Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и РНК-связывающие свойства бактериального регулятора экспрессии генов-белка Hfq

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура и РНК-связывающие свойства бактериального регулятора экспрессии генов-белка Hfq"

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВА ЮлияМихайловна

Структура и РНК-связывающие свойства бактериального регулятора экспрессии генов - белка Ид

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004 г.

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Мария Борисовна Гарбер Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ольга Николаевна Озолинь

кандидат биологических наук, профессор Игорь Александрович Крашенинников

Ведущая организация:

Филиал Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова

Защита состоится 21 апреля 2004 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д 501.001.76 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ Физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, Лабораторный корпус "А".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Н. О. Калинина

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Изучение регуляции экспрессии генов является одной из наиболее важных задач молекулярной биологии. Осуществление контроля экспрессии генов происходит как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции и представляет собой достаточно сложную систему взаимодействий многих молекул. Для детального понимания механизмов этого процесса необходимо знание структурной организации различных его компонентов.

Белок Hfq является одним из ключевых регуляторов экспрессии бактериальных генов. Он контролирует трансляцию многих клеточных мРНК. Hfq взаимодействует с данными мРНК и меняет их вторичную структуру, а также связывается с различными нетранслируемыми малыми регуляторными РНК. Механизм взаимодействия белка Hq с РНК пока еще не известен. Данный белок является высококонсервативным среди бактерий, его гомологи найдены также у архей и эукариот. На сегодняшний день определены пространственные структуры нескольких эукариотических и архейных гомологов Hfq, а также недавно решены структуры двух бактериальных белков Hfq. Данная диссертация посвящена разработке методов выделения белков Hfq бактерий Escherichia coliи Pseudomonas aeruginosa, изучению их РНК-связывающих свойств, а также кристаллизации белка Hfq для структурных исследований.

Цель работы: выделение и исследование РНК-связывающих свойств белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa, кристаллизация одного из исследуемых белков.

Основные задачи работы

Получение штаммов-суперпродуцентов белков Hfq E. coli и P. aeruginosa, разработка методик выделения и проверка гомогенности данных белков, получение и оценка стабильности комплексов этих белков с регуляторными РНК, поиск условий кристаллизации как минимум одного из исследуемых белков Hfq.

Научная новизна в практическая ценность работы

Полученные штаммы-суперпродуценты белков Hfq E. coli и P. aeruginosa используются для препаративного выделения данных белков. Ауксотрофные по метионину штаммы-суперпродуценты белков Hfq E. coli и P. aeruginosa используются для препаративного выделения тяжелоатомных производных данных белков, у которых атомы серы в метиониновых остатках заменены атомами селена. Разработанные для данных белков методики выделения из биомассы полученных штаммов позволяют

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

«

быстро получать высокоочищенные препараты нативных и модифицированных белков HfqE. coliи P. aeruginosa в больших количествах.

Полученные специальные конструкции с клонированными под контроль Т7-промоторов измененными генами регуляторных OxyS, DsrA, RprA и RyhB РНК Е. coli позволяют синтезировать in vitro данные РНК в препаративных количествах с минимальными затратами ресурсов. Получены комплексы белков Hfq E. coli и P. aeruginosa с регуляторными DsrA, RprA и RyhB РНК. Исследована стабильность данных комплексов, и измерены константы их диссоциации в разных солевых условиях.

Проведен поиск условий кристаллизации и получены кристаллы Hfq P. aeruginosa, получены тяжелоатомные производные кристаллов данного белка. Нативные кристаллы и их тяжелоатомные производные использованы для сбора кристаллографических данных и определения пространственной структуры белка Hfq P. aeruginosa с разрешением 1.6 А.

Полученные штаммы-суперпродуценты, разработанные методики выделений и выделенные нами препараты белков Hfq E. coli и P. aeruginosa, а также конструкция для транскрипции in vitro малой регуляторной OxyS РНК, связывающейся с белком Hfq, используются для функциональных исследований в Институте молекулярной генетики (Вена, Австрия).

Структура диссертации

Диссертация состоит из обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работу иллюстрируют рисунков и таблиц. Список литературы содержит 191 ссылку. Общий объем диссертации - страниц.

Апробация работы и публикации

Работа была представлена на открытом семинаре Лаборатории структурных исследований аппарата трансляции Института белка РАН. Результаты диссертации доложены на 7 научных конференциях, по материалам диссертации в научных журналах опубликованы 3 печатные работы.

Обзор литературы посвящен биохимическим исследованиям бактериального белка Hfq. Приводятся данные о структуре и функциональных свойствах гомологов Hfq у архей и эукариот, рассматриваются предлагаемые модели их функционирования. Представленный обзор опубликован на русском языке.

Результаты и обсуждение

Создание штаммов-суперпродуцентов и выделение рекомбинантных белков Hfq Е. colmP. aeruginosa

Гены белков Hfq E. coli и P. aeruginosa были клонированы в экспрессионные векторы pETl la-PL (любезно предоставлен д-ром В. Пиндлом) и рЕТ22Ь+. Молекулярные массы белков Hfq E. coli и P. aeruginosa равны 11.2 и 8.9 кДа соответственно. Общая схема клонирования представлена на рис. 1. Последовательности генов были проверены секвенированием. Ген белка Hfq E. coli был суперэкспрессирован под контролем Т7 промотора в клетках Е. coli BL21(DE3), ген белка Hfq P. aeruginosa был суперэкспрессирован под контролем Т7 промотора в клетках BL21(DE3)/pUBS520. Плазмвда pUBS520 содержит ген аргининовой тРНК, узнающей редкие для Е. coli кодоны AGA и AGG. Присутствие данной плазмиды в клетках штамма-суперпродуцента Е. coli значительно увеличивает продукцию рекомбинантных белков и предупреждает замены аргининов на лизины, возникающие при недостатке соответствующей тРНК (Brinkmann et al., 1989, Gene (Amst.), 85, 109-114). Экспрессия генов проводилась в системе Штудиера (Studier et al., 1990, MethodsEnzymol, 185, 60-89).

Рис. 1. Обшая схема создания экспрессирующих векторов для суперпродукции белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa.

Были подобраны оптимальные условия экспрессии генов hfq E. coli и P. aeruginosa в полученных штаммах-суперпродуцентах. Клетки выращивали на богатой среде до оптической плотности ODsgo^S-O-SS о.е./мл. Экспрессию генов индуцировали добавлением изопропил-Р-О-тиогалактозида (ИПТГ) в растущие культуры до конечной концентрации 0.1 мМ, после чего клетки росли еще 3 часа при

37°С с качанием. Эффективность экспрессии проверяли методом SDS-электрофореза (рис. 2).

Для получения белков Hq £ coli и P. aeruginosa, содержащих атомы Se, клетки штамма Е. coli B834, ауксотрофного по метионину, были трансформированы полученными плазмидами pEcoHfq и pPaeHfq. Далее клетки выращивались на синтетической среде с добавлением селенометионина (SeMet). Суперпродукция белка SeMet-Hfq P. aeruginosa также проводилась в присутствии плазмиды pUBS520, как и в

случае суперпродукции нативного белка Hfq P. aeruginosa. Индукция синтеза суперподуцируемых белков проводилась добавлением ИПТГ в растущие культуры при оптическом поглощении 0.4-0.45 о.е/мл до конечной концентрации 0.1 мМ.

Рис. 2. Электрофореграмма лизатов клеток полученных суперпродуцентов (SDS-naar). 1 - клетки до индукции; 2 - индукция синтеза белка Hfq E. coli после добавления ИПТГ; 3 - индукция синтеза Hfq P. aeruginosa после добавления ИПТГ; М - маркеры молекулярных масс, кДа.

Схема выделения белков Hfq E. coli и P. aeruginosa из штаммов-суперпродуцентов включает в себя несколько основных этапов: разрушение клеток и удаление дебриса, прогрев клеточного лизата и удаление термолабильных белков, хроматографическое разделение белков (рис. За). Первые стадии очистки белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa (удаление мембранной фракции и тепловая обработка полученного экстракта) позволили получить препараты с чистотой до 85% по данным SDS-электрофореза (рис. 3б, 3в). Температуру тепловой обработки подбирали экспериментальным путем, прогревая клеточный экстракт при температурах 40-100°С с шагом 5°С и оценивая степень очистки белков методом SDS-электрофореза. При прогревании препаратов при 80°С в течение 15 мин большинство белков £. coli денатурирует и образует нерастворимый осадок, тогда как практически весь белок Hfq остается в растворе. Стадия прогрева не меняет активность белков Hfq £. coli и P. aeruginosa, что было показано в представленной работе при исследовании РНК-связывающих свойств данных белков, а также в экспериментах по тоэпринту, проведенных нашими австрийскими коллегами.

