Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация и функционирование миофибриллярной фосфатазы и киназы легких цепей миозина гладких мышц

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация и функционирование миофибриллярной фосфатазы и киназы легких цепей миозина гладких мышц"

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ 1нститут б1ох!мп 1м. 0. В. Палладша

У' БАБ1ЙЧУК В1КТ0Р1Я СТАН1СЛАВ1ВНА

1ндекс УДК 591.175.4

СТРУКТУРНА 0РГАН13АЦ1Я I ФУНКЦЮНУВАННЯ МЮФ1БРИЛЯРН01 ФОСФАТАЗИ I К1НАЗИ ЛЕГКИХ ЛАНЦЮГ1В МЮЗИНУ ГЛАДЕНЬКИХ М'Я31В

03.00.04 - 61ОХ1МХЯ

АВТОРЕФЕРАТ дисертацП на здобуття наукового ступени кандидата б1ологччних наук

Ки1в - 1998

Дисертащею е рукопис.

Робота виконана в ЩЦ ф1зюлоги Кшвського ушверситету ¡меш Тараса Шевченка.

Науковий кepiвник - кандвдат бюлопчних наук, с.н.с.

Данилова Валентина Михайл1вна,

НД1 ф1зюлоп1 Кшвського ушверситету

¡меш Тараса Шевченка, зав. вщцшом бюф!зики.

Офщшш опоненти: доктор бюлопчних наук, професор

Васильев Олександр Миколайович, Кшвсысий ушверситет ¡мен! Тараса Шевченка, професор кафедри бюодш;

кандидат бюлопчних наук,с.н.с. Погр1бний Петро Васильевич,

1нститут експериментальноТ патолопТ, онкологи та радюбюлогп1м. Р.е. Кавецького НАН Украши, С.Н.С. ВЩДШу бюлоги пухлинно'1 КЛГГИНИ.

Пров1дна установа - 1нститут ф1зюлоги ¡м. О.О. Богомольця (в1ддш кровооб1гу) НАН Укра'ши, м. Кшв.

Захист вщбудеться 2 березня 1998 р. о 14 годиш на заЫданю спещагизован вченоУ ради Д 01.84.01 в 1нституп бюх1мп ¡м. О.В. Палладша НАН Украши (252601, Кшв-30, вул. Леонтовича, 9).

3 дисертащею можна ознайомитись у бгблютещ 1нституту бюхшп ¡м. О.В. Палладша НАН Украши.

Автореферат рсшсланий 30 с1чня 1998 р.

Вчений секретар ^

спец1ал1зовано! вченоТ ради /сс^рге-е***-^ ИрсенкоО.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Актуальн1сть проблеми. Гладеньк1 м'язи (ГМ) викликають жвавий imepec досл!дник1в перш за все тому, що вони приймають участь у функц1онуванн1 таких життево важливих органов i систем, як крово-HocHi та л1мфатичн1 судини, матка, трахея, сечов1д, шлунково-киш-ковий тракт та Irani. На сьогодШ встановлено, що основою регуляцП скоротливих процес1в ГМ е фосфорилювання м1озину - основного ско-ротливого б1лка м'яз1в.

Усп1хи у розвитку теорИ фосфорилювання-дефосфорилювання були досягнут1 завдяки глибокому вивченню к1нази (КЛЛМ) i фосфатази (ФЛЛМ) легких ланцюг1в м1озину. Кшаза i фосфатаза легких ланцюг1в м!озину е ключовими ферментами, що регулшть процеси скорочення та розслаблення гладеньких м'яз1в. КШаза, що е абсолютно неактивною у в!дсутност! Са2+ i капьмодулшу (КМ), представляе собою первин-ний молекулярний перемикач, активац1я якого викликае скорочення цього типу м'яз!в. Зростання концентрацП Miоплазматичного Са2 + приводить до утворення комплексу Са2+/КМ, який зв'язуеться з кша-зою i3 стех1ометр1бю 1 до 1 i, в1дпов!дно, активуе фермент. Акти-вована к!наза фосфоритов регуляторний легкий ланцюг (РЛЛ) м!озину, що приводить до цикл1чно! взаемодп м1ж головками м1озину i акти-новими ф1ламентами i, таким чином, до скорочення м'яза. Деактива-ц1я кшази при зменшеши концентрацП внутр!шньокл!тинного калыдю приводить до дефосфорилювання РЛЛ фосфатазою легких ланцюгis Mio-зину, що супроводжуеться дисоц!ац1ею актину i м!озину i, внаоидок цього, розслабленням м'яза.

В1дпоз!дно до найб1льш визнано! на даний час г1потези, актив-

HiCTb КЛЛМ регулюеться так званим псевдосубстратним ауто1нг1б1тор-

ним доменом, гомолог1чним до сайта фосфорилювання РЛЛ м!озину,

2 +

який блокуе активний центр фермента у в1дсутност1 Са /КМ (Kemp et al., 1987). Зв'язування КМ з к1назою усувае ауто!нг1бування, i таким чином активуе к!назу. Однак 1снують дан1, якг демонструють зв'язування модифшованого капьмодулшу з КЛЛМ без П активацП (VanBerkum and Means, 1991) 1 як1 свхдчать про те, що для функц1о-нування фермента, окр!м усування ауто1нг1бування, потр!бн1 додат-KOBi його модифшацП. В1домо також, що КЛЛМ за певних умов акти-вуеться кальмодулшом з високим ступеней кооперативное^, для пояснения яко1 було висунуто припущення про 1снування ол1гомерних форм К1нази з piзною спор1днен!стю до KM (Sobleszek, 1991).

- г -

Якщо властивост1 КЛЛМ вивчаються досить 1нтенсивно, то про властивост1 фосфатази легких ланцюг!в мхозину в1домо набагато мен-ше. На сьогодн! з гладеньких м'язхв ¡зольовано декхлька фосфатаз, як! можуть дефосфорилювати М10зин in vitro (Hartshorne, 1987). Але, по-перше, bcí вони мають дуке низьку субстратну специф1чн!сть i можуть дефосфорилювати багато i нших субстрат1в, а по-друге, вони були !зольованх з цитозольнох фракцП ГМ. У той же час СЛ1Д очхку-вати, що найб1льш можливим кандидатом на роль фосфатази, що дефос-форилюе мхозин in vivo, був би фермент tícho асоцшований 1з ско-ротливим апаратом.

