Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация регуляторной области гена уридинфосфорилазы E. coli и Salmonella typhimurium

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Домакова, Елена Владимировна, Москва

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

На правах рукописи

Домакова Елена Владимировна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ РЕГУЛЯТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА УРИДИНФОСФОРИЛАЗЫ ESCHERICHIA COLI И SALMONELLA TYPHIMURIUM

03.00.15- ГЕНЕТИКА

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Миронов A.C.

Москва 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ 4

2.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10 Глава 1. Общая характеристика транскрипционного

цикла прокариот 11

1.1. РНК-полимераза и структурные элементы промотора. 11

1.2. Модуляция активности промотора 15 Глава 2. Взаимодействие элементов негативного и позитивного контроля в регуляции экспрессии бактериальных оперонов 18

2.1.Феномен катаболитной репрессии ' 19

2.2. Генетический контроль катаболитной репрессии у Е. соН 24

2.3. Активирующий транскрипцию комплекс сАМР-СЯР 26

2.4. Классификация СЯР-зависимых промоторов 28

2.4.1. Лактозный оперон 32

2.4.2. Галактозный оперон 36

2.4.3.Мальтозный оперон 39

2.5. Множественные операторные участки и образование петлевых структур в ДНК 43

2.6. Общая характеристика гистоноподобных белков 45

2.7.ДНК-связывающий белок И Б и его роль в

регуляции транскрипции 47

2.8. ДНК-связывающий белок 1НГ и его функции в клетке 49

2.9. Влияние суперспирализации ДНК на активацию транскрипции 51

2.10. Заключение 51

Глава 3.Особенности структурно-функциональной организации и регуляции генов катаболизма нуклеозидов 52

3.1. Структурно-функциональная организация белка CytR 57

3.2. Структура и регуляция экспрессии генов deo- оперона 60

3.3. Регуляция экспрессии гена tsx 64 3.4 Регуляция экспрессии гена nupG 65 3.5. Регуляции экспрессии гена cdd 66 3>.6. Регуляции экспрессии гена udp 67 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 72

Глава. 4.Роль межгенной области metE-udp в регуляции экспрессии гена udp Escherichia coli 86

4.1. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности межгенной области metE-udp 86

4.2. Компьютерный анализ нуклеотидной

последовательности регуляторной области гена udp 89

4.3. Экспрессия гена udp в штаммах, дефектных по белкам

IHF и FIS 90

4.4. Зависимость экспрессии гена udp от размера регуляторной области 92

4.5. Особенности экспрессии гена udp у промоторных мутантов udpP264 и udpPl 98 Глава.5.Мутационный анализ основного сайта связывания белка CytR в регуляторной области гена udp Escherichia coli 102

5.1.Влияние нуклеотидных замен в пентамере TGCAA

на экспрессию гена udp 102

5.2. Влияние полученных мутаций на способность промотора к титрованию белка-репрессора CytR 107 Глава 6. Анализ структуры и регуляции udpP промотора

y S.typhimurium 110 6.1. Анализ структурной организации регуляторной области

гена udp S. typhimurium 111 6.2 Изучение регуляции udp промотора S. typhimurium

в системе in vivo 112

ОБСУЖДЕНИЕ 115

ВЫВОДЫ 124

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 126

ВВЕДЕНИЕ

Изучение механизмов регуляции экспрессии генов является одним из важнейших направлений молекулярной генетики. Долгое время считалось общепризнанным, что бактериальные регуляторные белки содержат всю необходимую структурную информацию, обеспечивающую распознавание и связывание со специфическими последовательностями-мишенями в молекуле ДНК, в то время как регуляция с участием мультибелковых комплексов характерна исключительно для эукариотических генов. К настоящему времени выяснилось, что механизм регуляции, основанный на белок-белковых взаимодействиях не является исключительной прерогативой эукариот и довольно широко используется и в прокариотических системах. К таким системам относятся гены, контролирующие транспорт и катаболизм нуклеозндов у E.coli, экспрессия которых находится под негативным контролем белка-репрессора CytR, а также регулируется позитивно с участием активирующего транскрипцию комплекса циклический аденозинмонофосфат (сАМР) - белок-рецептор цАМФ (CRP) [57].

