Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация единиц транскрипции и трансляции генов 75 S РНК хирономуса

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация единиц транскрипции и трансляции генов 75 S РНК хирономуса"

11 9 *

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

МАСИЧ Сергей Васильевич

УДК 576.322.32: 576.348.32/33 ' СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЕДИНИЦ ТРАНСКРИПЦИИ И ТРАНСЛЯЦИИ ГЕНОВ 75 8 РНК ХИРОНОМУСА

Клеточная биология - 03.00.25

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Институт цитологии и генетики

На правах рукописи

Новосибирск -

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск и в Отделе молекулярной генетики Каролинского института, г.Стокгольм, Швеция.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

с.н.с. Г.А.Зайниев Институт цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Н.П. Мертвецов

Институт биоорганической химии СО РАН, г. Новосибирск

кандидат биологических наук O.A. Агапова

Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН

г. Санкт-Петербург

Защита состоится " 1992 г. на

заседании специализированного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) при Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: г.Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан " ^ " ^«¿У 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

А.Д.Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Одной из принципиальных проблем современной клеточной биологии является изучение различных уровней упаковки ДНК в хромосоме и, в частности, петлевой организации ДНК. Без выяснения взаимосвязи структурной и функциональной организации генома невозможно понимание всего многообразия процессов, происходящих при реализации генетической информации.

Гены так называемой 768 РНК хирономид, локализованные в кольцах Бальбиани - гигантских пуффах политенных хромосом из слюнных желез личинок, являются уникальным объектом для изучения всего пути от кодирования генетической информации до функционирования продуктов работы этих генов - секреторных белков личинки. Особые преимущества генов 758 РНК для исследования пространственной организации ДНК в пуффе обусловлены гигантскими размерами этих генов, повышающими относительную разрешающую способность цитологических методов. К моменту начала настоящей работы структура транскрипционного домена (петли) генов 758 РНК была частично изучена. Установлено, что ДНК между соседними молекулами РНК полимераз имеет диаметр около 5 нм, а при достаточно большом расстоянии между полимеразами может быстро компактизоваться до фибриллы диаметром 10 нм и далее до 30 нм (Andersson et al., 1980, 1982, Bjorkroth et al., 1988). Была исследована структура растущей РНП частицы (Skogiund et al., 1983, 1986). Детально была изучена ультраструктура ДНП фибриллы, примыкающей ч 3' и б* концам гена (Ericsson et al., 1989). Однако, попытки реконструировать пространственную организацию целой транскрипционной петли оканчивались безрезультатно. Трудность такого рода работы обусловлена наличием в политенной хромосоме большого числа сложно переплетенных копий активно работающего гена, что практически не позволяет проследить путь отдельной петли. Для решения этой задачи необходим был новый подход. Было очевидно, что реконструкция петли генов 758 РНК in situ, т.е. в составе фиксированной клетки, также невозможна из-за наличия структур ядерного матрикса, затрудняющих анализ электронно- микроскопического изображения. Предполагалось использовать для данной цели изолированные политенные хромосомы, поскольку было показано, что они сохраняют большую

-1-

степень нативности (ВЛогкгоИ! в! 1988). с другой стороны, мы полагали, что уменьшить количество копий ДНК можно за счет использования хромосом низкой степени политении. Однако, ко времени начала настоящей работы не существовало метода изолирования таких хромосом.

Таким образом, основной цельр настоящей работы являлось исследование принципов пространственной организации ДНК в состоянии высокой транскрипционной активности с использованием новых методических подходов.

В конкретные задачи работы входило:

разработка метода приготовления электронно-микроскопических препаратов изолированных хромосом низкой степени политении;

- реконструкция трехмерной организации транскрипционных петель в кольцах Бальбиани;

количественный анализ полученных результатов и выявление основных закономерностей процесса транскрипции генов 758 РНК;

применение метода электронно-микроскопической компытгерной томографии для получения компьютерных образов реконструированных петель;

апробирование метода Миллера для приготовления препаратов распластанных хромосом малой степени политении для получения материала, пригодного для статистического анализа.

Актуальность подобного исследования обусловлена тем, что создание адекватной модели транскрипционного процесса невозможно без учета изменений в способе упаковки ДНК и ее укладки в пространстве. Следует подчеркнуть, что высокие уровни организации ДНК, такие как фибриллярный и хромомерный, остаются до сих пор слабо изученными, и исследование изменений в структуре ДНК при транскрипции является актуальным и для выяснения общих принципов упаковки ДНК в ядре.

