Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Стабильность и изменчивость ядрышкообразующих районов хромосом

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Стабильность и изменчивость ядрышкообразующих районов хромосом"

российская академия наук

институт биологии развития имени и. к. кольцова

На правах рукописи

АМОСОВА Александра Владимировна

УДК 575,!б7 : 575.222,7: 576 -316 23

СТАБИЛЬНОСТЬ И ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЯДРЫШКООБРАЗУЮЩИХ РАЙОНОВ ХРОМОСОМ

03.00.15 — генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

Работа выполнена в Лаборатории функциональной морфологии хромосом и в Центре информации о структуре генома человека Института молекулярной биологии им. В. А. Зигель-гардта РАН.

доктор биологических наук, профессбр А. В. Зеленин, доктор биологических наук Н. С. Бадаев.

доктор биологических наук, С. А. Гостимский, кандидат биологических наук Е. А. Ляпунова.

Ведущая организация — Институт эволюционной морфологии и экологии животных им. А. Н. Северцова РАН.

ного ученого совета Д 002.85.01 при Институте биологин развития им. Н. К. Кольцова РАН по адресу: г. Москва, 117808, ул. Вавилова, 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан « . . . ».....1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук Е. М. Протопопова

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

ОК^ЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТМ Актуальность проблемы. „ В 1912 г. С,Г.Навашин впервые Описал спугнешь» храыосокы С>а1(01па сагкПсапк, показал участие нити спутника я ,;'.';рй<ир<1й а им и члрышка и, тем самым, привлек внимание исследователей к ядрг-пдоообразукбхим районам (ЯОР) хромосом. Позднее С .Г.Навашин открыл явление "дифференциальной амфиг.ластии", заключающееся в изменении поведения ЯОР при межвидовой гибридизации. После локализации в ЯОР риб >сомал ьных генов, эти районы стали привлекать внимание сщг большего ч^сла исследователей. Изучение ЯОР значительно облегчилось а свяэй с появлением методов дифференциального окрашивания хромосом, частности, с метоаон окрашивания серебром

(А^-окрашивания), благодаря который на метафазных хромосомах стало возможным выделение транскрнпционно активных ЯОР. Эти методы получили наиболее широкое распространения при исследовании ЯОР хромосом человека и животных. Однако, при попытках использования методов А£-окрашияания для анализа хромосом растений, в частности злаков, возник ряд трудностей, таких как плохой разброс хромосом, плохая воспроизводимость результатов окраски и т.п. С нашей точки зрения это связано с особенностями строения оастительной клетки, то есть с необходимостью разрушении клеточной целлюлозной оболочки и с невозможное! ыи нриминення гипотонической обработки.

В последние годы постгпып.о накапливаются данные, указывающие на существование определенной изменчивости генома (непостоянство, подвижность, мобильность генома). Это касается не только подвижных генетических элементов. У ряда вияо'в обнаружено существование внутривидовой изменчивости количества ДНК на геном. Так, например, у таких видов злаков как рожь, твердая и мягкая пшеница, гекса- и октоплоидные тритикале она достигает 25% (Бойко. 1985). Можно предположить, что такая изменчивость осуществляется за счет фракций средне- и высокоповторяюшихся последовательностей нуклеотндов (в том числе рлбосомальной ДНК) и следовательно, должна частично проявлятся в наличии хромосомного полиморфизма по гетерохроматическим районам, По-видимому, на хромосомном уровне изменчивость по рибосомальной ДНК находит свое отражение в существовании полиморфизма ЯОР, изменчивости количества ЯОР метафазных хромосом и I ядрьпиек в интерфазных клетках, длин ядрышкообразуюших вторичных перетяжек и т.д. В то же время вопрос о стабильности и изменчивости ЯОР на хромосомном уровне изучен недостаточно.

Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение стабильности й изменчивости Лg-oкpaшeнныx ядрышкообразующих районов хромосом.

-Непосредственными задачами работы являлись:

1) Разработка надежно воспроизводимой модификации метода А$-окрашивания ядрышкообразующих районов хромосом растений;

2) Разработка методов измерения и количественных оценок Ак-окрашенных ядрышкообразу'ющих районов отдельного организма (растительного или животного);

3) Исследование с помощью разработанных количественных методов межклеточной и межиндивидуальной изменчивости АЁ-окрашенных ядрышкообразуших районов;

4) Анализ количественного взаимоотношения содержания в ядрышкообразующих районах активных и неактивных рибосомальных генов у растений на примере мягкой пшеницы;

5) Изучение наследования ядрышкообразующих районов у межвидового гибрида ТННсшп пиви£сЬоуае;

6) Исследование поведения ядрышкообразующих районов при внутривидовой гибридизации на примере иежсортовых гетерознсных гибридов ячменя.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые разработан метод приготовления препаратов метафазнмх хромосом растений, путем раскапывания суспензии клеток, позволяющий получать более нативные хромосомы. Разработана модификация метода окрашивания нитратом серебра ЯОР (Ag-Я0P) хромосом растений, характеризующаяся хорошей воспроизводимостью. Предложена количественная оценка ЯОР отдельного организма (растительХого или животного) по суммарной площади А£-окрашенных ЯОР в клетке (суммарная клеточная площадь Ag-Я0P). Обнаружено, что суммарная клеточная площадь А£-Я0Р хромосом пшеницы с высокой степенью значимости .(коэфф. корр. > 0,999) коррелирует с общим содержанием рибосомальных генов. Показано, что суммарная клеточная площадь Ag-Я0P хромосом человека и растений является характеристикой данного организма. Обосновано использование коэффициента вариации площади Ag-Я0P хромосом человека и растений в качестве характеристики, отражающей стабильность (или гетерогенность) генома исследуемого организма. Показано, что у межвидовых гибридов может наблюдаться не только инактивация ЯОР одной из родительских форм или сохранение ЯОР обоих родителей, но и активация дополнительных ЯОР по сравнению с родительскими формами. Анализ гетерозисных гибридов ячменя выявил увеличение суммарной клеточной плошади Ag-

ЯОР по сравнению с родительскими формами, а также снижение коэффициента вариации суммарной клеточной площади Ag-ЯOP

хромосом. Это указывает на более высокую стабильность генома гетерозисных гибридов. Обосновано использование А§-окрашивания ЯОР как простого теста, отраиающего стабильность и дифференциальную активность генома.

Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на Т] ^Т ЛТ( Всесоюзных совещании* по структуре и функциям хромосом (Пущине, 1985; 1988; 1991 гг.), на VI съезде ВО! КС (Минск, 1992), а такяе «а II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Путанно, 1993).