Биомасса суперпродуцента белка Hfq

iPaipjiueiiHC >лытшв>коч. нилчоскорочное иентриф\ гирование

Клеточный лизат SJtl

Температурная обработка, ни jracKopocTHoe центриф) гирование

Супернатант после прогрева

^ Хромата рафия на But>l-Tovopearl

Объединенные фракции, содержащие Hfq

^ Диализ концентрирование

Hfq

а в

Рис. 3. а - Общая схема выделения белков Hfq из биомассы суперпродуцентов. 6 - Электрофореграмма (SDS-пааг) клеточных фракций на разных стадиях очистки белка Hfq P. aeruginosa, в - Электрофореграмма (SDS-пааг) клеточных фракций на разных стадиях очистки белка Hfq Е. coli. М - маркеры молекулярных масс, кДа; 1 -клеточный лизат до индукции ИПТГ; 2 - клеточный лизат после индукции ИПТГ; 3 -клеточный дебрис; 4 - супернатант после осаждения дебриса; 5 - осадок после тепловой обработки; 6 - супернатант после тепловой обработки.

Самой сложной задачей оказалось удаление РНК из препаратов белков Hfq. Проведение гидрофобной хроматографии на смоле бутил-Тоуореаг1 в градиенте концентраций (NH^SOi/NaCl (1.7/1.5М- 0/0 М) позволило полностью очистить исследуемые белки от РНК. Белки Hfq Е coli и P. aeruginosa прочно связывались с носителем и элюировались при концентрациях (NH^SOi/NaCl 0.4/0.35 М, тогда как РНК не связывалась с носителем и выходила при нанесении образца и промывке колонки исходным буфером. Отсутствие РНК во фракциях

Рис. 4. Электрофореграмма (SDS-пааг) выделенных по описанной методике белков Hfq Е coli (1) и P. aeruginosa (2)

контролировали по спектру поглощения (максимум поглощения в ультрафиолетовой области наблюдался при длине волны 274 нм). В результате были получены растворимые препараты белков Hq E. coli и P. aeruginosa, свободные от РНК, с чистотой 95% по данным SDS-электрофореза (рис.4). Наиболее чистые фракции объединяли, концентрировали на концентраторах с отсечкой 30 кДа до 20-60 мг/мл и переводили диализом в 10 мМ Трис-HCl, рН 8.0,200 мМ NaCl. Разработанная методика позволяет получать 10-14 мг белка Hiq E. coli и 7-10 мг белка Hiq P. aeruginosa из 1 г биомассы штаммов-суперпродуцентов.

Несмотря на высокую чистоту выделенных белков, для получения кристаллизуемых препаратов было необходимо проведение еще одной стадии очистки для каждого из исследуемых белков. В случае белка Hq P. aeruginosa было необходимо проведение ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе, в результате которой чистота белка повышалась до 98%. В случае очистки белка Hq Е. coli вместе с препаратом выделялся запасающий железо белок ферритин, мРНК которого, как известно, является одной из мишеней действия белка Hfq в комплексе с регуляторной RyhB РНК. Таким образом, увеличение синтеза белка Hq вызывало увеличение синтеза ферритина в клетках штамма-суперпродуцента. Примесь ферритина в препарате белка Hq, составляющая 0.5-1%, довольно сильно мешала экспериментам по кристаллизации. Полностью удалить ферритин из препарата белка Hfq E. coli удалось после проведения колоночной хроматографии на хелатирующей сефарозе, заряженной ионами Zn2*.

Проверка гомогенности полученных препаратов белков Hfq E. coli и P. aeruginosa

Гомогенность препарата является необходимым условием для начала экспериментов по кристаллизации. Присутствие белков, нуклеиновых кислот или существование исследуемого образца в виде смеси нескольких конформаций может значительно ухудшить его способность кристаллизоваться. Поэтому прежде, чем приступить к поиску условий кристаллизации, необходимо проверить гомогенность выделенных белков и добиться максимальной их очистки.

Гомогенность полученных рекомбинантных белков Hfq E. coli и P. aeruginosa проверяли методами ультрацентрифугирования в шлирен-системе и гель-фильтрации в системе ЖХВД.

Методом ультрацентрифугирования в шлирен-системе были определены коэффициенты седиментации белков Hfq E. coli и P. aeruginosa при 20°С, которые

составили 4 1 8 и 3 5 8 соответственно, и было показано, что полученные препараты являются достаточно гомогенными и пригодными для кристаллизации (рис. 5)

Белок Hfq E coh был также проанализирован гель-фильтрационной хроматографией на колонке Superóse-12B в системе ЖХВД с маркерами молекулярного веса пактальбумином (142 кДа, что примерно соответствует молекулярной массе мономера Hfq Е coh - 112 кДа) и бычьим сывороточным альбумином (66 7 кДа, что соответствует молекулярной массе гексамерного комплекса Hfq E coli -67 кДа) При совмещении хроматограмм (рис 6) можно видеть четкое соответствие пика Hfq E coli пику бычьего сывороточного альбумина, что подтверждает существование данного белка в растворе в гексамерной форме

Из данных ультрацентрифугирования в шлирен-системе и гель-фильтрации в системе ЖХВД с маркерами молекулярного веса можно сделать вывод, что в растворе в свободном от РНК состоянии полученные рекомбинантные белки Hfq E coli и Р aerugmosa существуют в виде достаточно гомогенных гексамерных комплексов

Рис. 6. Хроматограммы белка Hfq Е coli (вверху, обозначен EcoHfq) и маркеров молекулярного веса - бычьего сывороточного альбумина и а-лактальбумина (внизу)

Получение регуляторных DsrA, RprA, RyhB и OxyS РНК E. coli

Для получения регуляторных DsiA, RpiA, RyhB и OxyS РНК Е. coli методом транскрипции in vitro в препаративных количествах были созданы конструкции на основе векторов pUC18. Данные векторы были использованы, поскольку они не содержат собственных Т7 промоторов. Т7 промоторы были клонированы вместе с генами регуляторных РНК непосредственно перед кодирующими последовательностями, что позволило при синтезе избежать добавления дополнительных нуклеотидов на 5'-концы РНК. Кроме того, гены всех РНК были сходным образом изменены для увеличения выхода в реакциях транскрипции in vitro: на 5'-конец каждой РНК были добавлены несколько остатков G, а З'-концы генов содержали сайты рестрикции Smal для линеаризации матричной ДНК. Ранее нами было обнаружено, что при линеаризации матричной ДНК с образованием тупых концов (с использованием рестриктазы Smal) транскрипция проходит намного эффективнее, чем при линеаризации матричной ДНК с образованием липких концов (например, с использованием рестриктазы Pst I).

yHindll] \T7pro \ rna у

* \Sma I

Ы PUC18 I

ч. d

Рис. 7. Схема получения конструкций для транскрипции in vitro некоторых малых регуляторных РНК.

Модифицированные гены регуляторных RpiA и RyhB РНК Е. coli были амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК Е. coli штамма DH5a. Модифицированные гены регуляторных DsiA и OxyS РНК Е. coli были амплифицированы без использования хромосомной ДНК в качестве матрицы. Небольшая величина генов малых РНК позволила нам сконструировать частично комплементарные друг другу

A L

W

(I u ( с

11 9 « GCGAS-

с ^A

с о Е'-д

CCAAUAttß Lt<

А

V ,о 4cL

Л а

оА

р

Рис. 8. Вторичные структуры модифицированных малых регуляторных OxyS (a), RprA (б), DsrA (в) и RyhB (г) РНК сГД (построены с использованием программы «RNAstructure», (tuJtA°A Mathews el al., 1998, American Chem Soc Symp. Series 682, ch. 15.246-257). г

праймеры, использованные в ПЦР. Продукты ПЦР были клонированы в векторы pUC18, полученными конструкциями были трансформированы клетки Е coli Схема клонирования генов некоторых малых регуляторных РНК представлена на рис. 7.

Для синтеза немеченой РНК выделяли плазмидные ДНК, очищали их в градиенте CsCl, линеаризовали с помощью рестриктазы Smal и проводили Т7 транскрипцию in vitro с использованием Т7 РНК-полимеразы. Для получения высокомеченных проводили транскрипцию в присутствии

убирали матричную ДНК добавлением ДНКазы I и далее очищали транскрипты с помощью специальных колонок фирмы "Roche". Выход реакции транскрипции и чистоту препаратов контролировали методом ПААГ-электрофореза в присутствии 8 М мочевины. Полученные меченые РНК использовали для исследования их комплексов с белками Hfq E. coli и P. aeruginosa методами гель-шифта и связывания на нитроцеллюлозных фильтрах. Вторичные структуры исследуемых малых регуляторных РНК представлены на рис 8.

Исследование РНК-связывающих свойств белков Hfq E. coli и P. aeruginosa

Проверка стабильности комплексов Hfq E. coli и P. aeruginosa с малыми ретулягорными РНК проводилась методом гель-шифта в жестких условиях. После образования комплексов к образцам добавляли мочевину до конечной концентрации 6 М и прогревали их на кипящей водяной бане в течение 3-5 мин. Затем полученные образцы наносили на полиакриламидный гель, содержащий 8 М мочевину, и проводили

электрофорез. Было показано, что белки Hfq Е. coli и P. aeruginosa прочно связываются с регуляторными DsiA, RpA и RyhB РНК Е. coli in vitro (рис. 9). Кроме того, результаты данного эксперимента говорят о высокой стабильности структуры РНК-связывающих участков белков Hfq Е. mli и P. aeruginosa и об отсутствии в полученных белковых препаратах РНКазной активности.

