Структурная лабильность фотосинтетических реакционных центров и ее роль в электронном транспорте

Нокс, Петр Петрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурная лабильность фотосинтетических реакционных центров и ее роль в электронном транспорте
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурная лабильность фотосинтетических реакционных центров и ее роль в электронном транспорте"

0 9 9 Я

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

НОКС Петр Петрович

УДК 577.1:577.3: 577.346: 577.355

СТРУКТУРНАЯ ЛАБИЛЬНОСТЬ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ И ЕЕ РОЛЬ В ЭЛЕКТРОННОМ ТРАНСПОРТЕ

03.00.02 — биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1992

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Э. А. Бурштейн

доктор физико-математ. наук, профессор Ю. Б. Гайдидей

доктор физико-математических наук В. И. Лобышев

Ведущая организация: Институт почвоведения и фотосинтеза РАН

_ зо

Защита состоится « > о 1С 7" 1992 г. в час.

на заседании Специализированного Ученого Совета Д 053.05.53 по биофизике при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ

Автореферат разослан « » 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биол. наук, профессор

Т. Е. Кренделева

PUKCKKCKAH ; ft ,1.-3 i

СУДАРСГВ-У'^Я

5 К t"л!чу; ;v'a OBLAd.ХАШЙЕЗМШ работы

Начальные стадии, фотосинтеткческого преобразования энергия осуществляются, в так называемых реакционных центрах (РЦ), которые можно определить как структурно-функциональные белково-пигментные единицы, способные к фотохимическому разделению зарядов кеаду встроенными в белок донором хлорофилльной природы а акцепторами электрона. ЕЦ обеспечивают стабилизацию фоторазделенннх зарядов, на времена, достаточные для сопряжения крайне быстрых процессов, транспорта электрона в комплексе фиксированных в белке переносчиков. с последующими более медленными стадиями электронного пе'рено-са,. контролируемыми диффузией.

Актуальность исследования, механизмов, переноса электрона в фото синтетических БД связана с фундаментальностью проблемы изучения их уникальных функциональных свойств, с широкими возможностями, реализации, результатов - в частности, для дальнейаего развития теория электронного транспорта в биологических системах, для непосредственного практического применения принципов функционирования. и самих ыакромолакулярпых комплексов в конкретных фатопреоб-разующих устройствах.

Многочисленные эксперименты, проведенные на модельных системах, убедительно показачи, что на реакционную способность и эффективность взаимодействия редокс-компонентов фотосиатзтических электрон-транспортных цепей решающее влияние оказывает их окружение (Замараев, Хайрутдинов, IS86;. ¡Еафирович, Шилов, 1Э86; Боровков и др., 1989; Pujtta et al., 1982; Boxer et al.,1985j Heltele et al., 1985;lilller, 1985|Waaielew3ki, 1988).0но определяет расстояния меяду реагентами, nx необходимую ориентацию,, полярность и другие детали, молекулярной организации среды, контролирующие направленность и скорости, переноса электрона. В природных комплексах РЦ роль этого окружения выполняет белок. Однако, вплоть до недавнего времени считалось, что фхзтослнтетнческие белки, в основном, выполняют только функцию носителя связанных с ними редокс-коф^акторов, эффективность переноса электрона меаду которыми регулируется главным образен/, высокочастотными внутримолекулярными колебаниями самих переносчиков, акцептирующими, часть энергии, переносимого электрона (Patera et al., 1978; De Vault, 1980; Jortner, 198Ó). Вместе с тем, дальнейшее развитие исследований, особенно стимулированное изучением температурных зависимостей электрон^-транспортных процессов в РЦ, показа-' ло„ что адекватная физическая картина функционирования, этих коып-

лексоа должна, по-видимому, обязательно учитывать также и роль низкочастотных движений белка (см., напр.; КаЫЛап!., Ка]с1г&п1, 1981; К1гта1ег вt аХ., 1985;. Рубин а др., 1987). При этом, как начинает вырисовшзаться, значение последних скорее всего значительно иире, чем просто возможность внесения определенного, пусть даже существенного, вклада з процессы диссипации части энергии при стабилизации переносимого электрона на. редокс-кофакторах. Важнейшая роль динамической организации структуры РЦ могла бы заключаться в том, чтобы служить основой для реализации конкретных реакци-онноспосабных состояний системы, эффективно контролирующих функциональную активность. В этой случае просматривается определенная аналогия с традиционными каталитическими белками, реакционная способность которых неотделима от их динамической организации., ее тесной связи, с состоянием окружения, составляющим, вместе с самим белком единое взаимодействующее целое. Можно ожидать, что и в комплексах фотосинтетических РЦ тонкая сбалансированность их динамической макромолекулярной структурц могла бы выполнять ключевую роль для точной "настройки" согласованно протекающих функциональных электрон-транспортных процессов.

В связи с этим основной целью настоящей работы явилось исследование конкретной роли структурной лабильности фотосинтетических ЕЦ а их функционировании на различных этапах разделения разноименных электрических зарядов, влияния окружения РЦ и ряда физико-химических факторов, на структурно-динамическое состояние этих макро-молекулярных комплексов и их электрон-транспортную активность.

Объектом исследования были изолированные РЦ и фатосинтетичео-кие мембраны пурпурных бактерий, а также хларопласты высших растений.

Были, поставлены следующие задачи;

- исследовать, основные пространственные характеристики фотопре-образующих комплексов бактериального типа, изолированных в водво-буферюа- окружение и. в пленках Ленгыюра-Блоджет г влияние состава растворителя на эти. характеристики;

- детально исследовать электроа-транспортные процессы между ре-данс-компонентами РЦ пурпурных бактерий, начиная с сверхбыстрых пихо-нанасекундных стадий электронного переноса, в условиях направленной модификации структурно-динамического состояния препаратов;

- провести, параллельные исследования в аналогичных условиях кон-фориацаонной динамики образцов, используя набор эндо- и экзогенных

индикаторов подвижности различных областей препаратов в различных времешшх диапазонах;,

- детальна изучить роль температурного и гидратационного факторов в регуляции фотохите ской активности РЦ,

- а также оценить влияние а\1фиф;1льного окружения РЦ в изолированном и мембрана связанном состоянии на функционирование различных звеньев электроы-транспортыой цепи данных комплексов;

- исследовать возмолшуа роль струкгурно-динаклческого состояния в функционировании РЦ фотосистем II высших растений и участия в процессах регуляции их ашпшности внутркмембранных электрических ' полей.

Научная новизна. В работе впервые определены размеры и форма двух белково-пигыентных комплексов бактериального типа - РЦ йь. sphaeroidea и РЦ-цитохромного комплекса Chr. minutiaaimum, изолированных в водио-буферное окружение. Показана возможность влияния состояния растворителя на размеры комплексов. ■

Всесторонне обосновано наличие начального.и релаксированного состояний ион-радикальной пары РЦ пурпурных бактерий и участие внутрибелкових водородных связей в релаксационном процессе, сопровождающем временами стабилизацию ион-радакальшх фотопродуктсв.

Показано, что реакции с участием хкношшх акцепторов зависят от возмокности локальных конформационных изменений РЦ в связи с изменением, зарядового состояния переносчиков электрона и варьированием внешних условий;, построена кинетическая модель процессов, учитывающая конформационше перестройки комплексов. Показано, что температурные эффекты в реакциях электронного переноса в РЦ, включая начальные процессы, могут быть связаны преимущественно о кои-формационными степенями свободы. Оценены термодинамические характеристики отдельных конформацианных состояний ЕЦ и характерные времена переходов РЦ между конформациями,. регулирующими перенос электрона ме;;ду первичным и вторичным хинонами.

Установлена корреляция между характером внутримолекулярной подвижности различных областей РЦ и активностью отдельных звеньев электрон-транспортной цепи. Исследовано влияние структурно-динамического состояния аыфифильного окружения РЦ на функционирование различных участков электрон-транспортной цепи этих комплексов.

Впервые проведено шогостороннее исследование с привлечением-комплекса методов радио- и оптической спектроскопии динамика различных структурных компонентов фотосинтетического аппарата пурпур-

ных бактерий а функциональной активности отдельных звеньев электрон-транспортной цена РЦ в зависимости от степени, гидратации препаратов - мембранного уровня организации и изолированных при помощи различных детергентов РЦ.

Впервые изучено влияние постоянного внешнего электрического поля на термолвшшесценцию хлоронластов высших растений. Показано, что- процессы фиксации фоторазделенных зарядов в фотосистеме II также могут зависеть от различных структурных состояний фотосинтетического аппарата, переходы медду которыми управляются, в частности, внутримембраншми электрическими полями.

Практическая значимость. В работе всесторонне раскрыта роль структурно-динамической организации фстсеинтетического яппарата в процессах высокоэффективного преобразования световой энергии реакционными центрами. Эта имеет не только фундаментальное значение для развития теории, электронно-коифорыационных взаимодействий и биокатализа в целом, но и для. биотехнологических задач. Исследована возможность практического применения бактериальных РЦ в качестве элемента новых фотопреобразующих устройств. Отработаны методики получения ориентированных пленок активных РЦ и предложен макет высокочувствительного спектрального устройства на их основе. Впервые получены ориентированные многокомпонентные мультислойные структуры с участием активных РЦ-цитохромных комплексов бактерий, что открывает реальные возможности конструирования упорядоченных молекулярных ансамблей с заданными свойствами. 11а примере исследования эффектов миллиметрового излучения нетешгавой интенсивности показана возможность эффективного использования фотосинтетических РЦ в качестве чувствительных тест-систем внешних воздействий, влияющих на структурно-динамическое состояние функциональных белков.

Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались на 9 конференции ревз (Будапешт, 1974), симпозиуме "Пиг-■ мена-белковые комплексы в фотосинтезе" с Познань, 1975), венгерско-польском. симпозиуме (Сегед, 1977),, международной конференции па квантовой химии, биологин и фарыокологии (.Киев,. 1978), международной конференции, по воде и ионам в биологических системах (Бухарест, 1980), Еа I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), 4-ой конференции но люминесценции (Сегедг ВНР, 1982), международной конференции но применению эффекта Ыессбауэра (Ал-ма-Ата,1983), международной школа па физике ионной сольватации (Львов, 1983), 1-ой Всесоюзной конференции "Кинетика и механизм! электронного

переноса в белковых системах и их моделях" (Вильнюс, 1985), 4-ой Всесоюзной школе "Применение лазеров в биологии" (Кишинев, 1986), Всесоюзной конференции "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов" (Минск, I988J; 5-ом советско-ивейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функции" (Рига, 1988), 6-ой и 7-ой конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1988, 1991), Всесоюзной конференции "Преобразование световой энергии в фотосиа-тезирующих системах и их моделях" (Пущина, 1989), 8-ой Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии, и медицине" (Звенигород, 1990), 2-ом съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990), конференции по биофизике мембранных процессов <Опа-тия, Югославия, 1990), международном симпозиуме "Миллиметровые волны нетепловой интенсивности в медицине"'(Москва, 1991).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 54 печатных работах, а таюке тезисах перечисленных выше конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает общее введение, раздел "объекты исследования", 6 глав с изложением экспериментальных данных и их обсуждением, выводы. Материал работы изложен на 3??.стр. машинописного текста, содержит 61 рисунок " 24 таблицы. Количество цитируемых работ - 3 63.

