Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СТИМУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕУСТОЙЧИВЫХ ФОРМ МЕТОДОМ КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "СТИМУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕУСТОЙЧИВЫХ ФОРМ МЕТОДОМ КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ"

Л-зу/у/

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи КОПЕРТЕХ Лилия Геннадьевна

СТИМУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА

В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕУСТОЙЧИВЫХ ФОРМ МЕТОДОМ КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ

Специальность 03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА и в отделе биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН.

Научный руководитель—чл.-кор. РАН, академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор Бутенко Р. Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Мазнн В. В., кандидат биологических наук Власова Т. А.

Ведущее учреждение — Главный ботанический сад РАН.

Защита диссертации состоится «

1995 г. в час. на заседании диссертационного совета

Д-120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва И-550, ул. Тимирязевская, 49, сектор защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке МСХА.

Автореферат разослан « . . » ч^СХ^рт^уСЬ-щд^ г.

Ученый секретарь диссертационного совета —

кандидат биологических

А. С. Лосева

- I -

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Одним из основных лимитируюших факторов сельскохозяйственной продуктивности является засоление почв. Около 9х10г всех земель планеты имеет повышенное содержание солей, количество засоленных почв с каждым годом воз- ■ растает. .'■ • ■ '..* ,•

С развитием биотехнологии растений потенциально.возможным стало получение толерантных к засолению генотипов путем селекции на уровне соматических клеток, слияния протопластов или переноса генов при использовании техники рекомбинантных молекул ДНК. На сегодняшний день для зерновых злаков наиболее хорошо разработана методика отбора соматических клеток'в стрессовых.условиях. _ . ' • " "

Чтобы применить к зерновым злакам технологию селекции на • уровне соматических клеток irt vitro, необходимы эффективные клеточные системы, позволяющие проводить скрининг клеток и . регенерировать целые растения с новыми качествами. .Такая клеточная система подразумевает выбор оптимального эксплантат -получение И поддержание морфогенной ткани; реализацию мор' фогенного потенциала ткани.. ' ' ' .

Однако, до сих пор недостаточно изучены факторы, определяющие пути ' развития культивируемых клеток и причины реализации той или. иной морфогенетической программы. Можно предположить, что"взаимодействие н^тивных и экзогенных регуляторов роста приводит к индукции определенного морфогенети- . ' ческого процесса." Изучение экзо- и эндогенной гормональной регуляции морфогенеза может помочь ответить на многие вопросы о' роли фитогормонов в культуре клеток пшеницы in vitro. . -Цели и'задачи исследования. Изучение экзогенных и эндо- '' . генных.гормональных факторов в процессах' морфогенеза in vitro и получение методами клеточкой селекции на основе со-маклональной вариабельности форм яровой пшеницы, устойчивых к хлоридному засолению. • ,'.. ..

Для'достижения г.оставленных целей необходимо было решить . следующие, задачи: ч . _ .•' ' - . . - •'

- изучить баланс4 нативных Фитогормонов экспланта (не.зре-' .

-ЦЕНТРАЛЬНАЯ: I ■ • НАУЧНАЯ С,- 16ЛИОТЕКА

¡.'.■оск. сольс;.-о>соз академии

. . '• - к-лого зародыша) и его влияние на характеристики первичного каллуса;

- изучить роль эндогенных фитогормонов в процессе образо-. вания организованных структур из дедифференцироЕанных клеток каллуса (на фоне пониженной концентрации 2,4-Д);

- выявить влияние хлоридного засоления на исходные геног типы in vivo и iv vitro;

- провести селекцию на клеточном уровне на резистентность к NaCI;

- охарактеризовать устойчивые.клеточные линии и получить из них растения - регенеранты; 4

-выяснить как сохраняется признак устойчивости в ряду клетка - растение-регенерант клетка и в последующих поколениях.

Научная новизна работы. Продемонстрировано, что эндогенное содержание гормонов в совокупности с экзогенными гормональными факторами играет.ключевую роль в индукции процессов морфогенеза. Впервые показано, что балаьс нативных фитогормонов экспланта (незрелого зародыша) является одним из факторов, влияющих на первичный каллусогенез и индукцию морфо-' генеза. Изучены особенности гормонального. баланса культивируемой ткани двух генотипов яровой мягкой пшеницы при высокой (2 мг/л) и . низкой (0,2 мг/л) концентрациях 2,4-Д. Предложена нетрадиционная добавка (ацетон), стимулирующая образование первичного морфогенного каллуса на незрелых зародышах. Комплексный подход при оценке толерантности к засолению, позволяет наглядно представить устойчивость новой формы по сравнению с ^сходной как на уровне клетки, так и на уровне целого растения. ...