К основным результатам проделанного исследования можно отнести описание пространственной организации целых трансрипционных петель генов 758 РНК и определение количественных характеристик расположения РНП гранул на петле. Было строго показано, что петли ДНК является "открытыми", т.е. незамкнутыми в основании. В целом они в значительной степени

-2-

отрелаксированы и содержат не более 1-2 супервитков по всей гигантской длине ДНК. Анализ расположения РНП гранул вдоль ДНК показал, что „ петли могут находиться в разной степени транскрипционной активности, при этом увеличение активности транскрипции связано с удлинением петли. Особенностью этого процесса является то, что при посадке каждой молекулы РНК-полимеразы петля дозированно удлиняется, а по окончании транскрипции ДНК быстро компактизуется в 30 ем фибриллу. При использовании метода Миллера нам не удалось получить хороио расправленных транскрипционных петель, однако, было обнаружено и описано значительное . количество полирибосом, предположительно содержащих 758 РНК. В частности, показано наличие двух классов полирибосом, отличающихся по присутствию на 3' конце группы рибосом без видимой полипептидной цепи. В результате сформулирована задача для продолжения исследований в рамках использованных методик с применение иммунной электронной микроскопии.

Научная новизна. В данной работе впервые проведен качественный и количественный анализ целой транскрипционной петли, позволивший сформулировать основные принципы организации ДНК пуффа в активном состоянии. Морфологическое по сути исследование позволило получить данные, характеризующие динамику молекулярных процессов, получение которых, по-видимому, затруднено или даже невозможно при использовании стандартных "молекулярно- биологических" методик.

Практическая ценность. Разработан оригинальный метод приготовления электронно-микроскопических препаратов изолированных политенных хромосом, позволяпций значительно сократить время между изолированием и фиксацией хромосом. В результате появилась возможность исследовать хромосомы малой степени политении, недоступные для исследования традиционными методами. Показано, что при изолировании хромосом длина транскрипционной петли сокращается, что необходимо учитывать при проведении количественного анализа результатов, получаемых при работе с изолированными хромосомами.

Апробация работы. Методические - аспекты и результаты работы докладывались на VIII Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Пущино, 1904), на Всесоюзном

-3-

симпозиуме "Эволюция, видообразование и систематика хирокомид" (Новосибирск, 1985), на V Всесоюзном совещании "Структура и функции хромосом" (Пущино, 1985), на III и IV рабочих совещаниях по кольцу Бальбиани (Ладвиг, Швеция, 1987 и Браунвальд, Швейцария, 1989, соответственно), на I, II и III симпозиумах по клеточной и молекулярной биологии Каролинского Института (Скоклостер, Швеция, 1989, 1990 и 1991, соответственно).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 сообщения и 1 статья находится в стадии подготовки к печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, две главы с результатами исследований и обсувдением соответствупцих результатов), заключения, общих выводов и списка литературы. Работа изложена на 80 страницах машинописного текста и иллюстрирована 15 рисунками. В списке литературы приведено 123 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объекты исследования. В работе использовали личинок chironomus tent ans из лабораторной популяции, поддерживаемой в Отделе Молекулярной генетики Каролинского Института, Стокгольм, Швеция и Chironomus thummi из лабораторной популяции, поддерживаемой в Институте цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск. Условия разведения личинок описаны ранее (Lezzl et al., 1981, Кикнадзе и др.,1975, соответственно). Выделение, фиксация и заливка политенных хромосом и ядер из слюнных желез. Личинок декапитировали в капле ТЕАКМ буфера (0,1 М KCl, 1 мМ НдС12; 10 мМ триэтаноламин - HCl, pH 7,0). Выделившиеся в раствор железы переносили в 100 мкл свежеприготовленного ТЕАКМ-Р буфера (ТЕАКМ буфер, содержащий дополнительно 1 мМ PMSF). К раствору добавляли 100 мкл 2% -Nonidet Р40 (НР40) в ТЕАКМ-Р буфере и раствор мягко перемешивали в течение 1 минуты. Быстро производили 4-х кратную промывку по 100 мкл 0,025% NP40 в ТЕАКМ-Р буфере. В последнем объеме железы энергично пипетировали, пропуская через силиконизированную стеклянную микропипетку с диаметром отверстия 60-200 мкм. Полученную суспензию переносили в пластмассовую чашку Петри диаметром 28 мм с 0,9 мл ТЕАКМ-Р

буфера. В течение нескольких минут хромосомы и более крупные фрагменты достигали дна чашки и прилипали к нему. В чашку добавляли 4 мл 2,5% глютаральдегида в ТЕАКМ-Р буфере (конечная концентрация глютаральдегида 2$). После 60 минут фиксации образец промывали в ТЕАКМ-Р буфере (4x15 мин) и в 70$ этаноле. Все описанные выше операции проводили на холоду при температуре около 4°с.