Таким чином, незважаючи на значн! ycnixH, досягнут! при вив-ченн1 бшххм!чних механ1зм1в регуляцП процесхв скорочення i розс-лаблення ГМ, на сьогодн! ще залишаеться багато невивчених або не-достатньо вивчених питань, пов'язаних перш за все з додатковими (oKpiM аутохнг!бування) мехашзмами регуляцП активност1 КЛЛМ i з 1ден™ф1кацхею i характеризацхею ФЛЛМ.

Мета i задач! дослхджень. Метою данох робота було висвхтлити роль модифшацш стгомерного типу в регуляцП активност! КЛЛМ i досл!дити особливост! структурно! органхзацх! i функц!онування Mi-оф!брилярно! фосфатази легких ланцюг1в мюзину гладеньких м'яз1в.

Для досягнення qiei мети були поставлен! сл1дуюч! задачх:

- довести !снування ол1гомерних форм КЛЛМ, використовуючи метод ковалентного зшивання, охарактеризувати ix, встано-вити механ!зми íx утворення i досл3.дити фактори, hkí впли-вають на розподхл ол!гомерних форм к!нази;

- вивчити вплив сшгомеризацП КЛЛМ на II активн1сть;

- вид!лити фосфатазу легких ланцюг!в мхозину, що присутня в очищених м!оф1брилах гладеньких м'яз!в, досл!дити II субо-диничний склад i катал1тичн1 властивост1;

- розд!лити окрем1 субодиниц! ФЛЛМ i визначити хх роль у функц!онуванн1 фосфатази.

Наукова новизна одержаних результатхв. В робот! вперше безпо-середньо показано хснування димерно! i ол!гомернох форм КЛЛМ; проведено досл1дження факторхв, що впливають на розпод!л олхгомерних форм к!нази. Встановлено, що розпод1л ол!гомерних форм може регу-люватися взаемод1ею к1нази з кальмодул!ном у присутност! !он!в Caz + . Вперше показано, що змхни олхгомерного стану кхнази впливають на хх катал!тичну активн!сть завдяки р1знхй спор1дненост! ди-MepiB i олiгомерiв до кальмодул!ну.

Вперше очищено м!оф!брилярну форму фосфатази легких ланцюг1в м1озину 1 вивчено П субодиничний склад та катал1тичн! властивос-т!. Вперше виявлено 1 охарактеризовано субодиницю М1оф1брилярно1 фосфатази, яка зв'язуюе к1назу 1 катал!тичну субодиницю фосфатази при утворенн1 мультиферментного комплексу м!ж КЛЛМ 1 ФЛЛМ.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами 1 темами. Робота виконувалася в рамках планових досл1джень в!дд!лу бшф!зики НД1 ф!з!ологп Кихвського утверситету 1мен1 Тараса Шевченка за темами: "Вивчити ф1зико-х1м!Чн1 властивост1 б1лк!в скоротливого апарату скелетних 1 гладеньких м'язхв та бхох1м1чн! механ!зми ре-гуляцП актин-мшзиновох взаемодП (1991-1993 рр.), "Структуры! основи регуляцп взаемодп б!лк!в скоротливого апарату гладеньких та серцевого м'язхв" (1994 - 1996 рр.), "Регуляторн! бхлки скоротливого апарату гладеньких ! серцевого м'яз1в. 1х ф1зико-х!м!ч-Н1 властивост1 та роль у функц1онуванн! актин-м!озинового комплексу" (1997 - 2000 рр.) та за грантом ДФФД по тем! "Структурн! основи ! молекулярн! механ!зми регуляцП скоротливо! активност! гладеньких м'язхв" (5.4/11, догов1р N Ф4/368-97, 1997-1998).

Практичне значения одержаних результат!в. Одержан! результата розширюють ! поглиблюють уявлення про тонк! механ1зми регуляцП скоротливох активност! гладеньких м'яз1в, що пов'язан! з ол!гоме-ризац!ею к1нази легких ланцюг!в м1озину ! утворенням мультиферментного комплексу м1ж кшазою х фосфатазою легких ланцюгхв м1ози-ну, ! можуть в значив м1р! сприяти вир1шенню р!зних прикпадних задач б!ологП ! медицини.

Матер1али дано!" роботи викорисговуються при викладанн! спецкурса "Б!оф1зика м'язового скорочення ! кл!тиннох рухомост!" ! спецпрактикума "1онообм1нна хроматограф!я ! электрофорез б1лк!в" для студентхв кафедри бхоф1зики б!олог!чного факультету Кихвського унхверситету хмен! Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана п!д кер1вництвом к.б.н. В.М. Даниловох у т1сному сп!вроб!тництв! з док. А. Собеше-ком, проф. В.Л. Зимою, к.б.н. Е.Б. Баб1йчуком, к.б.н. Н.В. Кул!ко-вою ! к.б.н. В.С. Трегубовим, з якими були опубл!кован! сп!льн! роботи, ! яким автор висловлюе щиру подяку. Конкретним внеском автора дисертацп у сп!льн! роботи була участь у розробц! концепцП роб1т, плануваннх ! виконанн! деяких експеримент!в, обговоренн!

одержаних результате. Bel експериментальн1 дан! наведенi в дисер-тац!йнш poôoTi були одержан1 за безпосередньо! участ1 автора.

