Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Стимуляция морфогенеза в культуре клеток яровой мягкой пшеницы для получения солеустойчивых форм методом клеточной селекции

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Стимуляция морфогенеза в культуре клеток яровой мягкой пшеницы для получения солеустойчивых форм методом клеточной селекции"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи КОПЕРТЕХ Лилия Геннадьевна

СТИМУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА

В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕУСТОЙЧИВЫХ ФОРМ МЕТОДОМ КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ

Специальность 03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА и в отделе биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН.

Научный руководитель—чл.-кор. РАН, академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор Бутенко Р. Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Мазин В. В., кандидат биологических наук Власова Т. А.

Ведущее учреждение — Главный ботанический сад РАН.

Защита диссертации состоится « . А . »

1995 г. в ^Н.'РР час. на заседании диссертационного совета Д-120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К- А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва И-550, ул. Тимирязевская, 49, сектор защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке МСХА.

Автореферат разослан «.•?..» . ЛЛ*(Х^ггу(Ъ-1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета — /?/'//!

1 ациипли! и сиосх а --// / /

кандидат биологических наук /*^осева

- I -ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Одним из основных лимитирующих факторов сельскохозяйственной продуктивности является засоление почв. Около 9x10' всех земель планеты имеет повышенное содержание солей, количество засоленных почв с каждым годом возрастает.

С развитием биотехнологии растений потенциально возможным стало получение толерантных к засолению генотипов путем селекции на уровне соматических клеток, слияния протопластов или переноса генов при использовании техники рекомбшгантных молекул ДНК. На сегодняшний день для зерновых злаков наиболее хорошо разработана методика отбора соматических клеток в стрессовых условиях1.

Чтобы применить к зерновым злакам технологию селекции на уровне соматических клеток in vitro, необходимы эффективные клеточные системы, позволяющие проводить скрининг клеток и регенерировать целые растения с новыми качествами. Такая клеточная система подразумевает выбор оптимального зкспланта, юлучение и поддержание морфогенной ткани, реализацию мор-фогенного потенциала ткани.

Однако, до сих пор недостаточно изучены факторы, определяющие пути развития культивируемых клеток и причины реализации той или иной морфогенетической программы. Можно предположить, что взаимодействие наивных и экзогенных регуляторов роста приводит к индукции определенного морфогенети-ческого процесса. Изучение зкзо- и эндогенной гормональной регуляции морфогенеза может помочь ответить на многие вопросы о роли фитогормонов в культуре клеток пшеницы in vitro.

Цели и задачи исследования. Изучение экзогенных и эндогенных гормональных факторов в процессах морфогенеза 'in vitro и получение методами клеточкой селекции на. основе со-маклональной вариабельности форм яровой пшеницы, устойчивых к хлоридному засолении

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

- изучить баланс натиьных фитогормонов зкспланта (незре-

- ¡¿ -

лого зародыша) и его влияние на характеристики первичного каллуса;

- изучить роль эндогенных фитогормонов в процессе образования организованных структур из дедифференцированных клеток каллуса (на фоне пониженной концентрации 2,4-Д);

- выявить влияние хлоридного засоления на исходные геног типы in vivo и iv vitro;

- провести селекцию на клеточном уровне на резистентность к NaCI;

- охарактеризовать устойчивые клеточные линии и получить из них растения - регенеранты;

'- выяснить как сохраняется признак устойчивости в ряду клетка - растение-регенерант - клетка и в последующих поколениях.

Научная новизна работы. Продемонстрировано, что эндогенное содержание гормонов в совокупности с экзогенными гормональными факторами играет ключевую роль в индукции процессов морфогенеза. Впервые показано, что балаьс нативных фитогормонов экспланта (незрелого зародыша) является одним из факторов, влияющих на первичный каллусогенез и индукцию морфогенеза. Изучены особенности гормонального баланса культивируемой ткани двух генотипов яровой мягкой пшеницы при высокой (2 мг/л) и низкой (0,2 мг/л) концентрациях 2,4-Д. Предложена нетрадиционная добавка (ацетон), стимулирующая образование первичного морфогенного каллуса на незрё-лых зародышах. Комплексный подход при оценке толерантности к засолению, позволяет наглядно представить устойчивость новой формы по сравнению с ^сходной как на уровне клетки, так, и на уровне целого растения.