Раствор заменяли на 95% этанол, переносили в тепло (около 20°С) и обезвоживали препарат проводкой через абсолютный этанол (4x5 мин). Инфильтрацию выполняли проводкой через раствор смолы Agar 100 Resin в абсолютном этаноле (этанол : Agar 100 Resin (2:1) (2x10 мин), этанол : Agar 100 Resin (1:1) (15 мин и ночь)). После 3-кратной замены на чистую смолу образец заливали в 3 мм слое смолы и полимеризовали при 45°С (2 суток) и при 60°С (не менее 3 суток).

Основным отличием нашего метода от существовавших ранее является изменение последовательности операций при приготовлении препарата, а именно: в нашем методе фиксация и заливка в смолу предшествуют этапу идентификации хромосом, что позволяет проводить поиск изолированных хромосом под микроскопом при большом увеличении, т.е. неограниченно увеличить время поиска мелких хромосом, плохо различимых под стереомикроскопом.

Электронная микроскопия изолированных хромосом и ядер. Полученный в результате описанной выше процедуры образец просматривали под инвертированным фазовоконтрастным микроскопом (Ollepua IMT). Положение нескольких хромосом IV и/или отдельных ядер отмечали путем нанесения царапин на поверхности смолы, после чего чашку Петри удаляли, погружая весь образец в жидкий азот. В отмеченных местах устанавливали желатиновые капсулы со смолой и приполимеризовывали их к образцу при 60°С. Далее весь диск разрезали на части так, чтобы каждая часть несла по одной капсуле или, то же самое, по одному маркированному объекту: хромосоме или ядру. Полученный препарат затачивали до получения пирамидки, обычно используемой для приготовления ультратонких срезов. Серийные ультратонкие срезы делали на ультратоме LKB V алмазным ножом (JUMDI). Срезы окрашивали 2% раствором уранил ацетата в спирте

-5-

и цитратом свинца. Полученные препараты анализировали под электронным микроскопом Jeol ТЕМ-SCAN ЮОСХ и фотографировали при положении препарата, перпендикулярном пучку электронов и наклоненном под углами +8°.

Приготовление препаратов слшных желез и их электронно-микроскопический анализ. Железы выделяли в капле 0,05 М натрий какодилатного буфера (рН 7,2) и фиксировали 2% раствором формальдегида в том же буфере втечение 2-х часов, затем промывали буфером 4 раза по 15 мин. Железы дополнительно фиксировали 30 мин в 1$ растворе тетроксида осмия в том же '(буфере и отмывали фиксатор буфером 4 раза по 15 мин. Все операции выполняли при температуре 4°С. После проводки через 50* этанол (5 мин) и затем 70% этанол (2x5 мин) препарат переносили в тепло. Далее железы дегидратировали последовательно в 90$ этаноле (2x5 мин), 95% этаноле (2x5 мин) и в абсолютном этаноле (3x10 мин). Инфильтрация выполнялась как описано выше для изолированных хромосом и ядер. Железы заливали в желатиновых капсулах в Agar 100 Resin и полимеризовали при 45°С (2 суток) и при 60°С (не менее 3 суток). Ультратонкие срезы готовили, окрашивали и анализировали как описано выше.

Реконструирование транскрипционных петель. Для реконструкции использовали микрофотографии, напечатанные на прозрачной пленке (Rapldoprlnt) при общем увеличении 50000. Фотографии соседних срезов подгоняли друг к другу с использованием легко опознаваемых структур, таких как хромосомные плечи и отдельные районы петель, пересекапцие перпендикулярно несколько срезов. Оси идентифицируемых петель отмечали цветными фломастерами. Обычно при реконструкции отдельной петли частично отслеживали от 10 до 15 петель в окрестности. Для более точной идентификации участков примыкапцих друг к другу петель использовали стереоизображение, получаемое при наблюдении в зеркальный стереоскоп wild ST4 парных фотографий, сделанных под углами +8°. Предварительное пространственное

представление о петле получали, располагая прозрачные микрофотографии между пластинами плексигласа толщиной 4 мм.