Апробац!я роботи. . Результата досл1джень були представлен! на Всесоюзному симпозхум! "Б1оф1зика i 6ioxiMiH м'язового скорочення" (1983, T6Lnici, Груз1я); V Всесоюзн!й конференцП з 6ioxiMlï м'я-3íb (Í985, Телав!, Груз!я); М1инародному симпоз1ум1 "Ф1з!олог!я i фармаколог1я гладеньких м'яз1в" (1985, Варна, Болгар1я); XIV Всесоюзн!й конференцП з ф!з1ологП травления i всмоктування (1986, Терноп1ль, Украгна); VI Всесоюзн1й конференцП з ф1з1оло-riï вегетативно! нервово! системи (1986, Ереван, Вхрменхя); XV 3'Ï3fli Всесоюзного ф1з!олог1чного товариства ím.I.П. Павлова (1987, Кишин1в, Молдова); VIII Всесоюзному симпоз!ум1 "Б!оф1зика i 6loxl-м!я 6icwïori4Hoï pyxoMocTi (1987, Тб!л!с!, Груз!я); V Шжнародному симпоз!ум! "Ф1з!олог!я i фармакологiя гладеньких м'яз!в" (1988, Варна, Болгар!я); VI Всесоюзн1й конференцП з б!ох!мП м'яз!в (1989, Тб1л1с!, Груз1я); ЬИвнародному CHMno3iyMi "Молекулярна ор-ган!зац!я б!олог1чних структур" (1989, Москва, Рос1я): IX Всесоюзному симпоз1ум! "Б1оф!зика i 6ioxiMifl б!олог!чно1 рухомост! (1990, Tôiflici, Груз1я); Науков1й конференцП, присвяченШ 150-р1ччю ка-федри ф1зюлогП людини та тварин Кшвського ун1верситету Imghí Тараса Шевченка "Актуальн1 проблеми фхз1ологП" (1992, Khïb, Украина); Симпоз1ум1 "Ф!зшлог1я i патолог1я MOTOPHOÏ д1яльност1 шлун-ково-кишкового тракту" (1992, Томськ, Рос1я); XXIII Бвропейському м'язовому конгрес! (1994, Бохум, Шмеччина); XVI М1жнародному KOHrpeci з 6ioxlMlï i молекулярное б1ологП (1994, Нью Делi, 1н-д!я); Л3.тн1й школ! пхд ег1дою НАТО/ФЕБС "Структура i функцП взае-мод!ючих домен!в бхлкХв, якi приймають участь в перетворенн! сиг-налхв 1 енергП" (1996, Аквафредда д! Маратеа, 1тал1я); VII Укра-ÏHCbKOMy 61oxiMi4HDMy з'хзд! (1997, Khïb, Укра1на).

Структура 1 об'бм роботи. Дисертац1я складаеться з вступу, огляду л1тератури, експериментально! частини, в як1й описано ос-hobhí методичн1 п!дходи, наведено i обговорено одержан! результата. а також bhchobkíb. Роботу викладено на 124 стор1нках включаючи 20 рисунк!в i список цитовано! л1тератури з 211 найменувань.

МАТЕР1АЛИ I МЕТОДИ ДОШДЖЕНЬ

М!оф!брили, к1назу легких ланцюг1в м1озину, кальмодул!н, м!о-зин та його !зольований регуляторний легкий ланцюг видiляли за методиками, розробленими Собешеком (Sobieszek et al.,1993).

Активн!сть КЛЛМ вш1рювали при 25°С в буфер1 А сл1дуючого складу (мМоль/л): КС1-60; МеС12-2; дит!отрейтол (ДТТ)-0.5; 1м1да-зол-10 {рН 7.5). КонцентрацП КЛЛМ, кальмодул!ну, РЛЛ I СаС12 ста-новили 100 нМоль/л, 120 нМоль/л, 300 мкМоль/л 1 0.1 мМоль/л в!дпо-в!дно. Реакц1ю фосфорилювання запускали додаванням до реакц1йно! сум!вц [«'-Р32]АТФ (2 х 105 !мп за хв/нМ) до кхнцевох концентрацП 1 мМоль/л. Фосфорилювання зупиняли додаванням 0.5 об'ему насичено-го розчину гуан!дин-г1дрохлориду або, у раз1 подалыпого анал1зу фосфорилювання за допомогою електрофорезу в сечовинх, твердо! се-човини до к1нцево! концентрацП 8.5 Моль/л.

Автофосфорилювання КЛЛМ (10 мкМоль/л) проводили в буфер1 А при 25°С в присутност! КМ (5 мкМоль/л) 1 СаС12 (0.1 мМоль/л). Ре-

о р

акц!ю запускали додаванням до реакцхйно! сумш1 [¡С-Р ]АТФ (6 х 105 1мп. за хв/нМ).

Активно.сть фосфатази визначапи за кхльк!стю радюактивно м1-ченого неорганичного фосфату, який вив!льнювався з фосфорильовано-го РЛЛ (150 мкМоль/л). Реакц1ю проводили в буфер1 А при 25°С. Ре-акц!ю запускали, додаючи РЛЛ, 1 зупиняли додаванням 0.5 об'ему на-сиченого розчину гуан1дин-г1дрохлориду або, у раз! подалыпого ана-л1зу дефосфорилювання за допомогою електрофорезу в сечовин!, твердо! сечовини до кшцево! концентрацП 8.5 Моль/л.

Ковалентне зшивання КЛЛМ (5-10 мкМоль/л) проводили в буферх А при 25°С за допомогою 1-етил-3-[3-(диметилам!но)проп!л]карбоди!м!д г1дрохлориду (ЕДК ). концентрац1я якого становила 5 мМоль/л. Якщо СаС12 х КМ були присутт, концентрац!я СаС12 дор1внювала 0.1 мМоль/л, а концентраЩя кальмодул1ну (мкМоль/л) перевищувала концентрацП к!нази у 1.5 рази. Реакц1ю ковалентного зшивання зупиняли, додаванням 10 мМоль/л ДТТ.

Обмежений трипсинол1з КЛЛМ (5 мкМоль/л) проводили при 25°С в буфер! А, що додатково включав в себе 1 мМоль/л ЕГТА, у ваговому сп!вв!дношенн! к!нази до трипсину 40:1. При необх1дност! ЕГТА за-м1нювали на 0.1 мМоль/л СаС12 ! додавали 8 мкМоль/л КМ. Трипсино-л!з зупиняли додаванням 1нг!б1тора трипсину з боб!в со! у ваговому сп!вв!дношенн1 хнг1бхтора до трипсину 2:1.

Молекулярну масу катал!тичнох субодиницх фосфатази визначапи методом гель-ф!льтрацП на колонц1 ЗерЬасгу! 6-200 (1 см х 60 см) в буфер! А з 0.3 Моль/л №С1. Колонку кал!брували, використовуючи ферритин (443 кДа), каталазу (235 кДа), альдолазу (158 кДа), аль-бум!н (66 кДа) 1 суттевий легкий ланцюг м!озину ГМ (17 нДа).

- в -

ДСН-ПААГ диск-електрофорез проводили в град1ентних (7.5-25 %) гелях за методом Собешека (Sobieszek, 1994) у буферной систем! Леммл! (Laemmli, 1970).

Електрофорез в сечовиш проводили за методом (Sobieszek and Jertschin, 1086).

KM- i БРЛЛ- аф1нн! Hocii виготовляли на основ! CNBr-активова-Hoi Sepharose за рекомендац!ями виробника.

Концентращю б!лк1в вим1рювали за методом Бредфорд (Bradford. 1976) з використанням б!лкового стандарту ф1рт Bio-Rad або сиро-ваткового альбум!ну бика.

