Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ЯРОВЫХ ТВЕРДЫХ И МЯГКИХ ПШЕНИЦ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ЗАСОЛЕНИЮ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ЯРОВЫХ ТВЕРДЫХ И МЯГКИХ ПШЕНИЦ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ЗАСОЛЕНИЮ"

А-30.949

. МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

- На^аравах рукописи ДИАС Фердинандез Тамара -)

КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ЯРОВЫХ *

ТВЕРДЫХ И МЯГКИХ ПШЕНИЦ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ЗАСОЛЕНИЮ

Специальность 03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1994

с ~ CaiCr-^/.f, rf

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА.

Научный руководитель — кандидат биологических наук И. Д. Никифорова.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук 3. Б. Шамина, кандидат биологических наук В. А. Аветисов.

Ведущее учреждение — Московский государственный университет (биологический факультет). п/\

Защита состоится 4 апреля 1994 г. в '' на заседании специализированного ученого совета Д 120 35 07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К А. Тимирязева.

Адрес: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, отдел защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной на\ч ной библиотеке ТСХА.

Автореферат разослан «.^LzL» марта 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

А. С. Лосева

Актуальность проблемы. Изменяющийся климат планеты, вызванный влиянием жизнедеятельности человека, ставит перед селекционерами задачи создания новых форм культурных растений, устойчивых к экстремальным факторам окружающей среды (засухе, засолению почв, низким температурам). Кроме того, возраставшие потребности в.пивдэ и потери земли из-за засоления вследствие орошения требуют создания высокопродуктивных и устойчивых форм культурных растений.

Одним из путей для решения подобных задач может, быть расширение арсенала методов повышения генетического разнообразия за счет применения культивируемых клеток растений. В настоящее время методами клеточной селекции уже созданы новые солеустойчивые формы люцерны, риса, томатов и других растений. Повышение устойчивости растений пшеницы к абиотическим стрессам позволит сократить потери урожая от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды.

. Методы культуры клеток для гексаплоидной пшеницы достаточно хорошо разработаны и уже применяются для создания исходных форм для селекции. Тетраплоидные пшеницы, до последнего времени были трудной культурой в биотехнологии. Исследователям удавалось получать каллуеную ткань, которая через два-три месяца культивирования теряла . способность к морфогенезу. ГЪэтому, создание системы для длительного культивирования клеток тетраплоидных пшениц и включения их в Оиотехнологический. процесс.ЯЬляется особенно актуальным. " Кроме того, это даст возможность изучать физиологические особенности клеточного ответа на различные стрессы и проводить эксперименты по клеточной селекции.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было создание новых форм твёрдой пшеницы и изучение особенностей ответа на солевой стресс на клеточном уровне у твёрдых и мягких пшениц. V 1

Для достижения поставленных целей бьшо необходимо: разработать систему, позволяющую культивировать клетки твёрдых сортов пшеницы длительное время без потери ими способности к морфогенезу; ,

- оценить РИ'ЯЯП (рияиппргцтрпипго состояния' исходного растения в поцесс форм фован^-"ка2^«ЙА%кани;

НАУ.Ч .Шеи: ^

И ; иие к

- г -

- провести сравнительное изучение влияния солевого и осмотического стресса на формирование каллусной ткани и рост уже сформированного каллуса у твердых и мягких сортов пшеницы;

- отселектировать устойчивые к засолению клеточные линии и получить из них растения р*>генеранты;

- провести лабораторную оценку растений-регенерантов.

Научная новизна. Впервьз разработана система позволяющая длительное время (более полутора лет) культивировать каллусные ткани твердых сортов пшеницы способные к регенерации целого растения. Показано, что в ответе на солевой стресс на клеточном уровне не существует принципиальных различий между двумя видами пшеницы (Triticum aestlvum и Trtticum durum). Впервые показано, что среди сортов твердой пшеницы встречаются сорта, которые по устойчивости к засолению на клегочном уровне превосходят сорта мягкой пшеницы. Впервые, проведена клеточная селекция на устойчивость к засолении на сортах тетраплоидной пшеницы и получены растения -регснеранта Методом регистрации кинетики замедленной флуоресценции среди растений-регенерантов выявлены формы превосходящие по устойчивости исходный сорт.