Для определения длины петли определяли длину всех ее фрагментов в соответствупцих срезах. (Толщину среза при этом

-6-

предполагали равной 80 нм.) Затем суммировали полученные значения последовательно, начиная с 5*-конца. Количество гранул на каящом фрагменте подсчитывали под стереоскопом Wild 8Т4.

Получение компьютерного изображения реконструированных петель. Для компьютерной обработки использовали микрофотографии с общим увеличением 20000. Микрофотографии были последовательно подогнаны друг к другу, как описано выше, и на них нанесены по 4 маркера. Для нанесения маркеров стопку подогнаных фотографий прокалывали тонкой иглой и места проколов отмечали черной краской. Фотографии последовательно сканировали на барабанном сканере Optronics Р- 1000. Маркеры на фотографиях использовались для стыковки соседних цифровых образов по методу наименьших квадратов. Районы фотографий, содержащие реконструируемые петли, выделяли из целой фотографии и оптические плотности всех полученных районов преобразовывали для получения одинакового контраста. Оптические плотности соседних срезов "сшивались" в компьютере, формируя объемный образ, который затем растягивался до соответствующей толщины. Реконструированный материал заключался в контур, включающий области с оптической плотностью выше заданного порогового значения. Полученный объемный образ проецировался на экране дисплея Evans ft Sutherland PS 3S0. Материал, не принадлежащий реконструированным петлям, отсекался, а сами петли по частям "раскрашивались" в соответствующие цвета. Полученное изображение фотографировали с экрана фотоаппаратом Contax 139 Quartz под различными углами.

Приготовление препаратов, "распластанных" по методу Миллера. Слюнные железы выделяли в капле ТЕАКМ буфера и промывали в том же буфере. Последовательно железы инкубировали по 10-15 сек в растворах: 1 - 0,1$ Joy, 0,1$ саркозилат натрия; 2 - 0,052 Joy; 3 - 0,1$ саркозилат натрия, 1$ формальдегид, 0,1 мМ борат натрия рН 9,0. Все операции выполняли при 4°С. В 200 мкл последнего раствора железы энергично пипетировали, пропуская через силиконизированную пипетку с диаметром отверстия 200 мкм. По 60 мкл получившейся суспензии осаждали центрифугированием на гидрофильные угольные пленки. Полученный образец промывали в 0,4$ Photo-Flo, высушивали и напыляли

-7-

платиной-палладием под углом 6 . Препарат исследовали в электронном микроскопе Jem-iooc.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Трехмерная организация транскрипционных петель генов 758 РНК.

Трехмерную структуру петель генов 75S РНК реконструировали в кольцах Бальбиани политенных хромосом Chlronomus tentans III личиночного возраста.

Для реконструкции использовали серии из не менее, чем 10 срезов. Во всех случаях мы прослеживали петлю от одного плотно упакованного гетерохроматинового участка на конце до другого аналогичного участка, которые были описаны ранее (Ericsson et al., 1989). На 3' конце петель мы, как правило, отмечали наличие толстых фибрилл диаметром около 30 нм и длиной около 200 нм, которые описаны там же.

Всего нами было полностью реконструировано в BRI 11 петель из 3 личинок и в BR2 9 петель из 3 личинок.

Схематичное представление одной из реконструированных петель показано на рис.1.

Все петли были в значительной степени

отрелаксированы. На некоторых из них наблюдались спиральные структуры, при этом количество суперспиралей не превышало 1-2, что при гигантской длине гена может рассматриваться, как отсутсвие торсионного напряжения вообще. Следует подчеркнуть, что равновероятно встречались как "правые", так и "левые" спирали. Это может свидетельствовать о том, что процесс транскрипции приводит к возникновению суперспиралей обоих направлений, которые релаксируют под действием топоизомераз. В этом случае образование спиралей того или иного направления на всем протяжении транскрипта может носить случайный характер и быть обусловлено сбоем или задержкой в действии топоизомерапы. Именно такой механизм лежит в основе модели, предложешюй Лю и Вангом (Liu, Vang, 1987). Авторы спязывают образование

-8-

Рис. 1

суперспирализации ДНК с затрудненным вращением полимеразного комплекса при движении РНК-полимеразы. Замедление вращения комплекса приводит к образовании положительной суперспирализации впереди молекулы РНК-полимеразы и отрицательной - позади. Таким образом, почти полная релаксация петли в активном состоянии должна свидетельствовать о наличии большого числа активно работающих ДНК-топоизомераз.

