Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и функция гена РАХ-7 человека в норме и патологии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воробьев, Евгений Владимирович, Санкт-Петербург

Институт Экспериментальной Медицины РАМН Мюнстерский Государственный Университет

На правах рукописи

Воробьёв Евгений Владимирович

СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ ГЕНА РАХ-7 ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ

03.00.04. биохимия

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н., ст.н.с. А.П.Перевозчиков, д.м.н., проф. Юрген Хорст.

Санкт - Петербург 1999

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений. ......... 5

Введение. . . . 6

1. Обзор литературы. ........ 8

1.1. Открытие PAX генов. ........ 8

1.2. Структурная организация белков PAX семейства. ... 9

1.3. Структура ДНК - связывающих доменов PD и HD. 12

1.3.1. Структура домена HD. 13

1.3.2. Структура домена PD. ... . . 16

1.4. Экспрессия PAX генов в эмбриогенезе. 19

1.5. PAX гены и раковые заболевания человека. .... 21

1.6. Гены РАХЗ и РАХ7.........22

1.6.1. Экспрессия генов РАХЗ и РАХ7 в эмбриональном развитии. 23

1.6.2. Патологии, связанные с потерей функции гена РАХЗ. ... 24

1.6.2.1. Мутация Splotch мыши. ....... 24

1.6.2.2. Синдром Ваарденбурга. ....... 26

1.7. Альвеолярная рабдомиосаркома. ...... 27

1.7.1. Транслокация [t(2; 13)(q35; q 14)] в альвеолярной рабдомиосаркоме. . 29

1.7.2. Транслокация [t(1;13)(p36.2; q14)] в альвеолярной рабдомиосаркоме. 32

2. Материалы и методы исследований. ...... 34

2.1. Клеточные линии. ........ 34

2.2. Клонирование кДНК гена РАХ7. ...... 35

2.3. Клонирование кДНК химерного гена PAX7-FKHR . ... 35

2.4. Клонирование и анализ геномных клонов гена РАХ7. ... 36

2.5. Конструирование экспрессионных векторов. .... 36

2.6. Культивирование клеток и получение клеточных линий. ... 36

2.7. Анализ ДНК-связывающей активности белков. .... 37

2.8. Метод мягкого агара. ........ 38

2.9. Анализ клеточного цикла. ....... 38

2.10. Эксперименты с бестимусными мышами. ..... 38

2.11. Анализ экспрессии известных генов методом обратной гибридизации. 39

2.12. Дифференциальный дисплей. . . 39

2.13. Компьютерный анализ. ........ 39

3. Результаты исследований и их обсуждение. .... 40

3.1. Клонирование и анализ кДНК гена РАХ7. ..... 40

3.1.1. Скрининг фаговой библиотеки кДНК. ...... 40

3.1.2. Рабдомиосаркома как источник РНК для клонирования

кДНК гена РАХ7. ........41

3.1.3. Клонирование кДНК гена РАХ7 методом RACE. .... 42

3.1.4. Старт трансляции белка РАХ7. ...... 45

3.1.5. Альтернативная терминация транскрипции гена РАХ7. ... 46

3.1.6. Альтернативный сплайсинг транскриптов гена РАХ7. ... 47

3.1.7. Белок РАХ7 отличается от РАХЗ уникальной последовательностью

в С - конце. .......... 49

3.2. Клонирование кДНК гибридного гена PAX7-FKHR. ... 51

3.3. Геномная организация гена РАХ7 человека. . 54

3.3.1. Клонирование и анализ геномных клонов гена РАХ7. ... 54

3.3.2. Гены РАХ7 и РАХЗ имеют сходную геномную организацию. 60

3.3.3. Седьмой интрон гена РАХ7 вовлечен в транслокацию t(1; 13). . 63

3.4. Клонирование геномных фрагментов генов РАХЗ и FKHR. 63

3.5. РАХ7 - вероятный кандидат на роль гена опухолевого супрессора. . 65

3.6. РАХ7 и синдром Ваарденбурга. ...... 67

3.7. Перенос генов РАХ7 и PAX7-FKHR в клетки NIH3T3 и получение стабильных клеточных линий с конститутивной экспрессией соответствующих белков. ....... 68

3.7.1. Эктопическая экспрессия как подход для функционального анализа

генов РАХ7 и PAX7-FKHR........68

3.7.2. Эмбриональные фибробласты мыши в качестве тестовых клеток. 68

3.7.3. Получение клеточных линий, экспрессирующих белки РАХ7

и PAX7-FKHR..........69

3.8. Функциональный анализ генов РАХ7 и PAX7-FKHR. ... 71

3.8.1. Общие характеристики полученных клеточных линий ... 72

3.8.2. Анализ клеточного цикла. ....... 74

3.8.3. Анализ клеток методом мягкого агара. . 77

3.8.4. Клетки, экспрессирующие PAX7-FKHR, образуют опухоли in vivo. 79

3.8.5. Обобщение результатов функционального анализа генов РАХ7

и PAX7-FKHR..........80

3.9. Анализ дифференциальной экспрессии генов. 81

3.9.1. Анализ экспрессии известных генов методом обратной гибридизации. 81

3.9.2. Идентификация и клонирование генов методом "дифференциального дисплея". ...... 83