РЕЗУЛЬТАТИ I 0БГ0В0РЕННЯ

Механ!зм модуляцП активност! к!нази, пов'язаний !з зм1нами Ii' ол1гомерного стану був вперше запропонований Со бешеном i cni-вавторами при вивченн! так званого "Са2+/КМ-залежного пригн1чення активност! к!нази" (Sobieszek, et al., 1993). Але. незважаючи на значн1 переваги г1потези ол1гомеризац11 к1нази при поясненн! дея-ких експериментальних даних, вона до останнього часу не мала п1д собою твердого тдгрунтя. В дан1й po6oTi вперше безпосередньо показано, що КЛЛМ з гладеньких м'яз1в е ол!гомерним. а не мономерним ферментом, як це вважалося ран1ше (Hartshorne. 1987). Головн1 до-кази на користь ол1гомеризацП к!нази були одержан1 методом кова-лентного зшивання нульово! довжини з використанням 1-етил-З-[3-(диметилам!но)nponiл]карбоди1м!д г1дрохлориду (ЕДК). Цей водорозчинний реагент утворюе ковалентн1 зв'язки м1ж ам!но- i карбоксильними трупами, розташованими на поверхн1 б1лкових молекул, як1 tIcho контактують м!ж собою (Mornet et al., 1989).

ДСН ПААГ електрофорез препарат1в КЛЛМ, про1нкубовано! в при-сутност! ЕДК, показав наявн1сть пол!пептиду з Mm 130 нДа, який в1дпов1дав мономерам к!нааи, пол!пептиду з Mm приблизно 200 кДа, який в1дпов1дае П ковалентно зшитим димерам, i дек!лькох пол1пеп-тид!в з Mm Bifl 400 до 600 кДа, як! в!дпов1дають II ковалентно зшитим олхгомерам (Рис.1). 1снування у розчин1 р!зних олхгомерних форм к!нази було незалежно п1дтверджено методами св!тлорозс1ювання (Filenko et al., 1997) i електронно! м1кроскоп11 (Babiychuk and Sobieszek, 1997). Таким чином, можна вважати встановленим, що у розчин1. KiHaaa iCHye у вигляд1 мономер!в, димер1в i cmirouepiB, як! знаходяться у динам1чн1й р1вноваз1 м!к собою.

OfliroMepHi форми к!нази утворюються при взавмодП ауто!нг1б1-

- olig. В dirn.

monom.

s«

ю о 9 LO о о

cvi 1Л ^ о т см -0 е0

^ CVJ Ю CVi

EGTA Ca

2+

ЧАС (хв.)

Рис. 1. Зм1на розпод!лу ол!гомерних форм к1нази при ïï взаемодП з КМ. Препарати, що включали в себе кШазу (5 мкМоль/л) i кальмодул!н (6 мкМоль/л) ковалентно зшивали ЕДК в при-сутност! або 1 мМоль/л ЕГТА <зл!ва), або 0,1 мМоль/л Ca (справа) на протяз! вказаних 1нтервал1в часу. 1нш1 умови описано в розд!л1 "Матер1али 1 методи". Monom, dira. 1 ollg. - мономери к1нази та И ковалентно зшит1 димери 1 ол1гомери, в1дпов!дно.

торного домена одного мономера з С-к1нцевим доменом 1ншого, що бу-ло нами встановлено за допомогою метод1в обмеженого протеол!зу 1 ковалентного зшивання. Ковалентне зшивання к!нази в1дбувалося т1льки у випадку, коли ауто1нг1б1торний домен (приблизно 3 % вс1е! ач1нокислотно! посл1довност1 к1нази) не був деградованим внасл1-док обмеженого протеол!зу. Це св1дчить про високу специф!чн1сть ковалентного зшивання 1 повн1стю викпючае можлив1сть неспециф1ч-ного утворення димер1в i ол!гомер!в внасл1док "хаотичних з1ткнень" мономер!в к1нази.

ДинамХчна р1вновага м1ж р!зними ол1гомерними формами к1нази зм1нювалася в залежност1 в1д Iohhoï сили розчину, ïï концентрацП 1. що особливо ваяливо, при ïï взаемодП з кальмодул!ном. Як показано на Рис. 1, взаемод1я к!нази з кальмодул1ном, яка в1дбуваеться в присутност! ioHlB Са2+, призводила до п!двищення в1дносного вм1сту димерхв i практично повного зникнення ол!гомер1в. Як св!д-чать дан!, наведен! на Рис. 2, димери к1нази виявляли меншу спо-р!днен!сть до КМ в пор!внянн! з ол!гомерами. Зсув динам!чно! р!в-

а х

4

г

X

»/ -

/

I

А Б

О 50

50 100 150 200 250 300 350

КСНЦЕНГРАДГЯ КАЛЬМОДУЛГНУ (нМсхь/л)

Рис. 2. Активац1я ковалентно ашитих димер!в (• ) i ол!гомер!в

(О-О) к1нази кальмодул1ном. Ковалентно зшит1 за стан-дартних умов ол!гомери 1 димери к!нази розд1ляли на гель-ф1льтрац1йн1й колонц1 з Sefahacryl S-200. На вставц1 наведено електрофореграми фракц1й на початку п1ка к!на-зи, збагачених ковалентно зшитими ол1гомерами (А), i фракц1й в к!нц1 п1ка, збагачених димерами (Б). Активац1ю розд!лених ол1гомерних форм к!нази кальмодул!ном вим1рю-вали за умов, описаних в розд!л! "Матер1али i методи".

новаги у напрямку димер1в при взаемодП к1нази з кальмодул1ном, який супроводжуеться зменшенням И спор!дненост! до КМ. вказуе на можлив1сть 1снування механ!зму модуляцП к!назно! активност! при скороченн1 ГМ.

На нашу думку, запропонована г1потеза ол1гомеризацП к!нази задов1льно пояснюе зниження чутливост1 КЛЛМ до КМ. яке спостер1га-лося при подовжен1й стимуляцП гладенького м'яза (Stull et al., 1993). Ми вважаемо. що п1д час тривало! стимуляцП м'яз1в, яка призводить до п!дтримання високого р1вня внутр!шньокл1тинно1 кон-центрацП Са2+, в1дбуваеться Саг+ /КМ-залежна дисоц1ац!я б1льш чут-ливих до кальмодул1ну ол!гомер1в к1нази 1 накопичення менш чутли-вих до нього димер!в.

