Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СТРУКТУРА, ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И ФОРМИРОВАНИЕ АЛЕЙРОНОВЫХ ЗЕРЕН СЕМЯН КЛЕЩЕВИНЫ И ЛЮПИНА

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "СТРУКТУРА, ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И ФОРМИРОВАНИЕ АЛЕЙРОНОВЫХ ЗЕРЕН СЕМЯН КЛЕЩЕВИНЫ И ЛЮПИНА"

АКАДЕМИЯ НДУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

СУВОРОВ Василий Иванович

СТРУКТУРА, ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И ФОРМИРОВАНИЕ АЛЕЙРОНОВЫХ ЗЕРЕН СЕМЯН КЛЕЩЕВИНЫ И ЛЮПИНА

(03.00.12. — Физиология растений) .

Автореферат , ' диссертации на соискание ученой степЦ кандидата биологических наук у

/'

Москва — 1978

(

Cuty^Ji^^U^-tJf - fid

Y-c^-i-ccià

АКАДШЯ НАУК СССР <

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ ИМЕНИ S.A. ТИМИРЯЗЕВА

Не правах рукопвсш

СУВОРОВ Весяий Иванович

СТРУКТУРА, ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И ФОРМИРОВАНИЕ

А1ЕЙР0НОВЫХ ЗЕРЕН СЕМЯН КЛЕЩЕВИНЫ И ЛЮПИНА

■ *"' *■...' <

(03.00.12. - Фшашояогия растений)

Автореферат

дяссвргвции на соискание ученой степени пендядвгв биологических неук

Москва - 1973

Работа выполнена в лаборатории запасных отложений Ордена Трудового Красного Знамени'Института физиологии растений им. К.АЛимирязвв8 АН "СССР.

Научные руководители:

^ г доктор биологических неук» профессор О/.

'::;•„-.'-:''. V" .- •' А .А .Прокофьев -: кандидат биологических неук ' ' „ -;

■.'•"•.-•' ■ А;Ц.Соболев •

Официальные оппоненты: .

'•7т. доктор биологических наук К.В.0вч8ров

/ кандидат биологических наук^ М.В.А»ексеевв X;

Веющее учреждение - Ордена Ленина Институт % ; ■ биохимии им. А.Н.Бах8 АН СССР -

Защита диссертации состоится & марта 1973 г. ' на заседании Ученого совета Института физиологии рвстенай им. К.А.Тимиряввва АН СССР.

. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке. Института. ■ '";"*

.^Автореферат разослан 6 февраля 1973 г.

/ .Просьба отзывы направлять по адресу: 127273,Москва," И-273Ботаническая ул., 35, Институт физиологии растений им. К.А.1имиря8вва АН СССР, ученому секретаре доктору биологических наук В.И.Кефали.

Семена растений и продукты вх^переработки является основный источником ПИГаНИЯ для Ч0ДОВвК8'н животных.

В свнзас этим изучение образования и отложения в сома нех растений основных запасных продуктов - белков, углеводов и хоров ишет больное значение для последующей разработки . яаучно-осЗосповгшных методов.воздействия не процессы накопления атах воцаств в сеиенах. Следует, однако, отметать, что если молекулярная аспекты сввтега указаннюс вощаств выяснены в достаточной мере, то. нави сведения о клеточных структурах, непосредственно связанных с отложением в гапас ; атах веществ в тканях семян,яваязтся значительно менее полными. В первую очередь ото относится к такимважнейшим продуктам^ кок запасные белка семян. Действительно, несмотря на то, что в настоящее время установлен факт накопления ' белков в особых образованиях - алейроновых зернах или белковых телах, точное место синтеза этих соединений в клетках семян, а такае путиих перемещения.от месте синтезак месту накопления оставтся до сих пор невыясненными. Такае мало изученными до последнего времени остается строение и хами- : чосквй состав самих алейроновых зерен. Хотя белковая природа указанных образований была установлена еще в. прошлом веке ( НигИ-б , 1855, 1956; МавсЬкв ^ 1859; На^еИ ; 1862; 1 РХеЯСвг ■ ;-1872; * , 1890),, а также в самых обдах

чэртах выяснено их строенае, многие детали структуры и химического состэзо оствзтся невыясненными по сегодняшний день. В насгоявде гремя известно, что основными по содержанап и наиболее всзшша в физиологическом отношении компонентами-алойроновцх зерен являвтся белок и фитин ( Ю1е0квг* е-ь а1.,

ligt , Altschul ,• 1964; . 'Graben, Morton,, Raison,.;;

1963; Morton, Palk, Raison , 1964; х0л0д0в8,

1964;-Соболев, 1966; Lui, Altschul. ^ ' ' »1967;

Toaba , 1967; Прокофьев, 1968; Алексеева,

1969'.'и ¿р.), причем последний присутствует в алейроновых v.. зорнах, как правило,- в форме: особых-образований - глобоидов.; Наряду о отим имеются отдельные указания, что глобоиды'у-алайроновыг зерен ряда растений могут отсутствовать ( wioior, 1943)." ; . : .; .до.

Д Белки алейроновых эорен могут находиться какв кристаллической, ток и в нэ1фИстёллической формах ( Ferner , "' ; 1965; - Angelo ot al., À ДД , 1968) . В на сто я® в время . мы еде: очень мало знаем о химических различиях-и физиолога-,-ческой функции отдельных: белковых компонентов^алейронового ; ; зерна. - , ' Ч " :

V, В ряде работ показано,-что алейроновое зерно'имеет собственную мембрану, по-видимому, идентичную тонопласту,ва-куола.>Г, - Г"-'.' , , - -

у- Кце менее выясненным является вопрос о происхождении- -/алейроновых зерен. Согласно наиболее распространенной точке зрения,,'алейроновые зерна возникает в созрев8пцих "семенах -в результате;последовательной кристаллизации различных фракций белков и фитина при обезвоживании вакуоли (представление об олейроновом зерне , как о высашей вакуоли). : ~ , -Д.

•V;Согявсводругой теории запасные белки возникают в результате ,активной деятельности самого алейронового зерна, ко5оровр8ссц8тривавтся как ппвстида ( -Mottier , 1921; 1,,':Уо\хк."ДДУ^925;ДЦе - '

пл8сгиднэя1аор!1я. Наиболее полное вирагвние эта тоория нашла в работах Ыортона ссогрудниками, покззввпих, чтовыдедан

ныо- из.эндосперма шзеницы'алейроновые зер1а содерж8Т все ' ~

компоненты белоксинтезируюцей системы и способны'вкличать ' ; меченые аминокислоты в запасные белки in vitro (Morton,

PaUc, Raison ' ,1964; Morton, Raison. ,1964;

Morton, Raison, Ssoaton> ; » 1964).. ".

Однако, в последующих работах ¡было показано, .что ^ ; ^ включение вминокислот в запасные белки изолированнее адей-.* роновых верен, могло, по-видимому,"обусловливаться бакте- ; риальным заражением;инкубационной среды (г Wilson, . , > > 1966; Wbeеlor," Boulter , 1966).

Наконец, согласно другой точке 8рения,„ центральная роль в образовании и накоплении запасных;белков и фитина . отводится структурным предаественникем глобоида ^Прокофьев и др., 196?; Соболев и др., 1968).

Таким: образом, детальное изучение строения,химического " состава и формирования алейроновых зерен-семян в связи с процессами синтеза"и накопдения звпасных белков в фитина ^ представляется весьма важным для более:совершенного пони- . мания отложения в запас указанных веществ.

В соответствии с'этим, основной задачей нашего исследования являлось сравнительное изучение структуры, химичес-j кого состава и формирования алейроновые зерен различных типов. * .

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ' \

В качестве объектов исследований ^намибнжв взяты согревающие и зреаыо Семене клецевины ( Ricinus-cojmvmi? ь; ) сорт ВШШЫК-165 и\яюпина желтого ( Lupinus"luteus L;- )-сорт Бысгрор8стуаай-4. :

Основным объектом являлись семена;клещевины, имеющие -крупные вжойроно'еыэ зерна, с четко вцражвнными глобоидами а: криаталлокдемп ц продстевдквцие собой, следовательно, . > удобный обмкт Д1я изучения деталей строения и химического соста ва алейронозых зорей, и их компонентов.'Алейроновые - * : зорка сомядолой лапина/;за, исключением" нескольких периферических слоев клотокуимеют иной тип строения, выражающийся в отсутствии четко,выраженных глобоидов иаднеталлоидов. ■

-

Отдельные акспориыонтыпрово дались с алейроновыми зерна ии зрелых семян горчицы белой ( л зитрю' а1Ъа ъ. : )-сорг ВНУИУК-162, содержащими мелкие глобоиды при отсутствия кристаллоидов и продстовлгшцит, следовательно, промежуточный тип строения алейроновых зерен.

Растения вырацивэли в условиях вегетационного опыта не дерновой почве. Дату цветения отмечали отдельно для : , 1 каждого соцветия, что позволяло включать впробы одновоз-' растные~самена . Пробы семян для анализов бралась всегда из средней-часта соцветия.-На протяженно созравэвая было ; взято несколько проб, причем последние пробы включали в себя зрелые сомэна.

