоЬЗ bram-specific sequence is a part of phylogenetically conserved human MAP1B gene 3'untranslated region//BiomolEng 2003 V 20(3) P 91-96

5 Raevskaya N M , Dergunova L V, Vladychenskaya IP , Stavchansky V V, Obonna M V , Poltaraus A B, Limborska S A Structural organization of the human complexm 2 gene (CPLX2) and aspects of its functional activity // Gene 2005 V 359 P 127-137

Материалы симпозиумов и конференций

6 Dergunova L V, Vladychenskaya I P , Raevskaya N M , Polukarova L G, Limborska S A Structure and chromosomal localization of novel НтоЬЗЗ sequence from human bram cDNA library//Am J Hum Genet 1997 V61 N 4 P A391

7 Владыченская И П, Раевская Н М, Дергунова Л В Структурно-функциональный анализ двух новых генов Hfbl и НтоЬЗ, активно функционирующих в клетках головного мозга человека // Материалы конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", посвященной 240-летию ММА им ИМ Сеченова Москва 1998 г

8 Vladychenskaya IР , Dergunova L V, Buyakova О I, Rajevskaya N М , Limborska S A Novel bramspecific Hfbl sequence structure, expression and chromosomal mapping//Am J Hum Genet 1998 V63 P A195

9 Дергунова Л В , Владыченская И П, Раевская Н М , Лимборская С А Структурно-функциональная организация новых мозгоспецифических

генов человека Hfbl, НшоЬЗ и НгпоЬЗЗ // Сборник отчетов за 1998 г "Геном человека" Москва 1998 С 50

10 Лимборская С А , Дергунова Л В , Владыченская И П , Раевская Н М , Полтараус А Б Анализ структуры гена Hfbl, активно функционирующего в клетках мозга человека // Сборник отчетов за 1999 г "Геном человека" Москва 2000 С 87-88

11 Дергунова Л В , Раевская Н М , Владыченская И П , Полтараус А Б , Лимборская С А Особенности структуры и хромосомная локализация новых генов, активно функционирующих в мозге человека // Второй (четвертый) Российский съезд медицинских генетиков Курск 17-19 мая 2000 г Тезисы докладов, часть первая С 102-103

12 Раевская НМ, Дергунова ЛВ, Владыченская ИП, Полтараус АБ, Лимборская С А Особенности структуры и хромосомная лов ализация новых генов, активно функционирующих в мозге человека // Пущино 28мая - 2 июня 2000 года Тезисы докладов С 261

13 Dergunova LV, Raevskaya NM, Vladychenskaya IP, Poltaraus AB, IvanovaNV, Limborska S A Cloning and mapping of Hfbl, a novel brain-specific gene // European J Hum Genet 2000 V 8 Suppl 1 P 128

14 Dergunova L V Raevskaya N M, Vladychenskaya IP, Poltaraus А В ,Limborska S A Hfbl brain specific sequence is the З'-UTR of complexm 2 mRNA //Am J Hum Genet 2000 V 67 P 177

15 Raevskaya NM, Dergunova LV Vladychenskaya IP, Limborska SA Genomic organization of human complexm 2 gene //European J Hum Genet 2002 V 10 Suppl 1 P 166-167.

16 Дергунова ЛВ, Раевская НМ, Владыченская ИП, Лимборская С А Новые данные о структурно-функциональной организации генов MAPI В и MOB, экспресирующихся в мозге человека // III съезд биохимического общества Санкт-Петербург 26 06 -01 07 2002. Тезисы научных докладов С 398

17 Raevskaya NM, Dergunova LV, Vladychenskaya I P., Limborska S A Bram-specific Sequence HMOB3 Is a Part of the 4,3 kb З'-Untranslated Region of the Human MAP IB Gene // Human Genome Meeting 2002 Scanghai China 14-17 April 2002 Poster 223

18 Raevskaya NM, Vladychenskaya IP, Dergunova LV, Limborska SA Alternative transcripts of human bram-specific genes MOB and CPLX2 // Am J Hum Genet 2001 V 71 (4) P 321

19 Dergunova LV, Raevskaya NM, Vladychenskaya IP, Obonna MV, Poltaraus A B, Limborska S A Structural organization of the human complexm 2 gene (CPLX2) and aspects of its functional activity // European J Hum Genet 2005 V 13 P 362

Подписано в печать 19 04 2007 г Исполнено 23 04 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 406 Тираж 80 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Раевская, Наталья Михайловна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цели и задачи работы.

Научная новизна.

Практическая значимость работы.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Основные подходы и методы изучения транскриптома.

1.1.1. Анализ нуклеотидной сложности мРНК.

1.1.2. Нозерн-блот-гибридизация и создание клонотек кДНК.

1.1.3. Компьютерные методы исследования.

1.1.4. Широкомасштабные методы исследования экспрессии генов.

1.1.4.1. Метод дифференциального дисплея мРНК.

1.1.4.2. Серийный анализ экспрессии генов.

1.1.4.3. Тотальный анализ экспрессии генов.

1.1.4.4. Метод микрочипов.

1.2. Особенности структурной организации и функционирования эукариотических мРНК.

1.2.1. Структурная организация молекулы мРНК.

1.2.2. 5'-НТО и ее роль в регуляции трансляции мРНК.

1.2.2.1. AUG-кодоны в 5'-НТО.

1.2.2.2. Короткие рамки считывания.

1.2.2.3. Вторичные структуры.

1.2.2.4. Нуклеотидные мотивы, участвующие в регуляции трансляции мРНК.

1.2.3. Роль З'-НТО мРНК в регуляции экспрессии генов.

1.2.3.1. Регуляция трансляционной активности транскриптов.

1.2.3.2. Механизмы, контролирующие локализацию мРНК в клетке.

1.2.3.3. Регуляция стабильности транскриптов.

1.2.4. Особенности структурно-функциональной организации мозгоспецифических мРНК.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клонирование фрагментов кДНК НтоЬЗ в ДНК фага М13.

2.1.1. Бактериальные штаммы и векторы для клонирования.

2.1.2. Среды и растворы.

2.1.3. Выделение рекомбинантной плазмиды ДНК pUC19 со вставкой НшоЬЗ.

2.1.4. Получение однонитевой формы бактериофага М13.

2.1.5. Выделение репликативной формы бактериофага М13.

2.1.6. Рестрикция плазмидной и фаговой ДНК эндонуклеазами Hindlll и EcoRI.

2.1.7. Фракционирование ДНК в агарозном геле.

2.1.8. Элюция фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы.

2.1.9. Обработка препаратов фаговой ДНК бактериальной щелочной фосфатазой.

2.1.10. Получение рекомбинантных молекул фага М13.

2.2. Получение компетентных клеток и высокоэффективная трансформация.

2.3. Определение первичной структуры последовательности НшоЬЗ.

2.4. Электрофоретическое фракционирование продуктов секвенирования ДНК.

2.5. Локализация последовательностей Н1Ы и НшоЬЗ на хромосомах.

2.5.1. Олигонуклеотидные праймеры, используемые в реакции ПЦР.

2.5.2. Полимеразная цепная реакция.

2.5.3. Анализ продуктов ПЦР.

2.5.4. RH-картирование.

2.6. Скрининг космидных клонотек.

2.7. Получение препаратов космидной ДНК.

2.8. Рестриктазное картирование ДНК геномных клонов.

2.8.1. Рестрикция ДНК космидных клонов.

2.8.2. Перенос ДНК из агарозных гелей на нейлоновые фильтры "Hybond N+".

2.8.3. Получение 32Р-меченого фрагмента ДНК (random-мечение).

2.8.4. Гибридизация продуктов рестрикции с меченым зондом.

2.9. Определение нуклеотидной последовательности ДНК фрагмента вставки клона 11-7 (Ghfb).

2.9.1. Клонирование Pstl-фрагмента геномного клона 11-7 в плазмиду pBluescript II SK+.

2.9.2. Подготовка образцов для секвенирования.

2.9.3. Автоматическое секвенирование.

2.10. Выделение тотальной РНК.

2.11. Получение поли(А+)мРНК на олиго(сГГ) целлюлозе.

2.12. Нозерн-гибридизация.

2.12.1. Получение 32Р-меченых зондов.

2.12.2. Электрофоретическое фракционирование РНК в денатурирующем агарозном геле.

2.13. ОТ-ПЦР.

2.13.1. Обработка препаратов тотальной РНК ДНКазой I.

2.13.2. Синтез одноцепочечной ДНК.

2.13.3. Условия амплификации.