1 23456789

Рис. 9. Анализ стабильности комплексов Hfq с малыми регуляторными РНК методом гель-шифта в 15% пааг (19:1) в присутствии 8 М мочевины. 1 - DsrA РНК; 2 - комплекс DsrA с Hfq Е. coli; 3 - комплекс DsrA с Hfq Р. aeruginosa; 4 - RprA РНК; 5 - комплекс RprA с Hfq £. coli; 6 - комплекс RprA с Hfq P. aeruginosa; 7 - RyhB РНК; 8 - комплекс RyhB с Hfq £ coli; 9 - комплекс RyhB с Hfq P. aeruginosa.

Кажущиеся константы диссоциации комплексов белка Hfq £. coli с регуляторными DsiA, RpiA и RyhB РНК Е. coli измеряли с использованием метода связывания на нитроцеллюлозных фильтрах. Эксперименты проводились при 100 и 350 мМ КС1, в обоих случаях в качестве отрицательного контроля использовали L1 -связывающий фрагмент 23S pPHK Methanococcus jannaschii (конструкция для транскрипции in vitro была любезно предоставлена д-ром В. Пиндлом). Были получены два набора кривых связывания белка Hfq Е. coli с регуляторными РНК (рис. 10).

При низкой концентрации моновалентных ионов (100 мМ КС1) константы диссоциации исследуемых комплексов составляют М в случае RpiA-Hfq и

RyhB-Hfq комплексов и ~2,10"8 М в случае DsiA-Hfq комплекса. При повышении концентрации КС1 до 350 мМ константа диссоциации комплекса DsiA-Hfq не изменяется, тогда как константы диссоциации RpiA-Hfq и RyhB-Hfq комплексов увеличиваются на два порядка и составляют

Характер связывания белка Hfq с взятым в качестве отрицательного контроля фрагментом архейной 23S рРНК оказался весьма интересным и неожиданным.

концентрация Hfq, М DsrA -тк-RprA -»-RyhB -+-23S rRNA

10"12 Ю-" КГ10 10-9 104 10-7 10-4 10"5

концентрация Hfq, M -«-DsrA -±-RprA -»-RyhB -+-23S rRNA

Рис. 10. Кривые связывания белка Hq Е. coli на нигроцеллюлозньк фильтрах с различными регуляторными РНК, меченными [згР], при концентрации KCl 100 мМ (верхняя диаграмма) и 350 мМ (нижняя диаграмма).

Значение константы диссоциации данного комплекса (-2-10'8М) сравнимо со значением константы диссоциации комплексов, образуемых белком Hfq и малыми регуляторными РНК, и так же мало зависит от ионной силы раствора, как и константа диссоциации DsiA-Hfq комплекса. Возможным объяснением данного факта можно считать участие эукариотических гомологов белка Hfq в созревании рРНК в ядре. Таким образом, можно предположить специфическое связывание белка Hfq с рибосомной РНК, что должно быть проверено в следующей серии экспериментов с использованием другого фрагмента РНК в качестве отрицательного контроля.

Кристаллизация белка Hfq P. aeruginosa.

Начальные эксперименты по поиску условий кристаллизации белка Hfq P. aerugmosa проводили при 4°С и 22°С методом диффузии паров в висящей капле с использованием коммерческих наборов Crystal Screen, Crystal Screen II и Natrix (Hampton Research). Было исследовано влияние различных солей, органических осадителей и значений рН на образование кристаллов в каплях. В первых экспериментах концентрация белка составляла 3-5 мг/мл. При использовании в качестве осадителей совместно 1 М сульфата лития и 0.6-0.8 М сульфата аммония в 100 мМ цитрате натрия, рН 5.6, наблюдалось появление кристаллов в виде тонких игл. Кристаллы выпадали при температуре 22°С в течение 1-2 недель. В дальнейшем условия роста кристаллов были оптимизированы совместно с Е. А. Столбоушкиной. Решающим фактором для появления кристаллов оказалось применение дивалентных катионов в качестве добавок. Использование в качестве осадителя 1.6 М сульфата аммония в буфере MES-KOH, рН 6.5, при 22°С, повышение концентрации белка до 25-30 мг/мл и добавление в капли CdSOi и о 3-5 мМ значительно

стимулировало рост кристаллов. Также белок Hfq P. aeruginosa был закристаллизован при использовании в качестве осадителя полиэтиленгликоля (ПЭГ). При добавлении в капли CdSO4 до концентрации 3-5 мМ кристаллы появлялись в течение 2-3 дней и достигали размеров 1000 мкм в длину и 70 мкм в диаметре (рис. 11). Полученные в этих условиях кристаллы были использованы для сбора дифракционных данных.

Кроме кристаллов нативного белка Hfq P. aeruginosa в тех же условиях были получены кристаллы, содержащие атомы Se (при кристаллизации препарата SeMet-Hfq P. aerugmosa). Было обнаружено, что замена остатков метионина на остатки селенометионина значительно снижает растворимость белка в воде и увеличивает его гидрофобность. Поэтому при оптимизации условий кристаллизации

данного белка его концентрация в каплях была снижена в три раза по сравнению с нативным препаратом (7-10 мг/мл).

Рис. 11. Фотография кристалла белка Hfq Р aeruginosa.

Для сбора кристаллографических данных в криоусловиях были проверены несколько широко используемых криопротектантов и были подобраны условия для замораживания кристаллов. Было обнаружено, что кристаллы белка Hq P aerugmosa мгновенно портятся в растворе глицерина любой концентрации В растворах МПД и низкомолекулярных ПЭГов (ПЭГшили ПЭГбоо) внешний вид кристаллов оставался неизменным, однако резко ухудшались их кристаллографические свойства (увеличивались предел разрешения и мозаичность кристаллов). Первый подходящий для замораживания кристаллов Hq раствор содержал 12 М (NH^SOi в 50 мМ Na-цитратном буфере, рН 5.6, и 15% этиленгликоль в качестве криопротектанта. Кристаллы петлей переносили в данный раствор не более, чем на 30 сек, и затем замораживали в струе жидкого азота. При выдерживании кристаллов в данном криорастворе в течение большего времени их кристаллографические свойства значительно ухудшались, а через 5-10 мин кристаллы начиналии растворяться. При оптимизации условий замораживания полученных кристаллов был найден другой криораствор, содержащий 1 М (NH^SO« в 50 мМ Na-цитратном буфере, рН 5.6, и 30% w/v глюкозу в качестве криопротектанта. Кристаллы петлей переносили в данный раствор и оставляли в нем на 3 минуты. При использовании метода мгновенного вымачивания ("flash soaking"), как в случае вымачивания в 15% растворе этиленгликоля, на рентгенограммах появлялись так называемые "водяные кольца", что

может объясняться заметно большей вязкостью данного криораствора и более медленным его проникновением внутрь кристаллов.

Рис. 12. Молекулярная модель пространственной структуры гексамера белка Hq P. aeruginosa.

Предварительное тестирование кристаллов проводили на генераторе с вращающимся анодом (Институт белка РАН, Пущино), используя детектор Image Plate MAR345. Наборы дифракционных данных с кристаллов белка Hq P. aeruginosa при 100°К были собраны на генераторе с вращающимся анодом (Институт белка РАН, Пущино) и на синхротронах DESY (Гамбург, Германия) и Spring-8 (Харима, Япония). Кристаллы принадлежат к пространственной группе P212121, параметры ячейки: в = 72.7 А, ¿> = 61.5 А, с= 108.5 А. С использованием в качестве стартовой модели димера N-концевого фрагмента белка Hq E. coli (Sauter et al, 2003, Nucl. Acids Res., 31, 4091-4098) методом молекулярного замещения в группе С. В. Никонова получена карта электронной плотности и определена структура белка Hq P. aeruginosa с пределом разрешения 1.6 А (рис. 12).

Выводы

1. Клонированы гены белков HfqEscherichia coli и Pseudomonas aeruginosa, получены суперпродуценты данных белков, и разработана методика их выделения.

2. Установлено, что в растворе при 20°С данные белки существуют в виде гексамеров с константами седиментации 4.1 S для белка Hq Е. coli и 3.5 S для белка Hq P. aeruginosa.

3. Клонированы гены регуляторных DsrA, RprA, RyhB и OxyS РНК Е. coli, исследовано связывание некоторых РНК с белком Hq, найдены условия для получения стабильных комплексов этих РНК с белками Hq E. coli и P. aeruginosa.

4. Получены кристаллы белка Hq P. aeruginosa, и собраны дифракционные данные с этих кристаллов, позволившие построить карту электронной плотности и пространственную модель этого белка с разрешением 1.6 А.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. I. M. Vassilieva, A. D. Nikulin, U. Blaesi, I. Moll, and M. B. Gaiber. Crystallization of Hfq protein - a bacterial gene expression regulator (2003). Acta Cryst. D59,1061-1063.

2. Ю. M. Васильева, М. Б. Гарбер. Регуляторная роль белка Hq в жизнедеятельности бактериальных клеток (Обзор) (2002). Молекулярная биология (Москва), т. 36, 970-977.