Выдвденнэ едейроновых зерен и иг структурных конпонан-

тов.- В. литературе имеются, противоречивые? данные в отнодонив химического состава алейроновых зерен, что, по-видимому, объясняется различиями методов, пршюнявмых .для их выдоле-ная./При выделеции в водных средах имеет место значительная

• потеря белков в водорастворимых компонентов глобоидов алой-' ; роновьк зёрен. В связи с этим возникла необходимость раз-^

работки методов выделения алейроновых зерен и цх частей (глобоидов, кристаллоидов в аморфной гоны), в условиях,иак-самально сохраняющих структуру-и химический.состав атвх образований. Для/этой цели нами была разработаны методы виде- ' ления указанных}чвстад в безводных средвх. В основу разработанной, методики был положен метод Дикерта и др. ( с* а1. ,1362), сводящийся к фракционированию 8дойроно-вых зерен в смеси растительного масла и органических растворителей различной плотности." : '

Алейроновые зерна из;ацетонового '.пор саке, обогаценного указанными частицами (Соболев, 1966),'ввделяли посредством многократного суспендирования и центрифугирования фракции ;.....

• в смеси ацетона и четыреххлористого углерода возрастающей плотности.,Полная схема фракционирования приводится па -рис. Г., > ..."

I

о

• семена • - -

I -

ацетоновый пороаок, обогавднный алейроновыми зернами

смесь ацетоне и . • ; : четыреххлористого углерода ■ 1 -р - 1,25; 2200е , Ю мин, 2 раза «

О р-1,33

Н 0 р- 1,3в

11 5 ? - I,«

■ ': .....-.':—г

Н 0 Клеточные стенка

i : ; ■ • •

добавление ацетона ■1 2200е /10 мин,

Н- 0 фракция алейроновых зерон

. Рис. I.Схемавыделения алейроновых'верен; :

Н-надосадочная «идкосгь, 0 .-.осадок р - плотность смеси

. Для разделения глобоидов, кристаллоидов и аморфной ': зоны частую фракцию аледроновых зерен клещевины обрабатывали 70% глицерином в течение Ю хин. при: интенсивнее пе-ремеапвайиа." При происходило набухание алейроновых зерен с последующим разрывом внеяней; мембраны, окрухаощей алейроновое зерно,и высвобождением глобоидов и кристаллоидов ив массы; алейронового зерна .-Аморфная зош пероходила ^ в раствор глицегяна. Иосле удаления.глицерина"спиртом полученную суспаязЕЮ фракционировали посредством многократно го суспондирования;и центрифугирования в смесях вцетона и : чатыреххлористого;углерода возрастающей'плотности, аналогично тому, как это'было .описано вше .'для получения влейро новых зорон.. Поело центрифугирования в •смеси;плотностью- - « 1,36 и 1,39 в вэдоседочнур хидкосгь опсодила фровдия крис--топлоидов о после 'заключительного центрифугирования при• •плотности 1,56 в осадке оставались более тяаолыо частицы --

глобоиды"с некоторой припасы» клеточных стенок и, оболочек^ алейронового зерна..Окончвтельная очистка фракции глобоидов-осуществлялась пропусканиеи ее "через стеклянный фильтрi.te 2-.^ и.ц0нтрифугиров8нйемфильтрэт8, ■ . - ■•>

Выделение белковых фракций»' Фракции альбуминов и гло-булиноз из алейроновых зерен и:их частой получали либо,эк-:: :стракцией 10$-ным растворси NaCI нэтрЕС-глициновои буфа-:pe;pH--.v8,8.Vc;посаедуицай диализом против дистиллированной ; ■ води, либо последовательной экстракцией водой и Юуб-ныи'-, раствором NaCI; . ~;v:'y <;-'- - . '

Разрушение-надмолекулярной структуры белков но ,субье2д-ницы проводилось в присутствии 6 U'мочовины на 0.05 Ц трис-глициновом буфере.(рН - 8,3). •> . :

Количественное определение белков проводилось по мето-v :ДУ Лоури^(л^ .¿ожгу eiral;,I95I).:> г ~ „ > •

Эдектрофоретическое разделение белков в полиакриламид- _ • ной геле. Электрофоретическов разделение;белков алодроно- :--вых.зерени суммарной глобуаиновой фракций созроввпЕзос семян .клецовиш проводилось с использованием микрометода верти- " [ квльногаiдиск-электрофореза (Сафонов,-Сафонова, 1971).

. . ДЫ¡выявления(белков фатин-<3елкс1вых комплексов применяли^"модифицированш1Й намиУфикса'тор (0.1%,'раствор" Na?l£oO/ в -т

Гли»»протеиды вгелях.идентифицировали при помощи реактива' :Иифф - иодная кислота ( Morrison, Woodlock ■ ,■ 1969)

■ 'Определение ферментативной активности. Фосфатознуи и-фат88Нуо активности, определяла ,по методу Гиббинсв иНорриса

.-(' Gibbinaif orris -^^-^у'ИбЗ);-. х 1 *""

fr'mwem^ojiSpipsto*- при определении активности кислой -фосфата'зы,в полиакриламидном геле использовались фосфаты зе-* мецонныхнафтодов <(.-.• Alien at'al..-..-'-v , 1963). ; -

- .-7.

Выявление протеолитической активности в гелях,.осу- д. цествлялось с помощь» синтетических субстратов : И, л. - бен-. '8овд - аргинин-- J0 : - нафтиламада:и :.глойцил-^-нафтидамида ( Reidel, Vfünscii , 1959;

Sc and alios , ' , 1969). . ' , ,

Определение фосфорных соединений, нуклеиновых кислот и катионов. ! Количественное определение•нужлеиновьк кис-*-лог в сочетании с определением каслоторастворимого и 'лвпвд. ного фосфора проводилось по методу Шмидтаи Тангаузере-в,-описании Курашинз,„Нетупской и Конарева (1967). ■ ----------

- «итин кн'кислотных вытяяек осаждался?.F оС13 в при-сутстши каталитических-количеств ионов • s о|~ ( Anderson t-1963; Соболев, 1966). ' .

Количественное содоржание фосфорной кислоты опрадо ляли колориметрическим. методом по Сиске в Суббароу (Fisko,, ¿

Subbarcw . , 1925). , **

Количественное содержание калия,'натрия,-кальция оп-г -ре делили. методом пламенной фотометрии ..(Алексеева, 1965), магния - фотометрически с использованием м8Гнезона 'ХС;ч." (Соловьева, Евтодиепко, 1968). • . ^ .

Матсриалы и методы иммундхими'ческого исследования.^ Иммунные сыворотки получали посредством.внутримышечного -введения кроликам белков с адыовантом Фрейнда. Инъекции • > проводили с-нодвльцым интервалом 8 раза. За весь цикл' •внутрвмызочных инъекций кролику было введено 80 мг белка г антигена. ' - "

В качестве~бел ко --антигена - использовалась суспензия -кристаллоидов-в 10% растворе Н аС1. Двойную.диффузия проводили по. методу Ух гор л они ( - Ouchterlony •. ¿ ,*I959)";-в слое 5^-пого полизкриламидного геля, содержащем 10^' 'г îioCI (Сафонов, Сафонова, 196*0. . - - „'

Световая и электронная микроскопия. <2итгг»»ппп ш*.--

факсе юрой Шмидта (97 мл 70^ .зтанода > 3 "мл ~4СЯГ$ормоль-, дегида). В-качестве красителей применяли ртутный бромфепо-. ловый;-синий - на белок (Иванов, 1963) и толуидино'вый синий-фитин-(Пирс, 1962). , - : , / V; .V-

. Для электронно-микроскопических исследований материал фиксировали в смеси 2$о-ного формальдегида и 2^-ного глута-, рольдегида в фосфатном буфере рН - 7.2 с послодуюсей до- . 'фиксацией I.5$-ным роствором четырехокаси осмия в фосфат- • .ном-буфере рН'-7.2. ,, , . г" . ;

•г/-/; //Материм после'спиртового обезвоживания заключали в \ 1дуркупан или эпон. После контрасхирования Влнасыценном .г •. растворе уранилацетата в 70$ этаноле в течение 30 мин. , ив растворе лимоннокислого свинца в течение 2-3 мин. ( ' ЕоупоЫв - , 1963) срезы просматривали под /

электронным, микроскопом Тоб1в , Вэ 513. ' •

V АЛЕЙРОНОВЫЕ ЗЕРНА ЗРЕЛЫХ СЕМЯН КЛЩКВИНН И - ЛЮПИНА, КАК ВЦВСТ1ШЦА-РАЗЛИЧНЫХ ФОРЫ ЗАПАСШХ

, ./бклкоб и фитина-

/Исследование клеток эндосперма зрелых семян клещевины : показало, что онк содержат значительное количество алейроно-" вых зерен,, размеры которых варьировали в аироких пределах ' от I. до 10 и боло о микрон. Уже при увеличении "саетового микроскопа удается наблюдать основные компоненты алейронового -зерна-кристаллоид, глобоид и аморфную зону. / //

; ./Дальнейшие электронно-микроскопическиеисслед вводили более детально изучить структуру алейронового зерна. Центральную часть алейронового зерне-семени-клещевина,аани- . мвет-кристаллоид, который значительно отличается по структуре и электронной плотности от окружающей его аморфной зоны. .Наиболее гетерогенным в структурном отношении является глобоид.- Было^установлено, что глобоида могут присутствовать по одноцу^ занимая в алейроновом зерне терминальное подоже-, ние, или 'по нескольку - в массе "аморфного:балка.1 При помощи модельных, опытов'с препаратами фитина была установлена ло-

•• ......*.. .ч .'.... . - ' . ' . • . • • . ч • - • • ...... т

V "

Г~:сГЛоГГаГ n8aSp-CK3„ часть гл^оада, ; Л. ^"ыягкий глобоид") "образована легконэбухвюцим в воде ве- - ,,

неизвестной природы.,Глобоид окружен полочкой • нал чие которой было установлено в специально проводенш* -■ опытах. Все алейроновое зерно окружено одинарной мембраной.