Практическая значимость. Созданные в результате работы новые формы твердой и мягкой пшеницы могут служить основой для создания новых сортов, обладающих устойчивостью к засолению и осмотическому стрессу, что позволит сократить потери урожая от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды. |

Апробация работы. Результаты исследования представлены на П Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" в 1993 году, на конференции молодых ученых Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева 1993 года, на заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА.

Публикации. Ш материалам диссертации опубликована одна работа.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методической части,

- з -

результатов и обсуждения. Материалы диссертации изложены на £> страницах текста, содержат /5" таблиц, А? рисунков и 10 фотографий. Библиография содержит 220 источников отечественной и зарубежной литературы.

,1 . ■ ■' ~ ■ ' ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .

В качестве объектов исследования были использованы , сорта яровой гексаплоидной пшеницы (Тписшп аезиуит) селекции Севере-Казахстанского селекционного центра (Каз. НИ-ИЗХ) Ишимская 90_, и сорта тетраплоидной;пшеницы - Безен-чукская 139 и ДамсинскаяЭО.

Каллусную ткань получали из незрелых зародышей (14-16 дней после цветения) на модифицированной среде Мураси-ге-Скуга (МЗ) с добавлением г иг/л 2.4Д. Следует отметить, что для индукции каллуса использовали зародыши.из. зерновок расположенных только в средней части колоса. Культивирование проводили при температуре 27"с и постоянном освещении. Пересадки на свежую питательную среду осуществляли каждые,4 недели. Интенсивность роста каллуса обозначали как относительный рост и определяли, как отношение прироста каллуса к весу экспланта. Вес; экспланта обычно составлял 20-30мг. Прирост биомассы в стрессовых условиях выражали как X к контролю, т.е. к росту каллуса данной линии на неселективной среде. •

Мэрфогенный потенциал ткани оценивали визуально по шестибальной системе, по которой морфогенным считался каллус, состоящий более чем на 30* из плотных структурированных тканей. ; •

Клеточную селекцию проводили по различным схемам. Рас-тения-регенеранты из отселектированных клеточных линий получали как в селективных условиях, так и на обычных средах.", , ■ .V: , Л

Тестирование на солеустойчивость растений-регенерантов проводили с помощью регистрации замедленной флуоресценции' (ЗФ), которую проводили на первом листе 10-дневных пророст-' ков. Солевому, стрессу подвергали как целые проростки ( про-

ращивание в 171 мМ растворе NaCl), так и срезанные листья, которые за 24 часа до регистрации ЗФ инкубировали в растворе NaCl. Контролем служили проростки или листья инкубированные в воде. Регистрацию ЗФ проводили на кафедре биофизики МГУ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Генотипические особенности формирования каллусной ткани у твердых и мягких пшениц.

Солеустойчивость у гексаплоидной пшеницы Triticum asstivum (геном АА HB DD) контролируется множеством генов, проявляющихся, как на клеточном уровне, так и на уровне целого растения. В работах Gorham с соавторами показано, что 8а контроль целого организма над транспортом ионов натрия в надземную часть побега у гексаплоидных пшениц отвечают гены расположенные в длинном плече хромосомы 4D. Тетраплоидные пшеницы (Triticum durum L.), обладающие геномом ААБВ, лишены организменного механизма противостояния солевому стрессу вследствие отсутствия D генома. В этом случае на передний план выходят клеточные механизмы устойчивости. Поэтому изучение ответа на солевой стресс на клеточном уровне твердых и мягких пшениц и попытка селекции клеток твердых пшениц устойчивых к засолению приобретает не только теоретическое но практическое значение.

Как уже отмечалось, работа по культуре клеток твердых пшениц сопряжена с определенными тудностями. Многие исследователи отмечают, что не удается культивировать каллусную ткань, полученную из незрелых аародышей до'таточно долго без иотери ею способности к морфогенезу,Поэтому, в своей рабрте мы особое внимание уделили первым этапам образования и культивирования каллуса и проанализировали влияние генетических и физиологических факторов на процесс формирования каллусной ткани.