Ген udp является одним из 9 генов, принадлежащих к CytR-регулону и кодирует синтез фермента уридинфосфорилазы. Промоторные области большинства генов катаболизма нуклеозидов, включая udp, охарактеризованы на уровне определения их нуклеотидной последовательности. Показано, что по крайней мере четыре промотора (deoP2, cddP, udpP, nupGP) имеют общий план строения и содержат два тандемно расположенных сайта связыания для белка CRP, между которыми

расположен сайт узнавания для белка-репрессора CytR [164]. Получены убедительные доказательства, что кооперативное связывание белков CytR и CRP с промотором обеспечивается за счет их прямого белок-белкового взаимодействия [152].

Несмотря на сходство в общей конфигурации CytR-регулируемых промоторов, характер взаимодействия

регуляторных белков CytR и CRP с различными промоторами может сильно варьировать. Так, уже в первых работах по клонированию гена udp были получены данные, свидетельствующие о том, что регуляция экспрессии гена udp носит более сложный характер по сравнению с регуляцией промоторов cddP и deoP2: у конструкций, содержащих "канонический" CytR-регулируемый udpP промотор (участок размером 125 пн относительно старта транскрипции), тем не менее наблюдался частичный выход экспрессии гена udp из-под контроля белка-репрессора CytR и комплекса цАМФ-CRP [2]. На основании этих данных можно было предположить, что нуклеотидная последовательность, предшествующая

каноническому промотору гена udp содержит дополнительные регулятор]ibie сайты, влияющие на уровень его экспрессии. Действительно, как выяснилось в ходе данной работы, участок хромосомы, расположенный между геном metE и каноническим промотором гена udp, содержит дополнительные сайты связывания для белков CytR и CRP. Делеционный и

мутационный анализ этих сайтов позволил выявить новое необычное свойство белка CytR менять свою функцию на противоположную и выступать в роли не только репрессора, но и активатора транскрипции. При этом выяснилось, что негативное или позитивное действие белка CytR на транскрипцию

определяется конфигурацией регуляторной области и зависит от количества и взаимного расположения на ней сайтов связывания белка CytR.

Следует отметить, что совсем недавно появились литературные данные, согласно которым белковый комплекс цАМФ-CRP /CytR вовлечен в регуляцию экспрессии гена гроН,

кодирующего синтез сигма-фактора (а32), ответственного за

в

контроль генов теплового шока [75]. Таким образом, функция комплекса cAMP-CRP /CytR в клетке не ограничивается его участием в регуляции генов транспорта и катаболизма нуклеозидов, а по всей видимости имеет более плейотропный характер. Для изучения функциональной роли комплекса сАМР-CRif/CytR в метаболизме клетки и оценки его универсальности могут быть использованы и другие подходы, например, поиск и сравнительный анализ гомологичных компонентов этой регуляторной системы у других микроорганизмов. Настоящая работа может рассматриваться как первая попытка реализации такого подхода с привлечением в качестве нового объекта для изучения механизма CytR-регуляции бактерий вида Salmonella typhimurium — наиболее близкого к E.coli представителю семейства Enterobacteriaceae. Цель и задачи исследования.

Основная цель работы состояла в изучении особенностей структурно-функциональной организации регуляторной области гена udp E.coli и S.typhimurium и выявлении механизма регуляции гена udp с участием белка-репрессора CytR и комплекса сАМР-CRP. В соответствии с этим в работе ставились следующие задачи:

/

I

1. Уточнение нуклеотидной последовательности межгенной области melE-udp E.coli размером 956 пн, включающей регуляторную область гена udp.

2. Получение коллекции делеционных вариантов фрагмента 956 пн, укороченных с 5'-конца, т.е. включающих промоторную область гена udp и отличающихся различной протяженностью относительно старта транскрипции.

: 3. Проведение сайт-направленного мутагенеза пентамерного мотива 5'-TGCAA-3', который согласно данным in vitro является левой частью основного сайта связывания белка CytR в регуляторной области гена udp.

4. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности регуляторной области гена udp S. typhimurium.

5. Выявление общих закономерностей структурно-функциональной организации промотора гена udp у E.coli. и S. typhimurium

Научная новизна и практическая значимость.