Алейроновые зерна центральной часта сомядолой люпинв поедетавяяятсп гомогенными образованиями, не' содержания включений и равномерно окранвввющамвея.броифеноловым сияют*.-при яввидояи иод световым иакроскопой. Однако, еаектрошш-; иикроскопическае исследования выявили значительный структур- -ный полиморфизм алейроновых зерен семядолей люпина. На ос- N нова ива проиьаншас исследований можно, jomao выделать ' три типа алейроновых зерен: I - гомогенные образования - -. округлой формы, имеющие собственную мембрану, ассоциированное о молкииа элокгроано-прозрачными-образованиями неизвестной природы; 2 - алейроновые эерна-с крупными включениями с низкой электронной плотностью, представляющие -собШ, пог vзадамоиу, остаткагвакуоли^Еззаподненныа белком;,3 - алейрот: V новые зорка неправильной ", угловатой формы с многочисленными мелкими глобоидами. 4 '; Проведенный нами анализ выделенных фракций алейроновых^ ¿open семян кяадевины и люпина показал,: что она содержат . , в качестве.основных компонентов белок и фитин,.причем содер-'жаиае иослодиаго у олейроновых зерен-семян люпина , значитесь-,

но мешае (табл. I).

i. - - Таблица I ■' "

■. Хваацасхпл состав.выделенных алейроновых эерен'самян люпина (в % на сухой вас)

Обьзхт - ... - Белок . . Фитиновая лУглево- Катио-'_: • касдота • ды_ны

'АлвЯрововио зерно: . ' " . *' ~ '

. Хлестаны , 73.2 ' 10.3- ' 3.9. 2.8 V

1юпий8 ' - • 80.0 ' 3.8[ 1 - ч , 1.9' -

, Л'Проведенный нами анализ поквзад, что большая часть 'белков алейронового зерна клещевины представлена кристаллоидами (в среднем до 65$), аморфная зона содержит значи-у тельно меньше белка (30$)' и около 5$ белка алейронового .-зёрна находится в глобоадех. '

Виэиих исследованиях было проведено изучение белковых спектров алейроновых зерен,и юс частой но уровне как целых белков,- так и составляющих их субъединиц.; ;

-'„„• Вразулиаге анализов с помощью электрофореза-в по-1 •ди8крап8мидшы'геле можно заключить, что белки алейроновых зеран'лредстзвлявг собой ^многокомпонентную систоцу, : причем отдельцыо части алейронового зерна.существенно. л. различаются как "по набору белковых компонентов, так и по ' их.относительному содержанию.

" Кристаллоид по ибору кислых белков является наиболее однородным - белки представлены двумя медленно движущимися компонентами, имеющими; очень;близкую элоктрофоретичёс-' кую подвижиость.,Что же касается присутствия нескольких катодных;белковых,компонентов^¿о пока нельзя"с: уверенное тью'утверждать - отражает ли оно истинную гагёрогеняоегь-бэлков. кристаллоида, мигрирующих при электрофорезе к като- . ду, или же является следствием своеобразной диссоциации ■ кристаллоцдных. белков, в кислой среде* > " V

о, у. Сравнительный электрофрретичесний анализ болков крис- ", талдоидов, возникающих в результате кристаллизации белка : в _ес1ественных условиях при обезвоживании семени,и крис- г.;; таляичёских глобулинов, полученных искусственно из суммар- ; ной белковой фракции семян, показал.идентичность указанных'. . белков друг другу.

; Эти.:данныо можно рассматривать как косвенное'подтвержде ■ ниа того, что кристаллоиды образованы основным солораствори-мым белковым компонентом семени и что именно этот белок .в первую очередь слеДуот считать,запасным. Пока мы не моодм, г однако, утверждать, что подобный бедок в семенах присутст- '*

BJQX ТОЛЬКО в форме КрИСТОДЛОИДОВ алейроновых зерен.

Наибольаую гетерогенность при электрофоретическом разделении показали белки аморфной зоны, которые экстрагировались из алейроновых зерен 70$ глицерином. Квк ухе отмечалось, белки этой зоны представлены растворимыми белками -альбуминами. Кроме того в этсй зоне присутствовали белки, условно обозначенные нами как "некрисхаллизувдиеся глобулины". Соотнозение указанных белков в аморфной зоне составляло соответственно 60 и АО56. ' .

Альбуминовая фрвкцая характеризуётся значительно большим набором как катодных, так и особенно анодных белков. Сра кцил некристаллизуюцихся глобулинов имеет, более бедный компонентный состав. Анодные белки данной фракции представлены дзумя отчетливыми компонентами и несколькими второстепенными. По компонентному составу катодные белки указанной фракции очень близки к белкам кристаллоидов.

Наконец, следует отметить некоторые отличительные особенности белков аморфной зоны. Нами было установлено¿:что в состав аморфной зоны, наряду с простыми белками входят также сложные белки- гликопротеиды, представленные тремя анодными и двумя негодными компонентами. . .

В этой se фракции были обнаружены белки, не осаждащие-ся в 7#-ном растворе трихлоруксусной кислоты. Эта белковая фракция' осаждалась из вышеуказанного раствора добавлением -Ha2UoO^ до конечной концентрации 0.2^. В составе "Мо-осая-даемой" фракции белков всегдв присутствовал фосфор в форме фитина, на основании чего она была предположительно идентифицирована нами-; как фитин-белковый комплекс. Последуодев сравнение белков указанной фракции с белками фитин-белкового комплекса, выделенного по методу Куртуа-и Барз ( Courtoio,

Barro ,1949), показало, что как те, так и другие белки , имеют ярко Еырахошшо основные свойства и обладают одинаковой электрофоратичоскоЯ подважность». Ддп фиксации этих белков в полиацридзмадцом голе был разработан специальный метод

■ основанный на их осаждении солями „молибденовой нислоты в кислой среде.

-в дольнейиих своих опытах с диссоциацией белковых "г; молокулалойронового зерна до субъединиц в концентрирован-'ных'растворахгмочевины мы пытались выяснить.- не являются^

• ли белковые 'компоненты аморфной зоны составными .частями

. более^сложных белковых агрегатов;1фист8лл0ид8,-утрэтививх при'кристаллизации й образовании четвортичной структуры ■ способность растворяться в воде. , ■ . ч - .

Почти*все субъединицы белков кристаллоидов совпадввт.-г-

• по электрофоретической подвижности;с,диссоциированными.. гбелковыми.компонентами аморфной /зоны и .отчасти {-глобоидов.

Возможно, что;образование четвертичной^структуры кристалло-' идных/белков может происходить на.базе;вл^уминов-аморфной -зоны. Однако,вместо. с тем ш обходимо/отметить,"что белки• • .« глобоидовГи аморфной зоны, в целом,боле ё сложны/по/компо-- > нентному;составуи ишвт/собственные . присудив только им.

•компоненты. 7 . :^

Белковый метрике алейронового зерна семян люпина в от-- , личие/от¿клещевины не дифференцирован нэ крист8ЛЛ0иД;Н аморфную 80ну,"и белок присутствует в.нем в некристаллической фор- г ме. В;то/же/время•анэлиз показал^ что'алейроновые зёрна яю- : пина содержат/эв: же белковыё фракции, т.в. альбумины и.гло-. булины (соответственно 30 и 7С$).«

Результаты электрофореза белков в пояиакриламидном ге- -ю- позволили.установить, что белки.глобулиновой фракции представлены/несколькими компонентами с«небольшой электрофоретической подвижности), ИЗ; которых: особенно отчетливо вы-, делятся два. Исходя из данных Баултер1а (1970) . можно предположить, что один из этих компонентов является/легумином, •а.другой/-/вицилином. Три компонента с меньшей электрофоре- ' тической подвижностью, по-видимому, соответствуют продуктам ' их полимеризации.;Квк и в случае клвцевины,;:Ьреди анодных белков на «большую' гетерогенность показали альбумины,/кото-"

' • - '.Л; V' ï"- ' Г 13 *

pue биди представлены примерно 15 компонентеми, причем электрофоретическая подвижность их варьировала в значительных пределах. Катодные белкиЬ как альбуминовой, так и глобулиновой фракций,имели более бедный кошоненгный состав.