■ Практическая ценность. Показана принципиальная возможность получения солеустойчивых форм у двух генотипов пшеницы методом селекции соматических клеток in vitrp. Продемонстрирована возможность практического применения гидропонных установок для тестирования растений-регенерантов на ■устойчивость к хлоридному засолению.' Полученные солеустойчивые формы пшеницы . могут служить материалом для ' селекционных программ как доноры генов толерантности к засолению.

• . Апробация работы. Основные положения работы были доложены на ежегодных семинарах Отдела биологии клетки и биотехноло-• гии ИФР РАН, на заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МОХА, на III Съезде Всероссийского Общества Физиологов растений: ■ (Санкт '.- . Петербург, 1993), на II ■Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Алмааты, 1993),' . '

■ Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

. Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырёх глав:, обзор литературы, объекты и мето: ды исследования,, результаты и.обсуждение (две главы), а также заключения, ■ выводов,.списка цитируемой литературы й приложений. .

Материалы диссертации изложены на 118 страницах машинописного текста,. , содержат 15 таблиц, 15 рисунков и 12 фотог-, рафий. Библиография содержит 140 источников, из которых зарубежной литературы - 89-. .'■•'■'

^ . • : . • ОБЪЕКТЫ И МЕТОЩ ИССЛЕДОВАНИЯ : , . '

Объектами: исследования служили два генотипа яровой мягкой пшеницы; сорт. Таежная и линия Фотос.У Растения выращивали в - поле или в сосудах"й .теплице.с режимом выращивания 25+2 С и 16 - часовой длиной светового дня.. ,-<■.■

Условия получения и культивирования каллусних тканей пшеницы.4 В- качестве эксплантов для индукции каллуса использовали незрелые гародыши на 14-16 сутки после цветения. В чашкуПетри помещали ;по■ 16-18-зародышей щитком вниз на среду M3'-(Murashige, Skoog, .1962)с добавлением 2-мг/л 2,4-Д и 10 мг/л AgNOj. • Длясубкультивироваяия использовали эту же среду; ' При индукции каллуса в стрессовых условиях и в'процессе■ (меточной селекции- на устойчивость к-засолению, использовали различные концентрации NaDI. . Изучая -влияние ацетона на. кал-лусообравование и-иачкяьные- этапы морфогенеза,: в среду. ► добавляли : 1,5 %.ацетона по объему.. Незрелые:.зародыши и каллус-; ные, ткани-культыьировали на свету '(интенсивностью освещения

3000 лк, длина дня 16 ч), при Т-25+1* С и относительной влажности воздуха 70+5X Длительность пассажа - 28-30 дней.

Регенерация растений Проводили в два этапа. На первом этапе каллуо переносили на среду КС, содержащую 1 мг/л БАП, 0,5 мг/л ИУК и 10 мг/л АеЫ03для индукции стеблевого морфогенеза. Регенерацию из отобранных клеточных линий проводили-как в нормальных условиях, так и в присутствии 0.5Х N301. При определении влияния ацетона на регенерацию в среду добавляли 1.5Х аце гона по объему. На втором этапе образовавшиеся растения переносили на жидкую среду С 1/2 минерального состава солей по КБ и 1 мг/л НУЮ для укоренения Растения с хорошо сформированной корневой системой переносили в почву.

Методы оценки солеустойчивости Оценивали солеустойчи-вость исходних генотипов и регенерантов из линии, полученных в результате клеточной селекции

Тестирование исходных генотипов и регенерантов методом проростков проводили в соответствии с Методикой УДовенко (Удовенко и др , 1988).

Для тестирования растений на гидропонных установках семена проращивали в течении одной недели Затем проростки помешали на гидропонные установки В качестве питательного раствора использовали смесь Прянишникова (Гродзинский, 1978). В питательный раствор опытных установок добавляли возрастающие концентрации МаС1. Контрольные растения сорта Таежная и линии Фотос выращивали на среде с солью Смену питательного раствора проводили еженедельно. На 50-е сутки культивирования измеряли длину растений и сырой вес. Устойчивость оценивали по соотношению длины и сырой массы растений при засолении к аналогичным параметрам в контроле, выраженные в процентах.

Незрелые зародыши исходных генотипов и солеустойчивых линий (поколение й^) помещали на среду каллусообразования, содержащую ИаС1. Устойчивость оценивали как отношение интенсивности роста каллуса в стрессовых условиях к интенсивности роста в контроле, выраженную в процентах.