При реконструкции отдельной петли мы частично реконструировали несколько петель в ее окрестности. Как правило, нам удавалось реконструировать по несколько петель в каждой серии срезов. Обычно это были группы петель, имеющих общие 5' и 3' концы соответственно. Таким образом получаются структуры, напоминавшие "китайский фонарик". Важно отметить, что если две петли начинаются на общем хроматиновом блоке, то заканчиваются они всегда также на общем блоке хроматина.

Все петли были "открытыми", т.е. незамкнутыми в основании. Расстояние между 5' и 3' концами петель варьировало от 0,3 ■ до 1,0 мкм в BRI и от 0,4 до 0,8 мкм в BR2. Морфологическая открытость петли не означает ее топологической незамкнутое™. Наличие топологически замкнутых доменов ДНК в интерфазном геноме дрозофилы было показано биохимическими (Bonyajatl, Worcel, 1976) и цитологическими (Worcel, Benyajatl, 1977) методами. К такой изоляции фрагментов ДНК, очевидно, может приводить закрепление их концов на структурах ядерного матрикса (Earnshaw, Laeœull, 1983, Gasser, Laeoall, 1986, Mlrkovltch et al., 1986, 1988, Kâa, Chasin, 1987, Izaurralde et al., 1988). Соединение концов нескольких петель колец Бальбиани в одной точке на структурах типа "китайского фонарика" также может ограничивать их подвижность и, в результате, приводить к топологической замкнутости петель.

Динамика процесса транскрипции генов 75S РНК.

Мы измерили длину фрагментов петель во всех соответствующих срезах и количество РНП гранул на этих фрагментах. Оказалось, что и общая длина петли, и число гранул на ней значительно варьируют от петли к петле даже в пределах едной группы петель, имеющих общие концы, т.е. образупцих структуру типа "китайского фонарика". Зависимость количества гранул от расстояния до начала транскрипта во всех случаях

-9-

была линейной, т.е. плотность расположения гранул была постоянной по всей длине транскрипта.

Средняя плотность расположения гранул вдоль петли была одинаковой в ВН1 и BR2, и составляла 82+9 гранул на мкм, что в 2 раза выше, чем было показано ранее (37 гранул на мкм) (Andersson et al., 1980). Такое расхождение с результатами, полученными при анализе колец Бальбиани in situ (в фиксированных железах), могло быть объяснено сокращением петли в результате изолирования хромосомы. Мы предположили, что ядерный матрикс мокет играть какую-то. роль в поддержании пространственной организации транскрипционных петель. Для проверки этой гипотезы, мы реконструировали 9 петель из трех личинок в составе изолированных ядер, где структуры ядерного матрикса сохранены частично По ряду характеристик петли в составе изолированных ядер не отличались от петель в изолированных хромосомах: 1.Петли не были замкнутыми в основании и расстояние между их концами варьировало от 0,3 до 0,9 мкм. 2.Петли были в значительной степени отрелаксированными и содержали не более 2 суперспиралей. 3.Группы петель образовывали структуры типа "китайских фонариков". 4.РНП частицы были расположены вдоль петли однородно. 5.Петли отличались между собой по длине и количеству РНП частиц. Мы провели также ряд измерений на фрагментах петель in situ, т.е. в составе фиксированных желез с хорошо сохраненной структурой ядерного матрикса. Всего мы реконструировали 9 фрагментов петель из 3 личинок с длиной тела 6 мм. Плотности посадки РНП частиц на транскрипционных петлях in situ и в изолированных ядрах оказались равны 52+5 и 68+7 гранул на мкм соответственно. Таким образом, действительно, в процессе изолирования ядер и хромосом происходит постепенное уменьшение длины петли. Важно, что при этом сохраняется однородность распределения гранул. Среднее значение плотности (52+5) несколько превышает полученное ранее (Andersson et al., 1980), однако известно, что в определенных пределах этот параметр может зависеть от физиологического состояния личинки (011ns, 011ns, 1982).