Другим важнейшим структурным компонентом алейроновых зерен является глобоид, который представляет собой центр накопления основного запасного фосфорного соединения растений - фитина. Немногочисленные данные (Соболев, 1966;

Lui,. Aitschui , 1967), касающиеся химического состава глобоидов,пуздализь в уточнении ввиду несовераенства : методов, с вомощыэ которых изолированные глобоиды были по- , лучены. В соответствии с этим нами была разработана методике шолвровашт'глобоидов, обеспечивающая лучшую сохранность структуры и химического состава глобоидов, после чего мы смогли перейти к химическому анализу этих образова-пий. ' V ; ' . "'*; . ■'

В табл. 2 приведены данные о химическом составе глобоидов алейроновых зерен зрелых семян; а также семян, взятых на 35 день после цветения (в период формирования алейроновых зерен).

• ' . Таблица 2.

Состав глобоидов алейроновых зерен семнн клещевкны (в % на сухой вес)

Возраст онмян

|0осТоГ * КГ- Белок Катио-_ - • ' лота • ___

вы

25 денл.с

KàMOES nts-

ни л - 0,6

Spotuo c7mj-. пз сяодц

36.2 г; 8.7 1.6 9Л -61.1 0.8 0.1 4.8 13.8

Из -двигав:,'- приведенных в таблице," южно видеть что глобоида чпейронов« зерен зрелого семеш, представлены^'

• основной, фитином, что 'согласуется с результатами, получен- . /ными:рз'нво:прй> цитохимических исследованиях.и определениях

• химичес"кЬго}'состава ввдоленнш глобоидов алейроцовьк.-зе рон,--З нааихопитое Taíoso било обнаружено в глобоидах зрелых' ;сомян клоцевины око"ло;5^ белгег. Содержанке болка-в^глобои-дах ;фориирующахся апе йроновых з ере н; нёс колько вьп е ¿■хотя, в:. •целом;уровень его остается незначительным.;В глобоикэх алой-

• роновых .зерен^зрелых. семян присугсгвупг -гв^е РНЙ а "фосфо-iлипоиды^" однако,содержание этих групп/ващвств здесь очень

низко "( соответственно 0.1; и 0.8$). Глобоиды" фориярупцахся /алейроновых зерен,* ввделоннт: из .нёзрелж*семян,сувдствен- -по различались-по своему химическому составу от|гл0боидов • адойронов1лс":зорен-зрелого семени-в характеризовались. значительно ' более" высоким - содержа ние м'белка• фо сфолйпёадов < и; ооо-.

• бенно РНК.-Эти";данные; свидатедьствуог;в^пользу высокой ивга-.болити ческой активности глобоидов в '"периодформирования алой . роновых' зерон:'(оьх8бхоя не выясненной г природе "остаточной 1

фракции" глобоидов, т.е.'той их части, которая остается за * ;вычетом идентифицированных вёцесхз.. . . . v /i-4 \

/ Кок уже*отмечвлось вкае, по содержании"фитина алейроновые, зернэ люпина значительно уступают алейроновым зернам клещевины^ С;другой стороны,наблюдаемое отсутствие глобоидов у больней части£алейроновых зерен,-возможно,' было: связано i с иным состоянием фитина или Гиной;.организ 8цией i глобоидов.- -Действительно, в литературе имеется указания на то, что фи-тинможет: присутствовать в семенах бобовых в 'форме фа тин- \ белковых комплексов. В связи с этим представлялось важным, провести сравнительную характеристику' состояния фитйпа и белка в алейроновых-зернах, различающихся" по своему строению, в первую очередь'по.-наличию в них глобоидов. Мы считали целесообразным, кроме вышеописанных алейроновых, зерен клёцегвины и. пюпина, твкже исследовать алейроновые зерна семян горчицы белой, имеющие многочисленные мелкие глобоида в ^недифференцированной на'белковый кристаллоид и аморфную зону белковой • строме"(Бузулукова, Овешнико ва, 1972) и, следоватёльно.

• предо та ваяющие собой промежуточный тип строения.* - '-V.

^ В качестве-критерия состояния фитина:была выбран8:его' \ способность осаждаться солями молибденовой кислоты в кислот-,;ншс вытяжках.-Нак.уже;неоднократно указывалось ранее, осаж- ч " дземая при этом фракция была првдставлена^фитин-белкоБыми > комплексами";*: Осаждение: фйтин-белковж'кЬмплёксбв осуществлялось из 1^-ной*НС1-- вытяжки алейроновых зерен путем ^добавления и^МоО^- до конечной концентрации 0.2#. у

-. Таблица .3 • .

Содержание фитин-белковых комплексов в кислотных, : вытяжках алейроновых зерен различных "семян

Объект В % от общего .белка :• алейроновых зерен ' В % фос<; на) вых от общего &ора(фити-алейроно-зеоен

Алейроновые-зерна: • г клещевины 16.5 21Л - '

горчицы белой 20.6 л 78.1

• люпина желтого - 43.5 ^ 98.2

Из результатов,-приведенных в табл'. 3 можно"заключить, что белки алейроновых зерен семян резных-растений^сильно " различаются по способности. к обр8зованию комплексовсфити- ' нш. Так, если у клещевины значительная часть фитина* нахо- ...■•• дится в свободном состоянии и лишь пятая" часть способна образовывать кошле кс с "белками, то у: люпина-наблюдается об- • ■ ра тна я кар тина к прзктачески, ве сь гфитин; прису тствующий,

кйслотнэЗ' зытяжко^ осаждается солями (молибденовой кисло- """ тц. Промежуточное;положение занимают але}фоновые зерна горчицы белой, что,-зозыодно,'.находится в'соответствии с ука-зонным вино типом*их;строения. : Г- • .

Катаонк&Гсосгов алейроновых зерен» - Наряду о хииачес-: кил состоянием фитана также: представляло 'интерес¡выяснение •• -.'катионного, состава.;алойроновых; зерен; имеющих различное 'строение . Проведение -узкого исследования представлялось•це-'

ле сообразным ввиду немног очи слонности да нных о содержа ни в.^ отдельных?катионов и распределении их в пределах.8Лойронов0-го зерна.-Вместе с тем этот вопрос имеет значение для пони- -мания физиологической цонноств глобоидов. Поскольку больвин-ство-исследователей в настоящее время рассматривают фитин,^ как кальдиевотмагниевую соль; можно было ожидать', что эти : а катионы будут содержаться в глобоидах в наибольшем количост-' ве. "

\В табл. 4 приводится относительное содержание ряда наиболее распространенных у растений катионов (К, Ыз , Са, Яв) в'алейроновых'зернах зрелых семян клещевины, горчицы и люпина, а -также ¡в глобоидах адейроновых^ зорен "клещевины. ,

Т, ^'''Î'I- - * ' .' - Таблица 4 :

-.Содержание .катионов в алейроновыхзернах семян

¿t'V'fK". (в % на сухой вео) ■'■.}' .V\ i •

Объект; . ' На К' Со. Сумма ;

Алейроновые зерна: . . '

люпине желтого 0.07 ' 1.29 0.13 0.36 1.85.

горчицы белой 0.06 1.12 0.21 0.86 2.25

клещевины 0.04 1.57 1.04 0.12 2.77

Глобоиды алейроновых . ' ;

зорен щвттш-\:у. ОДГ 7.28" 5.80 0.58 I3.7S;

Данные, приведенные в табл. 4 не согласуются с ранее существовавшими представлениями-^ катионном составе фитина, -к8к Са," -Мб* - соли фитиновой кислотц и соответствуют болов поздним исследованиям, проведенным с глобоидами и целыми!' алейроновыми зернами хлопчатника, показавшим, что калий яв- . ляется преобладающим катионом в этих образованиях^ Lui,

Altschul , 1967; Асамов, 1972);

;гПри этом выяснилось, что суммарное содержание катионаз в глобоидах,пркмерно в 5 раз превышает содержание : катионов вцогыхэлойроновшс зернах; .что указывает на локализацию ка-

У; . .-„Л- : ' -О \ \ Л

,'тионов в,глобоидах. - ■ . .'.

' Не основании приведенных донных можно заключить, что. глобоиды содержат наиболее физиологически активные катионы. -.Высокое содержание -фосфора иметаболитнчески активных ка-~ Ч Дтионов в глобоидах алейроновых зерен говорит о важной ро-•; ли этих образований в развертывании ыетаболитичзски актив- ,,'; -ных процессов при переходе покоящегося .семени к пророста-ни»: . .-д ' ' ; ""

;'Изучение некоторых гидролитических ферментов алейроно-

- в ых зерен зрелых сеиян кдатвины и лапина. Для правильно- ",' -го понимания.физиологической функции4алейроновых зерен ;,

'- представляется важным изучение ферментов алейроновых зерен:*У как,в зрелыхсеменах, так и при-их прорастании. 4

; -V Из приведенных в табл. 5 данных видно, что алеПроно-: вые зерна овладеют фосфагазной активностью, которая приуро-.* • чзна, в осиовн6м,/к аморфной-зоне; . , ;'. >

- Таким, обр азом, кислая фосфатаза,локализована преиыу-цэственно в аморфной зоне алейронового зерна, представлен-*;'; -ной,как уже отмечалось, вльбумниэми^ и некрастоллизуюцимися . глобулинами. Что же касается'кристаллических глобулинов -"семян (кристаллоидов), то в алейроновых зернах они обладают* линь слвбойГфосфатазной вктивност'ью. С другой стороны, . , фитознзп активность в обеих частях^алейронозого,зерна очень --незначительна. • •• • "■'■"•."'-"•; " ; '—тп-

х; -. В связи с "тем, что аморфная зона алейроновых зерен кле-цзвины представлена двумя белковыми фракциями, нам казалось: . важным'выявить приуроченность' фосфвтазной активности к<той: *':или иной указанной фракции аморфной зоны.,В качестве суб- \ '

- страта применяли:"фенилфосфзт, поскольку, как ото било пока-Узано-(табл; 5), этот субстрат с на'ибользей скоростью гидро-. , ;':лизов8Лся фос$агаз8ми алейроновых зерен. , ,

{;* V Данные в табл. 6 убедительно говорят о преимуществен-, л Дной локализации^к?чвносцикислой_4>айфатазы в альбуминовой , - Еег^зла-л«луя »СявлюяозI

" • ■>-, .-Д-яика Сохивз.|

Л^«-:.-, ^Пх!. А.