Выводы. ........... 86

Список литературы. . . . . 89

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ак - аминокислота

АРМС - альвеолярная рабдомиосаркома

кДа - килодальтон

РМС - рабдомиосаркома

скДНК - суммарные ДНК-копии клеточной РНК

(т.)п.н. - (тысяча) пар нукпеотидов

ФР - фактор роста

ЭРМС - эмбриональная рабдомиосаркома

DD - дифференциальный дисплей (differential display)

FISH - флюоресцентная гибридизация in situ

FKHR - fork head in rhabdomyosarcoma

HB - homeobox

HD - homeodomain

OP - octapeptide

PAX - paired box

PB - paired box

PD - paired domain

PCR - полимеразная цепная реакция (polymerase chain reaction)

RACE - быстрая амплификация концов кДНК (rapid amplification of cDNA ends)

RH - обратная гибридизация (reverse hybridization)

RT - обратная транскрипция (reverse transcription)

WS - синдром Ваарденбурга (Waardenburg syndrome)

Английское или латинское написание будет сохранено для слов, являющихся именами собственными, имеющих устойчивое употребление в международной научной литературе в качестве специфических терминов, и для слов, которые могут быть ключевыми при поиске соответствующей информации в литературе.

ВВЕДЕНИЕ

Гены, принадлежащие к PAX семейству, кодируют транскрипционные фаюгоры, общей чертой которых является наличие эволюционно консервативного ДНК - связывающего домена Paired domain (PD). PAX гены экспрессируются в эмбриогенезе и играют важную роль в детерминации зачатков различных структур будущего организма.

PAX гены впервые были обнаружены у дрозофилы, а позже гомологичные им гены были идентифицированы и у других организмов, включая мышь и человека. В настоящее время PAX гены человека являются объектом интенсивного изучения. Выяснилось, что нарушение функции PAX генов связано с развитием ряда заболеваний человека. В частности, потеря функции PAX генов приводит к развитию наследственных болезней, связанных с аномальным формированием определённых органов и тканей, в то время как гиперактивность этих генов ассоциируется с развитием раковых заболеваний.

Семейство PAX генов человека состоит из девяти членов. На основании структурного сходства белковых продуктов это семейство подразделено на четыре группы генов. Одна из групп представлена двумя высоко гомологичными генами РАХЗ и РАХ7. В последние годы было обнаружено, что потеря функции гена РАХЗ приводит к развитию тяжёлого наследственного заболевания человека - синдром Ваарденбурга. В связи с этим, ген РАХЗ привлек к себе большое внимание и был подвергнут всестороннему изучению. В то же время ген РАХ7 оставался одним из наимение изученных членов PAX семейства. Его полная белковая последовательность и геномная организация не были известны ни у одного из организмов.

Недавно было установлено, что развитие одной из превалирующих форм рака, образующегося в детском возрасте, альвеолярной рабдомиосаркомы (АРМС) связано со структурными изменениями генов РАХЗ и РАХ7. Вместе с

тем, появились данные, позволяющие предполагать, что ген РАХ7 может являться кандидатом на роль тканеспецифического опухолевого супрессора. Делеции хромосомного участка, где расположен этот ген, часто обнаруживаются в клетках раковых опухолей, мышечного и нейрального происхождения. При этом, известно, что функция гена РАХ7 тесно связана с формированием именно этих двух типов тканей. Однако чтобы обнаружить действительную связь между нарушением функции гена РАХ7 и развитием выше упомянутых заболеваний, важно знать его полную структуру и геномную организацию. Такая информация является необходимой для проведения мутационного анализа экзонов этого гена в поисках более тонких изменений, таких как нуклеотидные замены, небольшие делеции или инсерции.

Цель настоящей работы состоит в изучении структуры и функции транскрипционного фактора РАХ7 человека в норме и патологии. Для достижения поставленной цели предполагается решить следующие задачи:

1. Клонировать полную кодирующую последовательность гена РАХ7 человека.

2. Определить геномную организацию гена РАХ7 человека.

3. Клонировать кДНК химерного гена PAX7-FKHR, образуемого в результате хромосомной транслокации в клетках раковой опухоли - альвеолярной рабдомиосаркомы (АРМС).