Максим аильная длина петли достигала в изолированных хромосомах 3 мкм, что с учетом сокращения петли соответствует

-10-

4,8 мкм in situ, т.е. кратности упаковки ДНК 2,5. Это значительно ниже кратности упаковки 10 нм фибриллы (Finch, Klug, 1976). Число гранул на петле достигало 280, что не намного меньше, чем наблюдаемое при стимулировании транскрипции пилокарпином, т.е. при максимальной наблюдаемой активности (tfldser et al., 1S84).

На рис.2 представлены зависимости общего числа гранул на петле от ее длины, полученные в изолированных хромосомах и ядрах. С большой степенью достоверности (0,98) эти зависимости характеризуются прямыми, не проходящими через начале координат. Из этого следует, что в петле с низкой активностью (меньшее число РНП гранул) не транскрибируемые участки ДНК между РНК-полимеразами однородно упаковываются.

Экстраполяция к нулевому числу гранул (точка пересечения графика с осью абцисс) позволяет оценить длину петли в неактивном состоянии. Получаемое значение 0,25 мкм соответствует кратности упаковки 48, если принять длину ДНК в транскрипте равной 12 мкм. Известно, что достаточно близко к этому значению лежит кратность упаковки ДНК в 30-нм фибрилле.

Из угла наклона графика легко вычислить, что добавка одной РНК полимеразы удлиняет петлю приблизительно на 10 нм. С учетом сокращения петли получается, что при посадке одной молекулы РНК-полимеразы длина петли in situ увеличивается приблизительно на 16 нм, т.е. приблизительно на размер самой полимеразы (l/ldaer et al., 1984, Льюин, 1987). При "освобождении" ДНК от РНК полимеразы происходит упаковка ДНК в 30 нм фибриллу.

Организация единиц трансляции генов 75S РНК.

Препараты полирибосом готовили путем распластывания по методу Миллера суммарного гомогената, полученного в результате пипетнрования целых слюнных желез личинок Chironomus thummi III возраста.

1 1 j Iii 11 «ITH (»ml

Рис.2

На препаратах было обнаружено большое количество полирибосом, основную часть которых составляли гигантские полирибосомы, содержащие от 79 до 146 рибосом. Начало и конец молекулы мРНК легко идентифицировались по размеру растущих полипептидных цепей. На уровне 7-12-й рибосомы уже можно было обнаружить короткие фрагменты белковых молекул, отходящих от рибосом. Далее наблюдался градиент в длине белковых молекул: они становились длиннее и достигали вблизи 3* конца длины 100-120 нм. Расстояние между отдельными рибосомами варьировало в широких пределах, однако никогда не превышало 110 нм. Простые расчеты показывают, что эти вариации длин обусловлены, по крайней мере в ряде случаев, реальной разницей в расстоянии между рибосомами, а не растяжением в процессе приготовления препаратов.

Структура белковых молекул, отходящих от рибосом, имеет ярко выраженный неоднородный характер. Молекула белка состоит из чередующихся тонких и более толстых участков, напоминающих глобулы. На конце молекулы, как правило, имеется утолщение, имепцее вид глобулы диаметром 12-15 нм.

Аналогичные полирибосомы были визуализированы ранее при использовании лизатов слшных желез личинок смгопотия гелгаля (Ргапске еЪ в1., 1982). Авторы данной работы приводят убедительные свидетельства в пользу того, что эти полирибосомы содержат 758 РНК, а именно: 1. Представленность этого класса среди .всех наблюдаемых полирибосом соответствует ожидаемой. 2. Среднее количество рибосом в одной полирибосоме близко к определенному ранее биохимическими методами. 3. Отношение количества аминокислот^ в синтезируемом белке к числу рибосом хорошо согласуется^. с ожидаемым только в предположении гигантского размера этого белка (молекулярный вес более 1000 кД). Таким образом, с большой степенью уверенности можно утверждать, что наблюдаемые нами гигантские полирибосомы содержат 75Э РНК - продукт транскрипционной активности колец Бальбиани.

Обнаруженные нами гигантские полирибосомы разделяются на два класса: часть из них включает на 3' конце группу из двух-семи рибосом, не содержащих видимых белковых молекул. Наличие таких рибосом, по-видимому, не является артефактом, а

-12-

отражает реальную гетерогенность в составе полирибосом, поскольку практически все другие рибосомы, начиная с 7-12-й, содержат такие молекулы.