В дан1й робот1 вперше запропоновано 1 описано процедуру очистки фосфатази, асоц!йовано1 1з скоротливим апаратом (м1оф1бри-лами) гладеньких м'яз1в 1 вивчено деяк! II властивост!.

В процес! вид1лення м1оф1брилярно! форми фосфатази ми в значив м1р! удосконалили стратег1ю очистки фосфатаз, яка використову-

валася ран!ше. По-перие, для екстракцП фосфатази використовували ретельно в1дмиту фракц1ю м1оф1брил. що дозволяе позбутися вс!х ци-топлазматичних б!лк!в, в тому числ1 цитоплазматичних фосфатаз. По-друге. використання О-ЗерЬагоБе зам!сть ОЕАЕ-ЗерЬагоБе при про-веденн! !онообм!нно! хроматографН, дозволяе значно знизити к1ль-к!сть тропом1озину в фосфатазн1й фракцП, присутн1сть якого уск-ладнюе подальшу очистку внасл!док його значно! в'язкост!. По-тре-те, очистка препарат!в фосфатази проводилася з використанням ЗРЛЛ-аф1нно1 колонки. Активним агентом ц!б! колонки е т!офосфо-рильований регуляторний легкий ланцюг м!озину. тобто аналог субстрату ФЛЛМ, до якого фосфатаза мае високу спор!днен!сть. Для к1н-цево! очистки фосфатази використовували КМ-аф1нну колонку, активним агентом яко! е активатор КЛЛМ - кальмодул1н. Такий п!дх1д ра-н!ше н1коли не використовувався при вид!ленн! фосфатаз з гладеньких м'яз!в.

кйа, -130' -100

- 67

Рис. 3. ДСН ПААГ-електрофорез препарат1в мультиферментного комплексу (МФК). проте!ново1 фосфатази, асоц!иованох з к!на-зою 1 м!озином (ПФАКМ) та и субодиниць. А - К-субодини-ця, очищена за допомогою 1онообм!нно1 1 ЭРЛЛ-афХнно! хроматограф! I з фракцП МФК, що не зв'язувалася з КМ-аф!нною колонкою. Б - ПФАКМ (комплекс м!я К ! 3-субодиницями)ь очищена за допомогою 1онообм!нно! ! гель-ф1льтрац!йно1 хроматограф!! з фракцП МФК. що елюювалася з КМ-аф!нно! колонки в буфер! А з 360 мМоль/л В - МФК, одержаний за допомогою 8РЛЛ-аф!нно! хроматограф!I. Г - МФК. одержаний за допомогою КМ-аФ1нно1 хроматограф!I. Зл!ва вказано молекулярн! маси пол!пептид!в у кхлодальтонах. Детал! описано у текст!.

Препарати, що мали найб!льшу фосфатазну активн1сть, елюювали-ся з SPJUI-a$iHHoi колонки при висок1й iomiß сил! (360 мМоль/л NaCl) i включали в себе три полшептиди з Hm 37, 67 1 130 кДа (Рис.3 В). Так! препарати мали, oKpiM значно! фосфатазно! актив-ност!, неспод1вано високу к!назну активн!сть. Виходячи з цього, а тако» з даних (Cohen and Cohen, 1989; Hartshorne, 1987) про моле-кулярн! маси катал1тичних субодиниць в!домих на сьогодн! фосфатаз (37 кДа) i КЛЛМ (130 кДа). ми припустили, що 37 кДа пол!пептид е катал!тичною субодиницею (К-субодиниця) м!оф!брилярнох фосфатази, а 130 кДа пол!пептид б к1назою легких ланцюг!в м!озину. В подаль-шому це припущення було п!дтвердяено п!сля вид1лення цих пол!пеп-тид!в в гомогенному стан! i досл!дження хх катал!тичних властивос-тей. Препарати очищено! К-субодиниц1 зв'язувалися з БРЛЛ-колонкою, тод1 як препарати очищено! к!нази не зв'язувалися з такою колонкою н1 caMi по соб!, н! у присутност1 К-субодиниц1.

У в!дпов!дност1 до нашого припущення про те, що 130 кДа пол!-пептид б КЛЛМ, значна частина препарату, який отримували п!сля елюювання SPJW-a$iHHox колонки буфером з високою !онною силою, зв'язувалася з КМ-аф!нною колонкою в присутност! 0.1 мМоль/л СаС12, 1 могла бути елюйована з нех т!льки за умов високох !оннох сили або в присутност! 1 мМоль/л ЕГТА (Рис. 4). В присутност! ЕГТА елюювалася практично чиста КЛЛМ, тод! як препарати, що елюювалися при висок!й !онн!й сил!, включали в себе, як 1 у випадку 8РЛЛ-аф1нно1 хроматограф!I, К-субодиницю мхоф!брилярнох фосфатази, КЛЛМ i пол!пептид з Mm 67 кДа (Рис. 3 Г) 1, в!дтак, мали значну фосфатазну ! к1назну активн!сть. Очищена К-субодиниця не зв'язувалася з КМ-аф1нною колонкою нав!ть в присутност1 КЛЛМ (Рис. 5).

Зв'язування КЛЛМ з ЗРЛЛ-аф1нною колонкою т!льки в присутност! К-субодиниц1 ! пол!пептида з Mm 67 кДа 1 зв'язування двох остан-Hix з КМ-аф!нною колонкою в присутност! КЛЛМ св1дчить про !снуван-ня мультиферментного комплексу м1к цими трьома б!лками (МФК). В!д-сутн!сть зв'язування очищено! КЛЛМ з 8РЛЛ-аф!нною колонкою нав!ть у присутност! очищено! К-субодиниц! ! в!дсутн!сть зв'язування очищено! К-субодиниц! з КМ-аф!нною колонкою у присутност! КЛЛМ, св!д-чить про те, що роль зв'язуючо! субодиниц! в МФК належить пол!пеп-тиду з Mm 67 кДа, який в подалыпому ми будемо називати субодиницею м!оф!брилярнох фосфатази, яка в!дпов!дае за зв'язування К-субоди-ниц! з кШазою, або 3-субодиницею.