Уточнена нуклеотидная последовательность межгеннного участка metE-udp размером 956 пн. На этом фрагменте был обнаружен ряд делеций, вставок и нуклеотидных замен, которые отличаются от недавно опубликованной полной нуклеотидной последовательноси E.coli [15]. Кроме того, были идентифицированы три дополнительных потенциальных промотора с координатами сайтов инициации транскрипции -192 (PI), -392 (Р2), -636 (РЗ), один дополнительный CRP сайт с координатами от -320 до -305. При поиске потенциальных сайтов связывания для белка CytR был использован в качестве консенсуса модифицированный CytR-мотив, в результате нами

обнаружено 9 дополнительных сайтов связывания для белка CytR, которые отличаются от предполагаемого консенсуса заменами не более, чем в 5 пн. Анализ регуляторной области гена udp выявил наличие трех потенциальных сайтов связывания для белка IHF и 11 потенциальных сайтов для белка FIS.

Проведен делеционный анализ промотор-проксимальной области гена uJp и показано, что по мере укорочения регуляторной области гена udp происходит увеличение уровня экспрессии промотора udpP как в условиях его репрессии (cytR+) так и дерепрессии (cytR-). Показано, что негативное действие белка CytR на экспрессию промотора udpP реализуется до тех пор, пока в регуляторной области присутствует интактный сайт CRP2.

Впервые проведен систематический мутационный анализ сайта связывания белка CytR и показано, что все мутации затрагивающие пентамер TGCAA обусловливают частичный выход экспрессии гена udp из-под контроля белка-репрессора. Установлено, что нуклеотидная пара G/C в положении -67 имеет особо важное значение для связывания белка CytR с промотором. Показано, что все отобранные мутантные промоторы характеризуются сниженной способностью к титрованию репрессора CytR в системе in vivo.

Впервые осуществлено клонирование промотора гена udp S.typhimurium и определена его нуклеотидная последовательность. Выявлена большая гомология промоторной области гена udp E.coli и S.typhimurium. Некоторые из найденных отличий нуклеотидной последовательности, затрагивают основные сайты связывания для регуляторных белков CytR и CRP.

Впервые изучена гетерологичная экспрессия гена udp в клетках E.coli и S.typhimurium. Полученные результаты показывают, что белок-репрессор CytR S.typhimurium имеет большее сродство к промотору гена udp E.coli, чем к своему собственному.

. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ

Регуляция экспрессии генов является одной из ключевых проблем современной молекулярной генетики. В последнее время наметился существенный прогресс в расшифровке структурной организации и регуляции генетического материала у эукариот. Тем не менее, основной моделью для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе регуляции процессов транскрипции и трансляции, продолжают оставаться прокар и оти ческ и е системы, среди которых ведущее место занимают бактерии двух близкородственных видов: Escherichia coli и Salmonella typhimurium, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae.

В настоящем обзоре мы ограничимся рассмотрением работ, посвященных исследованию регуляторных механизмов, которые управляют активностью бактериальных генов и действуют на уровне инициации их транскрипции. В первой главе обзора кратко изложены основные этапы транскрипционого цикла прокариот. Во второй главе основное внимание будет уделено рассмотрению регуляторных механизмов, с помощью которых различные регуляторные белки влияют на процесс инициации транскрипции. Наконец, третья глава посвящена анализу особенностей регуляции генов, вовлеченных в катаболизм нуклеозидов у E.coli.

Глава 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТРАНСКРИПЦИОННОГО ЦИКЛА ПРОКАРИОТ 1.1. РНК-полимераза и структурные элементы промотора.

Большинство бактериальных оперонов регулируются на уровне инициации транскрипции. Инициация транскрипции — это сложный и высокоорганизованный процесс, состоящий из нескольких последовательных стадий (Рис.1.):

1 I 1 П

РНК-ролимераза + промотор —> Закрытый —» Открытый

двойной комплекс двойной комплекс

III

->

IV

—>

(RPc)

Элонгация

(RPco)

+ промотор

Инициирующий J тройной тройной

комплекс комплекс

( RPinit)

Рис.1. Схема транскрипционного цикла.