Структура ч объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы^ описании материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из 234 наименований, из и«х 203 иностранных источника. Работа содержит 110 страниц, вклпчая 8 рисунков и 7 таблиц. Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1 Материалы исследования

R работе использовали следующие материалы:

1 ) Лимфатические клетки из культуры периферической <сро«к пяти индивидов с нормальным хромосомным набором. Для кавпого индинида исследовали Ag-окрагаенные ЯОР акронеитрнческих хромосом в 16-25 метафазных пластинках. Материал лкЛезно предоставлен 0.А Поду гольниковой ( Ин-т медицинской генетики АМН);

2) Клетки корневой меристемы четырех сортов мягкой пшеницы Triiiciiffi aeslivum L. em The I I (2n=6x = 42): Атлас 66, Пардью 4930, Гвинее и Прибой, полученные от Е.В.бойко ( ВСГИ ВАСХНИЛ г.Одесса). Дл!я каждого сорта анализировали Ag-окзрашеннме ЯОР и 12-39 метафазных пластинка); и Ag-окрашенные ядрышки в 500 иитерфа»ных ядрах;

j 3) Клетки корневой меристемы Aegilops tauschii (=Ае. squarrosa) ssp. strangulata, 2n=2x=i4 и Tritlcum militinae ssp. mijHtinae, 2n=4x=28 и их амфидиплоидный гибрид Triticum raigusctiovae, x=42, ( no каталогу ВИР K-1740, K-46007 и K-

693925, соответственно). Материал получен от Р. Л.Еогуславского (Дагестанская опытная станция ВИР, г.Дербент). Для каждого вида анализировали Ag-окрашеннме ЯОР в 25 метафазных пластинках и Ag-окрашенные ядрышки в 500 интерфазных ядрах;

4) Клетки корневой меристемы двух сортов двурндною шеня

Hordeum vulgare L|. - Носовский 9 и Лбава, 2п-2х-14, а также ил гибридов (Fl, F2, F3). Сорта ячменя любезно пре доставлены В.А.Пухальским (НПО "Подмосковье"). Для каждого.сорта и гибрида анализировали Ag-окрашенные ЯОР в 14-43 метафазных пластинках.-

2. Методы исследования

Препараты хромосом человека готовили по модифицированному методу Мурхеда с соавт. (Moorhead et а 1., 1960). Готовые препараты выдерживали в течение 1 недели в термостате при 37° С.

Разработанная нами методика приготовления препаратов хромосом растений подробно описана в разделе "Результаты и обсуждение*.

Окраску препаратов хромосом человека проводили по модифицированному Ag-1 методу (Bloom, Goodpasture, 1976, Со эанский, 1983).

Окраску серебром ЯОР метафазных хромосом растений проводили по модифицированному нами методу Лакадена с соавторами (Lacadena et al., 1984). Подробно методика описана в разделе "Результаты и обсуждение^.

Определение содержание рибосомальных ДНК в различных сортах мягкой пшеницы проводили методом гибридизации иммобилизованной на мембранных фильтрах ВА 85 ДНК с 125I—РНК (Дьяченко, 1983). Метод определения рибосомальных генов в тканях высших растений разработан в лаборатории молекулярной биологии ВСГИ ВАСХНИЛ (г.Одесса). *

Препараты анализировали на микроскопе Ампливал ("Carl Zeiss", ГДР) с объективом Апохромат 100*, апертура 1,32 МИ, окуляр 12,5*. Использовали микрофотонасадку с автоматической установкой экспозиции mf-matic, фотопленку Микрат-300 и фенидоновый проявитель.

Визуальный анализ Ag-окрашенных ядрышек в интерфазных ядрах и ЯОР в метафазных пластинках осуществляли в прямом и отраженном свете. Для морфометрии отбирали полные метафазные пластинки в небольшом интервале спнрализации и с хорошим разбросом хромосом.

Система для измерения плошади Ag-ЯОР хромосом человека состояла из сканирующего микрофотометра, сопряженного с мини-ЭВМ СМ-4. В результате сканирования заданного участка на негативе в оперативную память ЭВМ закладывался цифровой портрет хромосом -матрица чисел, определяемых оптической плотностью изображения хромосомы. Затем изображение выводилось на экран цветного телевизионного монитора таким образом, что цвет и его

интенсивность в любой точке изображения на экране соответствовала оптической плотности определенной точки на негативе. С помощью курсора t.-t: ходили на зкрапе тот участок хромосомы, который анализирона;;". 9 предела» этого участка ЭВМ осуществляла обработку результатов сканирования и вычисляла площадь Ag-ЯОР по заданному алгоритму {Саралйдзе и др., 1981). Погрешность измерения составлял;! 0.8-4.6®.

Площади Ag-ЯОР хромосом пшеницы измеряли на негативах при помощи телевизионного анализатора .изображений (TAS, "Lei !z", ФРГ ). Погрешность измерений не превышала 4%.

Определение плащлан Ац-ZO? проноса: ячменя провопили с помощью устройства для виода графической информации настольнЗй ЭВМ Hewlett Packard 9830А. Погрешность измерения не превышала

Статистическую обработку результатов осуществляли, используй прикладные программы из библиотеки ЭВМ Hewlett Packard 9830А. flph этом в каждой клетке подсчитывали суммарную среднюю площадь Ag-ЯОР, стандартное отклонение и коэффициент вариации этой величины. Различия между индивидами, видами и сортами выявляли, сравнивая средние суммарные клеточные площади Ag-ЯОР й коэффициенты вариации этих величин с помощью статистических критериев с учетом нормальности распределений. Достоверность коэффициентов корреляции определяли при помощи таблицы Критических значений коэффициентов корреляции.

Р Е 3 У Я Ь Т А Т Ы й О Б С У S Я £ И Н Я 1. Митзд приготовления хромосомных препаратов и модификация ¡serosa Лц-о*раш1;в;шия вдрышкоабризуших районов zpoúócou patieftttS.

j Особенностй 'cTpO^fiftii клето* растений на позволяют «¿посредственно «спольэоват* менодйадг прйКИговлеМ»* хромосомных

п^епгргтов для дифференциального окрашивания, п-римейяе'йые lípw проведении хромосомного анализа животных Vi человека. Использование недостаточно "мягких" предобработок 3á¥p'yffrt*élr получение Ag-окрашивания ЯОР, а также других методов д;)ффогавнциарьного окрашивания хромосом растений при стандартных методах приготовления препаратов. Поэтому мы пришли заключении, 470 дли успешного проведения анализа ЯОР хромосом растений необходимо решить ряд вопросов; 1) разработать метод приготовления препаратов мотафазных хромосом злаков, используя сравнительно более мягкие воздействия, чем в случае стандартны* методов; 2) на основе данного метода разработать модификацию

методики Ag-окрашивания ЯОР. Следует отметить, что к моменту начала нами исследований в литературе, хотя и было описано несколько методик Ag-окрашивания ЯОР хромосом растений (Hizume el al., 1980; Kalm, Smyth, 1980; Linde-Laursen, 1984; Lacadena et al., 1984 ), но все они оказались трудновоспроиэводимыми.