- Ii -

1.8

i 60

1.6

n

1.4

1.2

1.0

О

0.8 I

0.6

0.4

0.2

10 20 30 40 50 60 номер epaknil

Рис. 4. Очистка препарат!в МФК за допомогою КМ-аф!ннох хроматограф!!. Неперервна л!н1я представляе собою абсорбц!ю б1лк!в шракц1й (А280). яку вим1рювали при 280 нм. Акхивн1сть фос-фатази i к1нази у розд!лених Фракц1ях (10 0 х 1мп/хв) представлено символами (Q-O) I (•-•), в1дпов!дно. Момента зм1ни буферу представлено стр1лочками з в1дпов!дними значениями Iohhox сили (мМоль/л NaCl). На ocl абсцис вка-зано номери фракц1й. 1нш1 детал! наведено в текст1. Умови проведения хроматограф!!, електрофорезу 1 приготування аф!нного нос!я описано в розд!л1 ''MaTepiann 1 метода".

За допомогою хроматограф!чних п!дход!в нам вдалося вид!лити гомогенн! препарата К-субодиниц! i II комплексу з 3-субодиницею, 1 досл!дити Ix властивост1. Саме комплекс м!» К- 1 3-субодиницями ми ввахаемо ы!оф!брилярною фосфатазою по аналог!! з фосфатазою асо-ц!йованою з гл!когеном, яка також складаеться з катал!тично! субо-диниц! 1 субодиниц!. що в!дпов1дае за зв'язування з гл!когеном (Hubbard and Cohen, 1993). Нами показано, що м1оф1брилярна фосфа-таза зв'язуеться, окр!м K/U1M, з ф!ламентарним м1озином 1 в активною по в!дношенню до його РЛЛ i сайт!в аутофосфорилювання к1нази. В зв'язку з цим. ми запропонували II назву - протехнова фосфатаза, асоц!йована з к!назою 1 м!озином, або ПФАКМ.

Гомогенна К-субодиниця елюювалася з кал!бровано! гель-ф!ль-трац1йно! колонки у вигляд! одного симетричного п!ка, положения якого в1дпов!дало Mm = 67 кДа, що вдв!ч! б!льше за молекулярну ма-су К-субодиниц!. яку визначали за допомогою ПААГЕ. Це св!дчить про те. що К-субодиниця за умов, при яких проводили хроматограф!*), 1с-

1.8

В 70

п

о

50

40

1.0

•О

со

о.а ^

о

о

5 3

0.6

0.4

Г2

10 20 30 40 50 60

НОМЕР «РАКЦП

Рис. 5. Розд1лення к1нази 1 К-субодиниц! фосфатази на КМ-аф1нн1й колонц1 у в1дсутност1 3-субодиниц1 фосфатази. Препарата, що включали в себе очищену КЛЛМ 1 К-субодиницю ПФАКМ наносили на КМ-аф!нну колонку в буфер! А в присутност! 0.2 мМоль/л СаСЬ. Неперервна л1н1я представляв собою абсорб-ц!в б1лк1в (А?8о). яку вим1рювали при 280 нм, Активн1сть фосфатази 1 к!нааи у розд1лених фракц1ях (10 х 1мп/хв) представлено символами (О-О) 1 (*-*), в!дпов1дно. Мо-менти зм1ни буферу представлено стр!лочками з в1дпов1дними значениями !онно1 сили (мМоль/л ИаС1). На ос1 абсцис вка-зано номери фракц!й. 1нш1 детал1 наведено в текст!. Умови проведения хроматограф!I, електрофорезу 1 приготування аф1нного нос!я описано в розд1л! 1,Матер!али 1 методи*'.

нуе у в иг ляд! димера. Кш 1 Ушах реакцП фосфорилюважя РЛЛ, яку катал1зуе К-субодиниця ПФАКМ дор!внюють 3.15 (± 1.1) мкМоль/л 1 1.98 С1 0.9) Моль-хв"1' мг"1, в!дпов1дно. Активн1сть К-субодиниц1 не залежала в1д присутност1 1он1в чи Са2+, але значно п1дви-щувалася в присутност1 1он1в Со2+. Так! ва*к1 метали, як N1 ! (М 1нг!бували активн!сть фосфатази: 5056 1нг1бування досягалося при 1.5 мМоль/л МС12 1 при 100 мкМоль/л СйС1г.

При досл!дженн! д!1 найб1льш поширених 1нг1б1тор1в проте!нових фосфатаз на активн1сть К-субодиниц1 ПФАКМ було показано, що ста-б!льний до нагр1вання 1нг1б1тор фосфатаз-2 в концентрац1ях до 5 мкг/мл був неактивним по в1дношенню до К-субодиниц1. Окадахнова кислота - специф!чний 1нг1б1тор протехнових фосфатаз типу РР-1 1 РР-2, 1нг!бувала активн1сть К-субодиниц1 з 150 приблизно р!вним 251

нМоль/л. Арах1донова кислота, не впливала на фосфатазну актив-н1сть, тод1 як для кал1кулина А 1нг1бування спостер!галося при концентрацП 1.5 мкМоль/л. Найб1льш ефективним виявився м1кро-цистин-Ы*, який повн1стю 1нг1бував фосфатазну активн!сть при концентрацП 250 нМоль/л.

Вплив 3-субодиниц1 на катал1тичну активн!сть К-субодиниц1 важ-ко досл1дити прямими методами, тому що 3-субодиницю практично, не можна вид!лити в гомогенному стан! внасл1док П значно! схильност1 до протеол1тично! деградацП. Однак непрямэ визначення впливу З-субодиниц! на активн1сть К-субодиниц1 було проведено при пор1в-нянн1 впливу певних фактор1в середовища на активн1сть препарат!в ПФАКМ 1 очищено! К-субодиниц1. Так, крива залежност1 активном! К-субодиниц! в!д рН буфера зм!нювалася у присутност! 3-субодиниц1: у комплекс! максимум фосфатазно! активност! зсувався в!д лужних значень рН, при яких активн1сть !зольовано! К-субодиниц1 була най-б!льшою, до нейтральних значень рН. 3-субодиниця також впливала на зв'язування К-субодиниц! з м!озиновими ф!ламентами. В таких експе-риментах ми вим!рювапи спор1днен1сть К-субодиниц! 1 ПФАКМ до м!о-зинових ф1ламент1в, як! знаходилися у повн!стю фосфорильованому (т1офосфорильованому) або дефосфорильованому стан!. Спор1днен!сть К-субодиниц! до дефосфорильованого м!озину була не дуже високою (20 мкМоль/л), але вона зростала приблизно у 4 рази в присутност! 3-субодиниц1. Протилежний ефект було отримано для фосфорильованого м1озину: в1дносно висока спор!днен!сть К-субодиниц1 (4 мкМоль/л) зменшувалася приблизно удв!ч! в присутност! З-субодиниц!. Ще одне п!дтвердження впливу З-субодиниц! на активн!сть К-субодиниц! було одержано при вивченн! впливу !он!в Со2+ на фосфатазну активн1сть ПФАКМ. Активн1сть !зольовано! К-субодиниц1, апе не ПФАКМ, п1двищувалася у дек!лька раз!в п!сля перед!нкубацИ з СоС12. Анал!зуючи вищенаведен! дан1, ми д!йшли висновку, що. хоча 3-субодиниця ! не в регуляторною в прямому розум!нн!, вона. по-перше, може впливати на зв'язування К-субодиниц! з м!озиновими ф!лаыентами, тобто визначати II локал!зац!ю. по-друге, за певних умов вона може зд1йснювати тонку настройку активност! К-субодиниц! !. по-трете, вона може служити м!стком для передач! регуляторно-го сигналу з КЛЛМ !, можливо, капьмодул1ну на К-субодиницю.