Практическая ценность. Показана принципиальная возможность получения солеустойчизых форм у двух генотипов пшеницы методом селекции соматических клеток in vitro. Продемонстрирована возможность практического применения гидропонных установок для тестирования растений-регенерантов на устойчивость к хлоридному засолению. Полученные солеустойчивые формы пшеницы могут служить материалом для селекционных программ как доноры генов толерантности к засолению.

АпроОация работы. Основные положения работы были доложены на ежегодных семинарах Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН, на заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МСХА, на II J Съезде Всероссийского Общества Физиологов растений ■ (Санкт - • Петербург,1993), на II Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Алмааты, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав: обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты и обсуждение (две главы), а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений.

Материалы диссертации изложены на 118 страницах машинописного текста,, содержат 15 таблиц, 15 рисунков и 12 фотографий. Библиография содержит 140 источников, из которых зарубежной литературы - 89 .

• ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектами исследования служили два генотипа яровой мягкой пшеницы: сорт Таежная и линия Фотос. Растения выращивали в поле или в сосудах в теплице.с режимом выращивания 25+2 С и 16 - часовой длиной светового дня..

Условия получения и культивирования каллусных тканей пшеницы. В качестве эксплантов для индукции каллуса использовали незрелые ■зародыши на 14-16 сутки после цветения. В чашку Петри помещали по 15-18 зародышей щитком вниз на среду MS (Murashige, Gkoeg, 1962). с добавлением 2-мг/л 2,4-Д и 10 мг/л AgNOj. Для субкультивирования использовали эту же среду. При индукции каллуса в стрессовых условиях и в процессе клеточной селекции на устойчивость к засолению, использовали различные концентрации NaCI. Изучая влияние ацетона на кад-луеообра&ование и начальные этапы морфогенеза, в среду, добавляли.'1,5 % ацетона по объему. Незрелые зародыши и каллус-ные тк&ни культивировали на свету ('интенсивность освещения

3000 лк, длина дня 16 ч), при Т=25+1* С и относительной, влажности воздуха 70+5%. Длительность пассажа - 28-30 дней.

Регенерация растедий. Проводили в два этапа. На первом этапе каллус переносили на среду МЗ, содержащую 1 мг/л БАП, 0,5 мг/л ИУК и 10 мг/л А^ЮзДДя индукции стеблевого морфогенеза. Регенерацию из отобранных клеточных линий проводили-как в нормальных условиях, так и в присутствии 0,5% МаС1. При определении влияния ацетона на регенерацию в среду добавляли 1,-5% ацетона по объему. На втором этапе образовавшиеся растения переносили на жидкую среду ( 1/2 минерального состава солей по МЗ и 1 мг/л НУК) для укоренения. Растения с . хорошо сформированной корневой системой переносили в почву.

Методы оценки солеустойчивости. Оценивали солеустойчи-вость исходных генотипов и регенерантов из линий, полученных в результате клеточной селекции.

Тестирование исходных генотипов и регенерантов методом проростков проводили в соответствии с методикой Удовенко (Удовенко и др., 1988;.

Для тестирования растений на гидропонных установках семена проращивали в течении одной недели. Затем проростки помещали на гидропонные установки. В качестве питательного раствора использовали смесь Прянишникова (Гродзинский, 1978). В питательный раствор опытных установок добавляли возрастающее концентрации МаС1. Контрольные растения сорта Таежная и линии Фэтос выращивали на среде с солью. Смену питательного раствора проводили еженедельно... На~ 50-е сутки культивирования измеряли длину растений и сырой вес. Устойчивость оценивали по соотношению длины и сырой массы растений при засолении к аналогичным параметрам в контроле, выраженные в процентах.

Незрелые зародыши исходных генотипов и. солеустойчивых линий (поколение помещали на среду каллусообразовакия, содержащую ИаС1. Устойчивость оценивали как отношение интенсивности роста каллуса в стрессовых условиях к интенсивности роста в контроле, выраженную в процентах.

