Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СТАНОВЛЕНИЕ ФОТОТРОФНОСТИ В КАЛЛУСНОИ КУЛЬТУРЕ FICUS ELASTICA ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "СТАНОВЛЕНИЕ ФОТОТРОФНОСТИ В КАЛЛУСНОИ КУЛЬТУРЕ FICUS ELASTICA ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ"

<я-ъзсез

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В, ЛОМОНОСОВА Биологический факультет

На правах рукописи

КОЛЬЧУГИНА ИРИНА БОРИСОВНА

СТАНОВЛЕНИЕ ФОТОТРОФНОСТИ В КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЕ FICUS ELASTICA ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Специальность - 03.00.25 - гистология, щггология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2002 г.

Работа вьЕПолнена на кафедре клеточной физиологии и иммунологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В, Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, академик РАЕН МГУ им.М.В- Ломоносова М.В. Гусев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук ИФР РАН A.M. Носов

кандидат биологических наук МГУ им.М. В Ломоносова Т.К. Антал

Ведущая организация: МСХА им.К.А. Тимирязева

Защита диссертации состоится ¿(0 20оЛ\ в-Т^^час на заседании

Специализированного совета Д 501.001.52 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Московском гасу?-*-' гвекном университете им, М.В, Ломоносова по адресу; 119992, Москва, Ленинские гор-, МГУ. биологический факультет, дом. 1, корпус 12, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотг ье биологического факультета МГУ Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

ЕЛ. Калистратова

оглцля хлслктшчкпикл рлгюты

АКТУАЛЬНОСТЬ Ш'ОБЛПМЫ, Ичиесччкч, что cimrei многих мцтжхи.....ее к и х

оюдншшш in viiro (хгущестн.чяется снсци^пипроиаинымн cisctcMLism расччиельных клеток. Причем л обраюпашш sioijC/n.^iiiiiit нажпую p. un, играет формн pona míe дифференцированных структур клеток (Бутенки. 1975, 1W9; liuhm. 1981; Dakon, Ped. 1УЙЗ: Lmdscy. Yeoman, 1483].

В рДСТИГеЛЬНЫХ клетках H ИрОЦСССС ЛНСПОЦИИ сформировался сиГЛаепкаШПЧИ ркд ре|уЛЯП>рШ.1Х МСХаШШЮН, КаЖД1.||| ИЗ которые KOItYpu.'blpycT jKClípct'Cüki IеПеТИЧССКиЙ информации для раэ;ш'ш1.и сиецпалтироланпш к.itтк. Рсчу.чнторная сисчема иключает и сев* факторы нпешнеи среды, такие, как yc.iomix кульпшнрчыннн и ГрЗДИСЫТЫ расЧфеИСЛСКПН ГОрМОНОИ ИЛИ МШК.'раЛЫИ.И Utilice II!. II J'l'li фаКЧ'ирЫ 11.111 ЯН )T lia codiммно культуры и Muiyr ика^ап.си peli'ai-hiiumií i> иошикнолешш и pelуляшш снецпали -мции клеток. J Iii ihm, I 9H I ; Dalum, IV-ct, 1983: Кнг/, ( >г,чсча1. пса также

пренмущестиа ныГюра фактории к уд ми мироцу и и я iitpt:.>( cc.ickhiici! t.itnn с улучшение.» IJpt >ду K-J-ll ШI ОСП-Itl.

У ассимиляционных КЛСТОК CUeilUílHUlilllU, (tOttHMO CItllC'KHHiC'l » Пр<!ДуЩ|р!НЫ 11, характерные для шггакчиоп» растения иещестна, ныражаечея » формнронашш структур! ipimamibl* Орган ел л - хлоропластеHJ ]JIaniij:oita, Ko'jyCíoH, 19Ш); Brannten. Naît). 19K1; Dation, iJcc'l, 1983], в спноидсник г|к>г\х.'Ш1тегнческоп функции [Iifan;;с'un. Маю. 19.SI; Dalliin, Pee!. 19КЗ].

Пмекггея сведения о toi, что giiiichiii'ti или i peu j (каклшым является каучук) ос уще стиля ется i: процессе фотос i шч ети че с к о н децтельлое ш лиспа [Schiil/e-Siebert, Schultz, 19ÍÍ7; Heinlze cl al, 1990; Loreto, Sharkey, 1990; Sehnender cl al., 19%].

Поскольку имеется несколько pjtX.lT но НПСДСКИЮ H культуру Лà ТСКСОСОДСрЖ tllLÍHX и каучуконосны* растений и изучению физиологического состояния культивируемых in vino клеток ¡Буге и ко и др., 1983; Маркарова и др.. 1983; Гусев и др., 19К5; Tide mail. Hawker. 19К2; Hardy el a!,, 19H7; Suri, Ramav-at. 1995], яилиется актуадьиList неслодоиать у этой культуры диффоренци ройку клеток и станолление и ней фочосинтс-гн ческой функции. определяющей биосинтез нсишизонреиа, т.е. фотоаитшрчфностн, при изменении внешних факторов куш/цтпривапня. ß нашей райтд сЛьектим для л иго исследовании служила гетеротрофная кал л venan ткань пол и шои ре lux *">р ja уняп с го растении Ficus claslka,' W_í'¡ í k-i'Vii . t

? нлуч; " :/\OTÍV-A

i -,................ „ ••

1 t : < -\. ■ * ■ - К,. i' '

ЦЕЛЬ t! ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель раГюпа состояла о получении фототрофнон каллусной культуры F. clástica и изучении ее отдсга на изменения пнешних фактор'и культшшронання. С с л язи с упш предстояло рсиит> следующие задачи: ]. разработка методики полутени я фотосинтез ирующен культуры и подбор оптимальных услоиий культшшропания, индуцирующих днфферешшропку клеток, на осноиании изменения с не тон ых условии, угленодиого и Г0рмонал|,но[О составов среди;

2. сравнительный анализ морф^фпзиодогинеской и ростовой характеристики полученных иггаммов культур:,i:

3. исслсдопание фотосшгтсза и длительною послсснечення (ДИС) у штаммов;

4. определение содержании эндогенных цнтокпнлноя п тканях штаммом;

5. с рашш тельное изучение oeoíien посте ti удi .траструктурпот строении хлоропластом у штамм он:

6. мнкрк: коническое тучение накопления полшпиирена и ГКаняХ кулыурь) |\ clasica ;

7. анализ на ос ко пан и и полученных данных функциональной роли эндогенных щтжинино» а растительных клепках, а -также определение оптимальных ус л опий культнинронання с целью получения зеленых каллусных масс с хорошими ростонымн характеристиками и увеличения их фотл^синтсти ческой и биосшггстяческон активности.