2.13.4. Электрофоретическое фракционирование продуктов ОТ-ПЦР.

2.14. Секвенирование продуктов ОТ-ПЦР.

2.15. Блот- гибридизация продуктов ОТ-ПЦР.

2.15.1. Получение 32Р -меченого ПЦР-зонда.

2.16. Реакция удлинения праймера (Primer extension).

2.16.1. Получение Р-меченого маркера и олигонуклеотидных праймеров.

2.16.2. Гибридизация меченых праймеров с поли(А)+ фракцией мРНК.

2.16.3. Реакция удлинения праймера.

2.16.4. Электрофоретическое фракционирование продуктов реакции.

2.17. Полуколичественный анализ.

2.17.1. Получение РНК и кДНК из тканей человека и крыс.

2.17.2. Полимеразная цепная реакция.

2.17.3. Компьютерная обработка результатов.

2.18. Программное обеспечение.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Определение первичной структуры последовательности НгаоЬЗ.

3.2. Нозерн-гибридизация ДНК клонов ШЫ и НтоЬЗ.

3.3. Хромосомная локализация последовательностей Hfbl и НтоЬЗ.

3.4. Рестриктазное картирование ДНК геномного клона 11-7, включающего последовательность Hfbl.

3.5. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК геномного клона 11-7.

3.6. Физическое картирование Ghfb в геноме человека.

3.7. In silico анализ последовательности Ghfb.

3.8. Выявление протяженной З'-НТО у транскрипта гена комплексина 2.

3.9. Анализ in silico мРНК комплексина 2.

3.10. Экзон-интронная организация гена комплексина 2 человека.

3.11. Выявление двух вариантов транскриптов гена комплексина 2 с помощью ОТ-ПЦР.

3.12. Исследование in silico промоторных областей гена CPLX2 человека.

3.13. Определение точек инициации транскрипции гена CPLX2.

3.14. Эволюционный консерватизм транскриптов гена комплексина 2. In silico идентификация транскриптов комплексина 2 мыши и крысы.SO

3.15. Выявление транскриптов гена комплексина 2 в тканях человека и крысы.

3.16. Рестриктазное картирование вставки клона 21-8, включающей последовательность НшоЬЗ.

3.17. Поиск последовательностей, гомологичных НшоЬЗ.

3.18. Выявление протяженной З'-НТО у транскрипта гена MAPIB.

3.19. Поиск регуляторных участков в З'-НТО транскриптов CPLX2 и МАР1В.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурная организация и особенности экспрессии генов CPLX2 и MAP1B, активно функционирующих в мозге человека"

Изучение структурно-функциональных свойств генов и особенностей регуляции их экспрессии относится к числу наиболее актуальных направлений современной молекулярной биологии. К настоящему моменту определены полные нуклеотидные последовательности геномов нескольких сотен различных биологических объектов, включая человека. В связи с этим чрезвычайно важную роль стали играть компьютерные методы хранения и анализа информации. Секвенирование геномных последовательностей, а также множества клонов кДНК из тканеспецифических клонотек привело к созданию банков данных накопленной информации, открывших широкую возможность для изучения структурно-функциональной организации транскрибируемых генов. Постоянно расширяющиеся базы данных позволяют осуществлять быстрый сравнительный анализ вновь появляющихся последовательностей и существенно облегчать формулировку предположений относительно их функциональной роли на основе сравнительного структурного анализа [5]. Компьютерные методы анализа информации, накопленной в базах данных секвенированных генов и экспрессирующихся последовательностей, открыли возможность выявления огромного числа неизвестных ранее генов, позволили уточнить экзон-интронную структуру, наличие альтернативных продуктов транскрипции, определить тканеспецифичность экспрессии многих уже описанных генов.

Информация о последовательностях и одновременно разработанные новые технологии анализа экспрессии генов стали мощным инструментом для исследования генов, работающих в такой сложной структуре как мозг. Отличительным и уникальным свойством этого органа является присутствие в нем наибольшего по сравнению с другими тканями числа морфологически и функционально различающихся клеточных популяций, осуществляющих разнообразные функции, для реализации которых требуется множество белков - продуктов экспрессии огромного числа генов. По предварительным данным общее число генов человека составляет около 30 ООО, большая часть из которых функционирует в мозге [217, 198, 43, 192]. Мозг осуществляет сложные задачи, ответственные за познание, эмоции, память, интеграцию сенсорной информации и моторную координацию, вовлекающие множество областей и биохимических систем [39]. Нарушения этих функций лежат в основе многих патологических состояний.

Изучение структурной организации генов, активно экспрессирующихся в мозге, является актуальным и фундаментально значимым для понимания молекулярно-биологических процессов, определяющих его нормальное функционирование [207, 212]. В дальнейшем это позволит исследовать роль генов, а также кодируемых ими белков в молекулярных механизмах, лежащих в основе многих заболеваний нервной системы [47].

Цели и задачи работы

Ранее для обнаружения генов, специфически экспрессирующихся в мозге человека, на основе фракции полиаденилированной мРНК различных отделов головного мозга человека в нашей лаборатории были получены клонотеки кДНК. Дифференциальный скрининг клонотек позволил отобрать несколько клонов, в том числе Hfbl (клон № 1 из клонотеки кДНК лобной коры головного мозга человека, human forebrain) и НшоЬЗ (клон № 3 из клонотеки кДНК продолговатого мозга человека, human medulla oblongata) последовательности которых показали преимущественную экспрессию в головном мозге человека [1].

• Определить первичную структуру экспрессирующейся последовательности НтоЬЗ.

• Сравнить секвенированные участки Hfbl и НтоЬЗ с последовательностями ранее изученных генов.

• Охарактеризовать структурную организацию генов, включающих последовательности Hfbl (CPLX2) и НтоЬЗ (МАР1В).

• Исследовать in silico промоторные области, а также 5'- и 3'- нетранслируемые области транскриптов гена CPLX2, включающих последовательность Hfbl.

• Оценить уровень экспрессии транскриптов гена CPLX2 в отделах мозга человека и крысы.

• Провести сравнительный анализ структурно-функциональной организации мРНК гена CPLX2 человека с транскриптами соответствующего гена мыши и крысы.

Научная новизна

В результате исследования клонированной ранее мозгоспецифической последовательности Hfbl удалось установить ее принадлежность 3'-концевой части гена комплексина 2 (CPLX2) человека. Впервые описана детальная структура гена CPLX2 человека, а также изучены особенности организации его транскриптов. Показано, что в регуляции функционирования исследуемого гена принимают участие механизмы альтернативного сплайсинга; идентифицированы и охарактеризованы два альтернативных варианта мРНК гена CPLX2. Высказаны предположения о возможных механизмах, регулирующих уровень активности гена CPLX2 и соответствующего белка в организме. Впервые исследована представленность транскриптов гена в разных отделах мозга человека и крысы. Впервые проведен сравнительный анализ нетранслируемых участков мРНК комплексина 2 между различными видами млекопитающих, показана эволюционная консервативность участка, отвественного за полиаденилирование.

Изучение клонированной последовательности НшоЬЗ позволило уточнить структурную организацию 3'-концевого участка гена MAP 1В человека, а также особенности строения З'-НТО его транскриптов. Показано, что изучаемый ген экспрессируется в мозге, почке и скелетной мышце человека. В почке и скелетной мышце также обнаружены новые варианты транскриптов гена MAPI В.

Практическая значимость работы

Информация о структурной организации транскриптов генов CPLX2 и МАР1В является значимой для дальнейшего изучения особенностей транскрипции и трансляции исследуемых генов. Идентификация функциональных элементов в промоторньтх областях гена CPLX2, а также в 5'- и З'-НТО его транскриптов позволяет сформулировать гипотезы относительно механизмов регуляции активности данного гена и разработать подходы к экспериментальным исследованиям влияния этих областей на эффективность его экспрессии. Сведения о характере экспрессии исследуемых генов CPLX2 и MAPI В в отдельных тканях могут представлять интерес с точки зрения изучения дальнейшей роли одноименных белков, а также механизмов их взаимодействия с другими белками в исследуемых тканях в норме и при патологии.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Раевская, Наталья Михайловна

выводы

1. Последовательность НтоЬЗ, полученная из клонотеки кДНК продолговатого мозга человека и локализованная на хромосоме 5, входит в состав протяженной 3'-нетранслируемой области мРНК МАР1В человека размером 4330 н., что существенно превышает величину З'-НТО описанных ранее мРНК MAP 1В.