Потенц!йна роль к1нази в регуляц!! фосфатазно! активност! МФК була виразною при пор!внянн! концентрац!йно1 залежност! активное-

тей ПФАКМ 1 МФК. Як показано на Рис. 6. питома фосфатазна актив-н1сть першо! форми була пост1йною 1 не залежала в!д П концентра-цП, в той час як активн1сть МФК зростала при зростанн1 його кон-центрац11. На нашу душу це св1дчить про наявн1сть складних ол1го-мерних ефект1в, природа яких мае бути вивчена б1льш детально.

Рис. 6.

10 20 30 4-0 50 60 70 80

КОНЦЕНТРАДШ (мкг/мл)

Залехн1сть питомо! активност! МКФ 1 ПФАКМ в1д 1х концент-рацП. Активн1сть препарат1в МФК (•-•) 1 ПФАКМ (О-О) вим1рювали за стандартною методикою за винятком того, що для менших концентрац!й активн!сть вим1рювали на протяз1 пропорц1йно б1льшого часу.

ВИСНОВКИ

1. Незважаючи на значн! усп1хи. досягнут1 при вивченн1 рол! процес!в фосфорилювання ! дефосфорилювання м!озину в механ1змах регуляцП скорочення-розслаблення гладеньких м'яз1в (ГМ). на сьо-годн! залишаеться ще багато невияснених питань, пов'язаних з функ-ц!онуванням двох ключових фермент1в, як! забезпечують ц! процеси, а саме. к!нази 1 фосфатази легких ланцюг1в м!озину (КЛЛМ 1 ФЛЛМ. в!дпов!дно). В дисертац1йн1й робот! вперше продемонстровано можли-в!сть регуляцП активност! к!нази шляхом II ол!гомеризац11, а та-кож вперше !дентиф!ковано 1 охарактеризовано м!оф!брилярну фосфа-тазу.

2. За допомогою ковалентного зшивача (крос-л!нкера) нульово! довжини 1-етил-3-[3-(диметилам!но)проп!л]карбоди!м!д г!дрохлориду

- реагента, який використовуеться для досл1дження специф!чних вза-емод1й Mis пол!пептидами, вперше було продемонстровано, що КЛЛМ гладеньких м'яз1в 1снув у розчин! у вигляд1 мономер!в, димер!в i ол!гомер!в. як1 знаходяться у динам1чн1й р!вноваз! Mi» собою.

3. Встановлено, що утворення димер!в i ол!гомер1в зд1йснюеть-ся за рахунок взаемодП м1* ауто!нг!б^орним доменом к!нази i II С-к1нцевим доменом, який включав в себе т1т1н-под!бну ам!нокислот-ну посл!довн1сть.

4. Показано, що при взаемодП КЛЛМ з кальмодул!ном р!в-новага м1ж П р!зними олхгомерними формами зсуваеться у напрямку димер!в, що супроводжуеться зменшенням II спор1дненост! до кальмо-дул!ну.

5. Вперше вид1лено фосфатазу легких ланцюг1в м!озину гладеньких м'яз1в, що асоц1йована з м1оф1брилами (м1оф!брилярна форма фосфатази). I показано, що вона м!цно зв'язуеться з КЛЛМ i м1ози-ном. Виходячи з цього, запропоновано II назву - проте!нова фосфа-таза, асоц!йована з к1назою 1 м1озином (ПФАКМ).

6. Показано, що ПФАКМ складаеться з двох субодиниць: каталi-тично! (К-субодиниця) i субодиниц1, що в1дпов!дае за зв'язування з КЛЛМ (3-субодиниця). За допомогою методу хроматограф!! отримада гомогенну К-субодиницю i дослужено II катал1тичн! властивост!.

7. Вперше показано !снування мультиферментного комплексу и!» КЛЛМ та ПФАКМ i вивчено його властивост!.

8. Одержан! результата розширюють уявлення про участь к!нази i фосфатази легких ланцюг!в м!озину в механ!змах регуляцП скорот-ливо! активност! ГМ шляхом ол!гомеризац11 КЛЛМ ! утворення мультиферментного комплексу м!я к!назою та ПФАКМ !. таким чином, вони можуть в значн!й Mipi сприяти вир1шенню р1зних прикладних задач б!олог11 i медицини.

СПИСОК ОСНОВНИХ ПРАЦЬ, 0ПУБЛ1К0ВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦ11:

1. Данилова В.М., Кул1кова Н.В., Трегубов B.C., Баб1йчук B.C. Досл1дження рол! кальдесмону в регуляцП АТФазно! активност! актом!озину гладеньких м'яз!в // В!сник Ки1вського ун-ту. 1нс-титут ф1з!олог!1. Проблеми регуляцП ф1з!олог!чних функц!й. -1996. - Вип.2. - С.10-20.

2. Хохлова (Бабийчук) B.C., Трегубов B.C., Данилова В.М. Два типа Са2+-зависимой регуляции актин-миозинового взаимодействия в гладких мышцах желудка свиньи // Молекулярная генетика и биофи-

зика. - К.: Вища школа. - 1986. - Вып.11. - С. 28-33.

3. Хохлова (Бабийчук) B.C., Куликова Н. В.. Трегубов В.С.. Данилова В.М. Роль фосфорилирования миозина гладких мышц в регуляции ак-тин-миозинового взаимодействия // Молекулярная генетика и биофизика. - К.: Вища школа. - 1991. - Вып.16. ~ С.74-78.