Определение содержания эндогенных фитогормонов в незрелых зародышах и морфогенной каллусной ткани пшеницы Незрелые зародыши вычленяли нестерильно из полевых растений на 14-16

день после цветения (в той же стадии, что и для получения каллуса). На анализ брали морфогенную ткань в третьем пассаже на пятый и шестнадцатый дни после начала культивирования. Контрольную ткань- культивировали на среде MS с 2 мг/л 2,4-Д и 10 мг/л AgNOj. В. опытных вариантах концентрацию 2,4-Д снижали до 0,2 мг/л. Навеску. (500мг) замораживали в жидком' азоте и хранили при -70* С.

Очистку растительного'материала и определение цитокининов и АБК проводили в соответствии с методикой* разработанной в ИФР РАН (Катаева и др.-;-, 1990), с небольшой модификацией- ци-токинины не делили и для очйстки экстракта применяли колонки с "Sepharon" (фирмы "Хемапол" ЧССР).' Определение ИУК проводили в. соответствии с методикой,, разработанной Кудояровой (Кудоярова и др., 1986) . ' • • ',

Все эксперименты с культурой каллусных тканёй проводили в трех биологических й четырех аналитических повторностях. Опыты по количественному определению фитогормонов проводили в двух биологических и четырех аналитических повторностях. В "работе приведены средние между повторностями со стандартной ошибкой. При тестировании регенерантов на гидропонных установках вычисляли среднюю между показателями"отдельных растений и отклонение от средней (не менее 15 растений на одну точку). ; : ! ' . ; - _ •

-РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Раздел I; Особенности морфогенеза in vitro у двух геноти- 1

\ . :'пов яровой мягкой П1»ницы.Л%'-1.1. Иатйвнь^ фитогормоны незрелого зародыша и морфоген- -,. ный~ потенциал клеток, первичного каллуса.

Одним из важных генотипических различий между сортами растений одного вида является. содержание и соотношение на-, тивных^фитогормонов в их органах. Наиболее часто для получения морфогенной - каллусной, ткани и регенерации растений у пшениц используются" незрелые , зародыши, (Бутенко и др.,-. 1986; Redway -et al.", = 1990);. Определенная стадия: развития зародыш,

его морфофизиологические характеристики играют важную роль в этом процессе.

К моменту выделения незрелых Зародышей зерновки выбранных нами генотипов различались по массе. Средний вес зерновки линии Готос составил 52,1 мг, юг да как у сорта Таежная он Оыл только 42,2 мг. .Незрелые зародыши линии Сотое на 14-16 день после цветения имели Соле* крупные размеры (1,5 мм) по сравнению с размерами Таенной (1 мм). Вместе с этим, морфологические признаки, характеризующие стадию развития эксплантоа, были идентичны.

Изучение содержания нативных фитогормонов э незрелых зародышах сорта Таежная и линии Готос. позволило выявить существенные различия по вс^м трем группам исследованных фитогормонов Как видно из данных таблицы I. незрелые зародыши линии *1отое отличались повышенным содержанием цитокини-нов, а экспланты сорта Таежная характеризовались более высокими концентрациями ИУК и АБК.

Таблица 1 Содержание нативных фитогормонов в первичных зкеплантах (незрелых зародышах) двух генотипов пшеницы.

І і содержание фитогормонов, нг/Г сухого веса і

I генотип I_!

I * I ИУК 3-Р ИПА ИПА+З-Р АБК I

і_;_і

ІФотос 53.4±2.2 504,8*44 7 102,0*1,3 606,8*45 810,3*39,6 1 I Таежная 84,7*4,1 299,5*20,1 44,9*0,3 344,4*20,3 3381.9*42,3!

!_____|

I .

При помещении эксплантов. обладающих различным балансом нативных фитогормонов , > на ореду каллусосОразоваши, наблюдали различия в их реакции на одинаковые условия культивирования. Уже на вторые сутки после эксплуатирования на незрелых зародышах начиналось образование неорганизованно растущей ткани При этом, интенсивность каллусообразования была выше у линии 'їотос. Можно предполо-шть существование положительной корреляции между крупными размерами и повышенным содержанием нативных цитокининов в нмрелых зародышах линии «Іотос и болеї» ранним образованием перечнем о каллуса.