3. Ю. М. Васильева, М. В. Рузанов, Н. В. Зелинская, И. Молль, У. Блези, М. Б. Гарбер. Клонирование гена hfq Escherichia coli, выделение и кристаллизация белка Hq -бактериального регулятора экспрессии генов (2002). Биохимия (Москва), т. 67, 1566-1571.

4. XVI зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". 9-12.02.2004. Москва, Россия. Столбоушкина Е. А., Васильева Ю. М.. Никулин А. Д., Гарбер М. Б. "Регулятор экспрессии генов - бактериальный белок Hq из Pseudomonas aeruginosa: кристаллизация и получение комплексов Hq с малыми регуляторными РНК", с. 23.

5. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. 25-27.09.2003. Kyiv, Ukraine. Stolboushkina E. A., Vassilieva J. M.. Garber M. B. "Crystallization ofHqprotein fromPseudomonas aeruginosa", p. 217.

6. 7-я Конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". 14-18.04.2003. г. Пущино, Россия. Васильева Ю. М.. Никулин А. Д., Гарбер М. Б. "Кристаллизация и предварительные структурные исследования белка Hfq и его комплексов с РЫК", с. 314.

7. III Съезд Российского биохимического общества. 26.06-1.072002. г. Санкт-Петербург, Россия. Васильева Ю. М.. Фоменкова Н. П., Габдулхаков А. Г., Моль И., Блези У., Гарбер М. Б. "Кристаллизация и предварительные структурные исследования бактериальных регуляторов экспрессии, генов - белков Hfq Escherichia colm Pseudomonas aeruginosa ", с. 5.

8. International Conference in Honour of Alexander Spirin "Protein Synthesis". 27.08-1.09.2001. Pushchino, Russia. Vassilieva I. M.. Rouzanov M. V., Zelinskaya N. V., Moll I., Blasi U., and Garber M. B. "Purification and characterization ofHfq protein from Escherichia coli - a global regulator ofgene expression", p. 90.

9. 6-я Конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". 20-24.05.2002. г. Пущино, Россия. Васильева Ю. М.. Габдулхаков А. Г., Блези У., Гарбер М. Б. "Кристаллизация и предварительные структурные исследования бактериальных регуляторов экспрессии генов - белков Hfq Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa", с. 223.

10.5-я Конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". 16-20.04.2001. г. Пущино, Россия. Васильева Ю. М.. Рузанов М. В., Зелинская Н. В., Блези У., Гарбер М. Б.. "Клонирование гена, выделение и характеризация регулятора экспрессии генов, белка Hfq Escherichia coli", с.11 .

Принято к исполнению 17/03/2004 Исполнено 17/03/2004

Заказ № 83 Тираж 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www autoreferat ru

Р-5273

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васильева, Юлия Михайловна

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы. Регуляторная роль белка Hfq в жизнедеятельности бактериальных клеток

1.1. Образование комплексов белка Hfq с некоторыми мРНК как фактор регуляции трансляции

1.2. Участие белка Hfq в регуляции трансляции rpoS мРНК малыми нетранслируемыми РНК£. coli

1.3. Hfq - белок, неспецифически связывающийся с РНК

1.4. Роль Hfq в метаболизме поли(А)

1.5. Участие Hfq в формировании бактериального нуклеоида

1.6. Белок Hfq - Sm-подобный белок бактерий

1.7. Пространственные структуры белка Hfq и его гомологов 25 Заключение

2. Материалы

2.1. Химические реактивы и ферменты

2.2. Растворы

2.3. Питательные среды

2.4. Бактериальные штаммы

2.5. Плазмиды

3. Методы

3.1. Методы генной инженерии

3.1.1. Выделение хромосомной ДНК Е. coli

3.1.2. Выделение плазмидной ДНК Е. coli

3.1.3. Очистка плазмидной ДНК равновесным центрифугированием в градиенте CsCl

3.1.4. Получение компетентных клеток Е. coli

3.1.5. Трансформация компетентных клеток плазмидной

3.1.6. Получение штамма-суперпродуцента белка Hfq

Е. coli

3.1.7. Получение штамма-суперпродуцента белка Hfq

P. aeruginosa

3.1.8. Получение штаммов, продуцирующих селенометиониновые производные белков EcoHfq и PaeHfq

3.1.9. Получение конструкций для транскрипции in vitro

OxyS, RprA, RyhB и DsrA РНК

3.2. Методы работы с белками

3.2.1. Выделение и очистка рекомбинантного белка EcoHfq

3.2.2. Выделение и очистка рекомбинантного белка PaeHfq

3.2.3. Гель-электрофорез белков в ПААГ в присутствии

3.3. Анализ гомогенности и оценка молекулярных весов полученных препаратов EcoHfq и PaeHfq

3.3.1. Проведение гель-фильтрационной хроматографии препарата белка EcoHfq

3.3.2. Проведение аналитического ультрацентрифугирования в шлирен-системе препаратов белков EcoHfq и PaeHfq

3.4. Методы работы с РНК и РНК-белковыми комплексами

3.4.1. Т7 транскрипция in vitro OxyS, DsrA, RprA и RyhB

3.4.2. Гель-электрофорез РНК в ПААГ в присутствии 8 М мочевины

3.4.3. Получение и очистка равномерно Р-меченных

DsrA, RprA и RyhB РНК

3.4.4. Определение кажущихся констант диссоциации РНК-белковых комплексов

3.4.5. Метод гель-шифта

3.5. Кристаллизация белка PaeHfq

3.6. Сбор дифракционных данных 53 4. Результаты и их обсуждение

4.1. Получение штаммов-суперпродуцентов белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa

4.2. Выделение гомогенных растворимых препаратов белков EcoHfq и PaeHfq из штаммов-суперпродуцентов

4.3. Проверка гомогенности полученных белковых препаратов

4.4. Получение регуляторных DsrA, RprA, RyhB и OxyS РНК

Е. coli

4.5. Исследование РНК-связывающих свойств белков Hfq

Е. coli и P. aeruginosa

4.6. Кристаллизация белка Hfq P. aeruginosa

4.7. Сбор дифракционных данных 70 Выводы 72 Список цитируемой литературы

Список сокращений бис-трис - (бис-(2-гидроксиэтил)-иминотрис-(гидроксиметил)-метан) БСА - бычий сывороточный альбумин ДМСО - диметилсульфоксид ед. - единица

ПААГ - полиакриламидный гель ПЭГ - полиэтиленгликоль мяРНК - малая ядерная РЖ

Трис-НС1 - трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорид ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота EcoHfq - белок Hfq Е. coli

HEPES - Ы-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы'-2-этансульфоновая кислота

MES - (2-[М-морфолино]этансульфоновая кислота)

MW - молекулярный вес

PaeHfq - белок Hfq P. aeruginosa

PMSF - фосфометилсульфонилфлуорид

SDS - до деци л сульфат натрия

SeMet - селенометионин

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура и РНК-связывающие свойства бактериального регулятора экспрессии генов-белка Hfq"

Изучение регуляции экспрессии генов является одной из наиболее важных задач молекулярной биологии. Осуществление контроля экспрессии генов происходит как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции и представляет собой достаточно сложную систему взаимодействий многих молекул. Для детального понимания механизмов этого процесса необходимо знание структурной организации различных его компонентов.

Белок Hfq является одним из ключевых регуляторов экспрессии бактериальных генов. Он контролирует трансляцию многих клеточных мРНК. Hfq взаимодействует с данными мРНК и меняет их вторичную структуру, а также связывается с различными нетранслируемыми малыми регуляторными РНК. Механизм взаимодействия белка Hfq с РНК пока ещё не известен. Данный белок является высококонсервативным среди бактерий, его гомологи найдены также у архей и эукариот. На сегодняшний день определены пространственные структуры нескольких эукариотических и архейных гомологов Hfq, а также недавно решены структуры двух бактериальных белков Hfq. Данная диссертация посвящена разработке методов выделения белков Hfq бактерий Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa, изучению их РНК-связывающих свойств, а также кристаллизации белка Hfq для структурных исследований.

Полученные штаммы-суперпродуценты белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa используются для препаративного выделения данных белков. Ауксотрофные по метионину штаммы-суперпродуценты белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa используются для препаративного выделения тяжелоатомных производных данных белков, у которых атомы серы в метиониновых остатках заменены атомами селена. Разработанные для данных белков методики выделения из биомассы полученных штаммов позволяют быстро получать высокоочищенные препараты нативных и модифицированных белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa в больших количествах.

Полученные специальные конструкции с клонированными под контроль Т7-промоторов измененными генами регуляторных OxyS, DsrA, RprA и RyhB РНК Е. coli позволяют синтезировать in vitro данные РНК в препаративных количествах с минимальными затратами ресурсов. Получены комплексы белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa с регуляторными DsrA, RprA и RyhB РНК. Исследована стабильность данных комплексов, и измерены константы их диссоциации в разных солевых условиях.

Проведен поиск условий кристаллизации и получены кристаллы Hfq P. aeruginosa, получены тяжелоатомные производные кристаллов данного белка. Нативные кристаллы и их тяжелоатомные производные использованы для сбора кристаллографических данных и определения пространственной структуры белка Hfq P. aeruginosa с разрешением 1.6 А.