Активность"кислой фосфвтазы в:алейроновых-зернах клещевины и люпина?( в1 единицах -. активностимкг -Р/час/мг белка) , / :

- Объекты - • •Субстраты,

" - • - Фенилфо офат; в-глкцеро- -; *' • \ - \ фосфат-. ■ т"' "' -V- * "•« "" " Фатин ••• .. ,«-...••• • л- ■ - •>

Клещевина "»'"",. > « * ' А --■ -

Алейроновые. зернэ- .*.-. Аморфная зона Кристаллоид-*' ; ' 48 ;о 53.8', - -8.6 37.3 - 45.0 ; - 1.4 -- 3.6 5.4 V 0.7 .

Люпин . - *

Алейроновые:аерна -;7 • Альбумины-- ■. ' Глобулины,- / _ * '84.8 168.0 ' 53 .6 40 ^8' 15.4' " 4.0 . " 15.0 - 3.1

. ---------------..*. ,."-,. ТобЛИЦЭ С

Распределение активности.-кислой фосфа'тазы ваморфной-' " . зоне алейронового зерна "клеэдваш

Объекты

• Активность '. - Содержание в'мкг ?/час/ыг.белка -белка (в % о? ----- " - - , белка аморфной - - - * зоны) .

■-Суммарный, белок

;Альбуманы' ;

Искри стэллпзуюгиеся• глобулины '-

' 54.7' 250.0 '

- 1715-

1С0 56

\\

*-- *- * " \.r "'v-'^f*??^4

• фракции алейроновых 'зерен кдеаэвины;;

. /. - выявление $осфа«зноГ вш'шооя; проводилось ноли , '" также в полнакрилоиидном геле после/электрофоретического .'■■-разделонпп белков в щелочной и кислой буфер них системах. , . Было показано, что,анодные и катодные спектрыфо сфатаа!' ал ь-.>буминов аморфной зоны представлены соответственно тремя и

•.....Четырьмя формами,ферментов. Анодные компоненты некриствп-

лизуюцихся глобулинов".представлены двумя компонентами.

Белки алейроновых."8вран люпина, не содержание кристол-- личе ских глобулинов *чв1форыё кристаллоидов, также- обладают ->•• низкой фитазной;актявностью, однако,1'вктавнос'ть кислой фос- -.:фатазы здесь.значительно вше, чём-в 'случае клещевины (табл. 5). Наряду! с альбуминовой фракцией'значительную долю фосфз-тазной активности можно :было обнаружить во фракций глобула--,

Проведенное нэмивыяздение фосфэтазной активности после _ элсктрофоретического разделения альбуминовой фракции алвйро--' новых зерен;люпина позволило установить среди анодных бел-! j'.kob пять компонентов;!при-этом было показано, что найболь-. " ¿/•пей активностью при: визуальной оценке обладали(компоненш -

'с'относитёльной элекгрофоретической-подвижностью (О.Э.П.)' ^равной 0 .23 и 0.27. В пределах глобулиновой фракции,вследст-i/ вии; нечёткого розделения(белков при электрофорезе,мы не мо- : -З. жем определенно говорить о роспределёнии; фосфэтазной актив- ; " ности между^отдельными:кош*онентоми.: . .'•'•. - <•:'

X - - Таким образом .[ элейронавиз^- зерна зрелых семян, ноза-;<1 висимо:от типа строения, содержат активную кислую фосфатаэу й-обладают херайненизкой фитазной активностью. Однако, не iS^JL®??'* ;ЧХ0-фв*8за: присутствует в;елейроновше зернах в ^неактивной форие и акгивируёгся-при прорастании семени, как : это-отмечалось дая алейроновых зерен кормовых бобов ruorrie't ; ot aii , 1970). - ' / "

Наряду с активностью кислой фосфат аз ы;иаип в вдейроно- •' ■ вих зернах зрелых.семян клещевины и люпина была установлена

протеиназная активность по отношению к синтетическому суб- : страту - N,=1- бензоип ■ ¿¿1 - аргинин - £ - нафталоыи-ду, субстрату используемому для выявления протеиназнод активности ра стенай. ■ ■ -. .

_ Протеиназная активность по отноаепаю-к-указа иному 'субстрату была выявлена на злектрофореграммах белков альбуминовой фракции алейроновых зерен. клеиевины и лопана и было в обоих случаях связана с однам^компонентом, имею-, щам О.Э.П.- 0.42 для альбуминов клецеваны и О.о.П. - 0.55-

• для люпина. ' -.-•'.-'■. .. ..

. Кроме того, альбуминовая фракция алейроновых зерен люпина обладала-аманопептидазной активностью по отнозенаю к синтетичэскому субстрату 1 -лейцал- р -'нафтиланаду, ' что4 указывало на прасутствае в-ней лейцанаманопептидазы ( Сохаъага оЪ а1. , 1959; БсасйаИов , 1969).,

• Указанная активность обнаруяавалась в:двух' белковых ком- - ; • < понентах, 'и1т>пз1х близкие значения О.Э.П. =,0.44; 0.47.

Вопрос,о"ферментативной активности запасных белков . имеет болылое значение., так как в завасаыости от ответа • на него, запасные белки можно рассматривать либо только.,-как инертный питательный материал, аспользуемый при прорастании семян после ..предварвгального гидролиза для-построения новшс белков, либо такге и как кагалатаческую систему лазосомпого типа,:участвующую з гидролитическом расцеплв- -ниа запасных продуктов ,-■ отклэдываекал-в-алейроновом.гор-

' Нв'. V. , ... " V'..

Но -основании- опытов "с залзонцхг бвпхьил аз млн, полу-, чанных з усаозкяА^всключеюасг дзнатурэаш. б?яиов сргаки- • ; чесании растворателпиа," было докезгно, что,глоЗуяинсши* . фракцаи- сеыпн обладали .фзрмвктативной'.ектйЕносш) (Зрвто- • вич и др., 1954; Кретович, Смирнова, 1957),

*. " : -На осноззяиа этих дгняй-:;Кретсаа'ч с-сочруднинс.'.а ; 'сдалапа- вывод,' что-у семян отсутствуют бочка» выпояндацие 1 исключительно/запасную функцию-и, что- семене'не киеют'нотабо-

литически: неактивных белков. *

V..:-- Однако, Давивлсбнч(вап3.о1ооп - , 1956) в препаратах*гло-булинов семян, гороха,не обнаружил, фер'ыентптивной активности. До сих' .пор вопрос-о феривнготивной активности запасных белков зрелых семян остается ..невыясненный;'/-' ¿у.*-'/

' В насих исследование в ходе,выделения чистых алейроно'-г--вых аерен.'и/пх.'структурних компонентов-мивынуждены били-ис-пользовать органические,растворителиспирт, ацетон, • четырех-.-.хлористы.1.углерод)^.которые,согласно/указанию Кретознча с ... -сотрудниками,могли/привести к.денатурации белков.указанных образований и,существенно изменить гидролитическую активность ■ белков алейроновых/зерен --'альбуминов1 и глобулинов.