Увеличение содержания ■ИУК и уменьшение цитокининов могло сказаться на темпах каллусообразоваяия у сорта Таежная. Не исключено также тормозящее действие АБК. На девятые -' четырнадцатые сутки после начала культивирования у части эксплан-тов наблюдали развитие побегов из тканей зародышей (,Табл. 2),-Линия Фотос, отличающаяся повышенным содержанием цитокининов, характеризовалась более высокой частотой развития побегов. ■ , 1 ; На первичных эксплантах наблюдали образование морфоген-ной и неморфогенной каллусной ткани. Большее количество каллуса первого типа образовалось на незрелых зародышах сорта Таежная.{Табл. 2). При помещении каллусной ткани, на среду регенерации, стеблевой,морфогенез удалось индуцировать у 28% эксплантов линии Фотос и у 62% сорта Таежная (Табл. 2).

Таблица 2. Характеристики первичного каллуса двух различ--ных генотипов пшеницы. ; ,' . '•

< * ■ ( , ... , * "побеги из-. 1 морфогенные число регене- 1

¡.генотип незрелых . К каллусы рировавших, 1

! . . ' 1 ' . зародышей, X ! 7. эксплантов, % ■ 1

! - Фотос " . : 40,012,6 25,8+1,4 28,4+0,6 1

! -Таежная' 1 ■ ■ , 23,213,4 , , - V 44,713,2 • 62,216,4 1

Сопоставление полученных результатов о различном балансе фитогормонов в незрелых зародышах разных генотипов с особенностями первичного каллусогенезачастотой образования мор. фогенной каллусной . ткани .и- ре гене рацион ной способностью, позволяет сделать вывод о том, что одним из, факторов, влияю-• щих на первичный каллусогенез и-индукцию.морфогенеза является баланс -эндогенных фитогормонов экспланта. Баланс зндоген-' ных•фитогормонов • ' в ' сочетании - с . дашшми условиями культивирования.позволил наиболее полно реализоваться морфо' генному потенциалу.сорта Таежн&я.- ■ .

- В -

1.2. Ацетон как стимулятор образования первичного каллуса.

Как правило, при использовании в качестве эксплантов незрелых зародышей, можно наблюдать развитие их собственных побегов . На контрольной среде возникающие побеги удаляли 23 раза, т.к. в их присутствии каллус растет хуже. Как показали наши исследования, добавление ацетона в среду культивирования увеличило число эксплантов, не образующих побеги из тканей незрелых зародышей как у Таежной, так и у Фотоса (Табл. 3). Это явление можно использовать для стимуляции образования первичного каллуса в культуре ir\ vitro

Таблица 3. Влияние ацетона на каллусообразование, индукцию морфогенной ткани и регенерацию в культуре незрелых зародышей пшеницы.

I I контроль I 1,52 ацетона I

I генотип!___I

I '1 1 2 3 11 2 3 1

I_I

1ФЭТОС 43,1+4.2 24.2*2.1 28,4±0,5 27.6±2.8 42,3±3,3 18,9±1,3! (Таежная 36,7+5,1 37,5+0.8 62,2±6,4 21,6i2.0 46,6±2,3 30,9i2,4! )_!

1 - побеги из незрелых зародышей, %

2 - морфогенные каллуоы, 7.

3 - число регенерировавших эксплантов, X

По структуре первичный каллус, образующийся на среде с ацетоном, сходен с таковым на контрольной ср^де. И'в том и в другом вариантах можно было выделить морфогенную и неморфо-генную ткань. Следует отметить, что в присутствии ацетона, повышалась частота образования морфогенных клеточных линий (.Табл. 3). Для подтверждения действия ацетона на развитие побега, каллусы помещали на среду рег^нерции с ацетоном. Способность к стеблевому морфогенезу снизилась с 28% до 132 у Фотоса и с 62Х до 30Х у Таетаой. Механизм действия ацетона на культивируемые ткани пшеницы еще не ясен. Возможно, что как токсическое химическое соединение он тормозит рост побегов, образующихся как из тканей зародыша, так и из морфоген-

. ного каллуса. < ' . .

1. 3. Баланс эндогенных гормонов в зависимости от экзогенного -содержания 2,4-Д.

Сохранение морфогенного потенциала в культуре неорганизованно растущих каллусных тканей . - -важная составная часть клеточных технологий,, создаваемых для селекции. В принятых методиках получения регенерантов пшеницы существует два различных подхода Первый!- использование первичных каллусов и регенерантов из этих каллусов. Второй - получение регенеран-,.тов из длительновыращиваемых культур. Продолжительное субкультивирование каллуса in vitro способствует повышению " ге- • нетического разнообразия клеток, • что позволяет проводить скрининг на устойчивость к различньои стрессам. >

. • Для получения и размножения культуртканей зерновых злаков наиболее широко ис пользуется 2,4- Д как физ иологический аналог ауксина. Мы также использовали 2,4-Д в качестве до-', бавки к среде культивирования. С целью длительного сохранения морфогеннбй потенции каллуса применяли два приема:

- культивирование на среде с высоким содержанием 2,4-Д (2 мг/л); •

- визуальная селекция морфогенного каллуса при субкультивировании. , •

При прочих равных условиях культивирования генотип оказывал- существенное ' влияние на сохранение способности к морфогенезу и регенерации,- Ткань сорта Таежная к 7-8' пересадке становится, неморфогенной, ; тогда' как каллус линии Фотос не терял способности ^ морфогенезу в течении 20 ■ субкультивирований. По ' балансу эндогенных фитогормонов ~морфогенная каллус ная ткань обоих генотипов имела много общего (Табл. 3).