Под влиянием 2,4-Д ткани незрелого зародыша начинают неорганизованно делиться, образуя каллусную ткань. Чаще

. • ' • 4 - 5 -

всего каллусная ткань бывает неоднородной и состоит из рых-. лых, водянистых участков и более плотных, структурированных тканей с выраженными меристематическими очагами. При сравнении морфологии каллуса твёрдой и мягкой пшеницы мы обнаружили, что-морфогенные каллусные ткани твёрдых сортов пшеницы более плотные имеют более насыщенный желтый цвет. Результаты оценки морфогеиного потенциала в конце нулевого пассажа представлены в'таблице 1. \ '

Табл. 1. Оценка морфогенного потенциала каллусных тканей твердой и мягкой пшеницы.

сорт условия число индук. всего морфог. X образ.

. опыта экс пл. X" каллусов. МК

Лам. 92 тепл. 130 100 / 78 60±4,3

Без. ; и 601 100 356 59+2,0

Ишим. »» 515 100 278 54+2,2

Дам. 92 пол. 157 100. 62 . 40±3,9

Без. •• " 116 100 > 54 47±4,6

Ишим. « 148 . 100 . 54 37+4,0

Дам. ' ) 93 пол. 124 100 69 56±4,5

Без; ■ и • 127 100 . 72 57±4,4

Ишим. , 134 93 32 24+3,7

¿.стандартная ошибка

В таблице' 1 представлены два варианта выращивания до-норных растений (в теплице и в поле). Следует отметить, что два варианта полевых экспериментов сильно отличались между собой по климатическим условиям - лето 1992 года было жаркое и острозасушливое, -а лето 1993 года было холодное и дождливое. . . ' ( . '• «•

Как видно из представленных данных,индукция каллуса на среде 1*2 > с добавлением 2 мг/л 2,4-Л практически для всех' сортов и во все испытанные годы проходила со стопроцентным

успехом. Однако, на образование морфогенного каллуса существенное влияние оказывая генотип исходного растения. Сорта тетраплоидной пшеницы (Безенчукская 139 и Дамсинская 90) при всех вариантах выращивания донорных растений по способности образовывать морфогенный каллус превосходили сорт гексаплоидной тле ниш (Ишимская 90). Эффективность образования морфогенного каллуса у сортов твердых пшениц примерно одинакова (56-60%) как для тепличных растений, так и для полевых 1993 года и снижалась до 40-47Х, когда донорные растения испытывали засуху в 1992 году. Для сорта мягкой пшеницы Ишимская 90 наиболее удачным источником незрелых зародышей служили растения выращенные в теплице.

Как мы уже отмечали выше, при индукции каллуса наблюдаются различия между зародышами по способности формировать тот или иной тип каллуса. При оценке итенсивности каллусо-генеза было установлено, что в популяции зародышей встречаются экземпляры, способные к высокой пролиферации каллусной ткани (до 240 мг.) з то время как другие-практически не образуют каллуса. ■ Анализ частоты распределения зародышей по интенсивности каллусогенеза (см. диссертацию) показал, что мг тду видами существуй: различия в зоне максимального прироста. Так для твердых пшениц максимальный прирост каллуса доаигал 200 мг., тогда как для мягкой пшеницы 250 мг. В зависимости от условий быоаииваяия донорных растений модальный класс мог сдвигаться или в сторону увеличения пролиферации (сорта Дамсинская 90 и Безенчукская 139 в полевых условиях), или в сторону понижения пролиферации (сорт Ишимская 90 в полевых условиях)

Для того, чтобы ответить на вопрос, в какой мере такая гетерогенность ответа зародыпей на условия индукции каллуса внутри сорта обусловлена физиологической или генетической неоднородностью исходного материала, мы сравнили способность к каллусогеневу у зародышей внутри семей и между различными семьями. Для этого оценивали интенсивность каллусогенеза и морфогенный потенциал по индивидуальным колосьям. Результаты этого эксперимента представлены на рисунке 1.

Из представленных данных'видно, что у твердых сортов

ЙО

юо

«б

I-

:1й

« ■

§40 о

■й!-

20

12345(78 Б - 138

100

ео

40,

20

а: > а>

в

¡В

я ф

и

£

/Рис. 1.2,

9 10 1234567 "123 4567-89 Ш - 90 Д - АО

□ Инт. роста I МП 1. . Сравнение индукции каллуса и морфоге иного потенциала

у зародышей по семьям. .

«.10 - N0. колоса.

пшеницы наблюдается существенные различия между колосьями по индукции каллуса из незрелых зародышей. Так у сортов Ве-зенчукская 139 и Дамсинская 90 выявлялись семьи, которые по способности к каллусогенезу различались в 3-5 раз. Интересно, что у сорта Ишимская 90 наблюдалась достаточно однородная реакция среди семей на индукцию каллуса. Следовательно, большие различия между зародышами по способности к формированию каллуса (от 19 до 236 мг.) обусловлены скорее всего физиологической неоднородностью эерновок в одном колосе, чем генетической неоднородностью сорта. В случае твердых пшениц можно предположить наличие генетической неоднородности сортов по этому признаку. Оценка морфогенного потенциала в этом эксперименте показала, что интенсивность роста каллусов при индукции не всегда корелирует с его морфоген-ной способностью.

На основании полученных данных можно заключить, что на процесс формирования морфогенного каллуса существенное влияние оказывают генотип исходного растения и его физиологическое состояние, что хорошо согласуется с имеющимися в ли- ' тературе данными. Правда существуют данные о преимуществах использования в биотехнологии именно полевых растений (Приходы» 1987), что не реализуется в варианте с сортом Ишимская 90. Но, на наш взгляд, это скореё всего исключение, обусловленное крайне неблагоприятными климатическими условиями для этого сорта.

Влияние засоления на индукцию каллуса у твердой и мягкой пшеницы.

Известно, что действие солевого стресса на растительные клетки складывается из двух компонентов - осмотического и токсического. Для решения поставленных перед нами задач было необходимо оценить влияние солевого и осмотического стресса на процесс формирования каллусных тканей у трёх сортов пшеницы. В работе, выпоненной ранее на кафедре биотехнологии ТСХА (Еаттатхоттаы 1991) было показано, что процесс дедифференциации более чувствителен к солевому стрес-

су, чем рост уже сформированных каллусных тканей, и было показано, что концентрация 0,ЗХ ИаС1 является в этом случае сублетальной. Пээтому мы использовали для индукции каллуса из незрелых зародышей эту концентрации соли и соответствующую ей по осмотическому потенциалу концентрацию неионного осмотика маннита-О,1 11 Результаты этих экспериментов приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Индукция каллуса в стрессовых условиях.

условия опыта __ г контроль ЫаС1 . маннит

сорт . прирост (мг) * прирост (мг) * к кон. прирост (мг) X к ков.

Даме. Без. Ишим. " тепл. 53+3,07 77+2,49 75+3,04 100 100 100 37+1,60 38±1,Б0 49+2,13 ' 83±2,87 75±2,70 75±3,50 70 49 65 -

Даме.. Вез. Ишим. поле 1993; 91±2,79 82+3,62 58±3,23 100 100 100 91 92 129 68±2,58 63+3,64 66+4.56 75 77 114

' ± стандартная ошибка ,

.-.■•'■ Из' представленных данных видно, что добавление к среде 0,3* №01 существенно угнетало формирование каллускых тканей у всех сортов, когда источником зародышей служили растения, выращенные в теплице. В том случае, когда источником зародышей служили . растения,- выращенные в поле, у сортов тетраплоидной пшеницы,наблюдалось незначительное ингибиро-ваниэ индукции каллуса, менее 10 X по сравнению с контролем, а у мягкой пшеницы данная концентрация соли стимулировала прирост каллусной,ткани. Стимуляция роста каллусной ткани низкими концентрациями солей отмечалась ранее ь литературе на каллусных тканях различных растений. Объясняют это явление облегчением"поступления питательных веществ в клетки при повышении ионной силы среды. В.наием случае мож-

но сказать, что в некоторых случаях стимуляция возможна и при формировании каллусной ткани.

Изоосмотическая концентрация неионного осмотика манни-та в этих условиях значительно сильнее ингибировала процесс дедифференциации у пшеницы твердых сортов, чем хлорид натрия.- А для сорта Ишимская 90 увеличение осмотического потенциала в среде также привело к стимуляции каллусогенеаа, хотя и не такой значительной, как соль. Как было показано ранее на различных видах растений (Еаттатхотам 1991, Дридэе 1989), осмотический стресс в меньшей степени угнетает рост пассируемого каллуса, чем солевой стресс в изоосмотической концентрации. Забегая вперед, можем сказать, что рост пас- ч сируемого каллуса использованных в нашей работе сортов пшеницы также в меньшей степени ингибировался 0,3 М манатом, чем изоосмотической концентрацией NaCl (171mM), что вполне логично, так как к осмотическому стрессу добавляется еше и токсическое действие ионов натрия. Результаты, полученные при индукции каллуса не вписываются в эту логику. Можно только предположить, что физиологическое состояние донорно-го растения влияет не только на процесс формирования каллуса из незрелых зародышей, но и на ответ на солевой и осмотический стресс.

Можно предположить, что изменение балланса эндогенных гормонов у зародышей сформированных в различных климатических условиях позволяет им с различной интенсивностью образовывать каллусную ткань а также по-разному противостоять солевому стрессу. Конечно нельзя сказать, что климатические условия лета 1993 года были оптимальны для сортов Еезен- , чукская 139, Дамсинская 90 и Ишимская 90. ~~Эти сорта предназначены для регионов с более сухим и жарким климатом.

Таким образом, оценивая результаты полученные на тепличных и полевых растениях, можно заключить, что в отношении к солевому стрессу на клеточном уровне сорт Ишимская 90 (Triticum aestivum) показал большую толерантность, чем сорта твердой пшеницы (Triticum durum). Кроме того, физиологическое состояние донорного растения в значительной мере

влияет на процесс дедифференциации клеток незрелого зародыша в стрессовых условиях.

Влияние генотипа на морфогенный потенциал культивируемых тканей двух видов пшеницы.

Известно, что культивирование каллусных тканей пшеницы (особенно твердой) часто приводит к снижению ее морфогенного потенциала и большое влияние на этот процесс оказывает генотип. В нашей работе мы культивировали каллусные ткани пшеницы на той же среде, на которой проводили индукцию каллуса из зародышей, то есть на ср^де МС, содердгш^ п 2 мг/л 2,4-Д. Для гексаплоидной пшеницы, как это было покги шо ранее, такие условия культивирования являются оптимальными.

Культивирование в таких условиях каллусньх тканей твердой пшеницы сорта Дамсинская 90 покапиго, что наряду с пролиферацией каллуса происходит регенерации р юте кий. Причем с увеличением времени культивирования проливр шля каллуса снижается, а регенерация возрастает. Для другого сорта твердой пшеницы Безенчукская 139 таких явлений н-' нчблюдн-лось, но морфогенный потенциал по мере субкультивировчнил ткани значительно снижался. Увеличив концентру. »> 2,-1-Д в среде до 2,5 мг/л мы практически исключили прелдевр^меннуи регенерацию у сорта Дамсинская 90 , а у сорта Б^з^нчукская 139 удалось избежать снижения морфогенного потенциала. Это позволило нам поддерживать дедифференцироЕанное состояние в культуре клеток твердых сортов пшеницы.

На рисунке 2 представлены результаты оценки морЮг^н-иого потенциала тканей трёх сортов пшеницы при длительном культивировании в присутствии 2,5 мг/л 2,4-Д. Как мы отмечали выше, субкультивированию подвер1ались только морфоген-ные участки каллусной ткани. В процессе пролиферации в течение пассажа происходит размножение как морфогенных участков, так и неморфогенных. Оценка морфогенного потенциала в конце каждого пассажа дает нам возможность проследить динамику изменения этого фактора при культивировании.

Из представленных данных видно, что у всех сортов

твердой пшеницы морфогенный потенциал ткани колеблется от пассажа к пассажу, особенно первые мзсяцы культивирования. Однако, через пол-года культивирования удается существенно повысить морфогенный потенциал тетраплоидной пшеницы ( до 90S) относительно его начального состояния (50Х) и сохранять его на этом уровне длительное время (1,5 года). Морфогенный потенциал каллусной ткани мягкой пшеницы не подвержен столь сильным колебаниям. Мы видим, что длительное субкультивирование только морфогенных частей каллуса мягкой пшеницы позволяет значительно повысить морфогенный потенциал ткани с 28Х при индукции до 88Х уже во втором пассажа и сохранять его на этом уровне длительное время. Способность к морфогенезу определялась не только визуально по морфологии каллуса, но и получением растений-регенерактов в каждом пассаже.

Таким образом, можно заключить, что нам удалось создать систему, позволяющую длительное времл культивировать высокоморфогенные каллусные ткани твердых сортов пшеницы.

Влияние солевого стресса на пролиферацию каллуса твердой и мягкой пшеницы.

Изучение влияния слабого солевого стресса на процесс формирования каллусной ткани ив незрелых зародышей покрало, что на индукцию каллуса существенное влияние оказывает физиологическое состояние донорного растения. При оценке влияния засоления на рост каллусных тканей, которые культивировались в системе in vitro 4-5 месяцев, можно рассчитывать на то, что влияние физиологического состояния исходного растения Судет исключено.

Анализ влияния хлоридного засоления на рост каллусной ткани трех сортов пшеницы показал (Рис. За), что на низких концентрациях NaCl (85,5шМ) выявляются видовые различия в ответе на солевой стресс на клеточном уровне. Эта концентрация соли стримулировала рост клеток сорта Ишимская 90, но угнетала рост клеток твердых сортов пшеницы. По-видимому, стимуляция роста каллусных клеток низкими концентрациями

Относительный рост

( X к контролю ).

N301 является характерной чертой для сорта Кшимская 90, г к как индукция каллуса также стимулировалась дсС.иь->'н»'.'м со-и.

Повышение концентрации соли до 171 «пМ пригодляо к ревкому снижению интенсивности роста (на 40-50Х) ;'лк у сорта Дамсинская 90, так и у сорта Ишимская 90, и то.лко нч ЮХ снижался рост клеток сорта Безенчукская 139. Длльчей^« повышение концентрации НаС1 в среде приводило к сн.гиенпо интенсивности роста клеток всех сортов, причем рост клеток сортов Безенчукская 139 и Ийшмская 90 ингЮировался п^ истл-чески одинаково, но не так резко, как рост клоток сорта Дамсинская.

Как видно из рисунка 30 сульфатное злсол^ние в низких концентрациях (35 мМ) оказывало сткмулирухчге^ д^йстеи^ га рост культивируемых клеток, сорта Дамсинская РО. П(м пэв>.г»>-нии концентрации соли наблюдается более рез.сое угН'тени« роста каллусных тканей у всех сортов, чем при хлорлдьом Засолении. Так из-50 для хлоридного засоления у и^пьггчшшх сортов располагается в пределах 160-240 мМ ИиС1, а д/м сульфатного в5-130 мМ.

Дисперсионный анализ, полученных данных, проведенной по трем факторам: сорт, тип соли и концентрация соли, ¡.оказал, что обнаруженные нами различия между сорт хмк в отг т» на соловой стресс являются достоверными ! а 0.03Х уроин« значимости.

На основании полученных данных можно г.р.'Я'о.-эжить, »гго по-видимому не существует принципиальны* рлзличиЛ в 1,-хл-низмах ответа на солевой стресс на клеточ>оч уроьно м хчу твердыми и мягкими пшеницами. Клетки сортов БеЛенчук ч^ы 139 и Дамсинская 90 более устойчивы к х.*ор/днзму засолешш, чем клетки сортов Саратовская 29 и M0CK0bCf.ru Сб. Отсутствие у тетраллоидных пшениц генов, обсспечивак^'х орган, з-менный уровень устойчивости к засолению по-видимому нпалК не сказывается на клеточных механизмах ответа на сслеьоЛ стресс, что позволяет надеяться на то, что повышенная в результате клеточной селекции устойчивость к засолении в дальнейшем реализуется на уровне целого растения.

.Клеточная селекция на устойчивость к-засолению. '

/ - I - V , ' г

Войду того, что ми по обнаружили'принципиальных отличил в ответе на соловол.стресс на- клеточном- уровне между двумя видами пшеницы, '-клеточную селекцию.мы.', проводили по. традиционным схемам начинал с кулевого или более поэдних паесалой. Основным лринципом селекции было длительное куль-тиекроьышо.клеток в стрессовых условиях.' Для исключения вс.2но.глости отбора адаптированных линий». клетки способные расти в условиях засоления.возвращали в неселективные условия и затем продолжит селекцию. Регенерацию' растений из отоораннах клеточных линий старались вести-также в присутствии селектирующего фактора. В результате проведенной работы наш получены растения-регенеранты из всех, использован- " них в работе сортов 'пшеницы...' В . таблице 3 . представлены данные о числе полученных клеточных линий и растений-реге-нераитов. - ' .' , ' ■* . •• .

селектир. число • число

сорта фактор клеточных полученных

линии регенерантов

Дамсин. ЫаС1 , 1 • <Э

Ыа^ , ' 18 21 ■

Еезенчук. ЫаС1 1 '- . "б--. '

, - ■ 2 . 13

Ишимск. . ЫаС1 ' 5 19

Ыа^ЗО; " 8 15

.Из представленных данных видно, что наибольшее количество' клеточных линий и регенерантов получено после селек- , ции у сорта мягкой пшеницы Ишимекая 90 и меньше всего у сорта Безенчукская 139, что отражает по-видимому их отношение к засолению. Кроме того, видно, что.с большей эффектив- . ностью отбираются клетки.устойчива к сульфатному засолению: чем к хлоридному у сорта Дамсинская 90, что лишний раз подтверждает данные о большей устойчивости.; этого сорта, к

сульфатному засолению. Тл'ич о1"?"-'л, i i»< » ' 1 *. клеточные дин л.i уотойчлп. > к <•' л.'-i й : 1 м- i » -т регенеранты.

Анализ р iCTPh.m р ген ; иге

Проблема тестирования р юич/.'Я-р- t^c , i ¡< ° - : *-• с -тро стоит для биотехнолегов, как и : е- * > ¡ I1 ходимость массового и ршыего тееиччл им i.1-.'! нл ,n > териала, потребность в доказательств г w."ni,i г? nti отобранного на клеточном уровне в цсл^ч г i н л и и лениях - заставляет искать адекгтгш^ v.» го- . ( i

В последнее время резко уно^и'.,' « 1 i -л .. > i ^ ' -дований с использованием э:ш.:-д."-ннсл ¡ к >. -л i v. тирования физиологической р-лчкц/и ¡^тс ельт * л(, « . i рата на различные стрессы (хо?од, ^ i ^ р. . и

работах Monn^veux (19S0) провеДсчьныс ni i¡.,.<- i i --растных по чувствительности к засолен» и с., >х г ¡ .11 ницы было показано, что изменение п ib мл г i m г>. ¿>. > 1 л кривой замедленной флуоресценции ко;> -"-'¡^ топ л v тойчивостыо к засоленлю. Шэтсму однич и< м т v и г > вания растений-регенерантов на солеустоП ьч -;сгь кч ¡< л'> t -зовали метод регистрации замедленной ф.-.гО^л. т»лл.

На рисунке Ба представлены типичные кг «е i 4 а и цч ым ,1 флуоресценции листа пшеницы в норме и послу инг'/Cv c¡ -занных листьев в растворе NaCl (171т"). Ix^ елл-чни. ■ участки этой кривой, ей форма и основные пар иа^три си-:но варьируют в зависимости от состояния Фотосинтет/чьеко.о нл-парата. В стрессовых условиях изменяется высота плка ингунции свечения и меняется время затухания свечения, что говорит о нарушениях в электронтранспортной цепи.

На рисунке 56 представлены результаты обсчета клк^тл* замедленной флуоресценции по параметру ^/2 - пол/цп-рлне пика, то есть ширине пика на уровне соответствующем спаду свечения в » раза. Из представленных данных видно, что инкубация листьев исходных сортов в растворе хлорида натр.tí приводит к увеличению показателя V2. Причем у мягкой пле-

£3 - N аС I И+НаСС

Рис. 4а Кривые замедленной флуоресценции в норме (1) и в присутствии ЫаС1 (2). . ,, >'. - ;

Рис. 46., Анализ растений-регенерантов с помощью измерения

замедленной, флуоресценции. : Д. Б, И- - Сорта. . ''

1,2,..'.8- Но. Регенеранта. . „

ницы этот показатель больше, чем у сортов тв^рдэл п-рницы. Momio предположить» что фо™осигт1тическ/й аптчрт- сорта Ишимскзя 90 более подвержен сол-^гочу стрессу, чем у сортов Безенчукская 139 и Дамсинская 90.

Среди растений-регенерантов, обозначение на д шном рисунке номерами, мы видим различны^ варианты р^ исц.ь: фотосинтетического аппарата на солевой стресс, осоош.о интр-ресными представляются номера 3 и 6 у сорта Г«\!> hvjkck-uí 139, у которых полуширина пгкл в ар/с/тстгик со,-/ отличается от полуширины пика Флуоресценции в норм«?. Сч-нь интересные результаты пс - >ны при анализе рргенеряктоь copra Ишимская 90. Почти у всех рег^нерантов солевой стресс не вызывал значительных изменений пол/тглрины гь ría фл/о; eivn-ции, как это происходит у исходного сорта. мслно предположить, что растения-регенеранты обладая" солъ^-й устойчивостью к засолению. К сожалению, ввиду нехватки вр-м-ни н ы удалось проанализировать только часть лолу.^нных н шл г тений. Для детального анализа растений-ptгек^р^чтов л пол -вых испытаний будут проведены дополнительные исследования.

В Ы 3 О Д Ы

1. Формирование каллусной ткани иа незрелых парольной двух видов пшеницы в нормальных и. стрессов1« условиях существенным образом зависит от генотипа и физиологического состояния исходного растения.

2. Изменение содержания 2,4-Д в ср^де позволило создать систему * для длительного культивирования тканей тетраплоидной пшеницы без потери ими способности к морфогенезу.

3. При работе с сортовым материалом необходимо ичеть ввиду генетическую неоднородность некоторых сортов, для чего предпочтительнее вести работу на колосовом материале.

4. Изучение влияния хлоридного и сульфатного засоления на индукцию и пролиферацию каллуса выявило различия по чувствительности между сортами к разным типам солей.

5. В результате проведенной клеточной селекции на ус-

тоПчиьссть к засолению на сортах тетраплоидной и гексапло-идной пшеницы получении устойчивые клеточные линии и расте-ния-регенеранты. ' • ' '-

6. Тестирование на солеустойчивость первого ,семенного поколения растений-регенерантов . методом регистрации замедленной флуоресценции показало, что фотосинтетический аппарат некоторых растений-регенерантов по устойчивости к засолению превосходит исходный: сорт. ^ ;. . / .

■ Публикации.' \ •.

Диас Т. Никифорова И. Д. 1993 Особенности роста каллус-ных тканей твёрдых и мягких пшениц в условиях засоления. II российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений"v

Объем 1'/4 п л

Тираж 100

Заказ 347

Типография Московской с ч академии им К А Тимирязева 127530, Москва И 550 Тимирязевская ул, 44