Ключевую роль в процессе транскрипции играет фермент РНК-полимераза. У E.coli так называемый кор-фермент РНК-полимеразы, состоящий из двух а, одной ß и одной ß' субъединиц, обладает каталитической активностью и может осуществлять элонгацию транскрипции, однако не способен распознавать специфические промоторные участки ДНК и инициировать транскрипцию. Специфическая инициация транскрипции зависит от присоединения к кор-ферменту дополнительной субъединицы — а-фактора, в результате чего образуется функционально активный холофермент РНК-полимеразы. Геном E.coli кодирует по крайней мере шесть разных а-факторов. Наиболее детально изучен а70-фактор, который необходим для транскрипции генов,

вовлеченных в фундаментальные клеточные функции во время экспоненциального роста. Другие ст-факторы ответственны за транскрипцию функционально связанных групп генов, которые вовлечены в ассимиляцию азота (а54), экспрессию генов флагеллина (а28), генов теплового шока (а32 и а24[аЕ]) и генов, экспрессируемых во время стационарной фазы роста бактерий (а38) [54]. За исключением а54, остальные ст-субъединицы обнаруживают большую гомологию [54,59]. Сравнение с-факторов других прокариот показало, что все известные а-факторы принадлежат либо к а70, либо к а54 семействам.

Процесс транскрипции начинается с присоединения РНК-полимеразы к специфической последовательности ДНК (промотору), содержащей стартовый сигнал для синтеза РНК. На первом этапе РНК-полимераза образует так называемый закрытый комплекс с промотором ИРсь который

характеризуется нестабильностью и легко распадается при повышении ионной силы. В этом комплексе ДНК сохраняет свою нативную двухспиральную структуру.

Первоначально сформированный комплекс ЯРа переходит в другое состояние закрытого комплекса — КРсг, в котором РНК-полимераза связывается с определенными последовательностями, расположенными по обе стороны от сайта инициации транскрипции и расплавляет сегмент двойной спирали ДНК размером 10-15 пн. Закрытый комплекс способен изомеризоваться и переходить в более устойчивый открытый комплекс 11Рсо. Согласно имеющимся данным можно разграничить два типа открытых комплексов (КРсо1 и ЯРсог). Переход ЯРсо1 в ЛРсо2 стимулируется в районе сайта инициации транскрипции (+1),

причем последний комплекс стабилизируется в результате связывания инициирующего рибонуклеотида.

При добавлении 4 рибонуклеозидтрифосфатов РНК-полимераза начинает синтез РНК и в промоторной области формируется тройной инициирующий комплекс. Различают абортивную и продуктивную инициацию. Поскольку на стадии инициации синтезируемая РНК достаточно непрочно связана с ДНК матрицей, она может отделяться от ЛРимгг комплекса. В этом случае ЛРиччт возвращается в состояние ЯРс2 комплекса и полимераза вновь инициирует РНК в составе открытого комплекса. Образование стабильного инициирующего комплекса сопровождается отделением а-субъединицы от РНК-полимеразы. Далее полимераза продолжает наращивать цепь РНК, обеспечивая переход к стадии элонгации транскрипции.

спейсерная последовательность Т Т С АС А 17 пн ТАТААТ

69 79 6156 54 54 43

77 76 60 61 56 82

А

47

_I_

-60 -35 -10 +1 +20

ИР элемент БЗЯ элемент

Рис.2. Функционально важные участки структуры "консенсусного" ст70-промотора. Показан состав консенсусной структуры -35 и -10 гексамеров и длина спейсера (внизу отмечен процент их встречаемости по базе данных примерно 300 промоторных последовательностей).

При достижении ферментом специфической последовательности — сигнала терминации транскрипции синтез РНК завершается (этап терминации). РНК-полимераза отделяется от ДНК-матрицы и вновь синтезированной цепи РНК и,

соединившись со свободной а-субъединицей, может вступать в новый цикл транскрипции.

Промоторы, узнаваемые холоферментом, содержащим сигму семейства а70, содержат два характерных гексануклеотидных блока консервативных последовательностей, расположенных в -10 и -35 положениях промотора. Эти блоки

разделены 17 неконсервативными парами нуклеотидов, однако,

Л

расстояние в 17 (1^-18) пн. консервативно. Структура типичного "кон1енсусного" ст7^-зависимого промотора и его функционально важные участки показаны на Рис.2 [101].

Рассмотренная выше схема транскрипционного цикла описывает характер взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами генов, обеспечивающих жизнедеятельность клетки в нормальных условиях роста и имеющих консервативные •последовательности в -10 и -35 областях промотора. Промоторы этого типа можно условно отнести к классу "сильных", так как для своей а