основное ащтшш работы

В ОБЩЕМ BBiJIKHM. дан краткий литературный анализ состояния исследований структурнсмфушщиональной организации фотосинтетических РЦ, обосновывается, актуальность работы, формулируются ее задачи. В разделе ОБЪЖГЫ МССВДОВАНШ кратко охарактеризованы методики выделения и основные свойства препаратов фотосинтетических мембран и изолированных РЦ пурпурных бактерий, получение хлоропластом высших растений.

Глава I. ОСНОВНЫЕ ПРОСТРАНСТВЙШЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФОТОСИНТЕТОТЕСКИХ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ ИЗ Rb. spha-eroidea И ЦИТ0ХР0МС0ЛЕР2А1Щ РЦ КОМПЛЕКСОВ ИЗ Chr. minutiaaimum ПО ДАННЫМ РЕНТГЕНОВСКОГО МАЛОУГЛОВОГО РАССЕЯНИЯ

Уникальные функциональные свойства фотосинтетичсскпх РЦ но- • разрыв по связаны,, как становится ясно, со структурой этих комплексов.. Впервые прямая информация о последней для РЦ Rb. aphaeroides

а' РЦ-ццтохро.мшго комплекса ил Hps. viridis была получена на кристаллических препаратах методом ренхгено-структурнбго анализа, РСА (Allen et al.,19S7s Delsenhofer et al., 19B4). Вместе С тем ранее на изучалось пространственное строение сТотосшпетических белков в. водно-буферном окружении. Для получения, инфорг.нщш о пространственных характеристиках двух ислользоваваихся в настоящем исследовании комплексов - собственно ЕЦ из Rb.sphaeroldes и цитохромсо-держащнх ЕЦ из Chr. minutiesimum был применен метод рентгеновского малоуглового рассеяния. Работа выполнялась в лаборатории проф. Фейгина Л .А. (Ин~т кристаллографии РАН). Кривые малоуглового рассеяния измеряли для растворов с различной концентрацией белка и с различным содержанием детергента. Радиусы инерции частиц (Rg) , 'рассчитанные на основе этих измерений, составили 24,4±1 Я для РЦ Hb. sphaeroldes и 35,5*1 Ä - для РЦ-цитохромного комплекса Chr. vrainutissimum. При. построении моделей частиц учитывались и данные, полученные при изучении структурных характеристик пленок Ленгмюра-Блоджет на основе исследуемых комплексов. Так, определенные из изотерм поверхностного сжатия, площади, занимаемые комплексам на поверхности, раздела субфаз вода-воздух, были близкими к площади поперечного сечения приведенных на рис. I моделей. Макйимальные же размеры частиц согласовались со значениями.периода повторяемо-с-' ти структуры ыультислойных упорядоченных пленок, полученных с уча-стиеи данных комплексов на твердых подложках сем. гл. У1).

Размеры и. форму частиц Rb.sphaeroldes определяли путем моделирования экспериментальной кривой малоуглового рассеяния расчетными, при. этом. белковая глобула апроксимирсшалась эллипсоидами и цилиндра-.ш с различным соотношением осей. Пояс детергента вокруг ЕЦ (в данном случае - лаурилдаметиламиноксид, ЛДАО) моделировали палым щшшдраы, прилегающим к белку и занимающим ок.. 2/3 его поверхности. Еаилучаее соответствие для рассчетных и. экспериментальных кривых получено применительно к модели, представленной на рис. I Д. Сопоставление ее с данными РСА подобных комплексов показывает, чта высота данной модели практически совпадает с размером.' длинной, оси глобулы ЕЦ Eb. sphaeroldes в кристаллической форме. В то же время поперечные размеры оказались.меньше, чем в кристалле. Для последнего поперечпое сечение РЦапроксимируется эллипсоидам. с осями, в 40 и 60 i, Разница скорее, всего обусловлена ослаблением гвдрофобных взаимодействий в белке РЦ при кристаллизации из раствора, содержащего в несколько раз большую концентрации де-

(<- бо X

45 X

X /

30 X

Rb. sphaeroidea'

Б.

T7"

LA 1Л

VO CTv

— 40 X

— бо 2

Chr. minutieaimura

Рио, I. Построенные^ на основа данных малоуглового рентгеновского рассеяния модели фотосингетических РЦ из бактерий кь.арЬав-roidos и комплекса РД о многогемовнм цитохромом £ из chr» mlnutissimum изолированных в водно-буферное окружение. Цитохромная оубъединица в последнем олучае представляется верхним эллипсоидальным телом. Штриховкой обозначен пояо детергента (ДШО - в случае Rb.sphaeroides , тритон X-IOO -для Chr. minutissimum ), окружащего гидрофобные облаоти белков.

тергента, чем образцы, используемые для малоугловнх измерений. О том, что состояние растворителя действительно влияет на пространственные характеристики РЦ свидетельствуют изменения Rg РЦ Rb. sphaeroidea при добавлении к водно-буферной среда их суспендиро-вания криопротекторов - длметнлсульфокспда (Д.МС0) а пропиленглико-ля. Так, в препаратах, содеряадах 40 о6.% Д.М00 или 50 ой.% прогш-ленгликоля, Rg частиц возрастал соответственно на —15% и на «10^. Изменения размеров частиц при этом сопровождались изменениями в кинетике начальных электрон-транспорт:<ых событии в РЦ (см. гл. II).

для ЕЦ-цптохромяого комплекса из Chr. minutissimun моделирование его пространственного строения проводили путем рассчета функции распределения расстояний р(г) ^характеризующей попарное распределение расстояний мекду любыми элементарными объемами внутри исследуемой частицы) по задаваемым для конкретной модели пространственным параметрам п сопоставления ее о соответствующей экспери- • ментальной кривой. Полученные форма и размеры комплекса представлены на рис. 1,Б. Максимальный размер его, непосредственно определяемый из экспериментальной кривой р(г), составляет 110*10 8, а высота согласуется такде со значением периода повторяемости структуры, полученного при измерении пространственных характеристик в упорядоченных мультаслойшвс пленках из данных комплексов и чередующихся с ними монослоев жирной кислоты (см, гл. У1). Если сопоставить параметры модели с данными РСА для функционального аналога исследованного комплекса - РЦ-цитохромнога комплекса Rps. viridis, то каиболыаее отличие выявляется в отношении максимального размера частиц: комплекс из Rpa. viridis в кристаллической форме апроксн-мируется эллипсоидальным телам, с осями в поперечном сечении 30 и 70 R и высотой ISO SL Существенное отличие в высоте двух комплексов позволяет предположить, что впервые усташвлешея на кристаллах из Rps. vixidiB пространственная структура комплекса РЦ с шгагогемовым. цитахромом возможно не является универсальной для. различных, бактериальных образцов. Учитывая"йиеакую степень близости молекулярных масс комплексов и. составляющих их макромолекуляр-ных компонентов, выявленная разница может отражать щ&де всего отличия в пространственной компоновке многогемовых цитохромных субъ-единвд по отношению к белку собственно РЦ., Это в свою очередь означает, что. вероятны вариации в топологии геыав относительно фотоактивного пигкента РЦ, что дошйю, очевидно, учитываться при анализе процессов переноса электронов от гемов к бактершхлорофшиу РЦ

Глава II. РОЛЬ СТРУКТУРНО-ДШАИГШХОГО СОСТОЯНИЯ ЕЦ ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ. В ПРОЦЕССАХ СТАБИЛИЗАЦИИ ИОЕ-РАПИКАЯЬНО! ПАРЫ. ИССЛЕДОВАНИЯ В УСЛОВИЯХ НАПРАВЛЕННОЙ МОДИФИКАЦИИ СТРУКТУШ РЦ.

Данные исследования выполнены на препаратах фотосинтетических мембран Схроматофоров) бактерий иъ. aphaeroides и R. rubrum и изолированных при помощи детергента ЛДАО РЦ Rb. sphasroldea - дикого типа и бескаротиновдного шташа Е-26. Последовательность и характерные времена прямых и обратных процессов переноса фотомобилизованного электрона в РЦ этих бактерий выглядят следующим образом: р 3-6 пс. j 150-200 пс. Q -ICO мкс^ л -Юно "^-100 мс ь Яс ' ^ где Р - фотоактивный дамер бактериохлорофшиа, I - промежуточный акцептор электрона (бактер^офеофитин), QA - первичный и - вторичный хиконные акцепторы.

Было показано, что на начальных стадиях электронного транспорта от Е к промежуточному акцептору I и затем к Q^ динамическая организация ЕЦ прежде всего служит основой для протекания быстрых релаксационных процессов в окружении первичных реактантов, что обег спечивает эффективную стабилизацию электрона на промежуточном акцепторе. В этих процессах участвует система водородных связей РЦ.

Данные выводы получены на основе всестороннего исследования процессов первичного разделения зарядов при различных направленных воздействиях на структурно-динамическое состояние препаратов: в результате замещения гидратной воды водой различного изотопного состава, модификации водородных связей в образцах криопротектора-ми, одно- и многоатомными спиртами, апротонными растворителями, дегидратации образцов. Кинетики флуоресценции и изменений поглощения Р и абсорбционных изменений бактериофеофитина в контрольных и дейтерированшх ЕЦ схематически представлены на рис. 2 и 3. Как видно из этих рисунков, замещение 1^0 ка ^Н^О в ЕЦ приводит к резкому изменении характера регистрируемых кинетик С сходные эффекты наблюдаются и после других воздействий, модифицирующих систему водородных связей ЕЦ).. Анализ этих изменений показывает, что вэотол-вов замещение ведет к уменьшению эффективности, фоторазделення зарядов между Р и Од, увеличению времени жизни, ион-радикальных фотопродуктов Е+ и I", появлению рекомбинационного процесса между фотоактивным пигментом и промежуточным акцептором. Эффект дейтерира-

Р*ША а "а"

к-1 (р+Г(}А)1 - -1« (р+1"<}а)г - "г"

3(Р+1"ЧА) - "ТГ" К4

К? КГ1

РЮА • "О" К > ¡1,2 > КН

Рас. 2. Схема элактрон-транспортных событий и схематическое представление типичных кинетшс флуорасцанции и абсорбционных изменений, сопровождающих пареное электрона в системе в открытых неиодифицированных РЦ Р.ъ. врЬавго1йез. Индексами "О", "в п обозначат! соответственно основное и сикглэтно--возбувдэнное состояния РЦ, "1", "г', "Тг " - начальное, ролаксированноа п трицлотнов состояния ион-радикальной пари. " <5 я - состояние о разделэгашыа мэзду Р я'фд зарядами.

Яд Я

к-1 * "1" 1

кп к-г Кг к3 п дн?

«т.г К4

"0"

кн

¿К^1 5-7 по)

дАт

Абсорбция

(<-0,7 не)

< (Г- 100 но)

(^0,7 но)

Рис. 3. Схема электрон-транспортных событий к схематическое представление типичных кинэтик флуоресценция и абсорбционных изменений, сопровождающих перенос электрона в системе

Р, I, в РЦ иь.врЬаего1ава о модифицированными водородными связями. Обозначения индексов - см. рао. 2.

ваьшя обратим. Существенно, что замещение 1^0 на Н^ О на функциональную активность не влияло.

Наблюдаемые кинетические эффекты можно объяснить полагая, что энергетическое положение уровня с разделенными зарядами между Р и I не является фиксированным, и что оно понижается в ходе стабилизации электрона на I в результате процессов молекулярной релаксации в окружении первичных реактантав с участием внутрпбелковых водородных связей. Предложена схема начальных электрон-транспортных событии в бактериальных ВЦ, отличительной чертой которой является наличие начального и релаксированного состояний ионг-радиЕаяьшй пары. В ыатившх препаратах в результате быстрого прохождения ре- . лаксационшго процесса ьшотрелаксированное состояние не оказывает существенна выраженного влияния на начальные электрон-транспортные события - рис. 2. Оно, однако, начинает заметно проявлять себя в кинетике окислительно-восстановительных превращений первичных реакталгоа после модификации водородных связей РЦ - рис. 3.