2. По результатам in vitro и in silico экспериментов последовательность Hfbl, полученная из клонотеки кДНК лобной коры человека и локализованная на хромосоме 5, входит в состав протяженной З'-нетранслируемой области мРНК гена комплексина 2 (CPLX2) человека.

3. Охарактеризована экзон-интронная организация гена CPLX2 человека. Показано, что общая длина гена CPLX2, включающего 6 экзонов и 5 интронов, составляет 87,5 т.п.н.

4. Установлено, что в результате альтернативного сплайсинга ген CPLX2 экспрессируется с образованием двух вариантов мРНК, различающихся участками 5'-нетранслируемых областей. Последовательность одного из них включает экзоны I, II, III, IV и V; последовательность другого не содержит экзоны I и II, а вместо них включает дополнительный экзон А.

5. Анализ in silico показал наличие в гене CPLX2 двух промоторных областей, расположенных непосредственно перед экзонами I и А. Альтернативные промоторы разделены в геноме участком ДНК длиной 74 т.п.н.

6. Регуляция экспрессии гена CPLX2 осуществляется предположительно за счет использования альтернативных промоторов и синтеза альтернативно сплайсируемых вариантов гена.

7. Ген CPLX2 экспрессируется в головном мозге, что согласуется с функциональной ролью одноименного нейрон-специфического белка, участвующего в передаче нейромедиаторов в синаптическую щель. Альтернативные варианты транскриптов комплексина 2 в разных отделах мозга человека и крысы представлены в разных соотношениях.

8. Наряду с эволюционным консерватизмом кодирующих областей гена CPLX2 у человека, мыши и крысы обнаружено высокое сходство организации его нетранслируемых областей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Направленное применение современных молекулярно-биологических и компьютерных методов анализа структурной организации транскриптов, идентификация их 5'- и 3'-концов, детальный анализ нетранслируемых областей приобретают все большее значение для выяснения структуры генов, механизмов регуляции их экспрессии. В данной работе, имеющей своей целью выявление и дальнейшее исследование генов, активных в головном мозге человека и включающих в себя последовательности Hfbl и НшоЬЗ, использовалось сочетание методов молекулярной биологии и биоинформатики. Ряд данных о структурной организации и функциональных особенностях нетранслируемых областей исследуемых генов был получен методами in silico, а затем подтвержден и детализирован экспериментально.

По результатам исследования последовательности Hfbl и НшоЬЗ, полученные из клонотек кДНК мозга человека, входят в состав протяженных 3'-нетранслируемых областей мРНК генов CPLX2 и МАР1В человека соответственно. Наличие протяженных 3'-нетранслируемых участков описано для многих мозгоспецифических мРНК [40, 119, 221]. По мнению исследователей, большая длина З'-НТО мозгоспецифических мРНК может быть связана со сложной системой регуляции экспрессии, требующей присутствия большого числа регуляторных последовательностей, так как клеточное разнообразие мозга, возможно, требует более точной и громоздкой регуляторной системы, включающей протяженные нетранслируемые области [150, 239]. В настоящее время многочисленные исследования свидетельствуют о ключевой роли этой области в пост-транскрипционной регуляции, контролирующей стабильность, трансляционную эффективность и локализацию мРНК [119, 150, 239]. Обнаруженное Masumder и соавт. увеличение средней длины З'-нетранслируемой области мРНК по мере усложнения организмов в процессе эволюции, позволило высказать предположение о ее потенциальной значимости в обеспечении механизмов трансляционной регуляции у высших позвоночных и в установлении различий между видами [150]. Выявление протяженных З'-НТО транскриптов генов CPLX2 и МАР1В человека, детальный анализ регуляторных элементов, локализованных в них, вносит существенный вклад в исследование механизмов трансляционного контроля и пост-транскрипционной регуляции их экспрессии.

Компьютерные методы анализа информации, накопленной в базах данных секвенированных генов и экспрессирующихся последовательностей, позволили нам уточнить экзон-интронную структуру гена CPLX2 человека, обнаружить альтернативные продукты его транскрипции. С помощью экспериментов in vitro альтернативные транскрипты гена комплексина 2 были выявлены в разных отделах мозга человека и крысы. Обнаружение альтернативных транскриптов исследуемого гена чрезвычайно важно для понимания особенностей его функционирования внутри клетки. Множество исследований свидетельствует, что механизмы синтеза альтернативных транскриптов наиболее широко используются в мозге. Эксперименты in silico позволили выявить альтернативные варианты транскриптов многих мозгоспецифических генов человека и других млекопитающих [77]. К числу механизов посттранскрипционной регуляции генов, приводящих к образованию нескольких мРНК с одного гена, относятся альтернативный сплайсинг, альтернативное использование сайтов начала транскрипции и альтернативное полиаденилирование. В результате проведенного исследования показано, что в регуляции функционирования гена CPLX2 принимают участие альтернативный сплайсинг и альтернативное использование сайтов инициации транскрипции. Высказаны предположения о возможных механизмах, регулирующих уровень активности данного гена и соответствующего ему нейрон-специфического белка.

Таким образом, полученные результаты позволили уточнить структуру генов CPLX2 и МАР1В, а также сформулировать предположения относительно механизмов регуляции их активности. Эти данные представляют большой интерес с позиции определения вклада исследуемых генов и кодируемых ими белков в осуществление процессов, протекающих в головном мозге как в норме, так и при патологических состояниях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Раевская, Наталья Михайловна, Москва

1. Буякова О.И., Баринова Е.И., Дергунова Л.В., Хаспеков Г.Л., Чивилев И.В., Лимборская СА. Выделение и анализ мозгоспецифических последовательностей из библиотек кДНК разных отделов мозга человека // Генетика. 1992. Т. 28. № 5. С. 40-6.

2. Копанцев Е.П., Нестерова Т.Д., Бородин A.M., Закиян С.М. Создание картирующей панели гибридных клеток человек-грызун // Генетика. 1993. Т.29. № 9. С. 1440-1451.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Москва. Мир. 1984.

4. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. Москва. Наука. 2000.

5. Свердлов Е.Д. Очерки современной молекулярной генетики по курсу лекций для студентов биологического факультета МГУ. Очерк 6. Генная терапия и медицина XXI века. Молекул, генет., микробиол., вирусол. 1996. № 4. С. 3.

6. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. Москва. Мир. 1998.

7. Спирин А.С. Биосинтез белка: регуляция на уровне трансляции // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6. № 5. С. 2-7.

8. Adams M.D., Soares M.B., Kerlavage A.R., Fields C., Venter J.C. Rapid cDNA sequencing (expressed sequence tags) from a directionally cloned human infant brain cDNA library // Nature Genet. 1993. V. 4(4). P. 373-80.

9. Aguilera G., Volpi S., Rabadan-Diehl C. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms regulating the rat pituitary vasopressin Vlb receptor gene // J Mol Endocrinol. 2003. V. 30(2). P. 99-108. Review.

10. Akashi M., Hachiya M., Koeffler H.P., Suzuki G. Irradiation increases levels of GM-CSF through RNA stabilization which requires an AU-rich region in cancer cells // Biochem Biophys Res Commun. 1992. V.189(2). P. 986-93.

11. Akashi M., Shaw G., Hachiya M., Elstner E., Suzuki G., Koeffler P. Number and location of AUUUA motifs: role in regulating transiently expressed RNAs // Blood. 1994. V. 83(11). P. 3182-7.

12. Arranz V., Kress M., Ernoult-Lange M. The gene encoding the MOK-2 zinc-finger protein: characterization of its promoter and negative regulation by mouse Alu type-2 repetitive elements // Gene. 1994. V. 149(2). P. 293-8.

13. Bartel D.P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function // Cell. 2004. V. 116(2). P. 281-97. Review.

14. Bashirullah A., Cooperstock R.L., Lipshitz H.D. Spatial and temporal control of RNA stability// Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V. 98(13). P. 7025-8. Review.

15. Beckmann S.L., Chikaraishi D.M., Deeb S.S., Sueoka N. Sequence complexity of nuclear and cytoplasmic ribonucleic acids from clonal neurotumor cell lines and brain sections of the rat // Biochemistry. 1981. V. 20(9). P. 2684-92.

16. Bender T.P., Kuehl W.M. Murine myb protooncogene mRNA: cDNA sequence and evidence for 5' heterogeneity // Proc Natl Acad Sci USA. 1986. V. 83(10). P. 3204-8.

17. Benekli M., Baer M.R., Baumann H., Wetzler M. Signal transducer and activator of transcription proteins in leukemias // Blood. 2003. V. 101(8). P. 2940-54. Review.