Определение содержания эндогенных фитогормонов в незрелых зародышах и морфогенной' каллусной ткани пшеницы. Незрелые зародыши вычленяли нестерильно из полевых растений на 14-16

день после цветения (в той же стадии, что и для получения каллуса). На анализ брали морфогенную ткань в третьем пассаже на пятый и шестнадцатый дни после начала культивирования. Контрольную ткань культивировали на среде МЗ с 2 мг/л 2,4-Д и 10 мг/л AgNOj. В. опытных вариантах концентрацию 2,4-Д снижали до 0,2 мг/л. Навеску (500мг) замораживали в жидком азоте и хранили при -70* С.

Очистку растительного материала и определение цитокининов и АБК проводили в соответствии с методикой, разработанной в ИФР РАН (Катаева, и др., 1990), с небольшой модификацией; ци-токинины не делили и для очистки экстракта применяли колонки с "Sepharon" (фирмы "Хемапол" ЧССР). Определение ИУК проводили в соответствии с методикой, разработанной Кудояровой (Кудоярова и др., .1986).

Все эксперименты с культурой каллусных тканей проводили в трех биологических й четырех аналитических повторностях. Опыты по количественному определению фитогормонов проводили в двух биологических и четырех аналитических повторностях. В работе приведены средние между повторностями со стандартной ошибкой. При тестировании регенерантов на гидропонных установках вычисляли среднюю между показателями отдельных растений и отклонение от средней (не менее 15 растений на одну точку).

. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. •

Раздел I. Особенности морфогенеза in vitro у двух генотипов яровой мягкой пшеницы.

1.1. Нативные фигогормоны незрелого зародыша и морфоген-ный потенциал.клеток первичного каллуса.

Одним из важных генотипических различий между сортами растений одного вида является,содержание и соотношение на-тивных фитогормонов в их органах. Наиболее часто для получения морфогенной каллусной ткани й регенерации растений У пшениц используются незрелые зародыши (Бутенко и др., 1986; Redway-et al. , 1990). Определенная стадия развития зародыша,

- С; -

его морфофизиологические характеристики играют важную роль в этом процессе. '

К моменту выделения незрелых ¡зародышей зерновки выбранных нами генотипов различались по массе. Средний вес зерновки линии <1отос составил 52,1 мг, тогда как у сорта Таежная он был только 42,2 мг. -Незрелые зародыши линии Фотос на 14-16 день после цветения имели более крупные размеры (1,5 мм) по сравнению с размерами Таежной (1 мм). Вместе с этим, морфологические признаки, характеризующие стадию развития эксплантов, были идентичны.

Изучение содержания нативных фитогормонов в незрелых зародышах сорта Таежная и,-линии йотос, позволило выявить существенные различия по всем трем группам исследованных фитогормонов. Как видно из данных таблицы 1, незрелые зародыши линии Фотос отличались повышенным содержанием щгаокини-нов, а экспланты сорта Таенная характеризовались более высокими концентрациями ИУК и АБК.

Таблица 1. Содержание нативных фитогормонов в первичных эксплантах (незрелых зародышах) двух генотипов пшеницы.

I i содержание фитогормонов, нг/г сухого веса i

! генотип !__]___¡

I I ИУК 3-Р ИПА ИПА+З-Р АБК I

í_____' _-

! Фотос 53,4±2,2 504,8*44.7 102,0*1,3 606,8*46 810,3*39,6 I ¡Таежная' 84,7*4,1 299,5*20,1 44,9*0,3 344,4*20,3 3381,9*42,3! I______. Г

При помещении эксплантов, обладающих различным балансом . нативных фитогормонов , ''на среду каллусообразования, наблюдали различия в их реакции на одинаковые условия культивиро- ' вания. Уже на вторые сутки после зксплантирования на незрелых зародышах начиналось образование неорганизованно, растущей ткани. При этом, интенсивность каллусообразования была выше у линии íotoc. Можно предположить существование положительной корреляции между крупными размерами и повышенным содержанием нативных цитокининов в незрелых зародышах линии Фотос и более ранним образованием первичного каллуса.

Увеличение содержания ИУК и уменьшение цитокининов могло сказаться на темпах каллусообразования у сорта Таежная. Не исключено также тормозящее действие АБК. На девятые -■ четырнадцатые сутки после начала культивирования у части, эксплан-тов наблюдали развитие побегов из тканей зародышей (,Табл. 2). Линия Фотос, отличающаяся повышенным содержанием цитокининов, характеризовалась более высокой частотой развития побегов.

На первичных эксплантах наблюдали образование морфоген-ной и неморфогенной каллусной ткани. Большее количество каллуса первого типа образовалось на незрелых зародышах сорта Таежная (Табл. 2). При помещении каллусной ткани на среду регенерации, стеблевой.морфогенез удалось индуцировать у 28% эксплантов линии Фотос и у 62% сорта Таежная (Табл. 2).

Таблица 2. Характеристики первичного каллуса двух различных генотипов пшенииы. -

побеги из 1 морфогенные число регене-

. генотип незрелых ' каллусы рировавших

зародышей, X ! % эксплантов, %

Фотос 40,012,6 25,8+1,4 28,4+0,5

Таежная 23,2±3,4 44,7±3,2 62,2*6,4

Сопоставление полученных результатов о различном балансе фитогормонов в незрелых зародышах разных генотипов с особенностями первичного каллусогенеза , частотой образования мор-фогенной каллусной ткани и регенерационной способностью, позволяет сделать вывод о том, что одним из. факторов, влияющих на первичный каялусогенез и индукцию морфогенеза является баланс эндогенных фитогормонов экепланта. Баланс эндогенных фитогормонов в сочетании с данными условиями культивирования позволил наиболее полно реализоваться морфо-генному потенциалу сорта Таежная.

- 8 -

1.2. Ацетон как стимулятор образования первичного каллуса.

Как правило, при использовании в качестве эксплантов , незрелых зародышей, можно наблюдать развитие их собственных побегов . На контрольной среде возникающие побеги удаляли 23 раза, т. к. в их присутствии каллус расчет хуже. Как показали наши исследования, добавление ацетона в среду культивирования увеличило число эксплантов, не образующих побеги из тканей незрелых зародышей как у Таежной, так и у Фотоса (Табл. 3). Это явление можно использовать для стимуляций образования первичного каллуса в культуре in vitro.

Таблица 3. Влияние ацетона на каллусообразование, индукцию морфогенной ткани и регенерацию в культуре незрелых зародышей пшеницы.

I I контроль ! 1,5% ацетона I

t генотип!_;__;_; I

I ! 1 2 3112 31

I_' _;__1

Юотос 43,1±4,2 24,2±2,1 28,4±0,5 27,6+2,8 42,3±3,3 18,9±1,3! ¡Таежная 36,7+5,1 37,5+0,8 62,2t6,4 21,6+2,0 46,6±2,3 30,9±2,4',

J _:__:___!

i_____

1 - побеги из незрелых зародышей, %

2 - морфогенные каллусы, %

3 - число регенерировавших -эксплантов, %

По структуре первичный каллус, образующийся на среде с ацетоном, сходен с таковым на контрольной среде. И"в том и в другом вариантах можно брю выделить морфогенную и неморфо-генную ткань. Следует отметить, что в присутствии ацетона, повышалась частота образования морфогенных клеточных линий (Табл. 3). Для подтверждения действия ацетона на развитие побега, каллусы помещали на среду регенерции с ацетоном. Способность к стеблевому морфогенезу снизилась с 28% до 18% у Фотоса и с 62% до'30% у Таежной.. Механизм действия ацетона на культивируемые ткани пшеницы еще не ясен. Возможно, что как токсическое химическое соединение он„тормозит рост побегов, образующихся как из тканей зародыша, так и из морфоген-

• - 9 -

ного каллуса. '

I. 3. Баланс эндогенных гормонов в зависимости от экзогенного содержания 2,4-Д.

Сохранение морфогенного потенциала в культуре неорганизованно растущих каллусных тканей - важная составная часть клеточных технологий,, создаваемых для селекции. В принятых методиках получения регенерантов пшеницы существует два различных подхода. Первый - использование первичных каллусов и регенерантов из этих каллусов. Второй - получение регенерантов из дяительновыращиваемых культур. Продолжительное субкультивирование каллуса in vitro способствует повышению генетического разнообразия клеток, что позволяет проводить скрининг на устойчивость к различным стрессам.

Для получения и размножения культур тканей зерновых злаков наиболее широко используется 2,4-Д как физиологический аналог ауксина. Мы также использовали 2,4-Д в качестве до-', бавки к среде культивирования. С целью длительного сохранения морфогенной потенции каллуса применяли два приема:

- культивирование на среде с высоким содержанием 2,4-Д (2 мг/л);

- визуальная.селекция морфогенного каллуса при субкультивировании.

При прочих равных условиях культивирования генотип оказывал существенное влияние на сохранение способности к морфогенезу и регенерации. Ткань сорта Таежная к 7-8 пересадке становится неморфогенной, тогда как каллус линии Фотос не терял способности к морфогенезу в течении 20 субкультивирований. По балансу эндогенных фитогормонов-морфогенная кал-лусная ткань обоих генотипов имела много общего (Табл. 3).

В процессе культивирования каллуса на среде с 2 мг/л 2,4- ' Д и 10 АеМ05первоначальные различия в' содержании эндогенных фитогормонов,. существовавшие между эксплантами, сглаживаются.

Для получения регенерантов изменяют экзогенное содержание гормонов. В данной работе концентрацию 2,4-Д снижали до 0,2 мг/л. Измерение содержания'фитогормонов проводили в двух

Табл. 3. Содержание нативных фитогормонов в морфоген-ных каллусах различных генотипов пшеницы на среде с 2мг/л 2,4-Д.

генотип

содержание нативных фитогормонов, нг/г сухого веса

ИУК

3-Р .

ИПА

3-РШ1А

АБК

Фотос 211,8il,4 436,9*58,3 378,2*21,3 815,1±77,6 832,9tl,0 Таежная 205,5+2,9 636,1*65,6 258,6*10,6 894,7t76,2 1170*8,4

точках: на 5-й и 16-й день после начала субкультивирования. В первой точке не наблюдали видимых различий между контоль-нсй и опытной тканью. При дальнейшем культивировании на этой среде наблюдали развитие организованных структур из дедифференцированных клеток каллуса. Так, через 16 дней на каллусе появлялись первые корни. Этому процессу предшествует измене- ' ние эндогенного баланса фитогормонов, выраженное' в повышении содержания ИУК и общих цитокининов и снижении концентрации ингибитора роста АБК (Рис. 1,2,3). К концу первого субкультивирования подавляющая часть экеплантов была ризогенной. Зеленые морфогенные очаги развивались в побеги. К концу второго субкультиьирования на среде с пониженным содержанием 2, 4-Л у тканей линии Фотос и после трех пассажей у тканей сорта Таежная способность к росту и морфогензу падала и наблюдалась гибель клеток. Таким образом, изменение гормонального состава среды культивировали? приводит к сдвигу эндогенного гормонального баланса культивируемой ткани и гак следствие этого к развитию структур de. novo из морфогенных клеток .

Раздел II. Клеточная селекция растений на устойчивость к хлоридному засолению.

II. 1. Особенности исходных генотипов при культивировании на засолении in vivo и in vitro.

Клеточная селекция на устойчивость к засолению более эффективна в том случае,, если существует связь между солеус-тойчивостью на уровне клеток и на уровне целого растения.

к

Рисунок I.

Изменение содержания эндогенной ИУК в морфогеннол каллусной укани пшеницы в'зависимости от концентрации экзогенной 2,4-Д.

1600

дни

Рисунок 2.

sat шаг

Изменение содержания эндогенных цитокишшов в глори/огенной каллусной ткани пшеницы в зависимости от концентрации экзогенной 2.4Д. 20001—--:-:-

оз о

(D

«

о 1600

Рч

О

£ О

!н 1000

it 600

iD

ч

о о

I Фотос

II Таешая

te дни

1. 2 иг/л 2,4-Д

2. 0,2 мг/л 2,4-Д'

- К "

Толерантность к засолению у растений оценивали на гидропонных установках. Влияние NaCI на индукцию каллуса и на рост клеток в третьем субкультивировании изучали у исходных генотипов с целью выявления клеточного уровня устойчивости.

На гидропонных установках растения выращивали в течении 50-и дней, постепенно увеличивая уровень засоления (от 0.5Z NaCI до 1% NaCI). В'качестве контрольного параметра использовали накопление сырой массы растений на среде без соли. По данным рис. 4 видно, что длительное культивирование растений в условиях гидропоники , позволило выявить различия в соле-устойчивости исследуемых генотипов. Линия Фотос продемонс-- трировала большую толерантность к возрастающим концентрациям хлористого натрия по сравнению с Таежной.

Метод тестирования солеустойчивости при индукции каллуса был предложен Nam и Hezsky (Nam et al. , 1986) и использован для лабораторной оценки устойчивости пшеницы на кафедре био-. технологии. МОХА (Еаттатхоттам, 1991;,Диас, 1994). Присутствие соли задерживало образование каллуса на незрелых зародышах на 7-9 дней у обоих генотипов. Кроме того, угнетался рост ткани и образование морфогенных каллусов. Прирост био-.ыассы первичного каллуса у Фотоса превышал этот показатель у Таежной (Рис. 5).

В третьем субкультивировании каллусные ткани помещали на среды, содержащие различные концентрации NaCI (Рис. 6). Выявили генотипические различия в ответе на засоление. Низкие концентрации соли стимулировали рост каллусной ткани у линии Фотос, тогда как у сорта Таежная этого эффекта не наблюдали. Необходимо отметить, что солевой стресс в большей степени угнетает процесс дедифференциации по сравнению с ростом сформированных каллусных тканей. Угнетение роста каллуса на ■50Z наблюдали при 1,5% NaCI у Фотоса и при 0,7% NaCI у Таежной. Можно сделать вывод, что и на уровне сформировавшейся каллусной ткани клетки линии Фотос также оказались более устойчивыми к засолению.

Таким образом, как на уровне клеток, так и на уровне целых растений проявляются генотипические различия по степени солеустойчивости. Можно ожидать, что селекция на клеточном

Рисунок 3_.

Изменение содержания эндогенной ДБК в мор(уогенной каллусной ' ткани пшеницы в зависимости от концентратах экзогенной 2,4-Д.

_ 1400

о

а> -

П 1200 о

о 1000

Й о

„ 800

600 400 200 О

16

ВВ1

днк

1. 2 иг/л 2,4-Д

2. 0,2 иг/л 2,4-Д

I >¿0100 ;

II Таежная

Рисунок 4.

•Влияние засоления питательного раствора на накопление сырой массы растений у исходных генотипов пшеницы.

100

о р<

и 80

о

К

н о

ео

2 40

о

§

д 20

0,5

20

' 0,7

38

I соль %

50

дни

I. Фотос

2. Таежная

- ь

Рисунок 5.

Влияние хлорида натрия на индукцию каллуса у исходных генотипов.

0.6 №01, %

-1 -+-:

Рисунок С.

•Влияние хлорида натрия на рост культивируемых клеток яровой пшеницы.

I. уотос . 2. Таежная

уровне представляет реальную перспективу получения резистентных к NaCI линий и растений-регенерантов из них.

II. 2. Устойчивые клеточные линии.

• С целью отбора истинно резистентных клеток использовали принципы длительного культивирования в присутствии стрессового фактора и возврата в неселективные условия. В процессе отбора применяли как жесткую селекцию (Таб.4, схема 1), так и ступенчатую (Таб.4, схемы 2 и 3).

Таблица 5. Отбор солеустойчиьых клеточных линий у двух генотипов пшеницы. .

субкультивирования 01 2 '3 4 5 6 7 в 9 10 0 00.1 1 1 1 1 00 1 0 0 0 0,5 0,5 0,5 1 10 0 1

схемы селекции

1 2 3

NaCI, % NaCI, %

11 1 1

NaCI, % 0,3 0,3 0,3 1 1 О О 0,5

схема i число стабильные солеуст. линии 1

! генотип .сел-^ ! зкспл. ! число 7, ! 1

1 Фотос 1 : 57 . 3 5,3 !

■2 137 26 18,9 1

3 210 21 10 i

! Таежная 1 77

2 76 4 5 !

3 216 ' 5 2,3 ! ( t

Эффективность отбора зависела от генотипа. Наибольшее количество устойчивых линий получено у Фотоеа на всех трех схемах селекции. Ткани сорта Таежная погибали в жестких селективных условиях и отобрать устойчивые клеточные линии по схеме 1' не удалось. При отборе с адаптивных концентраций, у Таежной были получены клеточные линии, резистентные к соли. Необходимо отметить, что к 7-8 субкультивированию ткани этого генотипа теряли способность к регенерации, поэтому селекцию пришлось вести на ранних еубкультивнрованиях и по схеме

- Iß -

3 (отбор устойчивых клеток на стадии индукции каллуса).

При выборе схемы селекции приходилось учитывать не только солеустойчивость генотипа, но и его способность к сохранению морфогенного потенциала при длительном субкультиьировании.

II.3. Растения - регенеранты.

Регенерация растений проса (Pius et al., 1993) и пшеницы (Еаттатхоттам, 1991) в присутствии стрессового фактора повышала эффективность отбора. В данной работе растения из толерантных линий получали как на бессолевой среде, так и в при-сутсвии 0,5% и 0,7% NaCI (Табл. 5). При' получении регенерантов приходилось учитывать генотипические особенности тканей Фотоса и Таежной, которые проявлялись при культивировании in vitro.

Таблица 5. Влияние NaCI на регенерацию растений различных генотипов пшеницы.

О NaCI 0,52 NaCI . 0,7Z NaCI !

! ,1 ЧИСЛО ЧИСЛО ! X число ¡ЧИСЛО 1 X ЧИСЛО 1 число 2 1

i ' 1 экспл.! рег-ов! экспл. 1 рег-ов! экспл. 1 рег-ов 1 1

1SOTOC 7 17 28 .165 23 14 60,9 14 4 28,61

1«стой 17 49 Э 6,2 23 5 21,7 19 4 21,1)

¡Таежная 1 18 15 83,3 5 2 . 40 6 2 33,3!

! Таежная 3 4 3 75 3 1 33,3 5 1 20 i

¡Фотос 8 ' 10 20 200 20 7 35 19 ; - - 1

(Фэтос 9 28 16 88,9 48 6 1.3 48 - - 1

I

В отсутствии стрессового фактора получено наибольшее количество регенерантов. Добавление ИаС! в среду снижало интенсивность регенерации по сравнению с контролем. У подавляющего большинства линий выход растений - регенерантов снижался, и при увеличении концентрации соли с 0,5% до 0,7%.

У регенерантов ¡^встречались аномалии в строении колоса, больщинсво из них были низкорослы ит стерильны. С увеличени-

- г? -

ем продолжительности культивирования каллуса, увеличивалась доля стерильных растений. Так, у линий Фотоса после 14 суб-•культивирования не удалось получить фертильных растений, несмотря на сохранение способности к регенерации.

. 11.4. Тестирование растений - регенерантов на устойчивость к засолению.

Получение солеустойчивых форм растений невозможно без применения в ходе работы методов и приемов диагностики уровня устойчивости растений.

Растения - регенеранты (поколение Rz) тестировали на гидропонных установках.. Одним из достоинств этой системы является возможность четкого контроля за уровнем засоления питательного рвствора. Содержание NaCI в среде за 50 дней культивирования постепенно увеличивали с 0,5% до 1%. Об уровне устойчивости судили по длине и накоплению сирой массы растений по отношению к контролю. Контрольные растения исходных генотипов выращивали в тех же условиях, что и линии. Тестированные линии в той или иной степени превосходили родительские сорта (Рис. 7,8). Можно выделить две полученные формы: линии Таежная 7 и Jotoc 17. .В литературе также встречаются сообщения о применении гидропонных установок для тестирования растений - регенерантов проса (Plus et al. , 1993) и риса (Nabors , 1985). Можно сделать вывод, что признак устойчивости к NaCI, отобранный на уровне клеток, сохраняется в течении двух поколений у растений- регенерантов.

Ранее было показано, что у исследуемых генотипов существует корреляция между уровнем солеустойчивости клеток и растений. Поэтому, мы посчитали правомерным использовать в качестве теста на солеустойчивость метод индукции каллуса в стрессовых условиях. Донорные растения выращивали в поле. Использовали незрелые зародыши линий Таежная 1, Таежная 3, Таежная 7, Фотос 17 и Фотос 26. Все изученные линии в той или иной степени превышали контроль по относительному приросту биомассы. * По этому признаку их можно расположить в следующий убывающий ряд:- Таежная 1, Таежная 3, Фотос 26, £о-

- 1ц-

Рксунок 7.

Влияние засоления питательного раствора на высоту .растений солеусюЛчивых линий (поколение

О120 Р.

н

¡,00 н

о 80 ЪЧ. . 60 О

р<40

(в н

о 20 о

с

В5

№

в .генотип

Рисунок Ь.

Влияние засоления питательного раствора на накопление сырой биомассы растений у солеустойчивых линий (поколение

200

о Рч

§160 к

н о

^100

да о о да

60

«

я 5

о

8 генотип

1. Таежная, контроль

2. Таенная I

3. Таенная 3

4. Таехшая б

0. Т&ежная 7 6..¿отос, контроль 7. ¿'отос 26 Ь. аотос 17 ■ -

7

3

4

б

6

- 19 - •

тос 17, Таежная 7 (Табл. 6). ЫаС1 оказывал влияние не только на процессы каллусообразования и накопления биомассы, но к •на процесс закладки морфогенных зон в ткани; Количество мор-фогенных каллусных линий у устойчивых генотипов превосходит количество морфогенной ткани у Таежной и Фотоса.

Полученные данные свидетельствуют в .пользу того, что признак устойчивости к соли передается в ряду клетка -растение-регенерант - клеткз.

Таблица 6. Тестирование регенерантов методом индукции каллуса в стрессовых условиях (0,5% МаС1). Семенное поколение Й!,

1 1 генотип ! ■ 1 1 относит, прирост биомассы каллуса- морфогенные каллусы, %

мг % к контролю

Таежная

контроль 61,9±9,9 100 17,2

Таежная 1 94,2+14,2 152 30,5

Таежная 3 70,6*1,1 114 21,2

Таежная 7 64,6±3,8 104,3 • 33,3

Фотос !

контроль •81.8+3,1 100 . 10,3

Фотос 17 85,9316,4 105 31,7

Фотос 26 98,13+3,1 107,9

Окончательное суждение об уровне-устойчивости полученных форм можно будет вынести после полевых испытаний.

ВЫВОДЫ.

1. Первичный каллусогенез и индукция морфогенеза сущест^ венно зависят от' баланса нативных фитогбрмонов экспланта (незрелого зародыша).

2. Применение ацетона в качестве добавки к среде культивирования угнетает рост побегов'зародышей и стимулирует каллусогенез с увеличением доли морфогенных клеток.

" '¿О

3., Исследуемые генотипы различны по продолжительности сохранения морфогенного потенциала. На среде с 2 мг/л 2,4-Д сорт Таежная теряет способность к морфогенезу к 7-8 субкультивированию, линия Фэтос сохраняет способность к регенерации до 20 пересадки.

4. Снижение на порядок (до 0,2 мг/л) концентрации 2,4-Д в среде приводит к увеличению содержания нативных ИУК и цито-кининов и снижению концентрации АБК. Такое изменение гормонального баланса индуцирует развитие структур Из проэмбрио-генных клеток.

5. Б результате проведенной клеточной селекции на толерантность к хлоридному засолению у двух генотипов яровой

. мягкой пшеницы получены устойчивые клеточные линии и растения - регенеранты из них.

6. Клетки, отобранные по признаку толерантности к засоле-' нию, сохраняли это свойство в течении двух поколений у

. .растений - регенерантов . Устойчивость к соли передается в ряду клетка - растение-регенерант - клетка.

7. Полученные солеустойчивые формы могут служить материалом для дальнейшей селекции и будут переданы в ВНИИЗиС для проведения полевых испытаний и оценки их хозяйственно - ценных качеств.

Работы, опубликованные по материалам диссертации.

1. Копертех Л. Г. , Бутенко Р. Г. Каллусогенез и морфогенез у различных генотипов ТгШсит аезиуцт // Тезисы докладов

4

11Г Съезда Всероссийского общества физиологов растений. Санкт-Петербург. - 1993. - С. 133.

2. Копертех Л Г. , Бутенко Р. Г. , Никифорова И. Д. Влияние ацетона на каллусогенез и морфогенез в культуре клеток ТгШсшп аезиушп // Тезисы докладов II Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология". -Алмнаты. - 1993. - С. 59.

3. Копертех Л. Г. , Бутенко Р. Г. Ацетон как нетрадиционная добавка к среде культивирования // Докл. РАН. - 1995. 342, N 1.

УСоуи^