На релаксационные процессы, сопровождающие стабилизацию электрона на I оказывает влияние рН. препаратов ([сходные с дейтерирова-ниам кинетические эффекты наблюдаются' при смещении рН в обе стороны от оптимума), присутствие заряда на С) д (влияние последнего в свою очередь зависит от структурного состояния глобулы РЦ). Вместе с тем релаксационные процессы в значительной степени не зависят от изменений в широких пределах вязкости препаратов, от структурно-динамичесного состояния поверхностных областей РЦ и его мембранного окружения. 0 последнем свидетельствуют исследования структурно-динамических характеристик препаратов мембран и изолированных РЦ с помощью сшшовых меток, и зондов в условиях модификации их водородных связей рядом органических добавок а в присутствии солей лиотропшй серии. 1'акке было установлено, что даже практически полная иммобилизация - по данным методов ыессбауэровских и спиновых меток - общей структуры РЦ при дегидратации, которая наступала а случае мембранных препаратов при. содержания вода в них, еще не вызывала изменений Функциональной активности. И только при дальнейшем удалении наиболее тесно связанных с белком- РЦ фракций воды, когда ее содержание снижалось до уровня ^ 2-3$, начинали проявляться функциональные изменения, приводящие в конечном итоге к значительному снижению (на порядок по сравнению с контролем) эффективности разделения зарядов а РЦ. Очевидно, что дпя модификации. релаксационных процессов, сопровождающих первичное разделение

зарядов, должны затрагиваться определенные водородные связи существенна в глубине белковой глобулы.. Действительно, сопоставление величины эф;-екта в рядах однотипных органических добавок, модифицирующих функциональную активность,, показало» что их воздействие связано со способностью проникать в гидрофобные области препаратов. Максимальный эффект оказывали агенты с высокой проникающей способностью в сочетании с большими значениями протон-акцепторюй силы и дипольшго момента. Модификация внутренних структур химическими добавками, влияющая на релаксационные процессы, приводила к изменению состояния окружения порфириновых компонентов РЦ. Об этом свидетельствуют измерения спектров кругового дихроизма препаратов РЦ. При этом, однако, не происходило заметных изменений в расстоянии и/или взаимоориентации между первичными реактантами. О последнем можно была судить на основе триплет-шнус-синглетных спектров, фотоактивного бактериохлорофилла, измеренных в присутствии ряда модифицирующих добавок. Сам же факт регистрации даншгх спектров для препаратов с открытым переносом электрона на Од после их модификации служит независимым подтверждением увеличения времени жизни, пары Р+-1- в этих условиях, являющегося предпосылкой для возможности интеркомбинациошой конверсии РЦ в триплетвэе состояние.

Влияние на быстрые процессы прямого переноса электрона от фотоактивного пигмента к первичному хинону модификации структурного состояния акцепторного участка в результате замены естественных хинонов другими было исследовано при замещении убихлыона-ТО в РЦ на антрахинон и дурохинон. Результаты показали, что эти замеш не влияли на релаксационные процессы, сопровождающие стабилизацию промежуточной ион-радикальной пары, однако вместе с тем существенно замедлялась скорость переноса электрона от Г к (}д: до «400 пс в случае замещения убкхинона-Ю на дурохинон и до е=900 пс в результате замещения на антрахинон. В последнем случае такое замедление скорости, приводила в конечном, итоге к снижению ва »10% квантового выхода разделения зарядов между Р а Од. Следует указать, что дурохинон а качестве Од имеет более положительный, а антрахинон - более отрицательный сшислительно-восстановительный потенциал по сравт-нению с убюошонсм. Это означает, что. на скорость переноса электрона си I к Чд кроме взаимного положения энергетических, уровней с разделенными между Е а I и 2 к 0А зарядами с рис, 2) влияют а другие факторы. Прежде всего это, очевидно, отличия в параметрах связывания различных хинонов в специфическом локусе белка РЦ.

Можно заключить, что оптимальные условия для быстрого прямого переноса электрона от ¿¡отоактивного пигмента к промежуточному акцептору и затем к первичному хинону обеспечиваются с одной стороны эффективными процессами, молекулярной релаксации с участием водородных связей РЦ, а, с другой стороны, и определенным стереохи-мическим соответствием реактантов внутри РЦ, обусловливаемым специфичностью связывания редоке-кофакторов в структуре белка.

Участие водородных связей в обсуждаемых релаксационных процессах может быть связана, например, с сопряженным с разделением зарядов смещением протонов между электроотрицательными атомами, формирующими эти связи. Известные данные РСА позволяют пр;шлечь к рассмотрению^ в связи с вопросом временной стабилизации первичных фотопродуктов, конкретные водородные связи в их окружении; проведены первые оценки в этом направлении (Н1сЬе1-Всувг1е ег в1.,1988}Теагеа е* о1.,1988{ БеАвепЬо!ег, И1сЬе1, 1909). возможно, также, вли-

яний состояния водородных связей РЦ на низкочастотные движения белковой /.-спирали. Эти движения по оценкам (Как1гап1, Как1гел1, 1981) могут играть существенную роль в процессах стабилизации первичных фотопродуктов, а рассчеты показывают их вероятную высокую чувствительность к конформационноыу состоянию макромолекулы и к влиянию коллективных флуктуаций ее слабых связей - особенно водородных связей (СЬо-а, 1983, 1985). в любом варианте, однако, вовлечения водородных связей в релаксационные процессы они должны обеспечивать необходимую стабилизацию первичных фотопродуктси даже при сверхнизких температурах, поскольку эффективность начальных элекг-роа-транснортных процессов в РЦ не снихается вплоть до 4 К., их скорость при.'этом, наоборот, возрастает. Для подобного характера температурных зависимостей электрон-транспортных реакций ранее было предложено квантово-механическое объяснение, основанное Еа связи электронного переноса с колебательшгл степенями свобода в системе (¿ГогЪпех, 1980; КаИЛап1, КаИЛап1, 1981). С этих позиций, а имент - на основе изменений степени перекрывания ядерных волновых функций начального и конечного состояний переносчиков, интерпретировалось исследователями в частности увеличение в 1,5-2 раза скорости переноса электрона в бактериальных РЦ при низких температурах (К1гса1ег а* еЛ., 1935). Вместе с тем, проведенный совместна с Дегаденко АЛ. (.НТО АН Украаш) » Логуновым СЛ. аситз температурной зав'лсглмостг данного процесса на основе преялокошюЗ выаа схеш начальных электрон-транспортных событий в Гц показал.

что, в принципе, возможна и другая пнтерпретац;:я. От основывается на предпаюденил, что элементарные акты переноса электрона в РЦ слабо зависят от температуры, а наблюдаемые в эксперименте температурные эффекты связаны с конформацпоннкми степенями свободы. В последней случае регпстрдруе:.ля температурная зависимость обусловлена тем, что при высоких температурах за счет тепловых движений реализуется определенное равновесие ме:;-ду релакспрованным и начальным состояниями ;;он-рад:пгльной пары P^-I" с частичным заселением последнего, перенос электрона с которого на Од характеризуется меньшей скоростью, чем из релаксированного состояния. По мере понижения температуры заселенность начального состояния падает, что приводит к некоторому увеличению скорости переноса электрона к Q^. Ответим, что представления о связи геисературных о&сктов в электронном переносе в ЕЦ с конфирмационными степенями свободы, включая ранние электрон-транспортные события, в настоящее время начинают все шире обсу.ждаться исследователями. В частности, и температурная зависимость переноса электрона от I к в недавней работе (Kirma-ier, Holten, 1990) объясняется на основе зависимости от температуры переходов белка РЦ ме:.ду конформационными подсостояниями, характеризующимися разными скоростями переноса электрона к фд.

Структурная лабильность фотосинтетических РЦ, характер ее зависимости от внешних условий оказывают самое существенное влияние на направленность и скорости также последующих более медленных электрон-транспортных процессов с участием хиноннъх кофакторов, что детально рассмотрено в следующей главе.

Глава III. РОЛЬ КШФОРйДШШЫОИ ПОДВШОСЩ РЦ ПУШНЫХ

БАКТЕРИЙ В РЕАКЦИЯ! С УЧАСТИЕМ ХШОННЫХ АКЦЕПТОРОВ

В этой части работы были детально исследованы процесс прямого переноса электрона от первичного хинонного акцептора к вторичному и реакция, рекомбинации фотсокисленного Р с восстановленным Од в условиях направленной модификации структурно-дангл^ическсго состояния препаратов (хроматофоры, изолированные с помощью различных детергентов РЦ Hb. aphaeroidaa, Л.гиЬгшОварьированиеи температуры и. стецехл гидратации препаратов, изменением вязкости и изотопного состава среды суспендированвя, применением молекулярных сшивок. Анализ совокупности экспериментальных данных привел к представлению о локальных конформационкых изменениях реакционного ценг-тра в связи с изменением зарядового состояния переносчиков, варьи,-

равшиеы. внешних условии проведения эксперимента.

Типичные эксперименты представлены на рис. 4, где приводятся кинетики фотоиндуцированных изменений поглощения бактериохлорофид-ла после его световой активации в условиях реализации обратимого взаимодействия Е с хинонными акцепторами. Быстрый миллиоекундный компонент темновато восстановления Е+ сего характерное время составляет ~100 мс "при комнатной температуре, сокращаясь в адаптированных к темноте образцах в 2-3 раза по мере охлаждения до -120° + -14йа) отвечает реакции медленный секундный - Од-*-Е+ взаи-

модействии. Соотношение вкладов дянныт компонентов в сушаршй процесс восстановления Е+ характеризует эффективность прямого переноса электрона н между Од и Из рис. 4 видно, что эта эффективность снижается по мере охлаждения образцов в темноте. В то же время. для. замораживаемых на свету препаратов кинетическая картина оказывается принципиально иной. В этом случае часть Е фиксируется в окисланном состоянии, а в той части центров, которые сохраняют способность к обратимым фотореакциям, их кинетические характеристики практически не отличаются от таксшнх для РЦ при 20°С. йриш примером. последнему может служить впервые отмеченный, наш и затеи подтвержденный другими, ее следователями Ше1и*в1й «4 о1., 1934) факт отсутствия температурной зависимости св отличие от охлаждаемых в темноте РЦ.) реакции ^ 1 рякомбинации во всем диапазоне температур 01 20й до -196°„ Очевидно, что световая активация приводит к. формирования нового структурного состояния ЕЦ, которое может фиксироваться, низкой температурой. Способность к формирования "светового" состояния падает по мере понижения начальной температуры включения активирующего света. Она также уменьшается пра увеличении вязкости среда сусаендяровакия образцов. Фиксации освещаг-еьанх ЕЦ в неактивном состоянии шжш достичь и при комнатной теи-пзратзре» обрабатывая Еа свету препараты ЕЦ с "разрыхленной" да-торгентсаг структурой саивашцамн. бедки агентами. Еааличия структур-ео-дшамииесюго состояния, схлаждаегагх 11 т слюне ш на сеоту образцов подтверждают такжо дашше алектретио-терлического анализа, 1 страхакцега ралаксагезэ к ршшазеехкау состояшз варяжепшх грухш в. диполей е продассо кагревашя препаратоз, предварительно шляри-еуеиг шшзнпу алектрпчеенна поле«: во- вреул схлаздесия. Оказалось, схгаздсЕг на езету ца^ет ¡^мгхка »икать форму к. кгяенсгзиость рагистрлруоп даппои метода 'тогез терхязполярпаации по сразпе-с обргаге^з, елладдаюггз!. в тслиотс., Вахко отметить, что спо-

Рис» 4. Канатика фотоиндуцированных изменений поглощения бактериохлорофилла Р в водно-глицериновой (60 об,% глнцарина) суспензии хроыатофоров к. гиЬгип в зависимости от темиэра-туры в образцах адаптированных к темнота (I) или к действующему (*Ю2 Д1-ы-2-с_1) свету ( II ). -^регистр.3 870 Ем> Стрелки вверх - включение,, вниз - выклшониа постоянного действующего света.