' ' В - ча с т ц о с т и,' значительно более.низкая гидролитическая активность белков-кристаллоидов.и глобулинов алейроновых зерен клещевины и люпина могла.быть.визЕанз больаей чувстви- • хелышстью зтих белков:к денатурирующему действия указанных органических.растворителей. С зтой^цёлью алейроновые зерна -и;слагающие.их.компоненты выделялись:в^глицерине, где была исключена возможность денатурации белков.-Сравнительный ана- .' •вив фос^втэзной активности по отловенив:к* двум субстратам-фенилфосфату/и. фитину/приведен^в;табл. Э.' '-'

Как видно из приведенных-данных; два соьерсенно различ-/ пых- метода выделения алейроновых зерен и их структурных ком-понэнтов'нз■оказали суще стве иного - влияния не активность ки о-лой "фосфотазы. и фитазы в белках алейроноык зерен. - .//

У белков кристаллоидов, выделенных из алейроновых 8е-' рен^ полученных з глицерине, наблюдается некоторое "увеличе-.. нив активности>кислой "фосфатвзы. Однако, в настоящий момент"', нельзя с .уверенностью сксзсть - связано ли оно с отсутствием л д е и ст в;щор г з н .гческ IX' р а с г е ор и те п е И или с .частичным загрязнением иопучениых«красталлоад6вбелками аморфней зоны, возмож-ним при давних-условиях зцделовия кристаллоидов. -

■ ■ Таблица 9

Фосфатазная'и фитазная активность алейронгоых зерен семян клещевины, полученных. различными методами '

Объект ■ . ; Фенилфосфат • ■■ . Ситин

Способ выделения алейроновых зерен

..... ^ .. - ^ .... Органи- , Глицерин , Оргоничзс- Глицерин

ческие раст- кие раство-

ворители рители

Алейроновые зерна 48.0 40.1 Кристаллоиды ; ; 8.6 11.3 Аморфная зона ' . 53.8 * .51.0

3.6 0.7 5.4

Л.О 0.8 5.7

В целом,наши исследования показали, чтр кристаллоиды обладают некоторой фосфатазной:активностью. Вместе с тем 'еледует признэть,что в алейроновых зернах; исследсвэнных нами растений, фосфатазная активность связана, в основном,с аль буминами. .•' ■ . .....■

Таким образом, алейроновые зерна зрелых семян клецевины и люпина представляют сложную гетерогенную систему как по своей морфологии, так а по химическое составу, причем различия.в физико-химическом состоянии белков соответствуют различиям в их физиологических функциях.* Так,белки кристал-.лоидов по ряду своих свойств (однородный химический состав, кристаллическое состояние, сложная четвертичная структура, нерастворимость в воде и буферных растворах ) следует отнести к истайно-запасным бедкам. Что касается ¿аморфной зоны,

то она представляет собой'физиологически активную часть алай

ронозого зерна, вследствие наличия в ней "гидролитических йзр центов (кислой фосфатэзы ипротеинззы).и сложных белков-гли-копротеидов а, возмо»во^'.фй1Ин-бвпковшс-;ко1шлоксов;' Боолвд-

пло'к?.«0пп?110,Ы0аН0 Рос°м«рив8ть;^как легкоыобплизуемые Запасные продукты, .используемые семенем в самом начале прорас-

тания. ' '

- В отличие от белков алейроновых зерен клецевины, белки алейроновых зерен лапина ю .различаются по своему физи-ческоцу состоянию (отсутствует разделение на кристаллоид и ■ аморфную зону), вместе с тем ив донном случае глобулины следует, по-видимому, рассматривать как истинно-запасные белки. '-'.V ' " ' '' ■ ■ -■:■-

: • Другой физиологически? важный компонент алейронсвого' " зерна - фитин-ыожет, по-видимому, присутствовать не только- ... в;глобоидах, но.может располагаться диффузно в аморфной зо- \ .не^и в.гомогенных алейроновых зернах-люпина, образуя фитин- " ■ белковые кошлоксы. : Л

Можно таюее предположить, что разпичные типы алейроновых зерен, наблюдаемые в зрелых "семенах люпина, отличаются . ^по'Усвоей,физиологической функции, как это имеет место в зер- ' ¿новке злаков (Павлов, 1272). Однако,.для доказательства это-;, го предположения,..требуются дополнительные, углубленные исследования. ч4 " " V ■ /

Л -. ОБРАЗОВАНИЕ 1! последующее сОР^ЛРОВАНПЕ ШАРОНОВЫХ ' -■ . - * : ЗЕРЕН СЕМЯН КЛЕЩЕВИНЫ.И ЛЮПИНА .

■ Как.было уже нами показвно, алейроновые зерно представляют собой довольно сложную систему, как в отношении строения»; так и химического состава. Казалось маловероятным,:что столь сложное образование могло. возникнут*. « результате ' высыхания ввкуоди - простого физического процесса. На основании данных, ''подученных при изучении изменений в химическом составе и структуре алейроновых зерен.в процессе их формирования, можно было говорить об активной роли элементе® самого Л алейроншого зерна-в накоплении запосного болкз и фитина (Прокофьев с сотр.,1967; Прокофьев, 1968). Так,определение содержания РНК в алейроновых зернех, выделенных из семян разного возраста, показало наличке прямой корреляции"между содер--жанием РНК в-алейроновых зернах и интенсивностью накопления ,

в нихбелка. Перечисленные данные наводят на мысль о том, ' что алейроновые зерна г или' их: структур ныв предаестввннаки' '.f пришшеюг'непосредственное участие в * сингезе коипоноипоз, входящих в состав алейронового зерна.;1аким обр83ом,гво-::. / прос-образования алейроновых зерен оказался тесно= связанны^ с вопросами'локализации центров' синтез а'запасных белков и фигипэ в клетке.* W

/ Рбнее проведенное изучение, образования алейроновых зерен :в эндосперме семян клеср вины при поиоди ^светового- ми- :i кроскопа (Прокофьев с сотр., I9G7) показало, что" указанный ;i процесс сводится к постепенному заполнению -вначале оптически пустых • вакуолей-белвом^7 при чем.этот-белок :откаадызаехся.: :вокруг гл об оидов, : с о держа щих. фиги н;, • 3 ти: данные : п в пр оти вр-речили.взглядэм.исспедователой; 'рвссиатрявявцях влацрово- , < вые зерна ; как высохаио вакуоли, а даже в какой-то степени . . служили их'.подтверждением. Однако, определенная последова- ; - тельноеть-в появлении отдельных структурно: компонентов алейронсвого оернау. а-также тот факт, что" белок появлялся v' на>поверхности глобоидов; допускало:ицую;трактовку получен-■.-шх' картин,: сводящуюся;к предполоаенпю. о наличии причинной -связи между появлением, глобоа'дсв. и синтезом запасных бел-; кга и фитина.-,

>: ; ...С целью болев:детального.неученая-' процесс• 8врохДения'= и и львеfixerо • фори)фов8вяя • éseSposjDsux^BeipiBB ме деввны о -

люпина^был лрослежё*Н:с1мадада'0лак^^ ' Д.

; ■■ •:. Было показ аио^ * что ■ в/перп о д Í "зепоррадо хвеннв.'пр ед- " V % яесгяувций появлению, в клетяахГссяреваю^^'свмяя -ххоцоза- i* ны.бзлков и фи танав:вакуолях /¿¿гяэ•на блюдзть * подале као многочисленных мелких/структурных?^

Jи.-электронной- плотности/;*сходншс^рабосомама -эндо'плазматй-; часкогоре тикулуыа. Этот .факт б ыл :eii е рв ио.у ст о н о зг.з ндл я \ семядолей льна; и-горчица (Бузулукова. Свевнккова', Д972);-: Наблюдаемые' частицы, были "условно -ваз взвы .-"поаясэмоподобны-ï ми;частицами"; Проникновение этих частиц.в вакуоли, обьяс-

няется авторами распадом но определенных, стадиях ранее;1не--;прерывного тонопластэ кз отдельные фрагменты. Сопоставление-;; наблюдаемых картинке рибосомами эндоплазматическогоретику-лума цитоплазмы делает вероятным предположение о рибосомаль-:ной:природе, рассматриваемых образований. . . * '

Накопление пояисоиоподобнцк'чостиц в вокуоло совпадает по времени с уменьшением числа мембран гранулярного эн-доплазматического;ретикулума в окружагкдай цитоплазме, что .'дает основание "предполагать, что "указ энные-структуры обра-" :зованы полисомами, связанными с мембранами эндоплазматичес-'кого ре тикулу на или. их фрагментами, "проникаюцими в вакуолю Л13 окружающей цитоплазмы. Возможен,"/однако,, и другой путь "проникновения полисомного маториала'.в вакуолю путем инва- * гинации участков тонопдоста с эргастоплозмой в вокуолю с ^посдедуюцим их отшнуровыванием а переходом содержимого в -вэкуолю. . ... ' ' ' '•' ' ^

: .; Следующим вгшшы.этапом являегсяпоявление глобоидов.-В этот период, по данным Бузулуковой и "Свепнаковой (1972), -полисомоподобныо; частицы, расположенные диффузно в вакуоли, группируются, образуя плотныо скопления; в которых возникают', мембранные; образования различной, формы и величины. Из у чо- л .нио:судьбы этих образований показало, что они представляют собой но что иное, как зачетки'буфцкх глобоидов. ' f

Хотя аналогичные картины образования глобоидов иногда -^наблюдались в 'эндоспормо клогцевины; наиболее типичным,; по напим данным,tбыл .другой.путь формирования глобоидов. По- . -следние обычно возникали.на; границе.вакуоли-и прилегающей < ^цитоплазмы в.виде характерных инвагинаций цитоллозматиадских мембран внутрь вакуоли и значительное время сохраняли связь ~ с цитоплазмой. Аналогичные-картины ранее были отшчены Соболевым, Свеинвковой и Кваицовым.(1968). О глобоидной природа V этих образований свидетельствует накопление внутри этих обра* зований вещество, обладающего высокой эта ктронноа плотностью и идентифицированного нами ранее; как фитин. " 7, 1

-.^--Последующий :этап* формирования «алейроновых зорен-сво- * :дится к одностороннему, обрастанию глобоадз-белком., О^раща-Г;-ет -на; себя внимание:также исчезновение-ко. данной фаза сво-:—. ;бОД1ШХ;;ПОЛИСОМОПбДО