НАУЧНАЯ НОШ 1 ЗИЛ сосгонт нтом. что

1. для ку.ты-ypf.i Г. elasiiea ainuioi ичных или подобных работ* нет,

2. разработана ме'тднка получении фоютрофной каллусной культуры:

3. получено 12 штаммоч культуры Г. clasliea, иыращенних na средах с 3, I и 0,25% сахароты и 0.40; <),25; 0,05 н 0 мг/л БАМ и комбинациях:

4. установлено нлнмние экзогенного б-г^нчиламиноп) рнпа (БАП) на синтез эндогенных питом шипов II культуре;

5. показана сня«> содержания эндогенных пнтокиннног! с ростом и старением культуры, с разлитое тью хлороплгего» и накоплением нластоглобул п них, с синтезом imnitHron, и фотосинтстической акптноегью. с фор м про изнием трахеидных струкчур в тканях:

6. оГ>№1р!'жсна ынисимость накопления no. m и зон ре на и клетках от физиологического состояния "иороиластон:

7. показана корреляты степени накопления политоп ре на с формированием трахен.чних структур.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Р А КОП Л -(аклочаетсм и том, что иол учи и иле результаты поаполямт оцс пинал. мклад каждого из научаемых нам» инешних факторои кульптнронання и форкшроиание снеииалюнрниаиних <Jn пхлштя ируи n них систем кле-м культуры F. ehstiea. К роме aixuo, данные im содержанию эндогенных шгюкниинон и клетках дают основание roiwpim. их участии н ре г/ля цн и спруктурной организации КЛСТОИ, 4111 дополняет ИреЦСПШЛСННЯ ort функциях J'JKX ГС'рМОНОК )» рк1СПГГеЛЫН.1Х клетках.,

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материал/.! димх-ргашш Гнали предстанлены на Международно й (ci>m|)ерсн1шн "Вноногня кулиптнруеммл клеток и fnioicxi/i 1Л01 ня "(! [oiioch-Г>нрск, ] VHH), на III са.ояе Исссоюанот мощек им фи 1110,101щ растений (1 '.шкт-lleicp-бург, 1У93), на IV Международной конференции н дне ну сено и ном научном клубе, IT+ME" 9К. "Ноные информационные технологии н медицине и аколоинГ (Украина. КрММ, Яд'са-Гурауф, l9WiJ, на Междуиа^ щиоц научно» Конференции 'Лнпнрофтас

мнкрооргз-низмы" (Мое к па, 2ШК)),

ПУБЛПКЛЦ1 [И. По материалам диссерп-щин олуолпкопано У ра "ют,

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация наложена па 102 страницах машинописного текста и состоит из поеден л и, oojopa лнтсраАры, методическою раздела, наложении и обсуждения реаульгатои, . заключения, ' выиодии, списка цитированной литератур).!, который включает 124 наименования н приложении. Экспериментальные данные предстаилсны ь виде 29 рисунков и ft таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ-ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования служила калл ус и а я ткань, полученная из листа интактного растении F. elasiiea Ro\b. (сем, Могасса), Каллус иыращнпалн и пробирках или колбах Эрдепминера на !!Ю мл на arapnaoi инной пнтатедкноп среде \{урасиге-Скур<4 |Murashi^c, Skoog, 1У62| и культнннронали л следующих услоиинх: и iepMitrale в

tcmhoic при температуре 26'С и и термоегле (ijmрмj "Karl Kolh") с круглосуточным otliemeitucM iwnni иг .! мм и нос net mil .1* ламп ннтенсшшостыо 40(H) л к при темпер;) type 26'С.

Прирост биомаССИ определяли цшешннанпем калл ус ной гении до кулн'таи-pouaii.in it I it cic окончания се ииращиланин и liojpacrc 25 суток И »ЫраЖаЛИ II К1Г.

Содержание суного вещества н каллусной ткани определяли несонмм >fen',t"M. ик. но'им ним следующие иоследоцутельшле операции: доиеденне массы Люкса до ностлнкш о личенпн путем сушки, отделите каллуса от шегаче'дыюп среды tt н [нешшинне fin и Гц,ikcc до и после сушки 1: сушильном шкафу мри 1Ш'С. Полученные

Данные ttl.ipTTaail II Ml il.l 1 Г Cl.lpoit futoMJC'CT.I.

Содержании ЦНТОКННННОВ и калл ус noil ткани определили хромат«'графически |liiolilm^Um, Thomas, 1973]. Для jtoio ннтокинины юндскалн hj K:i.t:ij(.'ii»i< iKititii. Экстракцию фракции гор мши ш нрншдилп 96%-м эта полом. После унарии.нтя иитоынншы 11ереiмдилп и ¡юдныи растнор. Далее модную фракцию очищал к и;« in у к капнем череч колонку с полимерным наполнителем Длуаке (мирки Dovvux 50 Ш х Я) при pi I о (1 'Злюшпо HimiKiiiniHOii с колонки Бели 2н N1140Н, Разделение щпикиишои ю 4 11,1,11,1 пропилили п с.чееп: и'кшришшш : аммиак I иода (10:1:1). Фракции -:1е,(Г1нк л [. »мнил, ¡еатинриоолнд и меа'Гин - по скорости нродннження характер)(конались cooiiiciviпешю величинами <Р, (>.0441.17). (Р, 0J-0.5) и (!', 0,7-0,«5) [Жоякснич.

J Це i\>u, ui I, ша. t ,¡. Дли оценки 111,^'p^t-.шин | I>{>Miiii! iji [il ljojii. Кijian,t le ст Aiil.ir:iiil]iu\

contain-. 1... продуцирую»»!» Леглшлшп u прмсутетнн» цнтокннино». Семена A.camhtus 11(тор,нц1ш.1Лп a термостате н ivmhoiv при 25"C it течение 72 час«». Об актинноста pa llll,l\ фраМЦШ 1Ц1ТОК1Н1ИНОН, ЭЛЮНрОНаШШХ и J соотие'гстнующих у чисткой xpoMn iot римм. судили no количеству образованного н проростках бстацнанииа. Содержание Смл-ацнанннон определяли на спектрофотометре СФ-16, намеряя оптическую плотность их растнороц при 542 н 620 им. Концентрацию бетацнапинон и вытяжке paeeiini i.iiu.iii по формуле |l)igui, 1УоН|.