4. Осуществить перенос генов РАХ7 и PAX7-FKHR в культивируемые эмбриональные фибробласты мыши и получить стабильные клеточные линии с конститутивной экспрессией соответствующих белков.

5. Исследовать функциональные свойства генов РАХ7 и PAX7-FKHR путем сравнительного анализа изменений клеточных характеристик, происходящих в ответ на эктопическую экспрессию этих генов.

6. Идентифицировать гены, дифференциально экспрессирующиеся под влиянием транскрипционных факторов РАХ7 и PAX7-FKHR.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Открытие PAX генов

Гены, принадлежащие к PAX семейству, кодируют транскрипционные факторы, общей чертой которых является наличие эволюционно консервативного ДНК - связывающего домена Paired domain (PD). Впервые такие гены были обнаружены у дрозофилы. Основанием для их открытия послужила гипотеза "gene network". Эта гипотеза, исходящая из эволюционных наблюдений, была сформулирована Маркусом Нолом в 1986 году (Ворр et al., 1986; Frigerio et al., 1986). Суть гипотезы сводится к следующим положениям. Новые гены (транскрипционные факторы) возникают в результате дупликации уже существующих генов или путем рекомбинации последовательностей, кодирующих отдельные домены. Продукты новообразованных генов, в силу своего родства или наличия сходных доменов, становятся участниками сходных процессов (взаимодествий). В результате, образуются сети генов с аналогичными функциями. Согласно своему происхождению, все гены, принадлежащие к таким сетям, состоят из комбинаций относительно небольшого числа субпоследовательностей, кодирующих определенные функциональные домены. Эта концепция предсказывает, что любой член какой - либо генной сети содержит один или несколько доменов, присущих и другим членам этой сети. Следовательно, возможно найти все гены и домены, принадлежащие одной генной сети. В дальнейшем эта гипотеза оказалась очень плодотворной, хотя и не стала парадигмой. В качестве объекта для её экспериментального подтверждения

был использован гомеобокс-содержащий ген дрозофилы, paired. Фенотип мух, мутантных по гену paired, свидетельствовал о важной роли этого гена в ранних процессах сегментации эмбриона, а именно, в определении парности сегментов. Чтобы обнаружить другие гены, относящиеся к той же функциональной группе, что и paired, его кДНК разделили на три примерно равные части и использовали эти фрагменты в качестве зондов для поиска гомологичных последовательностей других генов, кодирующих родственные домены. В результате, были изолированы новые гены, такие как bicoid, goosebery, neural goosebery, pox meso и pox neural. Общей чертой этих генов, за исключением bicoid, является наличие консервативной последовательности, которая была названа Paired box (РВ). В дальнейшем было установлено, что все эти гены, действительно, относятся к одной фенотипической группе мутаций парности сегментов (pair - rule). Позднее, используя в качестве зонда фрагмент ДНК, содержащий Paired box гена paired дрозофилы, были клонированы подобные гены других организмов. К настоящему моменту у мыши и человека известны девять членов этого семейства, получившего название PAX (paired box).

1.2. Структурная организация белков PAX семейства

Основным объединяющим признаком для белков, кодируемых генами PAX семейства, является наличие большого эволюционно консервативного ДНК - связывающего домена, Paired domain (PD). Этот домен находится в N -концевой части белка и состоит из 128 аминокислотных остатков. Некоторые PAX белки содержат ещё один ДНК - связывающий домен, Homeodomain (HD),

или не полный HD, а лишь его N - концевую половину. Homeodomain -содержащие белки, как известно, также образуют суперсемейство транскрипционных факторов, контролирующих развитие организмов. Однако Homeodomain PAX белков имеет специфические отличия по ряду аминокислотных остатков, которые являются инвариантными в HD домене НОХ белков и поэтому получил название "paired type homeodomain". Помимо этих двух доменов, некоторые PAX белки содержат ещё один консервативный элемент, октапептид (octapeptide, OP). Это восемь аминокислотных остатков -HSIDGILS, которые располагаются между PD и HD. Подобная последовательность встречается также у ряда белков, не содержащих PD. Функция октапептида до сих пор остается невыясненной.

В С-концевой области PAX белков находятся последовательности, играющие роль в транскрипционной транс-регуляции. В настоящее время ведется работа по выяснению их детальной структуры и функциональных особенностей. Сейчас можно лишь отметить, что эти последовательности являются уникальными и специфичными для каждого из членов PAX семейства.