1.1. Метод приготовления препаратов метафазных хромосом растений

из суспензии клеток.

1. Корешки проростков длиной 1.0-1.5 см обрезали и помещали в 0,05% водный раствор колхицина при 20°С на 4 часа. Концентрация

. колхицина была уменьшена в 4 раза по сравнению с той (0,2%), которая использовалась ранее в нашей группе для получения С-окраски злаков, так как, по нашим наблюдениям, использование более высоких концентраций колхицина затрудняло Ag-окрашивание ЯОР.

2. Корешки отмывали 3-5 раз в дистиллированной воде. Следует отметить, что наличие у клеток растений жестких оболочек не позволяет проводить гипотоническую обработку стандартными растворами, используемыми для животных. Отмывка корешков перед фиксацией в дистиллированной воде увеличивает тургор клеток и является в какой-то степени процедурой, заменяющей гипотоническую обработку.

3. После отмывки корешки помещали в свежеприготовленный холодный фиксатор - этанол : ледяная уксусная кислота (3:1) при 4°С; Такая фиксация является менее ■ "жесткой", чем используемая обычно фиксация в 60% или 45% уксусной кислоте, которую применяют для удаления остатков цитоплазмы. Время фиксации было подобрано нами экспериментально. Визуальный анализ готовых препаратов под микроскопом показал, что наилучшее качество метафазных пластинок (хороший разброс хромосом при отсутствии следов цитоплазмы) достигается при фиксации в течение 16 часов. Корешки отмывали от фиксатора в серии спиртов нисходящей концентрациии, а затем - в дистиллированной воде.

4. Кончики корешков длиной 2-3 мм обрезали и переносили в доведенный с помощью соляной кислоты до рН=4.0 водный раствор ферментов, содержащий 4% целлюлаэу и 4% пектиназу. Корешки выдерживали в растворе ферментов 1 час при температуре 37°С. Состав и концентрация ферментов, а также время обработки позволяют разрушать клеточную оболочку, не применяя "жестких" предобработок, таких как, например, гидролиз.

5. Кончики корешков отмывали от ферментов дистиллированной

&

водой, покера ли ь узкую пробирку, заливали небольшим количеством свежеприготовленного охлажденного фиксатора имацерировали петлей "до"~пол"уч1,нич однородной суспензии клеток. Клетки обычно легко ыацерируютс-г . что свидетельствует в пользу того, что состав и концентрация ферментов, а также время обработки в них кончиков корешков, были подобраны достаточно удачно. Введенная нами мацерация клеток в растворе фиксатора — дополнительная процедура, позволявшая избавляться от остатков цитоплазмы и получения метафазиых пластинок хорошего качества.

6. Суспензию к.четок наносили с помощью ¡пипетки мл чистые влажные охлажденные предметные стекла, акалога'ию *ак чтз

делается при приготовлении хромосомных препаратов человека и жнаитных. Расстояние, с которого производили раскапываенме суспензии на предметное стекло (около 20 см), было подобрано экспериментально.

1.2. Модификация метода А^-окрашивання ядрьшкообразукших районов

жроиосои злаков.

В основу модификации метода Ag-oкpaшивaния ЯОР хромосом злаков нами была положена методика Лакадена с соавт. ([.асаиепа г*, а!., 1934). Для А2~окрашивания одного препарата растворяли 30 мг Ag^J0^ » 60 м к л цитратиою буфера ( 500 мл дистиллированной волы и 0,02 г пи|рата натрия -С^Н^Ма^О^' 2 ?"-?0, значение рН=3,0 доводили с помощью муравьиной кислоты). Л"-' капли полученного раствора наносили пипеткой на препарат и покрывали покровным стеклом. Препарат переносили ь чашку Петри рядом с влажной фильтровальной бумагой. Закрытую чашку Петри намешали в термостат при температуре 60° С на 1 час. Затем препарат промывали в проточной воде несколько секунд, высушивали на воздухе, помещали з ксилол на1 30 шшут и заключали в энтелан ("Мегс>к" ¡).

Разработанная модификация метода достаточно стандартна, обладает высокой разрешающей способностью и универсальна для различных видов растений Хромосомы окрашиваются в светло-коричневый цвет, поэтому дополнительная окраска другими красителями не требуется. На фоне хромосом четко выделяются ЯОР, окрашенные а интенсивно черный цвет. Полученная качественная окраска ЯОР злаков при меньшей, по сравнению с используемой 1.&са(1ела е! а!. (1984), концентрации раствора ни-чат» серебра указывает на то, что препараты являются более нативными. Это дает основание предполагать, что разработанный нами метоп приготовления препаратов метафазных хромосом растени.. из

суспензии клеток моцет найти широкое применение в хромосомном анализе.

2. Количественный анализ Ag-oкpaseниыx ядрывкообразуюцих

районов хромосом. 2.1. Количественная оценка плоиади А£-окрапенных ядрыикообразую-вих районов хромосом человека. .

Целью данного раздела 'работы являлось разработка способа " количественной оценки площади Ag-oкpaшeнныx ЯОР акроцентрнчески* хромосом человека с помощью разработанной в ИМБ РАН системы для сканирования негативов и обработки результатов измерения, а такие исследование с помощью этой системы межклеточной и межиндивидуальной изменчивости площади Ag-ЯOP.

К моменту начала нами исследований ( 1984 г. ) в литературе не было описано методов количественной оценки Ag~oкpaшивaния ЯОР. Так как неправильная форма и небольшие размеры этих участков затрудняют определение их линейных параметров, то мы пришли к выводу о необходимости оценки количества связывающегося с ЯОР серебра по площади окрашенных участков. Погрешность измерения определяли по вариации площади ЯОР маркерной по Ag-oкpacкe хромосомы при повторных измерениях одного негатива н при измерении разных негативов, полученных в одинаковых условиях с данной клетки (Табл. 1). Как видно из таблицы, коэффициент вариации колеблется в пределах 0,8-4,6%.

Таблица 1. Изменчивость площади ЯОР маркерной хромосомы одной клетки в серии повторйнх измерений.