Полученные штаммы-суперпродуценты, разработанные методики выделений и выделенные нами препараты белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa, а также конструкция для транскрипции in vitro малой регуляторной OxyS РЬПС, связывающейся с белком Hfq, используются для функциональных исследований в Институте молекулярной генетики (Вена, Австрия).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Васильева, Юлия Михайловна

Выводы

1. Клонированы гены белков Hfq Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa, получены суперпродуценты данных белков, и разработана методика их выделения.

2. Установлено, что в растворе при 20°С данные белки существуют в виде гексамеров с константами седиментации 4.1 S для белка Hfq Е. coli и 3.5 S для белка Hfq P. aeruginosa.

3. Клонированы гены регуляторных DsrA, RprA, RyhB и OxyS РНК Е. coli, исследовано связывание некоторых РНК с белком Hfq, найдены условия для получения стабильных комплексов этих РНК с белками Hfq Е. coli и P. aeruginosa.

4. Получены кристаллы белка Hfq P. aeruginosa, и собраны дифракционные данные с этих кристаллов, позволившие построить карту электронной плотности и пространственную модель этого белка с разрешением 1.6 А.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васильева, Юлия Михайловна, Пущино

1. Васильева Ю. М., Гарбер М. Б. 2002. Регуляторная роль белка Hfq в жизнедеятельности бактериальных клеток. Молекулярная биология (Москва), 36(6), 1-9.

2. Васильева Ю. М., Рузанов М. В., Зелинская Н. В., Моль И., Блези У., Гарбер М. Б. 2002. Клонирование гена hfq Escherichia coli, выделение и кристаллизация белка Hfq бактериального регулятора экспрессии генов. Биохимия (Москва), 67(11), 1566-1571.

3. Altuvia S., Zhang A., Argaman L., Tiwari A., Storz G. 1998. The Escherichia coli OxyS regulatory RNA represses fhlA translation by blocking ribosome binding. EMBO J., 17(20), 6069-6075.

4. Argaman L., Altuvia S. 2000. JhlA repression by OxyS RNA: kissing complex formation at two sites results in a stable antisense-target RNA complex. J. Mol. Biol., 300, 11011112.

5. Argaman L., Hershberg R., Vogel J., Bejerano G., Wagner E. G. H., Margalit H., Altuvia S. 2001. Novel small RNA-encoding genes in the intergenic regions of Escherichia coli. Curr. Biol., 11, 941-950.

6. Arluison V., Derremaux P., Allemand F., Folichon M., Hajnsdorf E., Regnier P. 2002. Structural modelling of the Sm-like protein Hfq from Escherichia coli. J. Mol. Biol., 320, 705-712.

7. Bachman M. A., Swanson M. S. 2001. RpoS co-operates with other factors to induce Legionella pneumophila virulence in the stationary phase. Mol. Microbiol., 40(5), 1201-1214.

8. Badger J. L., Miller V. L. 1995. Role of RpoS in survival of Yersinia enterocolitica to a variety of environmental stresses. J. Bacteriol., 177, 5370-5373.

9. Barrera I., Schuppli D., Sogo J. M., Weber H. 1993. Different mechanisms of recognition of bacteriophage QP plus and minus strand RNAs by QP replicase. J. Mol. Biol., 232,512-521.

10. Basrga S. J., Steitz J. A. 1993. The diverse world of small ribonucleoproteins. In The RNA World, R. F. Gesteland and J. F. Atkins, eds. (Cold Spring Harbor, Ney York: Cold Spring Harbor Laboratory Press), 359-381.

11. Boeck R., Lapeyre В., Brown C.E., Sachs A.B. 1998. Capped mRNA degradation intermediates accumulate in the yeast spb8-2 mutant. Mol. Cell. Biol., 18, 5062-5072.

12. Bouveret E., Rigaut G., Shevchenko A., Wilm M., Seraphin B. 2000. An Sm-like protein complex that participates in mRNA degradation. EMBOJ., 19,1661-1671.

13. Branlant C., Krol A., Ebel J.P., Lazar E., Haendler В., Jacob M. 1982. U2 RNA shares a structural domain with Ul, U4 and U5 RNAs. EMBOJ., 1, 1259-1265.

14. Brescia С. C., Mikulecky P. J., Feig A. L., Sledjeski D. D. 2003. Identification of the Hfq-binding site on the DsrA RNA: Hfq binds without altering DsrA secondary structure. RNA, 9, 33-43.

15. Brinkmann U., Mattes R. E., Buckel P. 1989. High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent of the avaliability of the dnaY gene product. Gene (Amst.), 85, 109-114.

16. Brown L., Elliott T. 1996. Efficient translation of the RpoS sigma factor in Salmonella typhimurium requires host factor I, an RNA-binding protein encoded by the hfq gene. J. Bacteriol, 178(13), 3763-3770.

17. Brown L., Elliott T. 1997. Mutations that increase expression of the rpoS gene and decrease its dependence on hfq function in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol., 179, 656-662.

18. Burgess B. R., Richardson J. P. RNA passes through the hole of the protein hexamer in the complex with the Escherichia coli Rho factor. J. Biol. Chem., 276(6), 4182-41-89.

19. Cam K., Rome G., Krisch H.M., Bouche J.-P. 1996. RNase E processing of essential cell division genes mRNA in Escherichia coli. Nucl. Acids Res., 24(15), 3065-3070

20. Cao G. J., Sarkar N. 1992. Poly(A) RNA in Escherichia coli: nucleotide sequence at the junction of the Ipp transcript and the polyadenylate moiety. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 7546-7550.

21. Carpousis A. J., Vanzo N. F., Raynal L. C. 1999. mRNA degradation. A tale of poly(A) and multiprotein machines. Trends Genet., 15(1), 24-28.

22. Chen L.-H., Emory S. A., Bricker A. L., Bouvet P., Belasco J. G. 1991. Structure and function of a bacterial mRNA stabilizer: analysis of the 5' untranslated region of ompA mRNA. J. Bacteriol., 173(15), 4578-4586.

23. Chen Y.-J., Yu X., Egelman E. H. 2002. The hexameric ring structure of the Escherichia coli RuvB branch migration protein. J. Mol. Biol., 319,587-591.

24. Collins В. M., Harrop S. J., Kornfeld G. D., Dawes I. W., Curmi P. M., Mabbutt В. C. 2001. Crystal structure of a heptameric Sm-like protein complex from archaea: implications for the structure and evolution of snRNPs. J. Mol. Biol., 309(4), 915-923.

25. Cristofari G., Darlix J. L. 2002. The ubiquitous nature of RNA chaperone proteins. Prog. Nucl. Acids Res. Mol. Biol., 72,223-268.

26. Cunning C., Brown L., Elliott T. 1998. Promoter substitution and deletion analysis of upstream region required for rpoS translational regulation. J. Bacteriol., 180(17), 45644570.

27. Czeizel A., Hamula J. 1989. A hungarian study of Werdning-Hoffmann disease. J. Med. Genet., 26(12), 761-763.

28. Dahlberg J. E., Lund E. 1991. How does Ш * П make U6? Science, 254, 1462-1463.

29. Donahue W. F., Jarrell K. A. 2002. A BLAST from the past: ancient origin of human Sm proteins. Mol. Cell, 9, 7-8.

30. Doublie S. 1997. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzimol., 276, 523-530.

31. Dreufus M., Regnier P. 2002. The poly(A) tail of mRNAs: bodyguard in Eukaryotes, scavenger in Bacteria. Cell, 111, 611-613.

32. Edmonds М. 2002. A history of poly A sequences: from formation to factors of function. Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., 71, 285-389.

33. Fang F. C., Libby S. J., Buchmeier N. A., Loewen P. C., Switala J., Harwood J.,

34. GuineyD. G. 1992. The alternative sigma factor katF (rpoS) regulates Salmonella virulence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,11978-11982.

35. Feng Y., Cohen S. N. 2000. Unpaired terminal nucleotides and 5' monophosphorilation govern 3' polyadenilation by Escherichia coli poly(A) polymerase I. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(12), 6415-6420.

36. Feng Y., Huang H., Liao J., Cohen S.N. 2001. Escherichia coli poly(A)-binding proteins that interact with components of degradosomes or impede RNA decay mediated by polynucleotide phosphorylase and RNase E. J. Biol. Chem., 276(34), 31651-31656.

37. Fischer U., Liihrmann R. 1990. An essential signalling role for the ITI3G cap in the transport of U1 snRNP to the nucleus. Science, 249, 786-790.

38. Folichon M., Arluison V., Pellegrini O., Huntzinger E., Regnier F., Hajnsdorf E. 2003. The poly(A) binding protein Hfq protects RNA from RNase E and exoribonucleolytic degradation. Nucl. Acids Res., 31(24), 7302-7310.

39. Franze de Fernandez M. Т., Eoyang L., August J. T. 1968. Factor fraction required for the synthesis of bacteriophage Qp-RNA. Nature, 219, 588-590.

40. Franze de Fernandez M. Т., Hayward W. S., August J. T. 1972. Bacterial proteins required for replication of phage Qp ribonucleic acid. Purification and properties of host factor I, a ribonucleic acid-binding protein. J. Biol. Chem., 247, 824-831.