У- эффективность прямого переноса электрона в система хинонных акцепторов ЧдОд, опредэляамая как отношение весов быотрого миллисекундного (п ) и медленного (секунды и более, " ) ком. понзнтов в кинетике тамнового восстановления Р+. £- доля "необратимого" окисления бактериохлорофилла Р в образцах, охлаждаемых на действующем свету.

собность к фиксации'поляризованного состояния существенно связана с натквностью белковых компонентов образцов. Подобные (¿акты свидетельствуют о возможности существования белка РЦ в различных конфор-мационных состояниях и показывают, что последние могут оказывать значительное влшнпе на электрон-транспортные процессы.

Обобщение результатов по кинетике пигмент-акцепторного взаимодействия в бактериальных РЦ в зависимости от температуры и режимов освещения позволило предложить следующую общую схему событий, удовлетворяющую экспериментальным данным:

ИД в. состоянии'с окисленным Р

?1 В.

-I

«2

состояние с отсутствием эффективной стабилизации, электрона на Qg

P+QACÇ p+qA0i

состояние с эффективный переносом электрона от 0А к 0В

Существенной чертой предложенной схемы является введение отдельных ксшфармационвых состояний РЦ с собственными в каждом случае значениями констант скорости электронных (.прямые стрелки) и конЕюрмаци-анных (волнистые стрелки) переходов. Схс;-.а позволяет не только качественна объяснить опытные данные, на a получить количественные соотношения между экспериментально намеряемыми показателями и параметрами модели. Результаты кинетического диализа модели, выполненного совместно с В ЛЛаркяненоа и Э.1 .Петровым (ЙТФ АН Украины) для условий различных температурных и световых режимов проведения экспериментов, в частности показали, что наблюдаемые в эксперимзн-те температурные эффекты в реакциях электронного переноса между Е,. QA в Qg могут быть описаны соответствующими зависимостями коа-стант чисто канфоркацишшых переходов при слабой зависимости от температура собственно электрон-транспортных актов. Также, согласно оценкам, состояние, в котором осуществляется эффективный пере-ис электрона от к Qg, обладает более высокой энтальпией по cpai!iisiX3 с состоянием, в катара.! электрон не стабилизируется на Qg. Одкаг.э, первое состслгиз ыогст роадизозиваться в ф.изполсггчес-

ких условиях с г.-аксимальной вероятностью благодаря выигрышу в энтропии.

В соответствии с предложенной схемой била также проведена экспериментальная оценка величины констант темнового Jf2 и светового переходов рц между состояниями, контролирующими эффективность переноса электрона меаду QA и Qg. Это было сделано на основе специально выполненных экспериментов с быстрым изменением температуры образцов. Отработка условий резкого (до 15°/с) охлаждения препаратов позволила фиксировать при низкой температуре замораживаемые в темноте образцы с более эффективным переносом электрона от Од к 0gr чем при стандартных режимах охлаждения (ок. 0,1°/с). Анализ этих даншх показал, что в мембранных препаратах константа JC, имеет для комнатной температуры порядок десятков миллисекунд. Величину константы Хд светового конформационного перехода позволили оценить эксперименты, проведенные в ИОФ РАН. В этом случае охлажденные в стандартных режимах в темноте препараты освещали и подвергали. импульсному разогреву на свету тепловым лазерным излучением (71 = 2,94 мкм;. время разогрева образца •cl мс, время релаксации его к исходной температуре - несколько десятков мс). В результате наблюдалось увеличение эффективности переноса электрона по '

сравнению с ситуацией,, предшествовавшей тепловому воздействию. Из этих данных следует, что константа £2 для комнатной температуры характеризуется величиной того же порядка, что и для темнового конформационного перехода.

Наличие определяемых изменением температуры переходов бактериальных РЦ между различными реакционноспособными состояниями позволяет с этих позиций интерпретировать и аномальную (увеличение скорости при охлаждении) температурную зависимость реакции рекомбинации Р+ и <5д. Продолжительное время наблюдаемую зависимость пытались объяснять на основе температурно-обусловленных изменений скорости моноэкспоненциального процесса (см., напр.: Bolton, Coat, 1973; Hales, 1976; Romijn, Ameas, 1976). В ТО же время проведенный детальный анализ полученных для препаратов изолированных РЦ экспериментальных результатов показал, что рассматриваемый процесс имеет моноэкспокенциальный характер только на крайних - высоко- и низкотемпературном - участках, в-интервале жепромежуточных температур кинетика реакции лучшим образом апроксимлруется двумя экспонентами с временами, характерными соответственно для высоко- (8090 мс) и низкотемпературного (20-30 мс) диапазонов, и с изменяю-

20 7

щишся в зависимости от тешературы вкладами. Такое поведение рассматриваемого кинетического показателя хорошо согласуется со схемой температурнообусловлешшх переходов РЦ мевду состояшшми с различающимися значениями константы скорости рекомбинационного процесса. К выводу о возможности существования в бактериальных РЦ структурных подсостояный, характеризующихся разными временами прог-цесса Р+ и Q^ рекомбинации, склоняются при объяснении темперазур-■1ЮГО эффекта в этой реакции ряд других исследователей (Kleinield et al.I984 ). Сходное заключение о наличии распределения структурных состояний РЦ сделано и при изучении реакции рекомбинации, фото-окисленного хлорофилла с восстановленным первичным хиношшм акцептором в РЦ фотосистемы II высших растений (Gerten et al., 1939). Цри этом времепа переходов белка РЦ между различными состояниями оцешшаются в последнем случае порядком миллисекунд и выше (для комнатной температуры). Зависимостью от тешературы презде всего конформационных изменений РЦ,. сопряженных с переносом электрона мекду Р и Цд (фютоконформацпонного перехода), объясняют температурный эффект в реакции рекомбинации Р+ и авторы работы (Шайтан и др., 1991).

Характер внутримолекулярной динамики образцов,, шлеющей значение для формировать! конформационних состояний РЦ, влияющих на реакции с участием хинонных акцепторов, был детально исследован в экспериментах с параллельной регистрацией параметров функциональной активности и ряда показателей структурно-динамического состояния препаратов в контролируемых условиях температуры, степени гидратации, вязкости, состава среды. Динамику различных областей препаратов в различных временных диапазонах изучали с привлечением методов ЭПР, ЯЦР, ЯГР, люминесцентных меток и зондов. Типичные получаемые результаты представлены на рис- 5. Здесь приведены температурные зависимости индикаторов наносекундной динамики поверхностных областей исследуемых препаратов - время корреляции вращательной даффузпи спиновой метки (1-оксил-2,2,6,6-тетрал1етил-4-пи-иергдшйм-лодиц,':тамзд), присоединяемой к сульфгидрильным группам белковых компонентов, и спектральное положение ыакс;шума флуоресценции эозшювоп метки. 1>олее медленную динамику гидрофюбных участков отражает подвлкшсть спиновых зондов (на основе обычных мем-Ориишх лппздсь - лизолецптхна и стеариновой кислоты с нитроксиль-Ш.Ш ¿¡оплетши и полосе15 и 14 соответственно) и спектральное и одоление ;.:акс;;мд-л фоаТоресцищик тркптофанллов белка. На

Рио. 5. Теипврагурные зависимости времена корреляция (Т0) враща-тэльпой диффузии спиновых иэтка н зондов (А), спектрального положения максимумов флуоресценции эозикизотиоцианага я фосфорэсяшщяи тралтофанилоз болла (Б), а тсетз

гффоктивяоста 1я ) Чд-^-Зд переноса электрона а рогнстраруеиого врэиэиз рэагцга рекомбинации Р* й (В) в хроаатофо-

рах (сплопяая.линяя) п изолированных Щ (пунктир) п. гиЬгст.

этом же рисунке показаны температурные зависимости эффективности прямого переноса электрона между первичным и вторичным х/. но нами и. характерного времени реакции рекомбинации Р+ и <)д. Сопоставление такого рода данных выявляет корреляции между каносекукдной подвижностью поверхностных областей изучаемых препаратов и. переходами между состояниями, контролирующими. эффективность прямого переноса электрона в системе хинонов - звена электрон-транспортной цепи, локализованного вблизи поверхности РЦ. В то же время переходы между состояниями, определяющими время рекомбинации Р+ и Чд - процесса,, протекающего во внутренних структурах РЦ, - контролируются более низкочастотной динамикой внутренних областей.

Изменение структурно-динамического состояния окружения РЦ при переводе их из меыбраносвязанной формы в водно-буферную среду сходным образом отражается на температурных профилях динамических и функциональных показателей, сдвигая их в сторону более высоких температур, что отражено на рис. 5. Дополнительная модификация структурно-динамического состояния образцов путем увеличения концентрации испальзсшавшхся в экспериментах криопротекторав или добавлением Сахаров также приводит к сходным сдвигам в сторону более высоких температур температурил профилей показателей обоих типов - динамических а. функциональных (рис. б). Цахожие эффекты наблюдаются а после частичной фиксированной дегидратации препаратов. А в существенно обезвоженных образцах динамические и функциональные показатели практически не зависят от температуры (рис. 6, пунктир).

Следует также отметить обычно наблюдаемую близость энергий активации (Ка) для. сопоставляемых функциональных и динамических показателей. Как правило, на соответствующих температурных кривых, которые н общем заметно нелинейны, можно, в пределе, - в области низких и ближе к физиологическим температурам - выделить по крайней мере два линейных участка, позволяющих провести, подобное сопоставление. Согласно полученным оценкам, на низкотемпературном, криле эта значения Ед ниже (составляют единицу пиал/коль), чем е& ш-сошгемпературЕом. конце (ок» 10 ккал/шль). Еескатря, одного, на кавыка Еа, Еерохода «ищу коифор:.-лц2Яма в области низких темпа-рагур огранлчеси из-за сильного энтропийного торможения. Цр: возрастании же теглпоратура, особешо когда активизируется диехшл поверхностшх областей РЦ, ггерахедн иЕгесафщаруются, хотя пра этегг, угзелнчлваотсЕ. Еа„ благодаря внигр1С7 в Енграахи. ¿слс струк-

Рас. 6. Завпсдкоста or тешзрагура спектрального полатогаш aascfflxjKOD собственной фдуорзсцэшпда (Зодаа (А) а

эф^октпшостз (л ) QJ-> Qg переноса элоктрона (Б) в ГЦ яз • ПЪ. aphaexoldes с рЗЗГЗЧШШ С0£ЭртаНЯ8М ГЛЗЦОрМа (I - 60, 2 - 70 , 3 - 90 %), а таг^э в сисзтппной прз. гздгзнаа 10"^ :н р?.сг. агзтпо Щ (4). Б,5 - загасло сть о? теияаратурз ртпкярзруоглго врз::опл С tjyg) рзгктаа ?+ д ^д рокоаЗаса-:гл в cyxoi? пгэнзо РЦ.