18. Bergsten S.E., Gavis E.R. Role for mRNA localization in translational activation but not spatial restriction of nanos RNA // Development. 1999. V. 26(4). P. 659-69.

19. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 1979. V. 7(6). P. 513-23.

20. Brewer G. // An A+U-rich element RNA-binding factor regulates c-myc mRNA stability in vitro. Mol Cell Biol. 1991 May;l l(5):2460-6.

21. Brown C.S., Goodwin P.C., Sorger P.K. Image metrics in the statistical analysis of DNA microarray data // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V. 98(16). P. 8944-9.

22. Buck L., Stein R., Palazzolo M., Anderson D.J., Axel R. Gene expression and the diversity of identified neurons // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1983. V. 48. P. 485-92.

23. Budowle В., Chakraborty R., Giusti A.M., Eisenberg A.J., Allen R.C. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE // Am J Hum Genet. 1991. V. 48(1). P. 137-44.

24. Chamizo C., Rubio J.M., Moreno J., Alvar J. Semi-quantitative analysis of multiple cytokines in canine peripheral blood mononuclear cells by a single tube RT-PCR // Vet Immunol Immunopathol. 2001. V. 83(3-4). P. 191-202.

25. Chappell S.A., Edelman G.M., Mauro V.P. Biochemical and functional analysis of a 9-nt RNA sequence that affects translation efficiency in eukaryotic cells // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. V. 101(26). P. 9590-4.

26. Chen C.Y., Shyu A.B. AU-rich elements: characterization and importance in mRNA degradation // Trends Biochem Sci. 1995. V. 20(11). P. 465-70. Review.

27. Chen Y., Kamat V., Dougherty E.R., Bittner M.L., Meltzer P.S., Trent J.M. Ratio statistics of gene expression levels and applications to microarray data analysis // Bioinformatics. 2002. V. 18(9). P. 1207-15.

28. Chen C.Z., Li L., Lodish H.F., Bartel D.P. MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation. Science. 2004. V. 303(5654). P. 83-6.

29. Chikaraishi D.M. Complexity of cytoplasmic polyadenylated and nonpolyadenylated rat brain ribonucleic acids //Biochemistry. 1979. V. 18(15). P. 3249-56.

30. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction//Anal Biochem. 1987. V. 162(1). P. 156-9.

31. Clark A.R., Docherty K. Negative regulation of transcription in eukaryotes // Biochem J. 1993. V. 296. P. 521-41.

32. Сок S.J., Morrison A.R. The 3'-untranslated region of murine cyclooxygenase-2 contains multiple regulatory elements that alter message stability and translational efficiency // J Biol Chem. 2001. V. 276(25). P. 23179-85.

33. Colantuoni C., Purcell A.E., Bouton C.M., Pevsner J. High throughput analysis of gene expression in the human brain // J Neurosci Res. 2000. V. 59(1). P. 1-10. Review.

34. Costessi L., Devescovi G., Baralle F.E., Muro A.F. Brain-specific promoter and polyadenylation sites of the beta-adducin pre-mRNA generate an unusually long 3'-UTR //Nucleic Acids Res. 2006. V. 34(1). P. 243-53.

35. Cottage A.J., Edwards Y.J., Elgar G. API genes in Fugu indicate a divergent transcriptional control to that of mammals // Mamm Genome. 2003. V. 14(8). P. 514-25.

36. Creancier L., Mercier P., Prats A.C., Morello D. C-myc Internal ribosome entry site activity is developmentally controlled and subjected to a strong translational repression in adult transgenic mice // Mol Cell Biol. 2001. V. 21(5). P. 1833-40.

37. Crosio C., Boyl P.P., Loreni F., Pierandrei-Amaldi P., Amaldi F. La protein has a positive effect on the translation of TOP mRNAs in vivo // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28(15). P. 2927-34.

38. Dahanukar A., Wharton R.P. The Nanos gradient in Drosophila embryos is generated by translational regulation // Genes Dev. 1996. V. 10(20). P. 2610-20.

39. Datson N. A., van der Perk-de Jong J., van den Berg M.P., de Kloet E.R., Vreugdenhil E. MicroSAGE: a modified procedure for serial analysis of gene expression in limited amounts of tissue// Nucleic Acids Res. 1999. V. 27(5). P. 1300-7.

40. Denli A.M., Tops B.J., Plasterk R.H., Ketting R.F., Hannon G.J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex // Nature. 2004. V. 432. P. 231-235.

41. Dupays L., Mazurais D., Rucker-Martin C., Calmels Т., Bernot D., Cronier L., Malassine A., Gros D., Theveniau-Ruissy M. Genomic organization and alternative transcripts of the human Connexin40 gene // Gene. 2003. V. 305(1). P. 79-90.

42. Duret L., Mouchiroud D., Gautier C. Statistical analysis of vertebrate sequences reveals that long genes are scarce in GC-rich isochors // J Mol Evol. 1995. V. 40(3). P. 308-17.

43. Duthie S.M., Taylor P.L., Anderson L., Cook J., Eidne K.A. Cloning and functional characterization of the human TRH receptor // Mol. Cell Endocrinol. 1993. V. 95(1-2). P. 11-5.

44. Eastwood S.L., Harrison P.J. Hippocampal synaptic pathology in schizophrenia, bipolar disorder and major depression: a study of complexin mRNAs // Mol Psychiatry. 2000. V. 5(4). P. 425-32.

45. Ebihara M., Ohba H., Kikuchi M., Yoshikawa T. Structural characterization and promoter analysis of human potassium channel Kv8.1 (KCNV1) gene // Gene. 2004. V. 325. P.89-96.

46. Eckhart L., Kittel C., Gawlas S., Gruber F., Mildner M., Jilma В., Tschachler E. Identification of a novel exon encoding the amino-terminus of the predominant caspase-5 variants // Biochem Biophys Res Commun. 2006. V. 348(2). P. 682-8.

47. Edwardson J.M., Wang C.T., Gong В., Wyttenbach A., Bai J., Jackson M.B., Chapman E.R., Morton A J. Expression of mutant huntingtin blocks exocytosis in PC12 cells by depletion of complexin II //J Biol Chem. 2003. V. 278(33). P. 30849-53.

48. Engels B.M., Hutvagner G. Principles and effects of microRNA-mediated post-transcriptional gene regulation// Oncogene. 2006. V. 25(46). P. 6163-9.

49. Ernoult-Lange M., Kress M., Hamer D. A gene that encodes a protein consisting solely of zinc finger domains is preferentially expressed in transformed mouse cells // Mol Cell Biol. 1990. V. 10(1). P. 418-21.

50. Fedorova L.V., Dizadex I., Fedorov A.N., Ryskov A.P. In silico analysis of the restriction fragments length distribution in the human genome // Genetika. 2001. V. 37(4). P. 456-66.

51. Fernandez J., Yaman I., Mishra R., Merrick W.C., Snider M.D., Lamers W.H., Hatzoglou M. Internal ribosome entry site-mediated translation of a mammalian mRNA is regulated by amino acid availability// J Biol Chem. 2001. V. 276(15). P. 12285-91.

52. Fernandez-Miragall O., Martinez-Salas E. Structural organization of a viral IRES depends on the integrity of the GNRA motif// RNA. 2003. V. 9(11). P. 1333-44.

53. Ferrandon D., Elphick L., Nusslein-Volhard C., St Johnston D. Staufen protein associates with the 3'UTR of bicoid mRNA to form particles that move in a microtubule-dependent manner//Cell. 1994. V. 79(7). P. 1221-32.

54. Freeman W., Morton AJ. Differential messenger RNA expression of complexins in mouse brain // Brain Res Bull. 2004. V. 63(1). P. 33-44.

55. Friday R.P., Pietropaolo S.L., Profozich J., Trucco M., Pietropaolo M. Alternative core promoters regulate tissue-specific transcription from the autoimmune diabetes-related ICA1 (ICA69) gene locus // J. Biol. Chem. 2003. V. 278(2). P. 853-63.

56. Gallouzi I.E., Brennan C.M., Stenberg M.G., Swanson M.S., Eversole A., Maizels N., Steitz J.A. HuR binding to cytoplasmic mRNA is perturbed by heat shock // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. V. 97(7). P. 3073-8.

57. Gamberi C., Peterson D.S., He L., Gottlieb E. An anterior function for the Drosophila posterior determinant Pumilio//Development. 2002. V. 129(11). P. 2699-710.