41. Friesen W. J., Dreyfuss G. 2000. Specific sequences of the Sm and Sm-like (Lsm) proteins mediate their interaction with the spinal muscular atrophy disease gene product (SMN). J. Biol. Chem., 275(34), 26370-26375.

42. Geissmann T. A., Touati D. 2004. Hfq, a new chaperoning role: binding to messenger RNA determinates access for small RNA regulator. EMBOJ., 23, 396-405.

43. Gerbi S. A., Lange Т. S. 2002. All small nuclear RNAs (snRNAs) of the U4/U6.U5. tri-snRNP localize to nucleoli; identification of the nucleolar localization element of U6 snRNA. Mol Biol. Cell, 13,3123-3137.

44. Gibson Т. H. 1984. Ph. D. Thesis, University of Cambridge.

45. Gottschalk A., Nuebauer G., Banroques J., Mann M., Liihrmann R., Fabrizio P. 1999. Identification by mass spectrometry and functional analysis of novel proteins of the yeast U4/U6U5. tri-snRNP. EMBOJ., 18(16), 4535-4548.

46. Hajnsdorf E., Regnier P. 2000. Host factor Hfq of Escherichia coli stimulates elongation ofpoly(A) tails by poly(A) polymerase I. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 97, 1501-1505.

47. Hales L. M., Shuman H. A. 1999. The Legionella pneumophila rpoS gene is required for growth within Acantamoeba castellanii. J. Bacteriol., 181, 887-893.

48. Hall Т. M. T. 2002. Poly(A) tail synthesis and regulation: recent structural insights. Curr. Opin. Struct. Biol., 12, 82-88.

49. Hamm J., Darzynkiewicy E., Tahara S., Mattaj I. W. 1990. The trimethylguanosine cap structure of U1 snRNA is a component of a bipartite nuclear signal. Cell, 62, 569-577.

50. Hatfield L., Beelman C. A., Stevens A., Parker R. 1996. Mutations in trans-acting factors affecting mRNA decapping in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol., 16, 5830-5838.

51. He W., Parker R. 2000. Functions of Lsm proteins in mRNA degradation and splicing. Curr. Opin. Cell Biol, 12(3), 346-350.

52. He W., Parker R. 2001. The yeast cytoplasmic Lsml/Patlp complex protects mRNA 3' termini from partial degradation. Genetics, 158(4), 1445-1455.

53. Hengge-Aronis R. 1993. Survival of hunger and stress: the role of RpoS in early stationary phase gene regulation in Escherichia coli. Cell, 72,165-168.

54. Hengge-Aronis R. 1996. Back to log phase: sigma S as a global regulator in the osmotic control of gene expression in Escherichia coli. Mol. Microbiol., 21, 887-893.

55. Hengge-Aronis R. 2002. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the sigma(S) (RpoS) subunit of RNA polymerase. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 66(3), 373-395.

56. Hermann H., Fabrizio P., Raker V. A., Foulaki K., Hornig H., Brahms H., Luhrmann R. 1995. snRNP Sm proteins share two evolutionary conserved sequence motifs which are involved in Sm protein-protein interactions. EMBOJ., 14, 2076-2088.

57. Hershberg R., Altuvia S., Margalit H. 2003. A survey of small RNA-encoding genes in Escherichia coli. Nucl. Acids Res., 31(7), 1813-1820.

58. Herschlag D. 1995. RNA chaperones and the RNA folding problem. J. Biol. Chem., 270(36), 20871-20874.

59. Herschlag D., Khosla M., Tsuchihashi Z., Karpel R. 1994. An RNA chaperone activity of non-specific RNA binding proteins in hammerhead ribozyme catalysis. EMBO J., 13(16), 2913-2924.

60. Ishihama A. 1999. Modulation of the nucleoid, the transcription apparatus, and the translation machinery in bacteria for stationary phase survival. Gen. Cells, 4, 135-143.

61. Jorgensen F., Bally M., Chapon-Herve V., Michel G., Lazdunski A., Williams P., Stewart G. S. A. B. 1999. RpoS-dependent stress tolerance in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology, 145, 835-844.

62. Kabsch W. 2001. Integration, scaling, space-group assignment and post refinement. XDS. In International Tables for Crystallography (eds. Rossmann, M.G. & Arnold, E.) F. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers.

63. Kajitani M., Ishihama A. 1991. Identification and sequence determination of the host factor gene for bacteriophage Qp. Nucl. Acids Res., 19,1063-1066.

64. Kajitani М., Kato A., Wada A., Inokuchi Y., Ishihama A. 1994. Regulation of the Escherichia coli hfq gene encoding the host factor for phage Qp. J. Bacteriol., 176(2), 531-534.

65. Kambach C., Walke S., Young R., Avis J. M., de la Fortelle E., Raker V. A., Luhrmann R., Li J., Nagai K. 1999. Crystal structures of two Sm protein complexes and their implications for the assembly of the spliceosomal snRNPs. Cell, 96, 375-387.

66. Kaminski P. A., Elmerich C. 1998. The control of Azorhizobium caulinodans nifA expression by oxygen, ammonia and by the HF-I-like protein, NrfA. Mol. Microbiol., 28(3), 603-613.

67. Karpel R. L., Miller N. S., Fresco J. R. 1982. Mechanistic studies of ribonucleic acid renaturation by a helix-destabilizing protein. Biochemistry, 21(9), 2102-2108.

68. Klauck E., Bohringer J., Hengge-Aronis R. 1997. The LysR-like regulator LeuO in Escherichia coli is involved in the translational regulation of rpoS by affecting the expression of the small regulatory DsrA-RNA. Mol. Microbiol., 25(3), 559-569.

69. Klein R. J., Misulovin Z., Eddy S. R. 2002. Noncoding RNA genes identified in AT-rich hyperthermophiles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(11), 7542-7547.

70. Kufel J., Allmang C., Verdone L., Beggs J. D., Tollervey D. 2002. Lsm proteins are required for normal processing of pre-tRNA and their efficient association with La-homologous protein Lhplp. Mol. Cell. Biol, 22(14), 5248-5256.

71. Laemmli U. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.С

72. Lange R., Hengge-Aronis R. 1994. The cellular concentration of the a subunit of RNA polymerase in Escherichia coli is controlled at the levels of transcription, translation, and protein stability. Genes Dev., 8,1600-1612.

73. Le Derout J., Folichon M., Briani F., Deho G., Regnier F., Hajnsdorf E. 2003. Hfq affects the length and the frequency of short oligo(A) tails at the 3' end of Escherichia coli rpsO mRNAs. Nucl. Acids Res., 31(14), 4017-4023.

74. Lease R. A., Belfort M. 2000-a. Riboregulation by DsrA RNA: trans-actions for global economy. Mol Microbiol., 38(4), 667-672.

75. Lease R. A., Belfort M. 2000-b. A trans-acting RNA as a control switch in Escherichia coli: DsrA modulates function by forming alternative structures. Proc. Nad. Acad. Sci. USA, 97, 9919-9924.

76. Lease R. A., Cusick M. E., Belfort M. 1998. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proc. Nad. Acad. Sci. USA, 95, 12456-12461.

77. Lerner M. R., Steitz J. A. 1979. Antibodies to small nuclear RNAs complexed with proteins are produced by patients with systemic lupus erythemathosus. Proc. Nad. Acad. Sci. USA, 76(11), 5495-5499.

78. Loewen P. C., Hengge-Aronis R. 1994. The role of the sigma factor os (KatF) in bacterial global regulation. Annu. Rev. Microbiol., 48, 53-80.

79. Lorsch J. R. 2002. RNA chaperones exist and DEAD box proteins get a life. Cell, 109, 797-800.

80. Majdalani N. Chen S., Murrow J., John K. St., Gottesman S. 2001. Regulation of RpoS by a novel small RNA: the characterization of RprA. Mol. Microbiol., 39(5), 1382-1394.

81. Majdalani N., Hernandez D., Gottesman S. 2002. Regulation and mode of action of the second small RNA activator of RpoS translation, RprA. Mol. Microbiol., 46(3), 813826.

82. Marmur J. 1961. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J. Mol. Biol., 3, 208-218.

83. Masse E., Gottesmann S. 2002. A small RNA regulates the expression of genes involved in iron metabolism in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(7), 4620-4625.

84. Masse E., Escorcia F. E., Gottesmann S. 2003. Coupled degradation of a small regulatory RNA and its mRNA targets in Escherichia coli. Genes Dev., 17(19), 23512355.

85. Masse E., Gottesmann S. 2003. Regulatory roles for small RNAs in bacteria. Curr. Opin. Microbiol., 6, 120-124.

86. Mattaj I. W. 1986. Cap trimethylation of U snRNA is cytoplasmic and dependent on U snRNP protein binding. Cell, 46, 905-911.х

87. Mattaj I. W., Tollervey D., Seraphin B. 1993. Small nuclear RNAs in messenger RNA and ribosomal RNA processing. FASEB J., 7,47-53.

88. Mattioli M., Reichlin M. 1971. Characterization of a soluble nuclear ribonucleoprotein antigen reactive with SLE sera. J. Immunol., 107(5), 1281-1290.