турно-дшшмическое состояние образцов дополнительно модифицируется (например, повышением концентрации криопротекторов) , то не только в одну сторону изменяются значения сопоставляемых величин Еа, но также наблюдаются и коррелирующие между динамическими и функциональными показателями сдвиги по шкале температур точек "переключения" температурных участков с разными Еа. Сама нелинейность кривых: ойсуждаемых температурных зависимостей указывает, по-видимому, на существование различных кокформационных "траектории" реализации определенных структурно-динамических состояний, контролирующих функциональную активность..

Глава 1У. РОЛЬ ВОЛЫ В РЕГУЛЯЦИИ СТРУКТШЮ-ШАШЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ РЦ ПУРПУРНЫХ БАКТЕЙЙ, КОНТРОЛИРУЮЩХ РЕАКЦИИ С УЧАСТИИ ХИНОНННХ АКЦЕПТОРОВ

■ Существенное влияние на конформационную динамику и, соответственно, функциональную активность оказывает, как уже частично отмечалось выше, степень гидратации фотосшиетических образцов. В цикле исследований влияние данного фактора на реакции с участием хишнных акцепторов - эффективности прямого переноса электрона от <}А к и скорости ре комбинационного процесса между Р+ и - было изучено детальнее в условиях реализации фиксированных значений увлажненности на препаратах мембранного уровня организации,, отличающихся составом липидов, и на изолированных _ при помощи различных детергентов РЦ. Отличия в лшхаднш составе позволили одновременно анализировать влияние данного компонента на информационную динамику и функциональную активность образцов с рааличнсй влажностью. Использование в исследованиях различных вариантов методик НМР (включая протонный резонанс, резонанс на ядрах ^Р) дало возможность дифференцированно следить за поведением подвижных протонов в системе, состоянием белковых компонентов, полярных и не-палярных участков лишадшй фазы, В таком объеме подобные комплексные исследования, выполнявшиеся совместно с сотрудниками проф. Аксенова СЛ., проведена впервые.

Поведение функциональных показателей, содержание вода в образцах и количество, подвижных протонов, имеющих времена спзе-сшшо-вай релаксации Т^ОД не и Т2г1 мс представлена в зависимости ста относительна;', влажности срода снздгбдраваЕая для изолирование при птакзци ДДАО РЦ к хроматофоров Е. гиЬгиа ка рис. 7 а 8. Вид-га, что возможность переходов РЦ кзжду конфирмационными состояии-

Рис. 7. Рис. 8.

Рис. 7. Эффективность ( н ) переноса электрона и регист-

рируемое время ( процесса Р+ и рекомбинации в изолиро-

ванных РД И. гиЬгига в зависимости от относительной влажности Р/Р0 среда инкубирования -А;

Б - количество воды в образцах, регистрируемое методом Фишэра; В - суммарная амплитуда с:1гнала Л1ЛР спинового эха от подвижных протонов (I) и вклады его компонентов - о Т2~0,1 ыо (2) и Т2-?1 мс (3) - в пересчете на вас вода.

(—) - РЦ содержат в качества детергента ЛДАО, (—-) - Тритон Х-ЮО.

Рис. 8. А,Б,В - та но показатели, что а на предыдущем рисунка, но доя препаратов хроматофоров п. гиЪгит.

шли,, регулирующими в ре:, л рекомбинации Р+ и QJ, начинает проявляться по мере увлажнения высушенных образцов синхронна с увеличением амплитуды компонента в сигнале /LIP-сшшовое эхо от подвижных протонов,. имеющего время Т2~ 0,1 мс, что отвечает появлению коаформа-циошюй подвижности в системе. В то же время изменения в эффективности переноса электрона от QA к Qj происходят на более поздних этапах увлажкешш на ([юне резкого прироста содержания воды параллельно с появлением и увеличением вклада в суммарный сигнал ЯМР подвижных протонов с Тjil мс, т.е. при дальнейшем интенсивной растормаживании коыформационной динамика. Upi этом оказалось, что на зависимости от степени гидратации эффективности функционирования данного, локализованного вблизи поверхности РЦ, звена электрон—транспортной цепи, влияет состав лилидной фазы в фотосинтетической мембране или тип детергента в препаратах изолированных РЦ (последнее, в частности, отражено на рис. 7). 11х структурно-дина-мическов состояние определяет существенную для реализации конфор-мационных состояний, контролирующих перенос электрона от Чд к Ощ. наносекундную подвижность гидрофобного окружения РЦ и поверхностных областей самого белка. Вместе с тем, на скорость рекомбинаци-онного процесса между Р+ и Од, протекающего во внутренних структурах РЦ, состояние лилидной фазы препаратов заметного влияния не оказывает. Изменения этого показателя при варьировании степени гидратации коррелировали с изменениями более низкочастотной, по сравнению с поверхностными участками, динамики внутренних областей белка, менее чувствительной к внешним условиям и затормаживаемой при меньших влажшетях по сравнению с быстрой динамикой поверхности РЦ и его амфифильного окружения. Полученные корреляции между поведением функциональных и динамических показателей в зависимости от гидратации прежде всего выявляют связь функциональной активности с общим характером изменений подвижности препаратов. В то же время эти дашше могут служить источникам информации для дальнейшей детализации механизмов эффективного переноса электронов в системе хшюнных кофакторов, поскольку этот перенос тесно сопряжен, как теперь установлено, с процессами электростатической стабилизации восстаназл:ждешх хлнонов в результате направленных сдвижек протонов и/или протонсодерхадих групп в специфическом белковом окружении хиноаов (McPheraon et al., 1986; Paddock et al., 1989).

Результаты проведенных исследований также показали, что осо-беншетп строения лишцшой фазы,, влияющие на существенный для

функционирования поверхностного хинонного звена характер ее структурно- динамического поведения при изменении гидратации, связаны прежде всего с полярными участками липидов. Природа последних в первую очередь определяет сорбирующие характеристики липидного компонента и возможности его структурных перестроек при увлажнении. Вместе с тем, состояние липидного компонента и динамика его структурных переходов зависят, как оказалось, и от лшшд-белковых взаимодействий. Последнее проявляется, в частности, в сдвиге показателей гидратационных (сорбирующая способность) и динамических характеристик лишдной фазы фотосинтетических мембран или детергента в препаратах ЕЦ в область более низких значений относительной влажности среды инкубирования - к Р/Р0-0,3-0,5 - по сравнению с индивидуальными изолированными липкдами или детергентом. Взаимодействием с белком вероятно объясняются и резкие структурные изменения липвдной фазы препаратов в данной области Р/Р0^0,3-0,5, которые ваэсят существенный вклад, согласно анализу полученных результатов, в регистрируемый в этом диапазоне Р/Р0 значительный прирост количества сорбируемой веда и скачкообразное увеличение подвижности в системе (см. рис. 7 и 8). При этом, по-видимому, может скачком возрастать число доступных-для взаимодействия с водой полярных ■ групп липвдав (детергента) е достигаться их более упорядоченное расположение, что существенно влияет на гадратацианные и динамические характеристики последних. Белковый состав фотосшпетнчеоких образцов оказывает значительное влияние и на количества шлмавили,-эуемой шли (меняющей сваи динамические характеристики) воды. Об этом свидетельствуют исследования, проведенные методом КВЧ-диэлек-трометрии и измерения поглощения миллиметрового излучения в области дисперсии свободной воды препаратала изолированных РЦ (в таи числе и в условиях добавления модифицирующих структуру водного компонента кришротекторав). В экспериментах, выполненных па РЦ нь. орЬаего1аеэ и РЦ-цитахрокных комплексах СЪг. п1ютаз1сил выявлена существенная разница п количестве связываемой гая. води: у РЦ-цатахромвэго ютяшекса эта величина была гяисмум на порядок гпдго, прячем разница ке зависит, как было показало, от типа детергента, окружающего гидрофобные области белка.

Совокупность полутегглхг результатов свидетельствует, что-ГЦ Е-есте со стоки а?*£'ф«яьвуу сггрр'.е™е:1 а гадратго.Ч вода! прздетоз-ляет дивпгачеафа систему, в которой са ксг.ясшптц

влияют друг за друга,, а степень оводненюста является ктпзгг"1.

регулятором структурно-динамического состояния всего ансамбля, коа-тролуруя таким образом функциональную акгившсть этих белковых комплексов.

Глава У. РОЛЬ СТРУКТУРНОЙ ДШШСКИ «ОТОСЖГЕШШСОГО АППАРАТА. В РЕАКЦИЯХ С УЧАСТИЕМ ХЩОЩЫ! АКЦЕПТОРОВ РЦ ФОТОСИСТЕМЫ II шона РАСТЫМЯ; ВОЗМОЖНОСТЬ влияния ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ПОЛЯ НА ЗАСШШШОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ КШФОКЛАЦИОННЫХ СОСТОЯНИЙ

В данной главе показано, что способность к реализации определенных конформациошшх состояний, влияющих на реакции с участием, хя-шшшх акцепторов, распространяется очевидно и на структурно-фушс-циональную организацию РЦ фотосистем II (ФС II). Как известно, РЦ данного типа сходны с РЦ пурпурных бактерий строением макрсмодеку-лярного компонента и составом редокс кофакторов на акцепторной сто>-роне. Кроме того, в данных исследованиях получены результаты, свидетельствующие, что динамика переходов мевду различными реакционно-способными состояниями макет, в принципе, контролироваться помимо рассмотренных выше те;,лерагурного и гидратационного факторов также внутримембрашшми электрическими полями»

Функциональную активность ФС II изучали, анализируя термолюминесценцию СИ) хлоропластов. Последняя сопровождает индуцируемую повышением температуры рекомбинацию отрицательных зарядов, фиксируемых охлаждением в хкнонной части РЦ, с положительными зарядами, аккумулируемыми а кислородвыделяющей системе. В экспериментах исследовали влияние постоянного внешнего электрического поля на И хлоропластов гороха и шпината. Параллельно регистрировали токи тер-модеполяризацпл ( ТД) в образцах, отражающие подвижность и количество смещаемых внешним полем заряженных групп и диполей.

Эффекты электрического поля в суспензии хлоропластов исследовали. в экспериментах двух типов:.

1. Поло (до Ю6 В-м-1) прикладывали при прерывании нагрева образца в различных точках в интервале от -40° до -25°С. Регистрировалась вспшка люминесценции в этом поле. Затем продолжали нагревание.

2. Образец охлалдаш в электрическом поле, которое включалось так-ке п;л: различных теглеиатурах в интервале от -25° до -40°. При -70е (.тслх-прлгура, до ксгорой охлаждали образца) поле отключали и ,?ат¿.: ирап-и..'-".;'. н;прь;иншй нагрев препаратов. По сути это режим мемроти»-?» . гглеекзге ¿гдегэа,.' о котором уже говорилось в гл. Ы.

Для измерения токов Щ образцы охлаждали ва внешнем поле в режиме аналогичном условиям, эксперимента 2.