Негатяв Число измерений Средняя площадь ЯОР, мки Стандартное отклонение, мкм Коэффициент вариации, %

1 5 0,402 0,012 2,9

2 6 0,400 0,010 2,4

3 6 0,396 0,013 3,3

4 3 0,401 0,006 1,6

5 3 0,396 0,003 0,8

6 6 0,392 0,018 4,5

7 6 0,382 0,018 4,6

8 10 0,393 0,009 2,3

Среднее 0,395 0,013 3,4

Для оценки межклеточной ( внутрииндивидуальной) изменчивости —" ЯОР мы суммировали площади ^-окрашенных ~ЯОР всех хромосом в каждой—к.четкет "В Таблице 2 представлены средние значения, стандартные отклонения и коэффициенты вариации этой величины для пяти иняивндоа. У четырех из них обнаружена высокая межклеточная изменчивость: коэффициент вариации колеблется а пределах от 20,2 до 24,6 %. Вариабельность суммарной клеточной плошали ЯОР можно несколько снизить, исключая в каждой выборке максимальное и минимальное значения (Таблица 2, см. значения а скобках), однако и в этом случае ыевклеточиаа изменчивость в 4-7 раз -Превышает погрешность измерений. У индивида 3 межклеточная изменчивость суммарной площади суиесТ) ,шо ниже, чем у остальных (коэффициент вариации равен 11,2 96).' Причина такого отличия неясна, так как методика А£-окраски и метод вычисления площади ЯОР были стандартными, а качество культуры существенно не отличалось у всех индивидов.

Таблица 2. Межклеточная и межиндивидуальная изменчивость

суммарной площади Ag-ЯОР.

Индивид Число . клеток Средняя площадь всех ЯОР в клетке, мкм Стандартное отклонение, мкм Козффициент вариации, %

1 16 1,95 (1,96) 0,43 (0,39) 22,2 (19,8)

2 25 1,66 (1,64) 0,34 (0,23) 20,2 (14,6)

3 25 2,88 (2,88) 0,32 (0,28) 11,2 (9,8)

4 21 3,45 ( 3,36 ) 0,78 (0,71 ) 22,7 (20,6)

5 20 3,09. (3,14) 0,76 (0,65) 24,6 (20,6)

Примечание. В скобках указаны величины, ««численные бе» учета I максимального и минимального значений суммарной

площади ЯОР в каждой выборке.

| Межклеточная изменчивость суммарной площади ЯОР может быть обусловлена вариацией площади каждого Ag-окрашенного ЯОР. Наши результаты подтверждают данные литературы, указывающие на существование межклеточной изменчивости количества и степени окраски ЯОР, а также общей клеточной активности ^тих районов (Захаров и др., 1981; Jotterand-BeI lomo et al., 1981; Созанский н др., 1984). По мнению некоторых авторов (Созанский и др., 1984), у человека межклеточная изменчивое! ь Ag-ЯОР обусли,)лена

гетерогенностью клеточных популяций по активности рибосомальных генов. Нельзя исключать и влияния технических погрешностей метода Ag-окраски.

. Важно отметить, однако, что наблюдаемая высокая межклеточная изменчивость не перекрывает межиндивидуальные отличия. Для пяти обследованных индивидов были получены достоверные (Р > 0,99) различия по средним значениям суммарной хлеточной площади Ag-ЯОР, что позволяет использовать этот параметр в качестве характеристики индивида. Дополнительной характеристикой индивида может служить коэффициент вариации данного параметра, поскольку этот показатель для конкретного индивида достаточно хорошо воспроизводится (Табл. 2). •

2.2, Площадь Ag-окравенных ядрыпкообразуюцих районов хромосом

мягкой пшеницы коррелирует с содержанием рибосомальных

генов.

Известно, что в хромосомах растений в прилегающем к вторичной ядрышкообразующей перетяжке гетерохроматине локализована большая часть рРНК-генов, которые находятся в неактивном состоянии (Kalm, Smyth, 1984), то есть, клетки растений функционируют в условиях избытка рибосомальных генов. Целью данного раздела работы являлось установление количественных взаимоотношений между площадью Ag-окрашенных ЯОР клеток нескольких сортов мягкой пшеницы и сопоставление полученных результатов с содержанием рРНК-генов у этих же форм.

У аллогексаплоидной (AABBDD) мягкой шеницы (Triticum aestivum, L. еш The!I) на основе изучения Л»дрышковой активности и морфологии спутников были идентифицированы ЯОР на хромосомах 1А, 18, 6В и 5D (Crosby, 1957; Bhowal, 1972). Методом ДНК гибридизации было также получено доказательство локализации рРНК генов на ЯОР-несущих хромосомах 1А, IB, 6В и 5D (Mohan, Flavell, 1974; Liang et al., 1977). Показано, что геном пшеницы сорта Чайниз Спринг содержит четыре пары хромосом, несущих ЯОР. Из них два функционально сильных - на хромосомах 6В и 1В (они содержат 90 % от общего числа рРНК-генов) и два функционально слабых - на хромосомах 5Д и 1А (Flavell, Smith, 1974; Flavell, O'Dell, 1976). По существующим ■представлениям, Ag-окрашивание ЯОР зависит от степени функциональной активности рРНК-генов в предшествующей митозу интерфазе (Miller D.A. et а!., 1976). Хотя число рибосомальных генов может варьировать на всех четырех парах хромосом, несущих ЯОР (Mohan, Fiaveil, 1974), было показано, что

по своей фуку«скальной активности ЯОР соотносятся друг с другом следуюккм образом6В-> 1В >-5Д > 1А (Cermeño ~et al., 1984; Mukai eí e,¡., 1991).

Ь наших экспериментах нитратом серебра окрашивались 4-5 ЯОР метафазных хромосом и до б ядрышек в интерфаэных клетках (Табл. 3). По-видимому, методой Ag-ок'рашиеания, используемым в наших экспериментах, ЯОР xpouoi-ouu 1А не выявляется, что указывает либо на его инактивацию в проанализированных нами сортах пшеницы, либо на недостаточную чувствительность используемого нами метода. Полученные результаты согласуются с данными других авторов (Mukai et al., 1991), который обнаружили, что а ооычной пшенице модальное число ядришек составляло два или три, а максимальное -пять, хотя гексаплоианая пшеница имеет четыре пары активных ЯОР, и ожидаемое число ядрышек должно быть равно восьми. Очевидно, меньшее количество наблюдаемых ядрышек является результатом инактивации некоторых ЯОР (по-видимому, функционально наиболее "слабых" - хромосомы 1А, и, а меньшей степени, 5D) и/или слияние ядрышек различных хромосом, в первую очередь - гомологичных.

Таблица 3. Количество ядрыкек в интерфаэных ядрах разных сортов пшениц.

Количество клеток, содержащих ядрышки Среднее число идрышои клет.чу

Сорт 1 2 3 4 5 6

Атлас 66 39 181 158 10') 10 5 2,79

Пардью 4930 40 178 160 85 25 4 2,73

Гейнес 20 140 195 82 10 3 2,58

Прибои 49 175 215 57 3 I 2,59

щ

имечание: для каждого сорта просчитывалось околи 500 ядер.

¡ При исследованиях хромосом человека мы обнаружили, что средняя суммарная клеточная площадь Ag-ЯОР является характерным индивидуальным признаком (Табл.2). Поэтому мы использовали этот парзыетр а при изучении хромосом злаков, учитывая также, что по данном Mí 11er et a!. (1977), количество связывающегося с 80 Р серебра коррелирует с в:о функциональной активностью. Для оценки внутрнсортовой изменчивости ЯОР суммировали площади Ag-ЯОР все->: хромосом а ка*дой метафизноп пластинке. В Таблице 4 представлены средине значения, стандартные отклонения и козффициенты ва( лации

этой величин» для, ««.следованных сортов мягкой пшеницы. У всех сортов обнаружена! более высокая, по сравнению с результатами, полученными при изучении ЯОР хромосом человека, внутрисортовая изменчивость: коэффициент вариации площади колеблется в пределах от 31,6 до 54,6 что в 8-13 раз превышает погрешность

измерений. Именно благодаря такой высокой изменчивости лишь сорта Атлас 66 и Прибой, имеющие наибольшее различие по средней суммарной площади Ag-Я0P, достоверно различались между собой по данному показателю. Столь высокая изменчивость не может объясняться только влиянием технических погрешностей методики А2~окраски, так как условия эксперимента были стандартными. Неодинаковая степень ' изменчивости анализируемых сортов по изучаемому признаку, а также высокая воспроизводимость коэффициента вариации при многократных повторениях эксперимента указывают на то, что этот показатель является не артефактом, а характерной особенностью сорта.

Таблица 4. Внутри- и межсортовая изменчивость суммарной площади ядрышкообразуюких районов.

- -- » Сорт Число клеток Средняя площадь всех ЯОР в клетке, мкм Стандартное отклонение, мкм Коэффициент вариа ции, *

Атлас 66 29 2,26 • 0,74 32,7

Лардыо 4930 34 2,49 0,79 31,6

Тейнес 39 2,80 1.15 41,0

Прибой 12 3,68 ч 2,01 54,6

Изложенное позволяет сделать заключение,. что средняя суммарная клеточная площадь Ад-ЯОР хромосом как человека, так и растений является характеристикой исследуемого организма. В качестве дополнительной характеристики организма (индивида, растения) можно использовать коэффициент вариации площади А^-окрашенных ЯОР хромосом, который отражает гетерогенность исследуемого организма по данному показателю.

Проведенное нами сравнение средней суммарной клеточной пжжади А£-окрашенных ЯОР нескольких сортов мягкой пшеницы и содержания рРНК генов у тех же сортов показало , что, несмотря на значительную внутрисортовую изменчивость, эти показатели высоко коррелируют между собой (Рис.1). Коэффициент корреляции равен 0.999, Р=0.001. Выявленная зависимость открывает принципиальную

возможность оппедгления количества рРНК-генов у сортов мягкой пшеницы (а гри использования данной модификации метода/ возможно, м- у-других- <шдов"'злаков) по размерам А§-окрашенных ЯОР. Для этой иели можно пользоваться приведенным на Рисунке 1 графиком.

Рис.1. Зависимость между средней суммарной клеточной площадью Ag-окрашенных ядрьшжообразукмцих районов (ось абсцисс, мкм^) и содержанием рРНХ генов (ось ординат) у четырех сортов мп[кой пшеницы.

Существует по крайней мере два объяснения полученной зависимости. Во-первых, возможно, что при определенных условиях метод Ag-окрашивания перестает быть специфичным только для активной части ЯОР, и отращивается весь ЯОР, включая и гетерохроматиновую область. Так как многие авторы используют различные модификации Ag-метода, вполне вероятно, что более сильная предобработка препаратов обусловливает окрашивание всего ЯОР. Так, было показано, что в хромосомах кукурузы нитратом серебра окрашивается «« только вторичная перетяжка, но и прилегающий гетерохроматаи (Khuong, Schubert, 1985). Эту гипотезу подтверждают так*е данные о сохранении в ряде случаев способности ЯОР к Ag-окрзчшпанип после обработки различными ингибиторами синтеза FHK (llornamlez-Verdun et al . , 1984). Если предположить, что т наших экспериментах окрашивается нитратом серебра полностью клк вторичная перетяжка, так и прилегающий гетерохроматин, то

высокая корреляция между размерами Ag-окрашенных ЯОР и общим числом pFHK-генов вполне закономерна.

Второе возможное объяснение предполагает существование определенной зависимости между общим числом числом рРНК-генов и их активной частью. Ранее было показано, что существует корреляция между активностью ЯОР, числом рибосомальных генов, длиной вторичной перетяжки, соответствующей ЯОР (Miller, Brown, 1969; Sinclair et al., 1974; Sato et al., 1980). Однако, Кальм и Смит на хромосомах разных видов лилий и их гибридов не обнаружили корреляции между количеством рРНК-генов и размером Ag-окрашенного участка отдельных ЯОР (lCalm, Smyth, 1984), Следует, однако, учитывать, что авторы использовали более "жесткую" предобработку препаратов. Не исключено, что вышеуказанная зависимость сохраняется для всей клетки в целом, а между отдельными ЯОР происходят более сложные компенсаторные взаимодействия. Тем не менее, поскольку метод Ag-окрашиванпя проще, чем методы определения количества рРНК-генов, то существование обнаруженной зависимости дает возможность его использования для оценки числа рРНК-генов у сортов и форм мягкой пшеницы (а возможно и других злаков) по размерам Ag-окрашенных ЯОР.

3. Изменение Ag-окрашиваиия ядрьшкообразуодих районов хромосом у гетерозисных гибридов ячменя по сравнению с исходными родительскими сортами.

Стандартный кариотип ячменя (Hordeum vulgare I, ) содержит две спутничные хромосомы: хромосому 6 (6) и хромосому S (7). В скобках указан номер хромосомы в соответствии со стандартной классификацией (Tjio, Hagberg, 1951; Linde-Laursen, 1975, 1978). В дальнейшем мы будем использовать классификацию хромосом ячменя, соответствующую генетической номенклатуре хромосом мягкой пшеницы (Islam, Shepherd, 1981; Santos et al., 1984; Муравенко и др., 1986; Muravenko et al., 1991), использование которой было признано правомочным на VI Международном симпозиуме по генетике ячменя (VI IBGS., 1991).

Визуальный анализ Ag-окрашенных ЯОР хромосом ячменя показал, что размеры окрашенных участков хромосомы 6 больше, чем у хромосомы 5. Этот факт указывает на то, что ЯОР хромосомы 6 является функционально более активным. Наши результаты согласуются с данными некоторых авторов (Anastasova-Kristeva el al., 1980; Schubert, Kunzel, 1990) также считающих, что ЯОР, принадлежащий хромосоме 6, функционально более "сильный", чем ЯОР

хромосомы 5. Об этом говорят результаты исследований, проведенных на транслокационных линиях ячменя, содержащих два ЯОР от хромосом - 5 и б на" одной хромосоме. Было обнаружено, что ЯОР хромосомы 6 подавляет яктивность ЯОР хромосомы 5. Установлено также, что в интерфазных ядрах большие по размеру ядрышки формируют ЯОР, принадлежащие хромосоме 6, то есть ЯОР этой хромосомы проявляет "ядрышковое доминирование". Морфометрический анализ хромосом ячменя показал, что у всех исследуемых сортов хромосома 5 имеет меньший по размеру спутник, меньшую длину вторичной перетяжки и меньшие размеры блоков приядрышкового гетерохроматина По сравнению с хромосомой б (Муравенко, 1987).

Результаты проведенного нами количественного анализа ^^-окрашенных ЯОР хромосом 5 и б у сортов ячменя Носовский 9 и Абава и их гибридов первого, второго и третьего поколений (П, Р2 и РЗ ) приведены в Таблице 5. Во всех изученных формах средняя-площадь Ag-ЯOP хромосомы 5 была достоверно меньше таковой хромосомы б. При этом изменчивость данного параметра выше у хромосомы 6. Из Таблицы следует также, что площади А£-Я0Р хромосом 5 и б коррелируют между собой, что свидетельствует о взаимосвязи, а, возможно, и о едином механизме регуляции функционирования ЯОР в геноме сорта.

Таблица 5. Внутри- и межсортовая изменчивость средней площади

ЯОР хромосом 5 и 6 и коэффициент корреляции данного параметра этих хромосом у сортов ячменя и их гибридов.

Сорт Число клеток Средняя площадь ЯОР 5-х хромосом а клетке, мкм Средняя площадь ЯОР 6-х хромосом в клетке, мкм Коэффициент корреляции, %

Абава 43 0,10 (0,03) 0,13 (0,04) 0,56

Носовский 9 43 0, 13 (0,03) 0,17 (0,03 ) 0,42

П 26 0,14 (0.03) 0,18 (0,05 ) 0,32

Р2 18 0,15 (0,03) 0,18 (0,04) 0,67

РЗ 14 0,12 (0,03) 0,15 (0,03) 0,48

Примечание: в скобках указаны стандартные отклонения средней площади ЯОР (мкм).

При межсортовой гибридизации ячменя в кариотипе гибридов перпого поколения происходит увеличение площади Ag~ЯGP хромосом 5

15

и 6 (Табл.5). У хромосомы 5 этот параметр увеличился на 22% по сравнению со средним арифметическим между значениями площади А^-ЯОР у родительских сортов и на 8% по сравнению с родительским сортом Носовский 9, имеющим большее значение данного параметра. У хромосомы 6" площадь Аg-ЯOP увеличилась на 2095 по сравнении с ожидаемым средним и на 6% по сравнению с сортом Носовский 9. При этом изменчивость площади Ag-ЯйP хромосомы 6 несколько увеличилась. Коэффициент корреляции между средней площадью Ag-ЯQP хромосом 5 и 6 у гибрида Р1 снизился по сравнению со значениями Этого параметра у родительских сортов. По-видимому, в геноме гибридов первого поколения происходит дестабилизация единого механизма регуляции функционирования ЯОР, отмеченного йами ранее у родительских сортов.

В геноме гибридов второго поколения наблюдается дальнейшее увеличение средней площади Ag-Я0P хромосомы 5 (Табл.5). Значение . этого параметра увеличилось на 30% по сравнению с ожидаемым средним у исходных родительских сортов Носовский 9 и Абава. У хромосомы 6 значение средней площади Л£-Я0Р- не изменилось, однако коэффициент вариации данного параметра снизился. Необходимо отметить резкое увеличение значение коэффициента корреляции . площадей Ав-ЯОР хромосом 5 и 6 у гибрида Т2 по сравнению с Р1 (в два раза ) и с исходными родительскими формами. Вероятно, в происходит . стабилизация единого механизма регуляции функционирования ЯОР.

Сравнительный анализ гетерозисных гибридов ячменя и исходных родительских сортов выявил достоверные (Р>0,95) различия в • средней суммарной клеточной площади Ag-oкpaшeнныx ЯОР между родительскими формами и гибридами Р1 и Р2. При этом значение данного показателя у гибрида ИЗ (0,28) снижается по сравнению с Н и И2 (0,32) и приближается по величине к ожидаемому среднему значению (0,26) между родительскими сортами (Табл.6). Анализ распределения величины средней клеточной площади Ag-Я0P- для каждого сорта, а также для и гибридов, представленный . в виде гистограмм на Рисунке 2, показал, что у гибридов П и Р2 экстремальные значения гистограмм (то есть наибольшее число клеток, имеющих определенную площадь) смещаются в сторону большего значения площади по сравнении с родительскими сортами. Однако у гибрида РЗ экстремальное значение гистограммы не отличается от значения такового у родительских сортов. Этот факт позволил нам предположить, что гетерозисный эффект связан с амплификацией и/или с активацией рибосомальных генов. При этом

гетерозиснме гибриды характеризовались также и более низким

значением коэффициента вариации суммарной площади Ag-oкpaшeнныx

ЯОР хромосом по сравнению с родительскими формами, что указывает на более высокую стабильность их генома.

Таблица 6. Внутри- и межсортовая изменчивость суммарной площади ядрышкообразуюдих районов.

Сорт Число клеток Средняя площадь ясех ЯОР в клетке, мкм Стандартное откл мкм Коэффициент вариации, % .

Лбава 43 0,22 0,06 28 ,'6

Носопский 9 43 0,30 0,06 20,8

И 40 0,32 0,07 21,2

F2 23 0,32 0,06 18,7

F3 24 0,28 0,05 18,2

Полученные результаты мы ' сравнили с данными по морфометрическому анализу С-окрашенных хромосом, полученными ранее Муравенко с соавторами (Муравенко и др., 1987) для. этих же сортов. Согласно результатам морфометрического анализа С-окрашенных хромосом, во втором поколении по сравнению с родительскими формами происходит снижение вариабельности суммарного количества reгерохроматина как на кариотип в целом, так и на индивидуальную хромосому. Ныло обнаружено, что изменения коэффициента вариации размеров гетерохроматических районов хорошо согласуются с изменениями коэффициента вариации суммарной площади Ag-ЯОР у тех же форм. Изложенное позволяет сделать заключение, что метод Ag-окрашивания ЯОР может использоваться как простой тест, а коэффициент вариации площади Ag-ЯОР хромосом как характеристика, отражающие состояние генома, в том числе его стабильность я дифференциальную активность.

4. йзучекка методоьз А «-окрашивания искусственно созданного аыфи-диплоида Triticum miguschovae и родительских видов - Т.гаili-tínse и Aegilops tauschii (=Ae. squarrosa).

Показано, что в составе полиплоидных форм растений активность ЯОР хромосом родительских видов может изменяться (l.angrirtge et al., 1970; Oerlach et al., 1980; Carrossa, 1981; В;;г;аез и др., Г'82; Hutchinson, Mi Мет, 1982; Cermeño et al., I':h4; l.acailena el al., 1 984 ). Так, например, при образовании

Абава

Носовский

О 0.01 0.02 без 0 04 0.05

Рис.2; Распределение средней суммарной клеточной площади Ай-ЯОР (ось абсцисс, мкм2) у сортов Абавй, Носовский 9 и гибридов Р1, ?2 и ИЗ (ось ординат - число клеток)

тетраялоидных пшениц происходит инактивация ЯОР хромосом __А---

генсша, у гексаплоидных------активируетсясупрессированный на

тетраилоидном уровне ЯОР хромосомы 1А (Gerlach et al., 1980; Сагточм, 1981, Hutchinson, Miller, 1982). В настоящей работе с »отовью метода Ag-окрашивания ЯОР были изучены пшеница Triticum sölitinae, эгнлопс Aegilops tauschii и их амфидиплоидный гибрид Т. isiguschovae. Последний является синтетическим аналогом мягких гниения (геномные формулы a'gD и ABD, соответственно), важным преимуществом которого является наличие конкретных родительских форм.

T.militinae - тетраллоид, в состав которого входят хромосомы двух различных геномов - А1 и G. Сравнение рисунков дифференциального окрашивания хромосом этой пшеницы и ее . родительского вида - Т. t imopheevi i показало, что. их кариотипы практически идентичны (Badaeva et al., 1986; Бадаева и др..' 1988). Нами обнаружено, что кариотип T.militinae содержит две пары спутничных хромосом, одна из которых относится к А'-геному (6А*), а другая - к G (6G). Аналогичное количество хромосом с ЯОР было обнаружено при использовании метода гибридизации in situ (Hutchinson, Miller,- 1982). На метафаэных пластинках, окрашенных с помощью Ag-матола, выявляется не более 4 ЯОР, число ядрышек в интерфа :.нмх ядрах также не превышает эту величину (Табл.7). Все приведенные факты говорят о том, что в геноме T.militinae функционируют только две пары ядрьшжообразующмх хромосом.

Второй родительский вид - Ае. tauschii ssp. strangulata -диплоид с геномной фпрмулой DD. Изученный нами подвид считается тахже донором D-генома мягких пшениц (Jaasks, 1981). В связи с этим было интересно провести сравнение одноименных геномов у исходного вида и его производных - T.aestivum, который прошел длительный путь эволюции, и Т.miguschovae, который был синтезирован недавно. Исследование Ag-окрашенных препаратов Ае . tauschii выявило наличие в его кариотипе только одной пары спутничных хромосом - 5D. По чинным литературы (Mukai et al., J991), эта хромосома сохраняет ядрышкообразующую активность и в составе мягких пшениц.

Т .¡niguschovae - амфидиплоидный гибрид T.militinae и Ае. tausch!i - объединяет в счоем кариотипе А[, G и D геномы. Ни|у.'1лыыв сргшнение дифференциально окрашенных хромосом у ¿интезир.'заиио! о амфидиплоида и исходных родительских видов показало, что в кариотипе i ибрида не изменилось количество i етерохроч.1 тна и его распределение в хромосомах. Хромосомы А1 и

О геномов не отличались от таковых у T.uulitinae; особенности морфологии и рисунка С-окраски хромосом D-гёномов родительского вида Ae.tauschii и T.taiguschovae также были сходны и в тоже время отличались от D-генома мягкой пшеницы.

В мета'фазных пластинках T.miguschovae, окрашенных по С-методу, наблюдается три пары епутничных хромосом, соответствующие ядрышкообразующим хромосомам родительских видов. В то же врёмп, Ag-окрашивание выявляет до 7 ЯОР в метафазных клетках и до 8 ядрышек в интерфазных ядрах, хот» большинство клеток содержит 2-4 ядрышка в интерфазе и 4-5 ЯОР в метафазе (Табл.7). Поскольку у Т. miguschovae количество ЯОР Ь ряде клеток превышает сумму ЯОР у родительских видов, можно предположить, что при гибридизации произошла активация ЯОР, супресскрованного в геноме одного из родителей, вероятно, T.militinae. Аналогичное явление было описано ранее у мягкой пшеницы (Hutchinson, Miller, 1982; Сегюепо .et al., 1984).

Таблица 7. Количество ядрышек в интерфазных ядрах у различных видов пшениц.

Вид пшениц Количество клеток, содержащих ядрышки, 9»

1 2 3 - 4 5 6 7 8

Ае tauschii 95,8 4,2

Т. mi litinae 23,8 41,4 28,4 6.4

Т. mi guschovae 3,5 23,4 35,5 26,0 9.1 2,1 0,3 0,01

Примечание: для каждого вида просчитывалось по 500 ядер.

Явление дифференциальной амфипластии, выявленное «первые при анализе гибридов рода Crépis, и заключающееся в инактивации ЯОР одного из родительских видов в геноме межвидового гибрида, было описано С.Г.Навашиным (Nawaschin, 1927). Позднее, на основании исследования гибридов соматических клеток человек-мышь (Miller D.A. at al., 1976; Miller 0.1. et al., 1976), было обнаруяено, что характер изменения ЯОР неоднозначен и зависит от взаимодействия геномов родительских видов. -При этом, если инактивируется ЯОР человека, то в таком гибриде будут теряться хромосомы человека, а если инактивируется ЯОР мыши, то хромосомы мыши. Эти потери хромосом одного из родительских видов не сказываются на жизнеспособности таких гибридов, что позволяет высказать предположение, что более активным является тот геном,

чей ЯОР активен. Данное предположение подтверждается результатами^ патогенетических исследований-гексаплоидных тритикале (Бадаев и др.Т 1982; fi.' Iiieva et al., 1986; Bol.sheva et al,, 1986; Kost et al., 1990; Бо.тньева и др., 1990). В составе тритикале наблюдалось снижение активности ЯОР хромосомы 1R по сравнению с гаковой у родительской формы ржи и некоторое возрастание активности ЯОР хромосом 1В и 6В по сравнению с родительской формой пшеницы. Описанное явление сопровождалось некоторым снижением транскрипционной a«iявности хромосом R генома и увеличением таковой хромосом В генома, выявленное с помощью метода ник трансляции in situ. Следует отметить, что для ряда форм тритикале характерна цитологическая нестабильность, за которую ответственны в основном хромосомы R генома. Вышеизложенное позволяет предположить существование различных видов дифференциальной активности геномов^в составе полиплоидов и клеточных гибридов:

1. Элиминация хромосом одного из родительских геномов (очевидно, неактивного) при инактивации принадлежащих ему ЯОР. В качестве примера можно привести гибриды человек-мышь.

2. Снижение транскрипционной активности хромосом одногч из родителей, в том числе и ЯОР. Выше mi описали пример, касаюшийся тритикале.

3. Сохранение имеющихся ЯОР и даже активация в ряде клеток дополни!епьных (ранее инактивироазмных ) ЯОР по сравнению с родительскими видами, что, очевидно, связано с сохранением и даже некоторым усилением активности данного генома. По видимому, именно этот вариант дифференциальной активности геномов родительских видов в составе полиплоида имеет место в случае изученных нами T.migusctiovae и исходных родительских видов.

Таким образом, можно высказать предположение, что поведение рибосомальных генов является одним из показателей, отражающим дифференциальную активность генома в целом, а также его стабильность в составе полиплоид»» и клеточных гибридов.

В литераtура отпечена закисмлость между количеством ядрышек а интерфазном ядре и размерами »дрышек - чем больше их число, тем меньше величина отдельиьга ядрышек. Интересно, что в проанализированном нами материале с увеличением уровня плоидности в ояяу Ае. tauschi i (' 2и=2х= 14 ): T.railitinae (2n=4x=28): Т. mi gusthovae (2п=6х=42) чоличестяо ядрышек на основное число хромосом (2.x) остается приблизительно одинаковым 1,04: 1,10: t,*>7, спотчетстчемма. Возможно, что для описанного нами варианта функционир^ванч!» полиплоидного генома необходимо наличие

определенного числа активных ЯОР на 2х.

Таким образом, в данной работе еще раз показано, что в процессе гибридизации не происходит механического объединения геномов исходных видов. Гибридизация приводит к изменению функционирования родительских геномов, которое, по нашему предположению, в данном случае проявляется в активации ЯОР, супрессированного в геноме родительского вида или/и' с амплификации рибосомальных генов в соответствующей хромосоме.

ВЫВОДЫ

1.1. Разработан метод приготовления препаратов метафазнмх хромосом растений, в основе которого лежит раскапывание суспензии клеток, т.е. аналогичный используемому для хромосом человека и животных.

1.2. Разработана надежно воспроизводимая модификация метода окрашивания нитратом серебра ядрышкообразующих районов {Ag-Я0P) хромосом растений.

1.3. Предложена количественная оценка ядрьшжообраэуюших районов отдельного организма {растительного или животного) по суммарной площади Ag-oкpaшeннь!x ЯОР в клетке (суммарная клеточная площадь Ag-ЯOP).

2. Обнаружено, что суммарная клеточная площадь Ag-Я0P хромосом пшеницы с высокой степенью значимости коррелирует с общим содержанием рибосомальных генов.

3. Показано, что суммарная клеточная плошадь Ag~Я0P хромосом человека к растений является характеристикой данного организма.

4. Обосновано использование коэффициента вариации суммарной клеточной площади Ag-Я0P хромосом человека и растений в чкачестне характеристики, отражающей стабильность или,. иапротии, гетерогенность генома исследуемого организма,

5. Анализ собственных результатов и данных литературы показал, что у мнежвидовых гибридов может наблюдаться не только инактивация ЯОР одной из родительских форм или сохранение ЯОР обоих родителей, но и активация дополнительных ЯОР по сравнению с родительскими формами. Таким образом, активность рибосомальных генов может быть использована в качестве одного из показателей, отражающего дифференциальную активность генома в целом, а также его стабильность в составе полиплоидов и клеточных гибридов.

6. Сравнительный анализ внутривидовых (межсортовых) гетерозисных гибридов ячменя и исходных родительских сортов показал, что у этих гибридов происходит некоторое увеличение суммарной клеточной

плова ни Ag-ЯОР, что, возможно, связано с амплификацией и/или активацией рибосомальных __ генов. Гетерозисные гибриды характеризуются также более низким значением коэффициента вариации суммарной клеточной площади Ag-ЯОР хромосом по сравнению с родительскими формами, что указывает на более высокую стабильность генома гетерозисных растений.

7. Обосновано использование Ag-окрашивания ЯОР как простого теста, отражающего состояние генома, в том числе такие его характеристики, как стабильность и дифференциальная активность.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Амосова A.B., ((одуголышкова O.A., Каминир Л.Б. Количественная оценка площади Ag-окрашенных ядрышкообразуюгцих районов хромосом человека. Цитология, 1986, т.28, №. 1, <;. 113-116.

2. Амосова A.B., Бадаев Н.С., Дьяченко Л.Ф., Оноприенко B.C.,' Каминир Л.Б. Плошадь Ag-окрашенных ядрьявкообраэующих районов хромосом мягкой пшеницы коррелирует с содержанием рибосомальных генов. Доклады АН СССР, 1989, т.305, Ii 2, с.453-456.

3. Бадаева Е.Д., Амосова A.B., Оноприенко B.C., Бадаев Н.С. Цито-генетическое исследование Trilicum migushovae и его родительских видов. Цитология и генетика, 1989, т.23, 5. с.22-2Ь.

4. Амосова A.b., Ьцдиев Н.С. Стабильность и изменчивость Ag-окришенных ядрмшкообразующи* районов (Ag-ЯОР) хромосом растений. I! сб: Новые методы биотехнологии растений. !1 Российский симпошум. Тезисы. Нущпно: 1993, с.191.

5. Бадаев Н.С., Мураиенко О.В., Бадаева F.. Д. , Амосова A.B. Генотип-средовые взаимодеистзия и процесс формирования генома злаков. В сб: Новые методы биотехнологии растений. II Россййский симпозиум. Тезисы. Пушико: 1993, с.184.