4. Babiychuk Е.В., Babiychuk V.S.. Sobleszek A. Modulation of smooth muscle myosin light chain kinase activity by Ca2+/calmodulin-dependent, oligomeric-type modifications// Biochemistry. - 1995. - V. 34, N. 19. - P. 6366-6372.

5. Danilova V.M. ZymaV.L.. FilenkoA.M., Khohlova (Babiychuk) V.S.. Tregubov V.S. Uloga fosporiliranja miosina о Cae+ ovisnog aktiviranja kontrakcije glatkog misica zeluca svinje // Biodinamica misica. - Zagreb: SNL. - 1990. - P.93-101.

6. Sobleszek A., Borkowski J., Babiychuk V.S. Purification and characterization of a smooth muscle myosin light chain kinase-phosphatase complex// J. Biol. Chem. - 1997. - V.272, N. 11. - P. 7034-7041.

7. Sobleszek A., Ortner В., Babiychuk V.S.. Borkowski J. Kinase associated, myofibrillar smooth muscle myosin light chain phosphatase// Abstr.of XXIII EMC.- Ruhr-University of Bochum, (Germany). - 1994. - P.04/09.

8. Babiychuk E.В., Babiychuk V.S., Sobleszek A. Oligomeric eguilibria of smooth muscle myosin light chain kinase and their modifications by melittin and calmodulin// Abstr. of NATO/FEBS Advanced Study Institute "Structure and Function of Interacting Protein Domains in Signal and Energy Transduction". Acquafredda di Maratea (Italy).-1996.- P.47.

АН0ТАЦ1?

Баб1йчук B.C. Структурна орган1зац!я 1 функц!онування м!оф1бриляр-но1 фосфатази I к1нази легких ланцюг!в м1озину гладеньких м'яз!в.

- Рукопис.

Дисертац!я на здобуття наукового ступеня кандидата б!олог1ч-них наук за спец1альн!стю 03.00.04 - б1ох1м1я. - 1нститут 6ioxiMiI 1м. 0.В. Паллад!на HAH УкраТни. Ки!в, 1998.

Дисертац!ю присвячено питаниям регуляцП скоротливо! актив-HOCTl гладеньких м'яз!в (ГМ). Досл1дяено структурну орган!зац1ю i функц!онування двох основних фермент1в регуляторно! системи ГМ -к1нази 1 фосфатази легких ланцюг1в м!озину (КЛЛМ 1 ФЛЛМ). Вперше встановлено, що у розчин1 КЛЛМ iCHye у форм! мономер!в, димер!в i ол!гомер1в, як! знаходяться у динам!чн!й р!вноваз! м!ж собою. Показано, що ол!гомерний стан к!нази зм1нюбться при II взаемодИ з кальмодул1ном, що впливае на II катал1тичну активн1сть завдяки р!зн1й спор1дненост! димер!в i ол1гомер!в до кальмодул1ну. Вперше очищено м!оф!брилярну форму ФЛЛМ, яка разом з КЛЛМ утворюб мульти-ферментний комплекс, асоц1йований з м!озиновими ф!ламентами. Встановлено, що м!оф1брилярна фосфатаза складаеться з катал1тично1 су-бодиниц! 1 субодиниц!, що в1дпов1дае аа зв'язування з к1назою.

Ключов! слова: гладеньк! м'язи, к!наза легких ланцюг!в м!ози-ну. фосфатаза легких ланцкнйв м!озину, кальмодул!н, ол!гомериза-ц!я к!нази, ыультиферментний комплекс.

Бабийчук B.C. Структурная организация и функционирование мио-фибриллярной фосфатазы и киназы легких цепей миозина гладких мышц.

- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии им. А. В. Папладина HAH Украины. Киев, 1998.

Диссертация посвящена вопросам регуляции сократительной активности гладких мышц (ГМ). Исследована структурная организация и функционирование двух основных ферментов регуляторной системы ГМ -киназы и фосфатазы легких цепей миозина (КЛЦМ и ФЛЦМ). Впервые установлено, что в растворе КЛЛМ существует в виде мономеров, диме-ров и олигомеров, которые находятся в динамическом равновесии между собою. Показано, что олигомерное состояние киназы изменяется

при ее взаимодействии с кальмодулином, что влияет на ее каталитическую активность вследствие различного сродства димеров и олиго-меров к кальмодулину. Впервые очищена миофибриллярная форма ФЛЦМ, которая вместе с КЛЦМ образует мультиферментный комплекс, ассоциированный с миозиновыми филаментами. Установлено, что миофибриллярная фосфатаза состоит из каталитической субъединицы и субъединицы, отвечающей за связывание с киназой.

Ключевые слова: гладкие мышцы, киназа легких цепей миозина, фосфатаза легких цепей миозина, кальмодулин, олигомеризация кина-зы, мультиферментний комплекс.

Babiychuk V.S. Structural organization and functioning of smooth muscle myosin light chain myofibrillar phosphatase and kinase. - Manuscript.

Thesis for candidate of sciences degree by speciality 03.00.04 - biochemistry. - A.V.Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv. 1998.

The dissertation is devoted to the problems of regulation of smooth muscle (SM) contractile activity. A structural organization and a functioning of two key SM regulatory system enzymes - myosin light chain kinase and mlofibrillar phosphatase (MLCK and MLCP) are Investigated. For the first time, it is established that MLCK exists in solution as monomers, dimers and oligomers, which are In dynamic equilibrium between themselves. It is demonstrated that interaction of MLCK with calmodulin influences its oligomeric state. This results in changes of the catalytic activity due to different affinity of dimers and oligomers for calmodulin. The oiofibrillar form of MLCP was purified for the first time and it was shown that It formed together with MLCK the aultienzyme complex associated with myosin filaments. It is demonstrated that mlofibrillar form of the phosphatase Is composed of catalytic subunlt and targeting subunit which is responsible for binding of catalytic subunit to MLCK.

Key words: smooth muscle, myosin light chain kinase, myosin light chain phosphatase, calmodulin, oligomerization of kinase, multienzyme complex. -

ГНдписано до друку 20.01.98р. Формат 60x90/16. Ум. друк. арк.1.0, Обл.-вид. арк. 0.8. Наклад 100. Зам. 20.

Вщд1п оперативно! пол!графм Центру М1жнародно\ осв'гги 227-12-75, 227-37-86