58. Geek P., Medveczky M.M., Chou C.S., Brown A., Cus J., Medveczky P.G. Herpesvirus saimiri small RNA and interleukin-4 mRNA AUUUA repeats compete for sequence-specific factors including a novel 70K protein // J Gen Virol. 1994. V. 75. P. 2293-301.

59. Gill R.W., Hodgman T.C., Littler C.B., Oxer M.D., Montgomery D.S., Taylor S., Sanseau P. A new dynamic tool to perform assembly of expressed sequence tags (ESTs) // Comput Appl Biosci. 1997. V. 13(4). P. 453-7.

60. Gill R.W., Sanseau P. Rapid in silico cloning of genes using expressed sequence tags (ESTs) // Biotechnol Annu Rev. 2000. V. 5. P. 25-44. Review.

61. Gillis P., Malter J.S. The adenosine-uridine binding factor recognizes the AU-rich elements of cytokine, Iymphokine, and oncogene mRNAs // J Biol Chem. 1991. V. 266(5). P. 3172-7.

62. Ginsberg S.D., Hemby S.E., Lee V.M., Eberwine J.H., Trojanowski J.Q. Expression profile of transcripts in Alzheimer's disease tangle-bearing CA1 neurons // Ann Neurol.2000. V. 48(1). P. 77-87.

63. Glynn D., Bortnick R.A., Morton A.J. Complexin II is essential for normal neurological function in mice // Hum Mol Genet. 2003. V. 12(19). P. 2431-48.

64. Good P.J. A conserved family of elav-like genes in vertebrates // Proc Natl Acad Sci U S A. 1995. V. 92(10). P. 4557-61.

65. Gong M., Cowan K.H., Gudas J., Moscow J.A. Isolation and characterization of genomic sequences involved in the regulation of the human reduced folate carrier gene (RFC1) // Gene. 1999. V. 233(1-2). P. 21-31.

66. Gordon-Weeks P.R., Fischer I. MAP1B expression and microtubule stability in growing and regenerating axons // Microsc Res Tech. 2000. V. 48(2). P. 63-74. Review.

67. Gosden R.G. Oogenesis as a foundation for embryogenesis // Mol Cell Endocrinol. 2002. V. 186(2). P. 149-53. Review.

68. Grabowski P.J., Black D.L. Alternative RNA splicing in the nervous system // Prog Neurobiol. 2001. V. 65(3). P. 289-308. Review.

69. Gray N.K., Wickens M. Control of translation initiation in animals // Annu Rev Cell Dev Biol. 1998. V. 14. P. 399-458. Review.

70. Gregory R.I., Chendrimada T.P., Shiekhattar R. MicroRNA biogenesis: isolation and characterization of the microprocessor complex // Methods Mol Biol. 2006. V. 342. P. 33-47. Review.

71. Groisman I., Huang Y.S., Mendez R., Cao Q., Richter J.D. Translational control of embryonic cell division by CPEB and maskin // Cold Spring Harb Symp Quant Biol.2001. V. 66. P. 345-51. Review.

72. Guigo R., Knudsen S., Drake N., Smith T. Prediction of gene structure // J Mol Biol. 1992. V. 226(1). P. 141-57.

73. Hamilton T.L., Stoneley M., Spriggs K.A., Bushell M. TOPs and their regulation // Biochem Soc Trans. 2006. V. 34(1). P. 12-6.

74. Hammarback J.A., Obar R.A., Hughes S.M., Vallee R.B. MAP1B is encoded as a polyprotein that is processed to form a complex N-terminal microtubule-binding domain //Neuron. 1991. V. 7(1). P. 129-39.

75. Harrison P.M., Arosio P. The ferritins: molecular properties, iron storage function and cellular regulation // Biochim Biophys Acta. 1996. V. 1275(3). P, 161-203. Review.

76. Henics Т., Sanfridson A., Hamilton B.J., Nagy E., Rigby W.F. Enhanced stability of interleukin-2 mRNA in MLA 144 cells. Possible role of cytoplasmic AU-rich sequence-binding proteins // J Biol Chem. 1994. V. 269(7). P. 5377-83.

77. Holcik M., Sonenberg N., Korneluk R.G. Internal ribosome initiation of translation and the control of cell death // Trends Genet. 2000. V. 16(10). P. 469-73.

78. Hollams E.M., Giles K.M., Thomson A.M., Leedman PJ. MRNA stability and the control of gene expression: implications for human disease // Neurochem Res. 2002. V. 27(10). P. 957-80.

79. Hong Y.K., Ontiveros S.D., Strauss W.M. A revision of the human XIST gene organization and structural comparison with mouse Xist // Mamm Genome. 2000. V. 11(3). P. 220-4.

80. Huggett J., Dheda K., Bustin S., Zumla A. Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations // Genes Immun. 2005. V. 6(4). P. 279-84.

81. Hutvagner G., McLachlan J., Pasquinelli A.E., Balint E., Tuschl Т., Zamore P.D. A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA // Science. 2001. V. 293(5531). P. 834-8.

82. Iacono M., Mignone F., Pesole G. uAUG and uORFs in human and rodent 5'-untranslated mRNAs // Gene. 2005. V. 349. P. 97-105.

83. Ishizuka Т., Saisu H., Odani S., Abe T. Synaphin: a protein associated with the docking/fusion complex in presynaptic terminals // Biochem Biophys Res Commun. 1995. V. 213(3). P. 1107-14.

84. Ishizuka Т., Saisu H., Odani S., Kumanishi Т., Abe T. Distinct regional distribution in the brain of messenger RNAs for the two isoforms of synaphin associated with the docking/fusion complex //Neuroscience. 1999. V. 88(1). P. 295-306.

85. Ishizuka Т., Saisu H., Suzuki Т., Kirino Y., Abe T. Molecular cloning of synaphins/complexins, cytosolic proteins involved in transmitter release, in the electric organ of an electric ray (Narke japonica) // Neurosci Lett. 1997. V. 232(2). P. 107-10.

86. Ish-Horowicz D., Burke J.F. Rapid and efficient cosmid cloning // Nucleic Acids Res. 1981. V. 9(13). P. 2989-98.

87. Itakura M., Misawa H., Sekiguchi M., Takahashi S., Takahashi M. Transfection analysis of functional roles of complexin I and II in the exocytosis of two different types of secretory vesicles // Biochem Biophys Res Commun. 1999. V. 265(3). P. 691-6.

88. Jansen R.P. mRNA localization: message on the move // Nat Rev Mol Cell Biol. 2001. V. 2(4). P. 247-56. Review.

89. Jensen L.E., Whitehead A.S. The 3' untranslated region of the membrane-bound IL-1R accessory protein mRNA confers tissue-specific destabilization // J Immunol. 2004. V. 173(10). P. 6248-58.

90. Jin X., Turcott E., Englehardt S., Mize G.J., Morris D.R. The two upstream open reading frames of oncogene mdm2 have different translational regulatory properties // J Biol Chem. 2003. V. 278(28). P. 25716-21.

91. Joseph R., Dou D., Tsang W. Molecular cloning of a novel mRNA (neuronatin) that is highly expressed in neonatal mammalian brain // Biochem Biophys Res Commun. 1994. V. 201(3). P. 1227-34.

92. Kaplan B.B., Schachter B.S., Osterburg H.H., de Vellis J.S., Finch C.E. Sequence complexity of polyadenylated RNA obtained from rat brain regions and cultured rat cells of neural origin // Biochemistry. 1978. V. 17. P. 5516-24.

93. Kikuchi Т., Ichikawa M., Arai J., Tateiwa H., Fu L., Higuchi K., Yoshimura N. Molecular cloning and characterization of a new neuron-specific homologue of rat polypyrimidine tract binding protein // J Biochem (Tokyo). 2000. V.128(5). P. 811-21.

94. Kim H.Y., Gladyshev V.N. Alternative first exon splicing regulates subcellular distribution of methionine sulfoxide reductases // BMC Mol Biol. 2006.V. 7. P. 11.

95. Kim S.H., Shim K.S., Lubec G. Human brain nascent polypeptide-associated complex alpha subunit is decreased in patients with Alzheimer's disease and Down syndrome // J Investig Med. 2002. V. 50(4). P. 293-301.

96. Kim S.Y., Chao W., Choi S.Y., Volsky D.J. Cloning and characterization of the 3'-untranslated region of the human excitatory amino acid transporter 2 transcript // J Neurochem. 2003. V. 86(6). P. 1458-67.

