Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура гена новой металлопротеиназы Bacillus intermedius и регуляция его экспрессии
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Структура гена новой металлопротеиназы Bacillus intermedius и регуляция его экспрессии"
ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»
На правах рукописи
САБИРОВА АЛЬБИНА РУШАНОВНА
СТРУКТУРА ГЕНА НОВОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ BACILLUS INTERMEDIUS И РЕГУЛЯЦИЯ ЕГО ЭКСПРЕССИИ
03.02.03 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Казань-2011
1 7 ФЕ8 2011
4854383
Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии биолого-почвенного факультета ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет».
Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор
Шарипова Маргарита Рашидовна
Официальные оппоненты: Доктор биологических наук
Коксин Владимир Петрович
Ведущая организация: Казанский научно-исследовательский институт
эпидемиологии и микробиологии
Защита диссертации состоится «24» февраля 2011 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д.212.081.08 при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здание, ауд. 211. Факс 8(843)238-71-21,233-78-40. E-mail: albina-12@mail.ru
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского федерального университета
Автореферат разослан «.¿¿О » января 2011 г.
Кандидат биологических наук Давыдова Марина Николаевна
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук
3. И. Абрамова
Актуальность. Протеолитические белки вовлечены во все основные физиологические процессы, включая регуляторный протеолиз, и являются стратегическими ферментами клеток микроорганизмов. По результатам секвенирования геном Bacillus subtilis содержит 62 гена протеолитических белков, среди которых 9 кодируют секретируемые протеазы, 13 -мембраносвязанные протеазы и 6 генов кодируют протеазы, локализованные в клеточной стенке [Rey et al., 2004]. Многие из белков, соответствующих этим генам, пока не выделены, их физиологические функции не установлены. В международных базах данных содержится обширная информация о фрагментах последовательностей геномных ДНК различных видов бацилл, в том числе В.subtilis, B.cereus, B.licheniformis и других, что позволяет проводить геноинформационный анализ по идентификации генов и сравнению фрагментов геномов. Особый научно-практический интерес представляют ранее не идентифицированные белки протеолитического спектра, что обусловлено необходимостью расширения общих представлений об эволюционном развитии этой группы гидролаз, и выявления новых, практически значимых, ферментов с полезными свойствами.
Бациллы в ходе эволюции выработали сложную и разветвленную регуляторную систему, в основе которой лежит механизм сигнальной трансдукции, а именно, сеть двухкомпонентных систем регуляции экспрессии генов [Aguilar et al, 2001]. Выяснение регуляторных сетей, управляющих экспрессией поздних генов, к которым относятся гены протеолитических белков, открывает новые перспективы в микробной биотехнологии. Молекулярные механизмы, контролирующие интегрированный ответ микробной клетки на изменения среды, в настоящее время изучены недостаточно. Вклад разных систем регуляции в клеточный ответ можно оценить с помощью мутантных штаммов с дефектными регуляторными белками. Способы регуляции экспрессии поздних генов отражены в структуре промоторов, анализ которых позволяет определить потенциальные механизмы активации транскрипции.
Целью работы явился поиск, изоляция и характеристика гена новой металлоэндопептидазы (mprBi) из фрагмента хромосомной ДНК B.intermedius и изучение его экспрессии.
Основные задачи исследования:
1. Установить последовательность нуклеотидов 6 кб фрагмента хромосомной ДНК B.intermedius, провести поиск, идентификацию и характеристику открытых рамок считывания генов, включая гены протеолитических белков.
2. Клонировать ген внеклеточной металлопротеиназы B.intermedius и провести анализ его структурной организации.
3. Изучить экспрессию гена тргВг в штамме, мутантном по регуляторным белкам Ое§8-Ре§и системы сигнальной трансдукции, контролирующей синтез ферментов деградации.
4. Исследовать влияние фактора транскрипции ТпгА, одного из регуляторов азотного обмена у бацилл, на экспрессию гена металлопротеиназы В.ШегтесИиъ.
5. Изучить экспрессию гена тргВ1 в штаммах бацилл, дефектных по Бро белкам, участвующих в споруляции у бацилл.
Научная новизна. Основной научный приоритет работы заключается в идентификации у бацилл нового гена секретируемой металлоэндопептидазы -первого бактериального гомолога эукариотических адамализинов. Установлена последовательность нуклеотидов 6 кб фрагмента хромосомной ДНК В.ШегтесИш, в которой выявлены шесть открытых рамок считывания (AN ЕШ78894). Впервые у микроорганизмов изолирован ген тргЫ, кодирующий внеклеточную металлопротеиназу В.ШегтесИш семейства М12 адамализинов/репролизинов клана метцинкинов. Получены приоритетные данные о зависимости экспрессии гена адамализин-подобной металлопротеиназы от Ве£8-Бе§и регуляторной системы, контролирующей синтез ферментов биодеградации, ТпгА фактора транскрипции, участвующего в азотном обмене, механизма катаболитной репрессии, а также об отсутствии корреляции экспрессии гена тргВг с процессом спорообразования.
Практическая значимость результатов. Секвенированный фрагмент хромосомной ДНК, содержащий ген металлопротеиназы В.ШегтесНиз, занесен в базу данных Международного ГенБанка (АЫ ЕШ78894) и может быть использован для сравнительного анализа генов и геномов. Результаты секвенирования полного гена тргВ1 позволили оценить последовательность продукта трансляции, включая сигнальный пептид и пропептидную область белка, а также провести его корректную классификацию. Получен вектор экспрессии рБА!, несущий 1,2 кб вставку с геном тргВ1 для выделения соответствующего белка и изучения его свойств. Данные о структуре промотора и контроле экспрессии гена тргВ/ могут быть использованы при конструировании систем экспрессии на основе модификации промотора для практического применения.
Связь работы с научными программами. Работа выполнялась в соответствии с планом НИР Казанского федерального университета (№ гос. регистрации 01:02.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования выполнены при поддержке грантов РФФИ №05-04-48182 и №09-04-99044, Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России» 2009-2013 гг. ПС № П344, ГК № П406, ГК № П323, грантом Академии наук Республики Татарстан №14-24/2010 (Г).
Положения, выносимые на защиту:
1. Изолированный и охарактеризованный ген B.intermedius кодирует новую металлоэндопептидазу бацилл, которая относится к семейству адамализинов/репролизинов клана метцинкинов и является первым прокариотичёским гомологом эукариотических адамализинов.
2. Экспрессия гена mprBi контролируется системой DegS-DegU, которая отвечает за синтез ферментов деградации, фактором транскрипции ТпгА, регулирующим азотный обмен при дефиците этого источника питания, и не зависит от Spo-регуляторных белков, участвующих в контроле споруляции.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005 г.), Международных конференциях для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007, 2008 гг.), Международном симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007 г.), Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008 г.), Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009 г.), Российской школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, 2010 г.), Всероссийской молодежной научной конференции «Современные биологические аспекты в фундаментальных исследованиях молодых ученых» (Томск, 2010 г.) и Итоговых научных конференциях студентов КФУ (Казань, 2005, 2007 гг.), Итоговых научных конференциях сотрудников КФУ (Казань, 2008,2009,2010 гг.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, из них 6 статей в центральных отечественных и зарубежных рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, включает 7 таблиц, 38 рисунков. Библиография содержит 208 наименований, в т.ч. 202 - зарубежных авторов.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю профессору М. Р. Шариповой за постановку проблемы, внимательное отношение к работе и плодотворное обсуждение полученных результатов; к.б.н., с.н.с. Н. П. Балабан и к.б.н., доц. А. М.
Мардановой за постоянное внимание, помощь в работе и консультации. Отдельная благодарность выражается профессору С. В. Кострову (ИМГ РАН, Москва), к.б.н., в.н.с. И. В. Демидюку (ИМГ РАН, Москва), профессору Е. Феррари (Международная инкорпорация Генкор, США), профессору Д. Зайглеру {Bacillus Stock Center, Университет Охайо, США), профессору Е. Сахилду (Университет Копенгагена, Дания), профессору Й.Штульке (университет Геттингена, Германия), профессору Я. Маартену Ван Дижлу (университет Гронингена, Голландия) за предоставление для работы лабораторных штаммов и плазмид. Автор искренне благодарен заведующей кафедрой микробиологии КФУ профессору О. Н. Ильинской и сотрудникам кафедры за всестороннюю помощь и доброжелательную рабочую атмосферу.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы бактерий, векторы, плазмиды и среды культивирования.
Объектом исследования являлся рекомбинантный эритромициноустойчивый штамм Bacillus subtilis. Он получен путем трансформации плазмиды pSAl в протеазо-дефицитный штамм В. subtilis BG2036, из хромосомы которого делетированы гены внеклеточных протеиназ (штамм предоставлен проф. Eugenio Ferrarri, Genencor Int. Inc., USA). Мультикопийная плазмида pSAl сконструирована на основе вектора экспрессии рСВ22 [Sorokin et al., 1990] и несет полный ген металлопротеиназы В.intermedins (mprBi) под собственным промотором. Ген субклонирован после секвенирования 6 кб фрагмента геномной ДНК В. intermedius с плазмиды рСМ4 (плазмида рСМ4 предоставлена проф. С. В. Костровым, ИМГ РАН, г. Москва). Штаммы B.subtilis 8G5 AdegSAdegU (like 8G5; degS, degU; Kmr), с мутацией по генам degS и degU, B.subtilis 8G5 degU32(Ну) (like 8G5; degU32(Ну); Kmr) с мутацией по гену degU, ведущей к Ну-фенотипу и B.subtilis 8G5 (trpC2; tyr; his; nie; ига; rib; met; ade; sipP) с полноценными регуляторными белками предоставлены доктором Я. Маартен Ван Дижлом, университет Гронингена, Голландия. Штамм B.subtilis AtnrA-LCC с мутацией по гену tnrA (EmR), предоставлен профессором Е. Сахилдом, Университет Копенгагена, Дания. Штаммы B.subtilis GP254 (trpC2; AamtB, Cmr), B.subtilis GP253 itrpC2\ AglnK, Cmr) предоставлены проф. Й. Штульке, университет Геттингена, Германия, Штаммы, дефектные по spo-зависимым генам, и B.subtilis 168 (trpC2) предоставлены профессором Д. Зейглером из Bacillus Genetic Stock Center (BGSC), Университет Охайо, США.
Культивирование бактерий проводили на следующих средах: среда LB (%): триптон - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,5; NaCl - 0,5; pH 8.5 [Sambrook et al., 1989]. Агаризованная среда LA включала дополнительно 2% агара. Среды для трансформации штаммов B.subtilis включали солевую основу среды Спицайзена, среду Спицайзена I и среду Спицайзена II [Anagnostopolous & Spizizen, 1961]. Синтетическая минимальная среда SMM включала солевую
основу, микроэлементы [Saxild et al., 1987]. Идентификационная авизированная среда для отбора клонов, способных секретировать протеиназу, включала 30% обезжиренного молока и 2% агара. Среды стерилизовали при 1 атм. в течение 30 мин., pH доводили перед стерилизацией среды 40%-ным раствором NaOH до значения 8,5. Для изучения влияния углеродной катаболитной репрессии в среду SMM вносили 10 мМ глюкозы. Для изучения влияния азотной катаболитной репрессии в среду SMM вносили соли КаМОз и NH4C1 в конечной концентрации 20 мМ.
При выращивании рекомбинантных штаммов в среду вносили антибиотики (конечная концентрация в среде): для штаммов B.subtilis с плазмидами рСВ22, рСМ4, pSAl- эритромицин (20 мкг/мл); для штаммов B.subtilis, мутантных по белкам AmtB и ClnK - хлорамфеникол (20 мкг/мл); для штаммов B.subtilis, мутантных по белкам DegS и DegU, канамицин (20 мкг/мл).
Выделение плазмидной ДНК проводили с помощью набора реактивов GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas). Электрофорез плазмидной ДНК проводили по методу, описанному ранее [Sambrook et al., 1989].
Рестрикционное картирование ДНК. Последовательность фрагмента геномной ДНК B.intermedius анализировали с помощью программы Vector NTI и определяли потенциальные сайты рестрикции. Амплификат 6 кб фрагмента ДНК B.intermedius обрабатывали рестриктазами в разных комбинациях: Bglll, Dral, Hindll, Ndel, Pvull, Sacl, Sali, Xbdl. Рестрикцию ДНК проводили набором рестриктаз фирмы "Сибэнзим" в течение 2 ч при 37° С в условиях, рекомендованных производителем.
Трансформацию клеток В. subtilis плазмидной ДНК проводили, как описано в работе [Anagnostopolous et al., 1961]. Трансформацию протопластов B.subtilis плазмидной ДНК проводили, как описано в работе [Chang et al., 1979].
Определение протеолитической активности металлопротеиназы
проводили по расщеплению 1% азоказеина по методу, описанному ранее [Demidyuk et al., 2006]. Определение активности на синтетических хромогенных субстратах Z-Ala-Ala-Leu-pNA и Z-Glu-pNA проводили по методике, описанной в работе [Leshchinskaya et al., 1997]. Определение казеинолитической активности определяли по методу Каверзневой [Каверзнева, 1971]. За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 мкг субстрата за 1 мин. Продуктивность культуры определяли как отношение величины протеолитической активности к оптической плотности культуральной жидкости и выражали в усл. ед.
Исследование влияния ингибиторов на активность фермента. В реакционную смесь добавляли ингибитор в конечной концентрации 5 мМ и выдерживали пробу в присутствии реагента в течение 1 ч при комнатной
температуре, после чего определяли остаточную активность по гидролизу азоказеина. Остаточную активность выражали в процентах. За 100% (контроль) принимали активность фермента в отсутствие ингибиторов в реакционной смеси. В работе использовали специфический ингибитор сериновых протеиназ PMSF, ингибиторы металлопротеиназ ЭДТА и 1,10-фенантролин, а также белковый ингибитор трипсина.
ДНК секвенирование. Фрагмент геномной ДНК B.intermedius размером в 5896 п.о. на плазмиде рСМ4 амплифицировали с помощью синтетических олигонуклеотидов, комплиментарных фланкирующим областям плазмиды рСВ22 (рСВ rev - ATAGCTTTATAGAGTAGGTC, рСВ dir CCACTATCGACTACGCG). Условия проведения ПЦР реакции: 94° С 1 мин. -1 цикл; 94° С 30 сек., 43° С 30 сек., 72° С 6 мин. - 30 циклов; 72° С 10 мин - 1 цикл. Результаты ПЦР реакции оценивали электрофоретически в 1% агарозном геле. В пробирки объемом 0,5 мл вносили стандартное количество праймера - 3,2 pmol. В зависимости от типа матрицы и ее размера концентрация праймеров (нг) варьировала: ПЦР-продукт: > 2000 п.о. - 20-50 нг; плазмида: 6000 - 10000 п.о. - 300-400 нг. Образцы упаривали в вакуумной центрифуге или в термостате при температуре 60-65° С, пробирки выдерживали при комнатной температуре 10-15 мин, чтобы избежать образования конденсата.
Определение нуклеотидной последовательности проводили методом терминации цепи с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1, используя в качестве матрицы амплификат вставки с плазмиды рСМ4 (Межинститутский Центр коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН, http://www.genome-centre.narod.ru/). Последовательность нуклеотидов депонировали в международную базу данных GenBank под номером AN EU 678894.
Субклонирование ДНК. Последовательность гена mprBi амплифицировали, используя синтетические олигонуклеотиды: mprBiDir (TAACCTGGATCCAATCAAAGGAGGGATAGG), соответствующий началу регуляторной области гена протеиназы с сайтом для узнавания рестриктазой BamHl (подчеркнуто); и mprBiRev
(CATAAAGGATCCCAAGCACATAGGTGTTTG), соответствующий концу кодирующей области гена протеиназы с сайтом для узнавания рестриктазой BamHl (подчеркнуто). Обработанный рестриктазой продукт амплификации очищали, используя набор GeneJET PCR Purification Kit (Fermentas), и клонировали в плазмиду рСВ22, предварительно обработанную Bgñl рестриктазой.
Гено-информационный анализ последовательности
секвенированного фрагмента ДНК B.intermedius проводили с использованием алгоритма BLAST: пакета программ, представленных на сервере NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) [Altschul et al., 1997] и программы Vector
NTI Suite 8.0. Поиск открытых рамок считывания проводили с помощью программы ORF Finder (www.ncbi.nlm.nih.gov/gorCgorf). Потенциальный сайт отщепления сигнального пептида определяли с использованием алгоритма SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), который позволяет определить функционально-активный сигнальный пептид в последовательности аминокислот [Bendtsen et al., 2004]. Потенциальные -10 и -35 области для узнавания (^-фактором транскрипции идентифицировали в промоторе гена металлопротеиназы В. intermedius при использовании сервера Softberry BPROM network [Helmann, 1995]. Потенциальные участки связывания с белками-регуляторами DegU, SpoOA, TnrA в регуляторной области гена mprBi выявляли с использованием пакета программ Vector NTI Suite 8.0.
Для сравнительного анализа использовали последовательности фрагментов геномов бацилл, имеющиеся в свободном доступе на сервере NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov): B.pumilus SAFR-032 (YP_001488604.1), B.pumilus АТСС 7061 (ZP_03055196.1), B.licheniformis АТСС 14580 (YP_081058.1).
Статистическую обработку данных для анализа экспериментальных данных проводили с помощью программы Microsoft Excel. Для описания и сравнения признаков использовали построения 95%-ных доверительных интервалов для средних.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Секвенирование и характеристика 6 кб фрагмента геномной ДНК B.intermedius. В библиотеке геномной ДНК В. intermedius, полученной в Институте молекулярной генетики (ИМГ РАН, Москва), идентифицирован клон, протеолитическая активность которого снижалась в присутствии ингибиторов металлопротеиназ. Фрагмент хромосомной ДНК В,intermedius клонировали в вектор экспрессии рСВ22 с получением плазмиды рСМ4, которой трансформировали штамм-реципиент B.subtilis 20-36, дефектный по генам собственных секретируемых протеолитических ферментов. Изучение гетерологичной экспрессии гена металлопротеиназы В. intermedius в беспротеазном штамме B.subtilis показало, что максимальная активность в культуральной жидкости соответствовала 32 ч. роста культуры по гидролизу азоказеина и 36 ч. роста по гидролизу казеина (рис. 1). Активность фермента по расщеплению белковых субстратов практически полностью подавлялась в присутствии специфических ингибиторов металлопротеиназ, тогда как ингибиторы сериновых протеиназ не оказывали влияния на протеолитическую активность рекомбинантного штамма. Активность по расщеплению специфических субстратов для сериновых протеиназ не была обнаружена. Полученные результаты позволили заключить, что фрагмент хромосомной
ДНК B.intermedius, клонированный на плазмиде рСМ4, содержит ген, кодирующий секретируемый белок, относящийся к классу металлопротеиназ.
Рестрикционный анализ плазмиды рСМ4 показал, что размер клонированного фрагмента геномной ДНК составил 6 кб. Проводили определение его нуклеотидной последовательности. После секвенирования протяженность клонированного фрагмента геномной ДНК B.intermedius составила 5896 п.н. Рестрикционное картирование показало наличие в последовательности ДНК сайтов узнавания для пяти рестриктаз - BgUl, Mai, Hpal, Sail, Hindll. ОРС-анализ секвенированной ДНК в программе BLAST показал присутствие шести открытых рамок считывания (ОРС) генов, кодирующих различные полипептиды (рис. 2).
казеин
О 4 S 12 16 20 24 23 32 36 40 44 48 62 55 60 в4 В8 72 76
Время, ч
Рис. 1. Динамика роста и накопления протеолитической активности в культуральной жидкости рекомбинантного штамма B.subtilis 20-36 (рСМ4).
Рис. 2. Схема расположения открытых рамок считывания, идентифицированных во фрагменте геномной ДНК B.intermedius.
Рамки считывания обозначены стрелками: ywfO - металл-зависимая фосфогидролаза, ywfA - гипотетический белок, mprBi - секретируемая металлопротеиназа, pmbBi - мембраносвязанная металлопротеиназ а, ywhD - гипотетический белок, ywhE - пенициллин-связывающий белок.
В секвенированной ДНК идентифицированы гены двух протеолитических белков - pmbBi и mprBi. Оба гена кодируют
металлопротеиназы. Их сравнительный анализ показал отсутствие гомологии в структурной части генов. Соответствующие им белки относятся к разным семействам и выполняют в клетке различные функции. Анализ конвертированных аминокислотных последовательностей показал наличие различных структурных доменов в первичной структуре полипептидов. Наличие структурного домена ZnMc в последовательности гена mprBi свидетельствует о том, что продукт этого гена принадлежит к клану МА метцинкинов семейства Ml 2 секретируемых цинк-зависимых металлопротеиназ. Поиск гомологии последовательности гена mprBi с генами известных протеиназ в базе данных NCBI показал 98% гомологию с геном, кодирующим репролизин семейства цинк-зависимых металлопротеиназ B.pumilus АТСС 7061. Отметим, что ген B.pumilus, а также его продукт не изолированы и не охарактеризованы, функция установлена на основе сравнительного анализа с генами эукариотических металлопротеиназ клана метцинкинов. Анализ продукта гена mprBi проводили с применением программы SignalP, позволяющей идентифицировать в последовательности потенциальный сайт отщепления сигнального пептида. В результате, в структуре MprBi обнаружен потенциальный сайт (ASA) отщепления сигнальной последовательности, что свидетельствует о внеклеточной локализации зрелого белка.
Наличие структурного домена S2P-M50 в последовательности гена pmbBi указывает на принадлежность кодируемого белка к клану ММ семейства М50 мембраносвязанных металлопротеиназ (MEROPS М50.002). Поиск гомологии последовательности гена pmbBi с генами известных протеиназ в базе данных NCBI показал 98% гомологию с геном, кодирующим мембраносвязанную металлопротеиназу семейства М50 B.pumilus АТСС 7061, продукт которого также не исследован. Анализ аминокислотной последовательности гена pmbBi с помощью программы SignalP показал отсутствие потенциального сайта отщепления сигнального пептида. По результатам анализа PmbBi является интегральным мембранным белком. Отсутствие гомологии гена pmbBi с геном mprBi свидетельствует о том, что белок PmbBi не является предшественником внеклеточной металлоэндопептидазы MprBi, и эти белки выполняют в клетке различные функции.
Наличие структурного домена S2P-M50 в последовательности гена pmbBi явилось основанием для сравнительного анализа с генами других представителей семейства металлопротеиназ М50. Ферменты этого семейства характеризуются присутствием в структуре четырех трансмембранных сегментов (для эукариотических гомологов 6 сегментов) и Зх консервативных мотивов, указанных стрелками на рис. 3.
Сравнительный анализ показал, что локализованный на 6 кб фрагменте ДНК B.intermedius ген pmbBi кодирует мембраносвязанную
металлопротеиназу семейства регуляторных белков М50. Среди членов семейства М50 охарактеризованный бациллярный белок - фактор споруляции ЗроГУТВ. Он активен на поздних стадиях споруляции и осуществляет процессинг предшественника спороспецифичного фактора транскрипции который активирует транскрипцию спороспецифичных генов в материнской клетке [АИуата е1 а1., 2004]. Регуляторная протеиназа 8ро1УРВ содержит характерный мотив НЕххН, который локализован на одном из трансмембранных сегментов (Регион А), а также мотив из четырех аминокислотных остатков ИРБО (Регион С) (рис. 3). Идентичные домены выявлены в последовательности металлопротеиназы РтЬВь По результатам анализа сделано заключение, что ген ртЪШ кодирует регуляторный белок клана ММ мембраносвязанных металлопротеиназ.
Рис. 3. Схема интрамембранной организации металлопротеиназ семейства М50. Регионы А, Б, С - консервативные домены [Lewis, Thomas, 1999].
Итак, различие в структурной организации генов mprBi и pmbBi, принадлежность к различным семействам металлопротеиназ свидетельствуют о том, что продукты этих генов представляют ферменты с различной клеточной локализацией и выполняют различные физиологические функции в клетках бацилл.
Изоляция и характеристика гена металлопротеиназы B.intermedius.
На рис. 4 представлена нуклеотидная последовательность гена секретируемой металлопротеиназы mprBi и соответствующая аминокислотная последовательность. ОРС гена состоит из 810 п.о., что соответствует 270 а.к.о. Предполагаемый сайт инициации трансляции представлен ATG кодоном в отличие от сериновой протеиназы B.intermedius, стартовым кодоном которой является нестандартный кодон GTG. В структуре гена идентифицированы потенциальный сайт Шайна-Дальгарно (SD) и регуляторные области - 10 (GAATATA) и - 35 (TAGAAG). С помощью программы SignalP в структуре ОРС идентифицирован сигнальный пептид протяженностью 30 а.к.о. Определение N-концевой аминокислотной последовательности гомогенного белка [Рудакова и др., 2010] MprBi позволило идентифицировать
пропептидную область протяженностью из 66 а.к.о. и последовательность зрелого белка, которая включает 174 а.к.о.
1 ACTATCAGTATCGCTATTCGCTGACGGACAATGGGAAAGAGTTTCTCGATCAGTGTGAAG 61 TGGACATGCCTGACCTCAAAGTACTGACGCAGCAGATGAACGAGCAGTCGTCTCGITTCC 121 TAGAGCTCGTCTCCACAATTTTATACTTTGATGACCTGCCAGAAGATGAGGTAAAGGAAA 181 AGGTCTTCACTATTAAAAGCAAGCAGCGCTATACGGACGAAGAATTTGAGGATGCTCTTG 241 CTTATATTGMCAATTGAAGGAATTGAACTAGTTTCGCAAAAGCCCAGCATTTAGGGCTT 301 TTTTTGTTTTTGTAAGACCCAGACCAAAAGCGCTATTTTCCGATGAAATGTGTGCTGAAA 361 TATCCGAAAAATTAGTGAArATGACGTATTTCGACTTTTTTTTTGTGTATCCAATTCCCT 421 GTTTTTGACTGAATAGAAÍJGAAAATGGTGAATTTTCAGTGaArArATAACCTTGTCAAAA
-35 -10 +1
481 tcaaaggasggataggaatgaaaaagcgttcagtctttttgtcatttttattggtaggt
rbs mkkrsvflsfllvg
540 agtttgttaccgggagtaagttcagcttcagcaccagtcgcgagtgctggtcatgggcat sllpgvssasapv asa g h g h 601 gatcatggtcatgcgccgttcgaaacacatattagtgaggggttgccaaaggcaaacgat
dhghapfethiseglpkand 661 tttaaagatttgacgaaagcacctccaattgaacgagatgtgaaaacaaaggtattagat
fkdltkappierdvktkvld 721 gagtctggtaagcaagtaggctctagaacctttaaggcgaatacaggagattctatttca
esgkqvgsrtfkantgds1s 781 acñaaggcaagcacaggcagtcaaaaagtaacggtttatgctgtagcagatgcgcagtat
TKASTGSQKVTVYAVADAQY 841 CGTGCGAAATATAGTGACTGGCAGACGCGGATTGTCAGCATCATTGAGCAAGCGGACGTG
rakysdwqtrivs i ieqadv 901 acctttaaccgtgatcatgatgtggactttgtcgtacaagccgtaggatcttggacgtct
t fnrdhdvdfvvqavgswts 961 tcñggatcaaatgcagagcaaattttatctaacctttcgcgcagctttgatggcagagga sgsnaeqilsnlsrsfdgrg 1021 tacgattttgtcactggatttacagcaaatccaaactttgatgcgggcggaatcgcttat
ydfvtgftanpnfdaggiay 1081 gtñtacaatagtgcaccgagcggaagtgcattcgccgttaaccttgatcaaggaacagcg
vynsapsgsafavnldqgta 1141 aacaccgcaaaagcggctacgcatgñatacggtcataactttggcttaccgcatgaccct
ntakaathe ' g h к pgi phdp 1201 caaggcagcggcattgtctgcttaatgaactatgattattcctacacagtcgatttcttt
qgs g ivcvlm-n ydy sytvdff 1261 gatgcggctcataaaaatcm'gtgaacc'gtáacaaagcgtggtacagataaaataagaga
daahknqvnr.nkawyr* 1321 caaaaggacaaacacctatgtgcttgtccttttttatgcttacaggtcgctgatgcgttt 1381 tcctgctacggcatagtgttcttttttcaattattcaataatgacagagacttt1tctgc 1441 acctgcgcctgttgtttcaacaacagcatcagtgactttctccacaagagctcttttctg
Рис. 4. Нуклеотидная последовательность гена тргВ1. -10, -35 боксы обозначены курсивом, последовательность Шайна-Дальгарно (Ю^Б) выделена и подчеркнута. Звездочкой отмечен стоп кодон. Предположительные терминаторы транскрипции подчеркнуты. Стрелкой указан предполагаемый сайт отщепления сигнального пептида. Мотив активного центра и метиониновый изгиб отмечены серьм цветом. Терминаторы подчеркнуты.
Анализ первичной структуры белка, кодируемого геном тргВг, позволил выявить две маркерные последовательности НЕУОНКРОЬРН и СЬМОТ, которые соответствуют канонической структуре активного центра НЕХХНХХСХХН и МеЫюворота с остатком метионина, характерным для представителей клана метцинкинов. Наличие консервативных
последовательностей позволило определить семейство протеаз, к которому принадлежит продукт идентифицированного нами гена. Из таблицы 1 видно, что после третьего гистидинового лиганда в активном центре адамализиновых протеиназ, как и в случае протеиназы MprBi, расположен остаток аспарагиновой кислоты (D) [Jiang W. et al., 1992; Bode W. et al., 1992, 1993]. В таблице выделены консервативные аминокислоты активного центра и метионин в структуре Met-поворота. Кроме того, присутствие высококонсервативного цистеина (С) в структуре метионинового поворота характерно только для представителей семейства адамализинов/репролизинов (М12).
Таблица 1.
Гомология консервативных мотивов металлопротеиназ клана метцинкинов
№ Представители металлопротеиназ Последовательность активного центра Гомология активного центра Последовательность Met-поворота Гомология Met- поворота, %
1 mprBi - внеклеточная металлопротеиназа B.intermedius HEYGHNFGLPHÖ 100 CLMNY 100
2 Zn-зависимая металлопротеиназа B.pumilus АТСС 7061 HEYGHNFGLPHB 100 CLMNY 100
3 Адамализин II C.adamanteus HELGHNLGMEHD 66 CIMRP 40
4 Адамализин ADAM21 M.mulatta HELGHILGMQHß 58 CIMNT 60
5 Термолизин В. thearmoproteolyticus HELTH 25 - --
Таким образом, изолированный нами ген тргШ кодирует белок, являющийся аналогом эукариотических адамализинов/репролизинов. Такие белки известны и описаны только для эукариотических организмов. Продукт идентифицированного нами гена является первым бактериальным гомологом эукариотических адамализинов.
Эукариотические секретируемые адамализины (АОАМТз) - это мультидоменные белки, в структуру которых входят продомен, протеазный домен, фурин-распознающий мотив (Ихх11), дизентегриновый домен, тромбоспондин-подобный и цистеин-богатый домены. Физиологические функции адамализинов варьируют в зависимости от числа и набора доменов [Вгоскег е1 а1,, 2009]. Анализ конвертированной аминокислотной последовательности гена тргВх показал присутствие двух доменов, характерных для представителей семейства адамализинов - продомена и металлопротеазного домена (рис. 5). Отсутствие дизентегринового,
тромбоспондин-подобного и цистеин-богатого доменов в структуре МргВ1 может объясняться меньшим спектром действия адамализиноподобной металлопротеиназы В.Шегтес1ш в отличие от секрегируемых адамализинов эукариот. Показано, что С-конец эукариотических адамализинов, состоящий из тромбосподинопобных доменов, разделенных междоменным пространством, и цистеинбогатого домена отвечает за подавление образования и разрастания опухолевых клеток [Кило й а1., 2004]. Очевидно, что в ходе эволюции прокариотических гомологов адамализинов, эукариотические белки приобрели дополнительные функциональные домены.
вд . фрм да шд ад
на щпЗ-^^Э-в-^И-соон
сп пд МД
Ц-( Нг^^ЬСООН ^^
Рис. 5. Схема расположения доменов в структуре АОАМТз-белков
СП - сигнальный пептид, ПД- продомен, ФРМ - фурин-распознающий мотив, МД - металлопротеазный домен, ДД - дизентегриновый домен, ЦБД - цистеин-богатый домен, ТПД - тромбосподин-подобный домен.
Отметим, что большинство цинковых металлоэндопептидаз бацилл имеют характерную последовательность НЕХХН, представляющую активный сайт молекулы термолизина, и второй консервативный домен ЫЕХХЗО, остаток глутаминовой кислоты которого располагается в 20 аминокислотах от второго гистидинового остатка активного центра [МаИехув, 1988]. В структуре протеиназы МргЕН такой домен не обнаружен. Анализ последовательности генов тргВх и термолизиноподобной протеиназы не выявил гомологии (табл. !)■
Таким образом, в нашей работе впервые изолирован прокариотический ген, кодирущий адамализиноподобную металлоэндопептидазу МргВ1 клана метцинкинов, проведен его сравнительный анализ. Среди эукариотических адамализинов различают секретируемые и несекретируемые металлопротеиназы. Ранее, адамализины выделены только из змеиного яда, а также из репродуктивных тканей млекопитающих. Присутствие гена фермента этого семейства в геноме прокариот, в частности в геноме В,Шегтес1ш, представляет собой научную новизну и изучение его функциональной роли в клетках Мопега (уровень прокариот) является приоритетным.
Анализ регуляторной области гена тргВь Проводили выравнивание области промотора размером 400 нуклеотидов относительно канонических последовательностей для взаимодействия с регуляторными белками: фактором транскрипции БроОА, участвующим в инициации спорообразования; фактором транскрипции DegU, контролирующим
экспрессию белков биодеградации; фактором транскрипции СсрА, участвующим в катаболитной репрессии и фактором транскрипции ТпгА, участвующим в контроле азотного обмена, поскольку продукты расщепления протеаз - аминокислоты, могут служить бактериям в качестве источника азота. Выявленные в результате гено-информационного анализа сайты регуляции в промоторе гена тргЫ и степень их гомологии к консенсусам представлены в таблице 2.
Таблица 2.
Потенциальные сайты взаимодействия с регуляторными белками в промоторе гена тргШ
Регуляторный белок Консервативная последовательность Количество сайтов Гомология, %
БроОА ТОТСОАА 4 71-86
ТпгА ТСт-Ш7™АСА 6 72-79
Беви СТСАТТА^ТАААТАТС 0 -
Ое£и-Р ОТСАТТА 4 60-65
СсрА ТСТААОСОТТААСА 2 75-87
АЬгВ ТСОНА(АЯ4)ТСОЫА 0 -
РЬоВ СТСТСАТАНАКСТСТСАЫ 0 -
Выравнивание по сайтам регуляции определило направление дальнейших исследований - изучение экспрессии гена в регуляторных мутантах.
Влияние углеродной катаболитной репрессии на экспрессию гена тргВи В последовательности гена тргШ нами идентифицированы два потенциальных сайта для связывания с белком СсрА, располагающиеся в регуляторной и кодирующей областях гена металлопротеиназы В.ШегтесНия. Установлено, что в присутствии в среде 10 мМ глюкозы уровень протеолитической активности рекомбинантного штамма, несущего ген металлопротеиназы ВлШегтЫш, резко снижается. Эти данные свидетельствовали о том, что металлопротеиназа МргВ1 может участвовать в утилизации альтернативных источников углерода, так как ее синтез подавляется в присутствии глюкозы. Полученные данные позволяют заключить, что экспрессия гена тргВ1 контролируется по типу углеродной катаболитной репрессии.
Влияние DegU-фaктopa транскрипции на экспрессию гена тргВи В регуляторной области гена металлопротеиназы идентифицировали четыре потенциальных участка связывания с фосфорилированной формой белка Бе£и, что позволило предположить участие регуляторной пары в
контроле экспрессии гена тргВг. Изучение экспрессии тргВг в штамме,
дефектном по генам регуляторных белков Бе§8 и Ое£1Г показало, что их нарушение приводило к снижению продуктивности рекомбинантного штамма в отношении синтеза металлопротеиназы в среднем на 60% по сравнению со штаммом с полноценной системой Бе£8-Ве§и (рис. 6). Тем не менее, отсутствие регуляторной пары не приводило к полному подавлению экспрессии гена тргШ, как ранее показано для гена субтилизина В.аиЫШз [Киг^ е1 а1., 1995]. Таким образом, Без-система участвует в контроле синтеза протеиназы, но не является единственной в регуляции экспрессии гена тргВ1. По-видимому, в отсутствии полноценной Бе§8-Ве§и регуляторной пары другие системы регуляции участвуют в активации гена тргВи
Вр»«*,- Время, ч
Рис. 6. Экспрессия гена металлопротеиназы.
1 - контрольный штамм В.тЬНШ 8g5; 2 - штамм В.йиЫШз 8g5, дефектный по регуляторным белкам DegS - DegU> 3 - штамм ВлиЫИй 8£5 DegU Ну.
Экспрессию тргВг изучали в мутантах degU32^_Ну), у которых мутация в гене degU приводит к стабилизации DegU~P белка [Маёег е1 а1., 2002]. Известно, что эта мутация приводит к многократному повышению уровня экспрессии генов, позитивно регулируемых системой DegS-DegU. Полученные нами данные показали 10-кратное увеличение продуктивности в отношении металлопротеиназы в рекомбинантном штамме В. $иЫШ$ 8в5 йе%И52 (Ну) р8А1 (рис. 5) и позволили заключить, что фосфорилированная форма белка DegU активирует экспрессию гена тргВи Таким образом, регуляторная пара DegS-DegU позитивно регулирует экспрессию гена металлопротеиназы, которая участвует в адаптационных процессах клетки, протекающих в переходный период к стационарной фазе роста, когда активируются многие системы сигнальной трансдукции [Мвас1ек й а1., 2002].
Влияние азотной катаболитной репрессии на экспрессию гена тргВи При анализе промотора гена металлопротеиназы B.intermedius нами идентифицированы сайты с гомологией к консенсусной последовательности для взаимодействия с фактором транскрипции ТпгА, контролирующим азотный обмен в условиях, лимитированных по азоту. Этот факт позволил
предположить, что экспрессия гена тргВ1 регулируется с участием азотной катаболитной репрессии.
Предпочтительным источником азота для клеток является аммоний. Его присутствие в среде подавляет экспрессию генов, кодирующих ферменты ассимиляции сложнометаболизируемых источников азота, например, нитрата [Ое^сЪ, БшНсе, 2003]. По нашим данным, накопление протеолитической активности в культуральной жидкости рекомбинантного штамма на среде с нитратом натрия (условия голодания по источнику азота) превышало уровень активности рекомбинантного штамма В. зиЬйШ рБА1 на среде с добавлением хлорида аммония в среднем на 30%. Таким образом, отсутствие легкометаболизируемого источника азота в среде стимулировало синтез фермента в окружающую среду. Эти результаты свидетельствовали о том, что биосинтез металлопротеиназы взаимосвязан с азотным метаболизмом бактерий.
Изучение экспрессии гена тргВх в штаммах с мутациями по генам белков транспорта аммония АтШ и 01пК, показало, что уровень протеолитической активности на среде с нитратом натрия в 3 и в 2 раза ниже уровня активности на среде с добавлением хлорида аммония соответственно (рис. 7). По результатам экспериментов, в ответ на недоступность легкоутилизируемых источников азота в клетках бактерий активируется экспрессия гена металлопротеиназы, которая регуляторно взаимосвязана с экспрессией генов атХВ и %1пК, продукты которых формируют аппарат транспорта ионов аммония через цитоплазматическую мембрану.
О в 12 18 24 30 38 42 48 54 60 6в 0 б 12 18 24 30 36 42 46 54 60 65
Время, ч Время, ч
Рис. 7. Экспрессия гена тргВг.
А - в рекомбинантном штамме дефектном по белку АтШ, Б - в
рекомбинантном штамме В.ыЬНШ, дефектном по белку ИпК,; 1 -среда, содержащая 20 мМ нитрата натрия, 2 - среда, содержащая 20 мМ хлорида аммония.
Полученные данные позволяют предположить, что в контроле транскрипции гена металлопротеиназы В.ШегтесИш может участвовать
фактор транскрипции ТпгА, действующий в комплексе с белком бЬК [Каюмов и др., 2010]. Независимость экспрессии гена тргШ от присутствия в среде предпочтительного источника азота (М-^О) в рекомбинантном штамме с мутацией по гену ШгА свидетельствует о том, что азотный регулятор активен в условиях голодания по источнику азота (рис. 8,а). Однако, отсутствие полноценного белка ТпгА в рекомбинантных клетках в условиях азотного голодания на синтетической среде с добавлением нитрата натрия оказывало влияние на экспрессию гена (рис. 8,6).
12 18 24 36 48 60 12 18 24 36 42 48 60
Время, ч Время, ч
Рис. 8. Экспрессия гена mprBi.
А - на среде с 20 мМ NH4CI, Б - на среде с 20 мМ NaNC>3 в качестве единственного источника азота; 1 - B.subtilis pSAl (контроль), 2 - B.subtilis AtnrA-LCC pSAl.
Установлено, что уровень протеолитической активности рекомбинантного штамма B.subtilis AtnrA-LCC pSAl в условиях лимитации по азоту был на 40% ниже контрольного штамма с полноценным бежом ТпгА. Эти результаты указывают на то, что белок ТпгА является позитивным регулятором экспрессии гена металлоэндопептидазы. Известно, что позитивная регуляция фактором транскрипции ТпгА наблюдается в отношении генов, направленных на утилизацию различных источников азота [Fisher and Wray, 2009]. Вероятно, синтез металлопротеиназы является частью адаптационного процесса клеток, когда бациллы сталкиваются со стрессовым фактором, таким, как азотное голодание.
Полученные результаты позволяют сделать заключение, что реакция клеток на недостаточность легкоутилизируемых источников азота обусловлена действием системы транспорта аммония AmtB-GlnK, сопряженной с активацией фактора транскрипции ТпгА.
Влияние Spo- регуляторных белков на экпрессию гена mprBi. В
период перехода бацилл к дифференцировке клетки продолжают секретировать гидролитические ферменты, в том числе и протеиназы. В сети сигнальной трансдукции при переходе к споруляции ключевая родь принадлежит регуляторному белку SpoOA [Piggot and Hilbert, 2004]. В промоторе гена металлопротеиназы выше открытой рамки считывания нами идентифицированы участки ДНК с высокой гомологией к последовательности SpoOA-бокса - TGNCGAA. Тандемы SpoOA-боксов характерны для генов SpoOA-регулона [Fujita et al., 2005]. В связи с чем мы предположили, что синтез металлопротеиназы может быть связан со споруляцией и контролируется регуляторным белком SpoOA.
Установлено, что в рекомбинантном штамме, дефектном по регуляторному белку SpoOA, уровень экспрессии гена mprBi сохранялся на уровне экспрессии в штамме с полноценным геном spoOA (рис. 9). Такую же закономерность мы получили при изучении экспрессии гена mprBi в штаммах, дефектных по другим спороспецифичным регуляторным белкам (рис. 9). Во всех используемых в работе spo-регуляторных мутантах уровень экспрессии гена mprBi сохранялся на уровне контрольного штамма с соответствующими полноценными белками (рис. 9). Эти данные свидетельствуют о независимости экспрессии гена mprBi от Spo-регуляторных белков. На этом основании мы сделали заключение, что экспрессия гена металлопротеиназы не коррелирует со спорообразованием в отличие от экспрессии генов сериновых протеиназ B.intermedius [Sharipova et al., 2006; Шагимарданова и ДР., 2007].
В спорулирующей культуре только часть клеток популяции B.subtilis формирует эндоспоры, что приводит к образованию состояния бистабильности [Veening et al., 2008]. При этом культура бактерий разделяется на две субпопуляции - спорулирующие и вегетативные клетки. В первых клетках активен SpoOA фактор транскрипции (Spo0A+ клетки), во вторых клетках этот фактор находится в неактивном состоянии (SpoOA-клетки) (рис. 10). Установлено, что в вегетативной субпопуляции функционально-активным регулоном является degU регулон [Veening et al., 2008]. Клетки, принадлежащие к Spo0A+ субпопуляции, способны синтезировать киллер-факторы, которые приводят к лизису клеток SpoOA-субпопуляции. В результате лизиса компоненты разрушенных клеток становятся источником питания для Spo0A+ клеток, при этом процесс споруляции может пролонгироваться [Engelberg-Kulka et al., 2006].
Рис. 9. Экспрессия гена металлопротеиназы в штамме В.йиЬИШ (р8А1) и штаммах, дефектных по Бро-регуляторным белкам.
Голодание
Рис. 10. Схема процесса задержки споруляции Spo0A+ субпопуляции, вызванной клеточной смертью SpoOA- субпопуляции [Engelberg-Kulka et al„ 2006].
Согласно современным представлениям (рис. 10) ген mprBi, который позитивно регулируется постэкспоненциальными системами регуляции относится к DegU-регулону в вегетативной SpoOA- субпопуляции клеток. Контроль генов, экспрессирующихся в этих клетках, осуществляется регуляторными белками DegU, СсрА, СошА и ТпгА. Таким образом, экспрессия гена mprBi связана с формированием интегрированного ответа клеток бацилл в переходный период, когда активируются и корегулируются многие ответы постэкспоненциальной фазы. При этом образование фермента не взаимосвязано с процессом споруляции.
Итак, в геноме В. intermedins впервые у бацилл выявлен и охарактеризован ген, кодирующий гомолог эукариотических металлопротеиназ - адамализинов клана метцинкинов. В структурной области гена нового бактериального фермента идентифицированы маркерные последовательности, позволяющие классифицировать соответствующий белок как представителя клана метцинкинов семейства адамализинов/репролизинов. По данным геноинформационного анализа гомологичные гены присутствуют в геномах других бацилл. Анализ регулягорной области гена новой адамализиноподобной металлопротеиназы В.intermedins выявил сложную организацию промотора, что свидетельствует о его множественной регуляции. Полученные данные позволяют сделать заключение, что экспрессия гена
тргШ модулируется различными регуляторными системами в период постэкспоненциального роста. Экспрессия гена новой бактериальной адамализиноподобной металлопротеиназы контролируется механизмами углеродной и азотной катаболитной репрессии. Установлено, что белки транспорта аммония С1пК и Агг^В совместно с глобальным фактором транскрипции ТпгА участвуют в контроле экспрессии гена. Двухкомпонентная система DegS-DegU, ответственная за синтез ферментов биодеградации, оказывает позитивное влияние на экспрессию гена тргВи В клетках эукариот адамализины/репролизины выполняют защитную функцию, будучи агрессивными компонентами змеиных ядов. По аналогии с эукариотическими белками можно предположить, что бактериальные адамализиноподобные протеиназы в клетках прокариот могут выполнять защитную функцию. Клетки бацилл, сталкиваясь с неблагоприятными воздействиями окружающей среды и недостатком питательных веществ, начинают синтезировать металлопротеиназу как фактор агрессии. Таким образом, экспрессия гена металлопротеиназы является одним из адапционных ответов в постэкспоненциальный период роста спорообразующих бактерий.
ВЫВОДЫ
1. Установлена последовательность нуклеотидов 6 кб фрагмента хромосомной ДНК В.т1егтесИиз (АЫ ЕШ78894), в которой идентифицированы 6 ОРС, включая две металлопротеиназы - внеклеточная МргВ] и мембраносвязанная РтЬЕН. Гены не имеют гомологии, соответствующие им продукты относятся к разным кланам белков: М12 и М50.
2. Впервые изолирован и охарактеризован бациллярный ген, кодирующий протеолитический фермент - гомолог эукариотических адамализинов. В структурной области гена тргВг выявлены функциональные домены, позволяющие отнести белок к клану метцинкинов.
3. Установлено, что DegS-DegU регуляторная система, контролирующая синтез ферментов биодеградации, играет позитивную роль в регуляции экспрессии гена тргВ1
4. Показано, что экспрессия гена металлопротеиназы В.Шегтейшъ регулируется азотной катаболитной репрессией с участием фактора транскрипции ТпгА, а также белков ИпК и АпиВ, обуславливающих транспорт аммония в клетку.
5. Установлено отсутствие регуляторной взаимосвязи между экспрессией гена тргВ1 и споруляцией.
Публикации по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК:
1. Sabirova A.R. A novel sectreted metalloproteinase Bacillus intermedius - the first adamalysin-like enzyme from bacilli / A.R.Sabirova, N.L.Rudakova, N.P.Balaban, O.N.Il'inskaya, I.V.Demiduyk, S.V.Kostrov,
G.N.Rudenskaya, M.R.Sharipova // FEBS letters. -2010. -V.584. - №21. - P. 44194425.
2. Сабирова A.P. Структурная организация гена металлоэндопептидазы Bacillus intermedins / А.Р.Сабирова, М.Р.Шарипова II Учен. Зап. Казан, ун-та. Сер. Естеств. науки. -2010. -Т. 152, кн. 2. -С. 155-166.
3. Рудакова Н.Л. Секретируемая металлопротеиназа Bacillus intermedius: получение гомогенного препарата фермента и исследование физико-химических свойств / Н.Л.Рудакова, А.Р.Сабирова, А.Р.Каюмов, А.М.Марданова, Н.П.Балабан, М.Р.Шарипова // Учен. Зап. Казан, ун-та. Сер. Естеств. науки. -2010. - Т. 152, кн. 2. - С. 145-155.
4. Балабан Н.П. Металлоэндопептидазы клана метцинкинов: классификация, свойства, структурные особенности / Н.Н.Балабаи,
H.Л.Рудакова, А.Р.Сабирова, О.Н.Ильинская, М.Р.Шарипова // Учен. Зап. Казан, ун-та. Сер. Естеств. науки. -2010. -Т, 152, кн. 2. - С. 57-78.
5. Каюмов А.Р. Влияние системы регуляции азотного обмена на биосинтез сериновых протеиназ Bacillus intermedius / А. Р. Каюмов, Т.Р. Шамсутдинов, А.Р.Сабирова, М. Р.Шарипова // Микробиология. -2009. -Т. 78. -№6. -С. 742-748.
6. Каюмов А.Р. Стартовый кодон в гене сериновой протеиназы AprBi из Bacillus intermedius / А.Р.Каюмов, А.Р.Сабирова, Н. П.Балабан, А.М.Марданова, С.ВКостров, О.Н.Ильинская, М.Р.Шарипова // Молекулярная биология. -2008. -Т. 42. -№1. -С. 117-122.
Другие публикации по теме диссертации:
7. Байрамов P.A. Роль двукомпонентной системы трансдукции сигнала DegS-DegU в регуляции синтеза протеиназ Bacillus intermedius/ Байрамов P.A., Сабирова А.Р,, Каюмов А.Р, Шарипова М.Р. II Материалы XIII международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение». -Казань, 4-8 апреля, 2005. - С. 14.
8. Сабирова А.Р. Экспрессия гена металлопротеиназы Bacillus intermedins в условиях лимитации азота в рекомбинантном штамме Bacillus subtilis / А.Р. Сабирова, А.Р. Каюмов, М.Р. Шарипова // Материалы XIV Международной конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2007». -М., 2007. - С. 26-27.
9. Рудакова H.J1. Гетерологичная экспрессия гена нейтральной протеиназы Bacillus intermedins в клетках Bacillus subtilis / H.JI. Рудакова, А.Р. Сабирова, Н.П, Балабан, М.Р. Шарипова // Материалы XIV Международной конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007». -М., 2007.-С. 86.
10. Сабирова А.Р. Гетерологичная экспрессия гена металлопротеиназы Bacillus intermedius в условиях лимитации азота / А.Р. Сабирова, А.Р. Каюмов, М.Р.Шарипова // Материалы VI Международного симпозиума «Химия протеолитических ферментов». - М., 2007. - С. 65.
11. Сабирова А.Р. Секвенирование и анализ 6 кб фрагмента геномной ДНК Bacillus intermedius, содержащего ген протеазы / А.Р.Сабирова, H.JI. Рудакова, А.Р.Каюмов, М.Р.Шарипова // Материалы XV Международной конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2008». -М., 2008. -С. 47.
12. Шарипова М.Р. Вклад сигнальной трансдукции в регуляцию клеточного ответа в стационарную фазу роста бацилл/ М.Р.Шарипова, Н.П.Балабан, А.М.Марданова, А.Р.Каюмов, Т.Р.Шамсутдинов, Е.О.Михайлова, А.Р.Сабирова, А.А.Тойменцева, Н.Л.Рудакова// Материалы IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - М., 2008. -С. 116.
13. Sabirova A.R. Gene coding for metalloprotease of Bacillus intermedius / M.R. Sharipova, N.P.Balaban, A.M.Mardanova, A.R.Kayumov, A.R.Sabirova, N.L.Rudakova, E.I.Shagimardanova and Gusev.O.A.// GeneBank NCBI -EU678894. -2008.
14. Пономарева Ю.О. Построение контига геномной ДНК Bacillus intermedius/ Ю.О.Пономарева, А.Д.Мухаметзянова, А.Р.Сабирова// Материалы XLVI международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». -Новосибирск, 2008. - С. 42.
15. Шарипова М.Р. Особенности регуляции функциональной активности экспрессии генов протеиназ в условиях стресса у бацилл / Шарипова М.Р., Тойменцева A.A., Каюмов А.Р., Сабирова А.Р., Рудакова Н.Л., Балабан Н.П. //Материалы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». -Казань, 2009. -С. 96.
16. Рудакова Н.Л. Новая металлопротеиназа Bacillus intermedius/ Рудакова Н.Л., Сабирова А.Р., Данилова Ю.В., Балабан Н.П., Шарипова М.Р. // Материалы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды».-Издательство «ФизтехПресс» КФТИ КазНЦ РАН. -Казань, 2009. -С. 298.
17. Sabirova A.R. A novel metalloprotease of Bacillus intermedius / A.R.Sabirova, M.R.Sharipova // 14th International conference «Microbial enzymes in biotechnology and medicine». -Kazan, 2009. - P. 50-51.
18. Сабирова A.P. Влияние факторов транскрипции на экспрессию гена металлопротеиназы Bacillus intermedius1 А.Р.Сабирова, Шагимарданова Е.И., Хабибуллина Н.М., Сибгатуллина Э.Э., М.Р.Шарипова/7 Материалы докладов Российской школы молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии». -Минск, 2010. -С. 52.
19. Черемин A.M. ДНК-белковое взаимодействие промотора гена металлопротеиназы Bacillus intermedius с факторами транскрипции/ А.М.Черемин, А.Р.Сабирова, А.А.Тойменцева, М.Р.Шарипова // Материалы докладов Российской школы молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии». -Минск, 2010. -С. 67.
20. Сабирова А.Р. Металлопротеиназа Bacillus intermedius / А.Р.Сабирова, Н.Л.Рудакова, Ю.В.Данилова, Н.П.Балабан, М.Р.Шарипова// Труды Томского Университета. Сер.Биологическая. -Т. 275.-Томск, 2010. -С. 396-398.
Отзывы на автореферат просим высылать по адресу: Казань, 420008, ул. Кремлевская, 18. Казанский университет, отдел аспирантуры, Ученому секретарю Диссертационного совета Д 212.081.08 Абрамовой Зинаиде Ивановне.
Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207
Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 20.01.2011 г. Печ.л.1,6 Заказ М К-7008. Тираж 150 экз. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сабирова, Альбина Рушановна
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Механизмы адаптации бацилл
1.1. Системы глобальной регуляции
1.2. Двухкомпонентные системы трансдукции сигнала
2. Секретом бацилл
3. Основы геноинформационного анализа
4. Протеиназы бацилл 39 4.1 Клан метцинкинов 40 4.2. Клан мембраносвязанных металлопротеиназ (ММ) 46 Заключение ' 52 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 54 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы бактерий, векторы, плазмиды и среды культивирования
Выделение плазмидной ДНК
Электрофорез
Рестрикционное картирование ДНК
Трансформация клетокВ.БиЫИ'м плазмидной ДНК
Трансформация протопластов В.зиЫШз
Определение протеолитической активности металопротеиназы
Определение активности на синтетических субстратах
Исследование влияния ингибиторов на активность фермента
ДНК секвенирование
Субклонирование ДНК
Геноинформационный анализ последовательности ДНК
Статистическая обработка данных
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Получение и характеристика рекомбинантного штамма 64 В.хиЫШй
2. Секвенирование, построение контига и рестрикционный 67 анализ фрагмента хромосомной ДНК В. ШегтесИш
3. Идентифицкация открытых рамок считывания
4. Субклонирование гена металлопротеиназы
5. Анализ регуляторной области гена тргВг
6. Регуляция экспрессии гена металлопротеиназы В.ШегтесИж
6.1. Влияние углеродной катаболитной репрессии на 79 экспрессиию гена тргЫ
6.2. Влияние фактора транскрипции на экспрессиию гена 80 тргВг
6.3. Влияние азотной катаболитной репрессии на экспрессию 83 гена тргШ
6.4. Экспрессия гена тргВг в регуляторном штамме, дефектном 85 по фактору транскрипции ТпгА
6.5. Экспрессия гена тргВг в штамме В.БиЬНШ, дефектном по 87 белкам С1пК и АпйВ
6.5. Влияние 8р о -р егуляторных белков на экпрессию гена тргВг
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Изоляция гена металлопротеиназы В.ШегтесИш, его идентификация и структура
2. Характеристика экспрессии адамализиноподобной протеиназы В. intermedins ВЫВОДЫ Список литературы Приложение
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
А1а Алании
Аэр Аспарагиновая кислота
Абп Аспарагии
Ьеи Лейцин ть- Треонин в\у Глицин
С1и Глутаминовая кислота
СуБ Цистеин
ЮТР дезоксирибонуклеозидтрифосфаты ааытр дидезоксирибонуклеозиды
Taq Ткегтш сщнаНсш
РНК Рибонуклеиновая кислота
ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота
ПЦР Полимеразная цепная реакция
ББ Область Шайна-Дальгарно кДа Килодальтон
КЬ килобазы
ОРС открытая рамка считывания
Нм нанометры
РМЗБ Фенилметилсульфонилфторид
ОБР Диизопропилфторфосфат
8Б8 Додецилсульфат натрия
Трис 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диол
ЭДТА Этилендиаминтетраацетат
ДМФА Диметилформамид
Еш Эритромицин ьв Среда Лурия-Бертони рЫА Пара-нитроанилид
Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура гена новой металлопротеиназы Bacillus intermedius и регуляция его экспрессии"
Актуальность проблемы. Протеолитические белки вовлечены во все основные физиологические процессы, включая? регуляторный протеолиз, и являются» стратегическими ферментами клеток микроорганизмов. По результатам секвенирования геном Bacillus subtilis содержит 62 гена протеолитических белков, среди которых 34: — цитоплазматические протеиназы, 13: кодируют мембраносвязанные протеазы, 6 - протеазы, локализованные в клеточной стенке, 9 кодируют секретируемые протеазы [Rey et al., 2004]. Многие из белков; соответствующих этим генам, пока не выделены, их физиологические функции не установлены. В международных базах данных содержится обширная информация о фрагментах последовательностей геномных ДНК различных видов бацилл, в том числе В.subtilis, B.cereus, Bdicheniformis и других, что позволяет проводить* геноинформационный анализ по идентификации генов и сравнению фрагментов геномов; Особый научно-практический интерес представляют ранее не идентифицированные белки протеолитического спектра, что обусловлено необходимостью расширения общих представлений об эволюционном развитии этой; группы гидролаз, и выявления новых, практически значимых, ферментов с полезными свойствами.
Бациллы в ходе эволюции, выработали сложную и разветвленную регуляторную систему, в основе которой лежит механизм сигнальной трансдукции, а именно, сеть двухкомпонентных систем регуляции экспрессии генов [Aguilar et al, 2001]. Выяснение регуляторных сетей, управляющих экспрессией поздних генов, к которым относятся гены протеолитических белков, открывает новые перспективы в микробной биотехнологии. Молекулярные механизмы, контролирующие интегрированный ответ микробной клетки на изменения среды, в настоящее время изучены недостаточно. Вклад разных систем регуляции в клеточный ответ можно оценить с помощью мутантных штаммов, дефектных по генам регуляторных белков. Способы регуляции экспрессии поздних генов отражены в структуре промоторов, анализ которых позволяет определить потенциальные механизмы активации транскрипции.
Целью работы явился поиск, изоляция и характеристика гена новой металлоэндопептидазы {mprBi) из фрагмента хромосомной ДНК В. intermedins и изучение его экспрессии.
Основные задачи исследования:
1. Установить последовательность нуклеотидов 6 кб фрагмента хромосомной. ДНК В .intermedins, провести поиск, идентификацию и характеристику открытых рамок считывания генов, включая гены протеолитических белков.
2. Клонировать ген внеклеточной металлопротеиназы В.intermedins и провести анализ его структурной организации.
3. Изучить экспрессию гена mprBi в штамме, мутантном по регуляторным белкам DegS-DegU системы сигнальной трансдукции, контролирующей синтез ферментов деградации.
4. Исследовать влияние фактора транскрипции ТпгА, одного из регуляторов азотного обмена у бацилл, на экспрессию гена металлопротеиназы В. intermedins.
5. Изучить экспрессию гена mprBi в штаммах бацилл, дефектных по
Spo белкам, участвующих в споруляции у бацилл.
Научная новизна. Основной научный приоритет работы заключается в идентификации у бацилл нового гена секретируемой металлоэндопептидазы — первого бактериального гомолога эукариотических адамализинов. Установлена последовательность нуклеотидов 6 кб фрагмента хромосомной ДНК В .intermedins, в которой выявлены шесть открытых рамок считывания (AN EU678894). Впервые у микроорганизмов изолирован ген mprBi, кодирующий внеклеточную металлопротеиназу В.intermedins семейства Ml 2 адамализинов/репролизинов клана метцинкинов. Получены приоритетные данные о зависимости экспрессии гена адамализин-подобной металлопротеиназы от DegS-DegU регуляторной системы, контролирующей синтез ферментов биодеградации, ТпгА фактора транскрипции, участвующего в азотном обмене, механизма катаболитной репрессии, а также об отсутствии корреляции экспрессии гена mprBi с процессом спорообразования.
Практическая значимость. Секвенированный фрагмент хромосомной ДНК, содержащий ген металлопротеиназы В.intermedins, занесен в базу данных Международного ГенБанка (AN EU678894) и может быть использован для сравнительного анализа генов и геномов. Результаты секвенирования полного гена mprBi позволили оценить последовательность продукта трансляции, включая сигнальный пептид и пропептидную область белка, а также провести его корректную классификацию. Получен вектор экспрессии pSAl, несущий 1,2 кб вставку с геном mprBi для выделения соответствующего белка и изучения его свойств. Данные о структуре промотора и контроле экспрессии гена mprBi могут быть использованы при конструировании систем экспрессии на основе модификации промотора для практического применения.
Научные положения, выносимые на защиту:
1. Изолированный и охарактеризованный ген В.inter médius кодирует новую металлоэндопептидазу бацилл, которая относится к семейству адамализинов/репролизинов клана метцинкинов и является первым прокариотическим гомологом эукариотических адамализинов.
2. Экспрессия гена mprBi контролируется системой DegS-DegU, которая отвечает за синтез ферментов деградации, фактором транскрипции ТпгА, регулирующим азотный обмен при дефиците этого источника питания, и не зависит от Spo-регуляторных белков, участвующих в контроле споруляции.
Связь работы с научными программами. Работа выполнялась в соответствии с планом НИР Казанского федерального университета (№ гос. регистрации 01:02.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, 7 физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования; выполнены при поддержке грантов РФФИ №05-04-48182 и №09-04-99044, Федеральной: целевой« программы» «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» 2009-2013:гг: РК;№гИ344, ЕК-№ Ш406,.ГК № ГО23; грантом Академии наук Республики Татарстан №14-24/2010 (Г).
Апробация работы: Основные положения, диссертации; были представлены, на международной; научной; конференции! «Ферменты, микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань,, 2005 г.), Международных конференциях для; студентов- аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007, 2008 гг.), Международном симпозиуме «Химия; протеолитических. ферментов» (Москва, 2007 г.), Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008; г.), Российском симпозиуме «Белки- и пептиды» (Казань, 2009 г.), Российской школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и: молекулярной биологии» (Казань, 2010 г.),. Всероссийской;« молодежной научной? конференции «Современные биологические аспекты в фундаментальных исследованиях молодых ученых» (Томск, -2010 г.) и Итоговых научных конференциях студентов КФУ (Казань, 2005,. 2007 гг.), Итоговых научных конференциях сотрудников КФУ (Казань, 2008, 2009, 2010 гг.>
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, из них 6 статей в центральных отечественных и зарубежных рецензируемых журналах. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов: и методов, исследований, раздела экспериментальных исследований^ обсуждения результатов;, выводов, и списка литературы. Работа изложена, на 150 страницах машинописного текста, включает 7 таблиц, 38 рисунков: Библиография содержит 208 наименований, в т.ч. 202- зарубежных авторов;
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Сабирова, Альбина Рушановна
выводы
1. Установлена последовательность нуклеотидов 6 кб фрагмента хромосомной ДНК В.ШегтесИш (АЫ Еиб78894), в которой идентифицированы 6 ОРС, включая две металлопротеиназы - внеклеточная МргВ! и мембраносвязанная РтЬВь Гены не имеют гомологии, соответствующие им продукты относятся к разным кланам белков: М12 и М50.
2. Впервые изолирован и охарактеризован бациллярный ген, кодирующий протеолитический фермент - гомолог эукариотических адамализинов. В структурной области гена тргВ1 выявлены функциональные домены, позволяющие отнести белок к клану метцинкинов.
3. Установлено, что DegS-DegU регуляторная система, контролирующая синтез ферментов биодеградации, играет позитивную роль в регуляции экспрессии гена тргВг.
4. Показано, что экспрессия гена металлопротеиназы В.ШегтесИш регулируется азотной катаболитной репрессией с участием фактора транскрипции ТпгА, а также белков в1пК и АгЩВ, обуславливающих транспорт аммония в клетку.
5. Установлено отсутствие регуляторной взаимосвязи между экспрессией гена тргВг и споруляцией.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Секретируемые гидролазы бактерий в последние годы вызывают как практический, так и научный интерес в качестве модельных объектов для исследования регуляторных процессов. Среди микробных протеаз традиционными объектами исследования у бацилл являются сериновые протеиназы и термолизин. С развитием постгеномных технологий приоритетными стали исследования минорных протеолитических белков с целью выяснения их функциональной роли в клетках и популяциях, а также применения этих белков в практике. Особый интерес представляют цинкзависимые металлопротеиназы клана метцинцинов. Эти ферменты участвуют в белковом круговороте, также они вовлечены в регуляцию активности белков. В клетках эукариот метцинкины участвуют в развитии патологических процессов, таких как ревматоидный артрит, онкологические заболевания и обострение хронических заболеваний. Изучение этих белков является приоритетным в связи с физиологическими и патофизиологическими функциями многих адамализинов/репролизинов, которые остаются не установленными. Несомненно, что эти ферменты приобретают значимость как терапевтические мишени. Поэтому, поиск и выделение их прокариотических аналогов вызывает не только теоретический, но и практический интерес.
Экспрессия генов протеаз в клетках прокариот подвергается множественной, сложной регуляции и функционирует под контролем регуляторных белков двухкомпонентных систем трансдукции сигнала. Контроль, осуществляемый различными регуляторными белками, отражается на построении и организации промоторной области генов протеаз. Современные методы биоинформатики на основе структуры гена позволяют установить потенциальные системы регуляции, участвующие в контроле транскрипции гена. В секретоме бацилл идентифицировано много внеклеточных протеолитических белков, расшифровка и изучение которых пополнит фундаментальные знания о физиологии бацилл и расширит арсенал промышленно важных ферментов новыми белками с интересными практическими свойствами.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы бактерий, векторы, плазмиды и среды культивирования.
Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе, перечислены в табл.2. Плазмида рСМ4, несущая ген металлопротеиназы сконструирована путем лигирования в шатл-вектор рСВ22 (BamHl) фрагмента хромосомы В.intermedins 3-19 по сайту Sau3A (рис.8). Правая часть двурепликонного вектора рСВ22 представляет собой фрагмент плазмиды pUC19 с геном устойчивости к ампициллину (ApR), фрагмент экспрессионной системы лактозного оперона и полилинкер с уникальными сайтами рестрикции ВатШ и В gill. Вторая половина этой плазмиды обеспечивает репликацию в клетках B.subtilis, содержит экспрессинную единицу EU19035, ген устойчивости к эритромицину (EmR), благодаря чему может использоваться, как вектор экспрессии [Сорокин А.В. и др, 1990]. Плазмида pSAl, полученная в работе на основе вектора рСВ22, содержит изолированный ген металлопротеиназы под собственным промотором. В качестве штамма-реципиента для плазмиды с геном металлопротеиназы В. intermedins использовали модельный штамм B.subtilis JB 2036, в хромосоме которого нокаутированы гены внеклеточных протеиназ.
Культивирование бактерий проводили на следующих средах: Среда LB (%): триптон - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,5; NaCl - 0,5; рН 8.5 [Sambrook et al., 1989]. Агаризованная среда LA включала дополнительно 2% агара. Среды для трансформации штаммов B.subtilis включали солевую основу среды Спицайзена, среду Спицайзена I и среду Спицайзена II [Anagnostopolous & Spizizen, 1961]. Синтетическая минимальная среда SMM включала солевую основу, микроэлементы [Saxild and Nygaard., 1987]. Идентификационная агаризированная среда для отбора клонов, способных секретировать протеиназу, включала 30% обезжиренного молока и 2% агара. Среды стерилизовали при 1 атм. в течение 30 мин., pH доводили перед стерилизацией среды 40%-ным раствором NaOH до значения 8,5.
Для создания условий солевого стресса в среду LB дополнительно вносили KCl, NaCl до конечных концентраций 0,25, 0,5, 1,0, 1,5 и 2,0 М и цитрат Na до конечных концентраций 0,25, 0,5, 1 и 1,5 М. Для изучения влияния углеродной катаболитной репрессии в среду SMM вносили 10 мМ глюкозы. Для изучения влияния азотной катаболитной репрессии в среду SMM вносили соли NaNC>3 и NH4C1 в конечной концентрации 20 мМ.
Рис.8. Генетическая карта плазмиды рСМ4, несущая вставку хромосомной ДНК В. intermedins размером в 6 кб.
При выращивании рекомбинантных штаммов в среду вносили антибиотики (конечная концентрация в среде): для штаммов B.subtilis с плазмидами рСВ22, рСМ4, pSAl- эритромицин (20 мкг/мл); для штаммов B.subtilis мутантных по белкам AmtB и ClnK - хлорамфеникол (20 мкг/мл); для штаммов B.subtilis мутантных по белкам DegS и DegU - канамицин (20 мкг/мл).
Pst I (6)
SamHI С5205) BgÜl (5211)
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сабирова, Альбина Рушановна, Казань
1. Дорошчук Н.А. Регуляция азотного метаболизма в грамположительных бактериях Текст. / Hi А. Дорошчук, М. С. Гельфанд, Д. А. Родионов // Мол. Биол. 2006. - Т.40. - №5. - С. 919-26.
2. Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической: активности комплексных препаратов протеаз Текст. // Прикладная биохимия и микробиология. — 1971. — Т.7.- №2ю С.225-228.
3. Каюмов А. Р. Биосинтез субтилизиноподобной сериновой протеиназы Bacillus intermedins'в условиях солевого стресса Текст. / А. Р. Каюмов, Н. П. Балабан, А. М. Марданова, С. В. Костров, М. Р. Шарипова // Микробиология. -2006.
4. Сорокин А.В. Экспрессионная единица в области инициации репликации плазмиды pSM19035 стрептококков Текст. / А.В. Сорокин,
5. B.Э. Хазак // Молекулярная биология. 1990. - Т.4. - С.995-999.
6. Хмельков И. Приложения в составе Vector NTI Suite Текст. / И. Хмельков // www.molbiol.ru.- 2006.
7. Шагимарданова Е.И. Гетерологичная экспрессия гена глутамилэндопептидазы Bacillus intermedins штаммами Bacillus subtilis, дефектными по регуляторным белкам Текст. / Е.И.Шагимарданова, И.Б.Частухина, Т.Р.Шамсутдинов, Н.П.Балабан, А.М.Марданова,
8. C.В.Костров, М.Р.Шарипова // Микробиология. 2007. - Т.76. - №.5. -С.645-651.
9. Akiyama Y. RseP (YaeL), an Escherichia coli RIP protease, cleaves transmembrane sequences Text. / Akiyama Y., Kanehara K., Ito K. // EMBO J.-2004. -V.23. P.4434-4442.
10. Alba B.M. DegS and YaeL participate sequentially in the cleavage of RseA to activate the sigma(E)- dependent extracytoplasmic stress response Text.' / B.M. Alba, J.A. Leeds, C. Onufryk, C.Z. Lu, C.A. Gross // Genes Dev. -2002. -V.16. -P.2156-2168.
11. Alba B.M. Regulation of the Escherichia coli sigmadependent envelope stress response Text. / B.M. Alba, C.A. Gross // Mol. Microbiol. -2004. V.52. - P.613-619^
12. Albano M. The Rok protein of Bacillus subtilis represses genes for cell surface and extracellular functions Text. / M.Albano, W.K. Smits, L.T. Ho, B. Kraigher, f. Mandic-Mulec, O.P. Kuipers, D. Dubnau // J. Bacteriol. 2005. -V.187. - P.2010-2019.
13. Alfandari D. Xenopus ADAM 13 is a metalloproteinase required for cranial neural crest-cell migration Text. / D. Alfandari, H. Couin, A. Gaultier, K. Smith, J.M. White, T. Darribere, D.W. DeSimone // Curr. Biol. 2001. - V.l 1. -P.918-930.
14. Altschul S.E. Basic local alignment search tool Text. / S.E. Altschul, W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, DJ. Lipman // J. Mol. Biol. 1990. -V. 215. - P.403-410.
15. Amati G. DegU~P represses expression of the motility fla-che operon in Bacillus subtilis Text. / G. Amati, P. Bisicchia, A. Galizzi // J.Bacteriol. 2004. - V.l86. - P.6003-6014.
16. Anagnostopolous C. Requirements for transformation in Bacillus subtilis Text. / C. Anagnostopolous, J. Spizizen // Journal of Bacteriology. -1961. V.81. — P.741-746.
17. Ansaldi M. Specific activation of the Bacillus quorum-sensing systems by isoprenylated pheromone variants Text. / M. Ansaldi, D. Marolt, T.
18. Stebe, I. Mandic-Mulec, D. Dubnau // Mol. Microbiol. 2002. - V. 44. - P.1561-1573.
19. Antelmann H. Stabilization of cell wall proteins in Bacillus subtilis: a proteomic approach Text. / H. Antelmann, H. Yamamoto, J. Sekiguchi, M. Hecher // Proteomic. 2002. - V.2. - P.591-602.
20. Babu M.M. General trends in the evolution of prokaryotic transcriptional regulatory networks Text. / M.M. Babu, S. Balaji, L. Aravind // Genome Dyn. 2007. - V.3. - P.66-80.
21. Bacon Schneider K. Characterization of comQ and comX, two genes required for production of ComX pheromone in Bacillus subtilis Text. / K. Bacon Schneider, T.M. Palmer, A.D. Grossman // J.Bacteriol. 2002. - Y.184. -P.410-419:
22. Banse A.V. Parallel pathways of repression and antiperpession governin the transition to stationary phase in Bacillus subtilis Text. / A.V. Banse, A. Chatanet, L. Rahn-Lee, E.C. Hobbs, R. Losick // Microbiol. 2008. -V.105. -No.40. - P.15547-15552.
23. Beck N.A. TcpH influences virulence gene expression in Vibrio cholerae by inhibiting degradation of the transcription activator TcpP Text. / N.A. Beck, E.S. Krukonis, V.J. DiRita // J. Bacteriol. 2004. - V. 186. - P. 83098316.
24. Belitsky B. R. Role of TnrA in nitrogen source-dependent repression of Bacillus subtilis glutamate synthase gene expression Text. / B. R. Belitsky, L. V. Wray, S. H. Fisher, D. E. Bohannon, A.L. Sonenshein // J. Bact. 2000. - V. 182.-P. 5939-5947.
25. Bergara F. CodY is a nutritional repressor of flagellar gene expression in Bacillus subtilis Text. / F. Bergara, C. Ibarra, J. Iwamasa, J. C. PataiToyo, R. Aguilera, L. M. Marquez-Magana // J. Bacteriol. -2003. -V.185. -P.31'18-3126.
26. Bhatt A. Conditional depletion of KasA, a* key enzyme* of mycolic acid biosynthesis, leads to mycobacterial cell lysis Text. / Bhatt A. , L. Kremer, A.Z. Dai,- J.C. Sacchettini, W.R. Jacobs Jr.// J. Bacteriol.-2005. V.187.-P.7596-7606.
27. Blobel C.P. ADAMs and ADAMTs Text. / C.P. Blobel, S.S. Apte // Encaclopedia of Respiratory Nedicine 2006. - P. 19-23.
28. Bobay B.G. Revised structure of the AbrB' N-terminal domain-unifies a diverse superfamily of putative DNA-binding proteins Text. / BtG. Bobay, A. Andreeva, G.A. Mueller, J. Gavanagh, A.G. Murzin // FEBS Lett. -2005. V.579: - P.5669-5674.
29. Bode W. Structure of astacin and implications for activation of astacins and zinc-ligation of collagenases Text. / W. Bode, F.-X. Gomis-Rüth, R. Huber, R. Zwilling, W. Stöcker // Nature. 1992. - V.358, №6382. - P.164-167.
30. Bode W. The metzincins superfamily of zinc-peptidases Text. / W. Bode, F. Grams, P. Reinemer, F-X. Gomis-Rüth, U. Baumann, D.B. Mckay, W. Stöcker // Advan. Exp. Med. Biol. - 1996. - V.389. - P.l-11.
31. Bohn C. Dispensable PDZ domain of Escherichia coli YaeL essential protease Text. / C. Bohn, J. Collier, P. Bouloc, // Mol. Microbiol.-2004.- V.52. -P1427-435.
32. Brandenburg LL. Roles of PucR; GlnR, and' TnrA in regulating expression of the Bacillus subtilis ure P3 promoter Text. / J.L. Brandenburg, L.V. Wray, L. Beier, H. Jarmer, H.H. Saxild, S:H. Fisher. // J Bacteriol. -2002*. -V.184. -P.6060-6064.
33. Brantl S. Characterisation of Bacillus subtilis transcriptional regulators involved in metabolic precesses Text. / S. Brantl, A. Licht // Cutt.Protein Pept. Sei. 2010. - V.l 1. -No.4. - P.274-291.
34. Brocker C.N. Evolutionary divergence and functions of the ADAM and ADAMTS gene families Text. / C.N. Brocker, V. Vasiliou, D. W. Nebert // Human genomics. 2009. - V.4. -No.l. - P.43-55.
35. Brown M.S. Regulated intramembrane proteolysis: a control mechanism conserved from bacteria to humans Text. /M.S. Brown, J. Ye, R.B. Rawson, J.L. Goldstein // Cell. 2000. - V.100. - P.391-398.
36. Brown N.L. The MerR family of transcriptional regulators Text. / N. L. Brown, J. V. Stoyanov, S. P. Kidd, J. L. Hobman // FEMS Microbiol. -2003.-V. 27.-P. 145-163.
37. Bruckner R. Carbon catabolite repression in bacteria: choice of the carbon source and autoregulatory limitation of sugar utilization Text. / R. Bruckner, F. Titgemeyer // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - V. 209. - P. 141-148.
38. Camacho L.R. Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature- tagged transposon mutagenesis Text. / L.R. Camacho, D. Ensergueix, E. Perez, B. Gicquel, C. Guilhot // Mol. Microbiol.- 1999. V. 34. - P. 257-267
39. CampbelL E. A. Crystal structure of Escherichia coli sigma E with the cytoplasmic domain of its anti-sigma RseA Text. / E.A. Campbell, J.L. Tupy, T.M. Gruber, S. Wang, MM. Sharp, C.A. Gross, S.A. Darst // Mol. Celh-2003. -V.lh -P.1067-1078.
40. Chang S. High- frequency transformation of Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA Text. / S. Chang, N. Cohen. // Mol. Gen. Genet. -1979.-V.168.-P.111-115.
41. Chastanet A. Broadly heterogeneous activation' of the1 master regulator for sporulation in Bacillus subtilis Text. / A. Chastanet, D. Vitkup, G.-C. Yuan, T.M. Norman, J.S. Eiu, R.M. Losick // PNAS. 2010. - V.107. -No.18.
42. Chen J.C. A membrane metalloprotease participates in the sequential* degradation of a Caulobacter polarity determinant Text. / J.C. Chen, P.H. Viollier, L. Shapiro // Mol. Microbiol. 2005. - V.55. - P.1085-1103.
43. Dartois V. Characterization of a novel member of the DegS-DegU regulon affected by salt stress in Bacillus subtilis Text. / V. Dartois, M.
44. Debarbouille, F. Kunst, G. Rapoport // J. Bacteriol. 1998. - V.180: - №7. -P.1855-1861.
45. Dervyn E. The bacterial condensin/cohesion-like protein complex acts in DNA repair and regulation of gene expression / E. Dervyn, M.F. Noirot-Gros, P. Mervelet, S. McGovern, S.D. Polard, P.P.&Noirot // Mol.Microbiol.-2004.-V.51.-P. 1629-1640.«
46. Detsch C. Ammonium utilization in Bacillus subtilis: transport and1 regulatory functions of NrgA and NrgB Text. / C. Detsch, J. Stulke // Microbiology. -2003. -V.149. -P.3289-3297.
47. Dineen S.S. Represión of Clostridium difficile toxin gene expression by CodY Text. / S.S. Dineen, A.C. Villapakkam, J.T. Nordman, A.L. Sonenshein // Mol. Microbiol. 2007. - V.66. - P.206-219.
48. Dubnau D. Genetic competence in Bacillus subtilis Text. / D. Dubnau, C.M.Lovett // D.Dubnau, L.A. Sonenshein, J.A. Hoch, R. Losick // In Bacillus subtilis and its closest relatives: from genes to cells. 2002. - P.453-471.
49. Eder S. A Bacillus subtilis secreted phosphodiesterase/alkaline phosphatase is the product of a Pho regulon gene, phoD Text. / S. Eder, L. Shi, K. Jensen, K. Yamane, F.M. Hulett // Microbiology. 1996. - V. 142. - P. 20412047.
50. Ehrmann M. Proteolysis as a regulatory mechanism Text. / M. Ehrmann, T. Clausen// Annu. Rev. Genet. -2004. -V.38.-P.709-724.
51. Engelberg-Kulka H. Bacterial programmed cell death and multicellular behavior in bacteria / H. Engelberg-Kulka, S. Amitai, I. Kolodkin-Gal, R. Hazan // PLoS Genet. 2006. - V.2. - №10. - P. 1518-1526.
52. Erickson R.J. Industrial applications of the bacilli: a review and prospectus Text. / R.J. Erickon // Microbiology. 1976. -P. 406-419.
53. Fabret C. Two-component signal transduction in Bacillus subtilis: how one organism sees its world Text. / C. Fabret, V.A. Feher, J.A. Hoch // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 1975-1983.
54. Feklistov A. Promoter recognition by bacterial alternative sigma factors: the price of hight selectivity? Text. / A. Feklistov, S.A. Darst // Genes Dev. 2009. - V.23. - P.2371-2375.
55. Fisher S H. Mutations in Bacillus subtilis glutamine synthetase that block its interaction with transcription factor TnrA Text. / S.H. Fisher, J.L. Brandenburg, L.V. Wray // Mol Microbiol. -V.2002. -V.45. -P.627-35.
56. Fisher S.H. Novel trans-acting Bacillus subtilis glnA mutations that derepress glnRA expression Text. / S. H. Fisher, L. V. Wray // J Bacteriol. -2009.-V. 191.-P. 2485-2492.
57. Fujita M. The master regulator for entry into sporulation in Bacillus subtilis becomes a cell-specific transcription factor after assymetric division Text. / M.Fujita, R.Losick // Genes Dev. 2003. - V.17. - P.l 166-1174.
58. Fujita M. High- and low-threshold genes in the SpoOA regulon of Bacillus subtilis Text. / M. Fujita, J.E. Gonzalez-Pastor, R. Losick. // J Bacteriol. -2005. -V.187. -P11357-1368.
59. Fujita Y. Carbon catabolite control of the metabolic network in Bacillus subtilis Text. IY. Fujita // Biosci. Biotechnol.Biochem. — 2009. V.74. - No.2. - P.245-259.
60. Ghosh T. Mechanisms for activating bacterial RNA- polymerase Text. / T. Ghosh, D.Bose, X.Zhang // FEMS Microbiol.Rev. 2010. - V.34. -P.611-627.
61. Gohar M. Two-dimensional electrophoresis analysis of the extracellular proteome of Bacillus cereus reveals the importance of the PlcR regulon / M. Gohar, O.A. Okstad, N. Gilois, V. Sanchis, A.B. Kolsto, D.Lereclus //Proteomics.- 2002. V.2. -P.784-791.
62. Gomis-Rüth F.X. Structural aspects of the metzincin clan of metalloendopeptidases Text. // Mol. Biotechnology. 2003. - V.24, №2. -P. 157-202.
63. Gonzalez-Pastor J JE. Cannibalism by sporulating bacteria Text.;/ J.E. Gonzalez-Pastor, E.C. Hobbs, R. Losick // Science. 2003. - V.301. -P.510-513. '••'•!
64. Görke B. Carbon catabolic repression in bacteria: many ways to make the most out of nutrients Text. / B. Görke, J- Stülke // Nat. Rev. Microbiol. -2008. V.6. -P.613-624. ,
65. Guedon E. Overall' control of nitrogen metabolism in Lactococcns lactis by CodY, and possible models for CodY regulation in Firmicutes Text. / E. Guedon, B. Sperandiö, N. Pons, S.D. Ehrlich, P: Renault // Microbiol; 2005. -V.151.-P. 3895-3909.
66. Hamoen L.W. The pleiotropic response regulator DegU functions as priming protein in competence development in Bacillus subtilis Text. / L.M. Hamoen, A.F Van Werkhoven, G.Venema, D.Dubnau // Proc.Natl.Acad:Sci. -2000. V.97. - P.9246-925T.
67. Hamoen B.W. Controlling competence in Bacillus subtilis: shared use of regulators Text. / L.W. Hamoen, G. Venema, O.P. Kuipers // Microbiology 2003. V.- 149. - P19-17.
68. Hamon M.A. Identification of AbrB-regulated genes involved in biofilm formation by Bacillus subtilis Text. / M.A. Hamon, N.R. Stanley, R.A. Britton, A.D. Grossman, B.A. Lazazzera // Mol Microbiol. 2004. - V.-53. -№3.-P. 847-860.
69. Hayashi K. Bacillus subtilis RghR (YvaN) represses rapG and rapH, which encode inhibitors of expression of the srfA operon Text. / K. Hayashi, T. Kensuke, K. Kobayashi, N, Ogasawara, M. Ogura // Mol.Mocrobiol. 2006. -V.59.-1714-1729.
70. Helmann J.D. Compilation and analysis of Bacillus subtilis ctA-dependent promoter sequences: evidence for extended contact between RNA polymerase and upstream promoter DNA / J.D. Helmann // Nucleic Acids Res. -1995.-V.23.-P. 2351-2360.
71. Helmann J.D. RNA polymerase and sigma factors Text./ J.D. Helmann, C.P. Moran // In A.L.Sonenshein, J.A. Hoch, R.Losick Bacillus subtilis and its closest relatives: from genes to cells. 2001. - P.289-312.
72. Hobman J.L. MerR family transcription activators: similar designs, different specificities Text. / J. L. Hobman // Mol. Microbiol. 2007. - V. 63. -P. 1275-1278.
73. Hoch J.A. Two-component and phosphorelay signal transduction Text. // Curr.Op.in Microb. 2000. - V.3. - P.165-170.
74. Hoch J.A. Keeping signals straight in phosphorelay signal transduction Text. / J.A. Hoch, K.I. Varughese // J. Bacteriol. 2001. - V.183. -№17. - P.4941-4949.
75. Ikeda T.P. Salmonella typhimurium apparently perceives external nitrogen limitation as internal glutamine limitation Text. / T.P. Ikeda, A.E. Shauger, S. Kustu // J.Mol.Biol. 1996. - V.259. - P. 589- 607.
76. Ingmer Hi Proteases Abacterial pathogenesis Text.' / H. Ingmer, L. Brondsted // Res Microbiol. 2009. - V.160.- P.704-710.
77. Javelle A. Ammonium* sensing- in Escherichia, coli. Role of the' ammonium- transporter AmtB and AmtB-GlnK complex formation1 Text. / A. Javelle, E. Severi, J. Thornton, M. Merrick // J Biol Chem.- 20041 V.279. -№10. -P.8530-8538.
78. Jiang W. Families of metalloendopeptidases and their relationships-Text. / W. Jiang, J.S. Bond // FEBS Lett. 1992. - V.312, №2-3. - P. 110-114.
79. Jiang M. Differential processing of propeptide inhibitors of Rap' phosphatases in Bacillus subtilis Text. / M. Jiang, R. Grau, M. Perego // J.Bacteriol. 2000. - V. 1*82. - P.303-310.
80. Joseph P. A region of Bacillus subtilis CodY protein required for interaction with DNA Text. / P. Joseph, M. Ratnayake-Lecamwasam, A.L. Sonenshein // J Bacteriol.-2005. -V.187. -P.4127-4139.
81. Kanamaru K. Overexpression of the PepF oligopeptidase inhibits sporulation initiation in Bacillus subtilis Text. / K. Kanamaru, S. Stephenson, M. Perego // J.Bacteriol. 2002. - V.184. - 43-50.
82. Kayumov A. Inactivation of the general transcription factor TnrA in Bacillus subtilis by proteolisis Text. / A. Kayumov, A. Heinrich, M. Sharipova, O. Iljinskaya, K. Forchhammer // Microbiology. 2008. - V. 154. - P. 23482355.
83. Kliademi S. The Amt/MEP/Rh family: Structure of AmtB and the mechanism of ammonia gas conduction Text. / S. Khademi, R.M. Stroud // Physiology (Bethesda). 2006. - V.21. - P.419-429.
84. Kim H. J. Complex regulation of the Bacillus subtilis aconitase gene Text. IH. J. Kim, S. I. Kim, M. Ratnayake-Lecamwasam, K. Tachikawa, A. L. Sonenshein, M. Strauch. // J. Bacteriol. -2003. -V.185. -P. 1672-1680.
85. Kinch L.N. Site-2 protease regulated intramembrane proteolysis: sequence homologs suggest an ancient signaling cascade Text./ L.N. Kinch, K. Ginalski, N.V. Grishin// Protein Sei. -2005.
86. Klein T. Active Metalloproteases of the A Disintegrin And Metalloprotease (ADAM) Family: Biological Function and Structure Text. / T. Klein, R. Bischoff// J. Proteome Res., Article ASAP.-2010.
87. Kobayashi K. Comprehensive DNA microarray analysis of Bacillus subtilis two-component regulatory systems Text. / K. Kobayashi, M. Ogura, H. Yamaguchi, K. Yoshida, N. Ogasawara, T. Tanaka, Y. Fujita. // J. Bacteriol., 2001. -V.183. -P.7365-7370.
88. Kobayashi K. Gradual activation of the response regulator DegU controls serial expression of genes for flagellum formation and biofilm formation in Bacillus subtilis Text. II Mol. Microbiol. 2007. - V.69. - P.395-409.
89. Kodgire P. ScoC and SinR Negatively Regulate epr by Corepression in Bacillus subtilis Text. / P. Kodgire, M. Dixit, K.K. Rao // J.Bacteriol. 2006.- V. 188. No. 17. - P.6425-6428.
90. Kunst F. Salt stress is an environmental signal affecting degradative enzyme synthesis in Bacillus subtilis Text. / F. Kunst, G. Rapoport // J.Bacteriol.- 1995. -V.177. -P.2403-3407.
91. Larseni R. GlnR-mediated regulation^ of nitrogen metabolism in, Lactococcus lactis Text. / R. Larsen, T. G. Kloosterman, J; Kok, O. P. Kuipers // Bacteriol. 2006. - V. 188. - P. 4978-4982.
92. Lewis A.P. A novel clan of zinc metallopeptidases with possible intramembrane cleavage properties! Text. / A.P. Lewis, P.J. Thomas // Peorwin Science. 1999. - V.8. - P.439-442.
93. Louise T. Cloning and expression of a'novel protease gene encoding an extracellular neutral protease from Bacillus subtilis Text. / T. Louise, X.-C. Wu, S.-L. Wong // J.Bacteriol. 1991. - V.173. - №20. - P. 6364-6372.
94. Lövgren A. Molecular characterization of immune inhibitor A, a secreted virulence protease from Bacillus thuringiensis Text. / A. Lövgren, M.
95. Zhang, A. Engstrom, G. Dalhammar, R. Landen // Mol. Microbiol. 1990. - V.4, №12. -P.2137-2146.
96. Ludwig H. The Bacillus subtilis catabolite control protein CcpA exerts all its regulatory functions by DNA-binding Text. / H. Ludwig, J. Stülke // FEMS Microbiol. Lett. -2001. -V.203. -Pi 125-129.
97. Maeda H. Serralysin and related bacterial proteases Text. / H. Maeda, K. Morichara // Methods Enzymol. 1995. - V.248. - P.395-413.
98. Makinoshima H. Regulation of Mycobacterium tuberculosis cell envelope composition and virulence by intramembrane proteolysis Text. / H. Makinoshima, M.S. Glickman // Nature 2005. ~ V.436. -P.406-409.
99. Makinoshima H. Site-2 proteases in prokaryotes: regulated intramembrane proteolysis expands to microbial pathogenesis Text. / H. Makinoshima, M.S. Glickman // Microbes and infection. 2006. - V.8. -P.1822 - 1888.
100. Malke H. CodY-affected transcriptional gene expression of Streptococcus pyogenes during growth in human blood Text. / H. Malke, J.J.Ferretti I I J.Med.Microbiol. 2007. - V.56. - P.707-714.
101. Matson J.S. Degradation of the membrane-localized virulence activator TcpP by the YaeL protease in Vibrio cholera Text. /J.S. Matson, V.J. DiRita // Proc. Natl. Acad. Sei. -2005. V.102. -P.16403-16408.
102. Matthews B.W. Structural basis of the action of thermolysin and related zinc peptidases Text. // Accounts Chem. Res. 1988. - V.21. - P.333-340.
103. McQuade R.S. Control of a^ family of phosphatase regulatory genes (phr) by the alternate sigma factor sigma-H of Bacillus subtilis Text. / R.S. McQuade, N. Cornelia, A.D.Grossman // J.Bacteriol. 2001. - V. 183. - P.4905-49091
104. Miwa Y. Evaluation« and characterization' of catabolite-responsive elements icre) of Bacillus subtilis Text. / Y. Miwa, A. Nakata, A. Ogiwara, M. Yamamoto, Y. Fujita // Nucleic Acids Re. 2000. - V.28. - P. 1206-1210.
105. Molle V. The SpoOA regulon of Bacillus subtilis Text. / V. Molle, M. Fujita, S. T. Jensen, P. Eichenberger, J. E. Gonzalez-Pastor, J. S. Liu, R. Losick // Mol. Microbiol. 2003a. - V. 50.-P. 1683-1701.
106. Msadek T. When the going gets tough: survival strategies and environmental signaling networks in Bacillus subtilis Text. / T. Msadek // Trends Microbiol. -1999. -V.l. -P.201-207.
107. Olmos J. Effects of the sinR and degU32 (Hy) mutations on. the regulation of the aprE gene in Bacillus subtilis Text. / J. Olmos, R. De Anda, E. Ferrari, F. Bolivar, F. Valle. //Mol. Gen. Genet. -1997. -V.253. -P:562-567.
108. Perego M. A new family of aspatryl-phosphate phosphatases targeting the sporulation transcription factor SpoOA of Bacillus subtilis Text. / Mol. Microbiol. 2001. - V.42. - P.133-144.
109. Petrsohn A. Global analysis ofthe general stress response oiBacillus subtilis Text. / A. Petrsohn, M. Brigulla, S.Haas, J;D. Hoheisel, U. Volker, M.Hecker // J.Bacteriol. 2001. - V. 183. - P.5617-5631.
110. Piggot P.J. Sporulation of Bacillus subtilis Text. / P.J. Piggot, D.W. Hilbert// CunOpim Microbioli 20041—Y.7. -P;579 - 586.
111. Porter S. The AD AMTS metalloproteinases Text. / S. Porter, I.M. Clark, L. Kevorkian, D.R. Edwards //Biochem. J. 2005. - Y.386. - P. 15-27.
112. Pottathil M. The extracellular Phr peptide-Rap phosphatase signaling circuit of Bacillus subtilis Text. / M.Pottathil, B.A. Lazazzera // Front Biosci. -2003.- -V.8. -P.32-45.
113. Pruitt K. R'efSeq and LocusLink: NCBI gene-centered resources Text. / K. Pruitt, D. Maglott // Nucleic Acids Res.- 2001. N.29. - P. 137-140.
114. Ratnayake-Lecamwasam M'. Bacillus subtilis CodY represses early-stationary-phase genes by sensing GTP levels Text. / M. Ratnayake-Lecamwasam, P. Serror, K. W. Wong, A. L. Sonenshein // Genes Dev. 2001. -V. 15.-P. 1093-1103.
115. Rawlings N.D. Evolutionary families of peptidases Text. / N.D. Rawlings, A.J. Barrett // Biochem J. 1993. - V.290. - P.205-218.
116. Rawlings N.D. Evolutionary families of metallopeptidases Text. / N.D. Rawlings, A.J. Barrett // Methods Enzymol. 1995. - V.248; - P.183-228.
117. Rawlings N.D. MEROPS: the peptidase database Text. / N.D: Rawlings, F.R. Morton, A.J. Barrett// Nucleic Acid Research. 2006. - V.34. -P.270-272.
118. Rey M.W. Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species Text. / M.W*. Rey, P. Ramaiya, B.A. Nelson, S:D: Brody-Karpin, EJ. Zaretsky,
119. M. Tang, A.L. de Leon, H. Xiang, V. Gusti, I.G. Clausen, P.B. Olsen, M.D.j
120. Rudner D.Z. A family of membrane-embedded metalloproteases involved in regulated proteolysis of membrane-associated transcription factors Text. / D.Z. Rudner, P. Fawcett, R. Losick // Proc. Natl. Acad. Sei.- 1996. V. 96. -P. 14765-14770.
121. Rudner D.Z. A sporulation membrane protein tethers the prosigmaK processing enzyme to its inhibitor and dictates its subcellular localization Text.,/ D.Z. Rudner, R. Losick // Genes Dev. 2002. - V.16/ - P. 1007-1018.
122. Saile E. Control of anthrax toxin gene expression by the transition^ state regulator abrB Text. / E. Saile, T.M. Koehler // J.Bacteriol. 2002. -V. 184.-P.370-380.
123. Sambrook J. Molecular Cloning: a laboratory manual—second edition Text. / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis // Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.-V. 1,2,3.
124. Saxild H.H. Genetic and physiological characterization of Bacillus$subtilis mutants resistant to purine analogs Text./ H.H. Saxild, P. Nygaard // J Bacteriol. 1987. - V.169. - P. 2977-2983.
125. Schumacher M.A. Structural basis for allosteric control of the transcription regulator CcpA by the phosphoprotein HPr-Scr46-P Text. / M.A. Schumacher, G.S. Allen, M. Diel, G. Seidel, W. Hillen, R.G. Brcnnan // Cell. -2004. V. 118.-P.731-741.
126. Seals D.F. The ADAMS family of metalloproteases: multidomain protein with multiple functions Text. / D.F. Seals, S. Courtneidge // Gene. -2003. V.17,№1. - P.7-30.
127. Shafikhani S. H. Postexponential; regulation of .sw operon expression in Bacillus subtilis Text. / S. H. Shafikhani, I. Mandic-Mulec, M. A. Strauch, Ii. Smith, T. Leighton // J. Bacterid. -2002. V. 184. - P.564-571.
128. Shivers R. Pi Activation of the Bacillus subtilis global regulator CodY by direct interaction with branched-chain amino acids Text. / R. P. Shivers, A. L. Sonenshein // Mol. Microbiol. -2004. -V.53. -P.599-611.
129. Shivers R. P. Positive regulation of Bacillus subtilis ackA by« CodY and CcpA: establishing a potentional hierarchy in carbon flow Text. / R. P. Shivers, S.S. Dineen, A. L. Sonenshein // Mol. Microbiol. -2006. -V.62. -P.811-822.
130. Sleator R.D. Bacterial osmoadaptation: the role of osmolytes in bacterial stress and virulence Text. / R.D. Sleator, C. Hill // FEMS Microbiol. -2002. Rev.26. - P.49-71.
131. Smits W.K. Temporal separation of distinct differentiation pathways by a dual specificity Rap-Phr system in Bacillus- subtilis Text. / W.K. Smits // Mol. Microbiol. 2007. - V.65. - P. 103-120.
132. Smits W.K. The Transcriptional1 Regulator Rok Binds A+T-Rich DNA and Is Involved in Repression of a Mobile Genetic Element in Bacillus subtilis / W.K. Smits, A.D. Grossman // PLoS Genet.- 2010. V.6. - №11. -el001207.
133. Sonenshein A.L. CodY, a global regulator of stationary phase and virulence in Gram-positive bacteria Text. / A.L.Sonenshein // Curr. Opin.Microbiol. 2005. - V.8. - P.203-207.
134. Stöcker W. Structural features of a; superfamily of zinc-endopeptidases: the metzincins Text. / W. Stöker, W. Bode // Gurr, Opin Struct Biol. 1995. V.5. - P.383-390.
135. Stulke J. Garbon catabolite repression in bacteria Text. / J. Stulke; W. Hillen // Gurr. Opin. Microbiol. 2000. - V. 2. - P. 195-201.
136. Sullivan D.M. Insights into the nature of DNA binding of AbrB-like transcription factors Text. / D.M. Sullivan,1 B.G. Bobay, D.J. Kojetin, R.J. Thompson, M. Ranee, M.A. Strauch, J: Cavanagh // Structure.,- 2008. V.16. -No.l 1. - P. 1702-1713. '
137. Tjalsma H; Signal peptide-dependent protein transport in Bacillus subtilis: a genome-based survey of the secretome Text. / H; Tjalsma, J.D. Bolhuis, D.H. Jongbloed, S. Bron, J.M. van Dijl // Microbil.Mol.Biol.Rev. -2000.-V.64.-P.515-547.
138. Thomason P.'Eukaryotic signal transduction via, histidine- aspartate phosphorelay Text. / P. Thomason, R. Kay // J. Gell Sei. 2000. - V. 1.13. - P. 3141-3150.
139. Tsukahara K. Promoter selectivity of the Bacillus subtilis response regulator DegU, a positive regulator of the fla/che operon and sacB Text. / K. Tsukahara, M. Ogura //BMC Microbiology. 2008. - V. 8. - №8. - P.
140. Veening J.-W. Transient heterogeneity in extracellular protease production by Bacillus subtilis Text. / J.-W. Veening, Igoshin O.A., Eijlander R.T., Nijland R., Hamoen L.W., Kulpers O.P. // Molecular Systems Biology. -2008. V.4.-P.
141. Weicket M.J. Site-directed mutagenesis ' of a catabolite repression operator sequense in Bacillus subtilis Text. / M.J. Weicket, G.H. Chambliss // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1990. - V. 78. - P. 6238-6242.
142. Weihofen A.' Intramembrane-cleaving proteases: controlled liberation of proteins and bioactive peptides Text. / A. Weihofe, B. Martoglio // Trends Cell Biol. 2003. - V. 13. - P.71-78.
143. White J.M. ADAMs: modulators of cell-cell and cell-matrix interaction Text. // Curr. Opin. Cell Biol. 2003. - V.15. - P.598-606.
144. Wray L. V. Bacillus subtilis glutamine synthetase controls gene expression through a protein-protein interaction with transcription factor TnrA Text. / L. V. Wray, J'. M. Zalieckas, S. №. Fisher // Cell.- 2001. - V. 107. - PI 427-435.
145. Wray L.V. Functional" analysis, of the carboxy-terminal region of Bacillus subtilis TnrA, a MerR family protein-Text. / L.V. Wray, S: H. Fisher // J. Bacteriol. 2007. - V. 189. - P.20-27
146. Yao F. Independent and interchangeable multimerization domain of the AbrB, Abh and SpoVT flobal regulatory proteins Text., / F. Yao, M.A. Strauch // L. Bacteriol. -2005. V. 187. - No. 18. -P.6354-6362.
147. Yiallouros I. The roles of G1Û93 and Tyrl49 in astacin-like zinc peptidases Text. /1. Yiallouros, E.G. Berklioff, W. Stocker // FEBS Lett. 2000. - V.484,№3. - P.224-228.
148. Yoshida K.I. Combined transcriptome and' proteome analysis as a powerful approach to study genes under glucose repression in Bacillus subtilis Text. / K.I.Yoshida, K. Kobayashi, Y. Miwa. // Nucleic Acids Res. -2001. -V.29. -P.6683-6692.
149. Yoshida K. Identification of additional TnrA-regulated genes of Bacillus subtilis associated with a TnrA box Text. / K. Yoshida, H. Yamaguchi, M. Kinehara, Y. H. Ohki, Y. Nakaura, Y. Fujita // Mol. Microbiol. 2003. - V. 49.-P. 157-165.
150. Yu Y.-T. N. Evidence that SpoIVFB is a novel type of membrane metalloprotease governing intercompartmental communication during Bacillus subtilis sporulation Text. / Y.-T. N. Yu, L. Kroos // J. BacterioL-2000. V.182. -P.3305-3309.
151. Zhang Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences Text. / Z. Zhang, S. Schwartz, L. Wagner, W. Miller // J. Comp. Biol. 2000. - N.7. -P.203-214.
152. Zhou R. BofA protein inhibits intramembrane proteolysis of pro-sigmaK in an intercorapartmental signaling pathway during Bacillus subtilis sporulation Text. / R. Zhou, L. Kroos / Proc. Natl. Acad. Sei. 2004. - V.101. -P.6385-6390.
153. Zhu G.Z. Testase 1 (ADAM 24) a sperm surface metalloprotease is required for normal fertility in mice Text. / G.Z.Zhu, S.Gupta, D.G.Myles, P.Primakoff // Mol.Reprod.Dev. 2009. - V.76. - №.11.-P.l 106-1114.
-
Сабирова, Альбина Рушановна
-
кандидата биологических наук
-
Казань, 2011
-
ВАК 03.02.03
- Биосинтез внеклеточных гуанилспецифичных рибонуклеаз Bacillus thuringiensis и Bacillus circulans
- Биологические эффекты бациллярных протеиназ
- Разработка технологии получения протеолитического ферментного комплекса из бактерий рода Bacillis
- Новая секретируемая металлоэндопептидаза Bacillus intermedius
- Экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius в рекомбинантных штаммах Bacillus subtilis