г нар овоиия{алойр'оновшг зерен'эти.обргт с 'мембранами-глобоидов .в упорядоченную: структуру, ичто -иио1шо;в такой- сочетании она приобретают* способность:к-сан-*, тезу;'запасных'белков семена.- Впоследстваа,. в /массе белков -• кристаллические глобулины, образуют'.кристаллоид. .::: •• V

: ч.Нв' еле дуюцах.этапах ; связь - алейроновых зерен с цато-- гс плазыэтвческамв момбрэнзма-утрзчавэегся.-В~этот период алейроновые, зерна ^приобретают'* черты;' свойственные -алейроновым / •г1> - з ернэм:зрелого семени; Наблюдаемые - на-рз шах- с.аз ох • фор миро- V -вант -алейронового I зерна? картины. (исчезновение-'полисоыопо- >*-. добных' структурги; последующее поязление глобоидов -в эксцентрическое, обрастание глобоида белком ).-на водят на мысль-Ч .чтогглобоид представляет „собой ..октивную систоыув отноае-нии "биосантеза запасных балков и фитина. '

.-: ::!'.>: Отложение: запасных?белков<в - клетках созревающая, семян 5 различных.растений может,- по-видяыоиу, осупа ствляться'раз- ; лачпыии путями. Так;эле'ктронномикроскопичоское. »исследова-^ ниа: образования; алейроновых!зерен в созров8эцах-.сомонах не- ;* которых'бобовых пок83 8ло,^что" отложение : запасных белков выданном случае происходят; строго по из из ране вакуоли- ; < тоноплэсту-и•заполнение-вакуоли белком, происходит,, такии образом,: по - периферии - вакуоли ■('-.-: Ор±к ' ; -1968; Баул тор, "*' 5

1970). . . — ..

' * -" „ ~

V;;-:.; Исследование,"образования ал еГгроновьж -.зерен-в.семядолях созревающая семян люпина .выявило сущзствеццыа^отлкчия в' хо-с де,- протекания этого проце сса- от"закономерностей;'отмочоиных" для* семян'йлецевйны. Было уствновлоно, > что,-началу-формирования ало йроновых зерен такжопредзествует-харокмрнап вакуоли эацая.клегок, семядолей. Лоз дне е-в- Еакуолях появляются отло- -

жеивя белка, локализующиеся по:периферии вакуолей (по*тоно-. ^пласту). В;продолах;згой обцой'закономерности наблюдаются ~ "гдовольно неоднородные морфологическио картины накопления „ .' бейса.! В первом случае!;модно выделить огложешь болка по ' двсеку тонопласту :в виде непрерывного"слоя вещества.:-В вакуо^ -^лях формирующихся семядолей люпина;присутствуют также: клетки ! с /несколько:иным ,типом отложения белка,Гхаракторивушдамся /прерывистым отложением белка по тонопламу. ,В ряда случаев. . --в. образуюцихся алейроновых зернах наблюдаются -ыолкие глобои-едо',*ра сполагоющиеся в болковой;мессеНе" исключено, - что в -< ... данном,сдучэаг отложение белка происходит.вокруг" формируюцих-/ся глобоидов, как,ото мы могли:наблюдать в о1!доспормо-клеще-'^вины. В период,'' соответствующий началу отложения ;белка в *

вакуолях,наблюдается мощно, развитый знд'оплазматический ре-! ->тикулум с ассоциированными; на/ней рибосомами и располагаю-";, щийся' обычно вокруг;вакуолей. Однако;(мы не смогли ноблга-'дать нопос ре дет венной связи'меж^'1 се тью эндоплаз маги чо ског о: ротякулума и;отлагающимся по 'тоноплоЪту "бе лком. * " ^ ■

- ~ Дальнейшее формирование, алейроносвш: зерен-люпина сво-" ; датся к постепенному'заполнению.вакуоли белком. Ыорфологичес

- ким выраконйоы "различных путей отложения.запасных белков и фитина;и является; по-видимому, различное'строение алойроно-

^вых зореп;з семядолях-зрелых.семян:люпинэ-жолтого, показан-нов"нвми ранее* / ■'-V--I"'--'Г

Однако^ наряду с ;;Отмвчениыми!.типами отложения белка "в вакуолях/созревающих:семян люпина;желтого, сравнительно часто в.центральных частях ;СомяДодей~ наблюдолось отложение белка в/Цитопдсзме'вблизи вакуолей. По-видимому,* аналогичный картины^наблюдалиТондле и Валер ,(-"•КопаЗ-о1- - V, 1838;"' . кДеЗ-ог ,1943) з созревающих.семенах.люпина и но основаянии .наблюдаемых картинпривла к выводу; что-алейроновые зер-: напредзтавляют/осадок белка в цитоплЬзмо. Вместе с тем на

- соседних;участках цитоплазмы^ наблюдается обычное отложение ■ . болка по тонопдасту вакуоли. В настоящий момент с достовер- л

; ност.ъю трудно сказать, представляют, ли опасанньв; картины

последовательные стадии одного процесса или же .накопление белка в вакуолях -можёт-идти несколько.различными пущий.; в отдельных "случаях можно наблюдать, что.включения бдпсо > ; f лежат не свободно в"цитоплазме,%а ограничены мембраной, не :/. связанной с рибосомзми. . - _ ' - ' :

^а'.оИз» приведённых^ .этой главе, да иных видно, что оброзова 'ние элейроновых зерен представляет сложный, многоступоячэ-. ■ т'ый проце ос," в то же время ♦ отдельные>:зтвп'ы. формирования ." алейроновых зерен семян клещевины и люпина существенно от- ' личаются. Основное различив.сводится к1,тому,"что у клецёви-пы процессы накопления-и,по-видимому, образования белка локализуются в вакуолях,, в то время 'кэк у люпина наряду с > \ вакуолнрныы 'отложениеи беяко отмечается цатоппазиатичвскиД-щть • образ ования алейронового зерна,.. причем з зовисииости's хот.пути образования, сформированные, алейроновые зерна эре-:лых семян_ люпина имеют различную.структуру.■ % . , , ; •,^

- ' ОБРАЗОВАНИЕ ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ В ЭНДОСПЕРМЕ ' ' ' СОЗРЕВАЮШ çsmi МЕШБШЫ Л

^ , - Для правильного понимания" происхождения запасных боп-~ ков необходимо выяснить вопрос о времени >на чала "синтеза з а-■ пасных белков в семенах.- —. ' - * •

В отдельных работах"делались" попытки -устаназить время

. начале синтеза запасных белков и сопоставить его с определен • ным {возрастным состоянием/кде тек семянПри этом исслодова-* тели ? основывались либо-на выявлении начальных этапов образо Vbohhíi 'ёлейррновцх зерен ( ; sain; forcer. . ; 1S66; : 1 ¿X- Brioírtyjot. al. ;: ,;IS_S9;^Банниковаi; IS?0) , -.что нодостаточ ^ноТввиду возможного несовпадения этого-процесса.'с начопоц -5 синтеза.запасных белков, либо fuá кзйонешш 'суммарного>' со- -"дёржания.Основных групп белковой в-первую очередь глобущ»-"

семенах'(Хоаодов$ и IS63; Базговв-; щенсний.Л ISôG ; Клиаонко,- ; 1969 ; Клиао нк о, • Высоко с, 1972) .*,v :рдна*0гсу|»и0ряцй • визлиз ;глобулицоз сеияя .баз/выявлена fi ' •

встацно^епасных бея&ов1*также 'предс^авьяохся нам нодоста'точ

ним для реве ни я поставленного вопрооа. Таким образом, во- . ¿рос о времени начала сантоза запасных белков в клетках созревающих семян требует дополнительного изучения с исполь ¡зовонием высокоспецифичного метода'определения запасных Ч ¡.-белков. 6 качество такого метода могли бы быть применены иммунохимичоские методы с использованием в качестве антигена запасного белка. -..■".Ч . : Что во касается вопросе о времени появления запасных -белков.в семени,'что. он, очевидно, мог бы быть ресен путем изучения серологических свойств.белков, и в первую очэродо .глобулинов, выделяемых из сомян разного возраста, по отношению к антителом вшоуказанной сыворотки.

; . •■ Дли получения иммунной-сыворотки использовались не ; ; целке алейроноЁыа зерна, а ввделопные из них кристаллоиды, .рассматриваемые нами как истйш-запасные белки; -

;Ми попыталась установить время появления запасных белков в эндосперма созревающих семян клецевины и связать .его;с определенным состоянием клеток эндосперма и в первую" :.очерадь с формированием в них алейроновых зерен.