97. Kim Y.U., Rus H.G., Fisher S.N., Pitha P.M., Shin M.L. Binding of a protein to an AU-rich domain of tumour necrosis factor alpha mRNA as a 35 kDa complex and its regulation in primary rat astrocytes // Biochem J. 1996. V. 316. P. 455-60.

98. Kohler S.A., Henderson B.R., Kuhn L.C. Succinate dehydrogenase b mRNA of Drosophila melanogaster has a functional iron-responsive element in its 5-untranslated region // J Biol Chem. 1995. V. 270(51). P. 30781-6.

99. Kojima M., Morozumi Т., Onishi A., Mitsuhashi T. Structure of the pig sterol 14alpha-demethylase (CYP51) gene and its expression in the testis and other tissues // J Biochem (Tokyo). 2000. V. 127(5). P. 805-11.

100. Kotite L., Zhang L.H., Yu Z., Burlingame A.L., Havel R.J. Human apoC-IV: isolation, characterization, and immunochemical quantification in plasma and plasma lipoproteins // J Lipid Res. 2003. V. 44(7). P. 1387-94.

101. Kozak M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs

102. Nucleic Acids Res. 1987. V. 15(20). P. 8125-48. Review.

103. Kozak M. Context effects and inefficient initiation at non-AUG codons in eucaryotic cell-free translation systems // Mol. Cell. Biol. 1989. V. 9. P. 5073-80.

104. Kozak M. Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes // Gene. 1999. V. 234(2). P. 187-208. Review.

105. Kozak M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes // Cell. 1986. V. 44. P. 283-92.

106. Kozak M. The scanning model for translation: an update // J Cell Biol. 1989. V. 108(2). P. 229-41. Review.

107. Kuersten S., Goodwin E.B. The power of the 3' UTR: translational control and development // Nat Rev Genet. 2003. V. 4(8). P. 626-37. Review.

108. Kutschera W., Zauner W., Wiche G., Propst F. The mouse and rat MAP1B genes: genomic organization and alternative transcription // Genomics. 1998. V. 49(3). P. 4306.

109. Lachance P.E., Chaudhuri A. Microarray analysis of developmental plasticity in monkey primary visual cortex // J Neurochem. 2004. V. 88(6). P. 1455-69.

110. Lai E.C., Burks C., Posakony J.W. The К box, a conserved 3' UTR sequence motif, negatively regulates accumulation of enhancer of split complex transcripts // Development. 1998. V. 125(20). P. 4077-88.

111. Lai E.C., Posakony J.W. The Bearded box, a novel 3' UTR sequence motif, mediates negative post-transcriptional regulation of Bearded and Enhancer of split Complex gene expression//Development. 1997. V. 124(23). P. 4847-56.

112. Lai E.C., Tarn В., Rubin G.M. Pervasive regulation of Drosophila Notch target genes by GY-box-, Brd-box-, and K-box-class microRNAs // Genes Dev. 2005. V. 19(9). P. 1067-80.

113. Lantz V., Schedl P. Multiple cis-acting targeting sequences are required for orb mRNA localization during Drosophila oogenesis // Mol Cell Biol. 1994. V. 14(4). P. 2235-42.

114. Le S.Y., Maizel J.V. A common RNA structural motif involved in the internal initiation of translation of cellular mRNAs // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25(2). P. 362-69.

115. Lee C.J., Chan W.I., Scotting P.J. CIC, a gene involved in cerebellar development and ErbB signaling, is significantly expressed in medulloblastomas // J Neurooncol. 2005. V. 73(2). P. 101-8.

116. Lee J., Park E.H., Couture G., Harvey I., Garneau P., Pelletier J. An upstream open reading frame impedes translation of the huntingtin gene // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30(23). P. 5110-9.

117. Leibold E.A. and Guo B. Iron-dependent regulation of ferritin and transferrin receptor expression by iron responsive element binding protein // Annu Rev Nutr. 1992. V. 12. P. 345-68. Review.

118. Leviten M.W., Posakony J.W. Gain-of-function alleles of Bearded interfere with alternative cell fate decisions in Drosophila adult sensory organ development // Dev Biol. 1996. V. 176(2). P. 264-83.

119. Levy A.P., Levy N.S., Goldberg M.A. Post-transcriptional regulation of vascular endothelial growth factor by hypoxia // J Biol Chem. 1996. V. 271(5). P. 2746-53.

120. Liang P., Pardee A. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction // Science. 1992. V. 257(5072). P. 967-71.

121. Lien, L.L., Feener С.A., Fischbach N and Kunkel L.M. Cloning of human microtubule-associated protein IB and the identification of a related gene on chromosome 15 // Genomics. 1994. V. 22(2). P. 273-80.

122. Lipshitz H.D., Smibert C.A. Mechanisms of RNA localization and translational regulation // Curr Opin Genet Dev. 2000. V. 10(5). P. 476-88. Review.

123. Liu D., Fischer I. Isolation and sequencing of the 5' end of the rat microtubule-associated protein (MAPlB)-encoding cDNA // Gene. 1996. V. 171(2). P. 307-8.

124. Liu D., Fischer I. Two alternative promoters direct neuron-specific expression of the rat microtubule-associated protein IB gene // J Neurosci. 1996. V. 16(16). P. 5026-36.

125. Lo D., Hilbush В., Sutcliffe J.G. TOGA analysis of gene expression to accelerate target development//Eur J PharmSci. 2001. V. 14(3). P. 191-6.

126. Locatelli F., Magnani E., Vighi C., Lanzanova C., Coraggio I. Inhibitory effect of myb7 uORF on downstream gene expression in homologous (rice) and heterologous (tobacco) systems // Plant Mol Biol. 2002. V. 48(3). P. 309-18.

127. Lopez de Heredia M., Jansen R.P. mRNA localization and the cytoskeleton // Curr Opin Cell Biol. 2004. V. 16(1). P. 80-5. Review.

128. Macdonald P.M., Kerr K., Smith J.L., Leask A. RNA regulatory element BLE1 directs the early steps of bicoid mRNA localization // Development. 1993. V. 118(4). P. 123343.

129. Mandel S., Weinreb O., Youdim M.B. Using cDNA microarray to assess Parkinson's disease models and the effects of neuroprotective drugs // Trends Pharmacol Sci. 2003. V. 24(4). P. 184-91. Review.

130. Mann S.S., Hammarback J.A. Molecular characterization of light chain 3. A microtubule binding subunit of MAP1A and MAP IB // J Biol Chem. 1994. V. 269(15). P. 11492-7.

131. Martinez-Salas E., Ramos R., Lafuente E., Lopez de Quinto S. Functional interactions in internal translation initiation directed by viral and cellular IRES elements // J Gen Virol. 2001. V. 82. P. 973-84. Review.

132. Mazumder В., Seshadri V., Fox P.L. Translational control by the З'-UTR: the ends specify the means // Trends Biochem Sci. 2003. V. 28(2). P. 91-8. Review.

133. McClelland M., Mathieu-Daude F., Welsh J. RNA fingerprinting and differential display using arbitrarily primed PCR//Trends Genet. 1995. V. 11. P. 242-6.

134. McMahon H.T., Missler M., Li C., Sudhof T.C. Complexins: cytosolic proteins that regulate SNAP receptor function // Cell. 1995. V. 83(1). P. 111-9.

135. Mei В., Li C., Dong S., Jiang C.H., Wang H., Hu Y. Distinct gene expression profiles in hippocampus and amygdala after fear conditioning // Brain Res Bull. 2005. V. 67(1-2). P. 1-12.

136. Meijer H.A., Thomas A.A. Control of eukaryotic protein synthesis by upstream open reading frames in the 5'-untranslated region of an mRNA // Biochem J. 2002. V. 367. P. 1-11. Review.

137. Meixner A., Wiche G., Propst F. Analysis of the mouse MAP1B gene identifies a highly conserved 4.3 kb 3'-untranslated region and provides evidence against the proposed structure of DBI-1 cDNA // Biochim Biophys Acta. 1999. V. 1445(3). P. 345-50.

138. Mendez R., Richter J.D. Translational control by CPEB: a means to the end // Nat Rev Mol Cell Biol. 2001. V. 2(7). P. 521-9. Review.

139. Meric F., Searfoss A.M., Wormington M., Wolffe A.P. Masking and unmasking maternal mRNA. The role of polyadenylation, transcription, splicing, and nuclear history // J Biol Chem. 1996. V. 271(48). P. 30804-10.

140. Meyuhas O. Synthesis of the translational apparatus is regulated at the translational level // Eur J Biochem. 2000. V. 267(21). P. 6321-30. Review.