89. Mayer O., Waldsich C., Grossberger R., Schroder R. 2001. Folding of the td pre-RNA with the help of the RNA chaperone StpA. Biochem. Soc. Trans., 30(6), 1175-1180.

90. Mayes A. E., Verdone L., Legrain P., Beggs J. D. 1999. Characterization of Sm-like proteins in yeast and their association with U6 snRNA. EMBOJ., 18(15), 4321-4331.

91. McDowall K.J., Kaberdin V. R., Wu S.-W., Cohen S.N., Lin-Chao S. 1995. Site-specific RNase E cleavage of oligonucleotides and inhibition by stem-loops. Nature (London), 374(6519), 287-290.

92. Merrell D. S., Tischler A. D., Lee S. H., Camilli A. 2000. Vibrio cholerae requires rpoS for efficient intestinal colonization. Infect. Immunity., 68(12), 6691-6696.

93. Mohr S., Stryker J. M., Lambowitz A. M. 2002. A DEAD-box protein functions as an ATP-dependent RNA chaperone in group I intron splicing. Cell, 109, 769-779.

94. Moll I., Afonyushkin Т., Vytvytska O., Kaberdin V. R., Blasi U. 2003. Coincident Hfq binding and RNase E cleavage sites on mRNA and small regulatory RNAs. RNA, 9(11), 1308-1314.

95. Moll I., Leitsch D., Steinhauser Т., Blasi U. 2003. RNA chaperone activity of the SmГlike Hfq protein. EMBO Rep., 4(3), 284-289.

96. Moller Т., Franch Т., Hojrup P., Keene D. R., Bachinger H. P., Brennan R. G., Valentin-Hansen P. 2002a. Hfq: a bacterial Sm-like protein that mediates RNA-RNA interaction. Mol. Cell, 9, 23-30.

97. Moller Т., Franch Т., Udesen С., Gerdes К., Valentin-Hansen P. 2002b. Spot 42 RNA mediates discoordinate expression of the E. coli galactose operon. Genes Dev., 16, 1696-1706.

98. Mueller E. G. 2002. Chips off the old block. Nature Struct. Biol., 9(5), 320-322.

99. Muffler A., Fischer D., Hengge-Aronis R. 1996. The RNA-binding protein HF-I, known as a host factor for phage QP RNA replication, is essential for rpoS translation in Escherichia coli. Genes Dev., 10, 1143-1151.

100. Muhlrad D., Decker C. J., Parker R. 1994. Deadenylation of the unstable mRNA encoded by the yeast MFA2 gene leads to decapping followed by 5'>3' digestion of the transcript. Genes Dev., 8, 855-866.

101. Muhlrad D., Decker C. J., Parker R. 1995. Turnover mechanisms of the stable yeast PGK1 mRNA. Mol. Cell. Biol., 15, 2145-2156.

102. Mura C., Cascio D., Sawaya M. R., Eisenberg D. S. 2001. The crystal structure of a heptameric archaeal Sm protein: implications for the eukaryotic snRNP core. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10), 5532-5537.г

103. Mura C., Philips M., Kozhukhovsky A., Eisenberg D. 2003. Structure and assembly of an augmented Sm-like archaeal protein 14-mer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(8), 4539-4544.

104. Murzin A. G. 1993. OB (oligonucleotide/oligosaccharide binding)-fold common structural and functional solution for non-homologous sequences. EMBO J., 12, 861867.

105. Nagai К., Muto Y., Krummel D. А. P., Kambach С., Ignjatovic Т., Walke S., Kuglstatter A. 2001. Structure and assembly of the spliceosomal snRNPs. Biochem. Soc. Transactions, 29(2), 15-26.

106. Nogueira Т., Springer M. 2000. Post-transcriptional control by global regulators of gene expression in bacteria. Curr. Opin. Microbiol., 3,154-158.

107. O'Hara E. В., Chekanova J. A., Ingle C. A., Kushner Z. R., Peters E., Kushner S. R. 1995. Polyadenylylation helps regulate mRNA decay in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1807-1811.

108. Pannone В. K., Kim S. D., Noe D. A., Wolin S. L. 2001. Multiple functional interaction between components of the Lsm2-Lsm8 complex, U6 snRNA, and the yeast La protein. Genetics, 158(1), 187-196.

109. Pannone B.K., Wolin S.L. 2000. Sm-like proteins wring the neck of mRNA. Curr. Biol., 10, R478-R481.

110. Pannone В. K., Xue D., Wolin S. L. 1998. A role for the yeast La protein in U6 snRNP assembly: evidence that the La protein is a molecular chaperone for RNA polymerase IIIVtranscripts. EMBOJ., 17(24), 7442-7453.

111. Pellizzoni L., Kataoka N., Charroux В., Dreyfuss G. 1998. A novel function for SMN, the spinal muscular atrophy disease gene product, in pre-mRNA splicing. Cell, 95, 615624.

112. Pellizzoni L., Yong J., Dreyfuss G. 2002. Essential role for the SMN complex in the specificity of snRNP assembly. Science, 298, 1775-1779.

113. Plessel G., Liihrmann R., Kastner В. 1997. Electron microscopy of assembly intermediates of the snRNP core: morphological similarities between the RNA-free (E.F.G) protein heteromer and the intact snRNP core. J. Mol. Biol., 265, 87-94.

114. Pontius B. W., Berg P. 1992. Rapid assembly and disassembly of complementary DNA strands through an equilibrium intermediate state mediated by Al hnRNP protein. J. Biol. Chem., 267(20), 13815-13818.

115. Raker V. A., Hartmuth K., Kastner В., Liihrmann R. 1999. Spliceosomal U snRNP core assembly: Sm proteins assemble onto an Sm site RNA nonanucleotide in a specific and thermodynamically stable manner. Mol. Cell. Biol., 19, 6554-6565.

116. Repoila F., Majdalani N., Gottesman S. 2003. Small non-coding RNAs, co-ordinators of adaptation processes in Escherichia coli: the RpoS paradigm. Mol. Microbiol., 48(4), 855-861.

117. Repoila F., Gottesman S. 2001. Signal transduction cascade for regulation of RpoS: temperature regulation of DsrA. J. Bacteriol., 183(13), 4012-4023.

118. Repoila F., Gottesman S. 2003. Temperature sensing by the dsrA promoter. J. Bacteriol., 185(22), 6609-6614.

119. Rivas E., Klein R. J., Jones T. A., Eddy S. R. 2001. Computational identification of noncoding RNAs in is. coli by comparative genomics. Curr. Biol., 11, 1369-1373.

120. Robertson G. Т., Roop II R. M. 1999. The Brucella abortus host factor I (HF-I) protein contributes to stress resistance during stationary phase and is a major determinant of virulence in mice. Mol. Microbiol., 34(4), 690-700.

121. Rosenbaum V., Klahn Т., Lundberg U., Holmgren E., von Gabain A., Riesner D. 1993. Co-existing structures of an mRNA stability determinant. The 5' region of the Escherichia coli and Serratia marcescens ompA mRNA. J. Mol. Biol., 229(3), 656-670.

122. Ruiz N., Silhavy T. J. 2003. Constitutive activation of the Escherichia coli Pho regulon upregulates rpoS translation in an Hfq-dependent fashion. J. Bacterol., 185(20), 5984-5992.

123. Salgado-Garrido J., Bragado-Nilsson E., Kandels-Lewis S., Seraphin B. 1999. Sm and Sm-like protein assemble in two related complexes of deep evolutionary origin. EMBO J., 18(12), 3451-3462.

124. Sauter C., Basquin J., Suck D. 2003. Sm-like proteins in Eubacteria: the crystal structure of the Hfq protein from Escherichia coli. Nucl. Acids Res., 31(14), 4091-4098.

125. Schlax P. J., Worhunsky D.J. 2003. Translational repression mechanisms in prokaryotes. Mol. Microbiol., 48(5), 1157-1169.

126. Schumacher M. A., Pearson R. F., Moller Т., Valentin-Hansen P., Brennan R. G. 2002. Structures of the pleiotropic translational regulator Hfq and an Hfq-RNA complex: a bacterial Sm-like protein. EMBOJ., 21(13), 3546-3556.

127. Schuppli D., Miranda G., Tsui H.-C.T., Winkler M. E., Sogo J.M., Weber H. 1997. Altered 3'-terminal RNA structure in phage QP adapted to host factor-less Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10239-10242.

128. Schuppli D., Georgijevic J., Weber H. 2000. Synergism of mutations in bacteriophage QP RNA affecting host factor dependence of QP replicase. J. Mol. Biol, 295, 149-154.

129. Senear A. W., Steitz J. A. 1976. Site-specific interaction of Qbeta host factor and ribosomal protein SI with Qbeta and R17 bacteriophage RNAs. J. Biol Chem., 251(7), 1902-1912.

130. Seraphin В. 1995. Sm and Sm-like proteins belong to a large family: identification of proteins of the U 6 as well as the Ul, U2, U4 and U5 snRNPs. EMBOJ., 14,2089-2098.

131. Seto A. G., Zaug A. J., Sobel S. G., Wolin S. L., Cech T. R. 1999. Saccharomyces cerevisiae telomerase is an Sm small nuclear ribonucleoprotein particle. Nature, 401, 177-180.

132. Sledjeski D. D., Gottesman S. 1995. A small RNA act as antisilencer of the H-NS-silenced rcsA gene of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2003-2007.

133. Sledjeski D. D., Gottesman S. 1996. The small RNA, DsrA, is essential for the low temperature expression of RpoS during exponential growth in Escherichia coli. EMBO J., 15(15), 3993-4000.

134. Sledjeski D. D., Gupta A., Gottesman S. 1996. The small RNA, DsrA, is essential for the low temperature expression of RpoS during exponential growth in Escherichia coli. EMBOJ., 15(15), 3993-4000.

135. Sledjeski D. D., Whitman C., Zhang A. 2001. Hfq is necessary for regulation by the untranslated RNA DsrA. J. Bacteriol., 183(6), 1997-2005.

136. Small P., Blankenhorn D., Welty D., Zinser E., Slonczewski J. L. 1994. Acid and base resistance in Escherichia coli and Shigella flexneri: role of rpoS and growth pH. J. Bacteriol., 176, 1729-1737.

137. Sonnleitner E., Hagens S., Rosenau F., Wilhelm S., Habel A., Jager K.-E, Blasi U. 2003. Reduced virulence of a hfq mutant of Pseudomonas aeruginosa Ol. Microbial Pathogenesis, 35,217-228.

138. Sonnleitner E., Moll I., Blasi U. 2002. Functional replacement of the Escherichia coli hfq gene by the homologue of Pseudomonas aeruginosa. Microbiology, 148, 883-891.

139. Stark H., Dube P., Luhrmann R., Kastner B. 2001. Arrangement of RNA and proteins in the spliceosomal Ul small nuclear ribonucleoprotein particle. Nature, 409, 539-541.

140. Stevens S. W., Ryan D. E., Ge H. Y., Moore R. E., Young M. K., Lee T. D., Abelson J. 2002. Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP. Mol. Cell, 9, 31-44.

141. Su Q., Schuppli D., Tsui H.-C. Т., Winkler M. E., Weber H. 1997. Strongly reduced Qp replication, but normal phage MS2 replication in an Escherichia coli K12 mutant with inactivated Qp host factor (hfq) gene. Virology, 227, 211-214.

142. Suh S. J., Silo-Suh L., Woods D. E., Hassett D. J., West S.E., Ohman D. E. 1999. Effect of rpoS mutation on the stress response and expression of virulence factors in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol., 181, 3890-3897.

143. Sun X., Zhulin I., Wartell. 2002. Predicted structure and phyletic distribution of the RNA-binding protein Hfq. Nucl. Acids Res., 30(17), 3662-3671.

144. Takada A., Wachi M., Kaidow A., Takamura M., Nagai K. 1997. DNA binding properties of the hfq gene product of Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Com., 236, 576-579.

145. Takada A., Wachi M., Nagai K. 1999. Negative regulatory role of the Escherichia coli hfq gene in cell division. Biochem. Biophys. Res. Com., 266, 579-583.

146. Talukder A. A., Hiraga S., Ishihama A. 2000. Two types of localization of the DNA-binding proteins within the Escherichia coli nucleoid. Gen. Cells, 5, 613-626.

147. Talukder A. A., Ishihama A. 1999. Twelve species of the nucleoid-associated protein from Escherichia coli. J. Biol. Chem., 274, 33105-33113.

148. Talukder A. A., Iwata A., Nishimura A., Ueda S., Ishihama A. 1999. Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. J. Bacteriol., 181(20), 6361-6370.

149. Tarun S., He W., Mayes A. E., Lenneretz P., Beggs J. D., Parker R. 2000. Yeast Sm-like proteins function in mRNA decapping and decay. Nature, 404, 515-518.

150. Thompson J. D., Higgins D. G., Gibson T.J. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucl. Acids Res., 22, 46734680.

151. Thore S., Mayer C., Sauter C., Weeks S., Suck D. 2003. Crystal structures of the Pyrococcus abyssi Sm core and its complex with RNA. J. Biol. Chem., 278, 1239-1247.

152. Того I., Basquin J., Teo-Dreher H., Suck D. 2002. Archaeal Sm proteins from heptameric and hexameric complexes: crystal structures of the Sml and Sm2 proteins from the hyperthermophile Archaeoglobus fulgidis. J. Mol. Biol., 320, 129-142.

153. Того I., Thore S., Mayer C., Basquin J., Seraphin В., Suck D. 2001. RNA binding in an Sm core domain: X-ray structure and functional analysis of an archaeal Sm proteinVcomplex. EMBOJ., 20(9), 2293-2303.

154. Tsui H.-C.T., Feng G., Winkler M. E. 1997. Negative regulation of mutS and mutH repair gene expression by the Hfq and RpoS global regulators of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 179, 7476-7487.

155. Tsui Н.-С. Т., Leung Н.-С. Е., Winkler М. Е. 1994. Characterization of broadly pleiotropic phenotypes caused by an hfq insertion mutation in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol., 13, 35-49.

156. Tsui Н.-С. Т., Winkler M. E. 1994. Transcriptional patterns of the mutL-miaA superoperon of Escherichia coli K-12 suggest a model for posttranscriptional regulation. Biochimie, 16,1168-1177.

157. Ueno H., Yonesaki T. 2002. Role of Escherichia coli Hfq in late-gene silencing of bacteriophage T4 dmd mutant. Genes Genet. Syst., 11, 301-308.

158. Urlaub H., Raker V. A., Kostka S., Luhrmann R. 2001. Sm protein-Sm site RNA interactions within the inner ring of the spliceosomal snRNP core structure. EMBO J., 20, 187-196.

159. Vassilieva I., Nikulin A., Blasi U., Moll I., Garber M. B. 2003. Crystallization of Hfq protein — a bacterial gene expression regulator. Acta Cryst., D59, 1061-1063.

160. Vecerek В., Moll I., Afonyushkin Т., Kaberdin V., Blasi U. 2003. Interaction of the RNA chaperone Hfq with mRNAs: direct and indirect roles of Hfq in iron methabolism of Escherichia coli. Mol. Microbiol., 50(3),897-909.

161. Vidal V. P. I., Verdone L., Mayes A. E., Beggs J. D. 1999. Characterization of U6 snRNA-protein interactions. RNA, 5, 1470-1481.

162. Vivas E. I., Goodrich-Blair H. 2001. Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes. J. Bacteriol., 183(16), 4687-4693.

163. Vytvytska О., Moll I., Kaberdin V. R., von Gabain A., Blasi U. 2000. Hfq (HF-I) stimulates ompA mRNA decay by interfering with ribosome binding. Genes Dev., 14, 1109-1118.

164. Wachi M., Takada A., Nagai K. 1999. Overproduction of the outer-membrane proteins FepA and FhuE responsible for iron transport in Escherichia coli hfq::cat mutant. Biochem. Biophys. Res. Com., 264, 525-529.

165. Waldsich C., Grossberger R., Schroder R. 2002. RNA chaperone StpA loosens interactions of the tertiary structure in the td group I intron in vivo. Gems Dev., 16(17), 2300-2312.

166. Ward J. E., Lutkenhaus J. 1985. Overproduction of FtsZ induces minicell formation in Escherichia coli. Cell, 42, 941-949.

167. Wassarman К. M., Repoila F., Rosenow C., Storz G. 2001. Identification of novel small RNAs using comparative genomics and microarrays. Genes Dev., 15, 1637-1651.

168. Wassarman К. M., Zhang A., Storz G. 1999. Small RNAs in Escherichia coli. Trends Microbiol., 7(1), 37-45.

169. Webb C., Moreno M., Wilmes-Riesenberg M., Curtiss III R., Foster J. W. 1999. Effects of DksA and ClpP protease on sigma S production and virulence in Salmonella typhimurium. Mol. Microbiol., 34(1), 112-123.

170. Will C. L., Liihrmann R. 2001. Spliceosomal UsnRNP biogenesis, structure and function. Curr. Opin. Cell Biol., 13, 290-301.

171. Worhunsky D. J., Godek K., Litsch S., Schlax P. J. 2003. Interactions of the non-coding RNA DsrA and RpoS mRNA with the 30 S ribosomal subunit. J. Biol. Chem., 278(18), 15815-15824.

172. Yanisch-Perron С., Vieira J., Messing J. 1985. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, 33, 103-119.

173. Zhang A., Altuvia S., Tiwari A., Argaman L., Henhhe-Aronis R., Storz G. 1998. The OxyS regulatory RNA represses rpoS translation and binds the Hfq (HF-I) protein. EMBOJ., 17, 6061-6068.

174. Zhang A., Wassarman К. M., Ortega J., Steven A.C., Storz G. 2002. The Sm-like Hfq protein increases OxyS RNA interaction with target mRNAs. Mol. Cell, 9,11-22.

175. Zhang A., Wassarman К. M., Rosenow C., Tjaden В. C., Storz G., Gottesman S. 2003. Global analysis of small RNA and mRNA targets of Hfq. Mol. Microbiol., 50(4), 1111-1124.

176. Zieve G. W., Sauterer R. A. 1990. Cell biology of the snRNP particles. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 25, 1-46.