.« Проведенные нами цатобиохимнчзскйэ исследования охватывали длительный период формирования эндосперма, шкшчая . фазы клеточного деления, растяжения и интенсивного накопления запасных веществ. Морфологическим отражением последней фазы является мвссовоо образование элейроназцх зерен в \ вакуолях.* Ч /-, ■

Сопоставление морфологического состояния клеток эидо-сперма созревающих семян клещевины с результатами элокгро- • форотичоского и иммунно-химического исследований глобули-< нсв / выдоленных из-семян того же' возрасте,показало, что появление запасных (кристаллоидшх) белков совпадает по "времени с появлением в вакуолях клеток эндосперма глобоидов На более ранних этапах созревания клетки эндосперма не содержали указанных белков. С другой стороны»сразнение белков кристаллоидов и кристаллических глобулинов из эндосперме /

Зрелого*семени- кпецеваиц;'.-.прозеденное'истодом двойной;диффу-'ъж'-ъ1 слое :геля,"показало- полную -их- идентичность и-,тем. самым :ю г твердая о денные электрофоретического анализа;. - ■ . _

- Полученные результаты свлдетельствуют'о тон, 'что появ-•.ькае- за по снюсо'елков: приурочено к определеиному-этэпу. соз-,7 р.зззн^'я'семени, :.совпа/,аюцов]( по времени с- "на чал ом.обрез овэ-^ -нил'алейроновых зерен. .<Эти>'дэн1ше-св::детбЛьствуат; против ■. представлений об алейроновых зернах как о-висоха^ вакуолях," .допускаю цих 'присутствие в в а ку ол яр н * с о ке з а па с ных • бе л к ов ; •и'фитина-задолго до кх кристаллизации в -результате обезвожи- / ваная' семени. . ~ \ - - • „ ' :

; Полученные:результаты'косвенным, образоа- подтверждают • ^прежние ¡данные ■ об;активной-роли -глобоидов'-в синтезе .белков, -*; хотя вопрос о месте синтеза запасных-белков'-в клетке- еще.не г« цолст считаться окончательно решенным... ^ , • •

выводы' ' * " ^

-.г■-11.-:Разработаны:методы.выделения алейроновых,зерен.из,.; семян, ^клещевины и ■ люпина, - о . также. отдельных"- компоне нтов :г алейроновых зерен семян клещевины.- ,

.V - ■-2.'По г своей структурной: организации'алейроновые зерна клещевины представляют сложную- систему, включающую'в- себя'гло бонд,-.-имеющий1-собственную":оболочку,-кристаллоид,":аморфную зону и общую иемброну. ^ . ' ' — -

ж'-.-..-:' .8. Химический анализ глобоидов алейроновых зерен, выде-; ленных - из зрелых семян клещевины,:показал,:.чтогони - состоят «Л в :основной'йз фитина,- который-следует-рассматривать-;как-кат" ■ лиево-мзгш:ево-:-:альциевую соль.фатиносол-каслоты.'Гпобоидц'-г^: формирующихся алейроновых -зерен -характеризуются более .висо-ким.содержашмм- белка,-• фосфолиполдов -а = особенио РНК. .Высокое • ,-содзр..-сднас- фосфора,;э-гтаклсег^егаз'ояитичаски -акта иных": кэтио--нов дает - основание рассматривать глобоид^- как -захное з-.бкзио--логаческо«; •отноие^ии :обрязовспиа . ;

1 'Л. Кристаллоиды алейроновых;зерен являются наиболее ■ .однородными по своему компонентному составу образованиями " и представлены преобладающими белками семени - кристол- -"лическими глобулинами". Идентичность -кристаллических глобули-. нов и-белков кристаллоида была установлено с помощью электрофоре тического и И1шунахишческого" методов. Химический состав, физическое состояние,'-отношение,. к "растворителям и ряд других^ '.свойств дают основание считать белки кристаллоида наиболее' л.' ярко виракенной формой- з8П8сного:белкв семян.

• - 5. Аморфная.зона алейронового;зерна представлена-аль-- ; буминами и глобулииакии обладоеТнболее сложным компонент- ■ ным составом , 'чем кристаллоид. В-этой.части алейронтого зорна, наряду с простыми, обнаружены/сложные белки -глико-протеиды, а токже_1белковая фракция ,/предотовяеннвя основны-д мя белками » обладающими способностью/обрвзокшать комплексы с фитином. - .-'-У С.""1;

6. Диссоциированные на: субъединицы .под воздействием мочовини../белки кристаллоидов, глббоидов;и. аморфной зоны I имеют ряд компонентов с одинаковой элекгрофорвгичзекоя под-.вижностью,;хотя. в -.целом, указанные "части; алейронового зор-, -

на различаются по набору и отлосительноцу содержанию отдельных субъединиц. : .

7. Алейронозне;зерна-.секян.-люпина.представляют собой -гетерогенную в морфологичоскоц отношении группу,.'включающую в собя. кэк-гомогенные/некристаллические, белковые образова- . .вив, так и формы, содеркац;1е .включения. Глобоиды алейроновых зерен лопана имеют значительно.мэньаие размеры, чем", глобоиды алейроновых.зерен клецевзны, но их в алейроновом •.'.зерне ; ■ как .прэвилод'больае ;V. • ' * "

. :: 8. Алейроногыо зерна севдн клецевиш и люпина отлячо-^ : ются между собой по "содержанию; и состоянию фитина и по спо-.. -собноста белке' к«образованию |итин-белковых комплексов. В • -частности,белка алейроновых зерен люпине! облодаыт более '- * высокой способностью к образованию комплексов с фитанох.

9. Алейроновые аериа зрелых семян кледевиш а ляпана, практически нняены фитазной активности и содержат кислую фосфатэзу, локэдизоваяну»,в основном, в альбуминовой фракции* В соответствии с этим, у клещ вины аморфная зона об-, ладает значительно, бодьаей активностью кислой фосфатазы, : чей кристаллоид. Кроме того, в альбуминовой фракции алейроновых зерен обоих видов растений было обнаружена кислая протвиназа, а у люпина - также яейцинаминопептидаза. ;

10. Образование и последующее формирование алойроно- ,. bus зерен в эндосперме созревающих семян клещевины представляет собой сложный, многоступенчатый, процесс, связанный,по-в идимому, прежде всего с новообразованием белка в вакуоли. Использование иымун¿химических■нотодов в сочетании с цито- . химическими исследованиями показало, что появление запасных белков в созревающих семенах клещевины совпадает с возникновением глобоидов и сводится'К синтезу качественно новых белков. В связи с этим предполагается, что глобоиду принадлежат ввжнэя роль в накоплении как фитина, так и белка.

II; В-отличие .от семян клещевины, у; люпиш существует ' несколько путей формирования алейроновых зерен, что находит свое отражение в присутствии у зрелых'сеыян люпина различных типов алейроновых верен.

12. На основании совокупности получениях сведений алейроновые зерна семян следует считать образованиями органоидного типа, что не соответствует прежним представлениям об алейроновых зернахг как образованиях, возникающах в.вакуо лнх клетки в результате их высыхенип.

- ; ; ' ■ 83'. mV;

. По материалам диссертации опубликованы следующие ' * .'- работы: '

- I. Прокофьев A.A., Соболев АЛ., Иванцов А.И., Борбвшова

А.К., Суворов В.И. - 1969. Фитин - белко- / ; ' вые комплексы алейроновых зерен семян. *•«

' ■ Тезисы докл. на симп. П.Всесоюзн. биохик. ?

.ч;,-/ съезда: 80, Тапкент . : \

.2; Суворов В.И., Бузулукова Н Л., Соболев Á.M., Свежнико-

• ' ва И.Н. - 1970.,Строениеи химический с о с— •

тав глобоидов алейроновых зерен семян кле- ' ¡ * " • язвины. Физиол.рест. 17,6: I223-I23I

• 'З. Суворов.В.И., Соболев A.M. - 1972. О катионном составе1, ; " ' алейроновых'зерен семян. Фиэибл.раст.,1 .

19,3: 578-581 -'v.vKv V. .. ■' . ' -';■;.-:'

;-4.'-Соболев A.M., Суворов В.И. - 1972. Образование и отло- ■ ' ' V кение;в запас различных форм белка и фос-Г

• фора в семенах. Тезисы докл. симпозиуме .-; ч, V "Физиолого-биохимические проблемы семено-

■"; ведения и семеноводства": 41, Иркутск. ..

; 5. Соболев A.M., Суворов В.Н.,- Сафонова U.П., Прокофьев 1 A.A. - 1972. Изучение образования запасшх

белков в эндосперме созревающих семян кле- , щевины. Физиоп.раст., 19.5: I047-I052.

..ч 6. Соболев A.M., Сафонова М.П., Сафонов В.И., Суворов В.И.-Алейроновые зерна как место отложения различных форм запасного белке и фшинэ в са-"менах клещевины. Тр. симп. "Транспорт и , . отлоаение органических веществ в запас у, ..; ' растений" Владивосток, 1971 (в.печати) .

< 7. Сафонов В.И., Сафонова U.U., Суворов-¿.И. Об условиях ^ . '--'проявления кислых фосфатаз' (3,1.3.2) рас-"чтений не электрофореграммах в. полиокрила-...... ; миднои геле. Сб. трудов Всесоюзн. семинара

"Методы электрофореза в полиэкриламидном геле и их применение в биологии, медицине, сельском хозяйстве и пищевой промышленности", > • Москва, 1971 (в печати). • ' .

Материалы диссертации докладывались на П'Всесоюзном;.!'; биохимическом съезде (1969, Ташкент), на Симпозиуме "Транспорт ассимилятов и отложение веществ в запас" (1971, Владивосток), на Симпозиуме "Физиолого-биохимические проблемы семеноведения"и семеноводства" (1972, Иркутск).

Т 00662 от 24—1—73 г.

Эак. 116 ТИР. 300

Ж МП в ЕИ 3 С X