Установлены следующие основные закономерности. В суспензии ало-ропластов прямое воздействие поля во время прерывания нагрева приводил к вспышке свечения (рис. 9), пропорциональной напряженности поля. При дальнейшем нагреве наблюдается уменьшение интенсивности основных полос ТЛ, причем преимущественно правых частей данных полос» Влияние запасенного во врем охлаждения, "электретного" поля приводит к появлению новой полосы свечения в области —40-!—50° (рис. 10), близкой к локализации так называемой . zv полосы, природа которой дискутируется. Ира этом,, положение новой полосы ей зависят от интенсивности поля, а ее интегральная величина равна убыли основных полос ТЛ выше -20° (также - преимущественно правых их частей). Иными словами, под воздействием поля происходит перераспределение свечения основных полос ТЛ в новую низкотемпературную полосу» Измерения токоа ТА в препаратах (рис. 10) показывают, что шпетзтность "перекачиваемого" н вовую полосу ТЛ свечения коррелирует с интенсивностью этих токов, регистрируемых в одинаковых условиях воздействия поляризующим, полем (на рис. 10 это отражает равенство соотнесений площадей з^/ ц з 3^). Дейтерирование образцов привода? к сдвигу кривых токов ТД и полосы перекачиваемого свечения па 3—1° в сторону более высоких температур. В сухих плеппах хлорошгастса вайщцались такае корреляции между положением максимумов И а токоз ТД, а зависимости от гидратации а температурных диапазона соответственна световой анзшзацда (регистрация ТД) лаЗо Еоздайствия поляризующей полей (регистрация ТД).

Ссзокутшпсхъ найлюдеЕзД позволяет заключать, что фикседая фо-торазделенных зарядов а СС II зависят о? внутримолекулярной подпиз-посза. препаратов. Дплеииз гз перераспределения под дейстаиеи элект-ргпесЕсго ноля основ нетто свечетя в полосу оз. -40?—50° прз. иззава-сагзвсти. шюшгЕия ппзаЗ. паласы от иптепсивиаста псяя'пшцЗалее ео-тественш объясняется во~'отттостьр существазшшя по крайней мзрэ дпуз: казформацЕсншх состояли! лавутак зарядов. Электрическое пола (с нзпрпгенвосхьа тего гэ поридаз, что и естественные поля, ео-згзепе^гз прз фупкцзагзрезахшв. эпергояреобрапусгепс момбрад) гаэз ралппасгз глагду- сеафоравдиса. Отсутствиз сгинулируе»-зга злентртйгекпп полей пгпидаетерлтурнаго пшп ТЛ в хдсрашгсстгх» абрайатягшхх двурогой«, ЫздаЛзцируЕЧпа' акцепторную часть Щ СО II „ позволяет прееттлалагагь, что ирзЕпосилкоЗ для ейявггпгя зте! по-

Pue. 9. Влияние электрического поля 8-10^ В.м-1, прикладываемого во время прерывания нагрева образца при -25°, на ТЛ суспензии хлоропластов гороха. Образец освещали в течение 5 мин при охлаждении от 20 до -70°. Прерывание и продолжение нагрева показаны двойными стрелками, включение и выключение электрического поля - зигзагообразными стрелками. Сплошная линия - контроль: тот же режим нагрева, но без воздействия поля. Ба вставке -степень уменьшения интенсивности основных компонентов ТЛ образца, подвергнутого воздействию поля, по сравнению с контролем.

Рис. 10. Кривые ТЛ и токов ТД (вставка) в суспензии хлоропластов • гороха, подвергаемо;: воздействию электрического поля 8«105 В-м"? в различных температурных диапазонах в процессе охлаждения. Электрическое поле прикладывали к образцам при -33° (I) и -40° (2)'и охлаждали их в этом поле в течение 5 мин до -70°, затем поле отключали а образцы нагревали в непрерывном режиме, регистрируя либо ТЛ, либо токи ТИ. В первом случае образцы параллельно с охлаждением в электрическом поле активировали светоы. H - контроль: образцы охлаждаемые в отсутствие электрического ноля.

лосы являются информационные изменения именно в белке РЦ.

Таним образам, проведенные исследования показали, что структурная лабильность фотоспнгетических РЦ действительно имеет ключевое значение в их функционировании. Ее роль прослегшвается, начиная с ранних этапов разделения зарядов, когда она прежде всего обеспечивает соответствующие релаксационные механизмы стабилизации первичных фотопродуктов, и на более медленных стадиях последующего электрощит переноса, связанных уже с возможностью формирования определенных реакционноспособных состояний РЦ, контролирующих направленность а скорости электрон-транспортных процессов. Тонкая сбалансированность структурно-динамического состояния РЦ, реализуемая при активном, участии водного компонента, обеспечивает потенциальную возможность эффективной регуляции активности различных звеньев электрон-транспортной цепи в изменяющихся условиях их непосредственного окружения и внешней среды в не лам. Последнее позволяет, в частности, рассматривать эти макромолекулярные комплексы в качестве своего рода индикаторов внегншх воздействий, влияющих на структурно-динамическое состояние функциональных белков и, следовательно, па их активность. Некоторые аспекты возможностей практического .применения уникальных функциональных свойств фотоскнгетических РЦ обсуждаются в последней главе работы.

глгсз п. фотоаштетическиа РЦ как н1с®ствсткгш1шая тест-система шкших воадЕйствй. ушвдоченшв мудыи-слойннк пленочные конструкции на основе бактеишша РЦ

В настоящее врет большое внимание привлекает к себе проблема биологического действия миллиметрового излучения нетепловой интенсивности, первичные механизмы взаимодйствия которого с биообъектами остаются неясными. Полученные нами данные позволили предположить, что одним из путей" влияния мм излучения может быть воздействие га структурно-динамическое состояние функциональных белкез я, посредством этого, изменение их свойств.

Бнло обнаружено, что облучение Щ Hb.spbaeroidea d водкой среде sn волната (-10 приводит к обратимому увеличению выхода триплетсых состояний фотсакт явного tniryeirrav Эффект гл обуелст-леп пагрекгл или влияника мапшттЗ составляемой ма азлучегал, поскаль;^ И то, Я ДРУГС2 р.тепьпягт В1ССЯ Тр)-ЛЛЕ5ТЕНХ СОСТОЯНИЙ. Чго-

тотной зависимости эффекта не выявлено. Необходимость для его противления длительного воздействия излучением (не менее минуты) позволяет предположить, что это время возможно требуется для "перевода" локальных микроскопических событий, связанных,, например, с раскачкой (Гайдук, Цейтлин, 1989) электрическим вектором поля легких полярных групп или диполей воды, в более крупномасштабные изменения структурно-динамического состояния комплексов. Роль структ турна-динамического состояния РЦ в данных событиях подтверждается и наблюдениями за дальнейшей дезактивацией триплетного состояния фютоактивного пигмента в результате триллет-трпллетного переноса энергии на входящую в состав комплекса молекулу специфического каротиновда. Регистрировали время жизни триплета каротиноида. Данное время существенно зависит от динамики равновесия между триплетными состояниями фотоактивного пигмента и каротиноида (Lous, Но«, 1989). В свою очередь, на эту динамику могут заметно влиять Стерические факторы типа взаимной ориентации и расстояний между взаимодействующими в процессе триплет-триллетнаго переноса энергии молекулярными, ■группами, конфигурация полиеновой цепи, каротиновда. Оказалось, что поле КВЧ может вызывать заметное увеличение регистрируемого, времена распада триплета каротиноида: в одной из серий измерений - с *40 мкс в контроле до =*70 мкс в облучаемом образце. Решающее значение структурно-динамического состояния образцов в проявлении эффекта видно,, в частности, из того, что в использовавшихся в другой серии измерений препаратах ЕЦ, выделенных из мембран с применением менее интенсивного режима, обработки хроматофоров детергентом» влияния поля вообще не обнаружено: и контрольный, и. облучаемый образцы имела характерное время распада триплета каротиновда ок. 8 мкс. Приведенные результаты иллюстрируют высокую чувствительность фотосинтетических РЦ в качестве возможных тест-систем, внешних воздействий, влияющих на структурно-динамическое состояние функциональных белксв.

■'Уникальные свойства фотосинтетических РЦ, рассмотренные в настоящей работе, возможность избирательного управления функционированием, различных участков их электрон-транспортной цепи позволяют рассматривать эти макроыолекулярше комплексы также в качестве перспективного объекта прпгсоздашш. различных бпотехнологичесних устройств, преобразующих энергию фотонов видимого и ближнего ПК диапазонов в электрохимическую форму. Достоинствами РЦ как конструкционных компонентов новых фотопре'образующих устройств являются молекулярные размеры каждого отдельного 1ютатрепатриирующего элемента

аз

при высокой .степени однородности их характеристик (обусловленной генетическими механизмами), максимальная квантовая эффективность, быстродействие и спектральная селективность, потенциальная возможность включения их в более слояные функционально связанные молекулярные ансамбли с заданными свойствами. Однако дйя использования фотасшпетических РЦ в этих целях существенное значение приобретает проблема упорядочешюсти и ориентации этих комплексов, а также вопрос о контроле структуры формируемых молекулярных конструкций. В связи с этим совместно с сотрудниками проф. Л.А.Фейгина (Ин-т кристаллографии РАН) были исследованы возможности получения на твердых подложках ориентированных пленок активных бактериальных ЕЦ и более сложных молекулярных ансамблей. Основные структурные характеристики формируемых пленок: количество нанесенных на подложку маношлекулярных слоев, период повторяемости структуры, длину корреляции-позволил эффективно контролировать метод малоуглового рев-тгеновского рассеяния. В работе были использованы РЦ Rb. sphaerol-dea а РЦ-цитохроглше комплексы Chr. oinutiaainuo. Для получения упорядоченных пленок на их основе применяли метод Ленгмюра. При зтсм для перенесения на твердые подложки сформированных на поверхности. водной субфазн мономолекулярных белковых пленок в случае РЦ Ab.sphaeroides предпочтительным выявился вариант метода - горизонтальный лифт (касание плоскостью падлояки поверхности раздела фаз). Перешс же РЦ-цитскромных комплексов оказался возможным только при вертикальном пересечении подлогжой (вертикальный лифт) границы раздела фаз, причем на уха специально подготовленную поверхность аз ориентированного мошслся арахнновоД кислоты. При этом, как показали данные рентгеновского малоуглового рассеяния, упорядоченность полученных в конечном результате мультислойных конструкций из чередующихся коноалоев РЦ-цитохромных комплексов и гшрноЛ i си слоты оказалась выие, чем в многослойных пленках РЦ Hb.aphaeroldea. Рентго-нограм'ла ленгмюровской сверхрешеткд из РЦ-цлтохромнцх ко!!плексов а жирной кислота содергала 4 отчетливых брэгтсвсках максимума, период повторяемости структуры в сверхреаеткв составил Я, а'ддина корреляции - »440 5L В ивагаслайных ленгазрозских пленках из РЦ нъ. sphaeroidaa регистрировали I рефлекс, период повторяемости структуры для них составляя ^85 i, длина корреляции - =290 Я.

Конкретжм п^ншераа реализация возможностей ориентирован: зяс бактеркатышх РЦ явилось создаяга пакетного образца фсточувства-тельаого устройства на основе нолевого транзистора. Была исносьзо-

вана способность последнего изменять характер прохождения тока в дани "исток - сток" при приложения небольшого потенциала на затвор. Потенциал создавался в результате фоторазделения зарядов в нанесенной на затвор транзистора пленке ориентированных основной осью перпендикулярно к плоскости подложки РЦ Rb.sphaeroides.Исследование функциональных свойств одорированных на твердых подложках ленгиза-ровских пленок РЦ Rb. ephaeroldes в зависимости от времени показало, что их активность может сохраняться в достаточной для практических целей степени в точение недель при 22° и месяцев - при 5°С. Получение же высокоупорядочепшх сло.чных конструкций с участием РЦ-цитохромных комплексов л жирной кислоты практически подтверждает возможность создания многокомпонентных с включением белков молекулярных ансамблей с заданными свойствами.

освоакхЕ выводы

1. Предложены модели пространственной кои1игурацш1 частиц бактериальных фотоспытетическнх реакционных центров ( РЦ) H3Rb.sphaero-ides И комплекса РЦ с многогемовыы цитахромом из Chr. minutiasimua

в жидка] азних системах и пленках Ленгмгора-Блоджет. По данным малоуглового рентгеновского рассеяния РЦ апроксимируется цилиндроподоб-ныы телом высотой =*75 8 а диаметром ^30 8; Общая высота РЦ-цито-хромного комплекса, представляемого двумя эллипсоидальными телами длинные оси которых перпендикулярны друг другу, составляет ок. 95 8. Показано увеличение радиуса инерции частиц РЦ в присутствии криорастворителей - диметилсульфоксдда и прешиленгликоля.

2. Исследования функциональной организации бактериальных РЦ методами кинетической спектроскопии позволили установить:

а. В РЦ, изолированных с помощью детергента ЛДАО в водное окружение, при изотопном замещении HgO на ^О, но не Kg^O, а также частичной замене Н2О криопротекторамз, одно- и многоатомными спиртами,' апротаниымп растворителями стелется эффективность фотохимического переноса электрона от дилера бактериохлорофилла ( Р) к бакте-рпо^ео.птину (I), указывая на вовлечение водородных связей белка РЦ в процессы первичной стабилизации разделетшх зарядов. Предложена и проанализирована схема процесса, учитывающая наличие двух состояний иогь-радикально?. пары Р+-1~- начального и релаксированноги

б. Бт активность пзрсноса электрона из состояния Р+1~ на первичный хлпон Q. (yrinjciiiou) , помимо указанных релаксационных процессов определяете.-; тшие природой акцептора и характером его связы-

вания в специфическом месте посадки в РЦ, о чем свидетельствуют эксперименты по замене убихинона на его аналоги - антрахинон и дуро-хибон.

3. Анализ температурных и гидратационних зависимостей параметре® кинетики, прямого фотопереноса электрона от Чд ко. вторичному хи-шну (Од) и рекомбинации восстановленных акцепторов с окисленным Р, измеренных при различных исходных зарядовых состояниях переносчиков ( ЕОдОд, Е+0д0в, Р+ЧА05) 110330,111,1 предложить общую феноменологическую модель этих процессов. В ее основе отнесение эффектов температуры а гидратации к локальным изменениям конформации в белке РЦ при практически, неизменных константах скоростей собственно электронных переходов. Методами, температурного скачка при ударном понижении и повышении температуры проведет оценка характерного времени информационных изменений, оптимизирующих процесс Рд—»-Фд переноса электрона.

4. Изучение электронного переноса в ЕЦ при. параллельной регистрации структурш-дивамических показателей методами физических шток (спиновых, люминесцентных, мессбауэровских) выявило следующие оо-иовные закономерности:.

а. Изменение вязкости среды с изолированными РЦ или их естественного мембранного окружения се оказывает значительного влияния 151 внутрибелковые релаксационные процессы, связанные о разделением и . стабилизацией зарядов в первичной ион-радикальной паре Р+Г~. б» При. варьировании температуры и. степени гидратации обнаруживаются. отчетливые корреляции, изменения эффективности Функциональных процессов с торможением или активизацией молекулярной подвижности а РЦ - усиление прямого перекоса зарядов на стадии. (^В^А^В определяется возможностью паносекундных движений в поверхностных участках белка, а более низкочастотная динамика внутренних областей модулирует в определенной степени, скорость ре комбинационного процео-са Р+С)д-*ЕрА.

5. Систематически исследовано влияние гидратации на реакции' с участием хинонкых акцепторов в изолированных а мембраносвязанных РЦ в условиях объективного контроля содержания (гравиметрически методом,. хкггическш титрованием) и состояния (методами НМР) води при дифференцированном анализе поведения белковых компонентов, полярных я пспалярпых участков лшгадов (ГН, 13С, 31Р-Я.{Р). Показано, что переходы между состоящими, штЕЕтрупщЕкз пргслса перепое электрона от Чд.к Од», коррелирую* с появление!! а увеличзппги вала-

да в суммарный сигнал ШР-спановое эхо подвижных протонов, имеющих время спин-спиновой релаксации Т2Я мс. Эффекты гидратации в данном процессе зависят от состава липидной фазы в образцах, структур-ису-динамическоо состояние которой влияет на существенную для функ-. циониравания этого звена электрон-транспортной цепи наносекундную подвижность поверхностных областей Щ и его гидрофобного окружения. Характер структурно-динамического поведения липидов при изменении гидратации определяется в первую очередь природол их полярных частей. На скорость внутркбелкового процесса рекомбинации Р+ и <}д состояние лшщцной фазы заметно не влияет. Изменения этого показателя в зависимости от увлажненности модулируются более низкочастотной, по сравнению с поверхностными областями РЦ и его липидным окружением, динамикой белка и коррелируют с изменением количества подвижных протонов, -характеризующихся временем. Т2~0,1 мс.

6. Связь функциональных электронг-транспортных процессов, опосредованных фотосистемой II высших растений, со структурно-динамическим. состоянием объектов прослежена и проанализирована также на хло-ропластах (гороха, шпината )в жидкофазных средах с ^О или ^Н^О и пленках при различной влажности в сравнительном 'комплексном изучении препаратов с использованием методов термолюминесценции и термо-деполяриэации; выявлена роль электростатических мембранных полей в ' регуляции активности данных систем по регистрируемым показателям.

7. Показана принципиальная возможность использования препаратов бактериальных фотосинтетических ЕЦ, детально охарактеризованных в структурно-фушсцпональном отношении, в качестве информативных тест-объектов для установления первичных механизмов воздействия различных физических факторов, в частности электромагнитных полей крайне высокочастотного диапазона, на энергопреобразующие биологические системы, а такке в качестве светочувствительных материалов для создания оптических биосенсоров на основе традиционных элементов электроники.

Основше материалы диссертации изложены в работах:

1. Лутсшев Е.П., Нокс ПЛ., Конопенко A.A.,, Венедиктов П.С., Рубин А.Б. Влияние, температуры на темновое восстановление фотоокис-ленного бактериохдорофилла P87Q у фотосглтезпрутцих бактерий.// Биол. науки.-1975. 7.-С.48-55.

2.Kononenko' A.A., Knox Г.P., Adamova N.P. et al. Spectral and photochemical properties of photosynthetic reaction centre preparations from Rhodopseudomonas sphéroïdes, strain 1760-1.// atudia biophya.-1976. v.55.-p.183-198.

3. Нокс H.H., Адамова И.П., Пащенко B.3. и др. Выделение и исследование фотохимических свойств фотоспнтетпческих реакционных центров из клеток Rhodopseudomonas spheroides штаг.гл 1760-1 .// Молек. бнология.-19?6. т. 10.-с.641-651.

4. Чаморовскай O.K., Нокс П.П., Рекенников СЛ., Кононенко A.A., Рубин А .Б. Исследований температурной зависимости кинетики тег.шово-го восстановления бактериохлорофилла P87Q, окисленного импульсным лазерным и постоянным светом в препаратах фотосшггетических реакционных центров из RhodopseudoBonas spheroides штамм I760-I.// Биофизика,—1976. т. 21.-с.300-306. '

5. Нокс ПЛ., Кононенко-A.A., Рубин А.Б. функциональная актив-•ностъ реакционных центров фотоспнтетзческих едшшц в хроматофорах

Я. rubrum при обезвоживании.// Вестник ИГУ, сер. биол .почв .-1976. J8 2.-0.62-66.

6. Боне ПЛ., Кошненко A.A., Рубин А.Б. Спектральная позиция основной полосы поглощения пигментного комплекса Р870 и кинетика фотоиндуцираванных окепдоредукцай в реакционных центрах и хрог.-лто-форах пурпурных бактерий при различной температуре и гидратации препаратов.// Молек.<5иология.-1977. т.П.-с.933-940.

7. Бокс ПЛ.! Лукашев ЕЛ., Кононенко A.A., Венедиктов П.С., Рубин АЛ. О возможной роли макрокодекулярных компонентов в функционировании фотосинтетических реакционных центров пурпурных бактерий. 'Малек, биология.-1977. T.II.-C.I090-I099.

8. Borisevich O.P., Knox P.P., Kononenko A.A., Rubin A.B. 7ога-ry В. Blectric field-induced polarisation oí photosynthatic neabra-nes and reaction centers of Rhodopoeudonanaa ophaoroidaa.// Acta Biochin,Biophys.Acad,Sei.Hung.-1978. v*13.-p.67-72.

9. Накс ПЛ., Кснонэнко A.A., Рубил А.Б. Функциональная активность фотосинтетичесхвх реакционных центров из Rps. aphsroidea прл фиксированной гидратация препаратов .//ТЗиоорг.хшшя.-1979. т.5,-

с.879-885.

10. Берг Л.И., Бокс ¡1 .П., Кононенко А .А. и др. Конформационная подвижность и Функциональная активность фотосинтетических реакционных центров из Rpa.epheroides // ¡Лодек.биалогия.-1979. т.13,-

с.469-477.

11. Берг Л.Я., Нокс П.П., Кононенко А.А. и др. КонТормационное регулирование функциональной активности в фотосинтетических мембранах пурпурных бактерий.// Малек.биология.-1979. т.13,- с.81-69.

Е2. Еорисевич Г.П., Нокс П.П., Кононенко А.А., Рубин А.Б., Базара Э. Поляризация фотосинтетических мембран и реакционных центров из Rrs. epheroidea, 1760-1 во внесшем электрическом поле.// Био-физика.-1979. т.24.-с.843-848.

13. Rubin А.В., Kononenko A.A., Venediktov P.S., Borisevioh G.P., Knox P.P., Lukaahev E.P. Polarization effects in photosynthetic mem-braneo.// Intern.J.Quantum Chem.-1980. v.17.-p.587-593.

14. Hikolaev С.Ы., Knox P.P., Kononenko A.A., Griahanova N.P., Rubin A.B. Photo-induced electron transport and water state in R.

rubrum chromatophoree.// Biochira. Biophye.Acta.-1980.v.590.-p. 194-201.

15. Нокс П.П., Кононенко A.A., Рубин А.Б. Влияние дейтерирова-кия на кинетику фотоиндуцированного переноса электрона в реакционных центрах пурпурных бактерий.// Биофизика.-1980.т.25.-е.239-241;

16. Петров Э.Г., Харкянен В.Н., Нокс ПЛ., Кононенко А.А., Рубин А.Б. Кинетика электрошо-кошформациашшх переходов в фотосинтетических реакционных центрах.// Препринт ИТФ АН УССР, Киев, 1980 HT<t-80-67P.

17. Рубин А.Б., Кононенко АЛ., Венедиктов П.С., Борисевич ГЛ., Нокс ПЛ., Лукапев ЕЛ. Поляризационные явления в фотосинтетических мембранах.// В сб. "Успехи квантовой химии и квантовой биологии" ч.1, "Наукова думка", Киев - 1980.-с.404-411.

18. Kononenko A.A., Nikolaev G.M., Knox P.P. et al. Water state and functional activity in photosynthetic membranes and reaction centre preparations of purple bacteria.// studia biophys.~1961. v.84.-p.57-58. .

19. Knox P.P., Nikolaev G.U., Kononenko A.A. et al. Photo-induced electron transport and water state in R. rubrum chromatophoree, atudia biophyo.-1981. v.85.- p.13-14.

¿¿.Lukaahev в.p., Knox P.P., Borisevioh G.P. et al. Conformational mobility and electric polarization in biomerabranea.// etudia

biophya.-1981. v.85.-p.43-44.

21. Knoi P.P., Oarab Gy. The effect of a permanent electric field on thermolumineseence of chloroplaata.// Photoohem.Photoblol. ~ 1982. v.35.-P.733-736.

22. Петров ЭЛ., Харкянен 3.H., Нокс iï.n., Кононенко A.A., РутЗин А.Б.- Кинетическая модель электронных и конформационннх переходов в фото синтетических реакционных центрах пурпурных бактерий.// Изв.

АН СССР, сер.биол.-1983. И.-с.28-43.

23. Котельников А.И.Г Лихтекдтеин Г.И., Фогель В.Р.,_ Кочетков В., Holte ПЛ., Кононенко A.A., Гршпанова H.H., Рубин А .Б. Внутримолекулярная динамика и перенос электрона в фотосинтетических реакционных центрах.// Молен.биология.-1983. t.I7.-c.84S-Ö55.

24. Нокс ПЛ., Венедиктов П.С., Кононенко AJV. и др. Термодюма-несценция и электрическая поляризация в хлоропластах.// Waieк.биология.-1984. T.I8.-с.766^775.

25. Кочетков ВЛ., Лихтештейн ГЛ., Ксльтовер В.К., Нокс ПЛ., Кононенко A.A., Гршпанова НЛ., Рубин А.Б.. Связь внутримолекулярной динамики с переносом электрона а фотосинтетических реакционных центрах.// Изв. АН СССР, сер.биш.-1984. М.-с.572-577.

26. Knox P.P., VenediktoV P.S., Kononenko A.A. et ca. Role of electric polarisation in the thermolumineacence of chloroplaata.// Photochen.Photobiol.-19B4. v.40.-p.119-125.

27. Годик BX, Бокс ПЛ., Кононенко АЛ., Борисов AJ3., Рубин А.Б. Влияние обезвоживания на первичные пикосекундные стадии разделения зарядов ун, rubrum. /Долек.биология.-I984.I8.-c.I562-I568.

28. Аксенов С.И., Боженно В.К., Захарова Н.И., Кононенко A.A., Николаев Г.М., Бокс ПЛ., Рубин А.Б. Исследование эффектов гидратации фотосинтетических мембран и мембранного белка реакционного центра бактерий н. rubrum в связи с их функциональной активво-cfbJD.// Изв. АН СССР,. сер.биоя.-1985. И.-с.105-11е._

29.- Горбач ВЛ., Лукашев ЕЛ., Нокс ПЛ. и др. Киветига рексм<1н-нац ин исн-радикалов б акте риохлерофалла и первичного хидопнпгд акцептора а фотосинтетических реакционных центрах.// йзв. АН СССР, сер.биш.-1986. JSI.-c.H-23.

30. Харкянен В.Й.,, Храстофорса Л Л., Поде ПЛ., Кошненш A.A. Епзкотемпаратурвая фиксация состояшй кш метод исследования- элвге-тров-конформационшх пароходов в шлекулярннх пвмплексоз фотоегш-тетических реакционных центров.// Uoroit.биачогил.-198б. т.20.-с. 994-1001.'

31. Годик B.il., Ноко П.П., Кононенко АЛ., Рубин А.Б. Влияние ■ замещения Н^О ца HgO и HgI80, одно- и многоатомных спиртов и не-прото1ШЫх растворителей на динамику фотохимического разделения зарядов в реакционных центрах хроматофоров R. rubrura. // Малек. биология.-1986. t.2Q.-c.I305-I32I.

32. Кононенко А.А., Нокс П.П., Чаморовский С.К..Перенос электрона и внутримолекулярная динамика фотосиытетических реакционных центров.// Хим.фпзика.-1Э86. т.5.-с.795-804.

33. Пащенко В.3.г Корватовский Б.Н., Логунов СЛ., Васильев С.С., Кононенко А.А., Нокс П.П., Захарова Н.И., Гришанова Н.П.,Рубин А.Б. Эффективность пикосекундного перекоса электрона при фотосинтезе зависит от состояния водородных связей в реакционном центре.// Докл. АН СССР.-1986. т.290.-с.742-747.

34 Paschenko V.Z., Korvatoveky В.К., Logunov S.L., Kononenko А. Knox Î.P., Zacharova N.I., Grishanova N.P., Rubin А.В.. Modification

of protein hydrogen bonda influences the efficiency of picosecond

electron transfer in bacterial RCa.//FEBS Lett.-1987.v.214.-p.28-34.

35. Erokhin V.V., Feigin L.A., Kayushina R.L., Lvov Yu.M., Kononenko A.A., Knox P.P., Zacharova N.I. Langmulr films of photosynthe-tio reaction centres from purple bacteria.// studia biophye.-1937. v.122.-p.231-236.

36. Нокс П.П., Арутюнян A.M., Захарова Н.И., Кононенко A.A. Спектры кругового дихроизг.а бактериальных фотосинтетических реакционных центров в присутствии, криопротекторов.// Молек.биология,-1988. т.22.-с.63-€7.

37. Логунов СЛ., Васильев С.С., Корватовский Б.Н., Тусов В.Б., Нокс П.П. и др. Динамика рекомбинации, первичной ион-радикальной пары в фотосинтетических реакционных центрах из Rhodobacter aphaero-

ides //Докл. АН СССР.-1988. т.299.-сЛ004-Ю07.

38. Зубов Б .В., Кононенко А.А.; Мурина Т.М., Нокс ПЛ. и др. Исследование конформационных переходов в фотосинтетических реакционных центрах методом, температурного скачка»// Биофизика.-1988. т.ЗЗ. с.604-608.

39. Крохин В.В., Капай на РЛ., Львов ЮЛ., Захарова Н.И., Кононенко А.А., Кокс П.П., Рубин А.Б. Получение ленгмюровских пленок (¡отосинтетичсских реакционных центров пурпурных бактерий.// Докл. АН СССР.-1988. т.299.-сЛ262-1266.

40. Кондаков ¿.В., Нокс П.П., Тимофеев К.Н., Кононенко А.А. Псщ-шкаюсть сгпшстшх меток в препаратах фотосинтетических реакционных центрон в присутствии криопротекторов.// Бкофизика.-1989. т.34.-

с.606-610.

41. Лагунов CJI.,. Нокс ПЛ., Захарова H.H. и др. Влитые замещения хиношых акцепторов на энергетику быстрапротекашцих стадий фотоне ре носа электрона в бактериальных реакционных центрах.// Докл. Ali СССР.-1989. т.307.-е.238-242.

42. Нокс ПЛ., Быстряк Ü.M., Котельников AJ1. и др. Влияние глицерина и Сахаров на фотоперенос электрона в системе хинонных акцепторов реакционных центров пурпурных бактерий.// Изв. АН СССР, сер. биоя.-1989. №5.-с.651-659.

43. Ерахин В Л., Сабо Я., Захарова Н.И., Кашина Р.Л., Кононенпо A.A., Львов Ü.M., Лукашев ЕЛ., Нокс ПЛ. Получение ленгмюравских сверхрешетак на основе цитохромсодержащих фотосинтетических реакционных центров из Chromatium minutisaimum. // Биол.мембраны.-1989. T.6.-C.II25-II32.

44. Logunov 3.L., Knox P.P., Zakharova M.I. et al. Effect of replacing the primary quinone by different apecies on the ultrafaat photosynthetic electron transfer in bacterial reaction centrea.// J. of Photochem. and Photobiol.-1990. v.5.-p.41-47.

45. Тимофеев. K.H., Нокс ПЛ., Муравьев В.П., Кононенко A.A., Гря-шанпаа НЛ. Влияние криопротекторов, органических растворителей и

■ лиотропных солей на динамику бислол и внутрибелковый перешо электрона в фотасикгетическай мембране бактерий Rhodobacter sphaeroides./ Бшл. М£мбравы.-1990. Т.7.-С.254-260.

46. Елфимав E.H., ВознякВ.М., Нокс ПЛ.,. Гршианова НЛ., Кононенко A.A.. Влияние криорастворителей на время лизни иоа-радикаль-пзй пары а бактериальных фотосинтетических реакционных центрах. Исследование методом магнитооптической дифференциальной спектроскопии.// Биофизика.-1990. т.35.-с.519-521.

47. Вакс ПЛ., Годик В Л., Кононенко A.A. Эффект органических растворителей на ре комбинационную люминесценцию хроматофорав пурпурных бактерий, его зависимость от гидрофобности, протоэ-акцептор-епй силы и дипольеого момента.// Биофизика.-1990.т.35.-с.6214523.

48. Кашина Р.Л.„ Ерохин ВЛ., Дембо А.Г., Cado Я.г Вакс НЛ., Каноневлз- A.A. Исследование цитохршсодерхшдего белка фотосинтета-чесгазго реакционного центра аз' Chromat iura nlcutinai-ua глтсдсм кетодсм. рентгеновского гллауглсваго рассеяния в раствора а гшагг-KS3C Ленгкяра-Блодает.// Биш. мембраги.-1990.?.7.-с.IГЗ&-Ц4Э.

49.Aksjronov 3.1., Оо'гуасЬвт 3.3,, Denisov Т.?., КопопепЕя A.A., Snox P.P. »et al. Ajffecto of hydration pa dynsinio and functional

properties of photosynthetic membranes from Rhodospirillum rubrum as revealed by 3C and 31P NMR spectroscopy.// studia biophys.-1990. v.136.-p.149-156.

50. Аксенов С.И., Горячев C.H., Денисов В.П.„ Кононенко АЛ., Нокс И.Д., Ортэга Л.П., Ревокатов O.E., Рубин АЛ. Исследование связи между динамикой и функцией фотосинтетических мембран пурпурных бактерий при различной вла-шости с помощью 13С и 31Р-Л.'ЛР-спектро-

скопии.// Биол. мембраны.-1991. т.8.-с.491-503.

51. Демиденко A.A., Логунов С.Л., Нокс E.H., Кононенко A.A., Пащенко В.З. Анализ влияния температуры на стабилизацию первичной ионг-радикальюй пары в фотоскнтетических реакционных центрах пурпурных бактерии.// Молок. биология.-1991. т.25.-е.462-471.

52. Еыец Б.Г., Нокс 11.11., Ыаргишвили. Г.Ш., Беляков Е.В., Коно-ненко АД; Поглощение миллиметрового излучения препаратами бактериальных фотосинтетических реакционных центров.// Биофизика.-1991.

т.36.-с.55-59.

53. Щеголева TJ3., Оксюк Д.Ю., Нокс П.П., Маргшдвили Г.Ш., Коно-ненко A.A. Гидратация мембранных белков фотосинтетических решецион-1шх центров пурпурных бактерий: исследование методом СЗЧ-диэлектро-метрии.// Проблемы криобкол.-1991. М.-с.21-26.

54. Рубин А.Б., Пащенко В.З., Васильев С.С., Логунов СЛ., Кор-ватовешш Б.Н.„ Тусов В.Б., Нокс П.П., Гришанова НЛ., Кононенко A.A. Исследование действия ЭМИ КВЧ на перенос энергии и электронов в фотосинтетических мембранах методами флуоресцентной и абсорбционной спектроскопим_высокого пико-наносекундного временного разрешения.// В сб.; ".'.'иллимегровце волны в медицине", М., ИРЭ АН

СССР.-1991.-с.329-337.

... •.

Информация о работе

Нокс, Петр Петрович
доктора биологических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы