Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура ДНК, элиминируемой в ходе диминуции хроматина у Cyclops Kolensis (Crustacea: Copepoda)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структура ДНК, элиминируемой в ходе диминуции хроматина у Cyclops Kolensis (Crustacea: Copepoda)"

На правах рукописи

^(Р0 Бойкова

Татьяна Валерьевна

СТРУКТУРА ДНК, ЭЛИМИНИРУЕМОЙ В ХОДЕ ДИМИНУЦИИ ХРОМАТИНА У CYCLOPS KOLENSIS (CRUSTACEA: COPEPODA)

Генетика 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2006

Работа выполнена в лаборатории молекулярной цитогенетики Института цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Научный руководитель: чл.-кор. РАН, доктор биологических наук,

профессор Жимулёв Игорь Федорович Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Высоцкая Людмила Васильевна Новосибирский Государственный Университет, г. Новосибирск

доктор биологических наук, Вершинин Александр Васильевич Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт биологии гена РАН, г. Москва

Защита состоится 7" JJLClSu 2006 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адрес;. 630090, г.Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10. e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан " 7 " afipe*X3~ 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

дообА IliS

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Результаты недавних проектов по секвенированию геномов различных видов животных и растений, а также генома человека, подтвердили тот факт, что бблыпую часть генома эукариот составляют некодирующие последовательности ДНК. Однако данное открытие не только не разрешило загадку парадокса размера генома эукариот, так называемый С-парадокс, но поставило перед учеными новые вопросы о функциональной необходимости и роли данной ДНК.

В настоящее время в качестве попытки разрешения этой загадки было предложено одновременно два направления: первое - это сравнение ортологических последовательностей ДНК хорошо изученных и довольно близких видов, второе, развиваемое в настоящей работе, - изучение фрагментов ДНК, элиминируемых в процессе диминуции хроматина (ДХ). Данное явление, хотя и было открыто около 120 лет тому назад, до сих пор слабо изучено методами молекулярной генетики у многоклеточных животных. ДХ является запрограммированным в онтогенезе процессом, в ходе которого происходит необратимая потеря части генетического материала из генома соматических клеток. В связи с этим, ДХ может быть рассмотрена как биологическое явление, при котором клеточный механизм как бы освобождает геномы соматических клеток от избытка ДНК.

В качестве объекта для изучения ДХ и, в частности, структуры элиминируемой ДНК (эДНК) нами был выбран вид Cyclops kolensis из московской популяции. Представители семейства Cyclopoidae являются удобными, хотя и довольно трудными объектами. Главной особенностью, определившей перспективность Cyclopoidae, является элиминация огромной доли генома в клетках зародышевого пути (у С. kolensis - до 94%) при сохранении исходного числа хромосом (Гришанин и др., 1996). Кроме того, упаковка эДНК в специфические гранулы позволяет экстрагировать образцы данной ДНК для изучения ее молекулярной структуры.

Немецкая исследовательница Сигркд Берман подробно изучила методами цитогенетики различные виды рода Cyclops ещё во второй половине прошлого столетия. Она показала, что количество элиминируемой ДНК, а также её расположение в ядрах делящихся клеток видоспецифичны (Beermann, 1977). Однако в литературе встречается достаточно много противоречий в характеристике процесса ДХ даже у циклопов, отнесенных к одному и тому же виду. Это может быть связано с ошибкой в идентификации видов по морфологическим признакам, которая, в частности, у представителей копепод представляет, как правило, серьезные трудности. Поэтому изучение картины процесса диминуции у С. kolensis из байкальской популяции является не только интересным и важным, но и позволяет провести сравнительный анализ двух географически изолированных популяций: московской и байкальской. Это позволило бы ответить и на вопрос, может ли ДХ быть использована в качестве одного из признаков для идентификащш_внаов..__

РОС. I

В 1998 г. А.П. Акифьевым было выдвинуто предположение о том, что избыточная ДНК создает уникальный молекулярный портрет генома вида и, таким образом, служит фактором генетической изоляции, препятствуя синапсису гомеологичных хромосом в первом поколении межвидовых гибридов (если таковые могут возникать) (Акифьев и др., 1998). Сравнение геномов С. kolensis из московской и байкальской популяций (в первую очередь, размеров тотального и постдиминуционного генома, временнбй картины протекания процесса диминуции; гомологии последовательностей эДНК) может дать информацию, свидетельствующую в пользу данной гипотезы, либо ее опровергающую. Ыель и задачи исследования

Целью данной работы было изучение молекулярной структуры последовательностей ДНК, элиминируемых в процессе диминуции у Cyclops kolensis (Crustacea: Copepoda), и их сравнительный анализ у представителей двух географически изолированных популяций (московской и байкальской). В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Изучить структуру последовательностей ДНК, элиминируемых в процессе диминуции у С. kolensis из московской популяции:

а) с помощью метода микродиссекции собрать материал гранул, содержащих эДНК;

б) клонировать и определить первичную структуру ДНК, экстрагированной из дкминуциоикых гранул; провести компьютерный анализ структуры последовательностей эДНК.

2. Провести сравнительный анализ структуры последовательностей ДНК постдиминуционного генома С. kolensis из московской популяции и эДНК:

а) создать клонотеку постдиминуционной ДНК генома С. kolensis из московской популяции;

б) изучить структуру полученных последовательностей ДНК;

3. Оценить консерватизм структуры генома С. kolensis из двух географически изолированных популяций: московской и байкальской:

а) исследовать картину ДХ у С kolensis из байкальской популяции, определить стадию деления, во время которой проходит ДХ, продолжительность интерфазы, предшествующей процессу диминуции;

б) определить, насколько последовательности эДНК, полученные из диминуционных гранул у С. kolensis из московской популяции, являются консервативными: показать с помощью ПЦР анализа присутствие (или отсутствие) данных последовательностей в додиминуционном геноме С kolensis из байкальской популяции и сравнить их нуклеотидный состав.

4. Выявить, удаляются ли полностью во время ДХ последовательности ДНК, полученные из диминуционных гранул.

Научная новизна

Впервые получены последовательности ДНК, элиминируемые из хромосом презумптивных соматических клеток Cyclops kolensis (Crustacea: Copepoda) в процессе диминуции хроматина. Проведен компьютерный анализ и выявлены

закономерности в организации данных последовательностей нуклеотидов, свидетельствующие о высокой степени упорядоченности в организации ДНК, ограниченной клетками зародышевого пути.

Впервые проведено сравнительное изучение последовательностей эДНК геномов двух географически изолированных популяций С. kolensis: московской и байкальской, обнаружена высокая консервативность данных последовательностей.

Показано, что ДХ может использоваться в качестве одного из важных признаков при определении видов рода Cyclops (Cyclopoidae), что снимает ряд > противоречий между литературными данными относительно корректности

идентификации видов

Практическая ценность

Впервые с помощью микродиссекции получена библиотека фрагментов 1 эДНК Cyclops kolensis. Определена первичная структура ДНК,

экстрагированной из диминуциокных гранул, и проведен компьютерный анализ структуры данной ДНК. Последовательности эДНК являются АТ-богатыми и насыщены повторами. Показана мозаичная структура многих повторов и высокая степень гомологии внутри отдельных семейств повторов.

Впервые изучена каргина ДХ у С kolensis из байкальской популяции. ДХ происходит во время 4-го деления дробления с сохранением числа хромосом (2п=22), длительность предаиминуционной интерфазы составляет 9-10 часов, как и у С. kolensis из московской популяции.

Показано, что, во-первых, 20 из 21 проанализированного фрагмента, полученного из диминуционяых гранул С kolensis из московской популяции, присутствуют s геноме С. kolensis из байкальской популяции, во-вторых, данные последовательности эДНК не полностью элиминируются во время ДХ и присутствуют в постдиминуционном геноме циклопов из обеих популяций. Изучаемые фрагменты эДНК являются консервативными (90-99% гомологии).

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на международных конференциях в докладах и стендовых сообщениях: на III Международной конференции «Проблема вида и видообразования» (Томск, 2005), 9th International Conference on Copepoda (Hammamet, Tunisia, 2005), 7th International Conference on Drosophila Heterochromatin (Gubbio, Italy, 2005), 4-ой Верещагинской Байкальской конференции (Иркутск, 2005).

Публикации

По теме диссертации опубликовано или находится в печати 8 работ.

Обьем работы

Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, разделов Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Выводы и списка цитируемой литературы, в который входит 163 ссылки. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 17 рисунков.

Вклад автора

Основные результаты получены автором самостоятельно. Микродиссекция гранул эДНК была проведена совместно с д.б.н. Рубцовым Н.Б. (КЦиГ, СО РАН) и к.б.н. Гришаниным А.К. (ИОГен, РАН). Работа по секвенированию последовательностей эДНК была проведена автором в лаборатории проф. М. Эшбернера (Университет Кэмбриджа, Англия).

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность член-корр. РАН Жимулеву И.Ф. и профессору Акифьеву А.П. за помощь в работе и обсуждении результатов; д.б.н. Рубцову Н.Б. за проведение микродиссекции; проф. М. Эшбернеру за предоставленную возможность провести секвенирование клонов на базе его лаборатории. Особая благодарность директору Лимнологического института СО РАН (г. Иркутск) академику РАН Грачеву М.А. и сотрудникам данного института к.б.н. Мельник Н.Г. и Наумовой Е.Ю. за предоставленную возможность работать и помощь в сборе материала, за взаимное сотрудничество и обучение идентификации некоторых видов рода Cyclops, а также сотрудникам института Общей генетики РАН (г. Москва) к.б.н. Гришанину А.К. и Кетовой Т.А. Автор благодарен всем без исключения сотрудникам лаборатории молекулярной цитогенетики (в особенности к.б.н. Белякину С.Н. и аспирантке Зоткевич Е.А.) за их постоянную помощь.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вид Cvcloos kolensis Lillebore 1901. Самок с яйцевыми мешками, в которых находятся зародыши, собирали в период с 2001 г. по 2005 г. в Марьинском пруду на Воробьевых горах в Москве и в период 2004 - 2005 г.г. в прибрежной части (на глубине 7-10 метров) озера Байкал вблизи стационара Лимнологического института (г. Иркутск) в Больших Котах. Определение проводили по Монченко (Монченко, 1974) (табл. 1).

Анализ нуклеиновых кислот. Все эксперименты, связанные с очисткой и анализом нуклеиновых кислот выполняли методами, изложенными в руководстве Sambrook et al., 1989, с некоторыми модификациями.

Микродиссекшио гранул и создание библиотеки эДНК выполняли по методу, описанному в статьях (Telenius et al., 1992; Rubtzov et al, 1996) с небольшими модификациями (рис. 1).

Флуоресцентную гибридизацию in situ (FIS№ и детекцию сигнала (авидин-FiT S/биотинилированный антиавидин/авидин-FITS) проводили по стандартным методикам (Lichter et al, 1988; Karamysbeva et al., 2001).

Компьютерный анализ нуклеотидиых последовательностей ДНК. Для оценки гомологии нуклеотидных последовательностей фрагментов эДНК применяли тест на множественное сравнивание (AliBee-MultipIeAlignment: http://www.genebee.msu.su/services/malign_reduced.htmî).

Для поиска мотивов использовали программу MEME (http://meme.sdsc.edu/meme/website/meme.html).

Для анализа последовательностей нуклеотидов в ДНК использовали компьютерные программы: DNASIS (Hitachi Software Engeneering Co. LTD, 1984, 1989); DNA Strider V 1.2 (CEA); MAR-Finder (Singh et al., 1997) на сервере http://www.ncgr.org/MarFinder/; BLAST v.2.0 (Altschul et al, 1997) на сервере http://www.ncbi.nlrn.nih.gov/cgi-bin/BLAST.

Все нуклеотидные последовательности полученных фрагментов элиминированной ДНК Cyclops kolensis московской популяции зарегистрированы в базе компьютерных данных (GenBank Accession Numbers: AY533039-AY533099).

Таблица 1. Источники получения последовательностей ДНК и сокращенные названия клонов

название клона полное название клона дополнительная информация источник получения последовательностей ДНК

CkD Cyclops kolensis Drops последовательности элиминируемой ДНК диминуционные гранулы/капли, цитологические препараты ядер во время 5-го деления дробления

glCkM germ line Cyclops kolensis Moscow . последовательности ДНК из генома до диминуции яйцевые мешки на стадии 4-8 клеток, С Шеги^я из московской популяции

glCkB germ line Cyclops kolenis Baikal последовательности ДНК из генома до диминуции яйцевые мешки на стадии 4-8 клеток, С ко!еп$1? т байкальской популяции

sCkM somatic Cyclops kolensis Moscow последовательности ДНК из генома после диминуции лапки С ко1етЬ из московской популяции

sCkM somatic Cyclops kolensis Baikal последовательности ДНК из генома после диминуции яап.'си С кокгки из байкальской популяции

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение диминуционной ДНК С. kolensis

.Постдиминуционные гранулы собирали с сухих цитологических препаратов с помощью микроманипулятора. Получение диминуционной ДНК циклопа проводили методом микродиссекции с последующей амплификацией с помощью DOP-PCR. В результате нами были получены фрагменты ДНК длиной 100-1000 п.н. Часть этого материала была помечена биотином и использована в качестве зонда при гибридизации in situ, оставшийся продукт был клонирован в плазмидный вектор pGEM-T Easy (Promega). С помощью гибридизации диминуционной ДНК с додиминуционными хромосомами циклопа было показано, что последовательности эДНК присутствуют в большей или меньшей доле во всех хромосомах. Сигналы гибридизации указывают на то, что ДНК, подлежащая удалению, располагается в различных районах хромосом: около теломер, в прицентромерных участках, либо в других районах хромосом, не связанных ни с теломерами, ни с центромерами (рис. 2).

Рисунок 1. Сбор материала гранул с эДНК.

а, Цитологический препарат ядер во время пятого деления дробления (стрелкой указана гранула); б. удаление гранулы стеклянной иглой при помощи микроманипулятора; в. перенос материала граиуль: в пипе!ку Пастера; г. контрольная фотография микроиглы после переноса материала (стрелкой показано отсутствие материала гранулы на кончике иглы).

Л *Ъ

V i if * • »

Щф > Ч> j

Рисунок 2. Флуоресцентная гибридизация in situ материала постдиминуционных гранул, I меченного биотином, с додиминуционными I хромосомами циклопа. Участки, окрашенные черным -места гибридизации элиминированной ДНК с I хромосомами.

Общая характеристика последовательностей эДНК

В результате клонирования было получено и секвенировано 90 клонов, длина которых варьировала от 129 до 650 п.н. (средняя длина составила 351 п.н., их общая длина - 31564 п.н.). Данные клоны были названы CkD (Cyclops kolensis Drop). При анализе суммарного нуклеотидного состава обращает на себя внимание преобладание АТ-пар (61.1%) по сравнению с GC-парами (соответственно 38.9%). Последовательность нуклеотидов каждого фрагмента была переведена в аминокислотную последовательность во всех шести рамках считывания. Сравнение их с соответствующими банками данных * (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bia/BLAST') существенной гомологии не

выявило. При сравнении последовательностей нуклеотидов всех 90 фрагментов между собой мы обнаружили, что в полученной клонотеке присутствуют:

-19 уникальных фрагментов:

- 30 фрагментов, высокогомологичных по нуклеотидному составу (77-96%). но не идентичных на 100%. Мы разделили их на 7 семейств повторов:

- 41 клон входил в состав 8 групп фрагментов ДНК, которые состояли из точных копий:

В дальнейшем, анализ последовательностей эДНК мы вели в двух направлениях:

1.Отдельный анализ фрагментов внутри каждого из 7 семейств повторов. 2. Для получения более реального представления о молекулярной сложности эДНК была составлена выборка (S1), в которую вошли все «уникальные» фрагменты и по одному представителю из каждого семейства повторов и фрагментов, имеющих свои точные копии. С одной стороны, это исключает риск того, что программа поиска будет выдавать, прежде всего, мотивы, характерные для семейств повторов, с другой стороны, поскольку один из представителей будет участвовать в поиске с другими фрагментами, то можно ожидать, что мы получим более короткие гомологичные мотивы, присущие всем или, по крайней мере, большинству последовательностей эДНК.

I Анализ последовательностей внутри семейств повторов

В полученной нами клонотеке выделено 7 семейств повторов. С помощью компьютерной программы по поиску повторяющихся мотивов (http://meme.sdsc.edu/meme/website/meme.html'i мы анализировали последовательности данных фрагментов внутри каждого отдельно взятого семейства. В качестве примера рассмотрим первое семейство, включающее в свой состав 9 клонов (рис. 3). Было выявлено 10 мотивов (№1-10) длиной от 11 до 79 п.н. Из них 4 мотива входят в состав последовательностей всех 9 клонов - это мотивы №1 (56 п.н.), №2 (56 п,н.), №3 (41 п.н.), № 5 (11 п.н.). Расположение мотивов внутри фрагментов может быть одинаковым, например, мотив №1 во всех клонах находится между мотивами №5 и №3, либо может различаться, например, мотив №2 в клонах CkD 8, 75, 106 и 122

находится между №4 и №9, в клонах CkD 20, 57, 131 и 112 - между мотивами №6 и №7, а в CkD 53 - между №4 и №6.

-С

- 111111111 мтмшш-

11- Щ -56П.н - TAGGGAC-AGAGTTTTCTCAATGTTACrCTCCCAT/lCAACCTAGTTTCAIJTGTAAAT

и- ш -56 п н. - GJLOCTCCCAGCArCGGTiCA"TTCCCTTi.ATrrCXATACTTCCATTCiCATCTGTC

[31- ■ -41 п н - С TG ATGGTT7GTAG AGATCC А AC AGAACJTCCTCC GGC GCG

И1 о -29 п н - TTGJCAGTCGTA1GAACATACTATTTTGA

{5|- ■ -11 п и - GGATCCTACiC

¡6)- ш -15 п н - С АТААС С AGGTTAAC

171- ess -21 п н - Т AGTC G7TC 7Т АС С АСТС-ТСА

[91- □ -79 пн - GGCAATCTTGTATAGGTCCATCAGCTTTCTTATGrACTCCTCAGCCTGGGCTATGATA TGTOGCTTATAGGGGGCTTTC

(9!- О - 20пн - TTCiGACTCAACCTCGTTAT

¡10]- в -15 п н - ccgigaaagccccc?

Рисунок 3. Мотивы внутри иуклеотидных последовательностей семейства повторов №1 »ДНК С. кокюю.

Мотивы обозначены прямоугольниками с разной штриховкой. На оси ординат указаны названия клонов эДНК, по оси абсцисс отложено расстояние в п.н.

Таким образом, было показано, что до диминуции хроматина в геноме С. ¿о/едай из московской популяции присутствуют высокогомологичные последовательности ДНК, которые в свою очередь состоят из мотивов. Данные мотивы могут быть расположены в одинаковом порядке, однако спейсеры между такими мотивами отличаются по длине и нуклеотидному составу.

Анализ выборки SI

В выборку S1 вошли «уникальные» фрагменты и по одному представителю из каждого семейства повторов и фрагментов, имеющих свои точные копии В результате число клонов, оставленных для дальнейшего анализа, сократилось до 34. Их общая длина составила 10810 п.н., средняя длина - 318 п.н.

При дальнейшем анализе 34 клона выборки S1 тестировали на присутствие внутри каждого отдельно взятого фрагмента гомологичных последовательностей, т.е. повторов. Учитывали повторы длиной от 7 п.н. Обнаружено, что изучаемые 34 фрагмента эДНК С kolensis насыщены довольно короткими прямыми и обратными повторами, длиной от 7 до 40 п.н. Выло выявлено, что в составе каждого фрагмента, за исключением пяти клонов (CkD 19, 24, 31, 71, 103), присутствуют от 1 до 6 различных семейств повторов ([d1]-[d71] - нумерация повторов внутри «dentro» последовательности отдельно взятого клона; знаком отмечена их ориентация -прямая (i-) или обратная (-); цифры между повторами обозначают длину спейсера в п.н.). Например:

CkD 8: 14-[-^^9] -36- [+d9]-93-[+d9] -[+ci9]-4-t+ciH]-16-[+dl0] 132-[-dl0]-19-[+dll]-87 [d9] - 11 п.н. - GGCTTATTCGG [dlO] - 8 п.н. - CTACAAAC [dll] - 7 п.н. - CAGGCGC CJcD62: 4~[+d4 9]-12-[+d49]-15-[+d4 9]-l-[+d49]-2-[+d48]-5-[d48¡ - 40 п.н. - CAAGTTTCAGGAGACAGAATGTCCCACCAAAGTGACAGCA [d49] - 21 п.н. - GAAAATGTCCCATGACCAAAC

Следующим шагом нашей работы был поиск «общих» мотивов, т.е. мотивов, которые присутствуют во всех или большинстве последовательностях фрагментов эДНК. Во внимание принимались мотивы длиной не менее 15 п.н. Выявлено 10 мотивов (gl-gl0 - нумерация «общих» «generale» мотивов) длиной от 15 до 31 п.н., которые присутствуют в составе 28 из 34 фрагменюв (рис. 4). Особый интерес представляют мотивы g2, присутствующий в 22 копиях в 12 фрагментах; g3 — 17 копий в 13 фрагментах; g8 - 15 копий в 13 фрагментах; g5 и g9 - по 8 копий в 7 фрагментах.

В качестве примера разберем структуру одного клона, принадлежащего семейству повторов №1: CkD8 (рис. 5). Обобщенные результаты анализа показывают, что во фрагменте CkD8 имеются протяженные повторы, спейсер между повторами 8 и 3 одновременно является повторяющимся мотивом glO, который присущ большинству клонов из выборки S1 и повтором d9, который был обнаружен внутри клона. Спейсер между повторами 2 и 9 является частью мотива gl, а между 9 и 3 - частью повторяющегося мотива g7.

Таким образом, главным заключением из проведенной части работы являются два факта:

- мозаичная структура многих повторов в додиминуционном геноме;

- высокая степень гомологии внутри отдельных семейств повторов.

СМ>18: 173- [-д1] -32- [+дЗ] -2

СЫЗЗО: 33-[+д9]-109-[-д8]-27-[+д8]-23-[-д1]-91

СЫ)62: 37-[+д4]-15-[+д4]-8-[+д1]-11-[+д1]-14-[+д1]-11-[+д1]-24

СИ>55: 99-[-д4]-98-[+дЗ]-40-[+д5]-146-[-д8]-62

СМЭ126: 137-[-дЗ]-8-[+д4]-17-[+д4]-1

СкОЗ: 25-[+д4]-104-[-д8]-115

СЫ>44: 143-[+д2]-24-[+д2]-72-[+д2]-52-[+дб]-42-[-д4]-66

СкОИ6: 31- [+д2]-39- [+д7]-60-[+д7]-15- [+дЗ] -23

СкОв: 24-[-д2]-7-[+д10]-94-[+дЮ]-7-[-д7]-57-[-д1]-18-Е+д7]-103

СкОЭЗ: 12-[+д2]-53-[+дЗ]-22-[+д10]-117-[+д2]-75-[+д2]-8

СкВ7: 66-[-дЗ]-56-[-дЗ]-8-[-дЮ]-20

СкС108: 128- [-д10]-76

СХ031: 85-[~д2]-52

Ск043: 40-[+дЗ]-82-[-д5]-61-[+д5]-65-[+д8]-160-[+д8]-57-[+д2]-34

СМ397: 90-[-д9]-17-[+д9]-27-[+д8]-90-[-дб]-4-[-дб]-24

Ск0133: 68-[-д2]-41-[-д9]-24-[-д2]-8-[-д2]-52-[-д2]-104

СЫ>134: 2-[-д2]-72-[-д5]-64-[+д8]-11-[-д2]-20

СкОИ: 91-[+дЗ]-83-[+д5]-31-[-д2]-72

Ск042: 24-|-дЗ]-13-[+д9]-102-[+дЗ]—77—[—д8]—4—[+д6]-44-[-д5]-75

Ск02: 110-[+дЗ]-133-1-д21-5-1+д5]-11-1+дЗ]-116-[—д2]-32

СМ>92: 102-[+д8]-130-[+дЗ]

СкЮ47: 100-[+дЗ]-58-[+дЗ]-42

Ск029: 32-[-д2]-27-[-д2]-139-[-д8]-55-[+д9]-43

СМ>99: 167-[+д5]-33-[-д8]-5

Ск025: 172-[-д2]-51

СкС19: [-дЗ]—57—[-д9]-71-[-д8]-58

СкВ101: 72-[+дЭ]-76-[+д8]-81-[-д7]-3

СЫ>24: 66-[+д8]-48

Сд1] - 31 п. .н. СТСвАСЖСАСААТвТСССАССАААбТСАСАС

[д2] - 30 п, .н. ТТввССТТСАТСТТТТТСТССТТССТСТТС

[дЗ] - 16 п. .к. Т ССАТ САТ вТ ОТ С Т вС

[д4] - 21 п, . н. СААААТОТССССТСТССАААС

Гд5] - 15 п. . н. ТТТС&АССССААССС

[дб! - 20 п. , н. ТССТвТСТАСАСАТСТСТСС

[д7] - 31 п. н. АТССТААТТСТТССТТТбТАСААААТСААСА

[д8] - 15 п. ■ Н. САААСТААТТТТаСА

[д9] - 16 п. н. 6ТТТТТАТТСДДДДСС

дЮ] - 21 п. н. ССТТТССТТСвСТТССАССТС

Рисунок 4. Повторяющиеся мотивы, присущие большинству последовательностей изучаемой клонотеки эДНК С. коктк. Цифры и буквы внутри квадратных скобок - номера повторов, знаком отмечена их ориентация - прямая (+) или обратная (-). Цифры между блоками обозначают длину спейсера в п.н.

__=fi_ _

acttc6tcag<5gaaggcttattg<3<5aa catgaaaataaaattcaaaagaattaaatt тс aaggcttatt

■HttO

cggttctcaggtgaaataatggtataaactg<:tatggcaatcttttataggtccatcagctttctta.tg

+&_-И» ■>«!

__»»Ml

tactcctcagcctggtctatgatatftggcttatagggggctrtctcggctcccaggtgcatgttctct

Htxa

ti*

ctgtcactat

■KM

Рисунок 5. Повторяющиеся мотивы в составе фрагмента CkD 8. Цифрами и буквами обозначены:

1,2, 3, 5, 8, 9 - мотивы внутри последовательностей семейства повторов №1 (рис. 3); gl, g2, g7, glO - мотивы, присущие большинству клонов из выборки S1 (рис. 4); d9, dlO, dl 1 - повторы внутри исследуемого фрагмента CkD8. Знаком отмечена их ориентация - прямая (+) или обратная (-).

Общая характеристика и компьютерный анализ последовательностей постдиминуционной ДНК С. kolensis из московской популяции

Геномную ДНК соматических клеток выделяли из лапок циклопов, ф проводили недорестрикцию по сайтам Sau3A с последующим клонированием

в плазмиду pBluescript по сайтам BamHI. В результате клонирования было 1 получено и отсеквенировано 48 клонов (названия клонов sC.kM - somatic

' Cyclops kolensis Moscow). Общая длина последовательностей составила 40387

4 п.н. (средняя длина - 841 п.н.). При сравнении последовательностей

нуклеотидов между собой было показано, что каждый из фрагментов присутствует в данной клонотеке в одном экземпляре. Среднее значение содержания АТ-пар составляет 62.7%. Последовательность нуклеотидов каждого клона была переведена в аминокислотную последовательность во всех шести рамках считывания. После сравнение их с соответствующими банками данных мы выявили, что 11 фрагментов имеют некоторую

гомологию с известными аминокислотными последовательностями, данные клоны были исключены из дальнейшего анализа.

В результате осталось 37 фрагментов, составившие выборку S2 (общая длина - 30013 п.н., средняя длина - 811 п.н.) Как и в случае анализа последовательностей эДНК, фрагменты постдиминунионной ДНК исследовали сначала на предмет наличия повторов внутри каждого отдельно взятого клона и затем проводили поиск общих мотивов, присущих большинству фрагментов. Было показано, что все фрагменты содержат 1-5 семейств прямых и обратных повторов длиной от 7 до 48 п.н. Число повторов составляет в среднем 5 копий на фрагмент, а также было выявлено 15 мотивов длиной от 10 до 138 п.н., присущих большинству фрагментов. Поскольку анализируемые последовательности ДНК соматических клеток почти в 3 раза длиннее, то вполне ожидаемо было получить более протяженные повторы и более высокую копийность. В связи с этим для сравнения нуклеотидных последовательностей двух клонотек на предмет наличия коротких повторов был проведен расчет средних значений на общую длину секвенированных фрагментов и показано, что повторы составляют примерно 27% от общей длины ДНК для элиминируемой ДНК и 21% для постдиминуционной ДНК; соответственно средняя длина повтора для эДНК - 13,2 п.н., для ДНК генома соматических клеток - 15,7 п.н.

Таким образом, сравнительный анализ показал, что структура организации эДНК и декодирующих последовательностей постдиминуционной ДНК в общих чертах сходна, что позволяет нам говорить о том, что изучение ДНК, удаляемой в процессе диминуции, может внести вклад в понимание структуры и роли избыточной ДНК, а сам процесс диминуции служит удобной моделью для исследования этой проблемы. Кроме того, при анализе эДНК мы имеем дело с материалом, о котором точно знаем, что данные последовательности являются «избыточными» для соматических клеток, но не для клеток зародышевого пути.

Сравнительный анализ ДХ у С. kolensis из московской и байкальской популяций

Цитологическое исследование зародышей С. kolensis из байкальской популяции во время ранних делений дробления показало, что процесс ДХ происходит во время 4-го деления также с последующим уменьшением размеров хромосом, но с сохранением их числа (2п=22). Длительность преддиминуционной интерфазы была измерена более чем у 1000 эмбрионов и составила 9-10 часов (табл. 2). Гранулы элиминируемого хроматина в анафазе диминуционного деления в основном располагаются на полюсах веретена деления и лишь небольшая их часгь находится в области экватора. Таким образом, основные признаки, характеризующие процесс ДХ у байкальской популяции С kolensis полностью совпадают с таковыми у московской популяции.

Таблица 2. Сопоставление характеристик диминуции хроматина у Cyclops kolensis из московской (М) и байкальской (Б) популяций

Характеристика М Б

Число хромосом (2п) 22* 22

Длительность интерфаз первых пяти делений дробления: • перед 2-м; • перед 3-м; • перед 4-м (диминуционным делением); • перед 5-м; • перед 6-м. 70-90 мин* 70-90 мин* 8-9 час* 50-60 мин* 50-60 мин* 70-80 мин 70-80 мин 9-10 час 50-60 мин 50-60 мин

Содержание ядерной ДНК (М±т) в клетках: • до диминуции; • после диминуции. 2,30±0,03** 0,15±0,002** 2,30±0,04** 0,085±0,002**

Доля элиминируемой ДНК (%) 93,5%** 96,3%**

Примечание: * - данные из: Гришанин, Акифьев, 1993; Гришанин и др., 1996

** — данные из: Гришанин и др., 2006

Консерватизм структуры генома С. ко1еп$Ы из двух географически изолированных популяций: московской и байкальской

Для проведения ПЦР реакции в качестве матрицы мы использовали геномные ДНК до и после диминуции из особей двух изучаемых нами популяций и праймеры на 21 из 34 (выборка 81) исследованных ранее фрагментов эДНК С. кокпт из московской популяции (рис. 6). На остальные 13 последовательностей эДНК праймеры не были подобраны по двум причинам:

1. короткая длина самого исходного фрагмента;

2. содержание на концах протяженных АТ-трактов или повгоров, которые «залипают» сами на себя.

Результаты экспериментов показали что, во-первых, все фрагменты, за исключением СГО 22, присутствуют в геноме С ШетЫ из байкальской популяции, во-вторых, данные последовательности эДНК не полностью элиминируются во время диминуции хроматина и присутствуют в постдимияуционом геноме циклопов из обеих популяций.

Для достижения большей точности в анализе, мы провели по 3-4 ПЦР реакции в разное время, клонировали продукты ПЦР в плазмиду и взяли на сиквенс по 3-4 клона из каждой реакции, В результате выравнивания 9-12 последовательностей ДНК на каждую матрицу были получены консенсусные последовательности, которые были использованы в дальнейшем сравнительном анализе (рис. 7). Степень гомологии для 20 из 21 фрагмента (СГО 22 отсутствует в геноме циклопов из байкальской популяции) эДНК в геноме представителей двух изучаемых популяций представлены в таблице 3. Полученные результаты показывают, что данные последовательности эДНК являются консервативными.

Москва Байкал

0.5 ~

Рисунок 6. Электрофорез ПЦР-продуктов.

glCkM и §1СкВ -додиминуционная геномная ДНК, зСкМ и вСкВ -постдиминуционная геномная ДНК С. Шегкгэ из московской (СкМ) и байкальской (СкВ) популяций. Для положительного контроля в качестве матрицы мы брали ДНК клона СШ55. М - маркер молекулярного веса.

СМЭ55 ^С?Г,ЗАЗПТТСАОаТТСАССАТТОАССАСААССТСТТ1СРЛвТСТТСТТОТАЗДССАССАТАСТСТТ д1СкМ С0АетАССТТаАССТТСАССАТТСАССА0ААССфСТТССАААТСТТСТТЗТАёАССАС2САТАСТТТ д1СкВ ССАССАЗСТТСАОвТГСАССАТТбАССАСААеСТСТТССААаТаТТСТТСТАААССАЗСАаАСТСТТ

СЫЭ55 ТТАСТТСАСТАООАСАСаАОТАСАСТАвСАТСТАТСААСАСССАТСАААТТ^САСАТАССССТСАСС д1СкМ ТвАСТТСАСТАЙСАСАССАСТАСАСТ'АвСАТЗТАТСААСАССОАТСААДТТССАСАТАССОСТСАСС д1СкВ тёАСТТСАСТАС0АСАТСАСТАСАСТА*САТСТАёСААСАССЗАТСАААТТССАСАТАССС0ТСАСС

СХ055 ТСГГААСАСТАТСТТТСТТТСТТСАААССАТААСТТТТССАААААТТТТСТТСТОТТАТЕСАТ'ССАА д1СкМ 1еТТААСАСТАТС-ТТГСТТТСТТСАААССАгГААССТТ1ССАААААТТТТСТТС1СГТАТС-ЬАТССАА д1СкВ ТСТТААСАСААТеТТТСТТТСТТСвААСаАТАА0СТТТСТАААААТТ7ТСТТСТСТТвТССАТССАА

СЮ55 С-СТОеСТГ5ТТТААСАОТТССТААТТТСТСТС;СААССССАААСТССТСАТАТТССТАССТТЯЗГССАА д1СкМ 0СТС0СТ5ТТТААСАТТТССТААТТ7СТСТС0АА6СССАААСТССТСАСАТТССТАССТТГ,0ТССАА дХСкВ ЗСТеОТТЦТТТААСАГТТСССААТТТСТСТССААОСССАААиТССТСАСАТТСОТАССТТССТССАА

СЫ355 ГГГСАТТТССГТСССАеССТСТТТССАТОАетСТГСТТОСССАСАТАТТТСТТТСТТТТС-ССАСАСТ д1С1СМ ТТТОАТТТССТТСССАСССТСТТТС&АТСАОТСТТСТТСССС'ОАСТТТТетТТСТТТТСССАСАСГ д1СкВ ТГТОАТТТССТТСССАСССТСТТТССАТСАОТСТТСТТОСССАСАСТТТТСТТТСТТТТСССАСАСТ

СЫ555 ?тстТЗТА5АСАТЗСССАСТСТТТС0САТТСААС7ТСАСаА,:'ЗСССТС'1СТАСТГ'СТТТТТССТТТТ д!СкМ ТТСГТЗТАСАСАТСЗСССАСТСТТТСССАТТСААСТТаАЗААТССССТСТСТАГТССТТТТТССТТТТ д1СкВ ТТСТТС-САСАСАТЗСССАСТЗТТТСССАТГСААСТ'Т'бАЙААТСОССТСТСТАСТССГТТТТССТТТТ

СЫ>55 Т САААТ СО АСГ Т ТТ ОАЯ АвС АТ С С АААС С С 6С д1СкМ ТСАААТССАСТТТТСАСАйСАТССАААССССС д1СкВ ТСАААТССАСГТТТСАСАССАТССАААССССС

Рисунок 7, Сравнительный анализ консенсусов последовательностей ДНК, присутствующих в додиминуционном геноме С. ко1етЫ из московской (gICkM) и байкальской ^1СкВ) популяций, с фрагментом эДНК СЫ)55.

Жирным шрифтом с подчеркиванием выделены отличающиеся нуклеотиды.

Таблица 3. Гомология между последовательностями нуклеотидов для фрагментов эДНК в додиминуционных геномах С. ко1еюк из московской и байкальской популяций_____________

Номер Степень Номер Степень

фрагмента гомологии (в%) фрагмента гомологии (в%)

CkD 2 96.4 CkD 43 94.9

CkD 3 91.6 CkD 44 98.7

CkD 7 90.3 CkD 55 97.3

CkD 8 97.5 CkD 62 94.7

CkD 11 96.8 CkD 71 92.7

CkD 18 93.4 CkD 92 95.4

CkD 25 98.1 CkD 93 98.1

CkD 29 96.8 CkD 108 98.3

CkD 30 97.6 CkD 116 96.2

CkD 42 92.7 CkD 134 95.9

Это означает, что несмотря на огромное число поколений, прошедших между разделением С kolensis на московскую и байкальскую популяции (не менее 25 млн.), данные последовательности успешно противостояли факторам естественного мутационного процесса. В 1998 г. А.П. Акифьзвым было выдвинуто предположение о том, что «избыточная» для соматических клеток ДНК создает уникальный молекулярный портрет генома вида и, таким образом, служит фактором генетической изоляции. Сравнение московской и байкальской популяций С kolensis, свидетельствует в пользу данной гипотезы.

Выводы

1. Впервые получены и охарактеризованы последовательности ДНК, элиминируемые (зДНК) в процессе диминуции хроматина из хромосом презумптивных соматических клеток Cyclops kolensis московской популяции. Выявлены следующие закономерности:

• последовтельности эДНК являются АТ-богатыми;

• среди фрагментов обнаружены семейства повторов;

• каждый фрагмент содержит в своем составе от 1 до 6 семейств коротких повторов с высокой гомологией внутри семейств;

• между фрагментами найдены гомологичные мотивы, присущие большинству фрагментов;

• с помощью гибридизации in situ показано, что вырезаемые последовательности локализованы в самых различных районах хромосом.

2. Впервые изучена картина диминуции хроматина у С. kolensis из байкальской популяции. Показано, что ДХ происходит во время 4-го деления дробления с сохранением числа хромосом (2п=22), длительность преддиминуцнонной интерфазы составляет 9-10 часов. Сопоставление характеристик ДХ у С kolensis из московской и байкальской популяций

подтверждает предположение о том, что ДХ может быть использована в качестве одного из важных признаков при идентификации видов рода Cyclops.

3. Показано, что 20 из 21 проанализированного фрагмента эДНК, полученного из диминуционных гранул С. kolensis из московской популяции, присутствуют также и в додиминуциониом геноме С. kolensis из байкальской популяции. Данные последовательности эДНК являются консервативными (90-99% гомологии).

4. Выявлено, что последовательности эДНК не полностью удаляются во время ДХ и присутствуют в постдиминуционном геноме циклопов из обеих популяций. Структура эДНК и некодирующих последовательностей постдиминуционной ДНК в общих чертах сходна.

Публикации

1. Degtyarev S., Bovkova T.. Grishanin A., Belyakin S., RubtsovN., Karamysheva T., Makarevich G., Akifyev A., and Zhimulev I. The molecular structure of the DNA fragments eliminated during chromatin diminution in Cyclops kolemisH Genome Research. 2004. V. 14. N. 11. P. 2287-2294.

2. Акифьев А.П., Бойкова T.B.. Гришанин A.K., Зоткевич Е.А., Жимуяев И.Ф. Диминуция хроматина у циклопов как модель эволюционного преобразования геномов// Эволюционная биология. Томск. 2005. Т. 3. С. 133-144.

3. Boykova T.. Grishanin A., Shekhovtsov S., Melnik N., Naumova E., Akifyev A., Zhimulev I. Chromatin diminution in Cyclops kolensis// A 9th International Conference on Copepoda. 2005. P. 206.

4. Bovkova T.. Zotkevich E., Grishanin A., Melnik N., Naumova E., Akifyev A., Zhimulev I. On the chromatin diminution in Cyclops// A 7th International Conference on Drosophila Heterochromatin. 2005. P. 84.

5. Зоткевич F.A., Бойкова T.B.. Гришанин A.K., Акифьев А.П., Жимулёв И.Ф. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей элиминируемой ДНК Cyclops kolensis и геномной ДНК Cyclops insignis// Вестник Томского государственного университета. 2005. №4. С.47.

6. Гришанин А.К., Зоткевич Е.А., Бойкова Т.В., Наумова Е.Ю., Мельник Н.Г., Акифьев А.П., Жимулёв И.Ф. Диминуция хроматина как фактор генетической изоляции видов рода Cyclops// Материалы 4-ой Верещагинской Байкальской конференции. 2005. С. 60.

7. Гришанин А.К., Шеховцов C.B., Бойкова Т.В.. Акифьев А.П., Жимулёв И.Ф. Проблема диминуции хроматина на рубеже XX и XXI веков// Цитология. 2006. №5 (в печати).

8. А.К. Гришанин, Т.В. Бойкова. Т.Л. Маршак, Н.Г. Мельник, Е.Ю. Наумова, М.В. Загоскин, А.П. Акифьев, И.Ф. Жимулёв Консерватизм структуры генома в двух популяциях Cyclops kolensis (Copepoda, Crustacea), обитающих в прудах г. Москва и о. Байкал// ДАН. 2006. Т. 408. №5 (в печати).

Подписано к печати 22.03.2006

Формат бумаги 60 х 90. Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7

Тираж 100 экз. Заказ 44

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

"77-iS

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бойкова, Татьяна Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. С-парадокс: две стороны одной загадки.

1.2. Основные гипотезы о биологической роли избыточной ДНК.

1.3. Рекомбинация ДНК.

1.3.1. Гомологичная рекомбинация.

1.3.2. Негомологичная, или незаконная рекомбинация.

1.4. Диминуция хроматина как возможный ключ к решению С-парадокса.

1.4.1. Реорганизация генома при созревании вегетативных ядер (макронуклеусов) у инфузорий.

1.4.2. Диминуция хроматина у нематод.

1.4.3. Диминуция хроматина у циклопов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура ДНК, элиминируемой в ходе диминуции хроматина у Cyclops Kolensis (Crustacea: Copepoda)"

Актуальность проблемы

Результаты недавних проектов по секвенированию геномов различных видов животных и растений, а также генома человека, подтвердили тот факт, * что большую часть генома эукариот составляют некодирующие последовательности ДНК. Однако данное открытие не только не разрешило загадку парадокса размера генома эукариот, так называемый С-парадокс, но поставило перед учеными новые вопросы о функциональной необходимости и роли данной ДНК.

В настоящее время в качестве попытки разрешения этой загадки было предложено одновременно два направления: первое — это сравнение ортологических последовательностей ДНК хорошо изученных и довольно близких видов, второе, развиваемое в настоящей работе, - изучение фрагментов ДНК, элиминируемых в процессе диминуции хроматина (ДХ). Данное явление, хотя и было открыто около 120 лет тому назад, до сих пор ф слабо изучено методами молекулярной генетики у многоклеточных животных. ДХ является запрограммированным в онтогенезе процессом, в ходе которого происходит необратимая потеря части генетического материала из генома соматических клеток. В связи с этим, ДХ может быть рассмотрена как биологическое явление, при котором клеточный механизм как бы освобождает геномы соматических клеток от избытка ДНК.

В качестве объекта для изучения ДХ и, в частности, структуры элиминируемой ДНК (эДНК) нами был выбран вид Cyclops kolensis из московской популяции. Представители семейства Cyclopoidae являются удобными, хотя и довольно трудными объектами. Главной особенностью, определившей перспективность Cyclopoidae, является элиминация огромной * доли генома в клетках зародышевого пути (у С. kolensis — до 94%) при сохранении исходного числа хромосом (Гришанин и др., 1996). Кроме того, упаковка эДНК в специфические гранулы позволяет экстрагировать образцы данной ДНК для изучения ее молекулярной структуры.

Немецкая исследовательница Сигрид Берман подробно изучила методами цитогенетики различные виды рода Cyclops ещё во второй половине прошлого столетия. Она показала, что количество элиминируемой ДНК, а также её расположение в ядрах делящихся клеток видоспецифичны (Beermann, 1977). Однако в литературе встречается достаточно много противоречий в характеристике процесса ДХ даже у циклопов, отнесенных к одному и тому же виду. Это может быть связано с ошибкой в идентификации видов по морфологическим признакам, которая, в частности, у представителей копепод представляет, как правило, серьезные трудности. Поэтому изучение картины процесса диминуции у С. kolensis из байкальской популяции является не только интересным и важным, но и позволяет провести сравнительный анализ двух географически изолированных популяций: московской и байкальской. Это позволило бы ответить и на вопрос, может ли ДХ быть использована в качестве одного из признаков для идентификации видов.

В 1998 г. А.П. Акифьевым было выдвинуто предположение о том, что избыточная ДНК создает уникальный молекулярный портрет генома вида и, таким образом, служит фактором генетической изоляции, препятствуя синапсису гомеологичных хромосом в первом поколении межвидовых гибридов (если таковые могут возникать) (Акифьев и др., 1998). Сравнение геномов С. kolensis из московской и байкальской популяций (в первую очередь, размеров тотального и постдиминуционного генома, временной картины протекания процесса диминуции; гомологии последовательностей эДНК) может дать информацию, свидетельствующую в пользу данной гипотезы, либо ее опровергающую.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было изучение молекулярной структуры последовательностей ДНК, элиминируемых в процессе диминуции у Cyclops kolensis (Crustacea: Copepoda), и их сравнительный анализ у представителей двух географически изолированных популяций (московской и байкальской). В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Изучить структуру последовательностей ДНК, элиминируемых в процессе диминуции у С. kolensis из московской популяции: а) с помощью метода микродиссекции собрать материал гранул, содержащих эДНК; б) клонировать и определить первичную структуру ДНК, экстрагированной из диминуционных гранул; провести компьютерный анализ структуры последовательностей эДНК.

2. Провести сравнительный анализ структуры последовательностей ДНК постдиминуционного генома С. kolensis из московской популяции и эДНК: а) создать клонотеку постдиминуционной ДНК генома С. kolensis из московской популяции; б) изучить структуру полученных последовательностей ДНК;

3. Оценить консерватизм структуры генома 'С. kolensis из двух географически изолированных популяций: московской и байкальской: а) исследовать картину ДХ у С. kolensis из байкальской популяции, определить стадию деления, во время которой проходит ДХ, продолжительность интерфазы, предшествующей процессу диминуции; б) определить, насколько последовательности эДНК, полученные из диминуционных гранул у С. kolensis из московской популяции, являются консервативными: показать с помощью ПЦР анализа присутствие (или отсутствие) данных последовательностей в додиминуционном геноме С. kolensis из байкальской популяции и сравнить их нуклеотидный состав.

4. Выявить, удаляются ли полностью во время ДХ последовательности ДНК, полученные из диминуционных гранул.

Научная новизна

Впервые получены последовательности ДНК, элиминируемые из хромосом презумптивных соматических клеток Cyclops kolensis (Crustacea: Copepoda) в процессе диминуции хроматина. Проведен компьютерный анализ и выявлены закономерности в организации данных последовательностей нуклеотидов, свидетельствующие о высокой степени упорядоченности в организации ДНК, ограниченной клетками зародышевого пути.

Впервые проведено сравнительное изучение последовательностей эДНК геномов двух географически изолированных популяций С. kolensis: московской и байкальской, обнаружена высокая консервативность данных последовательностей.

Показано, что ДХ может использоваться в качестве одного из важных признаков при определении видов рода Cyclops (Cyclopoidae), что снимает ряд противоречий между литературными данными относительно корректности идентификации видов Практическая ценность

Впервые с помощью микродиссекции получена библиотека фрагментов эДНК Cyclops kolensis. Определена первичкая структура ДНК, экстрагированной из диминуционных гранул, и проведен компьютерный анализ структуры данной ДНК. Последовательности эДНК являются АТ-богатыми и насыщены повторами. Показана мозаичная структура многих повторов и высокая степень гомологии внутри отдельных семейств повторов.

Впервые изучена картина ДХ у С. kolensis из байкальской популяции. ДХ происходит во время 4-го деления дробления с сохранением числа хромосом

2п=22), длительность преддиминуционной интерфазы составляет 9-10 часов, как и у С. kolensis из московской популяции.

Показано, что, во-первых, 20 из 21 проанализированного фрагмента, полученного из диминуционных гранул С. kolensis из московской популяции, присутствуют в геноме С. kolensis из байкальской популяции, во-вторых, данные последовательности эДНК не полностью элиминируются во время ДХ и присутствуют в постдиминуционном геноме циклопов из обеих популяций. Изучаемые фрагменты эДНК являются консервативными (9099% гомологии). Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на международных конференциях в докладах и стендовых сообщениях: на III Международной конференции «Проблема вида и видообразованйя» (Тбмск, 2005), 9th International Conference on Copepoda (Hammamet, Tunisia, 2005), 7th International Confcrcnce on Drosophila Heterochromatin (Gubbio, Italy, 2005), 4-ой Верещагинской Байкальской конференции (Иркутск, 2005). Объем работы

Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, разделов Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Выводы и списка цитируемой литературы, в который входит 147 ссылок. Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 16 рисунков. Публикации по теме диссертации

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Бойкова, Татьяна Валерьевна

выводы

1. Впервые получены и охарактеризованы последовательности ДНК, элиминируемые (эДНК) в процессе диминуции хроматина из хромосом презумптивных соматических клеток Cyclops kolensis московской популяции. Выявлены следующие закономерности:

• последовтельности эДНК являются АТ-богатыми;

• среди фрагментов обнаружены семейства повторов;

• каждый фрагмент содержит в своем составе от 1 до 6 семейств коротких повторов с высокой гомологией внутри семейств;

• между фрагментами найдены гомологичные мотивы, присущие большинству фрагментов;

• с помощью гибридизации in situ показано, что вырезаемые последовательности локализованы в самых различных районах хромосом.

2. Впервые изучена картина диминуции хроматина у С. kolensis из байкальской популяции. Показано, ДХ происходит во время 4-го деления дробления с сохранением числа хромосом . (2п=22), длительность преддиминуционной интерфазы составляет 9-10 часов. Сопоставление характеристик ДХ у С. kolensis из московской и байкальской популяций подтверждает предположение о том, что ДХ может быть использована в качестве одного из важных признаков при идентификации видов рода Cyclops.

3. Показано, что 20 из 21 проанализированного фрагмента эДНК, полученного из диминуционных гранул С. kolensis из московской популяции, присутствуют также и в додиминуционном геноме С. kolensis из байкальской популяции. Данные последовательности эДНК являются консервативными (90-99% гомологии).

4. Выявлено, что последовательности эДНК не полностью удаляются во время ДХ и присутствуют в постдиминуционном геноме циклопов из обеих популяций. Структура эДНК и некодирующих последовательностей постдиминуционной ДНК в общих чертах сходна.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бойкова, Татьяна Валерьевна, Новосибирск

1. Акифьев А.П. «Молчащая» ДНК и ее роль в эволюции// Природа. 1974. №9. С. 49-54.

2. Акифьев А.П., Гришанин А.К. Некоторые биологические аспекты диминуции хроматина//Журнал Общей Биологии. 1993. Т. 54. С. 5-15.

3. Акифьев А.П., Гришанин А.К., Дегтярев С.В. Диминуции хроматина, сопровождающиеся реорганизаций молекулярной структуры генома: эволюционные аспекты// Генетика. 1998. Т. 34. С. 709-718.

4. Акифьев А.П., Гришанин А.К., Дегтярев С.В. Диминуция хроматина — ключевой процесс для объяснения парадокса размера генома эукариот и некоторых механизмов генетической изоляции// Генетика. 2002. Т. 38. №5. С. 595-606.

5. Акифьев А.П. Избыточная ДНК — генетическая квадратура круга?// Природа. 2004. №10.

6. Албертс Б., Брей Д., Льис Дж. и др. Молекулярная биология клетки: Пер. с англ. М.: Мир. 1994. Т. 1. ч. 2. С. 310-313, 318-324.

7. Георгиев Г.П. Гипотеза о структурной организации оперона и регуляции синтеза ДНК в животной клетке// Мол. биология. 1970. Т. 4. С. 17-29.

8. Гришанин А.К., Акифьев А.П. Диминуция хроматина и организация хромосом у Cyclops strenuus strenuus// Генетика. 1993. Т. 7. С. 1099-1107.

9. Гришанин А.К. Сравнительное электронно-микроскопическое изучение хромосом и интерфазных ядер в клетках зародыша Cyclops kolensis (Copepoda, Crustacea) до и после диминуции хроматина// Онтогенез. 1995. Т. 26. С. 188-195.

10. Гришанин А.К. Изучение элиминируемого хроматина в клетках зародыша циклопа Cyclops kolensis (Copepoda, Crustacea) с помощью сканирующей электронной микроскопии// Цитология. 1996. Т. 38. С. 1115-1117.

11. Гришанин А.К., Дегтярев С.В., Акифьев А.П. Радиочувствительность хромосом в связи с диминуцией хромосом у циклопов (Crustacea, Copepoda)// Генетика. 2002. Т. 38. С. 468-472.

12. Гришанин А.К., Шеховцов С.В., Бойкова Т.В., Акифьев А.П., Жимулев И.Ф. Проблема диминуции хроматина на рубеже XX и XXI веков// Цитолгия. 2006. (в печати).

13. Дулитл У.Ф. Четырнадцать месяцев концепции «эгоистичной ДНК»// Эволюция генома. М.: Мир. 1986. С. 13-19.

14. Льюин Б. Гены: Пер. с англ. М.: Мир. 1987. С. 453-476, 490-492.

15. Монченко В.И. Фауна Украина. Киев: Наукова Думка. 1974.

16. Оленов Ю.М. Некоторые проблемы эволюционной генетики и дарвинизма// M.-JI. Изд. АН СССР. 1961. с. 186.

17. Сингер М. и Берг П. Гены и геномы: Пер. с англ. М.: Мир. 1998. Т. 1. С. 103-110.

18. Adachi М., Tsujimoto Y. Potential Z-DNA elements surround the breakpoints of chromosome translocation within the 5' flanking region of bcl-2 gene// Oncogene. 1990. V. 5. P. 1653-1657.

19. Aeby P., Spicher A., de Chastonay Y., Muller F., Tobler H. Structure and genomic organization of proretrovirus-like elements partially eliminated from the somatic genome of Ascaris lumbricoidesll EMBO J. 1986. V. 5. P. 33533360.

20. Akifyev A.P. Mechanisms of the production of chromosomal aberration in eucaryotic cells// Physiol. General Biol. Rev. 1995. V. 10. P. 1-56.

21. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., and Lipman D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs// Nucl. Acids Res. 1997. V.25. P. 3389-3402.

22. Ammermann D. Morphology and development of the macronuclei of the ciliates Stylonychia mytilus and Euplotes aediculatusll Chromosoma. 1971. V. 33. P. 209-238.

23. Ammermann D., Steinbruck G., von Berger L., Hennig W. The development of the macronucleus in the ciliated protozoan Stylonichia mytilus. Chromosoma. 1974. V. 45. P. 401-429.

24. Ammermann D. Chromatin diminution and chromosome elimination: Mechanisms and adaptive significance. The evolution and genome size// London. John Wiley and Sons. 1985. P. 427-442.

25. Apian P.D., Raimondi S.C., Kirsch I.R. Disruption of the SCL gene by a t(l;3) translocation in a patient with T cell acute lymphoblastic leukemia// J. Exp. Med. 1992. V. 176. P. 1303-1310.

26. Bae Y.-S., Chiba M., Ohira M., Ikeda H. A shuttle vector for analysis of illegimate recombination in mammalian cells: effects of DNA topoisomerase inhibitors on deletion frequency// Gene. 1991. V. 1010-. P.285-289.

27. Baird, S.E., Fino G.M., Tausta S.L., and Klobutcher L.A. Micronuclear genome organization is Euplotes crassus: a transposonlike element is removed during macronuclear development// Mol. Cell. Biol. 1989. V. 9. P. 3793-3807.

28. Beermann S. A quantative study of chromatin diminution in embryonic mitosis of Cyclops furciferll Genetics. 1966. V. 54. P. 567-576.

29. Beermann S. The diminution of the heterochromatic chromosomal segments in Cyclops (Crustacea, Copepoda)// Chromosoma. 1977. V. 60. P. 297-344.

30. Bejerano G., Pheasant M., Makunin I., Stephen S., Kent W.J., Mattick J.S., Haussler D. Ultraconserved elements in the human genome// Science. 2004. V. 304. P. 1321-1325.

31. Bodley A.L., Huang H.-C., Yu C., Liu L.F. Integration of simian virus 40 into cellular DNA occurs at or near topoisomerase II cleavage hot spots induced by VM-26 (teniposide)// Mol. Cell. Biol. 1993. V. 13. P. 6190-6200.

32. Boveri T. Ueber differenzierung der zellkerne waehrend der furchung des eies von Ascaris megalocephala// Anat. Anz. 1887. V. 2. P. 688-693.

33. Britten R.J., Davidson E.H. Organization, transcription and regulation in the animal genome// Quart. Rev. Biol. 1973. V. 48. P. 565-613.

34. Callan H.G. The organization of genetic units in chromosomes// J. Cel. Sci. 1967. V. 2. P. 2-7.

35. Callan H.G. Lampbrush chromosomes// Berlin: Springer. 1986.

36. Caserta M., Amadei A., Di Mauro E., Camilloni G. In vitro preferential topoisomerization of bent DNA// Nucl. Acids Res. 19.89. Y~ 17. P. 8463-8474.

37. Cavalier-Smith T. Nuclear volume control by nucleosceletal DNA, selection for cell volume and cell grouth rate, and the solution of the DNA C-value paradox// J. Cell Sci. 1978. V. 34. P. 247-278.

38. Cavalier-Smith Т. Economy, speed and size matter: evolutionary forces driving nuclear genome miniaturization and expansion// Annals of Botany. 2005. V. 95. P. 147-175.

39. Chalker D.L., Yao M-C. Nongenic, bidirectional transcription precedes and may promote developmental DNA deletion in Tetrahymena thermophilalI Genes Dev. 2001. V. 15. P. 1287-1298.

40. Champoux J.J., Bullock P.A. Possible role for the eucaryotic type I topoisomerase in illegimate recombination// In Ge. Recomb. Washington DC. 1988. P. 655-666.

41. Collins J. The instability of palindromic DNA// Cold. Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1980. V. 45. P. 409-416.

42. Collins J., Volckaert G., Nevers P. Precise and nearly precise excision of the symmetrical inverted repeats of Tn5: common features of recA-independent deletion events in E.colill Gene. 1982. V. 19. P. 139-146.

43. Coyne R.S., Yao M-C. Evolutionary conservation of sequences directing chromosome breakage and rDNA palindrome formation in Tetrahymenine. ф ■ciliatesll Genetics. 1996. V. 144. P. 1479-1487.

44. Coyne R.S., Chalker D.L., Yao M-C. Genome downsizing during ciliate development: nuclear division of labor through chromosome restructuring// Ann. Rev. Genet. 1996. V. 30. P. 57-78.

45. Doolittle W.F., Sapienza C. Selfish genes, the phenotype paradigm and genome evolution// Nature. 1980. V. 284. P. 61-63.

46. Einsle U. Crustacea, Copepoda: Calanoida und Cyclopida in Subwasserfauna in Mitteleuropa// Stuttgart. Gustav Fisher Verlag. 1993. V. 8. p. 209.

47. Elder J.F., Turner B.J. Concerted evolution of repetitive DNA sequences in eucaryotes// Q. Rev. Biol. 1995. V. 70. P. 297-320.

48. Esteban M.R., Giovinazzo G., Goday C. Chromatin diminution is strictly correlated to somatic behavior in early development of the nematode Parascaris univalens// J. Cell Sci. 1995. V. 108. P. 2393-2404.

49. Esteban M.R., Giovinazzo G., de la Hera A., Goday C. PUMA1: a novel proteine that associates with the centrosomes, spindle and centromers in the nematode Parascaris//J. Cell Sci. 1998. V. 111. P. 723-735.

50. Etter A., Aboutanos M., Tobler H., Muller F. Eliminated chromatin of Ascaris contains a gene that encodes a putative ribosomal protein// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 1593-1596.

51. Etter A., Bernard V., Kenzelmann M., Tobler H., Muller F. Ribosomal.« .V ф .heterogeneity from chromatin diminution in Ascaris lumbricoidesH Science. 1994. V. 265. P. 954-956.

52. Fan Q., Yao M-C. New-telomere formation coupled with site-specific chromosome breakage in Tetrahymena thermophila// Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P. 1267-1274.

53. Fan Q., Yao M-C. A long stringent sequence for programmed chromosome breakage in Tetrahymena thermophila// Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 895-900.

54. Feigon J., Wang A.H., van der Marel G.A., van Boom J.H., Rich A. Z-DNA forms without an alternating purine-pyrimidine sequence in solution// Science. 1985. V. 230. P. 82-84.

55. Felder H., Herzceg A., de Chastonay Y., Aeby P., Tobler H., Muller F. Tas, a retrotransposon from the parasitic nematode Ascaris lumbricoides// Gene. 1994. V. 149. P. 219-225.

56. Gabriel M. Primitive genetic mechanism and the origin of chromosome// Amer Naturalist. 1960. V. 54. P. 257-269.

57. Gaffney D.J., Keightley P.D. Unexpected conserved non-coding DNA blocks in mammals// Trends in Genetics. 2004. V. 20. P. 332-337.

58. Gheysen G., Villarroel R., van Montagu M. Illegimate recombination in plants: a model for T-DNA integration// Genes Dev. 1991. V. 5. P. 287-297.

59. Gisler В., Salomon S., Puchta H. The role of duoble-strand break-induced allelic homologous recombination in somatic plant cells// Plant J. 2002. V. 32. P. 277-284.

60. Goday C., Pimpinelli S. Chromosome organization and heterochromatin ^ elimination in Parascarisll Science. 1984. V. 224. P. 411-413.

61. Goday C., Ciofi-Luzzatto A., Pimpinelli S. Centromere ultrastructure in germ-line chromosomes of Parascarisll Chromosoma. 1985. V. 91. P. 121-125.

62. Goday C., Pimpinelli S. Cytological analysis of chromosomes in the two species Parascaris univalens and P. equorumll Chromosoma. 1986. V. 94. P. 1-10.

63. Goday C., Pimpinelli S. Centromere organization in meiotic chromosomes of

64. Parascaris univalensll Chromosoma. 1989. V. 98. P. 160-166.

65. Goday C., Gonzales-Garcia J.M., Esteban M.R., Giovinazzo G., Pimpinelli S. Kinetochores and chromatin diminution in early embryos of Parascaris univalensll J. Cell Biol. 1992. V. 118. P. 23-32.

66. Goday C., Pimpinelli S. The occurrence, role and evolution of chromatin diminution in nematodes// Parasitol Today. 1993. V. 9. P. 319-322.

67. Gorbunova V. and Levy A.A. How plants make ends meet: DNA doublestrand break repair// Trends in plant science. 1999. V. 4. P. 263-269.

68. Gordenin D.A., Lobachev K.S., Degtyareva N.P., Malkova A.L., Perkins E., Resnick M. Inverted DNA repeats: a source of eukaryotic genomic instability// Mol. and Cell. Biol. 1993. V. 13. N. 9. P. 5315-5322.

69. Greslin A.F., Prescott D.M., Oka Y, Loukin S.H., Chappel J.C. Reording of nine exons is necessary to form a functional actin gene in Oxytricha novall Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 6264-6268.

70. Grishanin A.K., Dahms H-U., and Akifyev A.P. Nuclear DNA and remarks on chromatin diminution in Cyclopoida// Zool. Studies. 2004. V. 43. P. 300303..« . . Г О' 0 .

71. Grishanin A.K., Akifev A.P. Interpopulation differentiation within C. kolensis and C. strenuus strenuus (Crustacea: Copepoda): evidence from cytogenetic methods// Hydrobiologia. 1999. V. 417. P. 37-42.

72. Henthorn P.S., Mager D.L., Huisman T.H.J., Smithies O. A gene deletion ending with a complex array of repeated sequences 3' to the human P-globin gene claster// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 5194-5198.

73. Herrick G., Cartinhour S., Dawson D., Ang D., Sheets R., Lee A., and Williams K. Mobile elements bounded by C4A4 telomeric repeats in Oxytricha fallaxll Cell. 1985. V. 43. P. 759-768.

74. Holliday R. A mechanism for gene conversion in fungi// Genet. Res. 1964. V. 5. P. 282-304.0 /

75. Hotta Y., Stern H. The organization of DNA segments undergoing repair synthesis during pachytene// Chromosoma. 1984. V. 89. P. 127-137. *

76. Howard M.T., Maxwell P.L., Hsieh Т., Griffith J.D. Drosophila topoisomerase II-DNA interactions are affected by DNA structure// J. Mol. Biol. 1991. V. 217. P. 53-62.

77. Huang Y.J., Stoffel R., Tobler H., Miiller F. A newly formed telomere in Ascaris suum does not exert a telomere position effect on a nearby gene// Mol Cell Biol. 1996. V. 16. P. 130-134.

78. Hyrien O., Debatisse M., Buttin G., Vincent B. A hotspot for novel amplification joints in a mosaic of Alu-like repeats and palindromic A+T-rich DNA//EMBO J. 1987. V. 6. P. 2401-2408.

79. Ikeda H., Aoki K., Naito A. Illegitimate recombination mediated in vitro by DNA gyrase of Escherichia coli: structure of recombinant DNA molecules// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. P. 3724-3728.

80. Jahn C.L. Bal 31 sensitivity of micronuclear sequences homologous to C4A4/G4T4 repeats in Oxytricha novall Exp. Cell Res. 1988. V. 177. P. 162175.

81. Jahn C.L., Krikau M.F., and Shyman S. Developmentally coordinated en masse excision of a highly repetitive element in E. crassusll Cell. 1989. V. 59. P. 1009-1018. .

82. Jaraeczewski J.W., Jahn C.L. Elimination of Tec elements involves a novel excision process// Genes Dev. 1993. V. 7. P. 95-105.

83. Jentsch S., Tobler H., Miiller F. New telomere formation during the process of chromatin diminution in Ascaris suumH Int J Dev Biol. 2002. V. 46. P. 143148.

84. Johnston B.H., Hydroxylamine and methoxylamine as probes of DNA structure// Methods Enzymol. 1992. V. 211. P. 127-158.

85. Jonsson F., Steinbruck G., Lipps H.J. Both subtelomeric regions are required and sufficient for specific DNA fragmentation during macronuclear development in Stylonychia lemnaell Genome Biol. 2001. V. 2. P. 1-11.

86. Juranic Z., Kidric M., Tomin R., Juranic I., Spuzic I., Petrovic J. The importance of the specific Z-DNA structure and polyamines in carcinogenesis: fact or fiction// Med. Hypotheses. 1991. V. 35. P. 353-357.

87. Karamysheva T.V., Matveeva V.G., Shorina A.R., Rubtsov N.B. Clinical and molecular cytogenetic analysis of rare case of mosaicism with partial monosomy 3p and partial trisomy lOq in human// Russian J. Genetics. 2001. V. 37. P. 1-6.

88. Kirik A., Salomon S., Puchta H. Species-specific (louble-strand break repair and genome evolution in plants// EMBO J. 2000. V. 19. P. 5562-5566.

89. Klobutcher L.A. Micronuclear organization of macronuclear genes in the hypotrichous ciliate Oxytricha nova!I J. Protozool. 1987. V. 34. P. 424-428.

90. Klobutcher L.A., Gygax S.E., Podoloff J.D., Vermeesch J.R., Price C.M., Tebeau C.M., Jahn C.L. Conserved DNA sequences adjacent to chromosome fragmentation sites in Euplotes crassusll Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 4230-4240.

91. Klobutcher L.A. Characterization of in vivo developmental chromosome fragmentation intermediates in Euplotes crassusll Mol. Cell. 1999. V. 4. P. 695-704.

92. Kohno S., Nakai Y., Satoh S., Yoshida M., and Kobayashi H. Chromosome elimination in Japanese hagfish, Eptatretus burgeri (Agnatha, Cyclostomata)// Cytogenet. Cell Genet. 1986. V. 41. P. 209-214.

93. Konopka A.K. Compilation of DNA strand exchange siates for nonhomologous recombination in somatic cells// Nucl. Acids Res. 1988. V. 16. P. 1739-1758.

94. Landolt P., Tobler H. Organization of DNA sequences in the genome of the nematode Ascaris lumbricoides before and after diminution// Mol Cell Biol. 1988. V. 7. P. 33-42.

95. Leech D.M., Wyngaard G.A. Timing of chromatin diminution in the free-living fresh-water Cyclopidae (Copepoda)//J. Crust. Biol. 1996. V. 16. P. 496500.

96. Lichter P., Cremer Т., Tang C.J., Watkins P.C., Manuelidis L., Ward DC. Rapid detection of human chromosome 21 aberrations by in situ hybridization// Proc. Natl. Acad. Sci. 1988. V. 85. P. 9664-9668.

97. Malfoy В., Rousseau N., Vogt N., Viegas-Pequignot E., Dutrillaux В., Leng M. Nucleotide sequence of an heterochromatic segment recognized by the antibodies to Z-DNA in fixed metaphase chromosomes// Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 3197-3214.

98. Merrihew R.V., Marburger K., Pennington S.L.," Roth' b.B., Wilson J.H. High-frequency illegitimate integration of transfected DNA at preintegrated target siates in a mammalian genome// Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P. 10-18.

99. Milot E., Belmaaza A., Wallenburg J.C., Gusew N., Bradley W.E., Chartrand P. Chromosomal illegimate recombination in mammalian cells is associated with intrinsically bent DNA elements// EMBO J. 1992. V. 11. P. 5063-5070.

100. Mirsky A.E., Ris H. The animal cells and its evolutionary significance// J. Gen. Phisiol. 1951. V. 34. P. 451-462.

101. Morris Т., Thacker J. Formation of large deletions by illegimate recombination in the HPRT gene of primary human fibroblasts// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 1392-1396.

102. Moritz K.B., Roth G.E. Complexity of germline and somatic DNA in Ascarisll Nature. 1976. V. 259. P. 55-57.

103. Miiller F., Walker P., Aeby P. Nucleotide sequence of satellite DNA contained in the eliminated genome of Ascaris lumbricoidesll Nucleic Acids Res. 1982. V. 10. P. 7493-7510.

104. Miiller F., Aeby P., Schaller D., Tobler H. Qualitative diifferences between germ line and somatic DNA sequences in Ascaris lumbricoidesll Experientia. 1986. V. 42. P. 691-693.

105. Miiller F., Wicky C., Spicher A., Tobler H. New telomere formation after developmental^ regulated chromosomal breakage during the process of chromatin diminution in Ascaris lumbricoidesll Cell. 1991. V. 67. P. 815-822.

106. Miiller A.E., Kamisugi Y., Griineberg R., Niedenhof I., Horold R.J., Meyer P. Palindromic sequences and A+T-rich DNA elements promote illegimate recombination in Nicotiana tabacum/l JMB. 1999. V. 291. P. 29-46.

107. Miiller F., Tobler H. Chromatin diminution in the parasitic nematodes Ascaris suum and Parascaris univalensll Int J Parasitol. 2000. V. 30. P. 391-399.

108. Nakayama J., Rice J.C., Strahl B.D., Allis C.D., and Greval S.I. Role of histone H3 lysine 9 mcthylation in epigenic control of heterochromatin assembly// Science. 2001. V. 292. P. 110-113.

109. Nalbantoglu J., Hartley D., Phear G., Tear G., Meuth M. Spontaneous deletion formation at the part locus of hamster cells: the presence of short sequence homologies and dyad symmetries at deletion termini// EMBO J.1986. V.5. P. 1199-1204.

110. Nicholls R.D., Fischel-Ghodsian N., Higgs D.R. Recombination at the human• . *alpha-globin gene cluster: sequence features and topological constraints// Cell.1987. V. 49. P. 369-378.

111. Niedermaier J., Moritz K.B. Organisation and dynamics of satellite and telomere DNAs in Ascaris: implications for formation and programmed breakdown of compound chromosomes// Chromosoma. 2000. V. 109. P. 439452.

112. Orgel L.E., Crick F.H., Sapienza C. Selfish DNA// Nature. 1980. V. 288. P. 645-646.

113. Petrov D.A. Evalution of genome size: new approaches to an old problem// Trends in Genet. 2000. V. 17. P. 23-28.

114. Pimpinelli S, Goday C. Unusual kinetochores and chromatin diminution in Parascarisll Trends Genet. 1989. V. 5. P. 310-315. . "

115. Pirrotta V., Poux S., Melfi R., and Pilyugin A. Assembly of polycomb complexes and silencing mechanisms// Genetica. 2003. V. 117. P. 191-197.

116. Preiffer P., Thode S., Hancke J., Vielmetter W. Mechanisms of overlap formation in nongomologous DNA end joining// Mol. Cell. Biol. 1994. V. 14. P. 888-895.

117. Prescott D.M. The C-value paradox and glues in ciliated protozoa// Modern cell biol. 1983. V. 2. P. 329-352.

118. Prescott D.M. The unusual organization and processing of genomic DNA in hypotrichous ciliates// Trends in Genet. 1992. V. 8. N. 12. P. 439-445.

119. Prescott D.M. Origin, evolution and excision of internal eliminated segments in germ line genes of ciliates// Current Opinion in Genet, and Develop. 1997. V. 7. P. 807-813.

120. Prescott D.M. Invention and mistery in Hypotrich DNA// J. Euk. Microbiol.1998. V. 45. P. 575-581.

121. Prescott D.M. The evolutionary scrambling and developmental unscrambling of germ line genes in hypotrichous ciliates// Nucl. Acid Res. 1999. V. 27. P. 1243-1250.

122. Prescott D.M. Genome gymnastics: unique modes of DNA evolution and processing in ciliates// Nat. Rev. Genet. 2000. V. 1. P. 191-198.

123. Prescott D. M., Murti K.G. Chromosome structure in ciliated protozoans//

124. Cold Spring Harbor symp. Quant. Biol. 1973. V. 38. P. 609-618.

125. Puchta H. DSB-induced recombination between ectopic homologous sequences in somatic plant cells// Genetics. 1999. V. 152. P. 1173-1181.

126. Roth G.E, Moritz K.B. Restriction enzyme analysis of the germ line limited DNA of Ascaris suum// Chromosoma. 1981. V. 83. P. 169-190.• > .« . . Г С.' Ф >

127. Roth M., Prescott D.M. DNA intermediates and telomere addition during genome reorganization in Euplotes crassusll Cell. 1985. V. 41. P. 411-417.

128. Roth D.B. and Wilson J.H. Illegitimate recombination in mammalian cells// In Gen. Recomb. Washington DC. 1988. P. 621-653.

129. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual, Ed.2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY// 1989.

130. Sargent R.G., Brenneman M.A., Wilson J.H. Repair of site-specific duoble-strand breaks in a mammalian chromosome by homologous and illegimate recombination//Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P. 267-277.

131. Seite P., Leroux D., Hillion J., Monteil M., Berger R., Mathieu-Mahul D., Larsen C.J. Molecular analysis of a variant 18;22 translocation in a case of lymphocytic lymphoma// Genes Chromosomes Cancer. 1993. V. 6. P. 39-44.

132. Singh G.B., Kramer J.F., and Krawetz S.A. Mathematical model to predict regions of chromatin attachment to the nuclear matrix// Nucl. Acids Res. 1997. V.25. P. 1419-1425.

133. Smith G.P. Evolution of repeated DNA sequences by unequal crossover// Science. 1976. V. 191. P. 528-535.

134. Spear B.B., Lauth M.R. Polytene chromosomes of Oxytricha: biochemical changes during macronuclear developement in a ciliated protozoan// Chromosoma. 1976. V. 54. P. 1-13.

135. Spicher A., Etter A., Bernard V., Tobler H., Muller F. Extremely stable*transcripts may compensate for the elimination of the gene fert-1 from all Ascaris lumbricoides somatic cells// Dev Biol. 1994. V. 164. P. 72-86.

136. Standiford D. M., Gregg T. G. Development of the large nucleolus in the oocytes of the copepod Acanthocyclops vernalis: an electron microscope study// Biol. Cell. 1989. V. 65. P. 127-132.

137. Stary A., Sarasin A. Molecular analysis of DNA junctions produced by illegimate recombination in human cells// Nucl. Acids Res. 1992. V. 20. P. 4269-4274.

138. Steinbruck G. Molecular reorganization during nuclear differentiation in ciliates// Germ line-soma differentiation; results and problems in cell differentiation. Berlin: Springer. 1986. V. 13. P. 105-174.

139. Tang X., Nakata Y., Li H., Zhang M., Gao H., Fujita A., Sakatsume O., Ohta. . t

140. Т., Yokoyama K. The optimization of preparations of competent cells for transformation of E.coli// Nucl. Acids Res. 1994. V.22. P. 2857-2858.

141. Takano M., Egawa H., Ikeda J.-E., Wakasa K. The structures of integration sites in transgenic rice// Plant J. 1997. V. 11. P. 353-361.

142. Taverna S.D., Coyne R.S., and Allis C.D. Methylation of histone H3 at lysine 9 targets programmed DNA elimination in Tetrahymena// Cell. 2002. V. 110. P. 701-711.

143. Telenius H., Carter N.P., Bebb C.E., Nordenskjold M, Ponder B.A., Tunnacliffe A. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by single degenerate primer// Genomics. 1992. V. 13. P. 718725.

144. Tobler H., Miiller F., Back E., Aeby P. Germ line soma differentiation in Ascaris: a molecular approach// Experientia. 1985. V. 41. P. 1311-1319.

145. Tobler H. The differentiation of germ and somatic cell lines in nematodes// Hennig W., editor. Germ line-soma differentiation; results and problems in cell differentiation. Berlin: Springer. 1986. V. 13 P. 1-69.

146. Viersbach R., Schwanitz G., Noethen M. Delineation of marker chromosomes•• • ■ • •»by reverse chromosome painting using only a small number of DOP-PCR amplified microdissected chromosomes// Hum. Genet. 1994. V.93. P. 663-667.

147. Wahls W.P., Wallace L.J., Moore P.D. The Z-DNA motif d(TG)30 promotes reception of information during gene conversion events while stimulating homologous recombination in human cells in culture// Mol. Cell. Biol. 1990. V. 10. P. 107-126.

148. Wang P., Zhou R.-H., Zou Y., Jackson-Cook C.K., Povirk L.F. Highly conservative reciprocal translocations formed by apparent joining of exchanged DNA double-strand break ends// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 12018-12023.

149. Wang G., Christensen L.A., Vasquez K.M. Z-DNA-forming sequences generate large-scale deletions in mammalian cells// PNAS. 2006. V. 103. P. 2677-2682.

150. Wolffe A.P., Hayes J.J. Chromatin distruption and modification// Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 711-720.

151. Wolfl S., Witting R., Rich A. Identification of transcriptionally induced Z-DNA segments in the human c-myc gene// Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1264. P. 294-302.

152. Wyngaard G.A., Rasch E.M. Patterns of genome size in the copepoda// Hydrobiologia. 2000. V. 417. P. 43-56.

153. Wyngaard G.A., Gregory T.R. Temporal control of DNA jeplication and the adaptive value of chromatin diminution in Copepods// J. Exp. Zool. (Mol. Dev. Evol.). 2001. V. 291. P. 310-316

154. Yao M-C., and Chao J-L. RNA-guided DNA deletion in Tetrahymena: an RNAi-based mechanism for programmed genome rearrangements// Annu. Rev. Genet. 2005. V. 39. P. 537-559.

155. Zhao Т., Heyduk T.C., Allis C.D., and Joel C. Heterochromatin protein 1 binds to nucleosomes and DNA in vitro// J. Biol. Chem. 2000. V. 275. N. 36. P. 28332-28338.

156. Zhimulev I.F. Polytene chromosomes, heterochromatin, and position effect variegation//Adv Genet. 1998. V. 37. P. 1-566.