141. Mignone F., Gissi C., Liuni S., Pesole G. Untranslated regions of mRNAs // Genome Biol. 2002. V. 3(3). Review.

142. Milanesi L., D'Angelo D., Rogozin I.B. GeneBuilder: interactive in silico prediction of gene structure//Bioinformatics. 1999. V. 15(7-8). P. 612-21.

143. Milner R.J. and Sutcliffe J.G. Gene expression in rat brain // Nucleic Acids Res. 1983. V. 11(16). P. 5497-520.

144. Milner R.J., Bloom F.E., Sutcliffe J.G. Brain-specific genes: strategies and issues // Curr Top Dev Biol. 1987. V. 21. P. 117-50. Review.

145. Mirnick К., Middleton F.A., Marquez A., Lewis D.A., Levitt P. Molecular characterization of schizophrenia viewed by microarray analysis of gene expression in prefrontal cortex // Neuron. 2000. V. 28(1). P. 53-67.

146. Missler M., Sudhof T.C. Neurexins: three genes and 1001 products // Trends Genet. 1998. V. 14(1). P. 20-6. Review.

147. Muller W.E., Slor H., Pfeifer K., Huhn P., Век A., Orsulic S., Ushijima H., Schroder H.C. Association of AUUUA-binding protein with A+U-rich mRNA during nucleo-cytoplasmic transport // J Mol Biol. 1992. V. 226(3). P. 721-33.

148. Murphy L.D., Herzog C.E., Rudick J.B., Fojo A.T., Bates S.E. Use of the polymerase chain reaction in the quantitation of mdr-1 gene expression // Biochemistry. 1990. V. 29(45). P. 10351-6.

149. Musunuru K. Cell-specific RNA-binding proteins in human disease // Trends Cardiovasc Med. 2003. V. 13(5). P.188-95.

150. Myer V.I., Fan X.N., Steitz J.A. Identification of Hur as a protein implicated in AUUUA-mediated mRNA decay// EMBO J. 1997. V. 16(8). P. 2130-9.

151. Nagy E. and Rigby W.F. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase selectively binds AU-rich RNA in the NAD(+)-binding region (Rossmann fold) // J. Biol. Chem. 1995. V. 270(6). P. 2755-63.

152. Narayanan C.S., Fujimoto J., Geras-Raaka E., Gershengorn M.C. Regulation by thyrotropin-releasing hormone (TRH) of TRH receptor mRNA degradation in rat pituitary GH3 cell // J. Biol. Chem. 1992. V. 267(24). P. 17296-303.

153. Nave A., Kashi Y., Soller M. Minisatellite and microsatellite length variation at a complex bovine VNTR locus // Anim Genet. 1997. V. 28(1). P. 52-4.

154. Noble M., Lewis S.A., Cowan N.J. The microtubule binding domain of microtubule-associated protein MAP1B contains a repeated sequence motif unrelated to that of MAP2 and tau // J Cell Biol. 1989. V. 109. P. 3367-76.

155. Noh S.J., Lee K., Paik H., Hur C.G. TISA: Tissue-specific Alternative Splicing in Human and Mouse Genes // DNA Res. 2006. V. 13(5). P. 229-43

156. Okano H., Imai Т., Okabe M. Musashi: a translational regulator of cell fate // J Cell Sci. 2002. V. 115. P. 1355-9. Review.

157. Ostareck D.H., Ostareck-Lederer A., Shatsky I.N., Hentze M.W. Lipoxygenase mRNA silencing in erythroid differentiation: The 3'UTR regulatory complex controls 60S ribosomal subunit joining// Cell. 2001. V. 104(2). P. 281-90.

158. Ostareck-Lederer A., Ostareck D.H. Control of mRNA translation and stability in haematopoietic cells: the function of hnRNPs К and E1/E2 // Biol Cell. 2004. V. 96(6). P. 407-11. Review.

159. Ouchi Y., Kubota Y., Ito C. Serial analysis of gene expression in methamphetamine-and phencyclidine-treated rodent cerebral cortices: are there common mechanisms? // Ann N Y Acad Sci. 2004. V. 1025. P. 57-61.

160. Pabst S., Hazzard J.W., Antonin W., Sudhof T.C., Jahn R., Rizo J., Fasshauer D. Selective interaction of complexin with the neuronal SNARE complex. Determination of the binding regions // J Biol Chem. 2000. V. 275(26). P. 19808-18.

161. Pandey A., Lewitter F. Nucleotide sequence databases: a gold mine for biologists // Trends Biochem Sci. 1999. V. 24(7). P. 276-80.

162. Pelletier J., Kaplan G., Racaniello V.R., Sonenberg N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5' noncoding region // Cell Biol. 1988. V. 8(3). P. 1103-12.

163. Peng S.S., Chen C.Y., Shyu A.B. Functional characterization of a non-AUUUA AU-rich element from the c-jun proto-oncogene mRNA: evidence for a novel class of AU-rich elements //Mol Cell Biol. 1996. V. 16(4). P. 1490-9.

164. Pesole G., Bernardi G., Saccone C. Isochore specificity of AUG initiator context of human genes // FEBS Lett. 1999. V. 464(1-2). P. 60-2.

165. Pesole G., Mignone F., Gissi C., Grillo G., Licciulli F., Liuni S. Structural and functional features of eukaryotic mRNA untranslated regions // Gene. 2001. V. 276(1-2). P. 73-81. Review.

166. Petrik J. Diagnostic applications of microarrays // Transfus Med. 2006. V. 16(4). P. 23347. Review.

167. Plant M.H., Laneuville 0. Characterization of a novel transcript of prostaglandin endoperoxide H synthase 1 with a tissue-specific profile of expression // Biochem J. 1999. V. 344. P. 677-85.

168. Pongrac J., Middleton F.A., Lewis D.A., Levitt P., Mimics K. Gene expression profiling with DNA microarrays: advancing our understanding of psychiatric disorders // Neurochem Res. 2002. V. 27(10). P. 1049-63. Review.

169. Reimann I., Huth A., Thiele H., Thiele B.J. Suppression of 15-lipoxygenase synthesis by hnRNP El is dependent on repetitive nature of LOX mRNA З'-UTR control element DICE // J Mol Biol. 2002. V. 315(5). P. 965-74.

170. Rhyner T.A., Biguet N.F., Berrard S., Borbely A.A., Mallet J. An efficient approach for the selective isolation of specific transcripts from complex brain mRNA populations // J Neurosci Res. 1986. V. 16(1). P. 167-81.

171. Richardson D.R. and Ponka P. The molecular mechanisms of the metabolism and transport of iron in normal and neoplastic cells // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1331(1). P. 1-40.

172. Rieger P.T. The role of oncology nurses in gene therapy // Lancet Oncol. 2001. V. 2(4). P. 233-8.

173. Roberts G.C., Smith C.W. Alternative splicing: combinatorial output from the genome // Curr Opin Chem Biol. 2002. V. 6(3). P. 375-83.

174. Rogozin I.B., Kochetov A.V., Kondrashov F.A., Koonin E.V., Milanesi L. Presence of ATG triplets in 5' untranslated regions of eukaryotic cDNAs correlates with a 'weak' context of the start codon // Bioinformatics. 2001. V. 17(10). P. 890-900.

175. Rougvie A.E. Control of developmental timing in animals // Nat Rev Genet. 2001. V. 2(9). P. 690-701. Review.

176. Ryan M., Starkey M., Faull R., Emson P., Bahn S. Indexing-based differential display -studies on post-mortem Alzheimer's brains // Brain Res Mol Brain Res. 2001. V. 88(1-2). P. 199-202.

177. Sartorius L.J., Nagappan G., Lipska B.K., Lu В., Sei Y., Ren-Patterson R., Li Z., Weinberger D.R., Harrison P.J. Alternative splicing of human metabotropic glutamate receptor 3 // J Neurochem. 2006. V. 96(4). P. 1139-48.

178. Shao Y., Ismail-Beigi F. Different Na, K-ATPase mRNA(betal) species exhibit unique translational efficiencies // Arch Biochem Biophys. 2001. V. 390(1). P. 78-86.

179. Shilling P.D., Kelsoe J.R. Functional genomics approaches to understanding brain disorders // Pharmacogenomics. 2002. V. 3(1). P. 31-45. Review.

180. Schuur E.R., McPherson L.A., Yang G.P., Weigel RJ. Genomic structure of the promoters of the human estrogen receptor-alpha gene demonstrate changes in chromatin structure induced by AP2gamma// J Biol Chem. 2001. V. 276(18). P. 15519-26.