■ В процессе культивирования каллуса на среде с 2 мг/л 2,4-Д и' 10 AgNOjпервоначальные различия в1; содержании эндогенных фитогормонов,'. существовавшие между эксплантами, сглаживаются., - Для получения регенерантов изменяют экзогенное содержание гормонов: В; данной-.' работе концентрацию 2,4-Д снижали до 0,2 мг/л. Измерение содержания фитогормонов проводили в двух

• ■ ■ . - 10- ;.•,•■ ' . ' •

Табл.3. Содержание нативних_ фитогормонов- в .морфоген- ~ • ' ных каллусах различных генотипов пшеницы на среде с 2мг/л 2,4-Д.'

І"- содержание нативных фитогормонов, нг/г сухого веса I

генотип! • _:__1

і .ИУК 3-Р , . КПА З-РШІА АБК Г

' " '■ " ■ ■•. • ■:■■ ■ ' ■ і

Сотое 211,8±1,4 436,9158,3 378,2t21,3 815,1±77,6 832,9tl,0)

Таежная 205,5t2,9 636,1165,6 258,6il0,6 894,7176,2 І170±8,4 t

' ' ■ _ ____ •__• ' {

точках: на 5-й и 16-й день после начала оубкультивирования. ^ ". В первой точке не наблюдали видимых различий между контоль- : ней и опытной тканью. При дальнейшем культивировании.на этой среде наблюдали развитие организованных структур из дедиффе-. ренцированных клеток каллуса. Так, через 16 дней на каллусе / .' появлялись первые корни. Этому процессу предшествует измене- ' ние эндогенного баланса фитогормонов,' выраженное' в повышении .' ' содержания ИУК и общих цитокининов и снижении концентрации ' . ингибитора роста АВК (Рис. 1,2,3). К концу перврго еубкуль-тивирования подавляющая часть эксплантов была ризогенной. 'Зеленые морфогенные очаги развивались в побеги. К концу второго субкультивирования на среде с пониженным содержанием 2,. 4-Д у тканей линии Фотос и после трех пассажей у тканей сорта Таежная способность к росту и морфогензу падала и наблюда- / лась гибель клеток.' .Таким образом, изменение гормонального ■•' состава среды культивирование приводит'к сдвигу, эндогенного-гормонального баланса . культивируемой ткани и как следствие

этого к развитию структур cte novo из морфогенных клеток .

' ' ■ ■ - * ~ . - ■ -

Раздел II. Клеточная селекция растений на устойчивость к хлоридному засолению.4

II.1. Особенности исходных генотипов при культивировании ' на засолении in vivo и in vitro. ' д

Клеточная селекция; на устойчивость к засолению более эф-,-фективна в том случае,, если существует связь между солеус-': •гойчивостью на уровне клеток и на уровне целого растения.-..

Рисунок І.

Изменение содержания эндогенной ЇІУК в \гор.огенноЛ каллусной ткани пшеницы в зависимости от концентраты экзогенной 2,4-Д.

1ЄОО

Я 1400

о

§ 1200 X

о 1000

I

к о о

600 600 400 200 О

дни

Рисунок 2. Mi Изменение содердания эндогенных цитокининов в морйогенной каллусной ткани пшеницы в зависипостя от концентрат: л экзогенной 2.4Д.

2 ООО

I Фотос

II Таекная

ш дни

1. 2 мг/л 2,4-Д

2. 0,2 мг/л 2,4-Д

' ' - 12 - •■ ' ; . -Толерантность .к засолению у растений оценивали на гидропонных установках. . Влияние* N^1 на индукцию^ллуса и на рост . клеток в третьем субкультивировании изучали у исходных генотипов с целью выявления клеточного уровня устойчивости.'

На гидропонных установках растения выращивали в течении 60-и дней/; пАцпенно увеличивая уровень засоления (от 0,5% NaCI до 1Z NaCI)™ В качестве контрольного параметра использовали накопление сырой массы растений на среде без соли. По данным рис. 4 видно, что длительное культивирование растений в условиях гидропоники , позволило выявить различия в соле-устойчивости исследуемых' генотипов. Линия Фотос продемонстрировала большую толерантность к возрастающим концентрациям хлористого натрия по сравнению с Таежной. ■. ;-

Метод тестирования солеустойчивости при индукции каллуса был предложен Nam и Hezsky (Nam et al,,. 1986) и использован , для лабораторной оценки устойчивости пшеницы на кафедре биотехнологии МСХА (Еаттатхоттам, 1991; Диас, 1994). Присутствие соли .задерживало образование каллуса на незрелых зародышах на 7-9 дней у обоих генотипов. Кроме того< угнетался рост ткани и образование морфогенных каллусов. Прирост ' биомассы первичного каллуса у Фотсйа превышал этот показатель у Таежной (Рис. 5). ' ; ■ • ■ . ■ . :"

В третьем субкультивировании каллусные ткани помещали на среды, содержащие , различные концентрации NaCI (Рис.. 6). Выявили генотипические.различия в ответе на засоление. Низкие концентрации соли стимулировали рост каллусной ткани у линии. Фотос, тогда как у сорта Таежная этого эффекта не наблюдали. Необходимо.отметить, что солевой стресс в большей степени угнетает процесс ■ дедифференциации по сравнению с, ростом сформированных каллусных тканей. Угнетение роста каллуса на 50л наблюдали при 1,5Х NaCI у Фотоса и при 0,7Х NaCI у Таеж-^ ной. Можно сделать вывод," что и на уровне Сформировавшейся'-каллусной ткани клетки линии Фотос также оказались более: устойчивыми к засолению, ' - ■ ' "' . ,

Таким образом, как на уровне клеток, так и на уровне целых растений проявляются"Генотипические различия по степени соле устойчивости.' Можно ожидать, • что селекция на клеточном

- 1П -

Рисунок 3.

Изменение содерьшшя эндогенной АБК в мороогзнной каллусной • ткани пшеницы в зависимости от концентрации экзогенноЛ 2,4-Д.

1400

| 200

ДИК

1. 2 иг/л 2,4-Д

2. 0.2 чг/л 2,4-Д

I илэтос нв 1

II Таежная

Рисунок 4.

Влияние засоления питательного раствора ьа накопление сырой массы растении у исходных генотипов пшеницы.

100

р.

н 60

о ео

ЪЧ.

3 40 о

щ 3 20

0,5

0,5

20

0.7

I соль %

60 дай

I. чОТОС

2. Таеяная

' Рисунок 5; '■ /

Влияние хлорада натрия па индукцию каллуса • у исходных генотипов.'

• ■ .. ■ is - :, .

уровне представляет реальную перспективу получения резистентных к NaCI линий и растений-регенерантов из них.

/ : ;• ' II. 2. "Устойчивые клеточные линии.. ;

'•С целью отбора ■. истинно резистентных клеток использовали принципы длительного культивирования. в присутствии стрессового фактора и возврата в-неселективнне условия. В. процессе отбора применяли как жесткую селекцию (Таб. 4, схема 1), так и ступенчатую (Таб.4, схемы 2 и 3). ■ - .'. ! '

Таблица 5. Отбор солеустойчивых клеточных линий у двух "• генотипов пшеницы. . •••• .

схемы селекции субкультивирования

;• • . . О/ 1. 2 3 4 5 6 7 8-9 10 11

1 NaCI, Z О ; О 0.1 1 ' 1. 1 1. О' О 1 . 1-.

2 . NaCI, Л О ¡ 0 О 0,5 0.5 0,5 1 1 0 0 1 1

3 V NaCI, 2 0,3,0,3 0,3 1 1 О О 0,5

» схема 1 число Г стабильные солеуст. линии ■

I 1 генотип - ! .сел-^ 1 • экспл. ! ЧИСЛО i X 1

1 Фотос 1 ;, 57; 3 . • 5.3 !

1 •2 .137 .26 18,9 1

1 •'. .3 • 210 ■ . 21 10

1 Таежная , i;. 77 !

» '■■• ГУ . ■ ' " «V " ■ 76 . 4 • " ■' .5; ' '

V 3 - 216 \ ' 5 2,3

; . а^фективность1 отбора зависела от генотипа. Наибольшее количество устойчивых линий получено у Фотоса на Есех трех схемах селекции. Ткани сорта Таежная погибали в.жестких селективных условиях и отобрать устойчивые клеточные линии па схеме 1 не удалось.; При отборе с адаптивных концентраций, у Таёжной были получены клеточные линии, . резистентные к соли. Необходимо отметить, что к 7-8 субкультив'ировакию ткани этого генотипа теряли способность к регенерации, поэтому селек-. цию пришлось вести на ранних субкультивированиях и по схеме

Г .