Ранее было показано, что на 3* конце генов колец Бальбиани Ch.tentans содержатся экзоны, кодирущие ДНК-связывапцие белковые домены (Botella et al., 1988), и эти домены отсутствуют в белке sp-lb - продукте гена BR2.2 и имеются в белках вр-la, sp-ic и ep-ld. С другой стороны, в ядерной фракции удается обнаружить мелкий белок с соответствующими антигенными свойствами. Можно предполагать, что синтез этого короткого белка происходит по окончании синтеза и освобождении белковой молекулы ep-lb (Botella et al., 1988). По-видимому, аналогичные процессы происходят также у использованного в наших экспериментах Ch.thummi и наличие 3' концевых рибосом без видимой полипептидной цепи отражает этот процесс. Следует подчеркнуть, что примерно третья часть из 60 проанализированных нами гигантских полирибосом содержала "необычные" 3' концевые рибосомы. Такое соотношение соответствует ожидаемому, если действительно этот процесс характерен только для' одного белка из класса sp-i. Окончательный ответ на вопрос о функциональной роли концевых рибосом может дать иммунно-микроскопическое исследование как "распластанных" полирибосом, так и политенных хромосом.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Реконструирована полная трехмерная организации транскрипционных петель в кольцах Бальбиани политенных хромосом из слюнных желез личинок Chironomus tentans, получены компьютерные изображения групп таких петель и проведен количественный анализ распределения РНП ' гранул вдоль хроматиновой фибриллы. Показано, что:

1.1. Транскрипционные петли являются "открытыми", т.е. не замкнутыми в основании. Они в значительной степени отрелаксированы и содержат не более 1-2 супервитков. Равновероятно встречаются оба направления суперспирализации, что, по-видимому, отражает ее более или менее случайное образование. Несколько петель образуют структуру типа "китайского фонарика": они имеют общие 3' и 5* концы соответственно. Образование таких структур предположительно

-13-

необходимо для формирования топологической замкнутости отдельных петель.

1.2.1. РНП гранулы расположены вдоль всей единицы транскрипции равномерно и средняя плотность их расположения составляет l<j situ 52 гранулы на 1 мкм. Разные копии одного гена даже в пределах одной политенной хромосомы могут иметь разную степень транскрипционной активности. Количество РНП гранул на петле может изменяться, по крайней мере, от 60 до 250.

1.2.2. Длина транскрипционной петли линейно зависит от числа гранул на петле. На этом основании сделан вывод, что при посадке одной молекулы РНК полимеразы петля удлиняется приблизительно на 16 нм. Если после РНК полимеразы имеется достаточно протяженный нетранскрибируемый в данный момент участок, то он компактизуется в 25 нм фибриллу.

2. Использование метода "распластывания" по Миллеру суммарного гомогената слюнных желез позволило получить большое количество хорошо расправленных гигантских полирибосом, содержащих от 79 до 146 рибосом. Высказано предположение, что на этих полирибосомах происходит синтез секреторных белков, соответствующих фракции вр-l. Показано, что гигантские полирибосомы делятся на два класса по наличию на 3' конце группы из нескольких рибосом, не содержащих видимой полипептидной цепочки. Обсужцена возможная роль этих концевых рибосом.

3. Разработан метод изолирования и быстрой фиксации политенных хромосом из слюнных желез личинок хирономуса, позволяющий использовать для исследования хромосомы низкой степени политении. Сравнение структуры петель в составе изолированных хромосом, в изолированных ядрах и in situ показало, что в процессе изолирования происходит укорочение петель приблизительно в 1,6 раза. Такое сокращение петель однородно и не вносит изменений в сделанные выше выводы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Haslch S., BJorkroth В., Daneholt В. Reconstruction of whole transcription domains In Balblanl rings. // KI/CMB Conference. Skokloster, Sweden. - 1990 - p.86.

2. Киселева E.B., Масич C.B. Электронно-микроскопический

-14-

анализ структуры гигантских полирибосом из клеток слшных желез Chironomus thummi. // Молекулярная биология - 1991, т.25, Вып.5, стр.117-124.

3. Maslch S., BJorkroth В., Daneholt В. Three-dlKenslonal reconstruction of transcription loops ln Balblanl rings. // Kl/СКВ Conférence. Solbacka, Sveden. - 1992 - p.16.

4. Maslch S., Zalnlev G., Skoglund II., Daneholt B. Three-dlaenslonal structure of transcription loops ln Balblanl ring. // In préparation.