181. Siu I.M., Lai A., Blankenship J.R., Aldosari N., Riggins GJ. c-Myc promoter activation in medulloblastoma // Cancer Res. 2003. V. 63(16). P. 4773-6.

182. Slack F.J., Basson M., Liu Z., Ambros V., Horvitz H.R., Ruvkun G. The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor// Mol Cell. 2000. V. 5(4). P. 659-69.

183. Smale S.T. Core promoters: active contributors to combinatorial gene regulation // Genes Dev. 2001. V. 15(19). P. 2503-8. Review.

184. Stayner S.K., Cunliffe H.E., Ward T.A., Eccles M.R. Cloning and characterization of the human PAX2 promoter // J Biol Chem. 1998. V. 273(39). P. 25472-9.

185. Stein I., Itin A., Einat P., Skaliter R., Grossman Z., Keshet E. Translation of vascular endothelial growth factor mRNA by internal ribosome entry: implications for translation under hypoxia //Mol Cell Biol. 1998. V. 18(6). P. 3112-9.

186. Stone D.M., Nikolics K. Tissue- and age-specific expression patterns of alternatively spliced agrin mRNA transcripts in embryonic rat suggest novel developmental roles // J Neurosci. 1995. V. 15(10). P. 6767-78.

187. Stutz A., Conne В., Huarte J., Gubler P., Volkel V., Flandin P., Vassalli J.D. Masking, unmasking, and regulated polyadenylation cooperate in the translational control of a dormant mRNA in mouse oocytes // Genes Dev. 1998. V. 12(16). P. 2535-48.

188. Sutcliffe J.G. mRNA in the mammalian central nervous system // Annu Rev Neurosci. 1988. V. 11. P. 157-98. Review.

189. Sutcliffe J.G. Open-system approaches to gene expression in the CNS // J Neurosci. 2001. V. 21(21). P. 8306-9. Review.

190. Sweeney R., Fan Q., Yao M.C. Antisense ribosomes: rRNA as a vehicle for antisense RNAs // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V. 93(16). P. 8518-23.

191. Takahashi Y. Gene expression in cells of the central nervous system // Prog Neurobiol. 1992. V. 38(6). P. 523-69. Review.

192. Takahashi S., Ujihara H., Huang G.Z., Yagyu K.I., Sanbo M., Kaba H, Yagi T. Reduced hippocampal LTP in mice lacking a presynaptic protein: complexin II // Eur J Neurosci. 1999. V. 11(7). P. 2359-66.

193. Theil E.C. and Eisenstein R.S. Combintorial mRNA regulation: iron regulatory proteins and iso-iron-responsive elements (Iso-IREs) // J. Biol. Chem. 2000. V. 275(52). P. 40659-62.

194. Thiele B.J., Berger M., Huth A., Reimann I., Schwarz K., Thiele H. Tissue-specific translational regulation of alternative rabbit 15-lipoxygenase mRNAs differing in their 3'-untranslated regions // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27(8). P. 1828-36.

195. Thomson A.M., Rogers J.T., Leedman P.J. Iron regulatory proteins, iron-responsive elements and ferritin mRNA translation // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999. V. 31(10). P. 1139-52. Review.

196. Thyagarajan A., Szaro B.G. Phylogenetically conserved binding of specific К homology domain proteins to the 3'-untranslated region of the vertebrate middle neurofilament mRNA // J Biol Chem. 2004. V. 279(48). P. 49680-8.

197. Timchenko N.A., Welm A.L., Lu X., Timchenko L.T. CUG repeat binding protein (CUGBP1) interacts with the 5' region of C/EBPbeta mRNA and regulates translation of C/EBPbeta isoforms // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27(22). P. 4517-25.

198. Tranque P., Ни M.C., Edelman G.M., Mauro V.P. rRNA complementarity within mRNAs: a possible basis for mRNA-ribosome interactions and translational control // Proc Natl Acad Sci USA. 1998. V. 95(21). P. 12238-43.

199. Vagner S., Galy В., Pyronnet S. Irresistible IRES. Attracting the translation machinery to internal ribosome entry sites // EMBO Rep. 2001. V. 2(10). P. 893-8. Review.

200. Van der Velden A.W., Thomas A.A. The role of the 5' untranslated region of an mRNA in translation regulation during development // Int J Biochem Cell Biol. 1999. V. 31(1). P. 87-106. Review.

201. Vandecandelaere A., Pedrotti В., Utton M.A., Calvert R.A., Bayley P.M. Differences in the regulation of microtubule dynamics by micro tubule-associated proteins MAP IB and MAP2 // Cell Motil Cytoskeleton. 1996. V. 35(2). P. 134-46.

202. Velculescu V.E., Vogelstein В., Kinzler K.W. Analysing uncharted transcriptomes with SAGE // Trends Genet. 2000. V. 16. P. 423-5.

203. Velculescu V.E., Zhang L., Vogelstein В., Kinzler K.W. Serial analysis of gene expression // Science. 1995. V. 270(5235). P. 484-7.

204. Walter M.A., Spillett D.J., Thomas P., Weissenbach J., Goodfellow P.N. A method for constructing radiation hybrid maps of whole genomes // Nat Genet. 1994. V. 7(1). P. 228.

205. Whitney L.W., Becker K.G., Tresser N.J., Caballero-Ramos C.I., Munson P.J., Prabhu V.V., Trent J.M., McFarland H.F., Biddison W.E. Analysis of gene expression in mutiple sclerosis lesions using cDNA microarrays // Ann Neurol. 1999. V. 46(3). P. 425-8.

206. Wickens M., Bernstein D.S., Kimble J., Parker R. A PUF family portrait: 3'UTR regulation as a way of life // Trends Genet. 2002. V. 18(3). P. 150-7. Review.

207. Wilkie G., Dickson K.S., Gray N.K. Regulation of mRNA translation by 5'- and 3'-UTR-binding factors // Trends Biochem Sci. 2003. V. 28(4). P. 182-8. Review.

208. Wilson K.E., Ryan M.M., Prime J.E., Pashby D.P., Orange P.R., O'Beirne G., Whateley J.G., Bahn S., Morris C.M. Functional genomics and proteomics: application in neurosciences // J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2004. V. 75(4). P. 529-38. Review.

209. Wilson Т., Treisman R. Removal of poly(A) and consequent degradation of c-fos mRNA facilitated by 3' AU-rich sequences // Nature. 1988. V. 336(6197). P. 396-9.

210. Wood T.L., Frantz G.D., Menkes J.H., Tobin A.J. Regional distribution of messenger RNAs in postmortem human brain // J Neurosci Res. 1986. V. 16(1). P. 311-24.

211. Wormington M. Unmasking the role of the 3' UTR in the cytoplasmic polyadenylation and translational regulation of maternal mRNAs // Bioessays. 1994. V. 16(8). P. 533-5. Review.

212. Wyse B.D., Linas S.L., Thekkumkara T.J, Functional role of a novel cis-acting element (GAGA box) in human type-1 angiotensin II receptor gene transcription // J Mol Endocrinol. 2000. V. 25(1). P. 97-108.

213. Yamada N., Yamaya M., Okinaga S., Nakayama K., Sekizawa K., Shibahara S., Sasaki H. Microsatellite polymorphism in the heme oxygenase-1 gene promoter is associated with susceptibility to emphysema // Am J Hum Genet. 2000. V. 66(1). P. 187-95.

214. Zauner W., Kratz J., Staunton J., Feick P., Wiche G. Identification of two distinct microtubule binding domains on recombinant rat MAP IB // Eur J Cell Biol. 1992. V. 57(1). P. 66-74.

215. Хочу выразить глубокую благодарность заведующей Отделом молекулярных основ генетики человека, профессору Светлане Андреевне Лимборской за предоставленную возможность выполнения научной работы и мудрое руководство.

216. Отдельное спасибо хочу сказать доктору биологических наук Петру Андреевичу Сломинскому и кандидату биологических наук Ирине Владыченской за все ценные советы и замечания, сделанные ими в ходе работы, готовность в любую минуту оказать помощь.

217. Сердечное спасибо Обориной М.В., Дмитриевой В.Г., Ставчанскому В.В. за их неоспоримый вклад в проведенные исследования, а также всем сотрудникам Отдела за доброжелательное отношение и понимание.

Информация о работе

Раевская, Наталья Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.03

Диссертация

Структурная организация и особенности экспрессии генов CPLX2 и MAP1B, активно функционирующих в мозге человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы