Диссертации » Физико-химическая биология » Молекулярная биология

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура коровой части репликазы фага Θβ
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура коровой части репликазы фага Θβ"

ВАСИЛЬЕВ НИКИТА НИКОЛАЕВИЧ

Структура коровой части репликазы фага 00

03.01.03 - Молекулярная биология

-6 ОКТ 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2011

4855390

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук

Четверин Александр Борисович

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор

Кочетков Сергей Николаевич

доктор биологических наук

Северинов Константин Викторович

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится «-28 -»ектясря 2011 года в И часов на заседании сове Д.501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московскс государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москв ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.1 Белозерского, ауд.536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан « ^ у><&нтяеРр2011 года. Ученый секретарь диссертационного совета,

л

кандидат биологических наук „^^—X*. И.А.Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Qß-репликаза является РНК-зависимой РНК-полимеразой бактериофага Qß, паразитирующего на клетках Escherichia coli. Qß-репликаза является гетеротетрамерным белковым комплексом, состоящим из каталитической ß-субъединицы, кодируемой геномом фага, и трех белков Е. coli - рибосомного белка S1 и факторов элонгации трансляции EF-Tu и EF-Ts. Такой комплекс способен экспоненциально размножать геномную РНК бактериофага длиной 4200 нт и относительно короткие RQ РНК (от Replicable by Qß-replicase), образующиеся путем случайных рекомбинаций РНК и присутствующие как в зараженных клетках, так и фаговых частицах. До настоящего времени Qß-репликаза остается наиболее эффективной РНК-зависимой РНК-полимеразой, способной к экспоненциальному размножению РНК in vitro. По отношению к РНК-матрицам Qß-репликаза проявляет высокую специфичность, что позволяет ей избирательно размножать геномную РНК при заражении клеток Е. coli Механизм узнавания РНК-матриц Qß-репликазой до сих пор остается не известным, что ограничивает применение Qß-репликазы для размножения заданных молекул РНК in vitro. Для узнавания матриц Qß-репликаза не использует каких-либо праймеров или промоторных элементов, а последовательности реплицируемых молекул РНК не гомологичны, за исключением 5'-концевого onnro(G) и З'-концевого олиго(С) кластеров. Однако из 1012 случайных последовательностей длиной 50-77 нт, содержащих 5-GGG... и ...ССС-3' участки, с помощью процедуры SELEX удалось отобрать лишь единичные молекулы РНК, способные к размножению Qß-репликазой. Отсюда следует, что высокая специфичность узнавания обусловлена вторичной и третичной структурой РНК. Выявить важные для узнавания элементы структуры РНК можно было бы с помощью рентгеноструктурного анализа комплексов репликазы с РНК-матрицами, однако до сих пор не удавалось получить кристаллы ни таких комплексов, ни свободной Qß-репликазы.

В настоящей работе впервые получены кристаллы и определена пространственная структура коровой части (комплекса ß-субъединицы с факторами EF-Tu и EF-Ts), способной к выполнению основных каталитических функций Qß-репликазы. Это помогает выяснить, как взаимодействуют вирусная и клеточные субъединицы при

образовании репликазного комплекса, ответить на вопросы о роли хозяйских белков в составе вирусной репликазы, и, что наиболее интересно, выяснить механизм узнавания РНК-матриц Qß-репликазой.

Цели и задачи

Целью данной работы явилось получение кристаллов Qß-репликазы и определение ее трехмерной структуры. Для этого были решены следующие задачи. Чтобы повысить вероятность образования кристаллов репликазы, мы применили следующие способы увеличения жесткости ее молекулы. Во-первых, удалили белок S1, который не имеет компактной глобулярной структуры. Оставшаяся (коровая) часть репликазы способна выполнять все основные функции, включая специфическое узнавание реплицирующихся РНК и их экспоненциальное размножение. Во-вторых, попытались заменить факторы элонгации Е. coli (Eco EF-Tu и Eco EF-Ts) на их более стабильные аналоги из термофильной бактерии Thermus thermophilus (Tth EF-Tu и Tth EF-Ts) и найти способ получения химерной репликазы в количествах, достаточных для проведения экспериментов по кристаллизации. В-третьих, использовали для кристаллизации «слитую» Qß-репликазу, в которой субъединицы объединены в единый полипептид. Полученные варианты репликазы были проверены на способность образовывать кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного анализа, и на способность выполнять функции, характерные для репликазы дикого типа. Наконец, полученные кристаллы использовали для определения пространственной структуры Qß-репликазы.

Вклад автора

Работа по кристаллизации и определению структуры Qß-репликазы была выполнена большим международным коллективом авторов из трех научных учреждений: Института белка РАН (Пущино, Россия), Института генетики и молекулярной и клеточной биологии (Страсбург, Франция) и Университета города Орхуса (Дания). Автор диссертации разработал способ полного удаления белка S1 из молекулы Qß-репликазы без ее денатурации и способ получения в нативных условиях и в препаративных количествах химерных молекул, содержащих фактор элонгации Tth EF-Ts; выполнил эксперименты по кристаллизации химерной репликазы и участвовал в экспериментах по выделению и кристаллизации слитой репликазы; исследовал

функциональные свойства химерной и слитой репликаз; участвовал в анализе и интерпретации рентгеноструктурных данных.

Научная новизна и практическая значимость

Несмотря на значительное число известных структур вирусных РНК-зависимых РНК-полимераз, структурных исследований ОР-репликазы или репликаз родственных вирусов до настоящего времени не проводилось. В данной работе не только впервые установлена пространственная структура нового типа РНК-зависимых РНК-полимераз, но и впервые определена структура вирусной репликазы в комплексе с клеточными белками. Полученные результаты могут быть использованы для изучения структурной организации РНК-репликаз вирусов эукариот, многие из которых, подобно Ор-репликазе, существуют в клетках в виде комплексов с хозяйскими белками, участвующими в трансляции.

Получение кристаллов и определение структуры ОР-репликазы открывает путь к детальному изучению отдельных стадий репликационного цикла, а также создает базис для исследований механизма специфического узнавания С!Р-репликазой ее матриц. Это, в свою очередь, сделает возможным конструирование молекул РНК, обладающих заданной нуклеотидной последовательностью и способных к эффективному размножению Ор-репликазой, что может найти применение в разнообразных прикладных задачах, связанных с использованием РНК.

Апробация работы и научные публикации

Работа прошла апробацию на открытом семинаре лаборатории биохимии вирусных РНК Института белка РАН. Результаты работы изложены в 2 статьях, опубликованных в рецензируемых научных журналах, и представлены на 1 научной конференции.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного описанию свойств и строения ОР-репликазы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 135 листах машинописного текста и содержит 37 рисунков. Библиография включает 218 источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение и свойства химерной Qß-репликазы, содержащей фактор элонгации EF-Ts из Thermus thermophilus

Отсутствие данных о структуре Qß-репликазы связано с трудностью получения ее кристаллов. Наиболее вероятной причиной неудач может быть наличие в составе репликазного комплекса рибосомного белка S1, для которого было показано отсутствие компактной глобулярной структуры и подвижность отдельных его частей относительно друг друга. Это характерно для белка S1 как в свободном состоянии, так и в составе Qß-репликазы и 30S субчастиц рибосом (Chu and Cantor, 1979. Nucleic Acids Res. 6, 2363-2379; Moore and Laughrea, 1979. Nucleic Acids Res. 6, 2355-2361; Labischinski and Subramanian, 1979. Eur. J. Biochem. 95, 359-366; Chu et al., 1982. FEBS Lett 145, 203-207). Поэтому первой задачей была разработка эффективного метода отделения рибосомного белка S1 от коровой части репликазы, представленной факторами элонгации EF-Tu, EF-Ts и ß-субъединицей. Известно, что коровая часть репликазы сохраняет ферментативную активность, а потому определение ее структуры могло бы дать ответы на многие вопросы, связанные с функционированием репликазы. Подробно способ удаления белка S1 в нативных условиях будет изложен ниже. Однако оказалось, что коровая часть репликазы дикого типа также не способна образовывать кристаллы. Поэтому мы попытались заменить мезофильные факторы элонгации Escherichia coli на их более стабильные аналоги из термофильной бактерии Thermus thermophilus, надеясь, что это повысит стабильность и жесткость структуры репликазного комплекса, и повысит вероятность его кристаллизации.

Можно ли заменить факторы элонгации в составе Qß-репликазы на их термофильные аналоги?

Из литературных данных известно, что с помощью ренатурации денатурированной в мочевине Qß-репликазы можно получить химерные молекулы, если на стадии ренатурации добавить факторы элонгации из других бактерий. Сообщалось, что таким способом удалось получить химерные репликазы, содержащие EF-Tu и EF-Ts из Caulobacter crescentus, а также EF-Ts из Bacillus stearothermophilus (Stringfellow et

образец Сф-релпиказы для хроматографии на Ni Sepharose

вез m EF-Ts

-10* молярный избыто« Ith Htse-EF-Ts OX 20 "С . 30 "С

о п э O П Э П Э П Э

ico tf-íb —. —— fro Ei Ts -..._ 1 2 3 «M* — —

ш 4 — -«"w 5 6 tHI 7 8 9 fO

Рис. 1. Обмен фактора элонгации Eco EF-Ts в составе Qß-репликазы на Tth EF-Ts.

Коровую часть Qß-репликазы (дорожка 1) смешивали с 10-кратным молярным избытком Tth Hise-EF-Ts (дорожка 4), после чего проводили 30-минутную инкубацию при указанной температуре и затем хроматографию на заряженной Ni2* сефарозе (GE Healthcare). С помощью денатурирующего электрофореза в 10% ПААГ сравнивали белковый состав образцов до хроматографии (О), проскока (белка, не адсорбированного колонкой, П) и элюата (Э), полученного при промывке колонки буфером с 200 мМ имидазолом. Гель окрашен серебром.

al. 1980. J. Bacterio!. 143, 389-395; Stringfellow and Blumenthal, 1983. J. BacterioI. 153, 1083-1087). Мы попытались получить репликазный комплекс, содержащий факторы элонгации из Т. thermophilus. Tth EF-Tu и Tth EF-Ts не только обладают высокой термостабильностью, но и образуют между собой прочный комплекс, разрушающийся лишь в присутствии солей гуанидина (Arai et al. 1978. Eur. J. Biochem. 92, 509-519). Так как обмен субъединиц посредством денатурации репликазы дает низкий выход химерного комплекса и может приводить к химической модификации белков продуктами распада мочевины, мы проверили возможность обмена факторов элонгации на термофильные в нативных условиях.

С этой целью мы смешивали коровую часть Qß-репликазы дикого типа с 10-кратным молярным избытком термофильных факторов, модифицированных на N-конце гексагистидтином (Hise-EF-Tu или His6-EF-Ts). После 30-минутной инкубации при разных температурах, Hisg-модифицированные белки выделяли с помощью металл-хелатной хроматографии и сравнивали белковый состав элюатов (рис. 1). Видно, что вместе с Tth His6-EF-Ts выделяется ß-субъединица и Eco EF-Tu, а вытесненный из репликазы Eco EF-Ts Е. coli оказывается в проскоке. Отсюда следует, что фактор элонгации EF-Ts Е. coli в составе Qß-репликазы действительно может быть заменен на его аналог из Т. thermophilus. При этом выход химерного комплекса увеличивается с повышением температуры инкубации перед хроматографией от 0 до 30°С. В

варианты индукции

очищенная реппиказа дикою тпа

Eco EF-Tu > Eco EF-Ts Tth EF-Ts

удельная активность репликазы, ^g , 57 6 '1880

единиц на 1 мг велка :

Рис. 2. Образование химерной репликазы in vivo.

Проводили индукцию синтеза в Е. coli только ß-субъединицы или одновременно ß-субъединицы и фактора элонгации Tth EF-Ts, после чего сравнивали суммарный белковый состав клеток (С), а также белков в растворимой фракции клеточного лизата (Р) с помощью денатурирующего электрофореза в 10% ПААГ. Единица активности репликазы соответствует включению 1 нмоль [3H]GMP в течение 10 минут при 30°С в кислотонерастворимую фракцию при использовании поли(С) в качестве матрицы.

отличие от EF-Ts, обмена фактора EF-Tu на его термофильный аналог не происходило. Поэтому в дальнейшем работали с химерной репликазой, содержащей Tth EF-Ts.

Несмотря на простоту способа получения химерного комплекса с помощью обмена субъединиц, он не подходит для использования в препаративном масштабе из-за малого выхода продукта обмена и требует предварительного получения значительных количеств как репликазы, так и фактора элонгации Tth EF-Ts. Более продуктивным оказалось получение химерной репликазы in vivo.

Оказалось, что химерную репликазу можно получить в клетках Е. coli при использовании двухплазмидной системы экспрессии, которая позволяет одновременно индуцировать синтез как каталитической (ß) субъединицы репликазы, так и фактора элонгации Tth EF-Ts. Выяснилось, что одновременная индукция Tth EFTs повышает растворимость ß-субъединицы (большая ее часть остается в растворе после осветления) и удельную активность Qß-репликазы в лизатах клеток (рис. 2). Эти данные подтверждают факт образования химерного комплекса in vivo.

Заменить фактор элонгации EF-Tu на термофильный аналог с помощью коэкспрессии в клетках не удалось, что согласуется с результатами экспериментов in vitro.

Выделение химерной Qß-реапиказы

На этом этапе задачей стояло не только получение гомогенного препарата химерной репликазы, пригодного для кристаллизационных экспериментов, но и поиск эффективного способа отделения белка S1 от коровой части репликазы.

Для получения химерной репликазы в очищенном виде мы разработали процедуру на основе метода, описанного Муди и коллегами (Moody et al., 1994. Biochemistry 33, 13836-13847). После разрушения клеток с помощью ультразвука нуклеиновые кислоты удаляли с помощью осаждения полиэтиленимином. Затем проводили анионообменную хроматографию на Q Sepharose (GE Healthcare). Полученный препарат репликазы представлял собой смесь молекул, содержащих белок S1 (холофермент) и не содержащих его (кор).

Чтобы разделить холофермент и кор, мы ввели гидрофобную хроматографию. Наилучшие результаты были получены при использовании Butyl Sepharose (GE Healthcare): на такой колонке можно выделить коровую часть репликазы, полностью лишенную белка S1. Ранее коровую часть репликазы получали лишь в виде плечевых фракций при анионообменной хроматографии и гель-фильтрации, при этом ее выход составлял не более 20% от всего препарата репликазы (Kamen et al., 1972. Eur. J. Biochem. 31, 44-51). Другой метод удаления S1 включал обработку репликазы мочевиной (Hill and Blumenthal, 1983. Nature 301, 350-352), что создавало риск ее частичной денатурации и химической модификации.

На заключительной стадии проводили анионообменную хроматографию на колонке высокого разрешения (Resource Q, GE Healthcare). Разработанная процедура позволяет получать химерную Qß-репликазу в почти гомогенном состоянии с выходом 8-10 мг очищенного белка из культуры клеток Е. coli объемом 1 л, что в 4-5 раз больше в сравнении с известными ранее методами.

Субъединичный состав химерной Qß-репликазы

Как и ожидалось, препараты химерной репликазы содержали четыре субъединицы в случае холофермента и три в случае кор-фермента (рис. ЗА). Однако по сравнению с

M

1

Eco Eco m S1 g EF-Tu EF-Ts EF-Ts

Si л

e <

EcoEF-Tu ч Eco EF-Ts * TiftEF-Ts

« •}

— 40 3 ___ M

h à

B5 TD tO 60 <0

Рис. 3. Препараты химерной репликазы. Результаты денатурирующего электрофореза в 10% ПААГ (А), денситограммы того же геля (Б) и гель-фильтрации (В) препаратов репликазы дикого типа (1 и 2) и химерной репликазы (3 и 4). M - маркеры молекулярной массы (кДа); гель окрашен кумасси R-250. Денситограммы получали с помощью программы ImageJ 1.44. Гель-фильтрацию проводили на колонке 1*30 см Superdex 200. Нумерация образцов на электрофореграмме и денситограмме совпадает с нумерацией образцов на хроматограмме.

репликазой дикого типа, в препарате химерной репликазы интенсивность окрашивания полос факторов элонгации выше (денситограмма на рис. ЗБ), что говорит об их избыточном количестве. Избыточные факторы элонгации являются не примесью, а входят в состав комплекса химерной репликазы, что приводит к увеличению ее размера по сравнению с репликазой дикого типа (рис. ЗВ), несмотря на меньшую массу Tth EF-Ts по сравнению с Eco EF-Ts (22,4 и 30,4 кДа, соответственно).

Избыток факторов Eco EF-Tu и Tth EF-Ts можно объяснить способностью фактора Tth EF-Ts образовывать димер (Blank et al. 1996. Eur. J. Biochem. 236, 222-227), который может связывать две молекулы EF-Tu из Е. coli (Arai et al. 1978. Eur. J. Biochem. 92, 521-531). Представленные данные говорят о том, что димерный комплекс факторов Eco EF-Tu и Tth EF-Ts сохраняется в составе репликазы.

О репликаза ш«оготипа без □ хи»к<>наяреппиказасТйЕР-Т5беэ31

Рис. 4. Активность химерной ОР-репликазы в сравнении с репликазой дикого типа.

(А) Синтез поли(й) на поли(С) в присутствии 3,5 пмоль репликаэы. (Б) Размножение 16,6 фмоль (Ю10 молекул) ЯШ35 РНК в присутствии 3,5 пмоль репликазы и [а-32Р] УТР. Количество полноразмерного продукта определяли с помощью электрофореза в ПААГ и последующей радиоавтографии. (В) Падение активности в поли(С)-зависимой реакции после 10-минутной предынкубации при указанной температуре в отсутствие лигандов. (Г) Количество продукта репликации РЮ135 РНК в присутствии холофермента в течение 10 минут при указанных температурах.

Ферментативная активность химерной (З/З-репликазы

В реакции синтеза поли(в) на поли(С)-матрице химерная (Зр-репликаза, как и репликаза дикого типа, проявляла активность независимо от наличия рибосомного белка в составе комплекса (рис. 4А). Хотя химерная репликаза обладала при 30°С несколько меньшей удельной активностью в поли(С)-зависимой реакции по сравнению с репликазой дикого типа (рис. 4А), она столь же эффективно размножала специфическую матрицу (К0135 РНК) (рис. 4Б). В отсутствие белка 51 репликаза размножает РЮ135 РНК автокаталитически, что сопровождается примерно 200-кратным увеличением количества РНК за время реакции, однако среднее время репликационного цикла примерно в 10 раз больше, чем при использовании

холофермента (рис. 4Б). Этот результат оказался неожиданным, так как ранее считалось, что белок S1 нужен лишь для инициации синтеза (-)-цепи на геномной РНК бактериофага, и не нужен для репликации RQ РНК (Carmichael et al. 1976. J. Biol. Chem. 251, 2744-2748).

Замена Eco EF-Ts на Tth EF-Ts приводит к существенному повышению термостабильности репликазы. Температура полуинактивации химерной репликазы в отсутствие лигандов примерно на 10°С выше, чем репликазы дикого типа (приблизительно 40 и 30°С, соответственно: рис. 4В). Термостабильность обоих вариантов повышается в условиях реакции репликации, но и в этом случае химерная репликаза стабильнее: ее температурный оптимум на 10°С выше, чем репликазы дикого типа: 40 и 30°С, соответственно (рис. 4Г). Большая термостабильность химерной репликазы позволяет более чем вдвое увеличить выход продукта реакции относительно репликазы дикого типа (рис. 4Г), что может найти применение в приложениях, связанных с синтезом РНК in vitro.

Таким образом, замена только одной субъединицы (EF-Ts) на аналог из термофильной бактерии приводит к стабилизации всего репликазного комплекса. Наличие дополнительных копий EF-Ts и EF-Tu в составе химерной репликазы не мешает ей реплицировать РНК; следовательно, их расположение не перекрывается ни с участками связывания РНК, ни с каталитическим центром.

Кристаллизация химерной Q/3-репликазы

Эксперименты по кристаллизации химерной репликазы автор проводил в группе М.М. Юсупова в Институте генетики и молекулярной и клеточной биологии (Страсбург, Франция). Непосредственно перед кристаллизацией проводили гель-фильтрацию репликазы на колонке Superdex 200 (GE Healthcare) и последующее концентрирование белка до 5 мг/мл. В качестве образцов для поиска условий кристаллизации использовали как химерную репликазу, так и репликазу дикого типа в виде холоферментов и кор-ферментов. Для первичного скрининга использовали коммерческие наборы фирм Qiagen и Hampton Research. Кристаллизацию проводили методом диффузии паров. Для приготовления сидячих капель использовали робот Cartesian Honeybee 8+1 (Harvard Bioscience), затем проводили инкубацию при температурах 4°С и 24°С. Среди порядка 1000 протестированных вариантов были получены кристаллы только коровой части химерной репликазы, при использовании

0,7 M OßM 1,2 М

концентрация шаломата натрия в резервуарном растворе

Рис. 5. Кристаллы коровой части химерной Qß-репликазы.

Кристаллизацию проводили методом диффузии паров в сидячей капле. Капли готовили смешиванием равных объемов (по 2 мкл) 5 мг/мл репликазы и резервуарного раствора, содержащего 0,1 М Трис-HCI pH 7,5 и 0,7-1,2 М малонат натрия. Кристаллы появлялись в течение первых суток инкубации при 24°С и достигали максимального размера в течение недели.

солей органических кислот в качестве осадителей и температуре инкубации 24°С. Дальнейшая оптимизация условий позволила воспроизводимо получать кристаллы коровой части химерной репликазы с использованием малоната натрия в качестве осадителя (рис. 5). Максимальное разрешение, которого удалось достичь, используя полученные кристаллы, составило 6,5 А. Несмотря на невысокое разрешение, были определены параметры элементарной ячейки и пространственная группа кристаллов (P6i22, а = b = 200 А, с = 577 А, а = ß = 90°, у = 120°).

Слитая Qß-репликаза

Так как высокого разрешения для кристаллов химерной репликазы получить не удалось, мы обратились к другому варианту повышения жесткости молекулы фермента - путем объединения субъединиц в единый полипептид. Такой способ исключает возможность нестехиометрического соотношения субъединиц и препятствует их диссоциации. Эксперименты со слитой репликазой, включая определение ее структуры, проводили совместно с группами Г. Андерсена и Ш. Кнудсен Университета города Орхус (Дания).

Плазмида, кодирующая слитую репликазу, была получена из лаборатории Т. Йомо Университета города Осака (Япония). В этой плазмиде под контролем арабинозного промотера находятся слитые гены, кодирующие факторы элонгации EF-Ts и EF-Tu и ß-субъединицу репликазы в указанной последовательности. При экспрессии такой конструкции в Е. coli образуется полипептид, в котором факторы элонгации EF-Ts и EF-Tu соединены остатком His, a EF-Tu и ß-субъединица - линкером из 16-ти аминокислотных остатков. На С-конце полипротеина находится His6-

CAT

ixf tu/B fi-subutiit t-ene

Pbad II

Linker

ICACJe

GGG GCC TCT GGC. GCC CCA GOT GC.A GGC GGT TCA GGC GGA TOT GGO TCT С1 у Ala Ser Gly Ala Ala Gly Gly Gly Gly Sex Gly Gly Gly Gly Sar

Рис. 6. Схематическое изображение генетической конструкции для получения слитой Qß-репликазы. Представлена последовательность расположения генов факторов элонгации EF-Tu, EF-Ts и ß-субъединицы репликазы, а так же нукпеотидная и аминокислотная последовательность линкера, соединяющего EF-Tu и ß-субъединицу. Изображение взято из Kita et al. 2006. J. biosci. bioeng. 101, 421-426.

последовательность (рис. 6). Как было показано авторами, слитая Qß-репликаза стабильна и размножает RQ РНК с той же скоростью, что и репликаза дикого типа.

Выделение слитой репликазы

Слитую репликазу выделяли с помощью трех последовательных хроматографических стадий. После разрушения клеток ультразвуком и получения осветленного лизата сразу, минуя осаждение полиэтиленимином и анионообменную хроматографию, проводили металл-хелатную хроматографию на заряженной Ni2+ Sepharose (GE Healthcare), гидрофобную хроматографию на Butyl Sepharose (GE Healthcare) и гель-фильтрацию высокого разрешения на колонке Superdex 200 (GE Healthcare). При концентрировании слитой репликазы перед кристаллизацией часто наблюдали агрегацию белка, особенно в условиях низкой ионной силы. Эту проблему удалось решить путем расщепления связи между EF-Tu и ß-субъединицей, для чего в связывающий их линкер ввели последовательность, кодирующую сайт расщепления протеазой вируса гравировки табака (TEV; tobacco etch virus): Glu-Asn-Lys-Tyr-Phe-Gln-Gly. Обработку протеазой проводили после металл-хелатной хроматографии.

В отличие от репликазы дикого типа и химерной репликазы, как полностью слитая репликаза, так и расщепленная протеазой TEV оказались склонными к димеризации. Димер и мономер разделяли на стадии гель-фильтрации; при этом большая часть препарата, как правило, была представлена димером (рис. 7А). Оба варианта имеют одинаковый субъединичный состав (рис. 7Б).

А 0,50

0,45

ш 0,40 о

0,35

5 °<30

8 0.25

| 0.20

с 0.15 О

0,10 ■ 0,05 0,00 -

10 15

объем элюции, мл

ДТ 31 ММ

РР-Тя-Ти щ тт (¡ш*т ты»

, 40

Рис. 7. Разделение димера и мономера слитой ор-репликазы.

(А) Гель-фильтрация обработанного ТЕУ-протеазой препарата коровой части слитой репликазы. (Б) Денатурирующий электрофорез в 10% ПААГ препарата димера (Д), мономера (М), коровой части репликазы дикого типа (ДТ) и рибосомного белка ММ -маркеры молекулярной массы (кДа). Гель окрашен кумасси С-250.

® димер слитой репликазы X реппиказа дикого типа

О мономер спитой репликазы

Рис. 8. Сравнение свойств димера и мономера слитой Ор-репликазы. (А) Синтез поли(в) на поли(С) в присутствии 1 пмоль слитой 0(3-репликазы. (Б) Репликация 5 фмоль (30135 РНК в присутствии [а-32Р] 11ТР и 1 пмоль слитой (Зр-репликазы. (В) Термостабильность: остаточная активность в поли(С)-зависимой реакции после 10-минутной инкубации при указанной температуре в отсутствие лигандов. (Г) Температурный оптимум, в том числе для репликазы дикого типа, в поли(С)-зависимой реакции. Во всех случаях использовали препараты репликазы, лишенных белка

13

Ферментативная активность слитой Q/3-репликазы

Все последующие эксперименты проводили со слитой репликазой, обработанной протеазой TEV. По всем проведенным тестам - синтез поли(С) на поли(С), репликация RQ135 РНК, термостабильность и температурный оптимум - димерная и мономерная формы слитой репликазы существенно не отличались ни друг от друга, ни от репликазы дикого типа (рис. 8).

Кроме того, мономер и димер оказались неотличимы по способности образовывать инициаторные и элонгационные комплексы, которые удалось различить с помощью электрофореза в неденатурирующих условиях. Инициация в присутствии GTP (синтез немеченого pppGGG) приводит к появлению одной новой полосы в случае мономера (рис. 9А, дорожка 3) и двух новых полос в случае димера (рис. 9А, дорожка 7), электрофоретическая подвижность которых меньше подвижности соответствующих свободных форм репликазы (рис. 9А, дорожки 2 и 6). Вероятно, появление двух полос в случае димера говорит об образовании инициаторных комплексов, удерживающих одну и две молекулы матрицы. При добавлении СТР и [а-32Р] UTP, разрешающих синтез пентануклеотида (pppGGGCU*), соответствующие элонгационные комплексы радиоактивно метятся и выявляются при авторадиографии (рис. 9Б, дорожки 4 и 8). В присутствии всех четырех NTP синтезируется полноразмерная комплементарная копия RQ135 РНК, что приводит к дальнейшему уменьшению подвижности меченых элонгационных комплексов; при этом часть новосинтезированной РНК высвобождается в одноцепочечной форме (оцРНК) и в виде дуплекса (дцРНК) с исходной матрицей (рис. 95, дорожки 5 и 9). В присутствии GTP происходит диссоциации димера репликазы на мономеры (рис. 9А, дорожки 7-9), однако этот переход не связан с синтезом РНК, так как наблюдается в отсутствие матрицы (рис. 9А, дорожка 10) и не приводит к образованию меченых мономерных инициаторных и элонгационных комплексов (рис. 9Б; ср. дорожки 8 и 9 с дорожками 4 и 5).

Таким образом, объединение факторов элонгации EF-Tu и EF-Ts в один полипептид, равно как и димеризация Qp-репликазы, не изменяют ее функциональных свойств. Полученные данные также указывают на возможность выделения инициаторных и элонгационных комплексов Qp-репликазы, достаточно стабильных для их кристаллизации.

А Б

мономер димер мономер димер

12 3 4.5 67 89 10 12 3 45 67 89 10

Ш- .......*

*

* дц НСП35

•

Рис. 9. Электрофоретический анализ инициаторных и элонгационных комплексов мономера и димера слитой репликазы на ИС1135 РНК.

Дорожки содержат: одноцепочечную Р?(2135 РНК (1), свободные мономер (2) и димер (6), инициаторные комплексы, полученные в присутствии только вТР (3 и 7), элонгационные комплексы, полученные в присутствии вТР, СТР и [а-32Р] 1ЛР (4 и 8) и в присутствии всех МТР (5 и 9), смесь димера репликазы с вТР в отсутствие матрицы (10). Электрофорез проводили в неденатурирующих условиях в 8% ПААГ. (А) Гель окрашен серебром. (Б) Радиоавтограф того же геля. Положение радиоактивных маркеров (точек) на панели Б соответствуют положению точек на панели А.

Кристаллизация слитой О/З-репликазы

Среди всех вариантов слитой репликазы (димер и мономер, ± белок Б1) удалось получить кристаллы только димерной формы коровой части. Кристаллизацию проводили методом диффузии паров в сидячей капле с использованием пентаэритритолпропоксилата в качестве осадителя при температуре инкубации 4°С

оц ¡ЭД135<

§

■<з

=>

О

О о О

<а о

ш

5мг/мл 7,5 мг/мл 10 мг/мл

концентрация димера слитой репликазы в капле

Рис. 10. Кристаллы димера слитой (Э(3-репликазы.

Капли готовили смешиванием 2 мкп 10-20 мг/мл димера коровой части слитой <2(3-репликазы и 2 мкп резервуарного раствора, содержащего 0,1 М МЕ8-ЫаОН рН 5,7; 0,2 М КС1 и 27% пентаэритритолпропоксилат. Инкубацию проводили при 4°С. Кристаллы появлялись в течение первых суток инкубации и достигали максимального размера в течение недели.

А

Б

EF-Ts

6

Рис. 11. Пространственная структура коровой части Qß-репликазы.

(А) Элементарная кристаллическая ячейка, содержащая димер коровой части репликазы. (Б) Структура мономера репликазы, состоящего из каталитической субъединицы (ß) и слитых факторов элонгации EF-Tu и EF-Ts.

(рис. 10). Полученные кристаллы обеспечивали дифракцию вплоть до 2,5 А, что позволило решить структуру Qß-репликазы с высоким разрешением.

Структура Qß-репликазы

Определение структуры

Для решения структуры репликазы использовали метод молекулярного замещения и известную структуру комплекса факторов элонгации EF-Tu-Ts из Е. coli в качестве модели. В элементарной кристаллической ячейке был обнаружен димер репликазы (рис. 11 А), который, по-видимому, соответствует димеру репликазы в растворе. Мономер коровой части репликазы состоит из ß-субъединицы и полипептида, образованного слитыми факторами элонгации EF-Tu и EF-Ts (рис. 11 Б). Атомные координаты структуры депонированы в базе данных PDB под кодом ЗММР.

Данная структура является первой для репликаз РНК-содержащих бактериофагов из семейства Leviviridae и первой структурой комплекса каталитической субъединицы вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы с хозяйскими белками. Образование комплексов с хозяйскими белками характерно для РНК-репликаз не только бактериофагов, но и вирусов эукариот (Ortin and Parra, 2006. Ann и. Rev. Microbiol. 60, 305-326), поэтому значение данной структуры выходит за пределы левивирусов.

Рис. 12. Сравнение структуры факторов элонгации EF-Tu и EF-Ts в комплексе Tu:Ts и в составе Qß-репликазы. Структура слитых EF-Tu и EF-Ts в составе Qß-репликазы (выделено оранжевым) выровнена со структурой комплекса факторов (код 1EFU в базе PDB, выделено синим) при помощи программы PyMoi (панель А). Пунктиром выделен мотив coiled-coil в EF-Ts, положение которого изменяется при образовании комплекса с ß-субьединицей (панель Б).

Структура факторов элонгации EF-Tu и EF-Ts в составе Qß-репликазы

Структура слитых факторов элонгации EF-Tu и EF-Ts, входящих в состав Qß-репликазы, практически не отличается от структуры свободного комплекса факторов. Исключение составляет расположение мотива coiled-coil в EF-Ts (рис. 12). В составе репликазного комплекса этот мотив EF-Ts повернут по часовой стрелке примерно на 18° в сторону от ß-субъединицы (рис. 12В).

Взаимодействие факторов элонгации и ß-субъединицы обеспечивается прежде всего гидрофобными взаимодействиями, которые дополнительно стабилизируются водородными связями и солевыми мостиками.

Структура каталитической субъединицы

Пространственную структуру каталитической ß-субъединицы можно описать моделью сжатой правой руки, характерной для всех известных РНК-зависимых РНК-полимераз (Ferrer-Orta et al. 2006. Cuir. Opin. Struct. Biol. 16, 27-34). Присутствуют консервативные домены большого пальца, пальцев и ладони (рис. 13). Обычно домены пальцев и большого пальца образуют желоб, вдоль которого происходит продвижение РНК-матрицы в процессе синтеза, а каталитический центр расположен

Й. большой палец

пальцы

ладонь

Рис. 13. Структура каталитической субъединицы Qp-репликазы. Указаны консервативные элементы: домены пальцев, ладони, большого пальца и Bridge, а так же спирали Т и Bridge, участвующие во взаимодействии с фактором элонгации EF-Tu.

(3-субъединица

Bridge

bis? л

тРНК

спираль!

EF-Tu EF-Tu

Рис. 14. Взаимодействие В-субъединицы репликазы с фактором элонгации EF-Tu.

Спираль Т pS-субъединицы взаимодействует с доменом II фактора элонгации EF-Tu (А) в том же месте, где фактор EF-Tu связывает ССА-конец тРНК (Б) в комплексе с аминоацил-тРНК (код 10В2 в базе PDB).

на ладони, содержащей консервативный мотив GDD. Остатки аспартата в этом мотиве участвуют в координации двувалентных катионов, участвующих в катализе образования межнуклеотидной связи (Steitz, 1998. Nature 391, 231-232). В структуре р-субъединицы так же был обнаружен элемент Bridge, представленный двутяжевой (3-шпилькой и соединяющий домены пальцев и большого пальца. Подобный элемент также присутствует и в других вирусных РНК-зависимых РНК-полимеразах.

Помимо элементов, присущих всем РНК-репликазам, в структуре каталитической субъединицы обнаружены две а-спирапи, участвующие в образовании комплекса с фактором элонгации EF-Tu. Это спираль Т и следующая за ней спираль, примыкающая к участку Bridge. Во взаимодействии с фактором EF-Ts принимает участие домен большого пальца р-субъединицы.

Стоит отметить, что спираль Т р-субъединицы взаимодействует со вторым доменом фактора элонгации EF-Tu в том же месте, где происходит связывание ССА-конца аминоацил-тРНК, а спираль Bridge расположена на границе второго и третьего домена EF-Tu в непосредственной близости с регионами switch I и switch II (рис. 14). Регион switch II EF-Tu в составе репликазы имеет ту же конформацию, что и в свободном комплексе EF-Tu'EF-Ts. Регион switch I в полученной структуре репликазы не виден.

Таким образом, структуры, участвующие в образовании комплекса фактора элонгации EF-Tu и тРНК, в структуре Qp-репликазы взаимодействуют с вирусной субъединицей.

Сравнение с известными структурами РНК-зависимых РНК-полимераз

За исключением индивидуальных особенностей, структуру всех РНК-зависимых РНК-полимераз можно описать моделью правой руки, о чем говорилось выше. Среди известных структур РНК-зависимых РНК-полимераз можно выделить две основные группы (Ng et al., 2008. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 320, 137-156; Lesear and Canard, 2009. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 759-767). К первой группе относятся РНК-репликазы, осуществляющие инициацию синтеза РНК de novo, то есть без использования праймеров. Для этих полимераз характерно компактное расположение доменов пальцев и большого пальца, так что ограниченное ими пространство может вместить только одноцепочечный участок РНК. Для праймер-зависимых РНК-репликаз, напротив, характерна более открытая структура. При этом желоб, образованный доменами пальцев и большого пальца, может вместить двуцепочечный участок А-формы РНК. Из сравнения структуры каталитической субъединицы Qp-репликазы с известными структурами РНК-репликаз (рис. 15) можно сделать вывод, что для нее характерна открытая конформация, присущая праймер-зависимым РНК-репликазам. Однако известно, что QP-репликаза в норме осуществляет инициацию синтеза РНК de novo, хотя и может использовать праймеры in vitro.

Известно, что при взаимодействии с QP-PHK происходит значительное изменение конформации репликазы. При этом р-субъединица репликазы теряет возможность сшиваться с факторами элонгации бифункциональным агентом - диметил суберимидатом (Young and Blumenthal, 1975. J. Biol. Chem. 250, 1829-1832). Учитывая структурные изменения, происходящие при связывании с РНК, а также

р

р

HCV

FMDV

Q(3

Рис. 15. Сравнение структур РНК-зависимых РНК-полимераз.

(А) РНК-репликаза вируса гепатита С (код 1QUV в базе PDB) относится к группе репликаз, осуществляющих синтез РНК de novo имеющих компактную организацию. (Б) РНК-репликаза вируса ящура (FMDV, код 1U09 в базе PDB) относится к праймер-зависимым репликазам, которые менее компактны, а пространство между доменами пальцев и большого пальца может вместить участок двуцепочечной РНК. (В) Каталитическая субъединица Qg-репликазы по структуре больше похожа на праймер-зависимые РНК-репликазы, хотя и осуществляет синтез РНК de novo. F, Р, Т - домены пальцев, ладони и большого пальца соответственно.

формирование при инициации закрытой репликативной конформации, которая была охарактеризована биохимически (Ugarov et al., 2003. J. Biol. Chem. 278, 44139-44146), можно предположить, что на стадии инициации Qp-репликаза приобретает компактную структуру, а описанная здесь структура отражает свободное состояние репликазы до стадии инициации.

Модель элонгационного комплекса (¡[¡-репликазы

Представленная на рис. 16 модель построена на основании сравнения с кристаллической структурой РНК-репликазы норовируса (Norwalk virus), связанной с СТР и дуплексом матрицы и праймера (код 3BSN в базе PDB), и не учитывает вероятные конформационные изменения белка и РНК. В этой модели элемент Bridge находится у выхода из туннеля, в котором находится дуплекс матрицы и растущей цепи и разделяет отверстия для выхода матрицы и растущей цепи. Когда достигает в длину 6-7 пар оснований, он упирается в Bridge, который расплетает цепи дуплекса подобно замку молнии, так что при дальнейшей элонгации матрица и продукт покидают репликативный комплекс в виде одноцепочечных молекул, что является обязательным условием при синтезе РНК Qp-репликазой.

Согласно предложенной модели, в активном центре Ор-репликазы формируется короткий двуцепочечный участок РНК, существование которого прямо показано не

Рис. 16. Модель элонгационного комплекса Qß-репликазы.

Показаны каналы для входа матрицы (М) в активный центр и выхода матрицы и продукта (П). Так же указан канал, по которому NTP поступают к активному центру, расположенному на домене ладони. (А) вид модели элонгационного комплекса со стороны домена ладони (Р, palm); (Б) вид со стороны домена большого пальца (Т, thumb).

было, однако косвенно подтверждается тем, что репликаза может использовать праймеры in vitro. При этом наиболее эффективными праймерами являются олигонуклеотиды длиной 2-7 нт, а олигонуклеотиды большей длины не активны (Feix and Hake, 1975. Biochem. Biophys. Res. Commun. 65, 503-509).

Сравнение со структурой Qß-репликазы, опубликованной другими авторами

Спустя три месяца после публикации представленной структуры была опубликована еще одна структура коровой части Qß-репликазы, полученная японскими исследователями (Takeshita and Tomita, 2010. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 107, 1573315738). Для кристаллизации они так же, как и мы, использовали слитую репликазу, однако не отщепляли ß-субъединицу от факторов элонгации. Полученная ими структура практически идентична нашей. Отличие состоит в том, что они определили структуру комплекса репликазы с двухвалентными катионами Ca2* и Мд2+, проведя кристаллизацию в присутствии высокой концентрации их солей. Как и ожидалось, связывание двухвалентных катионов происходит в районе консервативного мотива GDD в домене ладони и сопровождается небольшим изменением положения боковых цепей остатков аспарагиновой кислоты, но не приводит к изменению конформации основной цепи.

Выводы

1. Получены кристаллы коровой части 0(3-репликазы благодаря использованию двух способов повышения жесткости ее структуры: замене фактора элонгации ЕЯ-Тэ на его термофильный аналог и введению ковалентной связи между субъединицами ЕР-Тэ и ЕЯ-Ти.

2. Показано, что способные к кристаллизации формы способны узнавать и экспоненциально размножать реплицирующиеся РНК и, следовательно, адекватно отражают свойства Ор-реппиказы дикого типа.

3. Решена структура коровой части ОР-репликазы с разрешением 2,5 А. Таким образом, впервые определена структура РНК-зависимой РНК-полимеразы, содержащей вирусный и клеточные белки.

4. Предложена модель структуры элонгационного комплекса, объясняющая такие свойства ОР-репликазы как способность расплетать дуплекс между матрицей и растущей цепью и неспособность использовать праймеры длиннее 7 нуклеотидов.

5. Показано, что введение ЕЯ-Тэ Пегтиэ МегторЬИиБ в состав ОР-репликазы приводит к повышению ее термостабильности и позволяет более чем вдвое повысить эффективность размножения РНК по сравнению с репликазой дикого типа.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах

Статьи в научных журналах:

1. Васильев Н.Н., Дженнер Л., Юсупов М.М., Четверин А.Б. Выделение и кристаллизация химерной QpS-репликазы, содержащей фактор элонгации EF-Ts Thermus thermophilus.ll Биохимия. - 2010 - Т.75 - С. 1091-1097.

2. Kidmose R.T., Vasiliev N.N., Chetverin А.В., Andersen G.R., Knudsen C.R. Structure of the Q(3 replicase, an RNA-dependent RNA polymerase consisting of viral and host proteins.// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2010 - V.107 - P. 1088410889.

Тезисы конференций:

1. Васильев H.H., Тнимов З.К., Угаров В.И., Дженнер Л.Б., Юсупов М.М., Четверина Е.В., Четверин А.Б. Химерная Qp-репликаза, содержащая термофильный EF-Ts.// Ежегодная научная конференция Института белка РАН. - Сборник тезисов - 8-9 июня 2010 - С. 18.

Подписано в печать 16 сентября 2011 г. Объем 1,2 п.л. Тираж 60 экз. Заказ № 360 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васильев, Никита Николаевич

Использованные сокращения.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. РНК-содержащие вирусы.

1.1.1. Бактериофаг Qß.

1.2. Qß-репликаза.

1.2.1. Матрицы Qß-репликазы.

1.2.2. Репликационный цикл Qß-репликазы.

1.2.3. Субъединичный состав Qß-репликазы.

1.2.4. Структура Qß-репликазы.

1.3. Структура и функции РНК-зависимых РНК-полимераз.

1.3.1. Инициация синтеза РНК.г.

1.3.2. Элонгация полинуклеотидной цепи.

1.3.3. Образование комплекса вирусных РНК-зависимых РНК-полимераз с клеточными белками.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура коровой части репликазы фага Θβ"

Qß-репликаза является РНК-зависимой РНК-полимеразой бактериофага Qß, паразитирующего на клетках Escherichia coli Qß-репликаза представляет из себя гетеротетрамерный белковый комплекс, состоящий из каталитической ß-субъединицы, кодируемой геномом фага, и трех белков Е. coli- рибосомного белка S1 и факторов элонгации трансляции EF-Tu и EF-Ts. Такой комплекс способен экспоненциально размножать геномную РНК бактериофага длиной 4200 нт и относительно короткие RQ РНК (от Replicable by Qß-replicase) длиной от нескольких десятков до нескольких сотен нуклеотидов, образующиеся путем случайных рекомбинаций РНК и присутствующие как в зараженных клетках, так и фаговых частицах До настоящего времени Qß-репликаза остается наиболее эффективной РНК-зависимой РНК-полимеразой, способной к экспоненциальному размножению РНК in vitro.

По отношению к РНК-матрицам Qß-репликаза проявляет высокую специфичность, что позволяет ей избирательно размножать геномную РНК при заражении клеток Е. coli. Механизм узнавания РНК-матриц Qß-репликазой до сих пор остается не известным, что ограничивает применение Qß-репликазы для размножения заданных молекул РНК in vitro. Для узнавания матриц Qß-репликаза не использует каких-либо праймеров или промоторных элементов, а последовательности реплицируемых молекул РНК не гомологичны, за исключением 5-концевого onnro(G) и З'-концевого олиго(С) кластеров. Однако из 1012 случайных последовательностей длиной 50-77 нт, содержащих 5-GGG. и .ССС-3' участки, с помощью процедуры SELEX удалось отобрать лишь единичные молекулы РНК, способные к размножению Qß-репликазой Отсюда следует, что высокая специфичность узнавания обусловлена вторичной и третичной структурой РНК.

Выявить важные для узнавания элементы структуры РНК можно было бы с помощью рентгеноструктурного анализа комплексов репликазы с РНК-матрицами, однако до сих пор не удавалось получить кристаллы ни таких комплексов, ни свободной Ор-репликазы.

В настоящей работе впервые получены кристаллы и определена пространственная структура коровой части ОР-репликазы (комплекса (3-субъединицы с факторами ЕЯ-Ти и ЕР-Тэ), способной к выполнению основных каталитических функций. Это помогает выяснить, как взаимодействуют вирусная и клеточные субъединицы при образовании репликазного комплекса, ответить на вопросы о роли хозяйских белков в составе вирусной репликазы, и, что наиболее интересно, открывает путь для выяснения механизма узнавания РНК-матриц 0(3-репликазой.

Работа по кристаллизации и определению структуры 0|3-репликазы была выполнена большим международным коллективом авторов из трех научных учреждений: Института белка РАН (Пущино, Россия), Института генетики и молекулярной и клеточной биологии (Страсбург, Франция) и Университета города Орхуса (Дания).

Автор искренне благодарит сотрудников лаборатории биохимии вирусных РНК (ИБ РАН) Е.В. Четверину, В.И. Угарова, З.К. Тнимова и технический персонал за помощь в планировании и проведении экспериментов, обучение и критическое обсуждение результатов.

Автор признателен М.М. Юсупову и сотрудникам его группы Г.З. Юсуповой и Л. Дженнеру (Институт генетики и молекулярной и клеточной биологии, Страсбург, Франция) за преподанные навыки работы в области кристаллизации белков и непосредственное участие в работе.

Автор благодарен Г. Андерсену, Ш. Кнудсен и Р. Кидмосу из Университета г. Орухус (Дания) за плодотворное сотрудничество и решающую роль в решении пространственной структуры Ор-репликазы.

Особую признательность автор выражает своему научному руководителю А.Б. Четверину за искренний интерес, постоянное внимание и прекрасную школу научной работы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Васильев, Никита Николаевич

выводы

1. Получены кристаллы коровой части 0(3-репликазы благодаря использованию двух способов повышения жесткости ее структуры: замене фактора элонгации ЕР-Тэ на его термофильный аналог и введению ковалентной связи между субъединицами ЕР-Тэ и ЕР-Ти.

2. Показано, что способные к кристаллизации формы способны узнавать и экспоненциально размножать реплицирующиеся РНК и, следовательно, адекватно отражают свойства Ор-репликазы дикого типа.

3. Решена структура коровой части 0(3-репликазы с разрешением 2,5 А. Таким образом, впервые определена структура РНК-зависимой РНК-полимеразы, содержащей вирусный и клеточные белки.

4. Предложена модель структуры элонгационного комплекса, объясняющая такие свойства 0(3-репликазы как способность расплетать дуплекс между матрицей и растущей цепью и неспособность использовать праймеры длиннее 7 нукпеотидов.

5. Показано, что введение ЕР-Тэ ТЬегтиэ №егторЫ1из в состав О0-репликазы приводит к повышению ее термостабильности и позволяет более чем вдвое повысить эффективность размножения РНК по сравнению с репликазой дикого типа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васильев, Никита Николаевич, Москва

1. Бони И.В., Исаева Д.М. 1988. Локализация участков РНК бактериофагов Q(B, fr и MS2, вовлеченных во взаимодействие с рибосомным белком S1 при образовании комплексов с 30S рибосомной субчастицей. Доклады Академии Наук СССР 298: 1015-1018.

2. Бони И.В., Исаева Д.М., Будовский Э.И. 1986. Рибосомный белок S1 в составе комплекса 30S рибосомной субчастицы Е. coli с РНК фага MS2 взаимодействует с внутренним районом гена репликазы. Биоорганическая химия 12: 293-296.

3. Тнимов, З.К. 2007. Получение гибридной 0(3-репликазы, содержащей факторы элонгации EF-Tu и EF-Ts Т. thermophilus. Магистерская диссертация. Институт белка РАН. Пущино.

4. Четверин, А.Б. 1998. Бактериофаг Q|3 как объект молекулярной биологии. Успехи биологической химии 38: 3-75.

5. Agol, V.I., Paul, A.V., Wimmer, Е. 1999; Paradoxes of the replication of picornaviral genomes. Virus Res. 62: 129-147.

6. Aposhian, H.V, Kornberg, A. 1962. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. IX. The polymerase formed after T2 bacteriophage infection of Escherichia coli: a new enzyme. J. Biol. Chem. 237: 519-525.

7. Arai, K., Arai, N., Nakamura, S., Oshima, Т., Kaziro, Y. 1978a. Studies on polypeptide-chain-elongation factors from an extreme thermophile, Thermus thermophilus HB8. 2. Catalytic properties. Eur. J. Biochem. 92: 521-531.

8. Avota, E., Berzins, V., Grens, E., Vishnevsky, Y., Luce, R., Biebricher, C.K. 1998. The natural 6 S RNA found in Qß-infected cells is derived from host and phage RNA. J. Mol. Biol. 276: 7-17.

9. Baltimore, D., Franklin, R.M. 1962. The effect of Mengovirus infection on the activity of the DNA-dependent RNA polymerase of L-cells. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 48: 1383-1390.

10. Banerjee, A.K., Eoyang, L., Hori, K., August, J.T. 1967. Replication of RNA viruses, IV. Initiation of RNA synthesis by the Qß RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 57: 986-993.

11. Banerjee, A.K., Kuo, C.H., August, J.T. 1969a. Replication of RNA viruses. 8. Direction of chain growth in the Qß RNA polymerase reaction. J. Mol. Biol. 40: 445-455.

12. Banerjee, A.K., Rensing, U., August, J.T. 1969b. Replication ofjRNA viruses. X. Replication of a natural 6S RNA by the Qß RNA polymerase. J'. Mol. Biol. 45: 181-193.

13. Barrera, I. 1993. Different mechanisms of recognition of bacteriophage Qß plus and minus strand RNAs by Qß replicase. J. Mol. Biol. 232: 512-521.

14. Bausch, J.N., Kramer, F.R., Miele, E.A., Dobkin, C., Mills, D.R. 1983. Terminal adenylation in the synthesis of RNA by Qß replicase. J. Biol. Chem. 258: 1978 -1984.

15. Beekwilder, J., Nieuwenhuizen, R., Poot, R., van Duin, J. 1996. Secondary structure model for the first three domains of Qß RNA. Control of A-protein synthesis. J. Mol. Biob256: 8-19.

16. Behrens, S.E., Tomei, L., De Francesco, R. 1996. Identification and properties of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis C virus. EMBO J. 15: 12-22.

17. Berestowskaya, N.H., Vasiliev, V.D., Volkov, A.A., Chetverin, A.B. 1988. Electron microscopy study of Qß replicase. FEBS Lett. 228: 263-267.

18. Bessman, M.J., Lehman, I.R., Simms, E.S., Kornberg, A. 1958. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. J. Biol. Chem. 233: 171-177.

19. Biebricher, C.K. 1992. Quantitative analysis of mutation and selection in self-replicating RNA. Adv. Space Res. 12: 191-197.

20. Biebricher, C.K., Diekmann, S., Luce, R. 1982. Structural analysis of self-replicating RNA synthesized by Qß replicase. J. Mol. Biol. 154: 629-648.

21. Biebricher, C.K., Eigen, M., Gardiner, W.C. 1983. Kinetics of RNA replication. Biochemistry 22: 2544-2559.

22. Biebricher, C.K., Eigen, M., Luce, R. 1981. Product analysis of RNA generated de novo by Qß replicase. J. Mol. Biol. 148: 369-390.

23. Biebricher, C.K., Luce, R. 1992. In vitro recombination and terminal elongation of RNA by Qß replicase. EMBO J. 11: 5129-5135.

24. Birnboim, H.C., Doly, J. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523.

25. Blank, J., Nock, S., Kreutzer, R,. Sprinzl, M. 1996. Elongation factor Ts from Thermus thermophilus overproduction in Escherichia coli, quaternary structure and interaction with elongation factor Tu. Eur. J. Biochem. 236: 222-227.

26. Blumenthal, T. 1980. Qß replicase template specificity: different templates require different GTP concentrations for initiation. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77: 2601-2605.

27. Blumenthal, T., Carmichael, G.G. 1979. RNA replication: function and structure of Qß-replicase. Annu. Rev. Biochem. 48: 525-548.

28. Blumenthal, T., Landers, T.A. 1973. The inhibition of nucleic acid-binding proteins by aurintricarboxylic acid. Biochem. Biophys. Res. Commun. 55: 680-688.

29. Blumenthal, T., Landers, T.A. 1976. Renaturation of a multisubunit multiactivity enzyme complex: recovery of phage Qß RNA replicase, EF-Tu, and EF-Ts activities after denaturation in urea. Biochemistry 15: 422-425.

30. Blumenthal, T., Landers, T.A., Weber, K. 1972. Bacteriophage Qß replicase contains the protein biosynthesis elongation factors EF Tu and EF Ts. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 69: 1313-1317.

31. Boni, I.V., Zlatkin, I.V., Budowsky, E.I. 1982. Ribosomal protein S1 associates with Escherichia coli ribosomal 30-S subunit by means of protein-protein interactions. Eur. J. Biochem. 121: 371-376.

32. Brown, D., Gold, L. 1996. RNA replication by Qß replicase: a working model. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 93: 11558-11562.

33. Brown, S., Blumenthal, T. 1976a. Function and structure in ribonucleic acid phage Qß ribonucleic acid replicase. Effect of inhibitors of EF-Tu on ribonucleic acid synthesis and renaturation of active enzyme. J. Biol. Chem. 251: 2749 -2753.

34. Brown, S., Blumenthal, T. 1976b. Reconstituting of Qß RNA replicase from a covalently bonded elongation factor Tu-Ts complex. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 73: 1131-1135.

35. Bruenn, J.A. 2003. A structural and primary sequence comparison of the viral RNA-dependent RNA polymerases. Nucleic Acids Res. 31: 1821-1829.

36. Butcher, S.J., Grimes, J.M., Makeyev, E.V.\ Bamford; D.H., Stuart, D.I. 2001. A mechanism for initiating RNA-dependent RNA polymerization. Nature 410: 235240.

37. Bycroft, M., Hubbard, T.J., Proctor, M., Freund, S.M., Murzin, A.G. 1997. The solution structure of the Sil RNA binding domain: a member of an ancient nucleic acid-binding fold. Cell 88: 235-242.

38. Cameron, C.E., Moustafa, I.M., Arnold, J.J. 2009. Dynamics: The missingtlink between structure and function of the viral RNA-dependent RNA polymerase? Curr. Opin. Struct. Biol. 19: 768-774.

39. Carmichael, G.G., Landers, T.A., Weber, K. 1976. Immunochemical analysis of the functions of the subunits of phage Qß> ribonucleic acid replicase. J. Biol. Chem. 251: 2744'-2748.

40. Cate, J.H., Yusupov, M.M.', Yusupova, G.Z., Earnest, T.N., Noller, H.F. 1999. X-ray crystal structures of 70Sribosome functional complexes. Science 285: 20952104.

41. Cheetham, G.M., Steitz, T.A. 1999. Structure of a transcribing T7 RNA polymerase initiation complex. Science 286: 2305-2309.

42. Chetverin, A.B., Chetverina, H.V., Demidenko, A.A., Ugarov, V.l. 1997. Nonhomologous RNA Recombination in a Cell-Free System: Evidence for a Transesterification Mechanism Guided by Secondary Structure. Cell 88: 503-513.

43. Chetverin, A.B., Chetverina, H.V., Munishkin, A.V. 1991. On the nature of spontaneous RNA synthesis by Qß replicase. J. Mol. Biol. 222: 3-9.

44. Chetverin, A.B., Spirin, A.S. 1995. Replicable RNA Vectors: Prospects for Cellfree Gene Amplification, Expression, and Cloning. In: Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. Academic Press, p 225-270.

45. Choi, K.H., Rossmann, M.G. 2009. RNA-dependent RNA polymerases. from Flaviviridae. Curr. Opin. Struct. Biol. 19: 746-751.

46. Chu, Y.G:, Cantor, C.Rt 1979. Segmental flexibility in Escherichia coii ribosomal protein S1 as studied by fluorescence polarization. Nucleic Acids Res. 6: 23632379.

47. Chu, Y.G., Cantor, C.R., Sawchyn, I., Cole, P.E. 1982. Segmental flexibility of ribosomal s protein S.1 bound to ribosomes and Qp-replicase: FEBS Lett. 145: 203-207.

48. Dennison, S., Hedges, R.W. 1972. Host specificities of RNA phages. J. Hyg. 70: 55-61.

49. Dobkin, C., Mills, D.R., Kramer, F.R., Spiegelman, S. 1979. RNA replication: required intermediates and the dissociation of template, product, and' Qp replicase. Biochemistry, 18: 2038-2044.

50. Doublie, S., Tabor, S., Long, A.M., Richardson,* C.C., Ellenberger, T. 1998. Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at' 2.2 A resolution. Nature 391: 251-258.

51. Dreher, T.W. 2009. Role of tRNA-like structures in controlling plant virus replication. Virus Res. 139: 217-229.

52. Eigen, M., Biebricher, C.K., Gebinoga, M., Gardiner, W.C. 1991. The hypercycle. Coupling of RNA and protein biosynthesis in the infection cycle of an RNA bacteriophage. Biochemistry 30: 11005-11018.

53. Engelberg-Kulka, H., Dekel, L., Israeli-Reches, M. 1977. Streptomycin-resistant Escherichia coii mutant temperature sensitive for the production of Qp-infective particles. J.Virol. 21: 1-6.

54. Falk, M.M., Sobrino, F., Beck, E. 1992. VPg gene amplification correlates with infective particle formation in foot-and-mouth disease virus. J. Virol. 66: 22512260.

55. Feix, G., Hake, H. 1975. Primer directed initiation of RNA synthesis catalysed by Qß replicase. Biochem. Biophy's. Res. Commun. 65: 503-509.

56. Feix, G., Sano, H. 1975. Initiation specificity of the poly(cytidylic acid)-dependent Qß replicase activity. Eur. J. Biochem. 58: 59-64.

57. Feix, G., Slor, H., Weissmann, C. 1967. Replication of viral RNA. 13. The early product of phage RNA synthesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 57: 14011408.

58. Ferrer-Orta, C., Agudo, R., Domingo, E., Verdaguer, N. 2009. Structural insights into replication initiation and elongation processes by the FMDV RNA-dependent RNA polymerase. Curr. Opin. Struct. Biol. 19: 752-758.

59. Ferrer-Orta, C., Arias, A., Agudo, R., Perez-Luque, R., Escarmis; C., Domingo, E., Verdaguer, N. 2006a. The structure of a protein primer-polymerase complex in the initiation of genome replication. EMBO J. 25: 880-888.

60. Ferrer-Orta, C., Arias, A., Escarmis, C., Verdaguer, N. 2006b. A comparison of viral RNA-dependent RNA polymerases. Curr. Opin. Struct. Biol. 16: 27-34.

61. Ferrer-Orta, C., Arias, A., Perez-Luque, R., Escarmis, C., Domingo, E., Verdaguer, N. 2004. Structure of foot-and-mouth disease virus RNA-dependent RNA polymerase and its complex with a template-primer RNA. J. Biol. Chem. 279:47212-47221.

62. Ferrer-Orta, C., Arias, A., Perez-Luque, R., Escarmis, C., Domingo; E., Verdaguer, N. 2007. Sequential structures provide insights into the fidelity of RNA replication. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 104: 9463-9468.

63. Filomatori, C.V., Lodeiro, M.F., Alvarez, D.E., Samsa, M.M., Pietrasanta, L., Gamarnik, A.V. 2006. A 5' RNA element promotes dengue virus RNA synthesis on a circular genome. Genes Dev. 20: 2238-2249.

64. Garrett, R.A., Wittmann, H.G. 1973. Structure of bacterial ribosomes. Adv. Protein Chem. 27: 277-347.

65. Garwes, D., Sillero, A., Ochoa, S. 1969. Virus-specific proteins in Escherichia coliinfected with phage Qß. Biochim. Biophys. Acta 186: 166-172.122

66. Gierer, A. 1957. Structure and biologicahfunction of ribonucleic acid from tobacco mosaic virus. Nature 179: 1297-1299.

67. Gierer, A., Schramm, G. 1956. Infectivity of ribonucleic acid from tobacco mosaic virus. Nature 177: 702-703.

68. Giorginis, S., Subramanian; A.R. 1980. The major ribosome binding site of Escherichia coli ribosomal protein S1 is located in its N-terminal segment. J. Mol. Biol. 141: 393-408.

69. Goelz, S., Steitz, J.A. 1977. Escherichia coli ribosomal protein S1 recognizes two sites in bacteriophage Q(3 RNA. J. Biol. Chem. 252: 5177 -5179:

70. Golmohammadh R., Fridborg, K., Bundule, M., Valegard, K., Liljas, L. 1996. The crystal structure of bacteriophage Q(3 at 3.5 A» resolution. Structure 4: 543-554!

71. Guerrier-Takada, C., Johnson, A.E., Miller, D.L., Cole, P.E. 1981. Transfer RNA cross-linked to the elongation factor tu subunit of Q(B replicase does not inhibit QP RNAtreplication. J. Biol. Chem. 256: 5840 -5844.

72. Guerrier-Takada, C., Subramanian, A.R., Cole; P.E. 1983. The activity of discrete fragments of ribosomal protein S1' in Q0 replicase function. J. Biol. Chem. 258: 13649 -13652.

73. Hamel, E. 1975. Activities of guanosine triphosphate analogues in-reactions catalyzed, by elongation factor Tu and* initiation factor 2 of Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta 414: 326-340.

74. Hansen; J.L., Long, A.M., Schultz, S.C*. 1997. Structure of the RNA-dependent RNA polymerase of poliovirus. Structure 5: 1109-1122.

75. Haruna, I., Nozu, K., Ohtaka, Y., Spiegelman, S. 1963. An RNA replicase induced by and selective for a viral RNA: isolation and properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 50: 905-911.

76. Haruna, I., Spiegelman, S. 1965a. Autocatalytic synthesis of a viral RNA in vitro. Science 150: 884-886.

77. Haruna, I., Spiegelman, S. 1965b. Recognition of size and sequence by an RNA replicase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 54: 1189-1193.

78. Haruna, I., Spiegelman, S. 1965c. Specific template requirments of RNA replicases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 54: 579-587.

79. Hershey, A.D,. Chase, M. 1952. Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. J. Gen. Physiol. 36: 39-56.

80. Hill, D., Blumenthal, T. 1983. Does Q(3 replicase synthesize RNA in the absence of template? Nature 301: 350-352.

81. Hofstetter, H., Monstein, H.J., Weissmann, C. 1974. The readthrough protein A1 is essential for the formation of viable Qp particles. Biochim. Biophys. Acta 374: 238-251.

82. Hori, K., Eoyang, L., Banerjee, A.K., August, J.T. 1967. Replication of RNA viruses. V. Template activity of synthetic ribopolymers in the Qp RNA polymerase reaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 57: 1790-1797.

83. Ichíhashi, N:, Matsuura, T., Hosoda, K., Yomo, T. 2010. Identification of two* forms of Qp replicase with different thermal stabilities but identical RNA replication activity. J. Biol. Chem. 285: 37210-37217.

84. Inokuchi, Y., Hirashima, A. 1987. Interference with viral infection by defective RNA replicase. J. Virol. 61: 3946-3949.

85. Inokuchi, Y., Kajitani, M. 1997. Deletion Analysis of Qp Replicase. Participation of the carboxyl-terminal region of the p-subunit protein in template recognition. J. Biol. Chem. 272: 15339-15345.

86. Johnson, C.M., Perez, D.R., French, R„ Merrick, W.C., Donis, R.O. 2001. The NS5A protein of bovine viral diarrhoea virus interacts with the a subunit of translation elongation factor-1. J. Gen. Virol. 82: 2935 -2943.

87. Jovanovic, M., Burrows, P.C., Bose, D., Cámara, B., Wiesler, S., Zhang, X., Wigneshweraraj, S., Weinzierl, R.O.J., Buck, M. 2011. Activity map of the Escherichia coli RNA polymerase bridge helix. J. Biol. Chem. 286: 14469-14479.

88. Jung, G.Y., Chetverin, A.B., Spirin, A.S., Morozov I.Yu. 1994. Expression and stability of recombinant RQ-mRNAs in cell-free translation systems. FEBS Lett. 341: 131-134.

89. Kamen, R. 1970. Characterization of the Subunits of Qß Replicase. Nature 228: 527-533.

90. Kamen, R. 1972. A new method for the purification of Qß RNA-dependent RNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta 262: 88-100.

91. Kamen, R., Kondo, M., Romer, W., Weissmann, C. 1972. ReConstitution>of Qß Replicase Lacking Subunit a. with Protein-Synthesis-Interference Factor i. Eur. J. Biochem. 31: 44-51.

92. Kamen, R.I. 1975. Structure and function of the Qß RNA replicase. RNA Phages: 203-234.

93. Kamer, G., Argos, P. 1984. Primary structural comparison of RNA-dependent1 polymerases from plant, animal and bacterial viruses. Nucleic Acids Res. 12: 7269-7282.

94. Kao, C.C., Del? Vecchio, A.M., Zhong, W. 1999. De Novo Initiation of RNA Synthesis by a- Recombinant Flaviridae RNA-dependent RNA Polymerase. Virology'253: 1-7.

95. Karring, H., Björnsson, A., Thirup, S., Clark, B.F.C., Knudsen, C.R. 2003. Functional effects of deleting the coiled-coil motif in Escherichia coli elongation factor Ts. Eur. J. Biochem. 270: 4294-4305.

96. Karring, H., Mathu, S.G.J., van Duin, J., Clark, B.F.C., Kraal, B., Knudsen, C.R. 2004. Qß-phage resistance by deletion of the coiled-coil motif in elongation factor Ts. J. Biol. Chem. 279: 1878-1884.

97. Kashkina, E., Anikin, M., Tahirov,- T.H., Kochetkov, S.N., Vassylyev, D.G., Temiakov, D. 2006. Elongation complexes of Thermus thermophilus RNA polymerase that possess distinct translocation conformations. Nucleic Acids Res. 34: 4036-45.