На основании структурного сходства девять PAX белков мыши и человека подразделены на четыре группы. Обобщенные сведения о них приведены в таблице 1. Первая группа состоит из двух членов РАХЗ и РАХ7. По-видимому, эти белки наиболее близки к предковой форме, так как они сохранили все основные консервативные элементы, встречающиеся у белков PAX семейства: PD, ОР и HD. Во вторую группу входят белки, не имеющие лишь октапептида: РАХ4 и РАХ6. В третьей группе - три члена: РАХ2, РАХ5 и

РАХ8. Они содержат Рй, ОР и НО, но не весь Нотеоскэплат, а лишь его 1М-концевую половину. Четвертую группу составляют Рах1 и Рах9, для которых характерно полное отсутствие домена НО.

Таблица 1. Структурная организация белков РАХ семейства (ЗЛиаЛ & Стээ, 1995).

ГЕН

СТРУКТУРА БЕЛКА

ХРОМОСОМА

РО

ОР

НО

мышь человек

Группа I РАХ-3 -С

РАХ-7 ?£

х>

]—о

1 2q35 4 1р36.2

Группа II РАХ-4 -С

РАХ-6

6

2 11р13

Группа III РАХ-2 -С

РАХ-5 -[ РАХ-8

]—о

ьо

х>

19 4 2

10я25 9р13 2я12-я14

Группа IV РАХ-1

РАХ-9 ?£

и—о-

2 20р11 12 14д12-д13

Необходимо добавить, что недавно появились сведения о новом члене PAX семейства дрозофилы, структура которого не позволяет отнести его ни к одной из четырёх групп. Это ген Lune; его последовательность еще не опубликована, но он упоминается в ряде статей, где сообщается, что данный ген кодирует белок, содержащий полный HD, но не имеющий первой наиболее консервативной половины домена PD (Jun & Desplan, 1996).

В геноме мыши и человека все PAX гены расположены на разных хромосомах и не организованы в кластеры, подобно большинству НОХ генов. Это предполагает независимость паттерна экспрессии PAX генов от взаимного расположения их на хромосомном уровне, как это свойственно для кластерных НОХ генов.

1.3. Структура ДНК - связывающих доменов PD и HD

В этой главе мы приводим сведения о детальной структуре двух ДНК-связывающих доменов, Paired domain и Homeodomain, которые составляют наиболее консервативную часть белков PAX семейства. В первую очередь, будет рассмотрена структура домена HD, являющегося эволюционно более древним, чем PD.

Homeodomain - содержащие белки были обнаружены у всех эукариот, включая царства грибов и растений. Роль этого домена является настолько фундаментальной, что его последовательность, состоящая из 60 аминокислотных остатков, порой сохраняется эволюцией в высшей степени неизменной. Например, при том, что позвоночные и насекомые разошлись в эволюции более, чем полмиллиарда лет назад, последовательности HD

доменов человеческого белка Нох-А7 и ортологичного белка дрозофилы Antennapedia отличаются лишь одним аминокислотным остатком.

Paired domain - содержащие белки, по-видимому, появились в эволюции значительно позже. В настоящее время полностью секвенированы геномы ряда прокариот и эукариот, включая E.coli и S.cerevisiae. В результате компьютерного анализа всех возможных кодирующих последовательностей в геномах этих организмов не удалось обнаружить наличие какой-либо значительной гомологии с последовательностью Paired box. Однако гены, кодирующие Paired domain, были идентифицированы даже у самых примитивных многоклеточных, таких как гидра, медузы и коралловые полипы. Таким образом, предполагается, что возникновение этого домена связано с появлением многоклеточное™.

1.3.1. Структура домена HD.

Вторичная и третичная структуры домена HD ряда НОХ белков были определены методом ядерномагнитного резонанса (Kissinger et al., 1990; Gehring et al., 1994). В результате, было выяснено, что Homeodomain состоит из трёх а - спиралей, образующих плотную глобулярную структуру. Спираль I, которой предшествует гибкий (не имеющий постоянной структуры) N-конец, отделена от спирали II небольшой петлёй, и вместе со спиралью III они формируют структуру спираль - поворот - спираль (helix-turn-helix). Подобный структурный мотив был ранее описан для ряда прокариотических транскрипционных факторов, включая репрессоры X и 434 (Steitz, 1990; Pabo and Sauer, 1992). Однако, в отличие от последних, третья спираль домена HD

имеет небольшой гибкий поворот, за которым следует несовершенный спиральный участок - спираль IV. Предполагается, что этот участок принимает форму близкую к а - спирали в результате связывания с ДНК. Структура, в большей степени напоминающая домен Нй белков многоклеточных организмов, обнаруживается у ряда белков низших эукариот. Например, НР -подобный домен гена МАТа2 (Б. сеге^ае), который лишь на двадцать восемь процентов гомологичен последовательности Нотеос1отат белка А^еппаресПа, имеет точно такую же пространственную укладку (\Л/о1Ьегдег е! а1., 1991). Можно заключить, что третичная структура домена НО в целом сохраняется в эволюции неизменной, даже при значительной вариабильност