Содержание ялороажлла н каротннондов it каллуаюй ткакн онрече.м.ш после JKerpai пронашы 85%-м ацепнюм |Г>асланская, Тру ос икона, 19М|. Оптическую плотность экстракта ичмерялн на с не ктроф| »том стре 'Hiiaehi*. KoiiHe-iiipaitiini хлорчфи.ша к каропшондои и пычл.кке риссчнтыиалк по формулам (t.iciliilllluLr el .ll,.

№2]. СоДСрЖЛШИ.' IllllMcHI-J It ПСС.ЧСН)ХМ(:Ч М,Г1ер||аЛе C учетом об 1л: M a III,1Г,IЖ Ml It neta np.ïT.1.1 расснт.шлли no формуле [rüitptiJitiiKo и др., !У75| it км раж а л и и мкг/с ci.i рои биомассы.

Интенснсность Фотосинтеза H дыхания характеризовали по скорости выделения или поглощения кислорода на cueiy или в темноте соогнетстленно, Изменение содержании кислорода регистрировали полярографическим методом [Гавриленко и др.. 1У75|, и использовали кислородный электрод фирмы "Orion" модели У7-0Я н сочетании с иономером ЕЛ 920 it самописцем L 6512. Расчет ип гспсниности флпоеч ш гети че с к ого выделения кислорода и темпоно го поглощения кислорода |.роишоднли е использованием типичной гралуироиочион крннои [I Кириленко и др-, 1У75|. Ип ichciiuhocti, поглощении и ныделешы кислорода выражали и м к mo.ii, О,/ i rciapuíi Гщпчиссы.

Измерении ДОС пр' июни л и на устапоны: с ф'^'Т" 'СКоиш.ш усфонетном, Которой фиксирует свечение, включающее мнллнеекундшай il jii en twin)) liiiiii компоненты | Ta русон, Весело пекши tlJ7íi). Максим.!.п.нач интенсивна гь побуждающего спета - ЗШХ) эрг/см. Регистрацию данных проводили па самописце КСП-4.

Ультра структуру нлиролл ОСТОВ к;| Л лумюн культуры шучхш е исно.'Ц/аонанием электронной микроскопии. Дли этого кусочки каллуса фиксировали 0.5 %-м глютаровым а,|п.дспиюм (фирма "Serva") на фосфатшм буфере pit 7.4 с r;iKi<arJO¿i и добаплсинем 1%-m CaCI, ¡Millón^. 1W>1|. Цофпксацто приводили 2%-ii чепарехокнсыо осмия на юы ж<1 буфере, Препараты oô<_ Кожина ли в спнргах к "ыл/ша-Ш и аралдит, Ульфадгжкие срсты получали нз уль'фа г>мс LK1Í-4КШ, кон фаетнрояи.ш на сеточках цшратом сытна (Reynolds, l')6í| ti нросмлтриил-ш и просвечивающем алектронном микроскопе JEM-!1Ш. Площадь клеточных ечрукпр определяли по формуле для эллипса [Псре.чьмац, 19fi3j и выражали с учетом увеличения микроскот и

KI1.MKM.

Определение полнизопрена H растительной ткани проводили но методу, целованному на снойсше пол и шоп fie на присоедини н» ó ром с обра ювдннем бромида. U jtom случае нолииаонрен н микроскопе ныпыдит и ыые окрашенных нключенин {Прокофьев, 1У-)К|. Кусочки кал л ус noil ткани фиксировали 70'íó-m лиловым спиртом. Ciuipv сливали, образцы обрабатывали жавелевой Hojiort дик птвлечеипм ич ник белковых, дубильных к краенпшх neme сто [Фурст. ] У79|, Иришки ж а неясной поды удалили добавлением 10%-й ajo гнои иди уксусноИ кислоты. Кислоту очмг.шалн

несколькими порциями поды. Водч слпнолк. oôpaj !,,).( й-лпилц глицерином, который

з.пем удаляли. Осадки ^рабатьшали раствором брома н глицерина в течении 18-2-1 часок. Г.шиорин уияячяк и образцу пропиты пал и смесью этнпошго спирта и хлороформа (l;t) li чеченце 24 часов для извлечения смол, ж и рои, терпенов н их бромидов. Бромид ноли» jo upe ua ц образцах иросматршшш и проходящем сиете в микроскопе Lctiz и фотографировали с помощью автоматической фотон ристав кн.

результаты экспериментальной работы и их обсуждение

ОТРАБОТКА МЕТОДИКИ И ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММОВ ФОТОТРОФНОЙ КЛЛЛУСИоГ! КУЛЬТУРЫ F. CLASTICA. Первая задача нашей раоогы состояла о получении n i гегерчтрчфноЛ каллусиой культуры F. clástica зеленеющих тканей. Для у ion> им отработали методику индукции и активации зеленення каллуса, и poipev~c upyK'iНего развитие фотосинтетического аппарата (ФСА) в клетках. Мстодака ttt.no'la. 1,1 следующие стадии: 1, индукция зеленения каллуса; 2. выращннанне Зелепеь'iiicti калл ус но» массы па сравнительно большой поверхности, дающее возможность проявить популяции культуры ткани гетерогенность — способность формировать участки, различающиеся по интенсивности зеленой окраски; 3, селекция наиболее зеленых учат кои, характеризующихся высокой степенью выделения Kiie:iop>!(a, и их дальнейшее культипнропанне. Среди факторов, индуцирующих формирование фчч11сл1п\;'л|рукнщ1х клеток культуры, исследовались действие снега, содержание сахарозы к БАП ti среде культивирования.

характеристика роста штаммов культуры F, ELASTICA. факторы,

определяющие рост 1ХвеТ Н углеводный состав среды. Гетеротрофная кул мура F. elástica на свезу носа-пен по начинала зеленеть. Известно, что свет не только индуцировал зеленение, но и влиял на характер роста культуры. Ранее дин каллусов каучуконосных растении Показано, что смет может активизировать процесс их роста [Гусев н др, 1985]; лаг-фаза роста культуры на снегу сокращается. В наших опытах для зеле не юн ¡его каллуса F. cLslica было показано, что свет стимулировал его рост в том случае, когда среда кулынвнроиашя содержала максимальное кол и честно сахарозы (3%) (рис.1. кривая 1), В данных условиях лаг-фаза длилась 2-3 су-сок.

Возраст культуры, : V,:!

Рис, 1, Рост каллусных кудьгур Г, е[а%Нса Пи свету на средах: с различным содержанием сахарозы:

1 - 3 % сахарозы, суоку.'н.тииирчнапие иа ту же срезу,

3-3 % сахарозы. су окультивировать на среду с 1 "'„ сахарила: 3 - 1 % сахарозы; суокудыштронанлс на 17 же среду.