98. Kawashima, T., Berthet-Colominas, C., Wulff, M., Cusack, S., Leberman, R. 1996. The structure of the Escherichia coli EF-Tu.EF-Ts complex at 2.5 Á resolution. Nature 379: 511-518.

99. Kimura, M., Foulaki, K., Subramanian, A.R., Wittmann-Liebold, B. 1982. Primary structure of Escherichia coli ribosomal protein S1 and features of its functional domains. Eur. J. Biochem. 123: 37-53.

100. Kita, H., Cho, J., Matsuura, T., Nakaishi, T., Taniguchi, I., Ichikawa, T., Shima, Y., Urabe, I., Yomo, T. 2006. Functional Q(3 replicase genetically fusing essential subunits EF-Ts and EF-Tu with (3-subunit. J. Biosci. Bioeng. 101: 421-426.

101. Klovins, J., Berzins, V., van Duin, J. 1998. A long-range interaction in Q(3 RNA that bridges the thousand nucleotides between the M-site and the 3' end is required for replication. RNA 4: 948-957.

102. Kolakofsky, D„ Billeter, M.A., Weber, H., Weissmann, C. 1973. Resynchronization of RNA synthesis bycoliphage Q3 replicase at an internal site of the RNA template. J. Mol. Biol. 76: 271-284.

103. Kolakofsky, D., Weissmann, C. 1971. Possible mechanism for transition of viral RNA from polysome to replication complex. Nature New Biol. 231: 42-46.

104. Kondo, M: 1975. Structure and function of RNA replicase of bacteriophage Q(3. Arch. Int. Physiol. Biochim. 83: 909-948.

105. Kondo, M.', Gallerani, R., Weissmann, C. 1970. Subunit Structure of Q(3 Replicase. Nature 228: 525-527.

106. Kostyuk, D.A., Dragan, S.M., Lyakhov, D.L., Rechinsky, V.O., Tunitskaya, V.L., Chernov, B.K., Kochetkov, S.N. 1995. Mutants of T7 RNA polymerase that are able to synthesize both RNA and DNA. FEBS Lett. 369: 165-8.

107. Kozak, M., Nathans, D. 1972. Translation of the genome of a ribonucleic acid bacteriophage. Bacteriol. Rev. 36: 109-134.

108. Kramer, F.R., Mills, D.R. 1978. RNA sequencing with radioactive chain-terminating ribonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 5334-5338.

109. Kuzmine, I., Gottlieb, P.A., Martin, C.T. 2001. Structure in nascent RNA leads to termination of slippage transcription by T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 29: 2601-6.

110. Kyono, K., Miyashiro, M., Taguchi, I. 2002. Human eukaryotic initiation factor 4AII associates with hepatitis C virus NS5B protein in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 292: 659-666.

111. Labischinski," H., Subramanian, A.R. 1979. Protein S1 from Escherichia coli ribosomes: an improved isolation procedure and shape determination by small-angle X-ray scattering. Eur. J. Biochem. 95: 359-366.

112. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

113. Lai, M.M. 1998. Cellular factors in the transcription and replication of viral RNA genomes: a parallel to DNA-dependent RNA transcription. Virology 244: 1-12.

114. Landers, T.A., Blumenthal, T., Weber, K. 1974. Function and Structure in Ribonucleic Acid Phage Qß, Ribonucleic Acid Replicase. J. Biol. Chem. 249: 5801 -5808.

115. Laurila, M.R.L., Salgado, P.S., Stuart, D.I., Grimes, J.M., Bamford, D.H. 2005. Back-priming mode of cp6 RNA-dependent'RNA polymerase. J. Gen. Virol. 86: 521-526.

116. Lehman, I.R., Bessman, M.J., Simms, E.S., Kornberg; A. 1958. Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleic Acid. J. Biol. Chem. 233: 163-170.

117. Lescar, J., Canard, B. 2009. RNA-dependent RNA polymerases from flaviviruses and'Picornaviridae. Curr. Opin. Struct. Biol. 19: 759-767.

118. Levisohn, R., Spiegelman, S. 1968. The cloning of a self-replicating RNA molecule. Proc. Natl. Acad. Sei: U.S.A. 60: 866-872.

119. Li, Z., Pogany, J., Tupman, S., Esposito, A.M., Kinzy, T.G., Nagy, P.D. 2010. Translation elongation factor 1A facilitates the assembly of the tombusvirus replicase and stimulates minus-strand synthesis. PLoS Pathog. 6: e1001175.

120. Lindner, A.J., Glaser, S.J., Biebricher, C.K., Hartmann, G.R. 1991. Self-catalysed affinity labeling of Qß replicase. Eur. J. Biochem. 202: 249-254.

121. Lizardi, P.M., Kramer, F.R. 1991. Exponential amplification of nucleic acids: new diagnostics using DNA polymerases and RNA replicases. Trend. Biotech. 9: 5358.

122. Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275.

123. Lyle, J.M., Bullitt, E., Bienz, K., Kirkegaard, K. 2002. Visualization and functional analysis of RNA-dependent RNA polymerase lattices. Science 296: 2218-2222.

124. Mans, R.M., Pleij, C.W., Bosch, L. 1991. tRNA-like structures. Structure, function and evolutionary significance. Eur. J. Biochem. 201: 303-324.

125. McDonald, S.M., Tao, Y.J., Patton, J.T. 2009. The. ins and outs of four-tunneled Reoviridae RNA-dependent RNA polymerases. Curr. Opin. Struct. Biol. 19: 775782.

126. Mekler, P. 1981. Determination ofnucleotide sequences of the bacteriophage Qß genome: organization and1 evolution of anRNA virus. PhD thesis. University of Zurich.

127. Miele, E.A., Mills, D.R., Kramer, F.R. 1983. Autocatalytic replication of a recombinant RNA. J. Mol. Biol. 171: 281-295.

128. Milligan, J.F., Uhlenbeck, O.C. 1989. Determination of RNA-protein contacts using thiophosphate substitutions. Biochemistry 28: 2849-2855.

129. Mills, D.R., Priano, C., DiMauro, P., Binderow, B.D. 1989. Qß replicase: mapping the functional domains of an RNA-dependent RNA polymerase. J. Mol. Biol. 205: 751-764.

130. Moore, P.B., Laughrea, M. 1979. The conformational properties of ribosomal protein S1. Nucleic Acids Res. 6: 2355-2361.

131. Morozov, I.Y., Ugarov, V.l., Chetverin, A.B., Spirin, A.S. 1993. Synergism in replication and translation of messenger RNA in a cell-free system. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90: 9325 -9329.

132. Munishkin, A.V., Voronin, L.A., Chetverin, A.B. 1988. An in vivo recombinant RNA capable of autocatalytic synthesis by Qß replicase. Nature 333: 473-475.

133. Munishkin, A.V., Voronin, L.A., Ugarov, V.l., Bondareva, L.A., Chetverina, H.V., Chetverin, A.B. 1991. Efficient templates for Qß replicase are formed by recombination from heterologous sequences. J.' Mol. Biol. 221: 463-472.

134. Murakami, K.S., Darst, S.A. 2003. Bacterial RNA polymerases: the wholo story. Curr. Opin. Struct. Biol. 13: 31-39.

135. Mustaev, A., Zaychikov, E., Severinov, K., Kashlev, M., Polyakov, A., Nikiforov, V., Goldfarb, A. 1994. Topology of the RNA polymerase active center probed by chimeric rifampicin-nucleotide compounds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 12036-40.

136. Nathans, D., Notani, G., Schwartz, J.H., Zinder, N.D. 1962. Biosynthesis of the coat protein of coliphage f2 by E. coli extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 48: 1424-1431.

137. Ng, K.K.-S., Arnold, J.J., Cameron, C.E. 2008. Structure-Function Relationships Among RNA-Dependent RNA Polymerases. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 320: 137-156.

138. Nishihara, T., Morisawa, H., Ohta, N., Atkins, J.F., Nishimura, Y. 2004. A cryptic lysis gene near the start of the Qp replicase gene in the +1 frame. Genes Cells 9: 877-889.

139. Nudler, E. 2009. RNA polymerase active center: the molecular engine of transcription. Annu. Rev. Biochem. 78: 335-361.

140. O'Reilly, E.K., Kao, C.C. 1998. Analysis of RNA-dependent RNA polymerase structure and function as guided by known polymerase structures and computer predictions of secondary structure. Virology 252: 287-303.

141. Ortin, J., Parra, F. 2006. Structure and function of RNA replication. Annu. Rev. Microbiol. 60: 305-326.

142. Overby, L.R., Barlow, G.H., Dpi, R.H., Jacob, M„ Spiegelman, S. 1966. Comparison of two serologically distinct ribonucleic acid bacteriophages. I. Properties of the viral particles. J. Bacteriol. 91: 442-448.

143. Pace, N.R., Spiegelman, S. 1966. In vitro synthesis of an infectious mutant RNA with a normal RNA replicase. Science 153: 64-67.

144. Palmenberg, A., Kaesberg, P. 1974. Synthesis of Complementary Strands of Heterologous RNAs with Q(3 Replicase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71: 13711375.

145. Plagemann, P.G., Swim, H.E. 1966a. Replication of mengovirus. I. Effect onsynthesis of macromolecules by host cell. J. Bacteriol. 91: 2317-2326.129

146. Plagemann, P.G., Swim, H.E. 1966b. Replication of mengovirus. II. General properties of the viral-induced ribonucleic acid polymerase. J. Bacterid. 91: 2327-2332.

147. Polatnick, J. 1980. Isolation of a foot-and-mouth disease polyuridylic acid polymerase and its inhibition by antibody. J. Virol. 33: 774-779.

148. Quadt, R., Kao, C.C., Browning, K.S., Hershberger, R.P., Ahlquist, P. 1993. Characterization of a host protein associated with brome mosaic virus RNA-dependent RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 1498-1502.

149. Ranjith-Kumar, C.T., Gutshall, L., Kim, M.-J., Sarisky, R.T., Kao, C.C. 2002. Requirements for de novo initiation of RNA synthesis by recombinant flaviviral RNA-dependent RNA polymerases. J. Virol: 76: 12526-12536.

150. Robertson, H.D., Lodish, H.F. 1970. Messenger Characteristics of Nascent Bacteriophage RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 67: 710-716.

151. Salah, P., Bisaglia, M., Aliprandi, P., Uzan, M., Sizun, C., Bontems, F. 2009. Probing the relationship between Gram-negative and Gram-positive S1 proteins by sequence analysis. Nucleic Acids Res. 37: 5578-5588.

152. Sambrook, J. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3e. Cold Spring Harbor N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

153. Schnier, J., Kimura, M., Foulaki, K., Subramanian, A.R., Isono, K., Wittmann-Liebold, B. 1982. Primary structure of Escherichia coli ribosomal protein S1 and of its gene rpsA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79: 1008-1011.

154. Schuwirth, B.S., Borovinskaya, M.A., Hau, C.W., Zhang, W., Vila-Sanjurjo, A., Holton, J.M., Cate, J.H.D. 2005. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 A resolution. Science 310: 827-834.

155. Selivanova, O.M., Shiryaev, V.M., Tiktopulo, E.I., Potekhin, S.A., Spirin, A.S. 2003. Compact globular structure of Thermus thermophilus ribosomal protein S1 in solution: sedimentation and calorimetric study. J. Biol. Chem. 278: 3631136314.