3 (отбор устойчивых клеток на стадии индукции каллуса). "

При выборе схемы селекции приходилось учитывать не только солеустойчивость генотипа, но и его способность к сохранению морфогенного потенциала при длительном субкультивировании.

II.3. Растения - регенеранты.

Регенерация растений проса (Pius et al., 1993) и пшеницы (Еаттатхоттам, 1991) в присутствии стрессового фактора повышала эффективность отбора В данной работе растения из толерантных линий получали как на бессолевой среде, так и в при-сутсвии 0.5Х и 0,77* NaCI (Табл. 5). • При получении регенерантов приходилось учитывать генотипическйе особенности тканей Фотоса и Таежной, крторые проявлялись при культивировании in vitro.

Таблица 5. Влияние NaCI на регенерацию растений различных генотипов пшеницы. . / - .-••"';.•:. ' ' •

1 1 0 NaCI 0.5Х NaCI' 0.7Z NaCI , 1

1 генотип 1 ' 1

1 » 1 число число 1 X :число і число ! г 1 число (ЧИСЛО і XI

« I і ! экспд. ! рЄГ-ОВ! I экспл. 1 рег-ові 1 ЭКСПЛ. 1 рег-ові : . 1 :■■•■' ■■ ' • Г

1ЇОТОС 7 17 28 165 23 14 і , 60,9 '..14 4 28,61.

ІФотос 17 49 3 6,1 23 5 . 21.7 19 '•. 4 ; 21,11-

!Таежная 1 18 , -15 83,3 5 '' 2 . •40 , 6 33,3!

і Таежная 3 4 3. 75 3-/. • і 33,3 5 . ''. 1' 20 1

!Фотос 8 ' 10 ' 20 200 20 . 7 35, . 19 - 1

!Фотос 9 28 16 88,9 48 6 1.3 48.; - 1

В отсутствии стрессового фактора получено наибольшее количество регенерантов. . Добавление ЫаС1 в сред/ снижало интенсивность регенерации по сравнению с контролем. У подавляющего большинства линий; выход растений - / регенерантов • снижался и при .увеличении концентрации соли с; 0,6Х .'до О, .

У., регенерантов. И»встречались аномалии в строении колоса;,, большинсво из них были низкорослы' ит стерильны.. С увеличени- *

ем продолжительности культивирования каллуса, увеличивалась доля стерильных растений. Так, у линий Еотоса после 14 еуо-культивирования не удалось получить -ферт иль них растений, несмотря на сохранение способности к сегенерации.

11. 4. Тестирование растений - регенерантов на устойчивость к засолению.

Получение солеустойчивых форм растений невозможно без применения в ходе работы методов и приемов диагностики уровня устойчивости растений.

Растения - регенеранты (поколение тестировали на гидропонных установках Одним из достоинств этой системы является возможность четкого контроля за уровнем засоления питательного рвствора. Содержание Иа01 в среде за 50 дней культивирования постепенно увеличивали с 0,5£ до 1%. Об уровне устойчивости судили по длине и накоплению сырой массы растений, по отношению к контролю. Контрольные растения исходных генотипов выращивали в тех же условиях, что и линии. Тестированные линии в той или иной степени превосходили родительские сорта (Рис. 7,8}. Можно выделить две полученные формы линии Таежная 7 и Сотое 17. В лиг^ратур^ также встречаются сообщения о применении гидропонных установок для тестирования растений - регенерантов проса (Рнь чЬ а1. , 1993) и риса (ИаЬогз , 1985). Можно сделать вывод, что признак устойчивости к ЫаС1, отобранный на уровне клеток, сохраняется в течении двух поколений у растений - регенерантов

Ранее было показано, что у исследуемых генотипов существует корреляция между уровнем солеустойчивости клеток и растений. Поэтому, мы посчитали правомерным использовать в качестве теста на солеустойчивооть метод индукции каллуса в стрессовых условиях. Донорные растения выращивали в поле. Использовали незрелые зародыши линий Таежная 1, Таежная 3, Таежная 7, Фотос 17 и Фотос 26 Все изученные линии е той или иной степени превышали контроль по относительному приросту биомассы. По этому прианаку их можно расположить в следующий убывающий ряд.. Таежная 1, Таежная 3, «Еотос 26, Фэ-

Рисунок 7. , .

Влияние засоления питательного раствора на высоту растений солеустоЛчквых.линий (поколение 82).

1*0

1 2 3 4 ' б 6 7 8 генотип

Рисунок Ь. . . • . '

. Влияние засоления питательного раствора на накопление сырой биомассы растений у оолеустойчнвых линий (поколение К^)

8 генотип

I. Таежная, контроль.

'¿. Таежная I

3. Таешая 3

4." Таекная о

Ь. Таежная 7 ■:. . 6.. ^отос, контроль У.. 4<отос 26 • " Ь. <Х)ТОС IV. ' ■ .: >".

тос 17, Таежная 7 (Табл 6). ИаС1 оказывал влияние не только на процессы каллусообразования и накопления биомассы, но и «а процесс закладки морфогенных оон в ткани Количество мор-фогенных каллусных линий у устойчивых генотипов превосходит количество морфогенной ткани у Таенной и Ь^тоса.

Получении'3 данные свидетельствуют в пользу того, что признак устойчивости к роли передается в ряду клетка -растение-регенерант - клетка

Таблица 6. Тестирование регенерантов методом индукции каллуса в стрессовых условиях (0,5^ НасI). Семенное поколение 1?|..

: ! ' генотип 1 1 1 относит, прирост оисмассы каллуса i морфогенные ! каллусы, Z ; • *

мг 7, к контролю

! Таежная

! контроль б1,9±9,9 100 17,2 1

1 Таежная 1 94,2114,2 152 30,5 1

! Таежная 3 70,6±1,1 114 OI О 1 , »у 1

1 Таежная 7 64,6±3,8 104,3 33,3 I

! Фотос

1 контроль 81.8+3,1 100 10.3 1

! Фзтос 17 85,93±.6,4 105 31.7

I Фотос 26 98.13+3.1 107,9 I

Окончательное суждение об уровне устойчивости полученных форм можно будет вынести после полевых испытаний.

ВЫВОДЫ

1. Первичный каллуоогенез и индукция морфогенеза существенно зависят от баланса нативных фитогормонов зксплонта (незрелого зародыша).

2. Применение ацетона в качестве добавки к ер^де культивирования угнетает рост пооегов зародышей и стимулирует кал-лусогрнез с увеличением доли морфогенных клеток.

- ¡¿О". . •

3. Исследуемые генотипы, различны по продолжительности сохранения морфогенного потенциала;. На среде с 2 мг/л 2,4-Д сорт Таежная теряет, способность к морфогенезу к 7-8 субкультивированию, линия Фотос сохраняет способность к регенерации до 20 пересадки. _ -

4. Снижение на порядок (до 0,2 мг/л) концентрации 2,4-Д в среде приводит, к увеличению содержания нативных ИУК и цито-кининов и снижению концентрации АБК. Такое изменение гормонального баланса индуцирует развитие структур из проэмбрио-генных клеток.

5. Б результате проведенной клеточной. селекции на толе-, -рантность к хлоридному засолению у двух генотипов .'яровой

мягкой пшеницы получены устойчивые клеточные линии и растения - регёнеранты из них. ... ' <

6. Клетки, отобранные по признаку толерантности, к засоле-. нию, сохраняли это свойство' в течении ' двух поколений у растений - регенерантов:. Устойчивость к соли передается в

. ряду клетка 1 р^стение-регенерант - клетка. . '

7. Полученные, солеустойчивые формы могут служить материалом для дальнейшей селекции и будут переданы в БНИИЗиС для проведения полевых испытаний и оценки их хозяйственно -'Ценных качеств.

Работы, опубликованные по материалам диссертации.

1. Копертех Л. Г. , Бутенко Р. Г. Каллусогенез и морфогенез у различных "■ генотипов Triticum aestivum // Тезисы докладов 111 Съезда Всероссийского общества физиологов растений. .Санкт-Петербург. - 1993. - С. 133. ■ .

- 2. Копертех JL Г. , , Бутенко Р. Г. . Никифорова И. Д. Влияние ацетона на ■ каллусогенез и морфогенез в культуре клеток Triticum aestivum // Тезисы докладов II Международной;конференции "Биология 1 культивируемых,клеток.и биотехнология". -Алмааты- - 1993. С. 59.;-._' V V.- '

' 3.. Копертех Л. Г., Бутенко Р. г. Ацетон как нетрадиционная добавка к среде культивирования // Докл. РАН. • - 1995.. 342, N 1. .' . , ■ . . ' ._*■■•'

УОСП■■

Объем 1'Д п л

Заказ 250

Тираж 100

Типография Московской с ■< академия им К Л Тимирязева 127550, Москва И 550, Тимирязевская ул, 44