С целью получения культуру, изилекающде из кнсишей среды углеводы и минимальном количестве, мы I) условиях освещении производили снижение содержании сахарозы в среде культивирования. Обнаружено, что снижение содержания углеводов от 3 до 1% приводило к замедлению р1хгга культуры (рнс.1, кривая 2). Однако это торможение роста проявлялось резко только в первые пассажи прн перенесении культуры со среды с 3% сахарозы на среду с меньшим содержанием углеводов. После много крап [ого с уокул ¡/нитрования к у л|.туры на среду с I % сахарозы и они >ра наиболее зеленых участков каллуса для посадки нам удалось получить культуру, скорость роста которой приближалась к таковой культуры, выращенной на среде с 3% сахарозы. Процесс роста культуры на среде с 1% сахарозы четко выражался н виде 5-образной кривой с участками, соозиетстнующнми лаг-фазе, логарифмической и стационарной фазам (рис.1, кривая 3).

Далее для каллусной культуры Р. с!ахнса М1,[ снижали содержание сахарозы и среде до 0,25%, и на зту же среду многократно субкульчипировали каллус. Прирост биомассы культуры за 25 суток на среде с 0,25'!(> сахарозы (прн 0,25 мс/л ВАП) но сравнению с приростом биомассы на средах, содержащих 3 и 1"!> сахарозы, снизился и

Н,5 и 8,6 рази соответсгве нно (тзбл, I). Эго сиижемис. возможно, связано с тем. что кульгура на среде с низким содержанием сахарозы не полностью удовлетворяла потреГитсть о пластических веществах для построения клеточной массы.

Таблица 1

Прирост биомассы зеленеющих каллус пых культур F. clastica, be,[ращенных на средах с различным содержанием сага розы за 25 суток

Содержанке сахарозы, % Прирост биомассы.

ml' cupoii биомассы %

3 lii73 + 49 100

1 1231 +99 75

0.25 145 ¿28 9

Попытка выращивать фикус в условиях освещения на среде бед сахарозы не уд.гдась. На втором пассаже культура темнела н прекращала рост. В данном случае сахароза, видимо, являлась фактором необходимым для роста культуры.

Таким образом, снег иызыиал позеленение каллуса Р. еЬ$11Са. Интенсивный рост кулыуры наблюдался и случае максимального содержания сахарозы (3%) в среде культ иннропанин. Возможно также сохранение хорошего роста культуры и при снижении содержании у гдеподои и среде, но в случае, когда при многократном с убкульгивироиании ныГшра.ыс!, дли посадки наиболее зеленые участки каллуса. Последовательное сцжулыиннрошнне на среду одного и того же углеводного состава улучшало рост культуры.

2, Содержании БЯП В Среде. Прирост биомассы зеленеющей культуры Р, сЬчиеа и^Толыпннстие случаен уиелнчииился с уменьшением содержания БАП в среде (рнс.2). Тенденция увеличения прироста биомассы культуры при уменьшении содержании БАП была сходна для нггаммов на средах с 3, 1 и 0,25% сахарозы. Однако прирост биомассы па среде с 3% сахарозы бььт выше но сравнению с средой с низким содержанием угле подо в (1 и 0,25%), Следует обратить внимание на то, чти культура хорошо рос.та на среде без БАП, тго свидетельствует о сс автотрофности в отношении цнгоиишион, Таким образом, снижение концентрации гормона ц среде сопровождалось увеличением прироста биомассы кулыуры.

БАП, ur/n

Ptic. 2. Прирост Сиомассы зеленеющих каллусных культур F. plástica 25 с у го к

МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ШТЛММ011 КЛЛЛУС1 ЮН КУЛЬТУРЫ F. ELASTICA И ФАКТОРЫ. ВЛИЯЮЩИЕ ПА ПЕСО. 1. Освещенность культуры н содержание сапарозы н БПП в

Среде Калл уем л темноте характеризовались рыхлой cipvKiypoit. имели срчтлп-кремовый цвет, не содержали хлорофилла. На сне чу кул (.17 pa формировала зеленую массу, тго €Ш1дспсл)>стг1уст о необходимости cuco для телеке)/н« к ал л veo«.

По мере роста каллусных культур на среда* с 0,50: 0,25: IU)5 и 0 Mi/л 1>ЛИ п комбинации с 3.1 н 25% сахарозы ito ttccx пассажах оченидиоП craiiomuiaci. их инчуаш.ная гетерогенность, свонсгееннан, как ираиино. растительным тканям in vitro. При пересадке каллуса мм отпирали однородные, зеленые участки, однако в процессе роста каллус ннопь становился гетерогенным. Гетерогснпостч, популяции клеток tío степени интенсивности окраски коизрастнее выражалась на среде с 1% сахарозы, тго свидетельствует об интенсивном синтезе пигментов. Снижение содержания БЛП п среде актпвнронажч ofipajoiiamic большего количества интсненпно окрашенных г* зеленый цист участков каллуса. Это более четко было и ид но у штамма, ниращешия о на среде (Чч БЛП.

2. Оводнениость каллу сны к тканей и содержание с у кого вещества в биомассе. При исследовании рос-га каллусных культур и цикле выращивания было выянлено, что их ткани во всех пассажах на соответствующих средах отличались но консистенции. Так, штамм, выращенный па среде с 0,50 мг/л БЛП, рыхлый к оподленный. Штаммы, выращенные на средах со сниженном содержанием БЛП, на вид имели более компактную консистенцию и были менее оподленными. Вместе с чем и большинстве случаен количество сухого вещества в тканях увеличивалось при снижении БЛП и среде. Следует отметить, что содержание сахарозы и среде мало влияло на накопление & клетках сухого вещества.

Итак, штаммы, выращенные на средах со сниженным содержанием БЛП и особенно без гормона, отличались интенсивной зеленой окраской и содержали большее количество сухою вещества.

ШШЯПШ: ГОРМОНАЛЬНОГО СОСТАВА СРЕДЫ ПА СОДЕРЖАНИЕ ЭНДОГЕННЫХ ЦНТОКИНИНОВ В ШТАММАХ КУЛЬТУРЫ F. ELASTICA. Хромапярафнровлню экстрактов на ряда выбранных нпаммов показало, что в их бнонробах содержались ештокишшы. Общая цктинноезъ цитокининоп ш гам мол на средах с 0,50; 0,05 и 0 мг/л БАП (при 1% сахарозы ) составляла 157, 162 и 244% соответственно. Отсюда следует, что культура на среде без гормона отличалась самой высокой iщтокнниHouort активностью. Можно предположить, что увеличение акптносзи цитокинннов связано с активацией синтеза цитокинннов, опосредованной изменением гормонального статуса среды.

Вь (деленные цнтокншшы бьшн представлены тремя основными формами; зсата нгл юкозвдом. зсатинрибоэндом и зеа-пшом (рис. 3). Фракция зеатннглюкозида, для которого, как известно, характерна форма запасания, проявляла достаточно высокую акзииность во всех трех изучаемых штаммах, что свидетельствует о ее стабильности. Активность зеагннрибозида у штамма на среде без БАП о 3,5 раза превышала гак о в ум у штамма на среде с 0,50 мг/л БАП. Коныогат зеатинрибозид, как известно, представляет собой транспортную форму и может переходить в активную форму, которой является зеатин. Содержание эеатина у штамма на среде без гормона почти в 2,2 раза было выше. чем у штамма на среде с 0,50 мг/л БАП. Можно предположить, что различие активности форм иитокининин, мнилось результатом их трансформации, которая происходила при изменении гормон ал ьно l o соста вз среды.

m ■■ ■ j'j. -.

ОЗезгвн

1W

71

3

Штаммы

Pire. 3. Активность форм цитокинииов из штаммов культуры F. clástica, % к контролю 1,2 и 3 - штаммы, выращенные на средах с 0,50; 0,05 пО мг/л БАГГ соответственно.

Итак, выращивание каллусньга тканей на среде с уменьшенным содержанием БАЛ сопровождалось формированием культуры, отличающейся высокой <^щей активностью цитскшппюв и высокой активностью свободного зеатина.

СОДЕРЖАНИЕ ПИГМЕНТОВ В ШТАММАХ КУЛЬТУРЫ F. ELASTICA И ЕГО ЗАВИСИМОСТЬ ОТ СОСТАВА СРЕДЬ!. Следующей нашей задачей при изучении днфференцнровки клеток явилось исследование количестве нею го и качественного составои пигментов у штаммов культуры. Из литературы известно, что на синтез пигментов может оказывачъ регуляторное воздействие углеводный статус среды кулътнппрования. Так. в условиях снижения от 3 до 1% сахарозы накопление хлорофилла в тканях увеличивалось более чем в 3 раза [ Гусев и др., 1985}.

В наших экспериментах с штаммами F, clástica показано, что при снижении R 4 раза концентрации сахарозы в среде (от 1 до 0.25%) наблюдалось накопление хлорофилла. Однако содержание пигментов я 1 г сырой биомассы п штамме.

нырагцешюм на среде С 0,25% сахарозы, было сутустненно ниже, чем в [»гамме, нi.ipaiнешюм на среде с t % сахарозы.

Приведенные на рис. 4 данные по изменению содержания хлорофилла и кароти-иоидон и штаммах при изменении конце н'фаиии БАП и среде показывают, что снижен не содержании БАП активировало накопление в каллусе хлорофилла и в меньшей степени накопление карочинондон.

Рис. 4. Содержание хлорофилла (а + Ь) н каротинондои и штаммах каллуснон культурр.! F. clasiica 20-25 суточного возраста. 1, 2, 3 н 4 - штаммы, выращенные на средах с 1 % сахарозы к 0,50:0,25; 0,05 н 0 мг/л БАП соотистстпснно; 5, б к 7 - пггаммы. выращенные на средах с 0,25 % сахарозы н 0,50; 0,05 и 0 мг/л БАП соответственно.

Таким образом, кал л усни и культура, выращенная на среде с низким содержанием сахарозы, обнаруживала способность накапливать хлорофилл и каротнноиды, Более интенсивного синтеза пигментов можно достичь к при снижении содержания БАП в среде.

ФОТОСИНТЕЗ И ДЫХАНИЕ ШТАММОВ КУЛЬТУРЫ F. ELASTICA ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ I. Влияние содержания сахарозы н БНП в среде. Как Г!ыло сказано ныше. ку.ндчра на СВе'гу На среде с максимальным содержанием сакарозм (3%) trpll

мг/л ЕАП, синтезировала хлорофшш. Исходи из итого. мы ожидали, что и данных условиях -jtj культура может проявдичъ фотосинтечическую активность. Однако определен и« фотосинтетнческого выделения кислорода показало, что фотосинтез у нее огсутсгаовал. Отсюда следует, что культура, си итерирующая хлорофилл, не всегда может фотосинтез продать.

Для культур, выращенных на свету на средах со сниженным в 3 (1%) или 12 раз (0,25%) содержанием сахарозы и с 0,50 мг/л ВАП^Чылн зарегистрированы фотосинтез и дыхание (табл. 2). Кроме того, ннтен сипи осп. фотосннтетнческош выделения кислорода и темнового поглощения кислорода с уменьшением содержания БАП в среде (от 0,50 до 0 мг/л) увеличивалась (табл.2). Таким образом, для штаммов на средах со сниженным содержанием сахарозы возможно повышение ф >т оси нгечи ческой функции при снижении содержания или исключении БАП из среды.

Таблица 2

Интенсивность <|ютоснитетнческоп> выделения кислорода и темпового поглощения кислорода у штаммов каллус нон культур).! F, ehslica (20-суточного возраста)

при различном составе среды культивирования

Состав среды въщелещю кислорода (Ф) Т<ье1Г<№>с «оптом КИСЛО[>>ДИ 00

СахариааД КАП, Мг/л МИ.101Н. U; Ы г сырой $1ЮМ4ССЫ % i >. i'l г сырей Зиоьмссм

1 0,50 70,7+ 16,8 100 su± ил 100 U

1 0,05 94.5 + 27,3 134 65,0 + 9 8 106 1,5

I 0 94.3 + 18,0 133 6S.4 ± 123 112 1,4

0,25 0,50 38,2 + 6,7 100 46.2 + 14,3 1(Ю 0,8

0,25 0,05 56,3 + 24,3 147 61,2 + tM 132 0,9

0,25 0 ftS.l +153 178 66.K + 123 144 1,0

2. Возрастные изменения Фотосинтеза и дынания в процессе роста культуры. Известно, <гго фотосинтез как физиологический процесс претерпевает возрастные изменения, С возрастом ассимиляция углерода клетками снижается.

Приведенные данные (рис. 5 и 6) но изменен ню фоччмдшч'етнческот выделения кислорода и ч-емнового поглощения кислорода у культур показывают, что у штамма на

среде Гч_'з ЕЛИ почти на протяжении Солее 40 суток цикла выращинання наблюдалось !WMmmpi,4iatme акпти<,;сти фот<ч;1>мт<:'га и дыхаиия «ад нгтаммом на средс с ÜJjtj miV.i BAI'I.

Рис. 5. Фотосшггсти чес-кос выделение кислорода у штаммов культуры F. eiaslica, выращеннмч на средах с 0,50 мг/л БЛП (1) и Оса БАП (2)

V "ÍTTT

" I 11 ЦП П I 1 И ц . III И . I ц ПГГГ1 ГЦ 1-1-Г11 » | Т-Т-. ¡

10 20 zo 40 50 Возраст культуры, сутки

о -

Рис. б. Темновое поглощение кислорода у штаммов культуры Р. clástica, выращенных на средах с 0,50 мг/л БАП (1)ч без БАП (2)

Возраст сулиуры. c;rr>;ii

Отмечено, что на 45-й день культивнронания инченспнпосп» фотосинтеза у штамма на среде 0,50 ыг/л БАП уже равнялась нулю (рис. 5). В отличие от него штамм на среде без БАП еще фотосинтезировал, что свидетельствует о продолжении функционирования и нем ФСА. Поскольку этот штамм отличался высокой активностью свободного зеатина, можно ечнгать, что деятельность ФСА была опое ре дона tu влиянием этого гормона. Итак, культур;!, выращенная на среде Gel БАП, на протяжении цикла выращивания проявляла высокую, и в более позднем возрасте, способность к фотосинтетическому выделению кислорода.

ДПС штаммов культуры F. elastica. В плане подробного изучения фотосинтеза мы иселедовали ДПС у разных штамм он. Известно, что величина послесвечения (ПС) зависит от скорости транспорта электронов в редокс-цспи фотосинтеза и фотофосфорнлнронання (Веселовский, Весело на, 1990], Данные (рнс, 7 а и Г>) но кал а на и гг. "по штаммы, выращенные на средах с различным содержанием сахарозы и БАП, отличались по величине индукционных вспышек. Так, максимальная индукция ПС регистрировалась у штамма иг среде с 1 % сахарозы и без БАП (рис. 7 а, кривая 3), что сшиютслыпиуит о ею высокой фоюсиптетнческой снособнослг Обнаружено, что тенденция возрастания величины индукционных вспышек при уменьшении БАП и среде наблюдалась и !(ля штамма, выращенного на среде с 0,35''а сахарозы, хотя и была выражена в меньшей степени (рис, 7 б).

Мы исследовали стимуляцию (днуроном) свечения у кульзур, выращенных на средах с различным содержанием сахарозы и БАП. Величиной свечения в присутствии днурона при освещении можно условно характеризовать количество реакционных це(пров фотосистемы II (РЦ ФС11) у интактнего объекта [Веселовский, Веселова, 1990J. Уровень свечения у штамма с уменьшением содержания БАП в среде увеличивался (рнс. 8). Это свидетельствует о формировании в нем в этих условиях ФСА, отличающегося большим количеством РЦ ФСН. Отмечено, что у|»аень свечении бьщ выше у штаммов, выращенных на средах с 1% сахарозы (рнс, 8, кривая 2), что подтиерж лается полученными для этих штаммов данными по фотосинтезу.

Таким образом, у культуры при снижении содержания БАП в среде с I % сахарозы формировался ФСА. характеризующийся большим количеством РЦ ФСП, |)|>|сокой скоростью транспорта электронов и высокой активностью ф< 1Т(х]х)сфорш! н рова н ня.

1С

Рис. 7, Индукционные кривые ПС у штаммон кутлурм Р. ЫамОса. пыращекнмх на средах с I % (а) и 0.25 % (б) сахарозы. Kpimi.it; 1, 2 и 3 соштадтствуюг штаммам, пыращенным на срелах с 0.50:0,05 и 0 мг/л БД П.

- IOOÍtttt 0.00

0,10

0.20 0.30 0.40 БАЛ, ш7л

0,50

Рис. 8. Стимуляция (днуроном) спечс-ния у штаммов культуры Р. clástica, выращенных на средах с 0.25 % (1) и 1 % (2) сахарозы н при различном содержании БАП

УЛЬТРАСТРУКТУРА ХЛОРОПЛАСТОП КУЛЬТУР F. ELASTICA, ВЫРАЩЕННЫХ НА СРЕДАХ С РАЗЛИЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ БАП. Опару же но, что при уменьшении содержания БАП п среде или при его исключении структура хлоронластон усложнялась. Форм иро палас г. более развитая внутренняя система мембран с более высокой шпупгостыо рибосом и пластоглобул в строме, что .сшщетельствует о высокой Оносинтсги ческой активности пластид, С снижением содержания БАП в среде крахмальные зерна и строме исчезали (рнс. 9). Итак, при снижении содержания БАП и особенно при его отсутствии в среде в штаммах формиро(шшсь хлоропласты с высокоразвитой внутренней системой мембран и большим количеством рибосом н пластоглобул в строме.

НАКОПЛЕНИЯ ПОЛИИЗОПРЕНА И ФОРМИРОВАНИЕ ТРАХЕИДНЫХ СТРУКТУР В КУЛЬТУРАХ F, ELASTICA, ВЫРАЩЕННЫХ НА СРЕДАХ С РАЗЛИЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ БАП. При просматривании в проходящем свете н микроскопе бромиды полнизопрена в кульзуре клс-tvik (рис. 11) как в грешке листа (рнс. 10) наблюдались светло- или бордоаыми включениями. что может енидезельсзионачь о споеобноеп! культивируемых. ¡n vilro тканей синтезировать харак-

1'нс, 9. У .и.траструкгура хдоро-

j i ласти штаммов кул муры Г,

claslica, выращенных из средах

с «,50 мг/л (а), 0,05 мг/л (Ö) БАП

и Cea БАП (»).

Kp. j. -крахмалимо зерно;

П - пластиглобуяа;

Т.ч. с. ~ тидаконды стримм;

Гр. - грана;

I*- рибосомы.

Рис. 10. Включения нодшпонрена И Продольном срезе черешка лис-га Р. еЫ11са (увеличение х280) Вкл.и-и - включения нилн-и ширена

Рис, 11. Включения полнил щрена о штаммах культуры Р. с1а1([са (увеличение х400), выращенных на средах с 0,50 мг/л (а) и 0,05 мг/л (б) БАП и без БАП (и) Вкл.п-и - включения полиизо-лрена;

[1-й - [кшшзпреп о диффузном состоянии

- г: -ч;.

средах с OJO лп/д fa) и 0,05 in (ft) БЛП а беа БАП (в)

торный дли шггакчкого растения полнизопреи.

Анализированные штаммы различались мсжку собой но тину распределения и степени накоплении нолнизонрона, Дли иггамм^. оi.ipaiценного на среде с 0,50 мг/л БАП, характерно накопление полиизопрена в клетках в ин.че отдельных включений икругло-бейошдаой формы (рис. И а), Особе нноезъю штаммом, выращенных на средах с 0,05 мг/л ВАП и без гормона, помимо включений, пилилась локализации полнизопрена в диффузном состоянии (рис. 11 б н в). Обнаружено, тт дли згнх штаммов характерно наличие и тканях трахеидных структур {рис, 12 б н и). Причем их количество больше у штамма, выращенного на среде без ВАП. Такие сосуда енп'аияем структурами высокого уровни диг|>форенциронки клеток (Данилова, Козу Г» м ИМ)] и характерны для ннтактнот растения F. elaMica (Dickenson, 1969, пит. по Archer, Можно

нредноложть, что в нашем опыте с культурой F, ehsiica ткань нпаммон, выращенных на средах с 0,05 мг/л БАП и без гормона, дифференцировалась и граде идиые структуры. Последние при просматривании и проходящем снеге с микроскопе выглядели также окрашенными в светло-бордовый цвет, 'гго предполагает возможность накопления в них полни зон ре на.

Итак, для каллусной кульзуры F. cbstica показана способность к накоплению характерного для цитатного растения пол и и юн pel [а. Причем большее накопление нолиизонрена характерно для клеток, содержащих большее количество зрахеидных структур, которых было Польше Н Штамме , выращенном на среде без liAII,

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ выполненной работы нозноляст сделан, положительный И1,шод о возможности получения штаммов фотогезеротрофной и ф1/гоавтотрофиой культур из гетеротрофной каллусной ткани поли изопрен ообразу юг него растения F. еЫпса при изменении внешних факторов культивирования. Сравнительное изучение .морфо-фнзно-логического состояния и биосиптетнческой способности этих штаммов позволяет установить оптимальные условия культаннронанил, индуцирующие днфферешщронку клеток.

Среди полученных иа%ги нтммов, ш.фащенных на спегу на средах с 3, 1 и 0Л5'!и сахарозы н 0,50; 0_23; 0,05 и 0 мг/л БАП, штамм на с;хч(е с 1% сахарозы и без БАП отличался наиболее интенсивным ноши юразопа пнем хлорофилла в клетках, а также высокой интенсивностью светозаинеймого выделении кислорода. Д;ы такого ФСА характерны высокая скорость фотоешгтетпческого транспорта элекзронон, оолипее

ко.шчч то ГЦ ФС [I if высокая активное», i [мтог|» к< jy рил и рова ни я. Кроме этого, Kv.41.144 <j*>n>citnie знровала и и Сю л с с позднем периоде роста, что енндеч сли'тует о се более медленном старении. Тенденции увеличения содержания хлорофилла и тканях и tío ¡p.iL iaMiia их iJx> 14чтипетнческой активности при уменьшении ПАП в среде покатана и дли кулыуры, ni,(ращенной на среде с (J,Z)% сахарозы. Однако интененшкхггь i юра миания шп мешок и фотосингеза n срапвеппн с теми же параметрами для культуры на (."реле с I % сахарозы Пыла ниже. Поскольку штаммы, выращенные на средах с 1 и 0,25':;, сахарны, - фотоа шч е зи рующие, он и являются фогоамтогрофними.

Максимальный pi >сг каллусион культуры наблюдался у зеленекяцего штамма, in.ip.nniinicio на среде с максимальным содержанием сахарозы (3%). Эго • наименее ДМ'j 'j| . tll|,l| ч v u!U.t l ку.11, !)(>.! (, "-M.L 1нрокмляла i| ю 11 ч. и ич cti тсс кон Ik'i.h:¡n -J.I п). что согласуется с оГч не крива г» >ii 104 к 011 аре пня о днфферепциронке клечок [ВутеНКо, 1У751, iiii ко lojxtit максимальна-,! пролиферация характерна для наименее дифференцированных к te 114, И а.ншом 1.1J4.»' дли штамма К claslk.i 11,1 1)4 де с 1"!. сдхаро характерен статус

; 11.1j i j , ) i | ^»¡ j '. ' j 'il, ч i п

III гамм фио.шчоцтфпой культуры, выращенный на среде Оса БАМ, имел хлоро-11.1,11 111 00 > ice пысокоорганн *>»лш<>м структуры н оглн'Ше ог штаммов, выращенных на средам е р.и.пишьш содержанием гормона. Пластиды содержали многочисленные фаны, состоящие из нескольких тилакондов, а также большее количество рибосом и пдасто-глоб\л. что свидетельствует о высокой их функциональной и бщчтш чечичсской акглв-iKieiii- .

Полученные памп данные по содержащим эндогенных цптокиишюв 11 клетках изученных ш гаммой фочоанггофофной культуры свидечч; л ьсчиуют о способности этих кулыур синтезировать зеаччщ. Самая высокая актавкость синтеза была отмечена у штамма на среде без БАП. что указывает на обратную зависим осп. интенсивности синтеза ундогеиного зеаччша от концентрации добавленного и среду культивирования БАП. Исходя из наших результатов и имеющихся литературных данных (Земляченко и др„ 1W7: Селннапкина и др., 2001], мы для культуры F. elástica допускаем возможность юрм, шальною |)озде|1счш!Я па клетки святы Bal ib ем цитокиннна е бел ком-реле] по ром. Koropt ic осуществлялось с помощью си итерирующегося в них в определенной конпенчрапиитсатина. . •

1 Ьученние m гаммы фогоаитотрофнон культуры способны к накоплении) 11 клетках полип юпрсна. причем jio накопление определялось типом тт:авв к легок, и которой

вы pa llai мылось соединение. 1>олыне нолиизопрепа накапливалось в клетках. содержащих большее количество чрахеидпых Сфуктур, 111,1 характерно для штамма, выращенного на среде Оса ЕЛП.

Результаты выполненной работы позволяют гонорнп. iH> участи каждого и i ti i>-ченных внешних факторов кудьтиинропаиня в pei-у.чяшш формирования специализированных фотосинтезнруилци х систем клеплк it их биоеннтетической способности. lit i.iee того, они спндстельстнунгг о возможности синтеза нзопреноидных сосдипений и культивируемых in vitro клмхах. Показана функциональная роль эндогенною зеагина ti растительных клетках, что дополняет знания о регуляторнмх функциях этою гормона

ВЫ ПОДЫ

1. Отработана методика получения фатотрофноЛ культуры, являющаяся основой кле точной селекции - процесса позраеззкяцет домнннршанпя клеток определенного аила.

2. Получено 12 штаммон ф погсгсрод-рофноо н фполп го|(чн|.нон культур и i iv irp.. трофной каллус) toil ткани нол нн зоп ре нообразу юще t о растения I". с tallica варьированием световых условий. гормонального ti углеводного составов среды.

3. Установлено, 'rix; освещение культуры являлось нерным и обя зазельним ус.юннем пелене к п и каллуса.

4. Обнаружено, ч то штамм, зеленеющий на свс-iy на среде с 3% еахлрп ii.t и П. Д i mi [!ЛП, оптимальной для гетеротрофного роста, и интенсивно наканлнватннй сырмо биомассу, tie проявлял фоаххлппетичсскоЛ функции.

5. Отмечена ф:лх1сиmein ч сская актинность. наряду с chkiviom xjh|рофи.тла, для ihi im мои. выращенных на средах со сниженным содержанием еахар.чы (1 или <!,.W'!> 1 и П.лИ мг/л БАМ.

6. Выявлено, "гго снижение БЛГ1 (от 0,50 до 0,05 мг/л) и особенно исключение юрмчна из среды активировало синтез хлорофилла в клетках и попытало фггосинтечнтеское выделение кислорода у штаммов культуры. При этом условии формирование <К"Л сопровождалось увеличением скороста транспорта электронов, количества РЦ 'К11 и возрастанием активности фотофосфорилировання. Штамм, пырл шейный на cjujic без БАП, проявлял фотскинтетичсскую активность и в Гхигсе позднем периоде роста.

7. Установлено, чго снижение БАП в среде коррелировало с проявлением laKHx особенностей клеток фотоавтогрофнои кулыуры фикуса, как развитость хлороилае юн.

lí.lk.llMOIIte t|.'t.¡L'Hli ;|4Ú\.l Ii СТрчме, (1)11С||С!И1№ icn> ClttlTe Iii JCaTHlfJ и nu.Iílll jlUíjXTW It k:ktk.i\. i¡n'fiiiiip' uta ill te трахситных с*фуктур н тканях.

H. 11 iMciitiinc ннешпнх фактор*hi к у;н, гп ни роиаи и я ('»спетеннс и снижение отностилыго нор\н t ,(.i>i iетсрофофлиго роста содержании са\ариы и DAI7 » среде) пошолило излучим. <j>ooait ттр.фпую ^ кулыуру. отличающуюся хорошими росттымн харамериеткамп. ш.Ко к, ill фотос | ШТсп 1ЧесК oil а ктиш iocTI.fi i H болыни.ч накоплением колли «'ai|4ai4 и эндогенных цнткнниион ц ткшмх. Kfxisie ап>п>, полученные данные но содержишь i ropMi.Hoii it ткани V дают ос lio lia н не то пор ни, о функциональной роли зеатина ti ji.it.TiHv.'ii .них клетках.

СПИСОК IWliilT, Ol 1У ГЛИКОИДНПЫХ 1ЮТГ.МЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. I\ieii M П., M.Iрkaрона Ivll,, Кош.чупша И.Б, Вееелоисний ß.A. I9WÍ. Культу pa 1К.ЛШ pat leiHiii - кауч\коносо» н i ^ч и orerc p профи Ы x услоння.х. ■ Tea. Докл. HtM (\u.ip- Ьлшф. "linoat.144 кл;и.ттифусммх « Сшотехиолотнн". 11оноснГ>нрск. ч ¡.е. 1 i

2. l ut» M Ii-, Mapit.iptiii.i Г,11., kceu.'iyi una U li,. К oj irai loua T.B,, весело.цскнн В.А.

Соде р. мине \дорофнлда, фопчнитст и длптсныюу нослсспеченне фоюкчсротрофнон культуры reamt рапе или - каучуконосол. - Фнлюл. н он о* им. ку.п.турпых |xuaenini, г. 21. N 4, с. 321-328. ,1, 1 yet ¡i M lt., Колыцыша И. Ii., Маркаропа R.II. 1992. Получение ан'тфофнон KV-'ii.iypi.i ткани lieii\ elasiiea "Заннснмисть роста, накопления ппгмснтоп н fj.iHoLiiiiK m or количсстна усленс.дон и 6-ое нншамишн i урина н среде. - Веет. Моск. ун- m, tejí, lo, Inio.'ioMiii. N 3, с. 29-3.1,

4. M.ipkajnina НИ,, Кольчуины Ht>,, Гусен M.Ii. 1993. Фоччлрофтя кульчура ткани. •I'.ik'Ikjiiii. регулирующие форм к pona 11 ne фотосиптетичсекого аппарата н культуре *|>.анл каучуконосных растении Heus clasica и Scorzoiiera ар, - Тез. докл. Ill съезда 1ЮФР. Санкт-Петероург, ч. 2, с, L5Ü.

5. Ko.H.'iyriHia n.iï , Маркаропа E.H., Гусен M,И. 1996. Содержание цнтокининон и каллусных ткани X разных штаммом ficus elasiiea, растущих на средах, раин (чающихся но количеству 6-оен iiuiaMiiiioiiypima. - Deem Моск. ун-та, сер. 16, Б но липы, N 2, с. 35-.R

6. Маркаропа K.H., Кольчутина И.Б. 1998. Anwгрофные культуры клеток Sc ог/enera -.у>. it lieu* ciasiita. Росс. oôpjjosianiie ннгментои, фотчсшпе:'! и содержание iciiOfctitiHHoit tt клетках. - Труды IV Мсжзунар. конф, н дне кусе. íiav4. клуоа ГГ+ 9.4

"Новые информационные технологии в медицине и экологии*, Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, ч. 2, с. 413-415.

7. Маркарова E.H., Кольчугина И.Б. 1998. Ультраструктура хлоропластов в каллуснъя культурах Ficus elaslica, различающихся no активности цптокяннноа. • Физиоя. растений,т. 45, N5,с. 659-663.

8. Кольчугина И.Б., Маркарова E.H. 2000. Становление автотрофности в культуре клеток растений. - Материалы Междунар. науч. конф. «Автотрофные микроорганизмы», Москва, с. 105.

9. Маркарова E.H., Кольчугина И.Б. 2002. Возрастные изменения фотосинтеза и дыхания на протяжении цикла культивирования у штаммов каллусиой культуры Ficus elaslica с различной цитокининовой активностью. - Вест. Моск. ун-та, сер. 16, Биология (в печати).

Отпечатано в ООО «Соцветие красок»» 119992 г.Москва. Ленинские горы, д.] Главное зданне МГУ. к. 102 Тираж 100 экз. Заказ №41 Подписано в печать 21.10.2002.