156. Senear, A.W., Steitz, J.A. 1976. Site-specific interaction of Q(3 host factor and ribosomal protein S1 with Q(3 and R17 bacteriophage RNAs. J. Biol. Chem. 251: 1902-1912.164,165166167168169170171172173174,175176

157. Sengupta, J., Agrawal, R.K., Frank, J. 2001. Visualization of protein S1 within the 30S ribosomal subunit and its interaction with messenger RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 11991-11996.

158. Shiryaev, V.M., Selivanova, O.M., Hartsch, T., Nazimov, I.V., Spirin, A.S. 2002. Ribosomal protein S1 from Thermus thermophilus: its detection, identification and overproduction. FEBS Lett. 525: 88.

159. Sousa, R., Chung, Y.J., Rose, J.P., Wang, B.-C. 1993. Crystal, structure of bacteriophage T7 RNA polymerase at 3.3 A resolution. Nature 364: 593-599.

160. Spiegelman, S., Haruna, I., Holland, I.B., Beaudreau, G., Mills, D. 1965. The synthesis of a self-propagating and infectious nucleic acid with a purified enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 54: 919-927.

161. Spiegelman, S., Pace, N.R., Mills, D.R., Levisohn, R., Eikhom, T.S., Taylor, M.M., Peterson, R.L., Bishop, D.H. 1968. The mechanism of RNA replication. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 33: 101-124.

162. Steil, B.P., Barton, D.J. 2009. Cis-active RNA elements (CREs) and picornavirus RNA replication. Virus Res. 139: 240-252.

163. Steitz, T.A. 1998. A mechanism for all polymerases. Nature 391: 231-232.

164. Steitz, T.A. 2006. Visualizing polynucleotide polymerase machines at work. The EMBO J. 25: 3458-3468.

165. Steitz, T.A. 2009. The structural changes of T7 RNA polymerase from transcription initiation to elongation. Curr. Opin. Struct. Biol. 19: 683-690.

166. Stevens, A. 1960. Incorporation of the adenine ribonucleotide into RNA by cell fractions from E. coli B. Biochem. Biophys. Res. Comm. 3: 92-96.

167. Stringfellow, L., Blumenthal, T. 1983. Q(B replicase containing a Bacillus stearothermophilus elongation factor. J. Bacteriol. 153: 1083-1087.

168. Stringfellow, L.A., Douglass, J., Blumenthal, T. 1980. Protein synthesis elongation factors Tu and Tu.Ts from Caulobacter crescentus: sensitivity to kirromycin and activity in Q(3 replicase. J. Bacteriol. 143: 389-395.

169. Studier, F.W. 2005. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41: 207-234.

170. Subramanian, A.R., Mizushima, S. 1979. Characterization of a mutant form of ribosomal protein S1 from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 254: 4309-4312.

171. Sukhodolets, M.V., Garges, S., Adhya, S. 2006. Ribosomal protein S1 promotes transcriptional cycling. RNA 12: 1505-1513.

172. Suryanarayana, T., Subramanian, A.R. 1979. Functional domains of Escherichia coli ribosomal protein S1 Formation and characterization of a fragment with* ribosome-binding properties. J. Mol. Biol. 127: 41-54.

173. Tahirov, T.H., Temiakov, D., Anikin, M., Patlan, V., McAllister, W.T., Vassylyev, D.G., Yokoyama, S. 2002. Structure of a T7 RNA polymerase elongation complex at 2.9 A resolution. Nature 420: 43-50.

174. Takeshita, D., Tomita, K. 2010. Assembly of Qß viral RNA polymerase with host translational elongation factors EF-Tu and -Ts. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 107: 15733-15738.

175. Tao, Y., Farsetta, D.L., Nibert, M.L., Harrison, S.C. 2002. RNA synthesis in a cage-structural studies of reovirus polymerase A3. Cell 111: 733-745.

176. Thomas, J.O., Boublik, M., Szer, W., Subramanian, A.R. 1979. Nucleic acid binding and unfolding properties of ribosomal protein S1 and the derivatives. S1-F1 and m1-S1. Eur. J. Biochem. 102: 309-314.

177. Tretheway, D.M., Yoshinari, S., Dreher, T.W. 2001. Autonomous role of 3'-terminal CCCA in directing transcription of RNAs by Qß replicase. J. Virol. 75: 11373-11383.

178. Tsukada, K., Okazaki, M., Kita, H., Inokuchi, Y., Urabe,' I., Yomo, T. 2009. Quantitative analysis of the bacteriophage Qß infection cycle. Biochim. Biophys. Acta 1790: 65-70.

179. Ugarov; V.l., Chetverin, A.B. 2008. Functional circularity of legitimate Qß replicase templates. J. Mol. Biol. 379: 414-427.

180. Ugarov, V.l., Demidenko, A.A., Chetverin, A.B. 2003. Qß Replicase Discriminates between Legitimate and Illegitimate Templates by Having Different Mechanisms of Initiation. J. Biol. Chem. 278: 44139 -44146.

181. Ugarov, V.l., Samatov, T.R., Chetverina* H.V., Chetverin, A.B. 1999., Plasmid purification ¿using hot Mg2+ treatment and no RNase. BioTechniques 26: 194-196;198

182. Van Dieijen, G., Van Der Laken, C.J., Van Knippenberg, P.H., Van Duin, J. 1975. Function of Escherichia coli ribosomal proteini S1 in translation of naturali and synthetic messenger RNA. J. Mol: Biol: 93: 351-366.

183. Van Dieijen, G., Van Knippenberg, P.H., Van Duin, J. 1976. The specific role of ribosomal protein S1 in the recognition of native phage RNA. Eur. J. Biochem. 64: 51.1-518!

184. Van? Dijk, A.A., Makeyev; E.V., Bamford, D.H. 2004. Initiation of viraliRNA-dependent RNA polymerization. J. Gen. Virol. 85: 1077-1093.

185. Vassylyev, D.G. 2009. Elongation by RNA polymerase: a race through> roadblocks. Curr. Opin. Struct. Biol. 19: 691-700.

186. Vassylyev, D.G., Sekine, S.-l , Laptenko, O., Lee, J., Vassylyeva, MiN:, Borukhov, S., Yokoyama, S. 2002. Crystal structure of a bacterial* RNA polymerase holoenzyme at 2.6 A resolution. Nature 417: 712-9.

187. Vogt, D.A., Andino, R. 2010. An RNA Element at the 5'-End of* the Poliovirus, Genome Functions as a General-Promoter for RNA Synthesis. PLoS'Pathog: 6: e1000936.

188. Vollenweider, H., Koller, T., Weber, H., Weissmann, C: 1976. Physical mapping; of Qß replicase binding sites on Qß RNA. J. Mol. Biol. 101: 367-377.

189. Voronin, L.A. 1992. Structural consensus of RNA templates replicated by Qß replicase. Biochimie 74: 491-494.

190. Wahba, A.J., Miller, M.J., Niveleau, A., Landers, T.A., Carmichael, G.G., Weber, K., Hawley, D.A., Slobin, L.I. 1974. Subunit I of Qß Replicase and 30 S Ribosomal Protein S1 of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 249: 3314 -3316.

191. Watanabe, I. 1964. Persistent infection with an RNA bacteriophage. Nihon Rinsho 22:243-251.

192. Weber, H., Billeter, M.A., Kahane, S., Weissmann, C., Hindley, J., Porter, A. 1972. Molecular basis for repressor activity of Q(3 replicase. Nature1 New Biol. 237: 166-170.

193. Weber, H., Weissmann, C. 1970. The 3'-termini of bacteriophage Qp plus and. minus strands. J. Mol. Biol. 51: 215-224.

194. Werner, A.M., Maizels, N. 1987. tRNA-like structures tag the 3' ends of genomic RNA molecules for replication: implications for the origin of protein synthesis. Proc. Natl. Acad: Sci. U.S.A. 84: 7383-7387.

195. Weiner, A.M., Weber, K. 1971. Natural read-through at the UGA termination signal of Qp coat protein cistron. Nature New Biol. 234: 206-209.

196. Wimmer, E., Nomoto, A. 1993. Molecular biology and cell-free synthesis of poliovirus. Biologicals 21: 349-356.

197. Wittinghofer, A., Leberman, R. 1976. Elongation factor T from Bacillus stearothermophilus and Escherichia coli. Purification and some properties of EF-Tu and EF-Ts from Bacillus stearothermophilus. Eur. J. Biochem. 62: 373-382.

198. Yamaji, Y., Kobayashi, T., Hamada, K., Sakurai, K., Yoshii, A., Suzuki,, Ml, Namba, S., Hibi, T. 2006. In vivo interaction between Tobacco mosaic virus RNA-dependent RNA polymerase and host translation elongation factor 1A. Virology 347: 100-108.

199. Yamaji, Y., Sakurai, K., Hamada, K., Komatsu, K., Ozeki, J., Yoshida, A., Yoshii, A., Shimizu, T., Namba, S., Hibi, T. 2010: Significance of eukaryotic translation• elongation factor 1A in tobacco mosaic virus infection. Arch. Virol. 155: 263-268.

200. Ye, Y., Godzik, A.' 2003. Flexible structure alignment by chaining aligned fragment pairs allowing twists. Bioinformatics 19 Suppl 2: ¡¡246-255.

201. Yin, Y.W., Steitz, T.A. 2002. Structural basis for the transition from initiation to elongation transcription in T7 RNA polymerase. Science 298: 1387-1395.

202. Yokota, T., Arai, K., Kaziro, Y. 1979. Studies on 30S ribosomal protein S1 from E. coli. I. Purification and physicochemical properties. J. Biochem. 86: 17251737.

203. Yoshinari, S., Dreher, T.W. 2000. Internal and 3' RNA initiation by Qp replicase directed by CCA boxes. Virology 271: 363-370.213.214.215.216.217.218.

204. Young, R.A., Blumenthal, T. 1975. Phage Qß ribonucleic acid replicase. Subunit relationships determined by intramolecular cross-linking. J. Biol. Chem. 250: 1829-1832.

205. Zamyatkin, D.F., Parra, F., Alonso, J.M.M., Harki, D.A., Peterson, B.R., Grochulski, P., Ng, K.K.-S. 2008. Structural insights into mechanisms of catalysis and inhibition in Norwalk virus polymerase. J. Biol. Chem. 283: 7705-7712.

206. Zhang, G., Campbell, E.A., Minakhin, L., Richter, C., Severinov, K., Darst, S.A. 1999. Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. Cell 98: 811-824.

207. Zhong, W., Ferrari, E., Lesburg, C.A., Maag, D., Ghosh, S.K., Cameron; C.E., Lau, J.Y., Hong, Z. 2000a. Template/primer requirements and single nucleotide incorporation by, hepatitis C virus nonstructural protein 5B polymerase. J. Virol. 74: 9134-9143.

208. Zhong, W., Gutshall, L.L., Del Vecchio, A.M. 1998. Identification and characterization of an RNA-dependent RNA polymerase activity within the nonstructural protein 5B region of bovine viral diarrhea virus. J. Virol. 72: 93659369.

209. Zhong, W., Uss, A.S., Ferrari, E„ Lau, J.Y.N., Hong, Z. 2000b. De Novo Initiation of RNA Synthesis by Hepatitis C Virus Nonstructural Protein 5B Polymerase. J Virol. 74: 2017-2022.

Информация о работе
  • Васильев, Никита Николаевич
  • кандидата биологических наук
  • Москва, 2011
  • ВАК 03.01.03
Диссертация
Структура коровой части репликазы фага Θβ - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Структура коровой части репликазы фага Θβ - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы